BRPI0713839B1 - Rumble bacterial mutant, method for production of root bacterial mutant and method for the production of succinic acid - Google Patents

Rumble bacterial mutant, method for production of root bacterial mutant and method for the production of succinic acid Download PDF

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Won Lim Sung
Song Hyohak
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Abstract

mutante bacterial de rúmen e método para produção da mesma. a presente invenção refere-se a um mutante bacterial de rúmen que produz ácido homossuccínico e um método para a produção de ácido homossuccínico, utilizando o mesmo e, mais especificamente, a um microorganismo mutante produtor de ácido succínico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas, obtido através da disrupção de um gene codificando lactato deshidrogenasa (1dha), um gene codificando fosfotransacetilase (pta), e um gene codificando acetano quinase (acka), sem a disrupção de um gene codificando piruvato formato-liase (pfl), além de um método para a produção de ácido succínico utilizando o mesmo. o microorganismo mutante inventivo tem a propriedade de possuir uma alta taxa de crescimento e produtividade de ácido succínico, enquanto produz poucos ou nenhum ácido orgânico, em comparação com as variantes produtoras de ácido succínico anteriores. portanto, o microorganismo mutante inventivo é útil para produzir ácido succínico para uso industrial.

Description

MUTANTE BACTERIAL DE RÚMEN, MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE MUTANTE BACTERIAL DE RÚMEN E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO SUCCÍNICO
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um mutante bacterial de rúmen, que produz ácido homossuccinico e um método para a preparação de ácido homossuccinico, utilizando o mesmo e, mais especificamente, a um mutante bacterial de rúmen, que produz ácido succinico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas, obtido através da disrupção de um gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA), um gene codificando fosfotransacetilase (pta), e um gene codificando acetato quinase (ackA), sem a disrupção de um gene codificando piruvato formato-liase (pfl), além de um método para a preparação de ácidos succinicos utilizando o mesmo.
ESTADO DA TÉCNICA 0 ácido succinico (HOOCCH2CH2COOH) , um ácido dicarboxilico consistindo de 4 carbonos, é um ácido orgânico de muitas utilidades, amplamente utilizado como um precursor de produtos médicos, alimentícios, cosméticos, e químicos de outras indústrias (Zeikus et ai., Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:545, 1999; Song et ai., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006). Especificamente, espera-se um significativo aumento na demanda por ácido succinico como principal fonte de macromoléculas biodegradáveis, com o recente aumento marcante do preço de petróleo (Willke et ai., Appl. Microbiol. Biotechnol., 66:131, 2004). É possível produzir ácido succinico através de síntese química e fermentação. Contudo, a maioria do ácido succinico para uso industrial atualmente é produzido através de métodos de síntese química, utilizando n-butano e acetileno derivados do petróleo como matéria-prima por empresas químicas chinesas, empresas químicas japonesas, e grandes empresas químicas como a BASF, DuPont, BP Chemical etc., mas apenas uma pequena quantidade de ácido succinico para usos especiais como medicina etc. é produzida através do tradicional método de fermentação microbial. Os métodos de síntese química acima mencionados têm o problema de emitir grandes quantidades de resíduos perigoso, efluentes e gás residual (p.ex., CO, etc.) geradas durante um processo de produção de ácido succinico. Especificamente, combustíveis fósseis com alta possibilidade de serem emitidos são utilizados como material básico e, existe, portanto uma necessidade urgente de desenvolver um método parar preparar ácidos succinicos a fim de substituir os combustíveis fósseis por combustíveis alternativos como recursos renováveis.
Para superar esses problemas causados pelo processo de síntese química para a preparação de ácido succínico, estudos sobre a produção de ácidos succínicos através da fermentação microbial, utilizando vários recursos renováveis foram intensiva e amplamente conduzidos por muitos pesquisadores. Microorganismos, que foram utilizados na produção de ácido succínico, variam, porém, em geral, podem ser classificados em Escherichia coli recombinante bactérias de rúmen {Actinobacillus, Anaerobiospirillum Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio, etc.) e_____(Song et al., Enzyme Microbial Technol. , 39:352, 2006).
Entre os estudos sobre a produção de ácidos succínicos utilizando E.coli recombinante, houve uma tentativa de aumentar a produção de ácido succínico, preparando um AFP111 mutante (ATCC N° 202021) obtido através de um método no qual um gene transportador de glicose (ptsG) é manipulado, enquanto genes (ldh e pfl), envolvidos na produção de ácido láctico e ácido fórmico in E.coli, são eliminados, pela equipe de pesquisas da Universidade de Chicago (U.S. 5,770,435).
Os presentes inventores amplificaram um gene de enzima málica (sfcA) envolvido na produção de ácido succínico, em E.coli recombinante, variante NZN111, de onde genes de ldh e pfl são eliminados, para conter o ácido pirúvico acumulado no processo de fermentação da variante NZN111, aumentando, assim, a produção de ácido succínico (Hong et al., Biotechnol. Bioeng. , 74:89, 2001). Outrossim, uma equipe de pesquisadores liderada pela Universidade de Geórgia construiu uma variante AFPlll/pTrc99A-pyc, expressando um gene de piruvato carboxilase {pyc) na variante AFP111 e, então, utilizou esta variante na produção de ácido succínico (Vemuri et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28:325, 2001). Recentemente, a fim de induzir a produção de ácido succínico em condições anaeróbicas, uma equipe de pesquisadores liderada pela Universidade de Rice relatou ter construído variantes de E.coli recombinante, manipulando genes envolvidos em vias de Glicolise, ciclo de TCA, e Gioxilato (Lin et al., Eng., 7:116, 2005; Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005). A variante Actinobacillus, a variante Anaerobiospirillum e a variante Mannheimia, que são um tipo de bactérias de rúmen são conhecidas por sua ótima produção de ácido succínico, portanto, estudos sobre as variantes tem sido ativamente conduzidos. Uma equipe de pesquisadores liderada pelo Michigan Biotechnology Institute (MBI) nos EUA descobriu a variante Actinobacillus succinogenes 130Z (ATCC N° 55618) para desenvolver um método de produção de ácido succínico, e construiu várias variantes mutantes de Actinobacillus succinogenes, utilizando mutagênese química tradicional para uso no desenvolvimento de um processo para produzir e purificar ácido succinico (U.S. 5,521,075; U.S. 5,168,055; U.S. 5,143,834).
Contudo, o processo de produção de ácido succinico utilizando fermentação microbial, desenvolvido até o momento, tem uma produtividade muito baixa de menos que 2g/L/h, e especialmente incorre em um grande custo para separar e purificar ácido succinico, pois ácido succinico é produzido juntamente com grandes quantidades de vários ácidos orgânicos e etanol como subprodutos até certo ponto durante a fermentação. Embora os resultados acima mencionados apresentassem um efeito decrescente de ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, e etanol como subprodutos em algumas variantes recombinantes, não apresentaram total eliminação dos mesmos. Além disso, em outras variantes mutantes recombinantes, houve alguns casos onde suas taxas de crescimento se tornaram tão baixas que a produtividade geral de ácido succinico não aumentou. Portanto, existe uma exigência urgente de desenvolver uma nova variante produtora de ácido succinico, que tenha uma elevada produtividade de ácido succinico e previna a produção de subprodutos (Hong et al., Biotechnol. Lett., 22:871, 2000).
Para desenvolver uma nova variante produtora de ácido succinico a fim de satisfazer as exigências acima, isolamento de uma variante com ótima produtividade de ácido succinico, conclusão de sua seqüência de genomas, uma compreensão de sua característica metabólica, e estabelecimento de uma técnica de manipulação genética necessários para a construção de uma variante recombinante devem ser precedidos. Até o momento, no caso de bactérias com elevada produtividade de ácido succinico, a total seqüência de genomas da variante M. succiniciproducens MBEL 55E foi concluída, porém aquelas bactérias como Actinobacillus, Anaerobiospirillum etc. ainda não foram relatadas. Embora uma tentativa visando produzir ácidos succínicos através da amplificação dos genes de fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pckA) de A. succinogenes e A. succiniciproducens em E.coli, foi relatada (Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997), não houve nenhuma tentativa de desenvolver uma variante produtora de ácido succinico recombinante baseada na seqüência de genomas.
Os presentes inventores relataram que isolaram M. succiniciproducens MBEL 55E produtora de ácido succinico com elevada eficiência a partir de gado nativo da Coréia, e concluíram a seqüência de genomas e caracterizaram propriedades metabólicas da variante (Hong et al., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004). Além disso, os presentes inventores construíram um mutante bacterial, M.succiniciproducens LPK (KCTC10558BP) através da disrupção de uma gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA) e um gene codificando piruvato formato-liase (pfl) in M. succiniciproducens MBEL 55E (KCTC 0769BP), um tipo de bactéria de rúmen a fim de inibir a produção de ácidos lácticos e ácidos fórmicos. Adicionalmente, os presentes inventores construiram um mutante M. succiniciproducens LPK7 (KCTC1062BP),através da disrupção de um gene de fosfotransacetilase (pta) e um gene de acetato quinase (ackA) na variante mutante, M.succiniciproducens LPK a fim de inibir a produção de ácido acético, para cultivar os mutantes bacteriais em condições anaeróbicas (WO 05/052135 Al; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006), aumentando, , assim, o ácido succinico. Contudo, no caso de essas variantes mutantes, embora a produção de subprodutos, ácido fórmico e ácido acético poderia ser contida até certo ponto, acumulou-se uma grande quantidade de ácidos pirúvicos como subproduto durante a fermentação, mais que tudo, a taxa de crescimento da variante tornou-se tão baixa quando comparada com uma variante silvestre que foi impossível atingir uma ótima produtividade de ácido succinico.
Por enquanto, relatou-se que um gene de piruvato formato-liase (pfl) participa na conversão de ácido pirúvico em acetilcoenzima A (acetil-CoA), afetando, assim, a redistribuição e crescimento das células de ácido pirúvico (Wolfe, Microbial. Mol. Biol. Rev., 69:12, 2005).
Conseqüentemente, os presentes inventores fizeram amplos esforços para construir um microorganismo mutante capaz de produzir ácidos homossuccínicos com alto rendimento ao minimizar uma diminuição na taxa de crescimento microbial e totalmente inibir a formação de vários subprodutos, incluindo ácidos pirúvicos e desenvolver um método de fermentação dos mesmos, e como resultado, construíram um mutante bacterial M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) através da disrupção de um gene de lactato deshidrogenasa (ldhA), um fosfotransacetilase (pta), e um gene de acetato quinase (ackA) sem a disrupção de um gene de piruvato formato-liase (pfl) in M. succiniciproducens MBEL55E, um tipo de bactéria de rúmen e, a seguir, fermentaram a variante mutante em condições anaeróbicas, utilizando glicose e glicerol como fontes de carbono e confirmaram que a variante mutante quase pode produzir ácido homossuccínico com alto rendimento, de modo a completar a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Portanto, um objetivo da presente invenção é prover um microorganismo mutante que tem elevada taxa de crescimento e produtividade de ácido succinico e produz apenas ácido succinico com alto rendimento, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico durante o período de fermentação anaeróbica.
Outro objetivo da presente invenção é propiciar um método para a produção de ácido homossuccínico sem a acumulação de outros subprodutos, ao cultivar o microorganismo mutante utilizando glicose e glicerol como fontes de carbono em condições anaeróbicas.
Para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece um mutante bacterial de rúmen carente em um gene de lactato deshidrogenasa (ldhA), um fosfotransacetilase {pta), e um gene de acetato quinase (ackA), em um microorganismo produzindo ácido succinico enquanto compreende um gene de piruvato formato-liase (pfl) , tendo a propriedade de produzir apenas ácido succinico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas, onde o microorganismo é escolhido a partir do grupo consistindo do gene Mannheimia, gene Actinobacillus e gene Anaerobiospirillum.
Além disso, a presente invenção fornece um microorganismo mutante Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) carente de um gene de lactato deshidrogenasa {ldhA), um fosfotransacetilase {pta), e um gene de acetato quinase {ackA), enquanto compreende um gene de piruvato formato-liase {pfl) em M. succiniciproducens, tendo a propriedade de produzir ácido succinico em uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas.
Adicionalmente, a presente invenção propicia um método para a produção de um microorganismo mutante, o método compreendendo as etapas de: (a) obtenção de um mutante bacterial de rúmen carente do gene codificando lactato deshidrogenasa {ldhA), através da disrupção de um gene codificando lactato deshidrogenasa {ldhA) a partir do genoma de ácido succinico produzindo bactéria de rúmen, utilizando recombinação homóloga; e (b) obtenção de um mutante bacterial de rúmen carente de um gene codificando lactato deshidrogenasa {ldhA), um gene codificando fosfotransacetilase {pta), e um gene codificando acetato quinase {ackA) através da disrupção de um gene codificando fosfotransacetilase {pta) e um gene codificando acetato quinase {ackA), a partir do genoma do microorganismo mutante carente do gene codificando lactato deshidrogenasa {ldhA) , através de recombinação homóloga.
Outrossim, a presente invenção propicia um método para a produção de ácido succinico, o método compreendendo as etapas de: cultivo dos mutantes· bacteriais de rúmen em condições anaeróbicas; e recuperação do ácido succinico do caldo da cultura.
Outras características e concretizações da presente invenção tornar-se-ão mais claras a partir das seguintes descrições detalhadas e as reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um diagrama esquemático ilustrando a via de produção de ácido succinico no microorganismo mutante, de acordo com a presente invenção. A FIG. 2 ilustra um processo de construção de um vetor de substituição para a disrupção de ldhA (pMLKO-sacB) através de recombinação homóloga. A FIG. 3 ilustra um processo de construção de um mutante bacterial (M. succinicproducens LK) pela disrupção do gene de ldhA em Mannheimia succiniciproducens MBEL55E através de recombinação homóloga. A FIG. 4 ilustra um processo de construção de um vetor de substituição para a disrupção de pta e ackA (pPTA-sacB) através de recombinação homóloga. A FIG. 5 ilustra um processo de construção de um mutante bacterial (M. succinicproducens PALK) pela disrupção do gene de pta-ackA em M. succiniciproducens LK através de recombinação homóloga. A FIG. 6 é uma fotografia de eletroforese ilustrando a disrupção de pta-ackA em M. succiniciproducens PALK, onde M representa marcador lkb; pistas 1-6 representam fragmentos de PCR (1,1 kb) utilizando promotores, PAUl e SP1; pistas A-F representam fragmentos de PCR (1,5 kb) utilizando promotores, SP2 e PAD2. A FIG. 7 ilustra as características de cultura de M. succiniciproducens PALK inventivo em condições anaeróbicas saturadas com CO2.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO, E CONCRETIZAÇÕES RECOMENDADAS
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um mutante bacterial de rúmen carente de um gene de lactato deshidrogenasa {ldhA), um fosfotransacetilase (pta), e um gene de acetato quinase (ackA), enquanto compreende um gene de piruvato formato-liase (pfl), tendo a propriedade de produzir apenas ácido succinico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas, onde o microorganismo é escolhido a partir do grupo consistindo do gene Mannheimia, gene Actinobacillus e gene Anaerobiospirillum.
Na presente invenção, o microorganismo produtor de ácido succinico refere-se a um microorganismo capaz de produzir uma quantidade extremamente grande de ácido succinico em comparação à produção de etanol ou outros ácidos orgânicos, podendo ser utilizado para uso industrial na produção de ácido succinico por fermentação.
Microorganismos típicos produtores de ácido succinico incluem bactéria de rúmen e outro tipo de bactérias produtoras de ácidos succínicos como Anaerobiospirillum succiniciproducens. A partir de informações genéticas parciais (16s rRNA), análise de enzimas, e resultados da fermentação de Actinobacillus succinogenes e________________M. succiniciproducens, que são um tipo de bactéria de rúmen, e Anaerobiospirillum succiniciproducens, e várias bactérias conhecidas por produzir ácido succinico até o momento, descobriu-se que a principal via de biossíntese para a produção de ácido succinico a partir de uma fonte de carbono em microorganismos produtores de ácido succinico é quase idêntica à via de biossíntese para a produção de ácido succinico em Mannheimia sp. que um tipo de bactéria de rúmen (Tabela 1; Van der Werf et al., Arch Microbiol., 167:332, 1997; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997; Samuelov et al., App. Environ. Microbiol., 65:2260, 1999; Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004). Especialmente todas as bactérias de rúmen e A. succiniciproducens, que estão envolvidas na produção de ácido succinico, convertem fosfoenolpiruvato e piruvato, compostos de C3 em oxaloacetato e malato, compostos de C4 utilizando uma enzima fixadora de CO2 na produção de ácido succinico, produzindo, assim, ácido succinico. Além disso, bactérias de rúmen e A. succiniciproducens produzem ácido acético, ácido fórmico, e ácido láctico como subprodutos da fermentação em condições anaeróbicas, sugerindo, portanto, que todas as bactérias de rúmen, incluindo a Mannheimia sp., e A. succiniciproducens têm a mesma via para a biossíntese de ácido succinico.
Tabela 1 Microorganismos produtores de ácido succinico Na presente invenção, um microorganismo mutante produtor de ácido succinico com uma alta taxa de crescimento, capaz de produzir ácido succinico a uma elevada concentração enquanto produz poucos ou nenhum outro ácidos orgânicos, foi construído manipulando o genoma de um microorganismo produtor de ácido succinico. Em outras palavras, um gene de lactato deshidrogenasa (ldhA), um fosfotransacetilase (pta), e um gene de acetato quinase (ackA) sofreram disrupção no DNA do genoma de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP), construindo, assim, um mutante bacterial de M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP), apresentado uma alta taxa de crescimento e produzindo ácido succinico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácidos orgânicos.
Na presente invenção, para a disrupção de cada gene, utilizou-se um método de substituição dos genes através de recombinação homóloga para desativar, porém qualquer método pode ser utilizado sem limitações desde que seja um método de manipulação genética, onde o gene correspondente possa ser modificado ou eliminado, de modo que uma enzima codificada pelo gene correspondente não seja gerada.
Na presente invenção, os mencionados microorganismos produtores de ácido succinico são bactérias Anaerobiospirillum sp. ou bactérias de rúmen, escolhidos a partir do grupo consistindo de Mannheimia sp.— e Actinobacillus sp.
Na presente invenção, recomenda-se que o microorganismo mutante seja uma variante de fermentação homogênea produzindo apenas ácido succinico, enquanto forma poucos ou nenhum outro ácido orgânico como subprodutos, recomenda-se que cada quantidade de outros ácidos orgânicos produzidos seja menor do que 1% do peso baseado na quantidade de ácido succínico produzido, e recomenda-se que os outros ácidos orgânicos sejam qualquer um ou mais ácidos orgânicos escolhidos a partir do grupo consistindo de ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico, e ácido pirúvico.
Em outro aspeto, a presente invenção refere-se a um mutante bacterial rúmen M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) , carente de um gene de lactato deshidrogenasa {ldhA), um fosfotransacetilase (pta), e um gene de acetato quinase (ackA) em M. succiniciproducens, enquanto um gene de piruvato formato-liase ipfl) é mantido em M. succiniciproducens, tendo a propriedade de produzir ácido succínico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas. 0 mutante bacterial M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) , construído através da disrupção de um gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA), um gene codificando piruvato formato-liase (pfl) , um gene codificando fosfotransacetilase{pta), e um gene codificando acetato quinase (ackA) no genoma de Mannheimia sp., foi utilizado a fim de comparar a produtividade de ácido succínico e a taxa de crescimento de M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), de acordo com a presente invenção, àquelas dos mutantes bacteriais tradicionais. Aqui, o mutante bacterial M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) tem um disrupção adicional de um gene codificando piruvato formato-liase (pfl) na variante mutante M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), de acordo com a presente invenção (W02005/052135; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006). M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), de acordo com a presente invenção, tem uma elevada produtividade de ácido succínico e produz poucos ou nenhum subproduto como ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico, e ácido pirúvico, apresentando, assim, ótimas propriedades em comparação com o tipo silvestre de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) referente à produção de ácido succínico e ao previamente construído mutante bacterial M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), e pode produzir ácido succínico com altos rendimentos devido sua elevada taxa de crescimento, elevada produtividade de ácido succínico e produção de ácido homossuccínico ao prevenir a acumulação de ácido pirúvico, em comparação com o previamente construído mutante bacterial M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP).
Em ainda outro aspeto, a presente invenção refere-se a um método para a construção de um a microorganismo mutante, o método compreendendo as etapas de: (a) obtenção de um mutante bacterial de rúmen carente do gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA), através da disrupção de um gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA) no genoma de ácido succínico produzindo microorganismo escolhido a partir do grupo consistindo do gene Mannheimia, gene Actinobacillus e gene Anaerobiospirillum, utilizando recombinação homóloga; e (b) obtenção de um microorganismo mutante carente de um gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA) , um gene codificando fosfotransacetilase (pta), e um gene codificando acetato quinase (ackA) através da disrupção de um gene codificando fosf otransacetilase (pta) e um gene codificando acetato quinase (ackA), no genoma do microorganismo mutante carente do gene codificando lactato deshidrogenasa (ldhA), através de recombinação homóloga.
Na presente invenção, a recombinação homóloga da etapa (a) é realizada, de preferência, utilizando um vetor de troca genética contendo um ldhA rompido, e a recombinação homóloga da etapa (b) é realizada, de preferência, utilizando um vetor de troca genética contendo um pta-ackA rompido.
Na presente invenção, o vetor de troca genética contendo um ldhA rompido é, de preferência, pMLKO-sacB, e o vetor de troca genética contendo um pta-ackA rompido é, de preferência, pMPKO-sacB. A presente invenção também propicia um método para a produção de ácido succínico, o método compreendendo as etapas de: cultura do acima mencionado microorganismo mutante em condições anaeróbicas; e recuperação do ácido succínico do caldo da cultura.
Na presente invenção, para a cultura, recomenda-se a utilização de glicose ou glicerol como uma fonte de carbono, e recomenda-se que cada quantidade de outros ácidos orgânicos produzidos como subprodutos seja menos do que 1 % do peso baseado na quantidade de ácido succínico produzido.
Em ainda outro aspeto, a presente invenção refere-se a um método para a preparação de ácido succínico, o método compreendendo as etapas de: cultura do mutante bacterial de rúmen em condições anaeróbicas; e recuperação do ácido succínico do caldo da cultura. A cultura do microorganismo mutante produtor de ácido succínico, de acordo com a presente invenção, e o processo de recuperação de ácido succínico podem ser realizados pelos métodos de cultura já conhecidos no processo de fermentação convencional e métodos para separação e purificação de ácido succínico.
Na presente invenção, para a cultura, recomenda-se a utilização de glicose ou glicerol como uma fonte de carbono, e recomenda-se que cada quantidade de outros ácidos orgânicos produzidos como subprodutos seja menos do que 1 % do peso baseado na quantidade de ácido succinico produzido.
Exemplos Doravante a presente invenção será descrita em maiores detalhes através de exemplos. Contudo, será evidente para um perito na técnica que estes exemplos são apresentados meramente com intuito ilustrativo, e a presente invenção não está limitada a ou pelos exemplos.
Especificamente, os seguintes exemplos ilustram apenas Mannheimia sp., um microorganismo produtor de ácido succinico como uma célula hospedeira a fim de deletar os genes de acordo com a presente invenção. Contudo, é evidente para um perito na técnica que é possível obter um microorganismo mutante produzindo ácido homossuccínico mesmo quando se utilizam outros tipos de microorganismos produtores de ácido succinico.
Exemplo 1: Construção do vetor de disrupção de ldhA (pMLKO-sacB) A fim de realizar a disrupção de um gene de lactato deshidrogenasa (ldhA) no genoma de um microorganismo produtor de ácido succinico através de recombinação homóloga, um vetor de troca de genes foi construído da seguinte maneira. Primeiro, o DNA genômico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), como um modelo, foi sujeito a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2 abaixo e, a seguir, o fragmento de PCR obtido contendo a região homóloga 1 (Ll) de ldhA foi clivado com Saci e Pstl e introduzido no vetor pUC18 (New England Biolabs, Inc., USA), construindo, assim, pUC18-Ll.
SEQ ID N°: 1: 5'-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG SEQ ID N°: 2: 5'-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA
Adicionalmente, o DNA genômico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), como um modelo, foi sujeito a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4 b abaixo e, a seguir, o fragmento de PCR obtido contendo a região homóloga 2 (L2) de ldhA foi clivado com Pstl e fíindlll e introduzido no pUC18-Ll, construindo, assim, pUC18-Ll-L2.
SEQ ID N°: 3: 5'-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC SEQ ID N°: 4: 5'-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG A fim de inserir um gene resistente à canamicina como um marcador de seleção no pUC18-Ll-L2, o vetor pUC4K (Pharmacia, Alemanha) foi clivado com PstI, e o gene resistente à canamicina resultante foi fundido com pUC18-Ll-L2 clivado com PstI, construindo, assim, pUC18-Ll-KmR-L2. Um ligante expresso na SEQ ID N°: 5 foi inserido no pUC18-Ll-KmR-L2 clivado com Saci, fazendo, assim, um novo sitio de divagem Xbal.
SEQ ID N°: 5: 5'-TCTAGAAGCT A fim de inserir um gene sacB no pUC18-Ll-KmR-L2 no qual foi inserido o sitio de divagem Xbal, realizou-se PCR no pKmobsacB (Schafer et ai., Gene, 145:69, 1994) como modelo utilizando promotores expressos na SEQ ID N°: 6 e 7. A seguir, o de fragmento de PCR resultante contendo o gene sacB foi clivado com Xbal, e inserido no novo sitio de enzimas de restrição Xbal de pUC18-Ll-KmR-L2 no qual foi inserido o sitio de divagem Xbal acima, construindo, assim, pMLKO-sacB, um vetor de troca para a disrupção do gene de ldhA (FIG. 2) .
SEQ ID N°: 6: 5'-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG SEQ ID N°: 7: 5'-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC
Exemplo 2:____Construção da variante de M.
succiniciproducens LK
Uma variante mutante foi construída através da disrupção do gene de ldhA no genoma de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) utilizando o pMLKO-sacB construído no Exemplo 1 como um vetor de troca genética para a disrupção do gene ldhA (FIG. 3).
Em outras palavras, M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) foi aderido ao meio LB-glicose ágar contendo 10 g/L de glicose, e cultivado a 37°C por 36 horas. A colônia formada foi inoculada em 10 ml de meio liquido de LB-glicose, e cultivada por 12 horas. 1% do caldo da cultura, suficientemente cultivado, foi inoculado em 100 ml de meio líquido de LB-glicose, e cultivado em uma incubadora de agitação a 200 rpm e 37°C.
Quando o caldo da cultura atingiu um OD600 de aproximadamente 0,3-0,4 após 4~5horas, foi centrifugado a 4D e 4.500 rpm for 20 minutos para coletar células. A seguir, as células foram ressuspensas em 200 ml de solução de glicerol 10% a 4°C. A suspensão foi centrifugada a 4°C e 5.500 rpm por 20 minutos, e as células foram coletadas. Após ressuspender e coletar em uma metade da acima mencionada solução de glicerol duas vezes da mesma maneira como os processos acima descritos, as células foram suspensas em glicerol a uma razão de volume de 1:1, para obter um concentrado de células. 0 concentrado de células assim obtido foi misturado com o vetor de troca genética pMLKO-sacB construído no Exemplo 1 e, a seguir, introduziu-se pMLKO-sacB no M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) cultivado através de eletroporação sob condições de 1,8 kV, 25 μΕ e 200 ohms. Adicionou-se 1 ml de meio líquido de LB-glicose à variante introduzida em pMLKO-sacB, e pré-cultivada um uma incubadora de agitação a 37°C e 200rpm por uma hora. O caldo da cultura foi colocado sobre um meio sólido de LB-glicose contendo um antibiótico canamicina (concentração final de 25 μg/ml) e cultivado a 37°C por 48 horas ou mais. A fim de escolher uma colônia onde ocorreu apenas um duplo cruzamento, as colônias formadas foram colocadas em faixas em um meio sólido de LB-sacarose contando canamicina (25 μg/ml) e sacarose lOOg/L. Após 24 horas, as colônias formadas foram colocadas em faixas mais uma vez no mesmo meio.
As colônias (mutantes) formadas no meio foram cultivadas em um meio líquido de LB-glicose contendo um antibiótico, e DNA genômico foi isolado da variante cultivada através do método descrito em Rochelle et ai. (Rochelle et ai., FEMS Microbiol. Lett., 100:59, 1992). Realizou-se PCR utilizando o DNA genômico mutante isolado como um modelo, e o produto da PCR foi submetido a eletroforese para confirmar a disrupção do gene de IdhA no DNA genômico. A fim de confirmar a disrupção do gene de IdhA, realizaram-se PCRs duas vezes das seguintes maneiras. Primeiro, o DNA genômico mutante, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 8 e SEQ ID N°: 9. SEQ ID N°: 8: 5'-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC (KM1) SEQ ID N°: 9: 5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC (LU1) A seguir, o DNA genômico mutante, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 11. SEQ ID N°: 10: 5'-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG (KM2) SEQ ID N°: 11: 5'-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC (LD2) Os fragmentos de PCR obtidos nas duas PCRs foram submetidos à eletroforese de gel para confirmar a disrupção de IdhA pelo seu tamanho. Os fragmentos de PCR do DNA genômico tendo IdhA rompido foram confirmados pelo fato do produto resultante da PCR utilizando os promotores das SEQ ID N°: 8 (KM1) e SEQ ID N°: 9 (LU1) ter um tamanho de 1,5 kb e, ao mesmo tempo, o produto resultante da PCR utilizando os promotores das SEQ ID N°: 10 (KM2) e SEQ ID N°: 11 (LU2) ter um tamanho de 1,7 kb. A posição de cada promotor é ilustrada na FIG. 3. A variante mutante de M. succiniciproducens LK foi construída através da disrupção do gene de ldhA no genoma de M. succiniciproducens MBEL55E de acordo com o método acima.
Exemplo 3: Construção de vetor de troca de genes (pPTA-sacB) para a disrupção de pta e ackA
A fim de provocar a disrupção de pta e ackA no genoma da variante de M. succinicproducens LK através de recombinação homóloga, um vetor de troca genética foi construído da seguinte maneira. Um vetor pKmobsacB contendo um gene de sacB, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 12 e SEQ ID N°: 13. 0 produto sacB resultante foi clivado com PstI e BamHI e inserido em pUC19 (Stratagene Cloning Systems. USA), construindo, assim, pUC19-sacB (FIG.4).
SEQ ID N°: 12: 5'-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG SEQ ID N°: 13: 5'-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC
Enquanto isso, o DNA genômico de M. succiniciproducens LK, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 14 e SEQ ID N°: 15, e o fragmento de PCR resultante contendo a região homóloga 1 de pta-ackA foi clivado com Xbal e BamHI. Adicionalmente, o DNA genômico de M. succiniciproducens LK, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, o fragmento de PCR resultante contendo a região homóloga 2 de pta-ackA foi clivado com Xbal e Saci. A seguir, esses fragmentos foram inseridos no sítio BamHI e Saci de pUCl9, construindo, assim, pUC19-PTA12.
SEQ ID N°: 14: 5'-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC SEQ ID N°: 15: 5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG SEQ ID N°: 16: 5'-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCA TGTTTCC
SEQ ID N°: 17: 5'-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC A fim de inserir um gene resistente a espectinomicina (GenBank X02588; SpR) como um marcador seletivo em pUC19-PTA12, o plasmídeo pIC156 (Steinmetz et ai., Gene, 142:79, 1994) contendo um gene resistente a espectinomicina (GenBank X02588), como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 18 e SEQ ID N°: 19, e o fragmento de PCR resultante contendo um gene de SpR foi clivado com EcoRV e introduzido no pUC19-PTA12, construindo, assim, pUC19-PTAlS2 tendo o gene resistente a espectinomicina. 0 pUC19-PTAlS2 construído foi clivado com Saci e BamHI e introduzido no pUC19-SacB construído acima, construindo, assim, um vetor de troca (pPTA-sacB) para a disrupção de pta e ackA (FIG. 4).
SEQ ID N°: 18: 5'-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC SEQ ID N° : 19: 5' -CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC
Exemplo 4: Construção da variante de M.
succiniciproducens PALK
Uma variante mutante foi construída através da disrupção dos genes de pta e ackA no genoma de M. succiniciproducens LK utilizando pPTA-sacB, um vetor de troca para a disrupção de genes de fosfotransacetilase (pta) e acetato quinase (ackA) construídos no Exemplo 3 (FIG. 4).
Em outras palavras, M. succiniciproducens LK construído no Exemplo 2 foi aderido ao meio LB-glicose ágar contendo 10 g/L de glicose, e cultivado a 37°C por 36 horas. A colônia formada foi inoculada em 10 ml de meio líquido de LB-glicose, e cultivada por 12 horas. 1% do caldo da cultura, suficientemente cultivado, foi inoculado em 100 ml de meio líquido de LB-glicose, e cultivado em uma incubadora de agitação a 200 rpm e 37°C.
Um concentrado de células foi coletado do caldo da cultura resultante da mesma maneira como descrito no Exemplo 2. 0 concentrado de células coletado foi misturado ao vetor de troca genética pPTA-sacB construído no Exemplo 3 e, a seguir, pPTA-sacB foi introduzido no M. succiniciproducens LK através de eletroporação sob condições de 2,5 kV, 50 μΡ e 200 ohms. Adicionaram-se 800 ml de meio líquido de LB-glicose à variante introduzida pPTA-sacB, e pré-cultivado em um termostato a 37°C por uma hora e meia. A fim de induzir um cruzamento duplo, o caldo da cultura foi aderido em um meio sólido de sacarose TSB (meio sólido de Tryptic Soy Broth (Caldo de Soja de Trípico) (Becton, Dickinson and Company) contendo 100 g/L de sacarose) contendo um antibiótico espectinomicina (concentração final de 50 μρ/πιΐ) e cultivado a 37°C por 48 horas ou mais. A fim de analizar uma colônia onde apenas aconteceu cruzamento duplo, as colônias formadas foram colocadas em faixas em um meio de sacarose TSB contendo espectinomicina de 50 μρ/ιηΐ e meio de TSB ágar contendo ampicilina de 50 pg/ml, respectivamente, e cultivadas a 37°C por 12 horas. A seguir, as colônias, formadas no meio de sacarose TSB contendo espectinomicina de 50 μg/ml, mas não formadas no meio de TSB contendo ampicilina de 50 μg/ml, foram selecionadas e colocadas em faixas mais uma vez no meio de sacarose TSB contendo espectinomicina de 50 μ9/ηι1. As colônias formadas aqui foram analisadas outra vez utilizando o meio contendo espectinomicina e o meio contendo ampicilina e, a seguir, as colônias que apresentaram os resultados desejados foram finalmente selecionadas. 0 DNA genômico mutante isolado, como um modelo, foi amplificado através de PCR e o produto de PCR foi submetido à eletroforese para confirmar a disrupção de pta-ackA.
Para confirmar a disrupção do gene de IdhA, realizaram-se PCRs duas vezes da seguinte maneira. Primeiro, o DNA genômico mutante, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 20 e SEQ ID N°: 21. A seguir, o DNA genômico mutante, como um modelo, foi submetido a PCR utilizando promotores expressos nas SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 23.
SEQ ID N°: 20: 5'-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC (SPl) SEQ ID N°: 21: 5' -GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC (PAU1) SEQ ID N° : 22:5' -GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG (SP2) SEQ ID N°: 23:5' -GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG ( PAD2) Os produtos obtidos nas duas PCRs foram submetidos à eletroforese de gel para confirmar a disrupção de pta-ackA pelo seu tamanho (FIG. 6) . A disrupção de pta-ackA foi confirmada pelo fato do produto resultante da PCR utilizando os promotores das SEQ ID N°: 20 e SEQ ID N°: 21 (promotor SPl e promotor PAU1) ter um tamanho de 1,1 kb, e ao mesmo tempo, o produto resultante da PCR utilizando os promotores das SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 23 (promotor SP2 e promotor PAD2) ter um tamanho de 1,5 kb. A posição de cada promotor é ilustrada na FIG. 5. A variante mutante construída pela disrupção de pta-ackA do genoma de M. succiniciproducens LK, como o método descrito acima, isto é, uma variante mutante resultante da disrupção de IdhA, pta e ackA do genoma de M. succiniciproducen, foi batizada "M. succiniciproducens PALK" e depositada sob o número de acessão "KCTC10973BP" no 26 de julho de 2006 na Coleção Coreana para Culturas de Tipos (KCTC; 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon-si, República da Coréia), Instituto Coreano de Pesquisa de Biociência e Biotecnologia, que é uma autoridade depositária internacional.
Exemplo 5: Produção de ácido homossuccinico utilizando M. succiniciproducens PALK M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) construída no Exemplo 4 foi aderida em 10 ml do meio de composição contendo 5 g/L de glicose, e cultivada em condições anaeróbicas a 39°C por 8 horas e, a seguir, transferida novamente para 250ml do meio de composição contendo 5 g/L de glicose e cultivada a 39°C. Então, adicionou-se espectinomicina de 50 μρ/ιηΐ ao meio como um antibiótico. 250ml do caldo da cultura de M. succiniciproducens PALK foram inoculados no biorreator contendo 2,25L do meio de composição (lg/L de NaCl, 2g/L de (NH4)2HP04, 0, 02g/L de CaCl2-2H20, 0.2g/L de MgCl2· 6H20, 8,709 g/L de K2HP04, 0,5g/L de cisteína, 0,5g/L de metionina, 0,5g/L de alanina, 0,5g/L de asparaginas, 0,5g/L de ácido aspártico, 0,5g/L de pralina, 0,5g/L de serina, 0,005g/L de ácido nicotínico, 0,005g/L de Ca-pantoa seguirata, 0,005g/L de piridoxina·HC1, 0,005g/L de tiamina, 0,005g/L de ácido ascórbico, e 0,005g/L de biotina), e realizou-se a fermentação sob condições de uma primeira concentração de glicose de 18,2g/L (lOOmM), uma primeira concentração de glicerol de 9,2g/L (lOOmM) a 39°C. Durante a fermentação, o pH da cultura foi regulado em 6,5 utilizando água amoniacal, e adicionou-se espectinomicina de 50 μρ/ml ao meio como um antibiótico. A fim de produzir ácido succínico com elevada concentração, sempre que a glicose estava totalmente esgotada, a concentração de glicose do caldo da cultura era ajustada para aproximadamente 18,2g/L (lOOmM) adicionando uma solução concentrada de glicose. M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) e . a variante mutante produtora de ácido succínico M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) foram fermentadas para produzir ácido succínico da mesma maneira que descrito acima. A concentração de células no caldo da cultura foi medida com um espectrofotômetro e, a seguir, calculada utilizando a absorção de luz do espectrofotômetro previamente medida e o teste de verificação referente ao peso de células secas. Durante a fermentação, coletaram-se amostras regularmente do biorreator. As amostras coletadas foram centrifugadas a 13.000 rpm por 10 minutos e, a seguir, os supernatantes foram utilizados para analisar as concentrações de ácidos orgânicos, glicose, e glicerol utilizando uma Cromatografia Líquida de Alto Desempenho.
Como resultado, ao comparar M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) da presente invenção a M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) e M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), apresentou produtividade mais elevada de ácido succínico, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico como subprodutos do que M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) e M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) como ilustra a FIG. 7 e a Tabela 2. Embora se detectou 0,45g/L de ácido acético e 0,24g/L de ácido pirúvico, é evidente para um perito na técnica que essas quantidades são as quantidades mínimas de ácidos orgânicos produzidos para uma variante crescer e podem ser ignoraras pois foram produzidas em quantidades menor5es do que 1 % do peso em comparação ao ácido succínico produzido.
Tabela 2 Produtividade de ácido succínico de M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Como descrito e propiciado acima detalhadamente, apresente invenção propicia o microorganismo mutante produtor de ácido succínico tendo uma alta taxa de crescimento, que produz ácido succínico a uma elevada concentração, enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico durante a cultura em condições anaeróbicas, e o método para a produção de ácido succínico utilizando o mesmo. 0 microorganismo mutante objeto da invenção possui a capacidade de ter uma alta taxa de crescimento e produtividade de ácido succínico, enquanto produz poucos ou nenhum ácido orgânico, em comparação com as variantes produtoras de ácido succínico anteriores. Portanto, o microorganismo mutante inventivo é útil para produzir ácido succínico para uso industrial.
Enquanto a presente invenção foi descrita com referência a características específicas, será evidente para peritos na técnica que essa descrição é apenas para uma concretização recomendada e não limita o escopo da presente invenção. Desse modo, o escopo substancial da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas e equivalentes das mesmas.
REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. Mutante bacterial de rúmen carente de um gene de lactato deshidrogenasa [IdhA), de um gene de fosfotransacetila.se ipta], e de um gene de acetato quinase [ackA) em um microorganismo do gênero Mannbeímia succinicipoducens caracterizado pelo fato de ser um gene de pimvato formato-liase (p/í) mantido no dito microorganismo, produzindo ácido succínico a uma elevada concentração enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróblcas.
2. Mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as bactérias de rúmen são variedades de fermentações homogêneas produzindo ácido succíníco, enquanto produzem poucos ou nenhum outro ácido orgânico como subprodutos.
3. Mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo Cato de as quantidades de outros ácidos orgânicos produzidos são menores do que 1% em peso baseado na quantidade de ácido succíníco produzido.
4. Mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito outro ácido orgânico é escolhido a partir de um grupo que consiste de ãeido láctico, ácido acético, ácido fõrmico e ácido pirúvico.
5. Mutante bacterial de rúmen Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP), carente de um gene de lactato deshidrogenasa (IdhA], um gene de fosfotransacetilase (ptn) e um gene de acetato quínase {ackA} em Mannheimia succiniciproducens, enquanto apenas um gene de piruvato formato-liase {ρβ} é mantido em Mannheimia succiniciproducens, caracterizado por produzir ácido succinico a uma elevada concentração enquanto produz poucos ou nenhum outro ácido orgânico em condições anaeróbicas.
6. Método para a produção de mutante bacterial de rúmen da reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: (aj obtenção de um mutante bacterial de rúmen carente de um gene codificando lactato deshidrogenasa {IdhA} através da disrupção de um gene codificando lactato deshidrogenasa {IdhA} no genoma de ácido succínico produzindo bactérias de rúmen, utilizando recombínação homóloga; e (b) obtenção de um mutante bacterial de rúmen carente de um gene codificando lactato deshidrogenasa {IdhA), um gene codificando fosfotransacetilase (pta) e um gene codificando acetato quina se {ackA) através da disrupção de um gene codificando fosfotransacetilase (pta) e um gene codificando acetato quinase {ackA) no genoma do mutante bacterial de rúmen carente de um gene codificando lactato deshidrogenasa {IdhA) através de recombinaçâo homóloga.
7. Método para a produção do mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a recombinaçâo homóloga da etapa (a) é realizada utilizando um vetor de troca genética contendo um IdhA rompido.
8. Método para a produção do mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a recombinaçâo homóloga da etapa (b) ê realizada utilizando um vetor de troca genética contendo um pta- ackA rompido.
9. Método para a produção do mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o vetor de troca genética contendo um IdhA rompido é pMLKO-sacB.
10. Método para a produção do mutante bacterial de rúmen, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o vetor de troca genética contendo um pta-ackA rompido é pMPKO-sacB.
11. Método para a produção de ácido succínico, caracterizado por compreender as etapas de cultivo do mutante bacterial de rúmen de qualquer uma. das reivindicações entre as reivindicações 1-4 em condições anaeróbicas e recuperar o ácido succínico do caldo da cultura.
12. Método para a produção de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que glicose ou glicerol é utilizada como uma fonte de carbono para a cultura.
13. Método para a produção de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as quantidades de outros ácidos orgânicos produzidos como subprodutos são menores do que 1% em peso baseado na quantidade de ácido succínico produzido.
14. Método para a produção de ácido succínico caracterizado por compreender as etapas de cultivo do mutante bacterial de rúmen Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) em condições anaeróbicas e recuperação do ácido succínico do caldo da cultura.
15. Método para a produção de ácido succínico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que glicose ou glicerol é utilizado como uma fonte de carbono para a cultura.
16. Método para a produção de ácido succínico, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de a quantidade de outros ácidos orgânicos produzidos como subprodutos é menor do que 1% em peso, baseado nas quantidades de ácido succínico produzido.
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