ES2464159T5 - Microorganismo modificado por ingeniería genética novedoso que produce ácido homosuccínico y método para preparar ácido succínico usando el mismo - Google Patents

Microorganismo modificado por ingeniería genética novedoso que produce ácido homosuccínico y método para preparar ácido succínico usando el mismo Download PDF

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Description

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DESCRIPCION
Microorganismo modificado por ingeniena genetica novedoso que produce acido homosuccmico y metodo para preparar acido succmico usando el mismo
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un mutante bacteriano del rumen que produce acido homosuccmico y a un metodo para preparar acido homosuccmico usando el mismo, y mas particularmente a un mutante bacteriano del rumen que produce acido succmico a alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, que se obtiene alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (Idha), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA), sin alterar un gen que codifica para piruvato formiato liasa (pfl), asf como a un metodo para preparar acidos succmicos usando el mismo.
Tecnica anterior
El acido succmico (HOOCCH2CH2COOH), un acido dicarboxflico que consiste en 4 carbonos, es un acido organico que tiene muchas utilidades, que se usa ampliamente como precursor de medicamentos, alimentos, cosmeticos y productos qmmicos de otras industrias (Zeikus et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 51:545, 1999; Song et al., Enzyme Microbial Technol., 39:352, 2006). Particularmente, se espera que aumente drasticamente la demanda de acido succmico como fuente principal de macromoleculas biodegradables, con el ultimo aumento brusco de los precios del petroleo (Willke et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 66:131, 2004).
Puede producirse acido succmico mediante smtesis qmmica y fermentacion. Sin embargo, la mayor parte del acido succmico para uso industrial se produce actualmente a traves de metodos de smtesis qmmica usando n-butano y acetileno derivados del petroleo como material de partida por compares qmmicas chinas, compares qmmicas japonesas y grandes comparuas qmmicas tales como BASF, DuPont, BP chemical etc., pero solo una pequena cantidad de acido succmico para uso especial tal como medicamentos, etc. se produce mediante el metodo de fermentacion microbiana tradicional. Los metodos de smtesis qmmica mencionados anteriormente tienen el problema de liberar grandes cantidades de desechos peligrosos, efluentes y gas de desecho (por ejemplo, CO, etc.) generados durante el proceso de produccion de acido succmico. Particularmente, se usan como material basico combustibles fosiles que tiene una alta posibilidad de agotarse y por tanto hay una necesidad urgente de desarrollar un metodo para preparar acidos succmicos reemplazando los combustibles fosiles por combustibles alternativos tales como recursos renovables.
Para superar estos problemas provocados por el proceso de smtesis qmmica para preparar acido succmico, muchos investigadores han realizado de manera intensiva y amplia estudios sobre la produccion de acidos succmicos mediante fermentacion microbiana usando diversos recursos renovables. Los microorganismos que se han usado en la produccion de acido succmico vanan, pero pueden clasificarse generalmente en Escherichia coli recombinante y bacterias del rumen (Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia, Succinimonas, Succinivibrio, etc.) (Song et al., Enzyme Microbial Technol, 39:352, 2006).
Entre los estudios sobre la produccion de acidos succmicos usando E. coli recombinante, hubo un intento de aumentar la produccion de acido succmico preparando un mutante AFP111 (n.° de la ATCC 202021) obtenido a traves de un metodo en el que se manipula el gen de transporte de glucosa (ptsG) mientras que se eliminan los genes (Idh y pfl) que estan implicados en la produccion de acido lactico y acido formico en E. coli, por el equipo de investigacion de la Universidad de Chicago (patente estadounidense n.° 5.770.435).
Los presentes inventores han amplificado un gen de enzima malica (sfcA) implicado en la produccion de acido succmico, en E. coli recombinante, cepa NZN111, de la que se eliminan los genes Idh y pfl, para suprimir el acido piruvico acumulado en el proceso de fermentacion de la cepa NZN111, aumentando asf la produccion de acido succmico (Hong et al., Biotechnol. Bioeng., 74:89, 2001). Tambien, un equipo de investigadores dirigidos por la Universidad de Georgia ha construido una cepa AFP111/pTrc99A-pyc que expresa un gen de piruvato carboxilasa (pyc) en la cepa AFP111, y entonces usaron esta cepa en la produccion de acido succmico (Vemuri et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol, 28:325, 2001). Recientemente, para inducir la produccion de acido succmico en condiciones anaerobias, un equipo de investigadores dirigidos por la Universidad de Rice notificaron que habfan construido cepas de E. coli recombinante manipulando genes implicados en rutas de glicolisis, ciclo de TCA y glioxilato (Lin et al., Eng., 7:116, 2005; Lin et al., Biotechnol. Bioeng., 90:775, 2005).
Una cepa de Actinobacillus, una cepa de Anaerobiospirillum y una cepa de Mannheimia, que son una clase de bacterias del rumen, se sabe que son excelentes en la produccion de acido succmico, de modo que se han realizado activamente estudios sobre las cepas. Un equipo de investigadores dirigidos por el Instituto Biotecnologico de Michigan (MBI) en America descubrio Actinobacillus succinogenes cepa 130Z (n.° de la ATCC 55618) para desarrollar un metodo para producir acido succmico, y construyo diversas cepas mutantes de Actinobacillus succinogenes, usando mutagenesis qmmica tradicional para su uso en el desarrollo de un procedimiento para producir y purificar acido succmico (patente estadounidense n.° 5.521.075; patente estadounidense n.° 5.168.055; patente estadounidense n.° 5.143.834).
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Sin embargo, el procedimiento de produccion de acido succmico usando fermentacion microbiana, desarrollado hasta ahora, tiene una productividad muy baja de menos de 2 g/l/h, y especialmente incurre en un gran coste para separar y purificar el acido succmico porque se produce acido succmico junto con grandes cantidades de diversos acidos organicos y etanol como subproductos en algun grado durante la fermentacion. Aunque los resultados mencionados anteriormente mostraron un efecto de disminucion de acido lactico, acido formico, acido acetico y etanol como subproductos en algunas cepas recombinantes, no mostraron una eliminacion completa de los mismos. Ademas, en otras cepas mutantes recombinantes, habfa algunos casos en los que las tasas de crecimiento de las mismas se han vuelto tan bajas que la productividad de acido succmico global no aumento. Por tanto, hay una demanda urgente de desarrollar una cepa productora de acido succmico novedosa, que tenga una alta productividad de acido succmico y evite la produccion de subproductos (Hong et al., Biotechnol. Lett., 22:871, 2000).
Para desarrollar una cepa productora de acido succmico novedosa para satisfacer las demandas anteriores, debe tener prioridad el aislamiento de una cepa que tenga una excelente productividad de acido succmico, la complecion de la secuencia genomica de la misma, la comprension de las caractensticas metabolicas de la misma y el establecimiento de una tecnica de manipulacion genetica requerida para la construccion de una cepa recombinante. Hasta ahora, en el caso de bacterias del rumen que tienen alta productividad de acido succmico, se completo la secuencia genomica completa de la cepa M. succiniciproducens MBEL 55E, pero las de bacterias del rumen tales como Actinobacillus, Anaerobiospirillum etc. aun no se han notificado. Aunque se ha notificado un intento de tratar de producir acidos succmicos amplificando el gen de fosfoenolpiruvato carboxicinasa (pckA) de A. succinogenes y A. succiniciproducens en E. coli (Kim et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:1238, 2004; Laivenieks et al., Appl. Environ. Microbiol., 63:2273, 1997), no se ha intentado tratar de desarrollar una cepa de produccion de acido succmico recombinante basandose en la secuencia genomica.
Los presentes inventores han notificado que aislaron M. succiniciproducens MBEL 55E (KCTC0769BP) produciendo acido succmico con alta eficacia a partir de ganado nativo coreano, y completaron la secuencia genomica y caracterizaron las propiedades metabolicas de la cepa (Hong et al., Nature Biotechnol, 22: 1275, 2004). Ademas, los presentes inventores han construido un mutante bacteriano, M. succiniciproducens LPK (KCTC10558BP) alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha) y un gen que codifica para piruvato formiato-liasa (pfl) en M. succiniciproducens MBEL 55E que es una clase de bacteria del rumen para inhibir la produccion de acidos lacticos y acidos formicos. Ademas de eso, las presentes invenciones han construido un mutante M. succiniciproducens LPK7 (KCTC1062BP) alterando un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en la cepa mutante, M. succiniciproducens LPK para inhibir la produccion de acido acetico, para cultivar los mutantes bacterianos en condiciones anaerobias (documento WO 05/052135 A1; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006), aumentando por tanto el acido succmico. Sin embargo, en el caso de tales cepas mutantes, aunque pudo suprimirse la produccion de subproductos, acido formico y acido acetico en algun grado, se acumulaban una gran cantidad de acidos piruvicos como subproducto durante la fermentacion, sobre todo, la tasa de crecimiento de la cepa se ha vuelto tan baja en comparacion con una cepa silvestre que no podfa lograrse una excelente productividad de acido succmico.
Mientras tanto, se notifico que un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) participa en la conversion de acido piruvico en acetil coenzima A (acetil-CoA), afectando asf al crecimiento celular y la redistribucion de acido piruvico (Wolfe, Microbial. Mol. Biol. Rev., 69:12, 2005).
El documento W02007/030830 da a conocer determinados metodos y organismos para la produccion de succinato acoplada al crecimiento.
Por consiguiente, los presentes inventores han hecho esfuerzos extensos para construir un microorganismo mutante que pueda producir acidos homosuccmicos a un alto rendimiento minimizando la disminucion en la tasa de crecimiento microbiano e inhibiendo completamente la formacion de diversos subproductos incluyendo acidos piruvicos y para desarrollar un metodo de fermentacion del mismo, y como resultado, han construido un mutante bacteriano M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) alterando un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) sin alterar un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) en M. succiniciproducens MBEL55E que es una clase de bacteria del rumen, y entonces fermentaron la cepa mutante en condiciones anaerobias usando glucosa y glicerol como fuentes de carbono, y confirmaron que la cepa mutante puede producir acido casi homosuccmico a un alto rendimiento, completando de ese modo la presente invencion.
Sumario de la invencion
Por tanto, es un objeto de la presente invencion proporcionar un microorganismo mutante que tiene alta tasa de crecimiento y productividad de acido succmico y produce solo acido succmico a un alto rendimiento mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos durante el periodo de fermentacion anaerobia.
Otro objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo para producir acido homosuccmico sin la acumulacion de otros subproductos, cultivando el microorganismo mutante usando glucosa y glicerol como fuentes de carbono en condiciones anaerobias.
Un aspecto de la invencion se refiere a un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato
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deshidrogenasa (IdhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) mientras que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir solo acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para producir acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano del rumen anterior en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) mientras que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir acido succmico a alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) alterando el gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum, usando recombinacion homologa; y
(b) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando el gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma del mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) usando recombinacion homologa.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para preparar acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
La presente solicitud tambien da a conocer un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en un microorganismo que produce acido succmico mientras que solo se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) en el microorganismo que produce acido succmico, que tiene la propiedad de producir solo acido succmico a alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Ademas, la presente solicitud da a conocer un mutante bacteriano del rumen Mannhimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldha), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en M. succiniciproducens mientras que se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) en M. succiniciproducens, que tiene la propiedad de producir acido succmico a alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Adicionalmente, la presente solicitud da a conocer un metodo para producir un microorganismo mutante, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) obtener un mutante bacteriano del rumen que carece del gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha) alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) del genoma de la bacteria del rumen productora de acido succmico usando recombinacion homologa; y (b) obtener un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA), del genoma del mutante bacteriano del rumen que carece del gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA), mediante recombinacion homologa.
Ademas, la presente solicitud da a conocer un metodo para producir acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar los mutantes bacterianos del rumen en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
Otras caractensticas y realizaciones de la presente invencion se aclararan mas a partir de las siguientes descripciones detalladas y reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquematico que muestra la ruta de produccion de acido succmico en el microorganismo mutante segun la presente invencion.
La figura 2 muestra un procedimiento de construccion de un vector de reemplazamiento para alterar ldhA (pMLKO- sacB) mediante recombinacion homologa.
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La figura 3 muestra un procedimiento de construccion de un mutante bacteriano (M. succiniciproducens LK) alterando el gen IdhA en Mannheimia succiniciproducens MBEL55E mediante recombinacion homologa.
La figura 4 muestra un procedimiento de construccion de un vector de reemplazamiento para alterar pta y ackA (pPTA-sacB) mediante recombinacion homologa.
La figura 5 muestra un procedimiento de construccion de un mutante bacteriano (M. succiniciproducens PALK) alterando los genes IdhA y pta-ackA en M. succiniciproducens LK mediante recombinacion homologa.
La figura 6 es una fotograffa de electroforesis que muestra la alteracion de pta-ackA en M. succiniciproducens PALK, en la que M representa un marcador de 1 kb; los carriles 1-6 representan fragmentos de PCR (1,1 kb) usando los cebadores PAU1 y SP1; los carriles A-F representan fragmentos de PCR (1,5 kb) usando los cebadores SP2 y PAD2.
La figura 7 muestra las caractensticas de cultivo de M. succiniciproducens PALK de la invencion en condiciones anaerobias saturadas con CO2.
Descripcion detallada de la invencion y realizaciones preferidas
Un aspecto de la invencion se refiere a un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) mientras que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir solo acido succmico a una concentracion alta mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum.
Una descripcion adicional se refiere a un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en un microorganismo que produce acido succmico mientras que solo se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) en el microorganismo del rumen que produce acido succmico, que tiene la propiedad de producir solo acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
En la presente invencion, el microorganismo productor de acido succmico se refiere a un microorganismo del rumen que puede producir una gran cantidad excesiva de acido succmico en comparacion con la produccion de etanol u otros acidos organicos, que puede usarse para uso industrial en la produccion de acido succmico mediante fermentacion.
Los microorganismos productores de acido succmico tfpicos son bacterias del rumen. A partir de informacion genetica parcial (ARNr 16s), analisis enzimatico y resultados de fermentacion de Actinobacillus succinogenes, Anaerobiospirillum succiniciproducens que son una clase de bacterias del rumen, y diversas bacterias del rumen que se sabe que producen acido succmico hasta ahora, se encontro que la principal ruta de biosmtesis para la produccion de acido succmico a partir de una fuente de carbono en bacterias del rumen es casi identica a la ruta de biosmtesis para la produccion de acido succmico en Mannheimia sp. que es una clase de bacteria del rumen (tabla 1; Van der Werf et al., Arch Microbiol., 167:332, 1997; Laivenieks et al., Appl Environ. Microbiol., 63:2273, 1997; Samuelov et al., App. Environ. Microbiol., 65:2260, 1999; Kim et al., Appl Environ. Microbiol., 70:1238, 2004). Especialmente todas las bacterias del rumen que estan implicadas en la produccion de acido succmico convierten fosfoenolpiruvato y piruvato, compuestos C3 en oxalacetato y malato, compuestos C4 usando enzima fijadora de CO2 con la produccion de acido succmico, produciendo asf acido succmico. Ademas, las bacterias del rumen producen acido acetico, acido formico y acido lactico como subproductos de fermentacion en condiciones anaerobias, lo que sugiere por tanto que todas las bacterias del rumen incluyendo Mannheimia sp. tienen la misma ruta para la biosmtesis de acido succmico.
Tabla 1
Bacterias del rumen productoras de acido succmico
Cepa
Referencias
Cytophaga succinicans
Anderson et al., J. Bacteriol., 81:130, 1961
Fibrobacter succinogens
Wood et al., J. Cereal. Sci., 19:65, 1994
Ruminococcus flavefaciens
lannotti et al., Appl. Environ. Microbiol., 43:136, 1973
Succinimonas amylolytica
Bryant, Bacteriol. Rev., 23:125, 1959
Succinivibrio dextrinisolvens
Bryant, Bacteriol. Rev., 23:125, 1959
Actinobacillus succinogenes
Glutter et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 49:207, 1999
Mannheimia succiniciproducens
Hong et al., Nature Biotechnol., 22:1275, 2004
En la presente invencion, se construyo un microorganismo del rumen mutante productor de acido succmico con una alta tasa de crecimiento, que puede producir acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos, manipulando el genoma de bacterias del rumen que son un microorganismo productor de acido succmico. En otras palabras, se alteraron un gen de lactato deshidrogenasa (ldha), un gen de
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fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en el ADN genomico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP), construyendo de ese modo un mutante bacteriano M. succiniciproducens pAlK (KCTC10973BP) que muestra una alta tasa de crecimiento y produce acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos.
En la presente invencion, para la alteracion de cada gen, se uso un metodo de sustitucion de los genes mediante recombinacion homologa para inactivar, pero puede usarse cualquier metodo sin limitaciones siempre que sea un metodo de manipulacion genetica en el que el gen correspondiente pueda modificarse o eliminarse, de manera que no se genere una enzima codificada por el gen correspondiente.
En la presente invencion, las bacterias del rumen se seleccionan del grupo que consiste en Mannheimia sp., Actinobacillus sp. y Anaerobiospirillum sp.
En la presente invencion, el microorganismo mutante es preferiblemente una cepa de fermentacion homogenea que produce solo acido succmico mientras que forma poco o nada de otros acidos organicos como subproductos, las cantidades de otros acidos organicos producidos son preferiblemente inferiores al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succmico producido, y los otros acidos organicos son preferiblemente uno cualquiera o mas acidos organicos seleccionados del grupo que consiste en acido lactico, acido acetico, acido formico y acido piruvico.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) mientras que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
Una descripcion adicional se refiere a un mutante bacteriano del rumen M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) en M. succiniciproducens mientras que se mantiene un gen de piruvato formiato-liasa (pfl) en M. succiniciproducens, que tiene la propiedad de producir acido succmico a una alta concentracion mientras que se produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
El mutante bacteriano M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), que se construyo alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldha), un gen que codifica para piruvato formiato-liasa (pfl), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma de Mannheimia sp., se uso para comparar la productividad de acido succmico y tasa de crecimiento de M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) segun la presente invencion con las de mutantes bacterianos tradicionales. En el presente documento, el mutante bacteriano M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) tiene una alteracion adicional de un gen que codifica para piruvato formiato-liasa (pfl) en la cepa mutante M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) segun la presente invencion (documento WO2005/052135; Lee et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:1939, 2006).
M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) segun la presente invencion tiene una alta productividad de acido succmico y produce poco o nada de subproductos tales como acido lactico, acido acetico, acido formico y acido piruvico, mostrando por tanto excelentes propiedades en comparacion con M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) silvestre para la produccion de acido succmico y el mutante bacteriano previamente construido M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), y puede producir acido succmico a altos rendimientos debido a la alta tasa de crecimiento del mismo, alta productividad de acido succmico y produccion de acido homosuccmico evitando la acumulacion de acido piruvico, en comparacion con el mutante bacteriano previamente construido M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP).
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) alterando el gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum, usando recombinacion homologa; y
(b) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando el gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma del mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) usando recombinacion homologa.
Todavfa otra descripcion se refiere a un metodo para construir un microorganismo mutante, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) obtener un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) alterando un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) en el genoma de bacterias del rumen productoras de acido succmico usando recombinacion homologa; y (b) obtener un mutante bacteriano del rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen que codifica para
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fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma del mutante bacteriano del rumen que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (IdhA) mediante recombinacion homologa.
En la presente invencion, la recombinacion homologa de la etapa (a) se lleva a cabo preferiblemente usando un vector de intercambio genetico que contiene un IdhA alterado, y la recombinacion homologa de la etapa (b) se lleva a cabo preferiblemente usando un vector de intercambio genetico que contiene un pta-ackA alterado.
En la presente invencion, el vector de intercambio genetico que contiene un IdhA alterado es preferiblemente pMLKO-sacB, y el vector de intercambio genetico que contiene un pta-ackA alterado es preferiblemente pMPKO- sacB.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para producir acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el microorganismo mutante mencionado anteriormente en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
En la presente invencion, para el cultivo, se usa preferiblemente glucosa o glicerol como fuente de carbono, y las cantidades de otros acidos organicos producidos como subproductos son preferiblemente inferiores al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succmico producido.
Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para preparar acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
Aun otra descripcion se refiere a un metodo para preparar acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano del rumen en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
El cultivo del microorganismo mutante del rumen productor de acido succmico segun la presente invencion y el procedimiento de recuperacion del acido succmico pueden llevarse a cabo mediante los metodos de cultivo conocidos en el proceso de fermentacion convencional y metodos para separar y purificar acido succmico.
En la presente invencion, para el cultivo, se usa preferiblemente glucosa o glicerol como fuente de carbono, y las cantidades de otros acidos organicos producidos como subproductos son preferiblemente inferiores al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succmico producido.
Ejemplos
La presente invencion se describira a continuacion en el presente documento con mas detalles mediante ejemplos. Sin embargo, resultara obvio para un experto en la tecnica que estos ejemplos se facilitan solo para fines ilustrativos, y la presente invencion no se limita a o por los ejemplos.
Particularmente, los siguientes ejemplos ilustran solo Mannheimia sp. que es un microorganismo productor de acido succmico como celula huesped para delecionar los genes segun la presente invencion. Sin embargo, resulta obvio para un experto en la tecnica que puede obtenerse un microorganismo del rumen mutante que produce acido homosuccmico incluso cuando se usan otras clases de microorganismos del rumen productores de acido succmico.
Ejemplo 1: Construccion del vector de alteracion de IdhA (pMLKO-sacB)
Para alterar el gen de lactato deshidrogenasa (IdhA) en el genoma de un microorganismo productor de acido succmico mediante recombinacion homologa, se construyo un vector de intercambio genico de la siguiente manera. En primer lugar, se sometio el ADN genomico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), como molde, a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 a continuacion y, entonces, se corto el fragmento de PCR obtenido que contema la region 1 homologa a IdhA (L1) con SacI y Pstl y se introdujo en el vector pUC18 (New England Biolabs, Inc., EE.UU.), construyendo de ese modo pUC18-L1.
SEQ ID NO: 1: 5'-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG
SEQ ID NO: 2: 5'-CTTT ATCGAAT CT GCAGGCGGTTTCCAAAA
Ademas, se sometio el ADN genomico de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP), como molde, a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 a continuacion y, entonces, se corto el fragmento de PCR obtenido que contema la region 2 homologa a IdhA (L2) con Pstl y HindIII y se introdujo en el pUC18-L1, construyendo de ese modo pUC18-L1-L2.
SEQ ID NO: 3: 5'-GTACTGT AAACT GCAGCTTT CATAGTTAGC
SEQ ID NO: 4: 5'-GCCGAAAGTCAAGCTT GCCGTCGTTT AGT G
Para insertar el gen resistente a kanamicina como marcador de seleccion en el pUC18-L1-L2, se corto el vector
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pUC4K (Pharmacia, Alemania) con Pstl, y se fusiono el gen resistente a kanamicina resultante con pUC18-L1-L2 cortado con Pstl, construyendo de ese modo pUC18-L1-KmR-L2. Se inserto un ligador expuesto en SEQ ID NO: 5 en el pUC18-L1-KmR-L2 cortado con SacI, produciendo de ese modo un nuevo sitio de corte de Xbal.
SEQ ID NO: 5: 5'-TCTAGAAGCT
Para insertar el gen sacB en el pUC18-L1-KmR-L2 en el que se ha insertado el sitio de corte de Xbal, se llevo a cabo PCR en pKmobsacB (Schafer et al., Gene, 145:69, 1994) como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 6 y 7. Entonces se corto el fragmento de PCR resultante que contema el gen sacB con XbaI, y se inserto en el nuevo sitio de enzima de restriccion Xbal de pUC18-L1-KmR-L2 en el que se ha insertado el sitio de corte de Xbal anterior, construyendo de ese modo pMLKO-sacB, un vector de intercambio para alterar el gen IdhA (figura 2).
SEQ ID NO: 6: 5'-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG
SEQ ID NO: 7: 5'-GCTCT AGAGGCT ACAAAAT CACGGGCGT C
Ejemplo 2: Construccion de la cepa LK de M. succiniciproducens
Se construyo una cepa mutante alterando el gen ldhA en el genoma de M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) usando pMLKO-sacB construido en el ejemplo 1 como vector de intercambio genetico para alterar el gen ldhA (figura 3).
En otras palabras, se sembro en placa M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) en medio de agar LB- glucosa que contema 10 g/l de glucosa, y se cultivo a 37°C durante 36 horas. Se inoculo la colonia formada en 10 ml de medio lfquido de LB-glucosa, y se cultivo durante 12 horas. Se inoculo un 1% del caldo de cultivo, que se habfa hecho crecer suficientemente, en 100 ml de medio lfquido de LB-glucosa, y se cultivo en una incubadora con agitacion a 200 rpm y 37°C.
Cuando el caldo de cultivo alcanzo una DO600 de aproximadamente 0,3-0,4 tras 4~5 horas, se centrifugo a 4°C y 4.500 rpm durante 20 minutos para recoger las celulas. Entonces, se resuspendieron las celulas en 200 ml de disolucion de glicerol al 10% a 4°C. Se centrifugo la suspension a 4°C y 5.500 rpm durante 20 minutos, y se recogieron las celulas. Tras resuspender y recoger en la mitad de la disolucion de glicerol anterior dos veces de la misma manera que los procedimientos descritos anteriormente, se suspendieron las celulas en glicerol a una razon en volumen de 1:1, para obtener un concentrado celular.
Se mezclo el concentrado celular asf obtenido con el vector de intercambio genetico pMLKO-sacB construido en el ejemplo 1, y entonces se introdujo pMLKO-sacB en la M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) cultivada mediante electroporacion en condiciones de 1,8 kV, 25 |iF y 200 ohmios. Se anadio 1 ml de medio lfquido de LB- glucosa a la cepa con pMLKO-sacB introducido, y se cultivo previamente en una incubadora con agitacion a 37°C y 200 rpm durante una hora. Se sembro en placa el caldo de cultivo en medio solido de LB-glucosa que contema el antibiotico kanamicina (concentracion final de 25 |ig/ml) y se cultivo a 37°C durante 48 horas o mas. Para seleccionar una colonia en la que solo se produjo doble sobrecruzamiento, se sembraron en estnas las colonias formadas en medio solido de LB-sacarosa que contema kanamicina (25 |ig/ml) y sacarosa 100 g/l. Tras 24 horas, se sembraron en estnas de nuevo las colonias formadas en el mismo medio.
Se cultivaron las colonias (mutantes) formadas en el medio en medio lfquido de LB-glucosa que contema un antibiotico, y se aislo ADN genomico de la cepa cultivada mediante el metodo descrito en Rochelle et al. (Rochelle et al., FEMS Microbiol. Lett., 100:59, 1992). Se llevo a cabo PCR usando el ADN genomico del mutante aislado como molde, y se sometio a electroforesis el producto de PCR para confirmar la alteracion del gen ldhA en el ADN genomico.
Para confirmar la alteracion del gen ldhA, se llevaron a cabo PCR dos veces de las siguientes maneras. En primer lugar, se sometio a PCR el ADN genomico mutante como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
SEQ ID NO: 8: 5'-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC (KM1)
SEQ ID NO: 9: 5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC (LU1)
Entonces, se sometio a PCR el ADN genomico mutante como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
SEQ ID NO: 10: 5'-GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG (KM2)
SEQ ID NO: 11: 5'-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC (LD2)
Se sometieron los fragmentos de PCR obtenidos en las dos PCR a electroforesis en gel para confirmar la alteracion de ldhA por su tamano. Se confirmaron los fragmentos de PCR del ADN genomico que teman ldhA alterado mediante el hecho de que el producto que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 8 (KM1) y
SEQ ID NO: 9 (LU1) tiene un tamano de 1,5 kb, y mientras el producto que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 10 (KM2) y SEQ ID nO: 11 (LU2) tiene un tamano de 1,7 kb. La posicion de cada cebador se muestra en la figura 3.
Se construyo la cepa mutante M. succiniciproducens LK alterando el gen IdhA en el genoma de M. 5 succiniciproducens MBEL55E segun el metodo anterior.
Ejemplo 3: Construccion del vector de intercambio genico (pPTA-sacB) para la alteracion de pta y ackA
Para alterar pta y ackA en el genoma de la cepa LK de M. succiniciproducens mediante recombinacion homologa, se construyo un vector de intercambio genetico de la siguiente manera. Se sometio un vector pKmobsacB que contiene el gen sacB, como molde, a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 12 y sEq ID NO: 13. Se corto el 10 producto de sacB resultante con Pstl y BamHI y se inserto en pUC19 (Stratagene Cloning Systems. EE.UU.), construyendo de ese modo pUC19-sacB (figura 4).
SEQ ID NO: 12: 5'-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG
SEQ ID NO: 13: 5'-GTCCT GCAGGGCT ACAAAAT CACGGGCGT C
Mientras tanto, se sometio el ADN genomico de M. succiniciproducens LK como molde a PCR usando los cebadores 15 expuestos en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, y se corto el fragmento de PCR resultante que contema la region 1 homologa 1 a pta-ackA con XbaI y BamHl. Ademas, se sometio el ADN genomico de M. succiniciproducens LK como molde a PCR usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, y se corto el fragmento de PCR resultante que contema la region 2 homologa a pta-ackA con XbaI y SacI. Entonces, se insertaron estos fragmentos en el sitio BamHl y SacI de pUC19, construyendo de ese modo pUC19-PTA12.
20 SEQ ID NO: 14: 5'-GCTCT AGAT ATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC
SEQ ID NO: 15: 5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG
SEQ ID NO: 16: 5'-GGGGAGCTCGCT AACTTAGCTT CT AAAGGCCA
TGTTTCC
SEQ ID NO: 17: 5'-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC
25 Para insertar el gen resistente a espectinomicina (GenBank X02588; SpR) como marcador selectivo en pUC19- PTA12, se sometio a PCR el plasmido pIC156 (Steinmetz et al., Gene, 142:79, 1994) que contiene el gen resistente a espectinomicina (GenBank X02588), como molde, usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, y se corto el fragmento de PCR resultante que contema el gen SpR con EcoRV y se introdujo en el pUC19- PTA12, construyendo de ese modo pUC19-PTA1S2 que tiene el gen resistente a espectinomicina. Se corto el 30 pUC19-PTA1S2 construido con SacI y BamHl y se introdujo en el pUC19-SacB construido anteriormente, construyendo de ese modo un vector de intercambio (pPTA-sacB) para la alteracion de pta y ackA (figura 4).
SEQ ID NO: 18: 5'-GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC
SEQ ID NO: 19: 5'-CCCGGGCCGACAGGCTTT GAAGCAT GCAAAT GT CAC
Ejemplo 4: Construccion de la cepa PALK de M. succiniciproducens
35 Se construyo una cepa mutante alterando el gen pta y ackA en el genoma de M. succiniciproducens LK usando pPTA-sacB, un vector de intercambio para la alteracion del gen de fosfotransacetilasa (pta) y el gen de acetato cinasa (ackA) construido en ejemplo 3 (figura 4).
En otras palabras, se sembro en placa M. succiniciproducens LK construida en el ejemplo 2 en medio de agar LB- glucosa que contema 10 g/l de glucosa, y se cultivo a 37°C durante 36 horas. Se inoculo la colonia formada en 10 ml 40 de medio lfquido de LB-glucosa, y se cultivo durante 12 horas. Se inoculo un 1% del caldo de cultivo, que se habfa hecho crecer suficientemente, en 100 ml de medio lfquido de LB-glucosa, y se cultivo en una incubadora con agitacion a 200 rpm y 37°C.
Se recogio el concentrado celular del caldo de cultivo resultante de la misma manera que se describio en el ejemplo 2. Se mezclo el concentrado celular recogido con el vector de intercambio genetico pPTA-sacB construido en el 45 ejemplo 3, y entonces se introdujo pPTA-sacB en la M. succiniciproducens LK mediante electroporacion en condiciones de 2,5 kV, 50 |iF y 200 ohmios. Se anadieron 800 ml de medio lfquido de LB-glucosa a la cepa con pPTA-sacB introducido, y se cultivo previamente en un termostato a 37°C durante una hora y media. Para inducir un doble sobrecruzamiento, se sembro en placa el caldo de cultivo en medio solido de TSB-sacarosa (medio solido de caldo de soja tnptica (Becton, Dickinson and Company) que contiene 100 g/l de sacarosa) que contema el antibiotico 50 espectinomicina (concentracion final de 50 |ig/ml) y se cultivo a 37°C durante 48 horas o mas. Para seleccionar una colonia en la que solo se produjo doble sobrecruzamiento, se sembraron en estnas las colonias formadas en medio
de TSB-sacarosa que contema espectinomicina 50 |ig/ml y medio de agar TSB que contema ampicilina 50 |ig/ml, respectivamente, y se cultivaron a 37°C durante 12 horas. Entonces, se seleccionaron las colonias que se formaron en el medio de TSB-sacarosa que contema espectinomicina 50 |ig/ml pero que no se formaron en el medio de TSB que contema ampicilina 50 |ig/ml, y se sembraron en estnas de nuevo en el medio de TSB-sacarosa que contema 5 espectinomicina 50 |ig/ml. Se seleccionaron las colonias formadas en el presente documento de nuevo usando el medio que contema espectinomicina y el medio que contema ampicilina, y entonces se seleccionaron en ultima instancia las colonias que mostraban los resultados requeridos. Se amplifico el ADN genomico del mutante aislado como molde mediante PCR y se sometio a electroforesis el producto de PCR para confirmar la alteracion de pta- ackA.
10 Para confirmar la alteracion de pta-ackA, se llevaron a cabo PCR dos veces de la siguiente manera. En primer lugar, se sometio a PCR el ADN genomico mutante como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21. Entonces, se sometio a PCR el ADN genomico mutante como molde usando los cebadores expuestos en SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23.
SEQ ID NO: 20: 5'-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC (SP1)
15 SEQ ID NO: 21: 5'-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC (PAU1)
SEQ ID NO: 22:
5'-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG (SP2)
SEQ ID NO: 23:
5'-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG (PAD2)
20 Se sometieron los productos obtenidos en las dos PCR a electroforesis en gel para confirmar la alteracion de pta- ackA por su tamano (figura 6). Se confirmo la alteracion de pta-ackA por el hecho de que el producto que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 (cebador SP1 y cebador PAU1) tiene un tamano de 1,1 kb, y mientras el producto que resultaba de la PCR usando los cebadores de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23 (cebador SP2 y cebador PAD2) tiene un tamano de 1,5 kb. La posicion de cada cebador se muestra en la 25 figura 5.
La cepa mutante construida mediante la alteracion de pta-ackA del genoma de M. succiniciproducens LK como el metodo descrito anteriormente, es decir, una cepa mutante que resultaba de la alteracion de IdhA, pta y ackA del genoma de M. succiniciproducens, se denomino “M. succiniciproducens PALK” y se deposito con el numero de registro “KCTC10973BP” el 26 de julio de 2006 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC; 52, Eoeun-dong, 30 Yuseong-gu, Daejeon-si, Republica de Corea), Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, que es una autoridad depositaria internacional.
Ejemplo 5: Produccion de acido homosuccmico usando M. succiniciproducens PALK
Se sembro en placa M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) construida en el ejemplo 4 en 10 ml de medio de composicion que contema 5 g/l de glucosa, y se cultivo en condiciones anaerobias a 39°C durante 8 horas, y 35 entonces se cambio de nuevo a 250 ml de medio de composicion que contema 5 g/l de glucosa y se cultivo a 39°C. En este momento, se anadio espectinomicina 50 |ig/ml al medio como antibiotico. Se inocularon 250 ml del caldo de cultivo de M. succiniciproducens PALK en el biorreactor que contema 2,25 l de medio de composicion (1 g/l de NaCl, 2 g/l de (NH4)2HPO4, 0,02 g/l de CaCl2'2H2O, 0,2 g/l de MgCh^O, 8,709 g/l de K2HPO4, 0,5 g/l de cistema, 0,5 g/l de metionina, 0,5 g/l de alanina, 0,5 g/l de asparagina, 0,5 g/l de acido aspartico, 0,5 g/l de prolina, 0,5 g/l de serina, 40 0,005 g/l de acido nicotmico, 0,005 g/l de Ca-pantotenato, 0,005 g/l de piridoxinaHCl, 0,005 g/l de tiamina, 0,005 g/l
de acido ascorbico y 0,005 g/l de biotina), y se llevo a cabo la fermentacion en condiciones de una primera concentracion de glucosa de 18,2 g/l (100 mM), una primera concentracion de glicerol de 9,2 g/l (100 mM) a 39°C. Durante la fermentacion, se ajusto el pH del cultivo a 6,5 usando agua amoniacal, y se anadio espectinomicina 50 |ig/ml al medio como antibiotico. Para producir acido succmico a una alta concentracion, siempre que la glucosa 45 se agotaba completamente, se ajusto la concentracion de glucosa del caldo de cultivo a aproximadamente 18,2 g/l (100 mM) anadiendo disolucion de glucosa concentrada.
Se fermentaron M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) y la cepa mutante productora de acido succmico M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) para producir acido succmico de la misma manera que se describio anteriormente.
50 Se midio la concentracion de celulas en el caldo de cultivo con un espectrofotometro, y entonces se calculo usando la absorcion de luz medida previamente del espectrofotometro y la prueba de verificacion para peso de celulas secadas. Durante la fermentacion, se recogieron muestras del biorreactor regularmente. Se centrifugaron las muestras recogidas a 13.000 rpm durante 10 minutos, y entonces se usaron los sobrenadantes para analizar las concentraciones de acidos organicos, glucosa, y glicerol usando cromatograffa de lfquidos de alta resolucion.
5
10
15
20
25
30
35
Como resultado, cuando se compare M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) de la presente invencion con M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) y M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP), mostro una productividad mas alta de acido succrnico mientras que produda poco o nada de otros acidos organicos como subproductos que M. succiniciproducens MBEL55E (KCTC0769BP) y M. succiniciproducens LPK7 (KCTC10626BP) tal como se muestra en la figura 7 y la tabla 2. Aunque se detectaron 0,45 g/l de acido acetico y 0,24 g/l de acido piruvico, resulta obvio para un experto en la tecnica que estas cantidades son las cantidades mrnimas de acidos organicos producidos por una cepa para crecer y pueden ignorarse porque se produjeron en cantidades de menos del 1% en peso en comparacion con el acido succrnico producido.
Tabla 2
Productividad de acido succrnico de M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)
Cepa
MBEL55E (KCTC0769BP) LPK7 (KCTC10626BP) PALK (KCTC10973BP)
Concentracion final de acido succrnico (g/l)
10,49 13,40 45,79
Consumo de glucosa (g/l)
22,50 19,98 53,00
Rendimiento de acido succrnico (g de acido sucdnico/g de glucosa)
0,47 0,67 0,86
Tasa de aumento de acido succrnico en comparacion con la cepa silvestre (MBEL55E) (%)
- 42,55 82,98
Concentracion final de acido acetico (g/l)
4,96 0,53 0,45
Concentracion final de acido lactico (g/l)
3,47 0,27 0,00
Concentracion final de acido piruvico (g/l)
0,00 2,47 0,24
Tasa de crecimiento espedfico celular (1/h)
0,81 0,30 0,69
Aplicabilidad industrial
Tal como se describio y proporciono anteriormente en detalle, la presente invencion proporciona el microorganismo mutante del rumen productor de acido succrnico que tiene una alta tasa de crecimiento, que produce acido succrnico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos durante el cultivo en condiciones anaerobias, y el metodo para producir acido succrnico usando el mismo. El microorganismo mutante del rumen de la invencion tiene la capacidad de tener una alta tasa de crecimiento y productividad de acido succrnico mientras que produce poco o nada de acidos organicos, en comparacion con las cepas anteriores que producen acido succrnico. Por tanto, el microorganismo mutante del rumen de la invencion es util para producir acido succrnico para uso industrial.
<110> Instituto de Ciencia y Tecnologfa de Corea
<120> Microorganismo modificado por ingeniena genetica novedoso que produce acido homosucdnico y metodo para preparar acido succrnico usando el mismo
<130> PP-80304
<150> KR10-2006-0071666
<151>
<160> 23
<170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 1
cagtgaagga gctccgtaac gcatccgccg 30 <210> 2
5
10
15
20
25
30
35
<212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400>2
ctttatcgaa tctgcaggcg gtttccaaaa <210> 3 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 3
gtactgtaaa ctgcagcttt catagttagc <210> 4 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 4
gccgaaagtc aagcttgccg tcgtttagtg <210> 5 <211> 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> sitio xbaI <400> 5 tctagaagct <210>6 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador
5
10
15
20
25
30
35
<400>6
gctctagacc ttctatcgcc ttcttgacg <210>7 <211> 29 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 7
gctctagagg ctacaaaatc acgggcgtc <210>8 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 8
gacgtttccc gttgaatatg gc <210> 9 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 9
cattgaggcg tattatcagg aaac <210> 10 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 10
gcagtttcat ttgatgctcg atg <210> 11 <211> 24 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
<220>
<223> cebador <400> 11
cctcttacga tgacgcatct ttcc <210> 12 <211> 30 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 12
agcggatccc cttctatcgc cttcttgacg <210> 13 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 13
gtcctgcagg gctacaaaat cacgggcgtc <210> 14 <211> 32 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 14
gctctagata tccgcagtat cactttctgc gc <210> 15 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 15
tccgcagtcg gatccgggtt aaccgcacag
5
10
15
20
25
30
35
<211> 39 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 16
ggggagctcg ctaacttagc ttctaaaggc catgtttcc <210> 17 <211> 32 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 17
gctctagata tccgggtcaa tatcgccgca ac <210> 18 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 18
gaattcgagc tcgcccgggg atcgatcctc <210> 19 <211> 36 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 19
cccgggccga caggctttga agcatgcaaa tgtcac <210> 20 <211> 36 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
<400> 20
cctgcaggca tgcaagcttg ggctgcaggt cgactc <210> 21 <211> 35 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 21
gctgccaaac aaccgaaaat accgcaataa acggc <210> 22 <211> 43 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 22
gcatgtaact ttactggata tagctagaaa aggcatcggg gag <210> 23 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cebador <400> 23
gcaacgcgag ggtcaatacc gaaggatttc gccg

Claims (12)

  1. 2.
    10
  2. 3.
  3. 4.
    15
  4. 5.
    20
  5. 6.
    25
    30
  6. 7.
    35 8.
  7. 9.
  8. 10. 40
  9. 11.
  10. 12.
    45
  11. 13.
    50 14.
  12. 15.
    REIVINDICACIONES
    Mutante bacteriano del rumen que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (IdhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA) mientras que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir solo acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias, en el que el mutante bacteriano se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum.
    Mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, en el que el mutante bacteriano es una cepa de fermentacion homogenea que produce solo acido succmico mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos como subproductos.
    Mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succmico producido.
    Mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, en el que los otros acidos organicos son uno cualquiera o mas acidos organicos seleccionados del grupo que consiste en acido lactico, acido acetico, acido formico y acido piruvico.
    Mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), que carece de un gen de lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen de fosfotransacetilasa (pta) y un gen de acetato cinasa (ackA), mientras que comprende un gen de piruvato formiato-liasa (pfl), mutante bacteriano que tiene la propiedad de producir acido succmico a una alta concentracion mientras que produce poco o nada de otros acidos organicos en condiciones anaerobias.
    Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicacion 1, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) alterando el gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) en el genoma de una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en el genero Mannheimia, el genero Actinobacillus y el genero Anaerobiospirillum, usando recombinacion homologa; y
    (b) obtener un mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA), un gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y un gen que codifica para acetato cinasa (ackA) alterando el gen que codifica para fosfotransacetilasa (pta) y el gen que codifica para acetato cinasa (ackA) en el genoma del mutante bacteriano que carece de un gen que codifica para lactato deshidrogenasa (ldhA) usando recombinacion homologa.
    Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicacion 6, en el que la recombinacion homologa de la etapa (a) se realiza usando un vector de intercambio genetico que contiene un ldhA alterado.
    Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicacion 6, en el que la recombinacion homologa de la etapa (b) se realiza usando un vector de intercambio genetico que contiene un pta-ackA alterado.
    Metodo para producir el mutante bacteriano segun la reivindicacion 7, en el que el vector de intercambio genetico que contiene un ldhA alterado es pMLKO-sacB.
    Metodo para producir acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano segun una reivindicacion cualquiera entre las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
    Metodo para producir acido succmico segun la reivindicacion 10, en el que se usa glucosa o glicerol como fuente de carbono para el cultivo.
    Metodo para preparar acido succmico segun la reivindicacion 10, en el que la cantidad de cada uno de los otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succmico producido.
    Metodo para preparar acido succmico, comprendiendo el metodo las etapas de: cultivar el mutante bacteriano Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) en condiciones anaerobias; y recuperar acido succmico del caldo de cultivo.
    Metodo para preparar acido succmico segun la reivindicacion 13, en el que se usa glucosa o glicerol como fuente de carbono para el cultivo.
    Metodo para preparar acido succmico segun la reivindicacion 13, en el que la cantidad de cada uno de los
    otros acidos organicos producidos como subproductos es inferior al 1% en peso basandose en la cantidad de acido succmico producido.
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