KR20110116438A - 바이오 에탄올 생산 향상용 글리세롤 생산 유전자 결손 변이체 및 그 균주를 이용한 에탄올 생성방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 조작되어진 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 생산 유전자의 결손을 통하여 부산물인 글리세롤 생산을 저해시킴으써 주산물인 바이오 에탄올 생산능이 향상된 형질전환체 및 그 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 생산하는 글리세롤의 합성 경로인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자를 결손 시켜 글리세롤의 생산량이 줄어들며 상대적으로 에탄올 생산능이 향상되어진 효모 형질 전환체 및 이들을 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.

Description

바이오 에탄올 생산 향상용 글리세롤 생산 유전자 결손 변이체 및 그 균주를 이용한 에탄올 생성방법{Recombinant yeast by interruption of glycerol production for improving productivity of bio-ethanol and Method for producing ethanol using the same}

본 발명은 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 조작되어진 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 생산 유전자의 결손을 통하여 글리세롤 생산을 저해시킴으써 바이오 에탄올 생산능이 향상된 형질전환체 및 그 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 제작되어진 형질전환체에서의 에탄올 생산능 증대를 위하여 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에서 10% 정도의 부산물로 생산이 되어지는 글리세롤의 합성 경로인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자를 결손 시켜 글리세롤의 생산량을 줄이며 상대적으로 에탄올 생산능이 향상되어진 형질전환체 및 이들을 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.

에탄올은 현재 산업 용매로써 거대한 시장을 형성하고 있으며, 앞으로 자동차 등의 수송연료로 사용 가능성이 현실화되고 있어 계속적인 수요 증가가 예상되고 있다.

글리세롤은 C₃H₈O₃로 C₆H₁₂O₆인 글루코오스 (glucose)에 비하여 1단계 환원된 물질로서 미생물의 대사 과정에서 보다 향상된 환원력을 제공할 수 있다. 발효를 통하여 생산되는 많은 물질이 그 대사과정에서 환원력을 요구하는 경우가 많기 때문에 글리세롤을 기질로 효과적으로 이용할 수 있다면, 원하는 발효산물의 수율 및 생산성의 향상을 가져 올 수 있다. 현재 바이오 디젤의 생산량이 늘어남에 따라 글리세롤의 생산량 늘어났기 때문에 가격이 급격히 하락하고 있는 실정이다. 상기한 바와 같이 바이오디젤의 생산량이 급증함에 따라, 부산물인 글리세롤의 생산도 늘어나 글리세롤을 포함하고 있는 부산물을 효과적으로 처리하는 문제가 발생할 것이다. 따라서 글리세롤을 이용하여 효과적으로 발효에 의해 유용한 발효산물을 생산할 수 있다면 많은 부속 효과를 가져 올 수 있다.

본 발명자들에서 의하여 사카로마이세스 세레비제에서의 글리세롤을 이용한 에탄올 생산능이 증대된 형질전환체가 보고되었다 (Yu et al. Bioresour Technol. 101(11):4157-61(2010)). 상기 연구는 기존의 글리세롤을 효율적으로 이용하도록 개발되어진 균주의 개량을 통한 에탄올 생산능의 증대를 위하여 사카로마이세스 세레비제에서의 에탄올 생산 시 약 10%정도의 부산물로 생산이 되어지는 글리세롤의 경로를 차단함으로써 에탄올 생산능의 증대를 이루었다.

미생물에 의한 글리세롤의 생산에는 S. cerevisiae , C. magnoliae , P. farinose, C. glycerinogens와 같은 효모 균주, B. subtilis 와 같은 박테리아 및 D. tertiolecta와 같은 조류가 생산 균주로 알려져 있다. 글리세롤 생산 균주로 종래에 알려진 미생물에서 발견된 글리세롤 생합성 경로를 조작하여 재조되는 미생물을 사용할 수 있음이 알려져 있다. 일반적으로, 포도당과 같은 탄소 기질은 ATP의 존재하의 헥소키나제에 의하여 글루코즈-6-포스페이트로 전환된다. 글루코즈-6-포스페이트는 글루코즈-포스페이트 이소머라제에 의하여 프럭토즈-6-포스페이트로 전환되고, 다시 6-포스포프럭토키나제의 작용에 의하여 프럭토즈-1,6-디포스페이트로 전환된다. 상기 디포스페이트는 알돌레이즈에 의하여 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)로 된다. 최종적으로 NADH-의존성글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제가 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로 전환시키고, G3P는 다시 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제에 의하여 탈인산화되어 글리세롤로 된다 (Hou J et al. Appl Microbiol Biotechnol. 85(4):1123-30.(2010)).

종래 디히드로게나제가 DHAP를의 글리세롤 생합성 경로에 관여하는 유전자로서 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제를 코딩하는 유전자로서 GPD1이 알려져 있었다. 또한, 글리세롤-3-포스페이트를 글리세롤로 전환시키는 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제를 코딩하는 유전자로서 사카로마이세스 세레비지애의 GPP2가 알려져 있다.

사카로마이세스 세레비제에서의 글리세롤 생산 경로는 디히드록시아세톤포스페이트 (dihydroxyacetone phosphate, DHAP) 에서 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd)에 의하여 글리세롤-3-포스페이트로 전환된 후, 글리세롤-3-포스페이트에서의 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 ( glycerol-3-phosphate phosphatase) 에 의하여 글리세롤로 전환되어지며 글리세롤 외분비 통로인 Fps1을 통하여 세포외부로 분비되어진다 (Oliveira et al. Biochim Biophys Acta. 27;1613(1-2):57-71(2003)).

본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애에서의 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 제작되어진 형질전환체에서의 에탄올 생산 증대를 위하여 글리세롤 생산 유전자, 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 와 효모 글리세롤 채널 Fps1을 결손시켰으며 또한 글리세롤 업테이크 프로테인 (Gup1)이 삼투압에 대한 회복을 돕는다는 것을 확인하였으며 에탄올 생산량 증대를 이루었다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 글리세롤을 발효원으로 이용시 바이오 에탄올 제조에 있어서 생산균주인 효모에서의 글리세롤 생산 경로를 차단하여 바이오에탄올 생산량이 증대될 수 있도록 개량되어진 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel)의 유전자가 결손된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 1에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자에 포함된다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 Fps1을 인코딩하는 FPS1은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 3에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤 파실리테이터 채널 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 효모 글리세롤 채널에 포함된다.

본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 Fps1을 인코딩하는 FPS1유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 4에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 효모 글리세롤 채널 유전자에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자 결손된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1은 바람직하게는 효모, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 형질전환체는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 a) 효모 글리세롤 채널 FPS1의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 효모 글리세롤 채널 FPS1의 1971에서 스탑 코돈까지의 서열이 포함된 리버스 프라이머로 도 7a의 개열지도를 가지는 pPICZ 벡터 디엔에이를 주형으로 하여 PCR반응을 수행하여 Fps1 유전자의 시작 코돈과 스탑 코돈이 포함된 PCR 산물을 얻는 단계;b) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 1324에서 스탑 코돈까지의 서열이 포함된 리버스 프라이머로 도 7b의 개열지도를 가지는 pET28a 벡터 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및 c) 상기 각각의 PCR 산물을 효모에 상동 재조합(homologous recombination) 하는 단계를 포함하는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 FPS1의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 효모 글리세롤 채널 FPS1의 1971에서 스탑 코돈까지의 서열이 포함된 리버스 프라이머는 각각 서열번호 5와 서열번호 6에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고,상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 1324에서부터 스탑 코돈이 포함된 리버스 프라이머는 각각 서열번호 7 및 서열번호 8에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체에 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 및 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자를 추가로 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM11071P인 효모 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △(pGcyaDak, pGup1Cas)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 상기 본 발명의 형질전환체의 제조방법에 의해 형성된 형질전환체에 c)단계 후에 추가적으로 재조합된 벡터 pGcyaDak, 및 pGupCas를 형질전환시키는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산용 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

상기 본 발명의 형질전환체 제조방법의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합된 벡터 pGcyaDak, 및 pGupCas는 도 4a 및 4b에 기재된 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 글리세롤을 기질로 하여 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤은 바이오디젤의 부산물로 생성된 글리세롤인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생산용 조성물을 제공한다.본 발명의 에탄올 생성물 조성물은 예를 들어 상기 형질전환체를 배양하여 글리세롤을 기질로 하여 에탄올을 생성하는데 적합한 폴리펩타이드, 브로쓰, 세포 용해물, 정제 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩타이드 등을 포함한다.

본 발명에서 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 취득은, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 글리세롤을 발효원으로 이용하도록 조작되어진 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 글리세롤 생산 유전자의 결손을 통하여 부산물인 글리세롤 생산을 저해시킴으써 주산물인 바이오 에탄올 생산능이 향상된 형질전환체 및 그 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 생산하는 글리세롤의 합성 경로인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자를 결손 시켜 글리세롤의 생산량이 줄어들며 상대적으로 에탄올 생산능이 향상되어진 효모 형질 전환체 및 이들을 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.

본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 유래한 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 2(glycerol dehydrogenase)와 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1의 유전자의 결손을 통한 글리세롤 생산능을 저해함으로써 에탄올 생산능이 증가된 이 균주에 글리세롤을 효율적으로 이용하는 유전자를 형질 전환시켜 기존의 형질전환체와 비교시 에탄올 생산능이 증가됨을 확인하였다. 또 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 유래한 글리세롤 업테이크 프로테인은 글리세롤에 대해 투과성과 삼투압에 대한 내성을 가지도록 도움을 주는 효소로써 글리세롤 생산능이 저해된 균주에서 글리세롤을 발효원으로 이용할 때 삼투압에 대한 내성을 가지도록 도움을 줄 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 제작되어진 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 생산되어지는 글리세롤의 생산을 저해한 효모 형질 전환체는 공정에 유용하게 사용될 수 있다. 글리세롤을 기질로 한 발효결과 상기 유전자가 결손 되어진 효모 형질 전환체가 그렇지 않은 효모균주보다 많은 양의 에탄올을 생성하였다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

사카로마이세스 세레비제에서의 글리세롤 생산 경로는 디히드록시아세톤포스페이트 (dihydroxyacetone phosphate, DHAP) 에서 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd)에 의하여 글리세롤-3-포스페이트로 전환된 후, 글리세롤-3-포스페이트에서의 글리세롤-3-포스페이트 포스파타제 ( glycerol-3-phosphate phosphatase) 에 의하여 글리세롤로 전환되어지며 글리세롤 외분비 통로인 Fps1을 통하여 세포외부로 분비되어진다. 본 발명에서는 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 조작되어진 균주에서의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제와 효모글리세롤채널 Fps1유전자를 결손시킴으로써 에탄올 생산이 증대되었다.

본 발명의 실시예에서는 forward에 Fps1의 start codon에서부터 40mer까지의 유전자가 포함되어진 프라이머와 reverse에 Fps1의 stop codon이 포함되어진 프라이머를 이용하여 pPICZ 벡터 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 1.5kb의 PCR product를 얻었고, 얻어진 Zeocin내성을 가지도록 하는 유전자 PCR product를 효모에 homologous recombination 함으로써 Fps1유전자 결손 균주를 제작하였다. 또한 forward에 Gpd2의 start codon에서부터 40mer까지의 유전자가 포함되어진 프라이머와 reverse에 Gpd2의 stop codon이 포함되어진 프라이머를 이용하여 pET28a 벡터 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 1.5kb PCR product를 얻었고, 얻어진 Kanamycin내성을 가지도록 하는 유전자 PCR product를 효모에 homologous recombination 함으로써 Fps1, Gpd2 유전자 결손 균주를 제작하였다. 이후, 상기 Gcy와 Dak을 양방향 삽입한 재조합 벡터를 이용하여 효모 숙주세포를 형질 전환시켰다. 이후, Gup1의 유전자 삽입을 위하여 효모-유전자 삽입벡터( yeast-integration vector)에 구축하였으며 이를 사카로마이세스 세레비지애에 유전자 삽입하였다. 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 글리세롤을 이용한 에탄올 생산을 조사하였다.

이로써, 본 발명에 따라 재조합되고 형질 전환 된 YPH499fps1 △ gpd2 △(pGcyaDak, pGup1Cas)에 의하여 에탄올 생산이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 대표적인 에탄올 생산균주인 효모 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 글리세롤을 이용한 에탄올 생산량의 증대를 위하여 본 발명자는 사카로마이시스 세레비지애로부터 유래한 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd2)와 글리세롤 외분비 통로인 효모 글리세롤 채널 Fps1의 유전자 결손, 그 균주에 글리세롤을 이용하도록 유전자 도입된 재조합 벡터의 형질 전환 및 글리세롤 업테이크 프로테인 (Gup1)의 도입을 통하여 효모 형질 전환체를 개발하여 이를 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 유림빌딩 소재 한국미생물보존센터(KCCM)에 2010년 3월 10일 기탁번호 KCCM11071P로 기탁하였다. 뿐만 아니라 상기 효모 형질 전환체가 탄소원으로 글리세롤을 효율적으로 이용하여 에탄올 생산이 효율적으로 증가한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd2)와 글리세롤 외분비 통로인 효모 글리세롤 채널 Fps1의 유전자 결손을 통하여 글리세롤 생산을 억제하였으며 또한 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 도입된 형질전환체에 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 유전자 삽입한 재조합 벡터를 효모 균주에 도입하였다. 이후, 상기 효모균주에 비하여 에탄올 생산수율이 높아진 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 글리세롤을 탄소원으로 이용하도록 조작되어진 균주에의 글리세롤 생산 유전자를 차단함으로써 제작되어진 효모 형질 전환체는 바이오디젤의 부산물로 생성이 되는 글리세롤을 이용하여 많은 양의 에탄올을 생산할 수 있어 매우 유용한 발명인 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 FPS1의 유전자 결손을 위한 homology arm의 확인을 위한 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Fps1의 유전자 결손을 위하여 Zeocin 내성 유전자의 5'와 3'에 Fps1 homology arm이 형성된 것 이며, Lane 3, Gpd2의 유전자 결손을 위하여 Kanamycin 내성 유전자의 5'와 3'에 Gpd2 homology arm이 형성된 것을 확인한 그림을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 제시된 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 FPS1의 유전자 결손 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3(A)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 디히드로게나제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gcy PCR 산물이며, 도 3(B)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 디히드록시아세톤 키나아제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Dak PCR 산물이며, 도 3(C)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gup PCR 산물을 나타낸다.
도 4a는 본 발명에서 제시된 글리세롤 디히드로게나제 유전자와 디히드록시아세톤 키나아제 유전자가 양방향으로 삽입된 재조합 벡터 pGcyaDak의 재조합 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4b는 본 발명에서 제시된 글리세롤 업테이크 프로테인의 유전자 삽입을 위하여 구축한 재조합 벡터 pGup의 재조합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명에서 제시된 유전자 결손 균주 YPH499fps1△gpd2△의 삼투압에 대한 영향을 나타낸 그림으로 삽입된 pGup1cas에 의하여 삼투압에 의한 회복능력을 확인한 그림이다. 도 5에서 사용되어진 배지는 (A) glycerol을 carbon source로 한 배지 (B) YPD 배지에 1 M NaCl,10 mM glycerol이 첨가된 배지. Lane1, YPH499 (pESC-TRP), lane2, YPH499fps1Δgpd2 (pESC-TRP),lane3, YPH499fps1Δgpd2 (pGcyaDak), lane4, YPH499fps1Δgpd2Δ(pGcyaDak,pGupCas)을 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 제시된 유전자 결손된 균주에 재조합 벡터 pGcyaDak, pGup를 형질전환하여 glycerol을 기질로 하여 에탄올 생산량이 증대됨을 생산함을 확인한 그래프이다. 도 6에서 심벌은 squares, YPH499 (pGcyaDak,pGupCas)
;diamonds, YPH499fps1Δgpd2Δ(pGcyaDak,pGupCas)을 나타낸다.
도 7a는 pPICZ 벡터의 개열지도를 나타내고,
도 7b는 pET28a 벡터의 개열지도를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효모의 글리세롤-3- 포스페이트 디히드로게나제2 ( glycerol -3- phosphate dehydrogenase , gpd2 ),효모 글리세롤 채널 Fps1 유전자의 결손

글리세롤의 생산 경로의 차단을 위하여 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, gpd2),효모 글리세롤 채널 Fps1 유전자의 결손을 위하여 forward (5-atgagtaatcctcaaaaagctctaaacgactgagccatattcaacgg

gaaacgtcttgctcagtttcatttgatgctcgatgagtttttccattatggtaatgctaagaaggtaacatga-3;서열번호 5)에 Fps1의 start codon에서부터 40mer까지의 유전자를 포함시켰으며 reverse(5'-gtcaaagtaaactacgagctactcaaaaaggtaataccattactattcttccattgtacttcatgttaccttcttatcattaccataatggaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactg-3';서열번호 6)에 Fps1의 stop codon이 포함시켰으며 pPICZ 벡터 (Invitrogen, USA ; 도7a) 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 1.5kb의 양 옆에 각각 Fps1 유전자의 start codon과 stop codon이 포함되어졌으며 Zeocin 내성을 가지는 PCR product를 얻었고,

또한 같은 방법으로 Gpd2의 유전자 결손을 위하여 forward (5-atgcttgctgtcagaagattaacaagatacacattccttagtgttgacaa

ttaatcatcggcatagtatagggadgctcgaaggctttaatttgcaagct-3;서열번호 7),reverse (5'-attgaagagctagacatcgatgacgaatagcccctgcgagcttccgaaattaaacgttcgataacttctcgatctgtagctactgcttattattcgtcatcgatgtctagctcttcaatagcttgcaaattaaagccttcgagcgtcccc;서열번호 8) 프라이머를 이용하여 pET28a 벡터(Invitrogen, USA ; 도7b) 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 1.5kb PCR product를 얻었고,

얻어진 Kanamycin내성을 가지도록 하는 유전자와 5'와 3'에 Gpd2에 유사성을 가지는 부위를 첨가함으로써 각각의 PCR product를 효모 YPH499 (MATa ura3 -52lys2-801_amberade2-101_ochretrp1-Δ63 his3 -Δ200 leu2 -Δ1) (Clontech Laboratories, Inc.) homologous recombination 함으로써 Fps1, Gpd2 유전자 결손 균주를 제작하였다. 이후, Zeocin, Kanamycin이 포함된 YPD배지 (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, and 2% glucose, 2% agar)를 이용하여 유전자 결손된 균주를 선별하였으며 유전자 결손을 위한 PCR 밴드 및 유전자 결손 방법을 도식화하여 도면 1, 2에 각각 도시하였다. 이를 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1△gpd2△ 라 명명하였다.

<실시예 2> 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 형질전환

< 실시예 2-1> 효모의 글리세롤 디히드로게나제 , 디히드록시아세톤 키나아제 , 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 증폭

글리세롤을 해당과정의 중간물질인 DHAP로 효율적으로 전환하기 위하여 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제 유전자를 클로닝하기 위하여 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이 (BY4741) 로부터 펩타이드 부분의 염기서열을 참고로 하여 Gcy의 클로닝을 위하여 BamH (5-ggatccatgcctgctactttacatga

ttct-3;서열번호 9), Sal( 5-gtcgacatacttgaatacttcgaaaggag-3;서열번호 10), Dak는 Spe (5-actagtatgtccgctaaatcgtttgaagtc-3;서열번호 11), Cla(5-atcgatatacaaggcgctttgaaccccctt-3;서열번호 12) 그리고 Gup1에는 EcoR(5-gaattcatgtcgctgatcagcatcctg-3;서열번호 13), Spe(5-actagtccagca

ttttaggtaaattccgtg-3;서열번호 14)으로 각각의 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 각각 936bp, 1755bp 그리고 1683bp의 PCR 밴드를 확인할 수 있었고 도면 3에 각각 도시하였다.

<실시예 2-2> 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 클로닝

상기 실시예 1에서 얻은 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Biospin gel extraction kit (Bioflux)를 사용하여 회수하였다.

그 후, Gcy는 BamH, Sal, Dak는 Spe, Cla그리고 Gup1은 EcoR, Spe으로 절단한 후 효모-대장균 셔틀 벡터 (yeast-E. coli shuttle vector) 인 pESC-trp (Clontech) 에 라이게이션 (ligation) 시켜 에스세리시아 콜라이 (대장균, E. coli) DH5a에 형질 전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 (ligation) 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 각각pESC-Gcy, pESC-Dak, pESC-Gup이라 명명하였다. 그 후 pESC-Gcy를 벡터로 하여 Dak를 클로닝하여 에스세리시아 콜라이 DH5a(인비트로겐(Invitrogen)에 형질 전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 pGcyaDak이라 명명하였고 도면 4에 도시하였다. 또한 pESC-Gup1을 유전자 삽입하기 위하여 BamH1 인식서열을 포함하도록 sense primer (5-ggatccatgt cagcattttaggtaaattccgtg-3;서열번호 15) 그리고 anti-sence primer (5-ggatccataatgtcgctgatcagcatcctg tct-3;서열번호 16)를 제작하여 효모 유전자 삽입 벡터 (yeast integration vector)인 YIP-5에 클로닝하여 이를 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이에 유전자 삽입하였다.

재조합된 벡터 pGcyaDak, pGupCas를 유전자 결손된 균주(YPH499fps1 △ gpd2 △)에 클론테크 (clontech)사의 이스트메이커 이스트 트랜스포메이션 키트 (YEASTMAKER yeast transformation kit2) 에서 제공하는 실험방법에 따라 효모 숙주세포를 형질 전환시켰다. 이후, 트립토판 결핍 SD배지 (0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.067% yeast nigrogen base w/o trp, 2% agar)에 Zeocin과 Kanamycin을 이용하여 형질 전환체를 선별하였으며, 이를 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1△gpd2△ (pGcyaDak, pGupCas)라 명명하였다.

<실시예 3> 글리세롤 생산 경로가 차단되어진 균주에서의 삼투압에 대한 영향 측정

글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2와 효모 글리세롤 채널 Fps1 유전자가 결손되어진 균주에서의 삼투압에 대한 영향을 측정하기 위하여 각각의 서로 다른 배지 에서 Growth test를 시행하였다. 균주를 glucose를 carbon source로 이용하는 배지에서 배양 후 OD600에서 1까지로 희석한 후 1/10로 각각 희석하여 10ul씩 분주하여 colony 생성을 확인한다. 삼투압에 대한 영향을 확인하기 위하여 NaCl의 농도를 늘려가며 이용하였다. 이 결과를 도면 5에 도시하였다.

< 실시예 4> 효모 형질 전환체를 이용한 바이오 에탄올의 생산

YPH499fps1 △ gpd2(pGcyaDak, pGupCas)와 YPH499(pGcyaDak, pGupCas)를 갈락토오스로 발현 유도되는 SG배지에서 24시간 전배양 후 48시간 진탕 배양하여 2%의 글리세롤이 기질로 첨가된 발효배지에 600nm파장에서 흡광도를 측정했을 때 각각 1가 되도록 한다. 상기 발효배양액을 30℃, 100rpm에서 배양하며 일정한 시간별로 배양액을 채취하여 가스 크로마토그래피를 실시함으로 생산된 에탄올을 측정하였다. 상기 방법대로 실행결과 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 와 효모 글리세롤 채널 Fps1 유전자가 결핍되어진 YPH499fps1△ gpd2 △(pGcyaDak, pGupCas)에서의 에탄올 생산수율이 YPH499 (pGcyaDak, pGupCas)보다 높게 측정이 되었다. 이 결과를 도면 6에 도시하였다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11071 20100310

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Recombinant yeast by interruption of glycerol production for improving productivity of bio-ethanol and Method for producing ethanol using the same <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 440 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Leu Ala Val Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr 1 5 10 15 His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro Ser Arg 20 25 30 Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys 35 40 45 Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp 50 55 60 His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys 65 70 75 80 Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr 85 90 95 Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile 100 105 110 Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp 115 120 125 Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr 130 135 140 Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His 165 170 175 Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro 180 185 190 His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys 195 200 205 Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln 210 215 220 Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu 225 230 235 240 His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln 245 250 255 Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His 260 265 270 Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val 290 295 300 Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu 305 310 315 320 Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser 325 330 335 Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile 340 345 350 Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala 355 360 365 Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly 370 375 380 Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu 385 390 395 400 Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr 405 410 415 Gln Ile Val Tyr Asn Asn Val Arg Met Glu Asp Leu Pro Glu Met Ile 420 425 430 Glu Glu Leu Asp Ile Asp Asp Glu 435 440 <210> 2 <211> 1319 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgcttgctg tcagaagatt aacaagatac acattcctta agcgaacgca tccggtgtta 60 tatactcgtc gtgcatataa aattttgcct tcaagatcta ctttcctaag aagatcatta 120 ttacaaacac aactgcactc aaagatgact gctcatacta atatcaaaca gcacaaacac 180 tgtcatgagg accatcctat cagaagatcg gactctgccg tgtcaattgt acatttgaaa 240 cgtgcgccct tcaaggttac agtgattggt tctggtaact gggggaccac catcgccaaa 300 gtcattgcgg aaaacacaga attgcattcc catatcttcg agccagaggt gagaatgtgg 360 gtttttgatg aaaagatcgg cgacgaaaat ctgacggata tcataaatac aagacaccag 420 aacgttaaat atctacccaa tattgacctg ccccataatc tagtggccga tcctgatctt 480 ttacactcca tcaagggtgc tgacatcctt gttttcaaca tccctcatca atttttacca 540 aacatagtca aacaattgca aggccacgtg gcccctcatg taagggccat ctcgtgtcta 600 aaagggttcg agttgggctc caagggtgtg aattgctatc ctcctatgtt actgatgagt 660 taggaatcca atgtggcgca ctatctggtg caaacttggc accggaagtg gccaaggagc 720 attggtccga aaccaccgtg gcttaccaac taccaaagga ttatcaaggt gatggcaagg 780 atgtagatca taagattttg aaattgctgt tccacagact tacttccacg tcaatgtcat 840 cgatgatgtt gctggtatat ccattgccgg tgccttgaga acgtcgtggc acttgcatgt 900 ggtttcgtag aaggtatggg atggggtaac aatgcctccg cagccattca aaggctgggt 960 ttaggtgaaa ttatcaagtt cggtagaatg tttttcccag aatccaaagt cgagacctac 1020 tatcaagaat ccgctggtgt tgcagattga tcaccacctg ctcaggcggt agaaacgtca 1080 aggttgccac atacatggcc aagaccggta agtcagcctt ggaagcagaa aaggaattgc 1140 ttaacggtca atccgcccaa gggataatca catgcagaga agttcacgag tggctacaaa 1200 catgtgagtt gacccaagaa ttcccattat tcgaggcagt ctaccagata gtctacaaca 1260 acgtccgcat ggaagaccta ccggagatga ttgaagagct agacatcgat gacgaatag 1319 <210> 3 <211> 669 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Ser Glu Ser 1 5 10 15 Val His Thr His Asp Ser Ser Arg Lys Gln Ser Asn Lys Gln Ser Ser 20 25 30 Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Gly Gly 35 40 45 Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Asn 50 55 60 Asn Asn Asn Gly Asn Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp Tyr Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Pro Gln Ser Ala Arg Pro Thr Pro Thr 85 90 95 Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Glu Ser Gly Thr Ala Phe Pro Ile Gln 100 105 110 Glu Val Ile Pro Ser Ala Tyr Ile Asn Thr Gln Asp Ile Asn His Lys 115 120 125 Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg 130 135 140 Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val Leu Asn Ile Glu Asp Phe Tyr 145 150 155 160 Lys Asn Ala Asp Asp Ala His Thr Ile Pro Glu Ser His Leu Ser Arg 165 170 175 Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Thr Ser Asn Ala Gly His Ser Ala Asn 180 185 190 Thr Gly Ala Thr Asn Gly Arg Thr Thr Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu 195 200 205 Ser Asn Glu Ser Pro Arg Asn Val Pro Ile Met Val Lys Pro Lys Thr 210 215 220 Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr Val Leu Pro Ser Thr Tyr His 225 230 235 240 Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe 245 250 255 Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala 260 265 270 Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe 275 280 285 Asn Val Ala Leu Asp Asn Leu Asn Val Thr Gly Ser Ser Ala Glu Thr 290 295 300 Ile Asp Ala Met Lys Ser Leu Thr Ser Leu Val Ser Ser Val Ala Gly 305 310 315 320 Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly Trp Ala Ala Ala Val Val Met 325 330 335 Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala Ile Ser Gly Ala His Leu Asn 340 345 350 Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys 355 360 365 Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly 370 375 380 Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr 385 390 395 400 Ser Asp Trp Trp Met Asn Glu Ser Val Ala Gly Met Phe Cys Val Phe 405 410 415 Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu 420 425 430 Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr 435 440 445 Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro Leu Met Met Phe Ile Leu Ile 450 455 460 Phe Ile Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn 465 470 475 480 Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe 485 490 495 Asp His Lys Met Leu Trp Val His His His His Phe Phe Trp Val Pro 500 505 510 Met Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Leu Met Gly Gly Leu Val Tyr Asp 515 520 525 Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro 530 535 540 Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp 545 550 555 560 Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser 565 570 575 Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Glu Glu Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln 580 585 590 Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly 595 600 605 Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe 610 615 620 Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala 625 630 635 640 Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp Ser Ile Gly Leu Ser Asp Thr Ser 645 650 655 Ser Glu Asp Ser His Tyr Gly Asn Ala Lys Lys Val Thr 660 665 <210> 4 <211> 2010 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgagtaatc ctcaaaaagc tctaaacgac tttctgtcca gtgaatctgt tcatacacat 60 gatagttcta ggaaacaatc taataagcag tcatccgacg aaggacgctc ttcatcacaa 120 ccttcacatc atcactctgg tggtactaac aacaataata acaataataa taataataat 180 aacagtaaca acaacaacaa cggcaacgat gggggaaatg atgacgacta tgattatgaa 240 atgcaagatt atagaccttc tccgcaaagt gcgcggccta ctcccacccg cattccacaa 300 tattctgtag aaagcaaagc tgctttcccg tccacagagg ttattcctag cgcatacatt 360 aacacacaag atataaacca taaagataac ggtccgccga gtgcaagcag taatagagtt 420 ccacggccta gagggcagac cacagtgtcg gccaacgtgc ttaacattga agaggttaac 480 aaaaatgcag acgatgcgca taccatcccg gagtcacatg ctgcgcttct ccttctcagg 540 tcgagggctt ctcagaatgc tgggcacagt gccaatataa tagcttctca tatgaggact 600 actggtgcgc atactaatat ggaaagctac tacgagtgca gtaacgtccc cattatggtg 660 aaggcataca cattatatcc tagccctcaa acaagctaac tactgcgctg cagaccacgc 720 gcatttaata aatggtcttc cgtcaaaaag aaatatgcga caaaaattag aaccgagttc 780 gcaaagccta ctgttatgaa tatgcccgtc catgctgtga ggtgcacggt ctactttgct 840 gggaaaatat aacaggacaa attcaacgtg gctttggata accagacgat ctactagtct 900 tctaggttaa cgatagacgc taagtaacgt ttaacatcat tgatttcatc ctttgcgata 960 gagtcctttg atgatgtatg attgggctgg gctgctgcgg tggtgatggg ctttttctag 1020 gctggtggta gtgccatagt aatgcagtat gcgactccgt ctaatacatt aggcatttaa 1080 gataatagag ggttattcca gtaactctcc taatatgact ttgctggaca aatgaccgtc 1140 gccttcacag aggctatgac ctgaggtttt aagaacaaaa gagataaaac agaggcatat 1200 agcgtccggt ggactacgga aagcattgcg atcagaggtt gcttttttcc aaaacattat 1260 ctaagccacg gacggcaatt tttttcctca ttttcgcatt cctccgcatt acaagcagga 1320 acatttaggc tgaccgtcca ttatacgtgg gtgcactctg agaggttccc attgatgatg 1380 tatatgccga tgcccagctg ctttgcttca cagtggctgc tgacagatat aacaactacg 1440 tagtggcgtg atctgggctg cagtaatgca ctatatgcag ttggaccgcc gagtaaaatg 1500 ctttgggtgc aacaacaaca attaatttct gtaccacagt tcggcccatg ctgtggtgcg 1560 ttaatggggg ggttgattta cgatgtctgt atgctgctgg gtcatgaatc tccagtcaac 1620 tggtctttac cagttcgcaa ggaaatgatt atgagaacat tgtagaaacg gcctggttgg 1680 aagtaacgaa atagagttag aagtacaccg taccagtgtg acttagtata caataacgat 1740 gatgatgagt acgtagtaac tctacagtgg cccacaaaga caaagaccaa gtcatctatt 1800 tcagacaacg aaaatgaagc aggagaaaag aaagtgcaat ttaaatctgt tcagcgcggc 1860 aaaagaacgt ttggtggtat accaacaatt cttgaagaag aagattccat tgaaactgct 1920 tcgctaggtg cgacgacgac tgattctatt gggttatccg acacatcatc agaagattcg 1980 cattatggta atgctaagaa ggtaacatga 2010 <210> 5 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgagtaatc ctcaaaaagc tctaaacgac tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 60 cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc cattatggta atgctaagaa ggtaacatga 120 120 <210> 6 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtcaaagtaa actacgagct actcaaaaag gtaataccat tactattctt ccattgtact 60 tcatgttacc ttcttatcat taccataatg gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg 120 120 <210> 7 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgcttgctg tcagaagatt aacaagatac acattcctta gtgttgacaa ttaatcatcg 60 gcatagtata gggadgctcg aaggctttaa tttgcaagct 100 <210> 8 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 attgaagagc tagacatcga tgacgaatag cccctgcgag cttccgaaat taaacgttcg 60 ataacttctc gatctgtagc tactgcttat tattcgtcat cgatgtctag ctcttcaata 120 gcttgcaaat taaagccttc gagcgtcccc 150 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggatccatgc ctgctacttt acatgattct 30 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtcgacatac ttgaatactt cgaaaggag 29 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actagtatgt ccgctaaatc gtttgaagtc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA 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Claims (18)

1. 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel)의 유전자가 결손된 형질전환체.
2. 제 1항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 형질전환체.
3. 제 1항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 형질전환체.
4. 제 1항에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 FPS1는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 형질전환체.
5. 제 1항에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 FPS1는 서열번호 4에 기재된 염기서열을 가지는 형질전환체.
6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환체는 효모인 형질전환체.
7. 제 6항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 형질전환체.
8. a) 효모 글리세롤 채널 FPS1의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 효모 글리세롤 채널 FPS1의 1971에서 스탑 코돈까지의 서열이 포함된 리버스 프라이머로 도 7a의 개열지도를 가지는 pPICZ 벡터 디엔에이를 주형으로 하여 PCR반응을 수행하여 Fps1 유전자의 시작 코돈과 스탑 코돈이 포함된 PCR 산물을 얻는 단계;
   b) 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 1324에서 스탑 코돈까지의 서열이 포함된 리버스 프라이머로 도 7b의 개열지도를 가지는 pET28a 벡터 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 PCR 산물을 얻는 단계; 및
   c) 상기 각각의 PCR 산물을 효모에 상동 재조합(homologous recombination) 하는 단계를 포함하는 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 효모 글리세롤 채널 FPS1의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 효모 글리세롤 채널 FPS1의 스탑 코돈이 포함된 리버스 프라이머는 각각 서열번호 5 및 서열번호 6에 기재된 프라이머인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체 제조방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 시작 코돈에서부터 40머까지의 유전자를 포함한 포워드 프라이머 및 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)의 스탑 코돈이 포함된 리버스 프라이머는 각각 서열번호 7 및 서열번호 8에 기재된 프라이머인 글리세롤-3-포스페이트 디히드로게나제2 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase2)와 효모 글리세롤 채널 FPS1을 인코딩하는 FPS1 (glycerol facilitator channel) 유전자가 결손된 형질전환체 제조방법.
11. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 형질전환체에 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 및 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자를 추가로 포함하는 형질전환체.
12. 제 11항에 있어서, 상기 형질전환체는 효모인 형질전환체.
13. 제 11항 또는 제12항에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM 11071P인 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas) 형질전환체.
14. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 형성된 형질전환체에 c)단계 후에 추가적으로 재조합된 벡터 pGcyaDak, 및 pGupCas를 형질전환시키는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산용 형질전환체의 제조방법.
15. 제 14항에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM11071P인 사카로마이시스 세레비지애 YPH499fps1 △ gpd2 △ (pGcyaDak, pGupCas)인 글리세롤을 이용한 에탄올 생산용 형질전환체의 제조방법.
16. 제 14항에 있어서, 상기 재조합된 벡터 pGcyaDak, 및 pGupCas는 도 4a 및 4b에 기재된 개열지도를 가지는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산용 형질전환체의 제조방법.
17. 글리세롤을 기질로 하여 제11항 또는 제12항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤을 이용한 에탄올 생산 방법.
18. 제 11항 또는 제12항의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물.

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