MX2013014536A - Levadura recombinante que expresa agt1. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la identificación de variantes del transportador de azúcares AGT1 que proporciona una fermentación mejorada de los oligosacáridos cuando se expresa de manera recombinante en levaduras. La invención además se refiere a los polinucleótidos que codifican las variantes, células de levadura recombinantes que expresan las variantes, y a uso de las células de levaduras recombinantes para fermentar oligosacáridos.

Description

LEVADURA RECOMBINANTE QUE EXPRESA AGTl Campo de la Invención La presente invención se refiere a la identificación de variantes del transportador de azúcares AGTl (transportador alfa-glucósido 1) que proporciona una fermentación mejorada de los oligosacáridos cuando se expresa de manera recombinante en levaduras. La invención además se refiere a los polinucleótidos que codifican las variantes, células de levadura recombinantes que expresan las variantes, y a el uso de las células de levaduras recombinantes para fermentar oligosacáridos .

Antecedentes de la Invención Con el consumo cada vez mayor de combustibles fósiles a nivel mundial, ha aparecido el correspondiente interés en opciones de energía alternativas. En la actualidad, se centra un interés considerable en el uso de etanol. El combustible a base de etanol se puede obtener a partir de cultivos que contienen almidón, tales como cereales forrajeros, cereales alimentarios, y tubérculos, tales como papas y camotes. Los cultivos que contienen azúcar, tales como la remolacha azucarera, la caña de azúcar y sorgo dulce, también se pueden utilizar para la producción de etanol. El azúcar, tanto en la forma refinada como en la forma sin refinar, no requiere una hidrólisis previa (a diferencia del almidón de maíz) antes de REF: 245091 la fermentación. Por consiguiente, el proceso de producción de etanol a partir del azúcar es más simple que la conversión de almidón de maíz en etanol. Sin embargo, la producción de etanol en cantidades suficientes de manera eficiente sigue siendo un motivo de preocupación.

En consecuencia, resulta deseable diseñar y desarrollar nuevos métodos y sistemas para aumentar la eficacia en el proceso de producción de etanol. La presente invención aborda las deficiencias previas en la técnica proporcionando un proceso fermentativo mejorado que aumenta el nivel y la tasa de fermentación de los oligosacáridos .

Sumario de la Invención La presente invención se basa, en parte, en la identificación de variantes de AGTl que aumentan el nivel y/o tasa de fermentación de los oligosacáridos cuando las variantes se expresan de manera recombinante en levaduras. La invención se basa además en el uso de estas variantes para aumentar la eficacia de la fermentación de los oligosacáridos por parte de las levaduras.

En consecuencia, como un aspecto, la invención proporciona un método de fermentación de un oligosacárido para producir etanol, que comprende poner en contacto el oligosacárido con una célula de levadura recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido de tipo AGTl de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTl de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de modificación de una célula de levadura para disminuir el período de latencia de la producción de etanol durante la fermentación de un oligosacárido, que comprende insertar en la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo AGTl de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTl de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de modificación de una célula de levadura para aumentar la cantidad de etanol producido durante la fermentación de un oligosacárido, que comprende insertar en la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo AGTl de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTl de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula de levadura recombinante para la producción de etanol a partir de un oligosacárido, donde la célula de levadura recombinante comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido de tipo AGTl de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTl de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

Estos y otros aspectos de la invención se exponen más detalladamente a continuación en la descripción de la invención.

Breve Descripción de las Figuras La Fig. 1 muestra una hibridación de Southern de ADN genómico de levadura con una sonda que consiste en la región codificante de aminoácidos de AGTl.

La Fig. 2 muestra las regiones de MALI amplificadas y secuenciadas de ocho cepas de levadura.

La Fig. 3 muestra un árbol filogenético de secuencias de AGTl.

La Fig. 4 muestra la fermentación de isomaltulosa (IM) al 4% por parte de cepas de levadura en las cuales el gen AGTl se ha secuenciado totalmente.

La Fig. 5 muestra la fermentación de IM al 4% por parte de una cepa de levadura AAGTl (que carece del gen AGTl natural) que expresa variantes de AGT1.

La Fig. 6 muestra la cantidad de etanol producido por levaduras que portan diferentes casetes de expresión de AGT1 en función de las horas de fermentación.

La Fig. 7 muestra la fermentación de panosa al 4% por parte de la cepa 1334.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se describirá a continuación más detalladamente en referencia a las figuras que la acompañan, en los cuales se muestran las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, esta invención puede formularse de diferentes formas y no debe considerarse que esté limitada a las modalidades expuestas en la presente. En su lugar, estas modalidades se proporcionan para que esta descripción sea exhaustiva y completa, y expresarán el alcance de la invención en su totalidad para los expertos en la técnica.

Todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente, a no ser que se definan de otra forma, tienen el mismo significado que el que sobreentienden habitualmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención de la presente tiene como propósito describir únicamente modalidades particulares y no se pretende que limite la invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, publicaciones de patente, secuencias identificadas por números de acceso y otras referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad al contenido relevante de la frase y/o párrafo en el cual se presenta la referencia.

A menos que el contexto indique lo contrario, se pretende específicamente que las diferentes características de la invención descritas en la presente se puedan emplear en cualquier combinación. Por ejemplo, las características descritas en relación con una modalidad también se pueden aplicar a otras modalidades y aspectos de la invención y pueden combinarse con estos .

Además, la presente invención también contempla el hecho de que, en algunas modalidades de la invención, se pueda excluir u omitir cualquier característica o combinación de características expuestas en la presente.

En la presente, las secuencias de nucleótidos se presentan solo mediante una única hebra, en la dirección de 5' a 3', desde la izquierda a la derecha, a menos que se indique específicamente lo contrario. En la presente los nucleótidos y aminoácidos se representan según la manera recomendada por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, o (para los aminoácidos) mediante el código de una letra o el código de tres letras, ambos de acuerdo con 37 C.F.R. §1.822 y el uso establecido.

A menos que se indique lo contrario, se pueden utilizar métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica para clonar genes, amplificar y detectar ácidos nucleicos y similares. Los expertos en la materia estarán familiarizados con estas técnicas. Remítase, por ejemplo, a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2.a Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology (Green Publising Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) .

I . Definiciones Se pretende que las formas en singular "un/a" y "el/la", tal como se utilizan en la descripción de la invención y en las reivindicaciones adjuntas, también incluyan las formas en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario .

Además, la expresión "y/o", tal como se utiliza en la presente, abarca y se refiere a todas y cada una de las posibles combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como también a la carencia de combinaciones cuando se interpreta en la forma alternativa ( "o" ) .

Se pretende que el término "aproximadamente", tal como se utiliza en la presente, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad de un polipéptido, dosis, tiempo, temperatura, actividad enzimática u otra actividad biológica y similares, englobe variaciones de un ± 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% o incluso un ± 0.1% de la cantidad especificada.

La expresión "constituido esencialmente por" (y sus variaciones gramaticales) , tal como se aplica a una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos de esta invención, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que está constituido tanto por secuencia enunciada (por ejemplo, la SEQ ID NO) como por un total de diez o menos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) aminoácidos o nucleótidos adicionales en los extremos 5' y/o 3' o en los extremos N y/o C de la secuencia enunciada de modo que la función del polipéptido o polinucleótido no se vea alterada materialmente. El total de diez o menos aminoácidos o nucleótidos adicionales incluye el número total de aminoácidos o nucleótidos adicionales de los dos extremos añadidos conjuntamente. La expresión "materialmente alterado", tal como se aplica a los polinucleótidos de la invención, se refiere a un aumento o disminución en la capacidad de expresar el polipéptido codificado de, al menos, aproximadamente un 50% o más, en comparación con el nivel de expresión de un polinucleótido constituido por la secuencia enunciada. La expresión "materialmente alterado", tal como se aplica a los polipéptidos de la invención, se refiere a un aumento o disminución en una actividad biológica del polipéptido (por ejemplo, la actividad transportadora de azúcares o una mejora de la fermentación) de, al menos, aproximadamente un 50% o más, en comparación con la actividad de un polipéptido constituido por la secuencia enunciada.

Tal como se emplean en la presente, los términos "ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos " y "polinucleótido" se pueden emplear indistintamente y engloban tanto el ARN como el ADN, incluidos el ADNc , ADN genómico, ARNm, ADN o ARN sintético (por ejemplo, sintetizados químicamente) y quimeras de ADN y ARN. Los términos "polinucleótido", "secuencia de nucleótidos" o "ácido nucleico" se refieren a una cadena de nucleótidos, independientemente de la longitud de la cadena. El ácido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario . Cuando es monocatenario, el ácido nucleico puede ser una hebra sentido o una hebra antisentido. El ácido nucleico se puede sintetizar empleando derivados o análogos oligonucleotídicos (por ejemplo, nucleótidos de tipo fosforotioato o inosina) . Estos oligonucleótidos se pueden emplear, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que presenten una capacidad modificada para aparear las bases o una mayor resistencia a nucleasas. La presente invención proporciona además un ácido nucleico que es el complementario (el cual puede ser totalmente complementario o parcialmente complementario) de un ácido nucleico, una secuencia de nucleótidos o un polinucleótido de esta invención.

Un "polinucleótido aislado" es una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, ADN o ARN) que no es inmediatamente contigua a secuencias de nucleótidos con las que es inmediatamente contigua (una en el extremo 5' y otra en el extremo 3 ' ) en el genotna natural del organismo del cual se deriva. Por lo tanto, en una modalidad, un ácido nucleico aislado incluye todas o algunas de las secuencias no codificantes 5' (por ejemplo, el promotor) que son inmediatamente contiguas a una secuencia codificante. Por consiguiente, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que está incorporado en un vector, en un virus o plásmido de replicación autónoma o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción), independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que forma parte de un ácido nucleico híbrido que codifica una secuencia polipeptídica o peptídica adicional. Un polinucleotido aislado que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye un gen de este tipo, sino que, en su lugar, incluye la región codificante y las regiones reguladoras asociadas con el gen, pero no genes adicionales que se encuentran de manera natural en el cromosoma.

El término "aislado" se puede referir a un ácido nucleico o polipéptido que esté sustancialmente exento de material celular, material vírico y/o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recom inante) , o precursores químicos u otros productos químicos (cuando se sintetiza químicamente) . Es más, un "fragmento aislado" es un fragmento de un ácido nucleico o polipéptido que no se produce de forma natural como un fragmento y que no se encontraría en el estado natural. El término "aislado" no quiere decir que el preparado sea técnicamente puro (homogéneo) sino que es lo suficientemente puro para proporcionar el polipéptido o ácido nucleico en una forma en la que se pueda utilizar para el fin deseado.

Una "célula aislada" se refiere a una célula que se separa de otros componentes con los cuales se asocia normalmente en su estado natural. Por ejemplo, una célula aislada puede ser una célula en medio de cultivo y/o una célula en un portador farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, puede suministrarse y/o introducirse una célula aislada en un individuo. En algunas modalidades, una célula aislada puede ser una célula que se extrae de un individuo y se manipula ex vivo y posteriormente se devuelve al individuo.

Se sobreentenderá que el término "fragmento" aplicado a un polinucleótido se refiere a una secuencia de nucleótidos de longitud reducida con relación a un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos de referencia y que comprende, está constituida esencialmente por, y/o está constituida por una secuencia de nucleótidos contiguos idénticos o casi idénticos (por ejemplo idénticos en, al menos, un 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 98% o 99%) respecto al ácido nucleico o secuencia de nucleótidos de referencia. Un fragmento de este tipo de ácido nucleico de acuerdo con la invención, cuando corresponda, puede estar incluido en un polinucleótido mayor del cual sea un constituyente. En algunas modalidades, los fragmentos de este tipo pueden comprender, estar constituidos esencialmente por, y/o estar constituidos por oligonucleótidos con una longitud de al menos aproximadamente 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 o más nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Se sobreentenderá que el término "fragmento" aplicado a un polipéptido se refiere a una secuencia de aminoácidos de longitud reducida con relación a un polipéptido o una secuencia de nucleótidos de referencia y que comprende, está constituida esencialmente por, y/o está constituida por una secuencia de aminoácidos contiguos idénticos o casi idénticos (por ejemplo idénticos en, al menos, un 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 98% o 99%) respecto al polipéptido o secuencia de aminoácidos de referencia. El fragmento de polipéptido de acuerdo con la invención, cuando corresponda, puede estar incluido en un polipéptido mayor del cual sea un constituyente. En algunas modalidades, los fragmentos de este tipo pueden comprender, estar constituidos esencialmente por, y/o estar constituidos por péptidos con una longitud de al menos aproximadamente 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 o más aminoácidos consecutivos de un polipéptido o secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención.

Un "vector" es cualquier molécula de ácido nucleico empleada para la clonación y/o transferencia de un ácido nucleico al interior de una célula. Un vector puede ser un replicón al cual puede estar unida otra secuencia de nucleótidos para permitir la replicación de la secuencia de nucleótidos unida. Un "replicón" puede ser cualquier elemento genético (por ejemplo, un plásmido, fago, cósmido, cromosoma, genoma vírico) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ácidos nucleicos in vivo, es decir, es capaz de replicarse bajo su propio control. El término "vector" incluye tanto las moléculas de ácido nucleico vírico como no vírico (por ejemplo, un plásmido) para introducir un ácido nucleico en el interior de una célula in vitro, ex vivo y/o in vivo. Se pueden utilizar un amplio número de vectores conocidos en la técnica para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores en los genes, etc. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ácido nucleico correspondientes a los elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado se puede lograr ligando los fragmentos de ácido nucleico apropiados en un vector escogido que posea un extremo cohesivo complementario. De manera alternativa, se pueden modificar enzimáticamente los extremos de las moléculas de ácido nucleico o se puede generar cualquier sitio ligando secuencias de nucleótidos (conectores) al extremo del ácido nucleico. Los vectores de este tipo se pueden modificar por técnicas de ingeniería para contener secuencias que codifiquen marcadores seleccionables que hagan posible la selección de las células que contienen el vector y/o hayan incorporado el ácido nucleico del vector en el genoma celular. Tales marcadores permiten la identificación y/o selección de las células hospedadoras que incorporan y expresan las proteínas codificadas por el marcador. Un vector "recombinante" se refiere a un vector vírico o no vírico que comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas (es decir, transgenes), por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias de nucleótidos heterólogas. Un vector de "expresión" se refiere a un vector vírico o no vírico que se diseña para expresar un producto codificado por una secuencia de nucleótidos heteróloga insertada en el vector.

El término "transíección" o "transducción" se refiere a la captación de un ácido nucleico (AR y/o ADN) heterólogo o exógeno por parte de una célula. Se ha "transíectado" o "transducido" una célula con un ácido nucleico heterólogo o exógeno cuando el ácido nucleico se ha introducido o suministrado al interior de la célula. Se ha "transformado" una célula mediante un ácido nucleico heterólogo o exógeno cuando el ácido nucleico con el que ha sido transfectada o transducida confiere un cambio fenotípico a la célula y/o un cambio en la actividad o función de la célula. El ácido nucleico transformante se puede integrar (unir covalentemente) en el ADN cromosómico y constituir parte del genoma de la célula o puede estar presente como un plásmido estable.

El término "heterólogo" respecto a un polinucleótido se refiere a un polinucleótido que no está presente de manera natural en la célula en la cual está ubicado o, de manera alternativa, un polinucleótido que normalmente está presente en la célula pero está en una ubicación diferente de la normal (por ejemplo, en un vector o en una ubicación diferente en el genoma) .

La expresión "célula de levadura recombinante " se refiere a una célula de levadura que comprende un polinucleótido heterólogo. El polinucleótido heterólogo se puede insertar en la célula de levadura mediante cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, el polinucleótido se inserta mediante ingeniería genética (por ejemplo, inserción de un vector de expresión) . En otra modalidad, el polinucleótido se inserta mediante cultivo selectivo (por ejemplo, introgresión) .

Los términos "proteína" y "polipéptido" , tal como se utilizan en la presente, se emplean indistintamente y abarcan tanto los péptidos como las proteínas, a menos que se indique lo contrario.

Una "proteína de fusión" es un polipéptido producido cuando dos secuencias de nucleótidos heterologas o fragmentos de estas codifican dos (o más) polipéptidos diferentes que no se encuentran fusionados en la naturaleza y se fusionan en el marco de lectura traduccional correcto. Los polipéptidos de fusión ilustrativos incluyen fusiones de un polipéptido de la invención (o un fragmento de este) con la totalidad o una parte de la glutatión-S-transferasa, la proteína de unión a la maltosa, o una proteína indicadora (por ejemplo, la proteína fluorescente verde, ß-glucuronidasa, ß-galactosidasa, luciferasa, etc.), hemaglutinina, c-myc, epítopo FLAG, etc.

Tal como se utiliza en la presente, un polipéptido "funcional" o un "fragmento funcional" es aquel que retiene sustancialmente al menos una actividad biológica asociada normalmente con ese polipéptido (por ejemplo, la actividad transportadora de azúcares o la mejora de la fermentación) . En modalidades particulares, el polipéptido "funcional" o "fragmento funcional" retiene sustancialmente todas las actividades que posee el péptido no modificado. Con la expresión que "retiene sustancialmente " la actividad biológica, se quiere dar a entender que el polipéptido retiene, al menos, aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de la actividad biológica del polipéptido nativo (y puede incluso tener un nivel de actividad más elevado que el polipéptido nativo). Un polipéptido "no funcional" es aquel que muestra poca o prácticamente ninguna actividad biológica detectable asociada normalmente con el polipéptido (por ejemplo, como mucho, únicamente una cantidad insignificante, por ejemplo, menos de aproximadamente un 10% o incluso un 5%) . Las actividades biológicas tales como la actividad transportadora de azúcar y la mejora de la fermentación se pueden cuantificar utilizando ensayos muy conocidos en la técnica y que se describen en la presente.

Con el término "expresar" o "expresión" de una secuencia codificante polinucleotídica , se quiere dar a entender que la secuencia se transcribe, y opcionalmente , se traduce. Normalmente, de acuerdo con la presente invención, la expresión de una secuencia codificante de la invención dará como resultado la producción del polipéptido de la invención. El polipéptido completo expresado o un fragmento también puede funcionar en células intactas sin purificación .

La expresión "tiempo de latencia", tal como se utiliza en la presente, se refiere al tiempo transcurrido desde el primer contacto del oligosacárido con la célula de levadura recombinante hasta el momento en el que se detecta por primera vez un aumento en los niveles de etanol .

II . Levadura recombinante que expresa AGT1 AGT1 es una proteína de levadura que actúa como un transportador general de a-glucósidos. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de variantes de AGT1 que son muy eficaces para aumentar el nivel y/o tasa de fermentación de los oligosacáridos en etanol cuando las variantes se expresan de manera recombinante en levaduras .

Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona una célula de levadura recombinante para la producción de etanol a partir de un oligosacárido, donde la célula de levadura recombinante comprende un polinucleotido heterólogo que codifica un polipéptido de tipo AGT1 de levadura; donde el polipéptido de tipo AGT1 de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

Otro aspecto de la invención proporciona un método de modificación de una célula de levadura para disminuir el período de latencia de la producción de etanol durante la fermentación de un oligosacárido, que comprende insertar en la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo AGTl de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTl de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos. En algunas modalidades, se trata de un tiempo de latencia reducido en comparación con el tiempo de latencia durante la fermentación con una célula de levadura que no expresa un polipéptido de tipo AGTl de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de modificación de una célula de levadura para aumentar la cantidad de etanol producido durante la fermentación de un oligosacárido, que comprende insertar en la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo AGTl de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTl de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos. En algunas modalidades, se trata de un aumento en el etanol producido en comparación con la cantidad de etanol producido durante la fermentación con una célula de levadura que no expresa un polipéptido de tipo AGTl de la invención.

MKNIISLVSKKKAASKNEDKNISESSRDIVNQQEVFNTENFEEGKKDSAF 50 ELDHLEFTTNSAQLGDSDEDNENVINETNTTDDANEANSEEKSMTLKQAL 100 LIYPKAALWSILVSTTLVMEGYDTALL ALYALPVFQRKFGTLNGEGSYE 150 ITSQWQIGLNMCVQCGEMIGLQITPYMVEF GNRYTMITALGLLTAYVFI 200 LYYCKSLAMIAVGQVLSAMPWGCFQGLTVTYASEVCPLALRYY TSYSNI 250 C LFGQIFASGIMKNSQENLGNSDLGYKLPFALQWIWPAPLMIGIFFAPE 300 SP WLVRKDRVAEAR SLSRILSGKGAEKDIQIDLTLKQIELTIEKERLL 350 ASKSGSFFDCFKGVNGRRTRLACLTWVAQNTSGACLLGYSTYFFERAGMA 400 TDKAFTFSVIQYCLGLAGTLCS VISGRVGRWTILTYGLAFQMVCLFIIG 450 G GFGSGSGASNGAGGLLLALSFFYNAGIGAVVYCIVTEIPSAELRTKTI 500 VLARICYNIMAVINA1LTPYMLNVSD NWGAKTGLYWGGFTAVTLAWVII 550 DLPETSGRTF5EINELFNQGVPARKFAS VVDPFGKGKTQHDSLADESIS 600 QSSSIKQRELNAADKC 616 (SEQ ID NO:l) En algunas modalidades, el polipéptido de tipo AGT1 es idéntico en al menos un 98%, 98.5%, 99%, 99.5% o 100% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1. En una modalidad, el polipéptido de tipo AGT1 comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l. En otra modalidad, el polipéptido de tipo AGT1 comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

MKN11SLVSKKKAASKNEDKNISESSRDIVNQQEVFNTE FEEGKKDSAF 50 ELDHLEFTTNSAQLGDSDEDNENVINETNTTDDANEANSEE SMTLKQAL 100 LIYP AALWSILVSTTLVMEGYDTALLNALYALPVFQRKFGTLNGEGSYE 150 ITSQWQIGLNMCVQCGE IGLQITPYMVEFMGNRYTMITALGLLTAYVFI 200 LYYCKSLAMIAVGQVLSAMPWGCFQGLTVTYASEVCPLALRYYMTSYSNI 250 C LFGQIFASGIMKNSQENLGNSDLGYKLPFALQ I PAPLMIGIFFAPE 300 SPWWLVRKDRVAEARKSLSRILSGKGAEKDIQIDLTLKQIELTIEKERLL 350 ASKSGSFFDCFKGVNGRRTRLACLTWVAQNTSGACLLGYSTYFFERAGMA 400 TDKAFTFSVIQYCLGLAGTLCSWVISGRVGRWTILTYGLAFQMVCLFI IG 50 G GFGSGSGASNGAGGLLLALSFFYNAGIGAVVYCIVTEIPSAELRTKTI 500 VLARICYNIMAVI AILTPYMLNVSDWNWGAKTGLY GGF VTLAWAI I 550 DLPETTGRTFSSINELFNQGVPARKFASTVVDPFGKGKTQLIR 593 (SEQ ID NO: 3 ) El polipéptido de tipo AGTl incluye fragmentos o partes funcionales (y las secuencias de polinucleótidos que las codifican) de al menos aproximadamente 590 aminoácidos que comienzan en el extremo N. En ciertas modalidades, el fragmento funcional puede tener una longitud de aproximadamente 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, o 616 aminoácidos.

Se ha descubierto que un alelo de AGTl descrito por Han et al., Mol. Microbiol. 17:1093 (1995) ("el alelo de Han") no es eficaz para aumentar la producción de etanol durante la fermentación. El alelo de Han comprende la inserción de un único residuo de lisina después del residuo 396 de la SEQ ID N0:1, así como la sustitución de tres aminoácidos adicionales en las siguientes posiciones: lisina en la posición 396, glutamina en la posición 397 y valina en la posición 398 de la SEQ ID N0:1. En ciertas modalidades, los polipéptidos de tipo AGTl de la invención excluyen cualesquiera alteraciones secuenciales (adiciones, sustracciones y/o sustituciones) en los residuos 390-405 de la SEQ ID N0:1, por ejemplo, los residuos 395-400. En una modalidad, los polipéptidos de tipo AGTl de la invención no comprenden una inserción de uno o más residuos aminoacídicos en el aminoácido 396 de la SEQ ID N0:1.

La presente invención también abarca polipéptidos de fusión de tipo AGT1 (y las secuencias de polinucleótidos que los codifican) . Por ejemplo, puede ser útil expresar el polipéptido (o fragmento funcional) como una proteína de fusión que un anticuerpo comercializado puede reconocer (por ejemplo, los motivos FLAG) o como una proteína de fusión que se puede purificar más fácilmente (por ejemplo, añadiendo una cola de poli-His) . Adicionalmente , se pueden producir proteínas de fusión que mejoran la estabilidad del polipéptido, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden la proteína de unión a la maltosa (MBP, por sus siglas en inglés) o la glutatión-S-transferasa . Como otra alternativa, la proteína de fusión puede comprender una molécula indicadora. En otras modalidades, la proteína de fusión puede comprender un polipéptido que proporciona una función o actividad que es idéntica o diferente de la actividad del polipéptido de tipo AGT1, por ejemplo, una función o actividad enzimática, de direccionamiento o de unión.

Asimismo, se sobreentenderá que los polipéptidos descritos específicamente en la presente tolerarán normalmente las sustituciones en la secuencia de aminoácidos y retendrán sustancialmente la actividad biológica. Para identificar polipéptidos de la invención diferentes de aquellos descritos específicamente en la presente, pueden basarse las sustituciones de aminoácidos en cualquier característica conocida en la técnica, incluidas las diferencias o similaridad relativas de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares.

Se pueden lograr sustituciones de aminoácidos diferentes de aquellas descritas en la presente cambiando los codones de la secuencia de ADN (o secuencia de AR ) , de acuerdo con la siguiente tabla de codones.

TABLA 1 Aminoácido Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCT Cisteína Cys C TGC TGT Ácido aspártico Asp D GAC GAT Ácido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F TTC TTT Glicina Gly G GGA GGC GGG GGT Histidina His H CAC CAT Isoleucina lie I ATA ATC ATT Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L TTA TTG CTA CTC CTG CTT Metionina Met M ATG Asparagina Asn N AAC AAT Prolina Pro P CCA CCC CCG CCT Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT Serina Ser S AGC ACT TCA TCC TCG TCT Treonina Thr T ACA ACC ACG ACT Valina Val V GTA GTC GTG GTT Triptófano Trp W TGG Tirosina Tyr Y TAC TAT En la identificación de secuencias de aminoácidos que codifican polipéptidos diferentes de aquellos descritos específicamente en la presente, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína es generalmente conocido en la técnica (remítase a Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol . 157:105 (1982); que se incorpora a la presente en su totalidad por referencia) . Es algo aceptado que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de su características de carga e hidrofobicidad (Kyte y Doolittle , id. ) , y estos son los siguientes: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteina/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9) y arginina (-4.5) .

En consecuencia, se puede tener en cuenta el índice hidropático del aminoácido (o secuencia de aminoácidos) cuando se modifican los polipéptidos descritos específicamente en la presente.

También es algo conocido en la técnica que la sustitución de aminoácidos se puede llevar a cabo en función de la hidrofilicidad. La patente de los EE. UU. N.° 4.554.101 (incorporada en la presente en su totalidad por referencia) afirma que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, tal como está determinada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Tal como se detalla en la patente de los EE . UU. N.° 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos aminoacídicos : arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (+3.0 + 1) ; serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4) .

Por lo tanto, se puede tener en cuenta la hidrofilicidad del aminoácido (o secuencia de aminoácidos) cuando se identifican polipéptidos adicionales diferentes de los descritos específicamente en la presente.

En ciertas modalidades, el polipéptido de tipo AGTl está codificado por un polinucleótido que es idéntico a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 en al menos un 80%, por ejemplo, en al menos un 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% o 100%. En una modalidad, el polinucleótido comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el polinucleótido comprende, está constituido esencialmente por, o está constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:4. atgaaaaatatcatttcattggtaagcaagaagaaggctgcctcaaaaaatgaggata aaaacatttctgagtcttcaagagatattgtaaaccaacaggaggttttcaatactgaaaattt tgaagaagggaaaaaggatagtgcctttgagctagaccacttagagttcaccaccaattcagcc cagttaggagattctgacgaagataacgagaatgtgattaatgagacgaacactactgatgatg caaatgaagctaacagcgaggaaaaaagcatgactttaaagcaggcgttgctaatatatccaaa agcagccctgtggtccatattagtgtctactaccctggttatggaaggttatgataccgcacta ctgaacgcactgtatgccctgccagtttttcagagaaaattcggtactttgaacggggagggtt cttacgaaattacttcccaatggcagattggtttaaacatgtgtgtccaatgtggtgagatgat tggtttgcaaatcacgccttatatggttgaatttatggggaatcgttatacgatgattacagca cttggtttgttaactgcttatgtctttatcctctactactgtaaaagtttagctatgattgctg tgggacaagttctctcagctatgccatggggttgtttccagggtttgactgttacttatgcttc ggaagtttgccctttagcattaagatattatatgaccagttactccaacatttgttggttattt ggtcaaatcttcgcctctggtattatgaaaaactcacaagagaatttagggaactctgacttgg gctataaattgccatttgctttacaatggatttggcctgctcctttaatgatcggtatcttttt cgctcctgagtcgccctggtggttggtgagaaaggatagggtcgctgaggcaagaaaatcttta agcagaattttgagtggtaaaggcgccgagaaggacattcaaattgatcttactttaaagcaga ttgaattgactattgaaaaagaaagacttttagcatctaaatcaggatcattctttgattgttt caagggagttaatggaagaagaacgagacttgcatgtttaacttgggtagctcaaaatactagc ggtgcctgtttacttggttactcgacatatttttttgaaagagcaggtatggccaccgacaagg cgtttactttttctgtaattcagtactgtcttgggttagcgggtacactttgctcctgggtaat atctggccgtgttggtagatggacaatactgacctatggtcttgcatttcaaatggtctgctta tttattattggtggaatgggttttggttctggaagcggcgctagtaatggtgccggtggtttat tgctggctttatcattcttttacaatgctggtatcggtgcagttgtttactgtatcgtaactga aattccatcagcggagttgagaactaagactatagtgctggcccgtatttgctacaatatcatg gccgttatcaacgctatattaacgccctatatgctaaacgtgagcgattggaactggggtgcca aaactggtctatactggggtggtttcacagcagtcactttagcttgggtcatcatcgatctgcc tgagacaagtggtagaaccttcagtgaaattaatgaacttttcaaccaaggggttcctgccaga aaatttgcatctactgtggttgatccattcggaaagggaaaaactcaacatgattcgctagctg atgagagtatcagtcagtcctcaagcataaaacagcgagaattaaatgcagctgataaatgt (SEQ ID N0:2) atgaaaaatatcatttcattggtaagcaagaagaaggctgcctcaaaaaatgaggata aaaacatttctgagtcttcaagagatattgtaaaccaacaggaggttttcaatactgaaaattt tgaagaagggaaaaaggatagtgcctttgagctagaccacttagagttcaccaccaattcagcc cagttaggagattctgacgaagataacgagaatgtgattaatgagacgaacactactgatgatg caaatgaagctaacagcgaggaaaaaagcatgactttaaagcaggcgttgctaatatatccaaa agcagccctgtggtccatattagtgtctactaccctggttatggaaggttatgataccgcacta ctgaacgcactgtatgccctgccagtttttcagagaaaattcggtactttgaacggggagggtt cttacgaaattacttcccaatggcagattggtttaaacatgtgtgtccaatgtggtgagatgat tggtttgcaaatcacgccttatatggttgaatttatggggaatcgttatacgatgattacagca cttggtttgttaactgcttatgtctttatcctctactactgtaaaagtttagctatgattgctg tgggacaagttctctcagctatgccatggggttgtttccagggtttgactgttacttatgcttc ggaagtttgccctttagcattaagatattatatgaccagttactccaacatttgttggttattt ggtcaaatcttcgcctctggtattatgaaaaactcacaagagaatttagggaactctgacttgg gctataaattgccatttgctttacaatggatttggcctgctcctttaatgatcggtatcttttt cgctcctgagtcgccctggtggttggtgagaaaggatagggtcgctgaggcaagaaaatcttta agcagaattttgagtggtaaaggcgccgagaaggacattcaaattgatcttactttaaagcaga ttgaattgactattgaaaaagaaagacttttagcatctaaatcaggatcattctttgattgttt caagggagttaatggaagaagaacgagacttgcatgtttaacttgggtagctcaaaatactagc ggtgcctgtttacttggttactcgacatatttttttgaaagagcaggtatggccaccgacaagg cgtttactttttctgtaattcagtactgtcttgggttagcgggtacactttgctcctgggtaat atctggccgtgttggtagatggacaatactgacctatggtcttgcatttcaaatggtctgctta tttattattggtggaatgggttttggttctggaagcggcgctagtaatggtgccggtggtttat tgctggctttatcattcttttacaatgctggtatcggtgcagttgtttactgtatcgtaactga aattccatcagcggagttgagaactaagactatagtgctggcccgtatttgctacaatatcatg gccgttatcaacgctatattaacgccctatatgctaaacgtgagcgattggaactggggtgcca aaactggtctatactggggtggtttcacagcagtcactttagcttgggccatcatcgatctgcc tgagacaactggtagaaccttcagtgaaattaatgaacttttcaaccaaggggttcctgccaga aaatttgcatctactgtggttgatccattcggaaagggaaaaactcaactgattcgctagctga tgagagtatcagtcagtcctcaagcataaaacagcgagaattaaatgcagctgataaatgtt (SEQ ID NO:4) En las modalidades de la invención, el polinucleótido que codifica el polipéptido de tipo AGT1 (o un fragmento funcional) se hibridará con las secuencias de ácido nucleico descritas específicamente en la presente o fragmentos de estas en condiciones estándar conocidas por los expertos en la técnica y codificará un polipéptido funcional o fragmento funcional de este.

Por ejemplo, la hibridación de secuencias de este tipo se puede llevar a cabo en condiciones de rigurosidad reducida, rigurosidad media o incluso en condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones representadas por una rigurosidad del lavado de un 35-40% de formamida con solución de Denhardt 5x, un 0.5% de SDS y SSPE lx a 37 °C; condiciones representadas por una rigurosidad del lavado de un 40-45% de formamida con solución de Denhardt 5x, un 0.5% de SDS y SSPE lx a 42 °C; y condiciones representadas por una rigurosidad del lavado de un 50% de formamida con solución de Denhardt 5x, un 0.5% de SDS y SSPE lx a 42 °C, respectivamente) para las secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido de tipo AGT1 o fragmentos funcionales de estas descritos específicamente en la presente. Remítase, por ejemplo, a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2.a Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, los expertos en la técnica comprenderán que puede existir variabilidad en los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de tipo AGT1 (y fragmentos de estos) de la presente invención debido a la degeneración del código genético. La degeneración del código genético, la cual permite que diferentes secuencias de ácidos nucleicos codifiquen el mismo polipéptido, está muy documentada en la bibliografía (remítase a, por ejemplo, la Tabla 1) .

Tal y como se conoce en la técnica, se pueden utilizar varios programas diferentes para identificar si un polinucleótido o polipéptido presenta similaridad o identidad secuencial respecto a una secuencia conocida. La similaridad o identidad secuencial se puede determinar utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, incluidos, sin carácter limitante, el algoritmo de identidad secuencial local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482 (1981), la determinación mediante el algoritmo de alineación de identidad secuencial de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 85:2444 (1988) , mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de isconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI) y el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al. Nucí. Acids Res. 12:387-395 (1984) , preferentemente utilizando la configuración predeterminada o por inspección.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación secuencial múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones por parejas y progresivas. También puede trazar un árbol que muestre las relaciones de agrupamiento utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol . 35:351 (1987); el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151 (1989).

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., J. Mol. Biol . 215:403 (1990) y Karlin et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:5873 (1993). Un programa BLAST especialmente útil es el programa WU-BLAST-2, el cual se ha obtenido a partir de Altschul efc al., Meth. Enzymol. 266:460 (1996); blast . wustl/edu/blast/ EADME . html . WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, los cuales se configuran preferentemente según los valores predeterminados. Los parámetros son valores dinámicos y los establece el mismo programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular en la que se busca la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.

Un algoritmo útil adicional es el BLAST con huecos tal como lo publican Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997) .

Se determina un porcentaje del valor de la identidad secuencial de los aminoácidos mediante el número de residuos idénticos coincidentes dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que tiene el mayor número de residuos propiamente dichos en la región alineada (se ignoran los huecos introducidos mediante WU-Blast-2 para maximizar el puntaje de alineación) .

De manera similar, se define la identidad porcentual secuencial de ácidos nucleicos respecto a la secuencia codificante de los polipéptidos descritos en la presente como el porcentaje de residuos nucleotídicos en la secuencia candidato que son idénticos a los nucleótidos en el polinucleótido descrito específicamente en la presente.

El alineamiento puede incluir la introducción de huecos en las secuencias que se han de alinear. Además, en el caso de las secuencias que contienen más o menos aminoácidos que los polipéptidos descritos específicamente en la presente, se sobreentenderá que en una modalidad el porcentaje de identidad secuencial se determinará basándose en el número de aminoácidos idénticos en relación con el número total de aminoácidos. Así, por ejemplo, en una modalidad, la identidad secuencial de secuencias más cortas que una secuencia descrita específicamente en la presente, se determinará utilizando el número de aminoácidos en la secuencia más corta. En los cálculos de identidad porcentuales no se asigna el peso relativo a las diferentes manifestaciones de variación secuencial, tales como inserciones, eliminaciones, sustituciones, etc.

En una modalidad, únicamente se puntúan positivamente (+1) las identidades y a todas las formas de variación secuencial, incluidos los huecos, se les asigna un valor de "0", el cual obvia la necesidad de parámetros o escala ponderados tal como se describe a continuación para los cálculos de similaridad secuencial. La identidad secuencial porcentual se puede calcular, por ejemplo, dividiendo el número de residuos idénticos coincidentes por el número total de la secuencia "más corta" en la región alineada y multiplicando por 100. La secuencia "más larga" es la que tiene más residuos propiamente dichos en la región alineada.

El polinucleótido que codifica el polipéptido de tipo AGT1 de la invención se puede insertar en una célula de levadura como parte de un vector episomal y/o integrado en el genoma. Se pueden insertar múltiples copias del polinucleótido en la célula, por ejemplo, hasta 10 copias o más, por ejemplo, hasta 100 copias o más.

En una modalidad, el polinucleótido es un vector de expresión que se mantiene de forma episomal y, por tanto, comprende una secuencia para su replicación autónoma. El vector de expresión puede ser uno que mantenga una copia única por célula (por ejemplo, un vector que comprenda un origen de replicación de tipo CEN/ARS) O uno que mantenga múltiples copias por célula (por ejemplo, un vector que comprenda un origen de replicación de 2µ) . Por ejemplo, se pueden seleccionar los siguientes vectores: (a) un vector replicativo (YEP) con un número de copias elevado que dispone de un origen de replicación en levaduras (por ejemplo, YEplacl81) ,- (b) un vector replicativo (Y p) con un número de copias elevado que posee una secuencia cromosómica ARS como origen de replicación; (c) un vector replicativo lineal (YLp) con un número de copias elevado que dispone de una secuencia telomérica como origen de replicación; y (d) un vector replicativo (YCp) con un número de copias bajo que dispone de una ARS cromosómica y secuencias centroméricas .

En otra modalidad, se integra el polinucleótido en una o más copias en el genoma de la célula hospedadora. La integración en el genoma de la célula hospedadora puede ocurrir por recombinación homologa como es bien sabido en la técnica de la genética molecular fúngica (remítase, por ejemplo, a los documentos WO 90/14423, EP-A-0 481 008, EP-A-0 635 574 y la patente de los EE . UU. N. ° 6,265,186). Por ejemplo, se puede seleccionar un vector integrativo (YIp) que no posee origen en las células hospedadoras para su uso en la recombinación homologa.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención estarán asociados normalmente con las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de las secuencias de proteínas insertadas. En concreto, el vector de expresión puede incluir secuencias promotoras y terminadoras para iniciar y terminar la transcripción del gen en la célula de levadura transformada y expresar el polipéptido de tipo AGT1. Los ejemplos de secuencias reguladoras que pueden emplearse en una molécula de ácido nucleico de la invención incluyen los promotores y terminadores de genes de la alcohol-deshidrogenasa I (ADHI) , gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) , 3-fosfoglicerato-cinasa (PGK) , triosa-fosfato-isomerasa (TPI) , fosfofructocinasa (PPK) , piruvato-cinasa (PYK) , GAL1, GAL4, GALIO, CUP1, GAP, CYC1, PH05 , HIS3, ADC1, TRP1, URA3 , LEU2 , ENO, A0X1 u otros promotores que son funcionales en levaduras. En algunas modalidades, el promotor es uno que no es sensible a la represión catabólica (glucosa) . En otras modalidades, el promotor y terminador pueden ser aquellos asociados con un gen AGT1 endógeno. Los ejemplos incluyen un promotor y terminador del gen AGT1 en la cepa de levaduras 1334.

Promotor de AGT1 de 1334 tgctgcataaagttaatgaattaagcaagtcaagagaagatggaacatcagaaccata gtacttctcctcgaaagagcactaattgtgctaaaaaaaaatatgaagtcttggacgttgtggc ataagaagaatcgcgtttacctattatgagataattatggtcatattatgagataattatggtc atattatgctacgaatctgtgtctatattggtgaatttaccatgaaaaagtgatatttccggta catgccattgaacggcttggcttaccttctcaattatcgtgcttggtttaaacgtttcttttgt tccgcttctattttgttgtacttttcgcgcgaggaacaaggtttttttcctttgcctaaatatt tgcctttgggttttggtcctccagagaatatcacgtactatggcagcgaaaggagctttaaggt tttaattaccccatagccatagattctactcggtctatctatcatgtaacactccgttgatgcg tactagaaaatgacaacgtaccgggcttgagggacatacagagacaattacagtaatcaagagt gtacccaattttaacgaactcagtaaaaaataaggaatgtcgacatcttaattttttatataaa gcggtttggtattgattgtttgaagaattttcgggttggtgtttctttctgatgctacatagaa gaacatcaaacaactaaaaaaatattataat (SEQ ID N0:5) Terminador de AGT1 de 1334 Taagtaaaagggttgtttttttttttttggaagaaataaggaatccctttgactgctc ccaaaaccctcagctagctcgagattttatatttatacattttttatttttctgtaaaacattt atatttaccattttttaagcaaaatattgttagtagttagttaagatagcccaagcagcaatca agcaaatatgagagtattttttctttagcacctggtacttgtgcctggatattgattcgaacaa catgccaggtcaaccgtattctcaattaactg (SEQ ID NO:6) Opcionalmente , puede estar presente en el vector un marcador seleccionable . Tal como se emplea en la presente, el término "marcador" se refiere a un gen o secuencia de nucleótidos que codifica un rasgo o fenotipo el cual permite la selección de una célula hospedadora que contiene el marcador o su cribado. El gen o la secuencia de nucleótidos marcadores pueden ser un gen o secuencia de nucleótidos resistentes a antibióticos por medio de los cuales se puede utilizar el antibiótico apropiado para seleccionar las células transformadas de entre las células que no están transformadas. Los ejemplos de marcadores de resistencia a antibióticos adecuados incluyen, por ejemplo, la dihidrofolato-reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, 3'-O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418) . De manera alternativa, se pueden emplear marcadores de resistencia a compuestos que no son antibióticos, tales como los marcadores auxotrófos (URA3, TRP1, LEU2) o el gen TPI de S. pombe (descrito por Russell, Gene 40:125 (1985)). En ciertas modalidades, las células hospedadoras transformadas con los vectores están exentas de marcadores génicos. En el documento EP 0635574 se describen métodos para construir células hospedadoras microbianas exentas de marcadores génicos recombinantes y se basan en el uso de marcadores bidireccionales tales como el gen amdS (acetamidasa) de A. nidulans o los genes URA3 y LYS2 de levaduras. De manera alternativa, se puede incorporar a los vectores de la invención un marcador cribable tal como la proteína fluorescente verde, lacZ, luciferasa, cloranfenicol-acetiltransferasa y/o beta-glucuronidasa, lo que permite el cribado de las células transformadas.

Algunos elementos opcionales más que pueden estar presentes en los vectores de la invención incluyen, sin carácter limitante, una o más secuencias líder, potenciadores , factores de integración y/o genes indicadores, secuencias de tipo intrón, centrómeros, telómeros y/o secuencias de unión a la matriz (MAR) .

La transformación de las células de levaduras con vectores se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos empleados normalmente en ingeniería genética e ingeniería biológica tales como el método de esferoplasto (por ejemplo, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978)), el método del acetato de litio (por ejemplo, J. Bacteriol , 153:163 (1983)), y el método de la electroporación (por ejemplo, Methods in Enzymology, 194:182 (1991)).

Una alternativa a la estrategia recombinante de transformar células de levadura con un plásmido de expresión que porte AGT1 o integrar el cásete de expresión en una ubicación cromosómica en levaduras consiste en la introgresión o cultivo selectivo de un gen AGT1 en un contexto genético deseado tal como el que poseen las cepas industriales de Elite. El cruzamiento de S. cerevisiae y otras levaduras es una técnica ampliamente utilizada, descrita en general en gran número de libros. A modo de ejemplo, se pueden utilizar los siguientes pasos en la introgresión del gen AGT1 procedente de una cepa de levaduras, denominada A, en otra cepa que o bien carece de AGT1 o bien posee un alelo de AGT1 con características no deseadas, denominada cepa B: 1. Transformar cada cepa con plásmidos que portan un componente de selección para diferentes fármacos, por ejemplo, transformar la cepa A con un plásmido que porta kanMX4 para la selección con G418 y la cepa B con un plásmido que porta el marcador hphMX4 para la selección frente a higromicina; 2. Esporular ambas cepas; 3. Cruzar las cepas transformadas A y B y seleccionarlas en medio que contiene ambos fármacos, en este caso G 18 e higromicina; 4. Esporular y determinar el genotipo de las esporas para seleccionar aquellas que portan el alelo de AGTl deseado; y 5. Repetir la estrategia de cruzamiento para mantener la introgresión del alelo de AGTl en el contexto deseado .

La célula de levadura puede provenir de cualquier cepa de levadura que se sepa que fermenta oligosacáridos en etanol o que tenga el potencial para ello. En una modalidad, la levadura se selecciona a partir del grupo constituido por Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Hansenula, Arxula, Candida, Kloeckera y Yarrowia. En otra modalidad, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. La levadura puede ser una que no comprenda un gen AGTl endógeno funcional .

En una modalidad, la célula de levadura es una que no contiene de forma natural un gen AGTl. En otra modalidad, la célula de levadura es una en la cual se ha inactivado el gen AGTl endógeno, por ejemplo, debido a una supresionparcial o completa del gen endógeno o al reemplazo del gen endógeno, en parte o en su totalidad, con un polinucleótido que codifica el polipéptido de tipo AGTl de la invención. La expresión inactivación del gen, tal como se emplea en la presente se refiere al descenso o pérdida de funciones inherentes al gen o polipéptido codificado por el gen inducido mediante diferentes técnicas de ingeniería genética o ingeniería biológica; por ejemplo, disrupción génica (por ejemplo, Methods in Enzymology 194:281 (1991)), introducción de un elemento genético móvil en el gen (por ejemplo, Methods in Enzymology 194:342 (1991)), introducción y expresión del gen antisentido (por ejemplo, la solicitud de patente examinada publicada japonesa N.° 40943/95 y The 23rd European Brewery Conv. Proc, 297-304 (1991)) e introducción de ADN relacionado con el silenciamiento de las cercanías del gen (por ejemplo, Cell 75:531 (1993)).

III . Fermentación de oligosacáridos La célula de levadura recombinante de la invención puede emplearse para fermentar oligosacáridos con niveles y/o tasas mayores. Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona un método de fermentación de un oligosacárido para producir etanol, que comprende poner en contacto el oligosacárido con una célula de levadura recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido de tipo AGT1 de levadura; donde el polipéptido de tipo AGT1 de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 98% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 1 o a un fragmento del extremo N de esta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

El oligosacárido puede ser cualquier oligosacárido que pueda ser transportado al interior de la célula por AGT1. En ciertas modalidades, el oligosacárido es uno con un enlace de tipo a-glucósido. En una modalidad, el oligosacárido es un disacárido o un trisacárido. En otra modalidad, el oligosacárido se selecciona a partir del grupo constituido por isomaltulosa, trehalulosa, maltosa, panosa y maltotriosa. En una modalidad adicional, el oligosacárido es isomaltulosa o trehalulosa. En otra modalidad, el oligosacárido es panosa. En ciertas modalidades, el oligosacárido no es maltosa. En otras modalidades, el oligosacárido no es maltotriosa. En modalidades adicionales, el oligosacárido no es maltosa ni maltotriosa .

El oligosacárido que se ha de fermentar puede proceder de cualquier fuente. En ciertas modalidades, el oligosacárido se obtiene a partir de material vegetal. En una modalidad, el oligosacárido procede de una planta que acumula grandes cantidades de azúcar, por ejemplo, remolacha azucarera, sorgo o caña de azúcar. En otra modalidad, el oligosacárido procede del material celulósico de una planta (por ejemplo, maíz) que se ha hidrolizado en oligosacáridos . En ciertas modalidades, el oligosacárido procede de una planta que se ha modificado para acumular niveles elevados de oligosacáridos, por ejemplo, isomaltulosa y/o trehalulosa, tal como se describe en el documento WO 2009/152285, incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

En ciertas modalidades, la fermentación tiene lugar a una tasa que es más rápida que la tasa cuando se utiliza una célula de levadura que no contiene el polipéptido de tipo AGTl de la invención. La tasa de la fermentación puede ser un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% o 200% o más rápida que la tasa cuando se utiliza una célula de levadura que no contiene el polipéptido de tipo AGTl de la invención. En ciertas modalidades, la producción de etanol durante la fermentación tiene lugar con un tiempo de latencia menor que el que tiene lugar cuando se utiliza una célula de levadura que no contiene el polipéptido de tipo AGTl de la invención. El tiempo de latencia puede ser un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% o 200% o más corto que la tasa cuando se utiliza una célula de levadura que no contiene el polipéptido de tipo AGTl de la invención. En una modalidad, la cantidad de etanol producido durante la fermentación alcanza la mitad del máximo en 15 horas o menos (por ejemplo, en 10 horas o menos) desde que se pone en contacto el oligosacárido con la célula de levadura recombinante . En ciertas modalidades, la cantidad de etanol producido durante la fermentación es mayor que la cantidad producida utilizando una célula de levadura que no contiene el polipéptido de tipo AGTl de la invención. La cantidad de etanol producido puede ser un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150% o 200% o más elevada que la cantidad producida cuando se utiliza una célula de levadura que no contiene el polipéptido de tipo AGTl de la invención.

La fermentación se puede llevar a cabo mediante cualquier proceso conocido en la técnica y descrito en la presente. El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se lleva a cabo en ausencia de oxígeno o en el cual, sustancialmente, no se consume oxígeno, por ejemplo, menos de 5 mmol/L/h, y donde las moléculas orgánicas actúan tanto como donadores de electrones como aceptores de electrones.

El proceso de fermentación se lleva a cabo preferentemente a una temperatura que es óptima para la levadura recombinante . Por lo tanto, para la mayoría de las levaduras, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es inferior a 38 °C. Para las células de levadura, el proceso de fermentación se lleva a cabo preferentemente a una temperatura que es inferior a 35, 33, 30 o 28°C y a una temperatura que es superior a 20, 22 o 25°C.

La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos, los cuales se pretende que sean únicamente ilustrativos, ya que existirán numerosas modificaciones y variaciones de estos que serán evidentes para los expertos en la técnica.

Ejemplo 1 Materiales y métodos Las técnicas de ADN recombinante y clonación molecular estándar utilizadas en la presente son muy conocidas en la técnica y han sido descritas por J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) T. J. Silhavy, M. L. Berman y L. W. Enquist, Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984); y por Ausubel, F. M. et al., Current Protocole in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley- Interscience (1987). Las manipulaciones y cultivo de levaduras se realizaron siguiendo los protocolos publicados (D. C. Amberg, D. J. Burke, J. N. Strathern, Methods in Yeast Genetics : A Cold Springs Harbor Laboratory Course Manual. D. C. Amberg, D. J. Burke, J. N. Strathern, Ed. , (Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, 2005); I. Stansfield, M. J. R. Stark, en Methods in Microbiology, I. S. M. J. R. Stansfield, Ed. (ELSEVIER ACADEMIC PRESS INC, 525 B Street, Suite 1900, San Diego, Ca 92101-4495 EE . UU. , 2007), vol . 36).

Todas las cepas son de Saccharomyces cerevisiae y se obtuvieron a partir de ATCC (204802 y BJ5464) y DSMZ (1884 y 1334) . La cepa que porta una supresionde AGT1 (AAGTl) se obtuvo a partir de la colección de eliminaciones de ORF haploiode (GSA-4, ATCC) . Los plásmidos pGEM30, p416 MET25 y p426 MET25 se obtuvieron a partir de ATCC. Se amplificó el cásete de kanMX4 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de una cepa de levadura que porta una supresiondel locus HO (GSA-7, ATCC) .

Se obtuvieron los fragmentos de AGTl mediante amplificación por PCR a partir de las cepas 1334 (AGT11334 y natAGT11334) y 2048¿2 (AGT1802) . El cásete de expresión de natAGT1334 incluyó el promotor, CDS, y un terminador transcripcional de AGTl procedente de la cepa 1334. El alelo de AGTIHan se sintetizó mediante GeneArt a partir del número de acceso de GenBank L47346 (Han et al., Mol. Microbiol . 17:1093 (1995)). AGT11334, AGT1802 y AGTIHan están constituidos por el CDS de AGTl clonado entre el promotor y el terminador del gen de la triosa-fosfato- isomerasa (TPI) .

Cada cásete de expresión de AGTl (promotor-CDS-terminador) se clonó en tres plásmidos. Los dos primeros tienen un gen ura3 como marcador seleccionable y se derivaron de los plásmidos p416 MET25 y p426 MET25 mediante la sustitución del cásete de expresión. p416 MET25 dispone de un origen de replicación de levaduras de tipo CEN/ARS, el cual mantiene una única copia del plásmido por célula. p426 MET25 dispone de un origen de replicación de 2µ, para un número múltiple de copias del plásmido por célula. El tercer plásmido dispone de un origen de replicación CEN/ARS y un marcador seleccionable de tipo kanMX4 y se derivó de pGEM30.

Las transformaciones de 204802, AAGTl y BJ5464 se realizaron utilizando el kit de transformación de levaduras FAST™ (G-Biosciences, San Luis, MO, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La transformación de la cepa 1848 se realizó mediante electroporación (Thompson et al., Yeast 14 : 565 (1998) ) .

Tras la transformación, las células de levadura se colocaron en placas en un medio que contenía una selección apropiada (medio sintético sin uracilo para los constructos de tipo ura3 o YPD más G418 (Sigma) para los plásmidos de tipo kanMX4) y se cribaron las colonias mediante PCR para confirmar la presencia del cásete de expresión. Se cultivaron dos o tres clones durante toda la noche en 5 mL tanto de medio sintético sin uracilo como de YPD con 200 ug/ml de G418. Se suplementaron ambos medios con un 4% de isomaltulosa . Este cultivo de la noche se utilizó para inocular 45 mL del mismo medio para el ensayo de fermentación. Se monitorizó la producción de etanol cada 10 minutos como una función de la pérdida volumétrica debida a la producción de C02 mediante un robot de ponderación a lo largo del transcurso de 50 horas. Las siguientes Tablas 3 y 4 son las estimaciones del etanol producido al final de las 50 horas.

Ej em lo 2 Diversidad natural de AGT1 en levaduras Con el fin de identificar los alelos de AGT1 que puedan conferir una fermentación de IM superior, se caracterizó este gen a partir de varias cepas de levadura secuenciando y por Southern Blotting de ácidos nucleicos. AGT1 es un gen de copia única presente en la mayoría de las cepas de levadura.

Una hibridación de Southern de ADN procedente de 15 cepas de levadura muestra que todas excepto dos cepas portan una copia de AGT1 (Fig. 1). Las cepas son: 1: 3798; 2: 3799; 3: 1848; 4: 1334; 5: 9763; 6: Ethanol Red; 7: 204802; 8: 201149; 9: 42335; 10: 495; 11: 204802; 12: 475; 13: 200060; 14: 208023; y 15: levadura de panadería comercial. Los carriles de ADN genómico están flanqueados por un marcador de 1 kb. Una de las cepas que carecen de AGT1 es Ethanol Red, un termentador anulado de IM.

Varias cepas de levaduras que son fermentadores anulados o deficientes de IM portan una copia de AGT1, como la cepa 1848. Para averiguar si las secuencias de AGT1 podrían explicar los fenotipos de fermentación de IM, se seleccionaron varias cepas de levadura con un rendimiento de fermentación de IM diferente, y se secuenciaron dos regiones, A y B (Fig. 2), que abarcan los genes IMA1, MALI3 , MALI2 y AGT1. Las secuencias de AGT1 procedentes de las cepas 1334 y 9763 se obtuvieron inicialmente mediante amplificación tan solo del marco abierto de lectura (secuencia codificante) .

Debido a que la región B no pudo amplificarse a partir de las cepas 1334 y 9763, se secuenciaron sus genomas y se obtuvo un contigo que comprendía el ORF de AGTl y 761 pb de la secuencia reguladora en dirección 5' y 282 pb de la secuencia reguladora en dirección 3' para 1334. Se confirmó el contigo ensamblado realizando una amplificación por PCR, clonando y secuenciando la cepa 1334.

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos de AGTl procedente de varias cepas de levadura. En la Fig. 3 se muestra un árbol filogenético de las secuencias de AGTl.

Secuencias de AGTl de levadura 1334: MKNIJ5LVS.K KKAASKNEDK' NISESSRDIV" NQQEVFNTEN.FEEGKKDSAF- 9763: KHlIjSLVS KKAASKÑÉD'NISESSRDIV. NQQEVFNTEN^-FEEGKKDSAE 1848: MKÑTISLVSK KKAASKNEDK NJSESSRDIV NQQEVFTON EEGKDSAF HAN: MKNIÍSLVSK KKAASKNEDK NISESSRDIV NQQEVFNTBNR EEGKKDSAF S288C: MKNITSLVSK KKAASKNE'DK NISESSRDIV 'NQQEVFNTED' 'FEEGKKDSAF 200060: MKÑIÍSLVSK'KKAASKNEDK NISESSRDIV JWQQBVFNTE'D' FEEGKKDSAF 208023: MKNIISLVSK, KKAASKNEDK NISESSRDIV jtíQQEVFNTED FEEGKKDSA?1 10 ' 20 " * 30 40 50 1334: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED- NENVlNE'i'NT' TDDANEANSE EKSMTLKQAL 9763: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED NENVINETNT. TDDANEANSE EKSMTLKQAL 1848: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED NENMINEMNA TDEANEANSE EKSMTLKQAL Han: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED NENVINÉ NA TDDÁNEANSE"EKSMTLKQAL S288C: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED* NENVINEMNA TDDANEANSE EKSMTLKQAL 200060: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED NENVINEMNA TDDANEANSE EKSMTLKQAL 208023: ELDHLEFTTN SAQLGDSDED NENVINEMNA TDDANEANSE EKSMTLKQAL 60 " ' 70 80 90 100 1334 : SI PKAALWS .ILVSTTLVME. GYDTALLNAL. 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YASEVCPLAL, RYYMTSYSNI 9763: LYYCKSLAMI AVGQVLSAMP WGCTQGLTVT YASEVCPLAL 'RYYMTSYSNI 1848: LYYCKSLAMI AVGQVLSAMP WGQFQGLTVT YASEVCPLAL RYYMTSYSNI Han: LYYCKSLAMI AVGQTLSAIP WGCFQSLAVT YASEVCPLAL RYYMTSYSNI S288C: LYYCKSLAMI AVGQILSAIP WGCFQSLAVT YASEVCPLAL .RYYMTSYSNI 200060: LYYCKSLAMI AVGQILSAIP WGCFQSLAVT YASEVCPLAL RYYMTSYSNI 208023: LYYCKSLAMI AVtíQlLSATP WGCFQSLAVT-.YASEVCPLAL ' YYMTSYSNI 210 220 230 240 250 1334: CWLFGQIFAS -JÍMKNSQENL QNSDLCYKLP FALQWIWPAP J.MIGIFFAPE 9763: CWLPGQIFAS '~GIMKNSQENL_GÑSDLGYKLP_ FALQWIWPAP LMIGIFFAPE 1848: SWLFGQIFAS GIMKNSQENL .GNSQLDYKLP FALQWIWPAP LMIG¾FFAPÉ Han: CWLFGQIFAS G' KNISQENL" .GNSDLGYl^ ^FALQWIWPAF LMIGIFFAPE S288C: CWLFGQIFAS GIMKNSQENL "GNSDLGYKLP FALQWIWPAP LMIGIFFAPE 200060: CWLFGQIFÁS, GIMKNSQENL GNSDLGYKLP FALQWIWPAP LMIGIFFAPE 208023: CWLFGQIFAS"GIMKNSQENI GNSDLGYKLP FALQWIWPAP LMIGIFFAPE ' "2Í0 * " " 27?" "280 ~ 290 * 300 1334: SPWWLVRKDR- VAEARKSLSR ILSGKGAEKD IQIDLTLKQI ELTJEKERLL 9763 : SPWWLVRKDR VAEARKSLSR ILSGKGAEKD, IQIDLTLKQI¦ ELTIEKERLL 1848: SPWWLVRKDR VAEARKSLSR ILSGKGAEKD 'IQVDLTLKQI ' ELTIEKERLL Han: SPWWLVRKDR VAEARKSLSR ILS.GKGAEKD IQVDLTLKQI ELTIEKERLL S288C: SPWWLVRKDR ,VAEA~RKSLSR ILSGKG EKDl,;IQVDLTLKQI_-JÍLTJEKERLL 200060: SP«WLVRKDR,_VAEARKSLSR ILSGKGAEKD IQVDLTLKQI ELTIEKERLL1 208023: SPWWLVRKDR VAEARKSLSR-ILSGKGAEKD IQVDLTLKQI ELTIEKERLL 310 320 330 340 350 1334: AJSKSGSFFDC .FKGVNGRRTR LACLTWVAQN TSGACLLGYS TYFFÉR-AGÍ! 9763: ASKSGSFFDG FKGVNGRRTR1 LACLTWVAQN TSGACLLGYS TYFFER-AGíf 1848: ASKSGSFFDC FKGVNGRRTR LACLAWVAQN TSGACILGYS TYFF Han: ASKSGSF¡FNC FKGVNGRRTR LÁCLTWVAQN SSGAVLLGYS TYFFEKKQVM S288C: ASKSGSFFNC FKGVNGRRTR LACLTWVAQN SSGAVLLGYS -TYFFER-AGM 200060: ASKSGSFFNC FKGVNGRRTR LACLTWVAQN SSGAVLLGYS TYFFER-AGM 208023: ASKSGSFFNC FKGVNGRRTR LACLTWVAQN SSGAVLLGYS 'TYFFER- G ' 360 370 ' "" 380 390 * 400 1334: ATDKAFTFSV; .IQYCLGLAGT* -LCSWVISGRV GRWTILTYGL , AFQMVCLFII 9763: ÁÍD AFTFSV IQY¾LGLAG "LCSWVISGRV GRW ILTYGL AFQMVCLFII 1848: ' Han: ATDKAFTFSL IQYCLGLAGT LCSWVISGRV GRWTILTYGL AFQMVCLFII S288C: ATDKAFTFSL , IQYCLGLA'GT: LCSWVISGRV GRWTILTYGL AFQMVCEFII 200060: ATDKAFTFSL" IQYCLQLAGT" LCSWVISGRV . GRWTILTYGL ÁFQMVCLFÍJ 208023: ATDKAFTFSL IQYCLGLAGT LCSWVISGRV GRWTILTYGL. AFQMVCLFII 410 " 420 "430 440 450 1334 GGMGFGSGSG ASNGAGGLLL ALSFFYNAGI GAWYCIVTE IPSAELRTKT 9763: GGMGFGSGSG ASNGAGGLLL ALSFFYNAGI. GAWYCIVTE IPSAELRTKT 1848: Han: GGMGffiSSGSS'' ASNGAGGÍÍLL ALSFFYNAGI GAVVYCIVAE IPáAELRTKT S288C. GGMG ¾§G;SS ASNGAGGLLL ALSFFYNAGI GAVVYCIVAE IPSAELRTKt 200060: GGMGFGSGSS ASNGAGGLLL ALSFFYNAGI' GAVVYCIVAE IPSAELRTKT-208023: GGMGFGSGSS" ASNGAGGLLL ALSFFYNAGI GAVVYCIVAE IPSAELRTKT 460~ " "47*0 480 490* 500 1334, IVLABICYNI:. MAVINATLTP YMLNVS DWNW GAKTGLYWGG FTAVTLAWVIÍ 9763: IVLARICYNI MAVINAILTP. YMLNVSDWNW GAKTGLYWGG FTAVTLAWA| 1848 Han: IVLÁRICYNL MAVINAILTP .YMLNVSDWNW GAKTGLYWGG FTAVTLAWVI S288C: IVLARICYNL MAVINAILTP YMLNVSDWNW GAK¾GEYWGG FTAVTLAWV 200060: I L LCYNLL AVINAILTP YM SD NW; -GAKTGLYWGG FTAVTLÁ V| 208023; IVLARJCYNL MAVINAILTP YMLNVSDWNW, GAKTGLYWGG FTSVTL V| 510* ~~ 520 " 530 ' 540 *" 550 1334: IDLPETSGRT FSEINELFNQ GVPARKFAST ~V¾pPFGKGKT QHDSLADESI 9763: 1DLPETTGRT FSEINELFNQ GVPARKFAST WDPFGKGKT QLIR-; 1848 Han: IDLPETTGRT FSEINELFNQ GVPARKFAST WDPFGKGKT QHDSLADESI S288C: IDLPETTGRT_ FSEINELFNQ GVPARKFAST WDPFGKGKT, QHDSLADESI 200060: IDLPETTGRT 'FSEINELFNQ- GVPARKFAST VVDPFGKGKT ,QHDSLADESI 208023: IDLPE'TTGRT' FSEINEI'.FNQ- VPARKFAST .WDPFGKGKT QHDSLADESI '''''"'560 " " '570 " 580 ¾ 590 ' 600 1334: SQSSSIKQRE LNAADKC (SEQ ID NO:l) 9763: ——- ------ (SEQ ID NO: 3} 1848: (SEQ ID NO: 7) Han: SQSSSIKQRE LNAADKC (SEQ ID NO: 8) S288C: SQSSSIKQRE LNAADKC (SEQ ID NO: 9) 200060: SQSSSIKQRE LNAADKC (SEQ ID NO: 10) 208023: SQSSSI QRE < NA DKC (SEQ ID NO: 11) 610 La mayoría de las cepas tienen una proteína de tipo AGTl constituida por 616 aminoácidos. El alelo de AGTIHan tiene una longitud de 617 aminoácidos (Han et al., Mol. Microbiol . 17:1093 (1995)) y hay dos cepas con codones de parada tempranos, 9763 y 1848. AGTl procedente de la cepa 9763 (AGT19763) es muy similar a AGT11334 pero su secuencia es 26 aminoácidos más corta. La secuencia de aminoácidos de AGT19763 es idéntica en más de un 99% a AGT11334. Por el contrario, las secuencias de AGTl procedentes de S288C, 200060 y 208023 solamente son idénticas a AGT11334 en un 97%.

La secuencia de aminoácidos de AGTIHan, además de ser idéntica a AGT1134 en menos de un 97%, también contiene una inserción de un único aminoácido tras el residuo 396.

Se evaluó el rendimiento de la fermentación de las cepas para las cuales se secuenció AGTl totalmente. La Fig. 4 y la Tabla 2 muestran la producción de etanol a partir de un 4% de IM. Los promedios y las desviaciones estándar provienen de triplicados. Las cepas 1334 y 9763 son buenos termentadores de IM, pero 1334 es considerablemente mejor. AGT11848 es mucho más corta, tan solo 394 aminoácidos, y esta cepa es prácticamente un termentador nulo. A partir de estos datos, es probable que el grupo que incluye AGT19763, AGT11334, y tal vez AGT11848, contenga sustituciones que confieren una fermentación de IM superior y las diferencias en la fermentación, especialmente AGT19763 vs . AGT11334, se deban a terminaciones tempranas en la secuencia proteica.

Ej emplo 3 La expresión de natAGTli334 en tres cepas de levadura aumenta la fermentación de isomaltulosa Se transformaron tres cepas (1884, 204802 y BJ5464) con un plásmido que portaba el cásete de expresión de natAGT11334 y un origen de replicación de tipo CEN/ARS. Se realizó la selección cultivando la levadura transformada en medio que contenía 200 ]ig/ml de G418. Los resultados se muestran en la Tabla 3, donde W corresponde al vector de control vacío, AGT1 es la levadura que expresa natAGT11334 y 1848, 204802 y BJ5464 son tres cepas de levadura.

Tabla 2.

Tabla 3. Cantidad de etanol producido por levaduras que expresan AGTl.

XE1 promedio y la desv. est. son el resultado de dos réplicas. 2E1 promedio y la desv. est. son el resultado de tres réplicas.

Ejemplo 4 Expresión de los tres alelos de AGTl en una cepa AAGTl Con el fin de separar los efectos del AGTl endógeno del transgen, se expresaron los alelos de AGTl en una cepa que carecía de AGTl. Se utilizó la cepa con una supresionde AGTl de la colección de eliminaciones de ORF diploide (GSA-7) . Los plásmidos de expresión consistieron en tres alelos de AGTl (AGTIHan, AGT11334 y AGT1802) clonados entre el promotor y terminador del gen de la triosa-fosfato-isomerasa (TPI) . De manera adicional, se clonó el gen completo procedente de 1334, incluidos el promotor y terminador (natAGT11334 ) . Cada cásete de expresión de AGT1 (promotor-CDS-terminador) se clonó en dos plásmidos, donde ambos tienen el gen ura3 como marcador seleccionable y se derivaron de los plásmidos p416 MET25 y p426 MET25 mediante la sustitución del cásete de expresión. p416 MET25 dispone de un origen de replicación de levaduras de tipo CEN/ARS, el cual mantiene una única copia del plásmido por célula. p426 MET25 dispone de un origen de replicación de 2u, para un número múltiple de copias del plásmido por célula. W corresponde al vector de control vacío. El promedio y la desv. est . son el resultado de tres réplicas. No se realizaron ni un control positivo (cepa 1334) ni un control negativo (Ethanol Red) en las réplicas.

Se observó que natAGT11334, AGT11334 y AGT1802, pero no AGTIHan, eran capaces de conferir el fenotipo de fermentación de IM en la cepa deficiente en AGT1 (Fig. 5 y Tabla 4) pero hubo diferencias perceptibles en la cantidad total de etanol producido así como en la tasa de fermentación entre las cepas dependiendo del cásete de expresión utilizado. Debido a que los plásmidos que portan el alelo AGTIHan no produjeron cantidades significativas de etanol, este no se discute en el siguiente párrafo.

Tabla 4. Cantidad de etanol producido por levaduras que expresan diferentes alelos de AGT1.

Las levaduras que portaban múltiples copias de los plásmidos que sobreexpresan AGT1 (2u/AGTli334 y 2u/AGTl802) produjeron una cantidad de etanol significativamente menor que los mejores productores y la fermentación de IM en estas cepas tuvo lugar mucho más lentamente (Fig. 6) . En el otro extremo, los que tuvieron un mejor rendimiento desde el punto de vista del etanol final producido y su tasa de fermentación fueron las cepas que sobreexpresaron AGT1 a partir de un plásmido con una única copia (CEN/AGTli334 y CEN/AGT1802) y la levadura que portaba múltiples copias de natAGTli334 (2µ/natAGTll334) . La levadura que portaba una única copia de natAGTli334 (CEN/natAGTl1334) fermentó aproximadamente la misma cantidad que la mejor pero lo hizo con una tasa más lenta.

Los datos muestran que se pueden incrementar los niveles de AGT1 hasta cierto punto, a fin de obtener una fermentación de IM más rápida a través tanto del número de copias del gen o mediante la fortaleza del promotor. Sin embargo, por encima de un cierto umbral, una cantidad de AGT1 adicional es perjudicial para la fermentación de IM, lo que tal vez refleja un efecto metabólico negativo que es el resultado de demasiado AGTl.

La alineación de aminoácidos de los alelos de AGTl en el Ejemplo 2 muestra que AGTlHan porta una inserción de un aminoácido además de tres sustituciones no conservadas respecto a AGT1802 y AGTli334. Las alteraciones de aminoácidos se deben a un par de inserciones de nucleótidos en el gen AGTl tal como se muestra a continuación, lo que genera un desplazamiento del marco de lectura y aminoácidos extra. Los aminoácidos del área alterada son aminoácidos muy conservados y son, probablemente, la razón de la pérdida de la función de AGTlHan.

Ejemplo 5 Fermentación de panosa Se evaluaron dos cepas de Saccharomyces cerevisiae respecto a la fermentación de panosa, Ethanol Red y 1334. Se centrifugó 1 mL de cultivo de levadura de la noche (base de peptona de levadura, isomaltulosa al 4%) y se resuspendió el sedimento en 1 mL de panosa al 4% en un tubo eppendorf de 1.5 mL. Se incubaron las muestras toda la noche, -16 horas, después de lo cual se centrifugaron para sedimentar las células y se tomaron los sobrenadantes para el análisis de carbohidratos. La separación y detección de carbohidratos se realizó mediante un sistema Dionex IC3000 con un automuestreador Dionex AS, un compartimento de detección Dionex DC (detección amperométrica pulsada (PAD, por sus siglas en inglés) utilizando un electrodo con superficie de oro certificado para carbohidratos Dionex desechable) y un sistema de bomba Dionex SP. En la separación con una resolución elevada, se utilizaron para el análisis una precolumna Carbopac PA200 3x50 mra y a continuación una columna analítica Carbopac PA200 3x250 mm. Se fijaron los potenciales del electrodo respecto al cuad. estándar de carbohidratos con un electrodo de AgCl de referencia tal como lo especifica la Corporación Dionex. El sistema eluyente utilizó una fase móvil isocrática constituida por NaOH 100 mM y un gradiente de NaOAc de 0 a 900 mM y a 0 con un tiempo de ejecución de 30 min. La identificación de los picos se basó en el tiempo de retención estándar de la panosa (Sigma) . El análisis de los picos utilizó la versión 7.0 del software Chromeleon (Dionex Corp., Sunnyvale, CA) .

Los resultados muestran que la cepa 1334 es capaz de fermentar panosa (Fig. 7) . En estas condiciones, 1334 degradó aproximadamente un 50% de la panosa de la muestra.

Lo expuesto previamente es ilustrativo de la presente invención y no se debe interpretar como limitante de esta. La invención se define mediante las siguientes reivindicaciones y los equivalentes de las reivindicaciones deben incluirse en ella.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para fermentar un oligosacárido para producir etanol, caracterizado porque comprende contactar el oligosacárido con una célula de levadura recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido de tipo AGTI de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTI de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 un fragmento del extremo N-terminal de ésta de al menos 590 aminoácidos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligosacárido es un disacárido o un trisacárido, tal como un oligosacárido seleccionado del gripo consistente de isomaltulosa, trehalulosa, maltosa, panosa y maltotriosa.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el oligosacárido se obtiene del material de planta, tal como maíz, remolacha de azúcar, sorgo y caña de azúcar.

. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la cantidad de etanol producido durante la fermentación alcanza la mitad del máximo en 15 horas desde que se pone en contacto con el oligosácarido, tal como en 10 horas desde que se pone en contacto con el oligosacárido .

5. Un método para modificar una célula de levadura para disminuir el tiempo de latencia para la producción de etanol o incrementar la cantidad de producción de etanol durante la fermentación de un oligosacárido, caracterizado porque comprende insertar en una célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo AGTI de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTI de levadura comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento del extremo N-terminal de ésta o al menos aproximadamente 590 aminoácidos .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polinucleótido est : a) en una expresión de vector; y/o b) integrado en el genoma de la célula de levadura recombinante, tal como por introgresión.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la expresión de vector mantiene: a) Una sola copia por célula, tal como una expresión de vector que comprende un origen de replicación de CEN/ARS; y/o b) múltiples copias por célula, tal como una expresión de vector que comprende un origen de replicación de 2µ.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el polipéptido comprende : a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1; o b) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la levadura recombinante no comprende un gen AGTI endógeno funcional.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la célula de levadura recombinante es : a) de una cepa seleccionada del grupo consistente de Saccharo yces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwannio yces, Pichia, Hansenula, Arxula, Candida, Kloeckera y Yarrowia; o b) Saccharomyces cerevisiae .

11. Una célula de levadura recombinante para la producción de etanol de un oligosacárido, caracterizada porque comprende un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido de tipo AGTI de levadura; donde el polipéptido de tipo AGTI de levadura comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l o un fragmento del extremo N-terminal de ésta de al menos aproximadamente 590 aminoácidos.

12. La célula recombinante de levadura de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el polinucleótido está a) En un vector de expresión; y/o b) integrada en el genoma de la célula recombinante de levadura, tal como la introgresión .

13. La célula recombinante de levadura de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la expresión de vector mantiene a) Una sola copia por célula, tal como una expresión de vector que comprende un origen de replicacion de CEN/ARS; y/o b) múltiples copias por célula, tal como una expresión de vector que comprende un origen de replicacion de 2µ.

14. La célula de levadura recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizada porque el polipéptido de tipo AGTI comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 1; o b) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

15. La célula de levadura recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizada porque la levadura recombinante no comprende un gen AGTI endógeno funcional.

16. La célula de levadura recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizada porque la célula de levadura es: a) de una cepa seleccionada del grupo consistente de Saccharo yces, Schizosaccharomyces, Kluyvero yces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Hansenula, Arxula, Candida, Kloeckera y Yarrowia; o b) Saccharomyces cerevisiae .