KR101102460B1 - 글리세롤을 발효원으로 하는 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합벡터, 형질전환체 및 그 전환체를 이용한 에탄올 생산방법 - Google Patents

글리세롤을 발효원으로 하는 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합벡터, 형질전환체 및 그 전환체를 이용한 에탄올 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리세롤을 발효원으로 하는 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합벡터, 형질전환체 및 그 전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 도입된 재조합 벡터 및 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein) 유전자 삽입된 재조합 벡터 그리고 상기 벡터로 형질 전환된 효모 형질 전환체 및/또는 이들을 이용한 에탄올 생산 증대 방법에 대한 것이다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 유래한 글리세롤 디히드로게나제와 디히드록시아세톤 키나아제는 글리세롤을 해당과정의 중간물질로 효율적으로 전환함으로써 이 유전자를 바이오 에탄올 생산능이 있는 효모에 형질 전환 시켜 기존의 야생형과 비교하여 에탄올 생산능이 증가됨을 확인하였다. 또 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 유래한 글리세롤 업테이크 프로테인은 글리세롤에 대해 투과성을 가지는 효소로써 글리세롤을 세포내로 이동시켜 글리세롤을 해당과정 중간 물질인 디에치에이피 (DHAP)로 전환하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 사카로마이세스 세레비지애 속 미생물로부터 유래한 글리세롤 디히드게나제, 디히드록시아세톤 키나아제와 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자가 도입된 효모 형질 전환체는 공정에 유용하게 사용될 수 있다. 글리세롤을 기질로 한 발효결과 상기 유전자들이 도입된 효모 형질 전환체가 그렇지 않은 효모균주보다 많은 양의 에탄올을 생성하였다.
글리세롤, 재조합벡터, 효모, 형질전환체, 에탄올,

Description

글리세롤을 발효원으로 하는 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합벡터, 형질전환체 및 그 전환체를 이용한 에탄올 생산방법{A recombinant vector, and a transformant using glycerol as a fermentation source with improved productivity of bio-ethanol, and a method of producing ethanol using the same}
본 발명은 글리세롤을 발효원으로 하는 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합벡터, 형질전환체 및 그 전환체를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이오 에탄올 제조에 있어서 생산균주인 효모가 바이오디젤의 부산물로 생성이 되는 글리세롤을 효과적으로 해당과정의 중간물질로 변환시킬 수 있게 하는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 도입된 형질전환체에 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 유전자 삽입한 재조합 벡터 및 이를 도입한 효모 형질 전환체 및 이를 이용한 에탄올 생산방법에 관한 것이다.
최근 원유가격의 급등과 에너지 고갈에 대한 우려가 심각해지면서 대체 에너 지 생산에 관한 관심이 증폭되고 있다. 대체 에너지 중 수송용 연료의 경우 가장 활발하게 대두되고 있는 소재가 바로 바이오 에탄올이다. 이는 자동차의 최종 기술 목표인 전기자동차 또는 수소자동차의 개발단계까지 현재의 아직도 개발초기 단계여서 이의 완료까지 이를 대체할 수 있는 절충형의 대체에너지가 필요하다. 현재 바이오 에탄올은 휘발유와 혼합하여 사용할 수 있어 바이오 디젤과 더불어 대표적인 재생자원 에너지이며 바이오 에탄올 연소 시 발생하는 이산화탄소는 교토의정서에서 규정한 온실가스 계산에서 예외 적용을 받아 온실가스 감축효과가 있다. 또한 보급에 별도의 인프라 (주유소 등) 구축이 필요한 다른 청정연료와는 달리 기존 인프라에서 보급이 가능해 조기 상용화가 용이하다.
글리세롤은 C3H8O3로 C6H12O6인 글루코오스 (glucose)에 비하여 1단계 환원된 물질로서 미생물의 대사 과정에서 보다 향상된 환원력을 제공할 수 있다. 발효를 통하여 생산되는 많은 물질이 그 대사과정에서 환원력을 요구하는 경우가 많기 때문에 글리세롤을 기질로 효과적으로 이용할 수 있다면, 원하는 발효산물의 수율 및 생산성의 향상을 가져 올 수 있다. 그러나, 이러한 특성에도 불구하고 현재까지 글리세롤을 이용한 연구는 한정되어 있었다. 그 이유는 기존 발효 산업에서 효과적으로 이용되었던 탄소원에 비하여 글리세롤이 고가였기 때문이다. 그러나, 현재는 바이오 디젤의 생산량이 늘어남에 따라 글리세롤의 생산량 늘어났기 때문에 가격이 급격히 하락하고 있는 실정이다. 이러한 점에 근거하여 최근 글리세롤을 포함하는 바이오디젤의 부산물을 이용하여 수소 및 에탄올을 생산하는 경우가 보고되었으나, 에탄올 생산의 대표적인 발효균주인 사카로마이세스 세레비제에서의 경우는 아직 그 예를 찾을 수 없다.
지금까지 글리세롤은 비누 제조업, 지방산 제조업, 왁스 및 계면활성제 생산 제조업 등에서 생산되었으나, 상기한 바와 같이 바이오디젤의 생산량이 급증함에 따라, 부산물인 글리세롤의 생산도 늘어나 글리세롤을 포함하고 있는 부산물을 효과적으로 처리하는 문제가 발생할 것이다. 또한, 정제된 글리세롤의 경우도 가격이 급락할 것으로 예상된다. 따라서, 글리세롤을 이용하여 효과적으로 발효에 의해 유용한 발효산물을 생산할 수 있다면 많은 부속 효과를 가져 올 수 있다.
미생물의 글리세롤 이용은 대장균(Escherichia coli)과 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 잘 알려져 있다 (Srienc F et al. 2009; Gonzalez R et al. 2008). 대장균에 있어서, 세포 외부의 글리세롤은 에너지의 소모 없이 수분 뿐만 아니라 글리세롤과 요소에 대한 투과성을 가지는 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin)의 하나인 GlpF를 이용하여 세포 안으로 들어오게 된다. 들어온 글리세롤은 글리세롤 키나아제(glycerol kinase)에 의하여 글리세롤-3-인산으로 전환된 후, 글리세롤-3-인산 디히드로게나제(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase)에 의해 디히드록시아세톤인산 (dihydroxyacetonephosphate, DHAP)로 전환되며 트리오스 인산 이소머라제 (Triosephosphate isomerase, TpiA)에 의하여 글리세로알데히드-3-인산(glyceroaldehyde-3-phosphate, G-3-P)로 전환되어 해당과정을 거쳐 대사되게 된다( Wei D et al. 2008; Wendisch VF et al. 2008). 본 발명에서는 현재 알려지지는 않은 사카로마이세스 세레비지애의 대사경로를 이용한 것으로 글리세롤에 대한 투과성을 가지는 Gup1을 이용하여 세포안으로 들어오게 된다. 들어온 글리세롤은 글리세롤 디히드로게나제(glycerol dehydrogenase, Gcy)에 의하여 디히드록시아세톤 (dihydroxyacetone, DHA)으로 전환된 후, 글리세롤 키나아제 (dihydroxyacetone kianse, DHA kinase)에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxyacetone phosphate: DHAP)로 전환된 후 대사된다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 바이오 에탄올 제조에 있어서 생산균주인 효모가 기질로 제공되는 글리세롤을 효과적으로 분해할 수 있도록 하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용한 에탄올 생산방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리세롤 디히드로게나제(glycerol dehydrogenase, 이하, Gcy1이라함)와 디히드록시아세톤 키나아제(dihydroxyacetone kinase, 이하, Dak1이라함) 유전자가 양방향 삽입된 재조합 벡터 pGcyaDak를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 1에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤 디히드로게나제 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 글리세롤 디히드로게나제에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase) 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 디히드로게나제 유전자에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase)는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 3에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 디히드록시아세톤 키나아제 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 디히드록시아세톤 키나아제에 포함된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 디히드록시아세톤 카나아제 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 4에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 디히드록시아세톤 키나아제 유전자에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase)는 바람직하게는 효모, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2a의 개열지도를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pGup를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 업테이크 프로테인은 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 5에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 부가 등의 돌연변이가 유발된 글리세롤 업테이크 프로테인 활성을 가진 돌연변이체도 본 발명의 글리세롤 업테이크 프로테인에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자는 서열번호 6에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 6에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 업테이크 프로테인 유전자에 포함된다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터 pGup는 도 2b의 개열지도를 가지는 재조합 벡터가 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 벡터 pGup를 포함하는 효모에 본 발명의 재조합 벡터 pGcyaDak가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM11042P인 형질 전환체 효모 사카로마이시스 세레비지애 YPH499aGup/pGcyaDak인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 재조합 벡터 pGup를 포함하는 효모에 본 발명의 재조합 벡터 pGcyaDak를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환체 효모 사카로마이시스 세레비지애 YPH499aGup/pGcyaDak의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 글리세롤을 기질로 하여 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 글리세롤은 바이오디젤의 부산물로 생성된 글리세롤인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물을 제공한다. 본 발명의 에탄올 생성물 조성물은 예를 들어 상기 형질전환체를 배양하여 글리세롤을 기질로 하여 에탄올을 생성하는데 적합한 폴리펩타이드, 브로쓰, 세포 용해물, 정제 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩타이드 등을 포함한다.
또한 발명은 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자 pGup1을 유전자 삽입한 사카로마이시스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) YPH499pGup1을 제공한다.
본 발명에서 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방 법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.
또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.
본 발명에 관한 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 생성축적시켜, 배양물로부터 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 균체 내에 축적시키고, 회수한다.
탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.
질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.
또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.
글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키 나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 취득은, 얻게 되는 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 또는 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
글리세롤 (glycerol)은 바이오디젤 생산시 생산되는 부산물로서, 글리세롤을 해당과정의 중간물질로 변환시키기 위하여 글리세롤 디히드로게나제(glycerol dehydrogenase, Gcy)에 의하여 디히드록시아세톤 (dihydroxyacetone, DHA)으로 전환된 후, 글리세롤 키나아제 (dihydroxyacetone kianse, DHA kinase)에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxyacetone phosphate: DHAP)로 전환된 후 대사된다.
반응식 1
글리세롤 + NAD+ → DHA + NADH + H+
반응식 2
DHA + ATP → DHAP + ADP
본 발명의 실시예에서는 Gcy, Dak, Gup 유전자를 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 얻었고, 얻어진 상기 유전자를 효모-대장균 셔틀벡터(yeast-E. coli shuttle vector)에 서브 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 이후, 상기 Gcy와 Dak을 양방향 삽입한 재조합 벡터를 이용하여 효모 숙주세포를 형질 전환시켰다. 이후, Gup1의 유전자 삽입을 위하여 효모-유전자 삽입벡터( yeast-integration vector)에 구축하였으며 이를 사카로마이세스 세레비지애에 유전자 삽입하였다. 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 글리세롤을 이용한 에탄올 생산을 조사하였다.
이로써, 본 발명에 따라 재조합되고 형질 전환된 pGcyaDak 유전자에 의하여 에탄올 생산이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따라 재조합되고 형질 전환된 YPH499pGup1/paEngDaBG1에 의하여 에탄올 생산이 증가됨을 확인할 수 있었다.
따라서 대표적인 에탄올 생산균주인 효모 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 글리세롤을 이용한 에탄올의 생산은 잘 알려 지지 않았으므로 본 발명자는 사카로마이시스 세레비지애로부터 유래한 글리세롤 디히드로게나제와 디히드록시아세톤 키나아제 유전자의 양방향 도입과 유전자 삽입된 글리세롤 업테이크 프로테인이 도입된 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질 전환된 효모 형질 전환체를 개발하여 이를 대한민국 서울시 서대문구 홍제동 소재 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 11042P로 2009년 10월 7일에 기탁하였다. 뿐만 아니라 상기 효모 형질 전환체가 글리세롤을 효과적으로 분비하여 에탄올 생산이 효율적으로 증가한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 도입된 형질전환체에 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)을 유전자 삽입한 재조합 벡터 및 이를 도입한유전자를 효모 균주에 도입하였다. 이후, 상기 효모균주에 비하여 에탄올 생산수율이 높아진 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 도입된 형질전환체에 글리세롤 업테이크 프로테인(glycerol uptake protein)을 유전자 삽입한 효모 형질 전환체는 바이오디젤의 부산물로 생성이 되는 글리세롤을 이용하여 에탄올을 생산할 수 있어 매우 유용한 발명인 것으로 기대된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 효모의 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제, 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 증폭
글리세롤을 해당과정의 중간물질인 DHAP로 효율적으로 전환하기 위하여 글리세롤 디히드로게나제, 디히드록시아세톤 키나아제 유전자를 클로닝하기 위하여 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이 (BY4741) 로부터 펩타이드 부분의 염기서열을 참고로 하여 Gcy의 클로닝을 위하여 BamH (5‘-ggatccatgcctgctactttacatga
ttct-3’;서열번호 7), Sal ( 5‘-gtcgacatacttgaatacttcgaaaggag-3‘;서열번호 8), Dak는 Spe (5’-actagtatgtccgctaaatcgtttgaagtc-3‘;서열번호 9), Cla(5’-atcgatatacaaggcgctttgaaccccctt-3‘;서열번호 10) 그리고 Gup1에는 EcoR(5‘-gaattcatgtcgctgatcagcatcctg-3’;서열번호 11), Spe(5‘-actagtccagca
ttttaggtaaattccgtg-3’;서열번호 12)으로 각각의 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. 이후 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 각각 936bp, 1755bp 그리고 1683bp의 PCR 밴드를 확인할 수 있었고 도면 1에 각각 도시하였다.
< 실시예 2> 글리세롤 디히드로게나제 , 디히드록시아세톤 키나아제 , 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 클로닝
상기 실시예 1에서 얻은 증폭산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였고 아가로스 겔 상의 DNA 절편은 Biospin gel extraction kit (Bioflux)를 사용하여 회수하였다.
그 후, Gcy는 BamH, Sal, Dak는 Spe, Cla그리고 Gup1은 EcoR, Spe으로 절단한 후 효모-대장균 셔틀 벡터 (yeast-E. coli shuttle vector) 인 pESC-trp (Clontech) 에 라이게이션 (ligation) 시켜 에스세리시아 콜라이 (대장균, E. coli) DH5a에 형질 전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 (ligation) 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 각각pESC-Gcy, pESC-Dak, pESC-Gup이라 명명하였다. 그 후 pESC-Gcy를 벡터로 하여 Dak를 클로닝하여 에스세리시아 콜라이 DH5a(인비트로겐(Invitrogen)에 형질 전환을 하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 pGcyaDak이라 명명하였고 도면 2에 도시하였다. 또한 pESC-Gup1을 유전자 삽입하기 위하여 BamH1 인식서열을 포함하도록 sense primer (5‘-ggatccatgt cagcattttaggtaaattccgtg-3‘;서열번호 13) 그리고 anti-sence primer (5’-ggatccataatgtcgctgatcagcatcctg tct-3‘;서열번호 14)를 제작하여 효모 유전자 삽입 벡터 (yeast integration vector)인 YIP-5에 클로닝하여 이를 사카로마이시스 세레비지애의 지노믹디엔에이에 유전자 삽입하였다.
이후, 상기 재조합 벡터들을 이용하여 클론테크 (clontech)사의 이스트메이 커 이스트 트랜스포메이션 키트 (YEASTMAKER yeast transformation kit2) 에서 제공하는 실험방법에 따라 효모 숙주세포를 형질 전환시켰다.
상기 효모 숙주세포로는 사카로마이시스 세레비지애 YPH499 (S. cerevisiae YPH499, ura3-52lys2-801amberade2-101ochretrp1-63 his3-200 leu2-1) 를 사용하였다. 이후, 트립토판 결핍 SD배지 (0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 0.067% yeast nigrogen base w/o trp, 2% agar)를 이용하여 형질 전환체를 선별하였으며, 이를 사카로마이시스 세레비지애 YPH499/pGcyaDak라 명명하였다. 또한 사카로마이시스 세레비지애 YPH499에 Gup1을 유전자 삽입 한 균주의 선별에는 SD 배지에 G418 (100ug/ml)이 첨가된 배지에서 선별하였다. 이를 이를 사카로마이시스 세레비지애 YPH499aGup라 명명하였으며 이에 pGcyaDak를 형질전환 한 것을 YPH499aGup/pGcyaDak라 명명하였다.
<실시예 3> 효모 형질 전환체를 이용한 바이오 에탄올의 생산
YPH499/pGcyaDak와 YPH499aGup/pGcyaDak를 갈락토오스로 발현 유도되는 SG배지에서 24시간 전배양 후 48시간 진탕 배양하여 2%의 글리세롤이 기질로 첨가된 발효배지에 600nm파장에서 흡광도를 측정했을 때 각각 5가 되도록 한다. 상기 발효배양액을 30℃, 100rpm에서 배양하며 일정한 시간별로 배양액을 채취하여 가스 크로마토그래피를 실시함으로 생산된 에탄올을 측정하였다. 상기 방법대로 실행결과 글리세롤 히드로게나아제, 디히드록시아세톤 키나아제가 삽입이된 YPH499/pGcyaDak에서의 에탄올 생산수율이 YPH499/pESC-trp보다 높게 측정이 되었고 글리세롤 업테 이크 프로테인이 삽입된 YPH499aGup/pGcyaDak에서의 에탄올 생산수율이 YPH499pGcyaDak보다 높게 측정되었다. 이 결과를 도면 3, 및 4에 도시하였다.
도 1(A)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 디히드로게나제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gcy PCR 산물이며, 도 1(B)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 디히드록시아세톤 키나아제 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Dak PCR 산물이며, 도 1(C)는 본 발명에서 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 글리세롤 업테이크 프로테인 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, Lane 1, 1kb DNA 마커; Lane 2, Gup PCR 산물을 나타낸다.
도 2a는 본 발명에서 제시된 글리세롤 디히드로게나제 유전자와 디히드록시아세톤 키나아제 유전자가 양방향으로 삽입된 재조합 벡터 pGcyaDak의 재조합 과정을 나타낸 모식도이고,
도 2b는 본 발명에서 제시된 글리세롤 업테이크 프로테인의 유전자 삽입을 위하여 구축한 재조합 벡터 pGup의 재조합 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명에서 제시된 재조합 벡터 pGcyaDak가 삽입된 효모 형질 전환체가 glycerol을 기질로 하여 에탄올을 생산함을 확인한 그래프이다. 도 3에서 심벌은 open circles, pGcyaDak; closed triangles, pESC-trp을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 제시된 재조합 벡터 pGcyaDak가 삽입된 효모 형질 전환체에 pGup를 유전자 삽입하여 glycerol을 기질로 하여 에탄올을 생산함을 확인한 그래프이다. 도 4에서 심벌은 open triangles, YPH499aGup/pGcyaDak; open squares, YPH499/pGcyaDak: open diamonds, YPH499aGup/pESC-TRP을 나타낸다.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> A recombinant vector, and a transformant using glycerol as a fermentation source with improved productivity of bio-ethanol, and a method of producing ethanol using the same <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 312 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Pro Ala Thr Leu His Asp Ser Thr Lys Ile Leu Ser Leu Asn Thr 1 5 10 15 Gly Ala Gln Ile Pro Gln Ile Gly Leu Gly Thr Trp Gln Ser Lys Glu 20 25 30 Asn Asp Ala Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ala Leu Lys Asp Gly Tyr Arg 35 40 45 His Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Glu Asp Gln Val Gly Gln 50 55 60 Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Val Thr Thr 65 70 75 80 Lys Leu Trp Cys Thr Gln His His Glu Pro Glu Val Ala Leu Asp Gln 85 90 95 Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met His 100 105 110 Trp Pro Ala Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Ile Lys Asn Glu Asp Ile Leu 115 120 125 Ser Val Pro Thr Lys Lys Asp Gly Ser Arg Ala Val Asp Ile Thr Asn 130 135 140 Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gln Glu Leu Pro Lys Thr 145 150 155 160 Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Leu 165 170 175 Lys Asp Leu Leu Ala Ser Gln Gly Asn Lys Leu Thr Pro Ala Ala Asn 180 185 190 Gln Val Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ile Asn Phe 195 200 205 Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser 210 215 220 Thr Asp Ala Pro Leu Leu Lys Glu Pro Val Ile Leu Glu Ile Ala Lys 225 230 235 240 Lys Asn Asn Val Gln Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val Gln 245 250 255 Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Asn Pro Asp Arg Ile Lys 260 265 270 Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala Ile 275 280 285 Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro Asn 290 295 300 Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys 305 310 <210> 2 <211> 939 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgcctgcta ctttacatga ttctacgaaa atcctttctc taaatactgg agcccaaatc 60 cctcaaatag gtttaggtac gtggcagtcg aaagagaacg atgcttataa ggctgtttta 120 accgctttga aagatggcta ccgacacatt gatactgctg ctatttaccg taatgaagac 180 caagtcggtc aagccatcaa ggattcaggt gttcctcggg aagaaatctt tgttactaca 240 aagttatggt gtacacaaca ccacgaacct gaagtagcgc tggatcaatc actaaagagg 300 ttaggattgg actacgtaga cttatatttg atgcattggc ctgccagatt agatccagcc 360 tacatcaaaa atgaagacat cttgagtgtg ccaacaaaga aggatggttc tcgtgcagtg 420 gatatcacca attggaattt catcaaaacc tgggaattaa tgcaggaact accaaagact 480 ggtaaaacta aggccgttgg agtctccaac ttttctataa ataacctgaa agatctatta 540 gcatctcaag gtaataagct tacgccagct gctaaccaag tcgaaataca tccattacta 600 cctcaagacg aattgattaa tttttgtaaa agtaaaggca ttgtggttga agcttattct 660 ccgttaggta gtaccgatgc tccactattg aaggaaccgg ttatccttga aattgcgaag 720 aaaaataacg ttcaacccgg acacgttgtt attagctggc acgtccaaag aggttatgtt 780 gtcttgccaa aatctgtgaa tcccgatcga atcaaaacga acaggaaaat atttactttg 840 tctactgagg actttgaagc tatcaataac atatcgaagg aaaagggcga aaaaagggtt 900 gtacatccaa attggtctcc tttcgaagta ttcaagtaa 939 <210> 3 <211> 584 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Glu Ser Glu Leu 195 200 205 Asn Glu Lys Gln Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro Gly 210 215 220 Val Lys Val Leu Asp Pro Ile Pro Ser Thr Glu Asp Leu Ile Ser Lys 225 230 235 240 Tyr Met Leu Pro Lys Leu Leu Asp Pro Asn Asp Lys Asp Arg Ala Phe 245 250 255 Val Lys Phe Asp Glu Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Val Asn Asn Leu 260 265 270 Gly Gly Val Ser Asn Phe Val Ile Ser Ser Ile Thr Ser Lys Thr Thr 275 280 285 Asp Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asn Ile Thr Pro Val Gln Thr Ile Ala 290 295 300 Gly Thr Leu Met Thr Ser Phe Asn Gly Asn Gly Phe Ser Ile Thr Leu 305 310 315 320 Leu Asn Ala Thr Lys Ala Thr Lys Ala Leu Gln Ser Asp Phe Glu Glu 325 330 335 Ile Lys Ser Val Leu Asp Leu Leu Asn Ala Phe Thr Asn Ala Pro Gly 340 345 350 Trp Pro Ile Ala Asp Phe Glu Lys Thr Ser Ala Pro Ser Val Asn Asp 355 360 365 Asp Leu Leu His Asn Glu Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Thr Tyr Asp 370 375 380 Phe Asp Lys Phe Ala Glu Trp Met Lys Ser Gly Ala Glu Gln Val Ile 385 390 395 400 Lys Ser Glu Pro His Ile Thr Glu Leu Asp Asn Gln Val Gly Asp Gly 405 410 415 Asp Cys Gly Tyr Thr Leu Val Ala Gly Val Lys Gly Ile Thr Glu Asn 420 425 430 Leu Asp Lys Leu Ser Lys Asp Ser Leu Ser Gln Ala Val Ala Gln Ile 435 440 445 Ser Asp Phe Ile Glu Gly Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr 450 455 460 Ser Ile Leu Leu Ser Gly Phe Ser His Gly Leu Ile Gln Val Cys Lys 465 470 475 480 Ser Lys Asp Glu Pro Val Thr Lys Glu Ile Val Ala Lys Ser Leu Gly 485 490 495 Ile Ala Leu Asp Thr Leu Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala Arg Lys Gly Ser 500 505 510 Ser Thr Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Phe Val Lys Glu Phe Thr Ala 515 520 525 Ser Lys Asp Phe Asn Lys Ala Val Lys Ala Ala Glu Glu Gly Ala Lys 530 535 540 Ser Thr Ala Thr Phe Glu Ala Lys Phe Gly Arg Ala Ser Tyr Val Gly 545 550 555 560 Asp Ser Ser Gln Val Glu Asp Pro Gly Ala Val Gly Leu Cys Glu Phe 565 570 575 Leu Lys Gly Val Gln Ser Ala Leu 580 <210> 4 <211> 1755 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgtccgcta aatcgtttga agtcacagat ccagtcaatt caagtctcaa agggtttgcc 60 cttgctaacc cctccattac 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ttcaatggta atgggttcag tatcacatta 960 ctaaacgcca ctaaggctac aaaggctttg caatctgatt ttgaggagat caaatcagta 1020 ctagacttgt tgaacgcatt tacgaacgca ccgggctggc caattgcaga ttttgaaaag 1080 acttctgccc catctgttaa cgatgacttg ttacataatg aagtaacagc aaaggccgtc 1140 ggtacctatg actttgacaa gtttgctgag tggatgaaga gtggtgctga acaagttatc 1200 aagagcgaac cgcacattac ggaactagac aatcaagttg gtgatggtga ttgtggttac 1260 actttagtgg caggagttaa aggcatcacc gaaaaccttg acaagctgtc gaaggactca 1320 ttatctcagg cggttgccca aatttcagat ttcattgaag gctcaatggg aggtacttct 1380 ggtggtttat attctattct tttgtcgggt ttttcacacg gattaattca ggtttgtaaa 1440 tcaaaggatg aacccgtcac taaggaaatt gtggctaagt cactcggaat tgcattggat 1500 actttataca aatatacaaa ggcaaggaag ggatcatcca ccatgattga tgctttagaa 1560 ccattcgtta aagaatttac tgcatctaag gatttcaata aggcggtaaa agctgcagag 1620 gaaggtgcta aatccactgc tacattcgag gccaaatttg gcagagcttc gtatgtcggc 1680 gattcatctc aagtagaaga tcctggtgca gtaggcctat gtgagttttt gaagggggtt 1740 caaagcgcct tgtaa 1755 <210> 5 <211> 560 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 Met Ser Leu Ile Ser Ile Leu Ser Pro Leu Ile Thr Ser Glu Gly Leu 1 5 10 15 Asp Ser Arg Ile Lys Pro Ser Pro Lys Lys Asp Ala Ser Thr Thr Thr 20 25 30 Lys Pro Ser Leu Trp Lys Thr Thr Glu Phe Lys Phe Tyr Tyr Ile Ala 35 40 45 Phe Leu Val Val Val Pro Leu Met Phe Tyr Ala Gly Leu Gln Ala Ser 50 55 60 Ser Pro Glu Asn Pro Asn Tyr Ala Arg Tyr Glu Arg Leu Leu Ser Gln 65 70 75 80 Gly Trp Leu Phe Gly Arg Lys Val Asp Asn Ser Asp Ser Gln Tyr Arg 85 90 95 Phe Phe Arg Asp Asn Phe Ala Leu Leu Ser Val Leu Met Leu Val His 100 105 110 Thr Ser Ile Lys Arg Ile Val Leu Tyr Ser Thr Asn Ile Thr Lys Leu 115 120 125 Arg Phe Asp Leu Ile Phe Gly Leu Ile Phe Leu Val Ala Ala His Gly 130 135 140 Val Asn Ser Ile Arg Ile Leu Ala His Met Leu Ile Leu Tyr Ala Ile 145 150 155 160 Ala His Val Leu Lys Asn Phe Arg Arg Ile Ala Thr Ile Ser Ile Trp 165 170 175 Ile Tyr Gly Ile Ser Thr Leu Phe Ile Asn Asp Asn Phe Arg Ala Tyr 180 185 190 Pro Phe Gly Asn Ile Cys Ser Phe Leu Ser Pro Leu Asp His Trp Tyr 195 200 205 Arg Gly Ile Ile Pro Arg Trp Asp Val Phe Phe Asn Phe Thr Leu Leu 210 215 220 Arg Val Leu Ser Tyr Asn Leu Asp Phe Leu Glu Arg Trp Glu Asn Leu 225 230 235 240 Gln Lys Lys Lys Ser Pro Ser Tyr Glu Ser Lys Glu Ala Lys Ser Ala 245 250 255 Ile Leu Leu Asn Glu Arg Ala Arg Leu Thr Ala Ala His Pro Ile Gln 260 265 270 Asp Tyr Ser Leu Met Asn Tyr Ile Ala Tyr Val Thr Tyr Thr Pro Leu 275 280 285 Phe Ile Ala Gly Pro Ile Ile Thr Phe Asn Asp Tyr Val Tyr Gln Ser 290 295 300 Lys His Thr Leu Pro Ser Ile Asn Phe Lys Phe Ile Phe Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Val Arg Phe Val Ile Ala Leu Leu Ser Met Glu Phe Ile Leu His Phe 325 330 335 Leu His Val Val Ala Ile Ser Lys Thr Lys Ala Trp Glu Asn Asp Thr 340 345 350 Pro Phe Gln Ile Ser Met Ile Gly Leu Phe Asn Leu Asn Ile Ile Trp 355 360 365 Leu Lys Leu Leu Ile Pro Trp Arg Leu Phe Arg Leu Trp Ala Leu Leu 370 375 380 Asp Gly Ile Asp Thr Pro Glu Asn Met Ile Arg Cys Val Asp Asn Asn 385 390 395 400 Tyr Ser Ser Leu Ala Phe Trp Arg Ala Trp His Arg Ser Tyr Asn Lys 405 410 415 Trp Val Val Arg Tyr Ile Tyr Ile Pro Leu Gly Gly Ser Lys Asn Arg 420 425 430 Val Leu Thr Ser Leu Ala Val Phe Ser Phe Val Ala Ile Trp His Asp 435 440 445 Ile Glu Leu Lys Leu Leu Leu Trp Gly Trp Leu Ile Val Leu Phe Leu 450 455 460 Leu Pro Glu Ile Phe Ala Thr Gln Ile Phe Ser His Tyr Thr Asp Ala 465 470 475 480 Val Trp Tyr Arg His Val Cys Ala Val Gly Ala Val Phe Asn Ile Trp 485 490 495 Val Met Met Ile Ala Asn Leu Phe Gly Phe Cys Leu Gly Ser Asp Gly 500 505 510 Thr Lys Lys Leu Leu Ser Asp Met Phe Cys Thr Val Ser Gly Phe Lys 515 520 525 Phe Val Ile Leu Ala Ser Val Ser Leu Phe Ile Ala Val Gln Ile Met 530 535 540 Phe Glu Ile Arg Glu Glu Glu Lys Arg His Gly Ile Tyr Leu Lys Cys 545 550 555 560 <210> 6 <211> 1683 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 atgtcgctga tcagcatcct gtctccccta attacttccg agggcttaga ttcaagaatc 60 aaaccttcac caaaaaagga tgcctctact accactaagc catcactatg gaaaactact 120 gagttcaaat tctactacat tgcatttctg gtcgtggttc ccttgatgtt ctatgctggg 180 ttacaagcta gttcgcccga aaatccaaac tatgcaagat acgaacgtct cctatctcaa 240 ggttggttat ttggcagaaa agtagacaat agtgattctc aatataggtt tttcagggac 300 aattttgcgc tattgtcagt tttaatgcta gtccacactt ctataaaacg cattgtactt 360 tattcaacaa atatcactaa attgaggttt gatctgatat ttggtttgat ctttttagtg 420 gccgctcatg gtgtcaattc gataagaatt ttagcccata tgctaatttt atatgccatc 480 gcccatgtac taaagaactt tagaagaata gccaccatca gcatttggat ttatggtatt 540 tctacgcttt ttattaacga caacttcaga gcatatccat ttggtaatat ttgctctttt 600 ttaagcccat tggaccattg gtatagaggt atcattccaa gatgggatgt ctttttcaat 660 tttactcttt tgagagtctt aagttacaac ttggacttct tagagaggtg ggagaattta 720 caaaagaaga aaagtccatc ctatgaatca aaagaagcta aatcagccat tttgctcaat 780 gaacgtgcta gattaactgc tgcacacccc atacaggact acagcttaat gaattatatt 840 gcatatgtta cttacacgcc acttttcatt gccggcccca ttataacatt caatgattat 900 gtttaccaat cgaaacatac cttgccatca ataaatttca aattcatttt ttactatgcg 960 gtgagattcg ttattgctct cttatctatg gagttcattt tacactttct ccacgttgtg 1020 gcaatctcaa aaaccaaagc gtgggaaaat gacacacctt tccagatttc catgattggc 1080 ttatttaatt tgaatattat ttggctaaaa ctactgattc cgtggaggct gtttaggctg 1140 tgggctttgc tagacggaat cgatacacct gaaaatatga tcaggtgtgt tgataacaat 1200 tacagttcac tagcattctg gagagcttgg catagaagct acaataagtg ggttgtccgt 1260 tacatatata ttcctctagg tggttcaaaa aatagagttt tgacatcact agcagtcttt 1320 tccttcgtag ctatatggca tgacatcgaa ctaaagttat tattatgggg ttggctaata 1380 gttttgttcc tcttaccaga aatttttgct acccaaattt tctctcatta taccgacgca 1440 gtctggtaca gacacgtttg cgctgtcggt gctgttttca acatatgggt tatgatgatc 1500 gctaatcttt ttggattctg cttgggctct gacggtacta aaaaattact aagcgatatg 1560 ttctgtaccg tatctggttt caaatttgta attttggcaa gcgttagttt attcatcgca 1620 gtacaaataa tgtttgaaat cagagaagaa gaaaagaggc acggaattta cctaaaatgc 1680 tga 1683 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatccatgc ctgctacttt acatgattct 30 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtcgacatac ttgaatactt cgaaaggag 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 actagtatgt ccgctaaatc gtttgaagtc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atcgatatac aaggcgcttt gaaccccctt 30 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaattcatgt cgctgatcag catcctg 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 actagtccag cattttaggt aaattccgtg 30 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggatccatgt cagcatttta ggtaaattcc gtg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggatccataa tgtcgctgat cagcatcctg tct 33

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  12. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 포함하는 효모에 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 삽입된 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 형질전환체는 균주 기탁번호가 KCCM 11042P인 형질 전환체 효모 사카로마이시스 세레비지애인 형질전환체.
  14. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 속 미생물 유래의 글리세롤 업테이크 프로테인 (glycerol uptake protein)의 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 포함하는 효모에 글리세롤 디히드로게나제 (glycerol dehydrogenase)와 디히드록시아세톤 키나아제 (dihydroxyacetone kinase) 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는 형질전환체 효모 사카로마이시스 세레비지애의 제조방법.
  15. 글리세롤을 기질로 하여 제 12항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산 방법.
  16. 제 12항의 형질전환체를 포함하는 에탄올 생성용 조성물.
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