CN108546691A - 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用 - Google Patents
7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种通过蛋白质工程获得的辅酶偏好性改变的7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组突变体酶制剂的制备方法，以及该重组突变体酶制剂在制备熊脱氧胆酸中的应用。通过酶法耦联的辅酶再生，本发明所述重组突变体酶制剂可以高效利用相对廉价的氧化型辅酶I(NAD+)而非昂贵的氧化型辅酶II(NADP+)，催化7‑羰基石胆酸的不对称还原，有效降低了生产成本，并且具有操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等优势，在鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种辅酶偏好性改变的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体、其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂的制备方法，以及重组7β-羟基甾醇脱氢酶催化剂在制备熊脱氧胆酸中的应用。
背景技术
熊脱氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)是名贵中药材熊胆的有效成分，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，又名乌索去氧胆酸、熊去氧胆酸，是美国FDA批准认可的治疗原发性胆汁性肝硬化的药物，还用于治疗原发性硬化性胆管炎，酒精性和脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝炎等胆汁淤积性肝病，也是胆固醇性结石溶石治疗的首选药物。1902年瑞典化学家Hammarsten首先从北极熊的胆汁中发现UDCA，1927年日本冈山大学Shoda从中国黑熊胆汁中分离、结晶得到UDCA，并对其进行了命名，1954年Kanazawa通过化学法合成UDCA并开始应用于临床(Journal of Biotechnology,2014,191:11-21)。
UDCA在熊的胆汁中含量最高，而在其他动物的胆汁中含量很少。目前，UDCA主要从熊胆中提取，少量由人工合成。“活熊取胆”是从人工养殖黑熊活体中提取UDCA的方法，这种方法产率低，周期长，并且因违背自然伦理而一直受到争议。从二十世纪五十年代开始，就有化学法合成UDCA的报道，随着生物技术的发展，利用生物催化技术及与化学法结合的方法合成UDCA由于具有反应条件温和、选择性高、绿色环保等优点，得到极大关注。采用养殖的家禽、家畜胆汁中可大量获取的胆酸(CA)或者鹅脱氧胆酸(CDCA)作为底物，采用酶法或者化学-酶法结合的方法，人工合成具有较高价值的UDCA，减少对天然熊胆汁的需求，符合当代可持续发展的理念，具有重要的经济、社会价值和生态意义。
当前工业上采用传统的七步合成法生产UDCA，以牛、羊胆汁中的胆酸(CA)为原料，酸性条件下，羧基甲酯化，再用吡啶/冰醋酸进行3位和7位二乙酰化以保护羟基，12位羟基用氧化铬氧化，随后Wolff-Kishner-黄鸣龙还原，然后水解得到CDCA，进一步氧化生成7-羰基石胆酸(7-KLCA)，最后在正丙醇中用碱金属钠还原得到UDCA。这种方法步骤繁琐，合成路线长，反应剧烈，操作安全性差，总收率低(27％-32％)，环境污染严重，不符合当代可持续发展的理念。日本专利(JP 02282393)报道，在丁醇溶液中，氢氧化钠和钯碳存在的碱性条件下，于100℃，80kg/cm2的压力环境中，化学法催化7-KLCA的氢化反应，反应5h，UDCA的得率为88.2％。由于此方法需要在高压下反应，操作不便，没有投入实际应用。
2009年，Riva等报道了生物催化CA转化生成12-羰基熊脱氧胆酸，进而利用化学法催化还原制备UDCA的方法(Adv Synth Catal,2009,351:1303-1311)。该生物转化反应中使用了三种酶，首先应用7α-羟基甾醇脱氢酶(7α-HSDH)和12α-羟基甾醇脱氢酶(12α-HSDH)催化CA氧化生成7,12-二羰基石胆酸，再利用7β-羟基甾醇脱氢酶(7β-HSDH)催化7,12-二羰基石胆酸还原生成12-羰基熊脱氧胆酸，随后通过Wolff-Kishner-黄鸣龙还原反应生成UDCA。由于该酶法氧化还原过程中催化辅酶循环再生的酶专一性差，导致转化不完全，因此终产物UDCA的纯度不高。
2011年，德国斯图加特大学Liu等首次克隆了来源于Collinsella aerofaciensDSM 3979的7β-HSDH，催化7-KLCA转化为UDCA，底物浓度40g/L，24h转化率达90％，最终产物得率71％(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127–135)。随后，其他研究者分别从Clostridium absonum和Ruminococcus gnavus中克隆得到第二、三个7β-HSDH，并应用于UDCA的合成(Appl Microb Biotechnol,2012,95:1221-1233；J Lip Res,2013,54:3062-9)。中国发明专利CN 10527070A公开了一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用，对来源于Ruminococcus gnavus的7β-HSDH进行了活性改造，并与醇脱氢酶耦联构建辅酶再生循环，催化7-KLCA转化制备UDCA，底物浓度达100g/L，转化率>99％。2015年，本发明的发明人从瘤胃球菌(Ruminococcus torques)中克隆得到新的7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDHRt)，通过进化改造得到活性提高5.5倍，40℃半衰期提高3倍，最适pH从弱酸性偏移至弱碱性的突变体，并通过两步酶法级联反应成功将CDCA高效转化为UDCA，底物浓度为100mM时，最终转化率高于99％(Process Biochem,2015,50:598-604；J Agric Food Chem,2017,65:1178-1185；CN107099516A)。
综上所述，现有的酶法制备UDCA的报道中，通常使用7β-HSDH催化7-KLCA的不对称还原制备UDCA。但现有的报道中，重组7β-HSDH的表达都是使用大肠杆菌作为宿主，表达的酶是胞内酶，需要对重组菌进行细胞破碎，才能分离获得酶液，催化剂制备过程繁琐；并且目前报道的重组7β-HSDH均是NADPH依赖型的，酶促反应液中需要加入辅酶NADPH或者NADP+(通过辅酶再生系统转化为NADPH)，由于辅酶NADPH或者NADP+价格昂贵，高昂的辅酶应用成本是酶法工业化生产UDCA的限制因素。NADH的价格相对比较便宜，并且比NADPH更加稳定。辅酶NADH与NADPH的分子结构上的差异在于：在辅酶的腺苷部分，NADPH的分子结构中多了一个额外的2'-磷酸基团。1990年，Scrutton等报道通过对辅酶结合口袋附近的氨基酸残基进行突变改造，可以有效地改变脱氢酶的辅酶依赖性(Nature,1990,343:38-43)。如果通过分子工程手段改变7β-HSDH的辅酶偏好性，得到NADH依赖型的7β-羟基甾醇脱氢酶，进而通过酶法耦联，应用更廉价的NAD+，对于降低UDCA工业化生产的成本具有重大意义。
发明内容
鉴于现有技术存在的不足，本发明一方面在已报道的专一性利用辅酶NADPH的7β-HSDH的基础上，通过蛋白质工程的手段对其进行改造，提高该酶针对辅酶NADH的活性，得到可以专一性利用辅酶NADH的7β-HSDH突变体；另一方面通过选择毕赤酵母作为表达宿主，对重组7β-HSDH突变体进行胞外表达，简化酶的分离工艺。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一，提供了系列辅酶偏好性改变的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，即辅酶偏好性改变的7β-HSDH突变体。
本发明以序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的7β-HSDH作为母本，通过氨基酸序列以及空间结构的比对，找到辅酶结合位点附近的关键氨基酸残基，采用定点突变的策略，成功地实现了7β-HSDH辅酶依赖型的改变。在此基础上，结合随机突变的方法，结合酶标仪高通量初筛和HPLC复筛，鉴别获得一批辅酶偏好性改变，而且可以高效利用NADH的7β-HSDH突变体。与母本相比，优选的突变体不仅可以高效利用辅酶NADH，催化7-KLCA还原生成熊脱氧胆酸，并且热稳定性也有所提高。
本发明7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的第17位苏氨酸、第18位谷氨酸、第22位赖氨酸、第39位甘氨酸、第44位赖氨酸、第64位精氨酸、第67位苯丙氨酸、第93位半胱氨酸、第114位缬氨酸或第243位天冬酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。
所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体在催化7-羰基石胆酸不对称还原时能够高效利用相对廉价的还原型辅酶NADH，而非更加昂贵的NADPH。
所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体具有如下序列中的一种：
(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸，第22位赖氨酸替换为丙氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；
(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位苏氨酸替换为丙氨酸，第39位甘氨酸替换为天冬氨酸；
(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸；
(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸；
(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸；
(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺；
(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；
(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸；
(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸。
本发明的技术方案之二，提供了7β-HSDH突变体的编码基因，以及含有所述编码基因的重组表达载体。所述编码基因编码表达如技术方案一所述的7β-HSDH突变体，其来源包括：通过基因工程技术对技术方案一所述的系列7β-HSDH突变体的基因序列进行克隆；或者通过人工全序列合成的方法得到编码如技术方案一所述7β-HSDH突变体的核酸分子。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明所述的7β-HSDH基因的核苷酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达相应的7β-HSDH突变体即可。针对不同的表达宿主，优选的质粒载体是不同的。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。对于大肠杆菌宿主，所述质粒载体优选的为pET-28a(+)质粒；对于毕赤酵母宿主，所述质粒载体优选的为pPICZαA。示例的，可通过下述方法制得本发明所述的大肠杆菌重组表达载体：将通过PCR扩增所得的7β-HSDH突变体基因序列DNA片段用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，同时将空载质粒pET28a同样用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，回收上述酶切后的7β-HSDH突变体的DNA片段以及空载质粒，利用T4DNA连接酶连接，构建获得用于大肠杆菌表达的含有所述7β-HSDH编码核酸分子的重组表达载体。采用本领域所公知的类似方法和技术，可以方便地构建用于毕赤酵母表达的含有所述7β-HSDH突变体编码核酸分子的重组表达载体。
本发明的技术方案之三，提供了一种包含本发明7β-HSDH突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过本领域常规技术，将上述重组表达载体转化至相应宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所编码的7β-HSDH基因能被有效表达即可。所述宿主细胞优选大肠杆菌和毕赤酵母，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或毕赤酵母P.pastorisX33。
本发明的技术方案之四，提供一种重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化剂，所述的重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)将所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体的粗酶液干燥得到的粗酶粉。
其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件，针对使用不同宿主构建的重组表达转化体，采用不同的优选培养方法和条件，只要使重组表达转化体能够生长并高效产生本发明所述7β-HSDH突变体即可。
对于重组大肠杆菌，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100ml的LB培养基(含卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述7β-HSDH突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组7β-HSDH突变体的粗酶液。
对于重组毕赤酵母菌，培养基优选BMGY培养基：甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素40mg/L，无氨基酸酵母氮源13.4g/L以及终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0-6.5。优选下述培养方法：将所述重组酵母菌接种至含氨苄青霉素的BMGY培养基中培养，培养温度为20-30℃。当培养液的光密度OD600达到1.3-2.0(优选1.5)时，将培养基替换为BMMY(甲醇10ml/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素40mg/L，无氨基酸酵母氮源13.4g/L以及终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)，每隔24h添加相当于培养液体积1％的纯甲醇进行诱导，持续诱导96h，高效诱导重组毕赤酵母菌分泌表达本发明所述的重组7β-HSDH突变体。培养结束后，将培养液高速离心，收集离心上清液，获得所述7β-HSDH突变体的粗酶液。
收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。
本发明中所述7β-HSDH突变体的活力测定方法：将含0.5mmol/L 7-KLCA和0.1mmol/L NADH的1ml反应体系(100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 8.0)预热至30℃，然后加入适量的7β-HSDH突变体，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。
用下式计算得到酶活力：
酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)
式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为ml；6220为NADH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化氧化1μmol NADH所需的酶量。
本发明的技术方案之五，提供了所述重组7β-HSDH突变体或7β-HSDH突变体催化剂在UDCA合成中的应用，即提供利用重组7β-HSDH突变体酶法转化制备熊脱氧胆酸的方法。
本发明提供第一种方法：以7-羰基石胆酸作为底物，辅酶NADH存在下，使用重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化7-羰基石胆酸不对称还原制备熊脱氧胆酸，同时NADH氧化生成NAD+。
优选地，为了进行辅酶NADH的循环再生，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(如J Biol Chem,1989,264:6381–6385)。葡萄糖脱氢酶的活力单位上载可以与所述重组7β-HSDH突变体相等。
即，上述第一种方法中还可以耦联葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖脱氢反应，将NAD+酶法还原再生为NADH。即，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和额外添加的NAD+的存在下，加入7-KLCA和如上所述的重组7β-HSDH突变体，恒温、充分混合的条件下，酶法催化7-KLCA的不对称还原反应。
优选地，上述反应条件为：在pH 6.0-9.0的缓冲盐溶液中进行，底物7-KLCA的浓度为1-120g/L，葡萄糖与底物的摩尔比为1.0-2.0，NAD+添加量为0.05-1.0mmol/L，温度20-40℃。所述缓冲盐溶液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在6.0-9.0即可，比如磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH缓冲液，优选pH范围为7.0-8.0，更优选pH 8.0的磷酸钾缓冲液。缓冲液的浓度可以为0.05-0.2mol/L。所述不对称还原反应的温度可以是20-40℃，优选30℃。
本发明提供第二种方法：以鹅脱氧胆酸作为底物，辅酶NAD+存在下，使用所述重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体与7α-羟基甾醇脱氢酶进行酶法耦联催化鹅脱氧胆酸的差向异构，制备获得熊脱氧胆酸。
进一步地，第二种方法还可以进一步分成两种操作方式：
第一种操作方式：辅酶NAD+存在下，7α-羟基甾醇脱氢酶与重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体同时催化反应，催化鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸。
第二种操作方式：辅酶NAD+存在下，7α-羟基甾醇脱氢酶与重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体顺序催化反应，催化鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸。
第二种操作方式的具体方法包括以下步骤：
(1)辅酶NAD+存在下，7α-羟基甾醇脱氢酶催化鹅脱氧胆酸立体选择性氧化生成7-羰基石胆酸；
(2)加入重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化上述步骤(1)所得7-羰基石胆酸的不对称还原，制备熊脱氧胆酸。
优选地，在步骤(1)结束后，采用化学或者物理的方法使7α-羟基甾醇脱氢酶灭活，然后再进行步骤(2)的反应。采用物理加热的方法使7α-羟基甾醇脱氢酶灭活，以防止7-羰基石胆酸被逆转还原为鹅脱氧胆酸。
优选地，第二种方法可按下述方法进行：在pH 6.0-9.0的缓冲盐溶液中，同时加入所述7β-HSDH突变体和7α-HSDH催化剂，在额外添加NAD+，恒温、充分混合的条件下，酶法催化CDCA的差向异构，制备获得UDCA。所述缓冲盐溶液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在6.0-9.0即可，比如磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH缓冲液，优选pH范围为7.0-8.0，更优选pH 8.0的磷酸钾缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度可以为0.05-0.2mol/L。所述7α-HSDH的编码基因来源于大肠杆菌Escherichia coli HB101(Journal ofBacteriology,1991,173:2173–2179)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示。所述底物CDCA的浓度为1-120g/L，额外添加辅酶NAD+的浓度为0.05-1.0mmol/L，所述的酶促不对称还原反应的温度可以是20-40℃，优选30℃。反应转化率采用液相色谱法进行分析，使用C-18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇：水＝75:25(磷酸调节pH为3.0)，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。
所述7β-HSDH突变体与7α-HSDH进行酶法耦联催化CDCA的差向异构，制备获得UDCA的方法，更优选的，可按下述方法进行：在pH 6.0-9.0的缓冲盐溶液中，在乳酸脱氢酶、丙酮酸钠和额外添加的NAD+的存在下，加入所述7α-HSDH催化剂，恒温、充分混合的条件下，酶法催化CDCA氧化获得7-KLCA，混合液于80-100℃加热5-10分钟，冷却后加入葡萄糖脱氢酶、葡萄糖，加入如上所述的7β-HSDH突变体，恒温、充分混合的条件下，酶法催化7-KLCA不对称还原获得UDCA。所述缓冲盐溶液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在6.0-9.0即可，比如磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH缓冲液，优选pH范围为7.0-8.0，更优选pH 8.0的磷酸钾缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度可以为0.05-0.2mol/L。所述乳酸脱氢酶来源于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus DSM 20081)(FEBS Lett,1991,290:61–64)。所述底物CDCA的浓度为1-120g/L，额外添加辅酶NAD+的浓度为0.05-1.0mmol/L，所述的酶促不对称还原反应的温度可以是20-40℃，优选30℃。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为0.5-24小时。反应转化率采用液相色谱法进行分析，使用C-18柱(250mm×4.6mm)，流动相为甲醇：水＝75:25(磷酸调节pH为3.0)，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。
本发明的7-KLCA不对称还原反应以及CDCA的差向异构反应的转化率高，反应液中只有极低浓度的7-KLCA残余。反应结束后，将催化剂分离除去，然后将反应液酸化，用常规溶剂萃取，萃取液洗涤、干燥后旋蒸浓缩，即可结晶获得高纯度的UDCA。
在本发明的第五技术方案中，所描述的7β-HSDH突变体包括前面描述的重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化剂。
与现有技术相比，本发明具有显著优势：
本发明的7β-HSDH突变体以NADH为辅酶，并且在应用中，通过辅酶再生，可以使用价格便宜的辅酶NAD+；本发明使用毕赤酵母宿主体系分泌表达所述的7β-HSDH突变体，不需要对重组细胞进行细胞破碎，酶催化剂的提取、制备更简便。使用本发明7β-HSDH突变体催化7-KLCA不对称还原，或与7α-HSDH耦联催化CDCA的差向异构转化制备UDCA，具有制造成本低、操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等显著优点，适宜于工业应用。
具体实施方式
本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整地描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
下列实施例中的材料来源为：
母本重组质粒pET28a-7β-HSDH，含有如序列表SEQ ID No.1所示的核酸序列，为发明人自行构建，在专利CN107099516A中也有公开。
质粒载体pET28a和pPICZαA购自Novagen公司。
E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和毕赤酵母X33感受态细胞、2×Taq PCRMasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶EcoR I、Xho I、Not I和Sac I均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。
实施例1 7β-HSDH的定点突变
通过Uniprot、NCBI BLAST以及空间结构模建，如序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的7β-HSDH的立体空间结构中，在辅酶NADPH的结合位点周围的氨基酸残基包括：17位苏氨酸、18位谷氨酸、22位赖氨酸、39位甘氨酸、44位赖氨酸以及67位苯丙氨酸等。采用定点突变技术，对这些位点的氨基酸残基进行定点突变，通过筛选，发现将第17位苏氨酸替换为丙氨酸(T17A)、第18位谷氨酸替换为苏氨酸(E18T)、第22位赖氨酸替换为天冬氨酸(K22D)、第39位甘氨酸替换为天冬氨酸(G39D)、第44位赖氨酸替换为甘氨酸(K44G)、第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸(F67A)等突变体对NADH的活性大幅度提高，而相应的，对NADPH的比活力显著降低。
所述7β-HSDH酶活力测定方法：将含0.5mmol/L 7-KLCA和0.1mmol/L NADH(或NADPH)的1ml反应体系(100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 8.0)预热至30℃，然后加入适量的7β-HSDH酶液，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算酶活力。
实施例2 7β-HSDH突变体的构建
在实施例1所述突变体的基础上，采用易错PCR技术随机突变，进一步提高酶的活性。
根据7β-HSDH的开放阅读框，设计上、下游引物如下：
上游引物，如SEQ ID No.3所示：
CCG GAATTC ATGAATCTGCGTGAAAAATAC
下游引物，如SEQ ID No.4所示：
CCG CTCGAG TTAATTGTTGCTATAGAAGC
其中上游引物下划线所示序列为EcoR I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Xho I的酶切位点。
以pET28a-7β-HSDH为模板，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μl，10×PCR buffer(Mg2+Plus)5.0μl，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μl，终浓度为100μmol/L的MnCl2，pET28a-7β-HSDH质粒0.5ng，上下游引物(10μM)各2μl，加灭菌蒸馏水补足至50μl。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对培养的细胞进行破壁，以NADH为辅酶，在96孔板中对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
所述7β-HSDH突变体的高通量活力筛选测定方法：将含0.5mmol/L 7-KLCA和0.1mmol/L NADH的磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 8.0)分装到96孔板中，预热至30℃，然后分别加入适量的7β-HSDH突变体，30℃振荡反应，在酶标仪上检测340nm处NADH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值，计算相应的酶活力。
通过筛选，得到了对NADH活性显著提高的突变体，进而对这些突变体的热稳定性进行了表征，优选热稳定性增高的系列突变体，这些突变体的序列以及这些突变体对NADH的活性和稳定性列于表1中。在表1中，序列标号分别对应于表1后面的一系列序列。在活性列中，与母本7β-HSDH相比，一个加号“+”表示突变体蛋白对NADH的活性提高了1-100倍；两个加号“++”表示突变体蛋白对NADH的活性提高了101-200倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白对NADH的活性提高了201-250倍。在热稳定性列中，一个加号“+”对应于45℃保温15min后，突变体蛋白的残余活性保留30.0-45.0％；两个加号“++”对应于45℃保温15min后，突变体蛋白的残余活性保留45.1-60.0％；三个加号“+++”对应于45℃保温15min后，突变体蛋白的残余活性保留60.1-80.0％。
表1：7β-羟基甾醇脱氢酶突变体序列和相应的活性改进列表
对应序列标号的7β-HSDH突变体的氨基酸序列分别如下：
(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸，第22位赖氨酸替换为丙氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；
(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位苏氨酸替换为丙氨酸，第39位甘氨酸替换为天冬氨酸；
(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸；
(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸；
(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸；
(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺；
(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；
(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸；
(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸。
优选的7β-HSDH突变体(以NADH为辅酶)的活性与母本7β-HSDH(NADPH为辅酶)的活性基本持平，在一个数量级，但是母本酶必须使用价格昂贵的NADPH，而突变体酶使用价格相对低廉的NADH，在工业化生产应用中，成本优势非常明显。
实施例3重组E.coli BL21(DE3)/pET28a-7β-HSDHM12的表达及活力测定
将实施例2中获得的突变体M12的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-7β-HSDHM12接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，活力为6.0U/mL。另外，将收获的细胞冷冻干燥，获得冻干细胞活力为0.8U/mg。
实施例4重组P.pastoris/pPICZαA-7β-HSDHM12的构建和表达
依据实施例2获得的M12突变体的序列，提交上海金斯瑞生物科技有限公司对其进行密码子优化，使其适合于在毕赤酵母中进行分泌表达。优化后的核酸序列如序列表中SEQID No.5所示，对其进行序列全合成。设计上下游引物SEQ ID No.6和SEQ ID No.7，对合成的序列进行PCR扩增，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，将酶切片段与同样使用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的pPICZαA质粒进行连接，获得重组质粒pPICZαA-7β-HSDHM12，然后在37℃，对其用限制性内切酶Sac I双酶切4h，使其线性化。将1μg线性化质粒DNA样品和100μl毕赤酵母X33的感受态细胞混匀，转移至预冷的电转杯(电极间距0.2cm)中，冰浴5min，然后在2kV、5ms的条件下脉冲电击一次，向电转杯中迅速加入0.5ml冰上预冷的山梨醇溶液(1M)，然后将电转杯中的菌液转移到装有0.5ml YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，pH 6.0)的1.5ml Eppendorf管中，于30℃、200rpm培养2h；用移液枪吸取200μl电转化复苏后的菌液，涂布于YPDZ固体培养基平板(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，博莱霉素1mg/ml，琼脂粉20g/L，pH 6.0)，倒置于30℃培养箱中培养2天左右，至有肉眼可见的转化子长出，获得重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZαA-7β-HSDHM12。
将重组毕赤酵母P.pastoris X33/pPICZαA-7β-HSDHM12接种至YPDZ液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，博莱霉素100μg/ml，pH 6.0)中，于30℃，250rpm震荡培养24h，按1％的接种量接种至100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的BMGY液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，甘油10g/L，无氨基酸酵母氮源13.6g/L，生物素0.4mg/L，终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH 6.0)中，置于30℃，250rpm摇床中培养，当培养液的光密度OD600达到1.5时，停止培养，静置2h使酵母细胞沉降，小心倾倒出BMGY培养基上清，然后将收集的菌体用100ml的BMMY培养基(甲醇10ml/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素0.4mg/L，无氨基酸酵母氮源13.6g/L，终浓度为100mM的磷酸钾缓冲盐，pH6.0)重新悬浮，置于30℃、250rpm摇床中继续培养，每24h添加1ml的纯甲醇进行诱导，持续培养、诱导96h。培养结束后，将培养液于4℃、8000×g离心去除菌体，收集上清粗酶液，粗酶液的活性为6U/ml。将粗酶液冷冻干燥，获得粗酶粉，比活力为0.8U/mg。
实施例5重组7β-HSDHM12催化合成UDCA
在20ml夹套反应器中，依次加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，0.4g 7-KLCA，0.27g无水葡萄糖，10U的如实施例3获得的重组7β-HSDHM12粗酶液，20U的葡萄糖脱氢酶，以及终浓度0.1mM的NAD+。30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。间歇取样检测反应转化率，反应6h，转化率大于99％，此时7β-HSDHM12的残余活力为73％。终止反应，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，得到0.35g产物，纯度为97％。转化率检测使用C-18柱，甲醇：水＝75:25(磷酸调pH＝3)为流动相，柱温30℃，流速0.8ml/min，检测波长210nm。
实施例6重组7β-HSDHM12催化合成UDCA
在20ml夹套反应器中，依次加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，1.2g 7-KLCA，0.81g无水葡萄糖，15U的如实施例3获得的重组7β-HSDHM12粗酶液，30U的葡萄糖脱氢酶，以及终浓度0.5mM的NAD+。30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。反应10h，转化率大于99％。终止反应，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，得到1.1g产物，纯度为97％。
实施例7重组7β-HSDHM12催化合成UDCA
在20ml夹套反应器中，依次加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，1.2g 7-KLCA，0.81g无水葡萄糖，15U的如实施例4获得的重组7β-HSDHM12粗酶液，30U的葡萄糖脱氢酶，以及终浓度0.05mM的NAD+。30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为8.0。反应24h，转化率为97％。终止反应，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，得到1.03g产物，纯度为96％。
实施例8重组7β-HSDHM12催化合成UDCA
在20ml夹套反应器中，依次加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)，1.2g 7-KLCA，0.81g无水葡萄糖，15U的如实施例4获得的重组7β-HSDHM12粗酶液，30U的葡萄糖脱氢酶，以及终浓度0.5mM的NAD+。30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH为7.0。反应16h，转化率大于99％。终止反应，离心分离除去酶制剂，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，得到1.02g产物，纯度为96.5％。
实施例9重组7β-HSDHM12与7α-HSDH耦联同时催化CDCA差向异构合成UDCA
在20ml夹套反应器中，依次加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，1.2g CDCA，15U的如实施例3获得的重组7β-HSDHM12冻干整细胞制剂，15U的7α-HSDH，以及终浓度0.5mM的NAD+。30℃条件下磁力搅拌反应。反应24h，转化率为82％。终止反应，离心分离除去细胞，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使产物析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，再经过柱分离后得到0.91g产物，纯度为95.5％。
实施例10重组7β-HSDHM12与7α-HSDH耦联同时催化CDCA差向异构合成UDCA
在20ml夹套反应器中，依次加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，1.2g CDCA，30U的如实施例3获得的重组7β-HSDHM12冻干整细胞制剂，15U的7α-HSDH，以及终浓度1.0mM的NAD+。30℃条件下磁力搅拌反应。反应48h，转化率为81％。终止反应，离心分离除去细胞，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使产物析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，再经过柱分离后得到0.95g产物，纯度为96％。
实施例11重组7β-HSDHM12与7α-HSDH耦联顺序催化CDCA差向异构合成UDCA
在20ml夹套反应器中，加入10ml磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，1.2g CDCA，0.50g丙酮酸钠，150U 7α-HSDH，200U乳酸脱氢酶，终浓度0.05mM的NAD+，30℃条件下磁力搅拌反应2h，检测转化率大于99％。混合液于90℃加热5分钟，冷却后再加入200U如实施例3制备的重组7β-HSDHM12冻干细胞，300U葡萄糖脱氢酶，0.81g无水葡萄糖，终浓度0.05mM的NAD+，通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH在8.0左右，30℃条件下磁力搅拌反应。间歇取样检测反应转化率，反应6h后，终转化率大于99％。终止反应，离心分离除去细胞，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发除去溶剂，得到1.13g白色固体，纯度高于97％。
实施例12 1-L规模重组7β-HSDHM12催化合成UDCA
在2L三颈烧瓶中，依次加入1L磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，40g7-KLCA，27g无水葡萄糖，20kU如实施例3制备的重组7β-HSDHM12冻干细胞，30kU葡萄糖脱氢酶，以及终浓度0.1mM的NAD+，30℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm。通过自动电位滴定仪控制滴加1.0M的NaOH溶液，维持反应液pH在8.0左右。间歇取样检测反应转化率，反应8h后，转化率高于99％，终止反应，离心分离除去细胞，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，将萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，洗涤后的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发浓缩至有结晶析出，冷却至室温，抽滤除去残余溶剂，烘干至恒重，得到35.8g白色固体，纯度97％，比旋光度为61.5°。
实施例13 1-L规模重组7β-HSDHM12与7α-HSDH耦联顺序催化CDCA差向异构合成UDCA
在2L三颈烧瓶中，加入1L磷酸钾缓冲液(100mM,pH 8.0)，40g CDCA，16.5g丙酮酸钠，10kU 7α-HSDH，20kU乳酸脱氢酶，终浓度0.1mM的NAD+，30℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm，反应4h后，混合液于90℃加热30分钟，冷却后加入20kU如实施例4制备的重组7β-HSDHM12粗酶粉，30kU葡萄糖脱氢酶，27g无水葡萄糖，终浓度0.1mM的NAD+，通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(1.0M)，维持反应液pH在8.0左右，30℃条件下机械搅拌反应，搅拌转速为350rpm。间歇取样检测反应转化率，反应12h后，终转化率高于99％。终止反应，用1mol/L的HCl调节pH至3-4使UDCA析出，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，将萃取液混合，用等体积饱和食盐水洗涤两次，洗涤后的萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，然后旋转蒸发浓缩至有结晶析出，冷却至室温，抽滤除去残余溶剂，烘干至恒重，得到35g白色固体，纯度95％，比旋光度为59.5°。
实施例5-13给出了不同的制备UDCA的实施例，可以看出，利用本发明方法所得重组突变体酶制剂可以高效利用相对廉价的氧化型辅酶I(NAD+)而非昂贵的氧化型辅酶II(NADP+)，催化7-羰基石胆酸的不对称还原，有效降低了生产成本，并且具有操作简单、反应条件温和、环境友好，产率高等优势，在鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸中具有很好的应用前景。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学、苏州百福安酶技术有限公司
<120> 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 扭链瘤胃球菌 (Ruminococcus torques ATCC 35915)
<400> 1
atgaatctgc gtgaaaaata cggcgaatgg ggcatcattc tgggcgcgac cgagggcgtg 60
ggcaaggcgt ttgcggaaaa gattgcgagc gaaggcatga gcgtggtcct ggtgggccgt 120
cgtgaagaaa aactgcaaga actgggtaaa tctattagcg aaacctatgg cgtggatcat 180
atggtcattc gtgccgattt cgcgcaaagc gattgcaccg acaagatctt tgaagcgacc 240
aaagatctgg acatgggctt tatgagctat gtggcgtgtt ttcacacctt tggcaagctg 300
caggataccc cgtgggaaaa acatgaacag atgattaatg tgaacgtgat gacctttctg 360
aagtgttttt accattatat gggcatcttt gcgaaacagg atcgtggcgc ggtgatcaat 420
gtgagcagcc tgaccgcgat tagcagcagc ccgtataatg cgcagtatgg cgcaggcaag 480
agctacatca aaaagctgac cgaagcggtg gcagcggaat gcgaaagcac caatgtggat 540
gtggaagtga ttaccctggg caccgtcatt accccgagcc tgctgagcaa tctgccaggt 600
ggcccagcag gtgaagcaat gatgaaaacg gcgatgaccc cggaagcgtg cgtggaagaa 660
gcgtttgata atctgggcaa aagcctgagc gttattgcgg gcgaacataa caaagccaat 720
gttcataatt ggcaggcgaa caaaaccgat gatgaatata tccgttacat gggtagcttc 780
tatagcaaca attaa 795
<210> 2
<211> 264
<212> PRT
<213> 扭链瘤胃球菌 (Ruminococcus torques ATCC 35915)
<400> 2
Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Ala Glu Lys Ile Ala Ser Glu Gly
20 25 30
Met Ser Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu
35 40 45
Gly Lys Ser Ile Ser Glu Thr Tyr Gly Val Asp His Met Val Ile Arg
50 55 60
Ala Asp Phe Ala Gln Ser Asp Cys Thr Asp Lys Ile Phe Glu Ala Thr
65 70 75 80
Lys Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Phe His Thr
85 90 95
Phe Gly Lys Leu Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Gln Met Ile
100 105 110
Asn Val Asn Val Met Thr Phe Leu Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly
115 120 125
Ile Phe Ala Lys Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Ala Ile Ser Ser Ser Pro Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ser Tyr Ile Lys Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Ala Glu Cys Glu Ser
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Ile Thr Pro
180 185 190
Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Ala Gly Glu Ala Val Met
195 200 205
Lys Thr Ala Met Thr Pro Glu Ala Cys Val Glu Glu Ala Phe Asp Asn
210 215 220
Leu Gly Lys Ser Leu Ser Val Ile Ala Gly Glu His Asn Lys Ala Asn
225 230 235 240
Val His Asn Trp Gln Ala Asn Lys Thr Asp Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr
245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Ser Asn Asn
260
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggaattca tgaatctgcg tgaaaaatac 30
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt taattgttgc tatagaagc 29
<210> 5
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaatttga gagaaaagta cggagagtgg ggtattattt tgggtgctac tgaaggtgtt 60
ggtaaagctt tcgctgaaaa gattgcttct gagggaatgt ctgttgtttt ggttggtaga 120
agagaagaga agttgcaaga attgggtaaa tctatttctg agacttacac tgttgatcat 180
atggttatta gagctgattt tgctcaatct gattgtactg ataagatctt cgaagctact 240
aaggatttgg atatgggttt tatgtcttac gttgcttgtt tccatacttt cggtaaattg 300
caagatactc catgggaaaa acacgagcaa atgatcaacg ttaacgttat gactttcttg 360
aagtgtttct accactacat gggtatcttc gctaagcaag atagaggtgc tgttattaat 420
gtttcttctt tgactgctat ctcttcttct ccttacaacg ctcaatatgg tgctggtaaa 480
tcttacatta agaaattgac tgaagctgtt gctttggagt gtgagtctac taacgttgat 540
gttgaggtta ttactttggg tactgttatt actccatctt tgttgtctaa cttgccaggt 600
ggtcctgctg gtgaagctat gatgaagact gctatgactc ctgaggcttg tgttgaagag 660
gctttcgata atttgggtaa atctttgtct gttattgctg gtgaacataa caaggctaat 720
gttcacaact ggcaagctaa caaaactgat gatgagtaca tcagatatat gggttctttt 780
tattctaaca at 792
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcatga atttgagaga aaagtacgga gagt 34
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaggaaaaaa gcggccgcat tgttagaata aaaagaaccc atat 44
<210> 8
<211> 255
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 8
Met Phe Asn Ser Asp Asn Leu Arg Leu Asp Gly Lys Cys Ala Ile Ile
1 5 10 15
Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gly Lys Glu Ile Ala Ile Thr Phe Ala
20 25 30
Thr Ala Gly Ala Ser Val Val Val Ser Asp Ile Asn Ala Asp Ala Ala
35 40 45
Asn His Val Val Asp Glu Ile Gln Gln Leu Gly Gly Gln Ala Phe Ala
50 55 60
Cys Arg Cys Asp Ile Thr Ser Glu Gln Glu Leu Ser Ala Leu Ala Asp
65 70 75 80
Phe Ala Ile Ser Lys Leu Gly Lys Val Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Pro Lys Pro Phe Asp Met Pro Met Ala Asp Phe Arg
100 105 110
Arg Ala Tyr Glu Leu Asn Val Phe Ser Phe Phe His Leu Ser Gln Leu
115 120 125
Val Ala Pro Glu Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Val Ile Leu Thr Ile
130 135 140
Thr Ser Met Ala Ala Glu Asn Lys Asn Ile Asn Met Thr Ser Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ser His Leu Val Arg Asn Met Ala Phe Asp
165 170 175
Leu Gly Glu Lys Asn Ile Arg Val Asn Gly Ile Ala Pro Gly Ala Ile
180 185 190
Leu Thr Asp Ala Leu Lys Ser Val Ile Thr Pro Glu Ile Glu Gln Lys
195 200 205
Met Leu Gln His Thr Pro Ile Arg Arg Leu Gly Gln Pro Gln Asp Ile
210 215 220
Ala Asn Ala Ala Leu Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ala Ser Trp Val Ser
225 230 235 240
Gly Gln Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Val Gln Glu Leu Asn
245 250 255
Claims (15)
1.一种7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，其特征在于，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质的第17位苏氨酸、第18位谷氨酸、第22位赖氨酸、第39位甘氨酸、第44位赖氨酸、第64位精氨酸、第67位苯丙氨酸、第93位半胱氨酸、第114位缬氨酸或第243位天冬酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。
2.如权利要求1所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体具有如下序列中的一种：
(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸，第22位赖氨酸替换为丙氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；
(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第17位苏氨酸替换为丙氨酸，第39位甘氨酸替换为天冬氨酸；
(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第18位谷氨酸替换为苏氨酸；
(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸；
(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第22位赖氨酸替换为天冬氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸；
(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺；
(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位甘氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第93位半胱氨酸替换为苏氨酸，243位天冬酰胺替换为丝氨酸；
(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第44位赖氨酸替换为甘氨酸，第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；
(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第64位精氨酸替换为谷氨酸，第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸；第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第67位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为天冬酰胺，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸；
(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第93位半胱氨酸替换为异亮氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第114位缬氨酸替换为酪氨酸，第243位天冬酰胺替换为亮氨酸。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1或2所述的7β-羟基甾醇脱氢酶突变体。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的核酸。
5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如权利要求4所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体的宿主选择大肠杆菌或毕赤酵母。
7.一种重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，所述的重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离含有所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)将所述7β-羟基甾醇脱氢酶突变体的粗酶液干燥得到的粗酶粉。
8.一种酶法转化制备熊脱氧胆酸的方法，其特征在于，以7-羰基石胆酸作为底物，辅酶NADH存在下，使用重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化7-羰基石胆酸不对称还原制备熊脱氧胆酸，同时NADH氧化生成NAD+。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，耦联葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖脱氢反应，将NAD+酶法还原再生为NADH。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应的条件为：底物7-羰基石胆酸的浓度为1-120g/L，葡萄糖与底物的摩尔比为1.0-2.0，NAD+添加量为0.05-1.0mmol/L，pH 6.0-9.0，温度20-40℃。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，以鹅脱氧胆酸作为底物，辅酶NAD+存在下，使用所述重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体与7α-羟基甾醇脱氢酶进行酶法耦联催化鹅脱氧胆酸的差向异构，制备获得熊脱氧胆酸。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，辅酶NAD+存在下，7α-羟基甾醇脱氢酶与重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体同时催化反应，催化鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，辅酶NAD+存在下，7α-羟基甾醇脱氢酶与重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体顺序催化反应，催化鹅脱氧胆酸差向异构制备熊脱氧胆酸。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)辅酶NAD+存在下，7α-羟基甾醇脱氢酶催化鹅脱氧胆酸立体选择性氧化生成7-羰基石胆酸；
(2)加入重组7β-羟基甾醇脱氢酶突变体催化上述步骤(1)所得7-羰基石胆酸的不对称还原，制备熊脱氧胆酸。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤(1)结束后，采用化学或者物理的方法使7α-羟基甾醇脱氢酶灭活，然后再进行步骤(2)的反应。
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