CN113388592A - 一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种7β‑HSDH酶突变体及其编码基因和应用。所述的7β‑HSDH酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型7β‑HSDH酶相比，在SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的第95位、第151位、第193位、第260位进行两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。所述的7β‑HSDH酶突变体可用于熊去氧胆酸的合成制备，将其作为生物催化剂转化底物7‑KLCA生成UDCA，反应后产物经HPLC验证，反应转化率>99％。本发明构建的7β‑HSDH酶突变体与野生型酶相比，催化活性显著提高，能显著降低酶的使用量，具有大规模工业应用的广泛前景。

Description

一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及生物酶工程技术领域，具体涉及一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid,UDCA)，化学名是3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)的7β-羟基差向异构体。临床上主要用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎等疾病，最新研究发现还可用于治疗慢性肝炎和肝移植后排斥反应。因此，随着研究的深入，UDCA的利用价值越来越受到人们的重视，对UDCA的需求量也在逐年升高。
UDCA目前主要采用熊胆提取和人工合成两种方法来制备。从熊胆提取来源有限，周期长、收得率低，而且有违于动物保护，因而现在主要采用人工合成来制备UDCA。UDCA的合成主要有化学法和酶法两种方法。化学法合成步骤多，收率低，有机溶剂使用量大，对环境污染很大。因此，以具有污染小、专一性强、反应条件温和等显著优势的酶法合成路线越来越受到各大厂商的青睐。其中合成UDCA的关键酶7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)是研发和工业生产中的重中之重，其活性好坏直接决定了UDCA的生产成本和产品质量。
目前国外已报道的7β-HSDH酶主要来源于Clostridium absonum、Eubacteriumaereofaciens、Ruminococcus gnavus、Collinsella aerofaciens、Ruminococcustorques、Xanthomonas maltophilia这六种菌株，但是酶活仍然达不到工业生产的需求，需要进一步提高。而国内关于7β-HSDH酶的研究和报道较少。例如CN112029740A公开了一种7β羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用，其通过易错PCR确定影响7β-HSDH活性的关键氨基酸并进行定点饱和突变，提高7β-HSDH底物耐受浓度，其构建的突变体7β-HSDH分泌能力增强的重组大肠杆菌可将7β-HSDH酶活较出发菌株提高2.47倍。虽然该专利有一定程度提高7β-HSDH酶活力，但是并不显著，工业化应用依然受到限制。
蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，是近年来发展起来的对原始基因序列进行人工改造、以满足工业化应用需求的高科技技术，其中蛋白定向进化技术更是获得了2018年诺贝尔化学奖。因此结合蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，进一步寻找和开发新的适用于工业大规模生产的羟基类固醇脱氢酶是目前研究的热点。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用，以解决现有羟基类固醇脱氢酶活性不理想，难以实现工业化生产的问题。本发明采用蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，对来源于梭菌属Clostridium innocuum的7β-HSDH酶进行了人工改造，改造后的突变体单位酶活相对于野生酶来说提高了约10倍，极大降低了酶在工业生产中的用量，具有良好的工业化应用前景。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
来源于Clostridium innocuum的野生型7β-HSDH酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7β-HSDH酶的编码基因核苷酸序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET29a(+)载体(Novagen公司)进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒7β-HSDH-pET29a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建7β-HSDH酶的体外异源表达体系。
7β-HSDH酶的突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的，即利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。具体地，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法来模拟7β-HSDH酶的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个活性位点，然后对这些活性位点进行NNK饱和定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。
更为具体的过程如下：本发明通过三维结构模拟技术预测出的可能的活性位点为H95、P151、W193、Y260。分别对这四个位点进行NNK饱和突变，利用高压液相色谱法(HPLC)来进行突变体的筛选。更为具体的为：1、当位点95的组氨酸(H)突变为赖氨酸(K)时，突变体的催化活性相对于野生型酶来说得到了提高；2、当位点151的脯氨酸(P)突变为缬氨酸(V)时，突变体酶活得到了提高；3、当位点193的色氨酸(W)突变为苯丙氨酸(F)时，突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高；4、当位点260的酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)时，突变体酶活得到了显著提高。当将上述4个位点的突变两两联合突变或三个联合突变或四个联合突变时，突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。
因此，一方面，本发明请求保护一种7β-HSDH酶突变体，其氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型7β-HSDH酶相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位、第151位、第193位、第260位进行两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。
具体地，所述的两两联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
具体地，所述的三个联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
具体地，所述的四个联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
另一方面，本发明还请求保护上述7β-HSDH酶突变体的编码基因。
具体地，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。
因此，又一方面，本发明还请求保护含有上述编码基因的载体。
具体地，所述的载体可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体。
又一方面，本发明还请求保护含有上述编码基因的宿主细胞。
具体地，所述的宿主细胞可以为任一种合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌或枯草芽孢杆菌。
又一方面，本发明还请求保护上述7β-HSDH酶突变体、编码基因、载体、宿主细胞在制备熊去氧胆酸中的应用。
再一方面，本发明还提供了一种制备熊去氧胆酸的方法，包括以下步骤：
S1.配置反应体系，包含：1-10g/L权利要求1-4任一项所述的7β-HSDH酶突变体，50-200mM pH9.0磷酸钠缓冲液，0.1-0.5g/L辅酶NADPH，40-100g/L7-酮基石胆酸，7-17g/L异丙醇；控制反应体系温度为30℃，进行搅拌反应；
S2.反应24h后进行HPLC检测，即得熊去氧胆酸。
反应产物经HPLC检测，反应转化率＞99％。从而可证明该酶突变体可作为生物催化剂，转化底物7-酮基石胆酸(7-KLCA)生成熊去氧胆酸(UDCA)。
此外，可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明构建的7β-HSDH酶突变体与野生型酶相比，催化活性显著提高，能显著降低酶的使用量，可在室温、24h之内将40-100g/L的底物7-KLCA完全转化为UDCA，转化率>99％。反应条件温和，几乎无副产物，辅酶循环体系稳定，具有广阔的工业化应用前景。
附图说明
图1为7β-HSDH酶突变体的生物催化反应过程。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
实施例一原核表达体系的构建
7β-HSDH基因片段由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII(购自New England Biolabs公司，NEB)在37℃双酶切4h后，1％琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司)。随后与同样经过双酶切的表达载体pET29a(+)(Novagen公司)，在T4 DNA连接酶(购自Takara公司)作用下置于16℃连接过夜。连接液转化Top10感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒7β-HSDH-pET29a(+)。
将阳性重组质粒7β-HSDH-pET29a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株7β-HSDH-pET29a(+)/BL21(DE3)，作为后续定向进化和发酵的原代菌株。
用于辅酶再生的醇脱氢酶基因(TbADH)由常州基宇生物技术有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同7β-HSDH-pET29a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后得到表达菌株。
实施例二酶的摇瓶发酵制备酶冻干粉
上述构建的表达菌株7β-HSDH-pET29a(+)/BL21(DE3)、GDH-pET29a(+)/BL21(DE3)、在加有终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素的5mL LB液体培养基【10g/L胰蛋白胨(OXIOD)，5g/L酵母粉(OXIOD)，10g/L氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为30μg/mL硫酸卡那霉素的500mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在30℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，20min)，于4℃、12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。
实施例三突变体的构建和筛选
突变体的构建：采用同源建模的方法来进行7β-HSDH的三维结构模拟，并利用分子对接和能量最低原理预测出可能的催化位点，初步确定为H95、P151、W193、Y260四个位点。随后以7β-HSDH-pET29a(+)重组质粒为模板，对这四个位点分别进行了NNK饱和突变(具体突变操作参照stratagene公司的
Figure BDA0003140900730000061
Site-Directed Mutagenesis Kit操作说明)。
其中：
95位点突变
正向引物(SEQ ID NO:15)：
GAGCTATGTGGCGTGCCTGNNKAAATTTGGCAAACTGCAGG，
反向引物(SEQ ID NO:16)：
CCTGCAGTTTGCCAAATTTMNNCAGGCACGCCACATAGCTC；
151位点突变
正向引物(SEQ ID NO:17)：
GACCGGCGTGACCAGCAGCNNKTATAACGCGCAGTATGGCG，
反向引物(SEQ ID NO:18)：
CGCCATACTGCGCGTTATAMNNGCTGCTGGTCACGCCGGTC；
193位点突变
正向引物(SEQ ID NO:19)：
GCAGCACCATTACCCCGAGCNNKCTGAAAAACCAGCCGGGCGG，
反向引物(SEQ ID NO:20)：
CCGCCCGGCTGGTTTTTCAGMNNGCTCGGGGTAATGGTGCTGC；
260位点突变
正向引物(SEQ ID NO:21)：
CGGAATATATGGGCAAATTTNNKTAAAAGCTTGCGGCCGCACTC，
反向引物(SEQ ID NO:22)：
GAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAMNNAAATTTGCCCATATATTCCG。
突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21(DE3)宿主菌后，涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，于37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜。于4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。
突变体的筛选：40g/L底物浓度，0.2g/L NADPH，50mM pH9.0磷酸钠缓冲液，2g/LTbADH，异丙醇7g/L，按10％比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应。分别于2h和24h取样进行HPLC检测。
将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：当位点95的组氨酸(H)突变为赖氨酸(K)，位点151的脯氨酸(P)突变为缬氨酸(V)，位点193的色氨酸(W)突变为苯丙氨酸(F)，位点260的酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)。
对这几个位点进行两两联合突变、三个联合突变和四个联合突变，活性检测发现某些位点的联合突变后催化活性相较于单点突变来说又得到了显著提高，具体酶活数值见下表1。
表1不同突变组合的酶活
突变体 单位酶活 提高倍数
Wild type 7β-HSDH 8.1U/mg --
H95K 12.2U/mg 1.5
P151V 16.1U/mg 1.98
W193F 9.8U/mg 1.2
Y260F 18U/mg 2.2
H95K/P151V 28.4U/mg 3.5
P151V/W193F 44.5U/mg 5.5
P151V/Y260F 47.8U/mg 5.9
P151V/W193F/Y260F 74U/mg 9.1
H95K/P151V/Y260F 63.7U/mg 7.9
H95K/P151V/W193F/Y260F 96.4U/mg 11.9
*1U定义为单位时间内(1min)生产1μmol产物NMN所需的酶量。
其中，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，相应地，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
实施例四突变体的生物催化
将8g底物7-KLCA溶解于100mL50mM pH9.0磷酸钠缓冲液中，并用液碱调节pH至8.0，待底物完全溶解后加入异丙醇1.4g、0.01g NADPH、0.2g 7β-HSDH突变体冻干粉、0.2gTbADH冻干粉。反应液置于30℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC检测，底物转化率>99％。催化反应过程见附图1。
实施例五突变体的生物催化
将10g底物7-KLCA溶解于100mL50mM pH9.0磷酸钠缓冲液中，并用液碱调节pH至8.0，待底物完全溶解后加入异丙醇1.6g、0.01g NADPH、0.2g 7β-HSDH突变体冻干粉、0.2gTbADH冻干粉。反应液置于30℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC检测，底物转化率>99％。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 中山百灵生物技术股份有限公司
<120> 一种7β-HSDH酶突变体及其编码基因和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> 无害梭菌(Clostridium innocuum)
<400> 1
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
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aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgcataaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc ccgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctggc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaattttat 780
taa 783
<210> 2
<211> 260
<212> PRT
<213> 无害梭菌(Clostridium innocuum)
<400> 2
Met Asn Phe Lys Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Thr Ala Glu Lys Ile Ala Glu Asn Gly
20 25 30
Met Asn Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Ala Leu Lys Glu Leu
35 40 45
Gly Ala Ser Ile Ser Glu Lys Tyr Gly Val Glu Asn Met Val Ile Arg
50 55 60
Ala Asp Phe Ser Glu Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Phe Glu Lys Thr
65 70 75 80
Lys Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu His Lys
85 90 95
Phe Gly Lys Leu Gln Asp Thr Asp Trp Glu Ser His Lys Arg Met Leu
100 105 110
Asn Val Asn Ile Asn Thr Phe Leu Glu Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly
115 120 125
Ile Phe Thr Lys Gln Lys Arg Gly Cys Val Ile Asn Tyr Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Gly Val Thr Ser Ser Pro Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Tyr Ile Ala Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Tyr Glu Ser Arg Asp
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gly Lys Val Arg Ser Leu Val Val Gly Glu Val Asn Arg Gln Ala Val
225 230 235 240
His His Trp His Cys Asp Ile Ser Ala Asp Glu Ala Ala Glu Tyr Met
245 250 255
Gly Lys Phe Tyr
260
<210> 3
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Phe Lys Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Thr Ala Glu Lys Ile Ala Glu Asn Gly
20 25 30
Met Asn Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Ala Leu Lys Glu Leu
35 40 45
Gly Ala Ser Ile Ser Glu Lys Tyr Gly Val Glu Asn Met Val Ile Arg
50 55 60
Ala Asp Phe Ser Glu Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Phe Glu Lys Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Asn Val Asn Ile Asn Thr Phe Leu Glu Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly
115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gly Lys Val Arg Ser Leu Val Val Gly Glu Val Asn Arg Gln Ala Val
225 230 235 240
His His Trp His Cys Asp Ile Ser Ala Asp Glu Ala Ala Glu Tyr Met
245 250 255
Gly Lys Phe Tyr
260
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<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Phe Lys Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
Met Asn Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Ala Leu Lys Glu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Gly Lys Val Arg Ser Leu Val Val Gly Glu Val Asn Arg Gln Ala Val
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245 250 255
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260
<210> 5
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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1 5 10 15
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20 25 30
Met Asn Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Ala Leu Lys Glu Leu
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gly Lys Val Arg Ser Leu Val Val Gly Glu Val Asn Arg Gln Ala Val
225 230 235 240
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245 250 255
Gly Lys Phe Phe
260
<210> 6
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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20 25 30
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Ala Tyr Ile Ala Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Tyr Glu Ser Arg Asp
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260
<210> 7
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5 10 15
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Gly Ala Ser Ile Ser Glu Lys Tyr Gly Val Glu Asn Met Val Ile Arg
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65 70 75 80
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100 105 110
Asn Val Asn Ile Asn Thr Phe Leu Glu Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly
115 120 125
Ile Phe Thr Lys Gln Lys Arg Gly Cys Val Ile Asn Tyr Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Gly Val Thr Ser Ser Val Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Tyr Ile Ala Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Tyr Glu Ser Arg Asp
165 170 175
Cys Val Asp Val Met Val Ala Thr Leu Gly Ser Thr Ile Thr Pro Ser
180 185 190
Trp Leu Lys Asn Gln Pro Gly Gly Glu Ala Gly Glu Ala Ala Ile Lys
195 200 205
Lys Ala Met Thr Pro Glu Ala Thr Ile Asp Glu Ile Phe Lys Gln Ile
210 215 220
Gly Lys Val Arg Ser Leu Val Val Gly Glu Val Asn Arg Gln Ala Val
225 230 235 240
His His Trp His Cys Asp Ile Ser Ala Asp Glu Ala Ala Glu Tyr Met
245 250 255
Gly Lys Phe Phe
260
<210> 8
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Asn Phe Lys Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Thr Ala Glu Lys Ile Ala Glu Asn Gly
20 25 30
Met Asn Val Val Leu Val Gly Arg Arg Glu Glu Ala Leu Lys Glu Leu
35 40 45
Gly Ala Ser Ile Ser Glu Lys Tyr Gly Val Glu Asn Met Val Ile Arg
50 55 60
Ala Asp Phe Ser Glu Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Phe Glu Lys Thr
65 70 75 80
Lys Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu Lys Lys
85 90 95
Phe Gly Lys Leu Gln Asp Thr Asp Trp Glu Ser His Lys Arg Met Leu
100 105 110
Asn Val Asn Ile Asn Thr Phe Leu Glu Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly
115 120 125
Ile Phe Thr Lys Gln Lys Arg Gly Cys Val Ile Asn Tyr Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Gly Val Thr Ser Ser Val Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Tyr Ile Ala Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Tyr Glu Ser Arg Asp
165 170 175
Cys Val Asp Val Met Val Ala Thr Leu Gly Ser Thr Ile Thr Pro Ser
180 185 190
Phe Leu Lys Asn Gln Pro Gly Gly Glu Ala Gly Glu Ala Ala Ile Lys
195 200 205
Lys Ala Met Thr Pro Glu Ala Thr Ile Asp Glu Ile Phe Lys Gln Ile
210 215 220
Gly Lys Val Arg Ser Leu Val Val Gly Glu Val Asn Arg Gln Ala Val
225 230 235 240
His His Trp His Cys Asp Ile Ser Ala Asp Glu Ala Ala Glu Tyr Met
245 250 255
Gly Lys Phe Phe
260
<210> 9
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
atggtgattc gcgcggattt tagcgaagat catgcggcgg cggcgatttt tgaaaaaacc 240
aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgaagaaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc gtgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctggc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaattttat 780
taa 783
<210> 10
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
atggtgattc gcgcggattt tagcgaagat catgcggcgg cggcgatttt tgaaaaaacc 240
aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgcataaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc gtgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctttc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaattttat 780
taa 783
<210> 11
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
atggtgattc gcgcggattt tagcgaagat catgcggcgg cggcgatttt tgaaaaaacc 240
aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgcataaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc gtgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctggc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaatttttt 780
taa 783
<210> 12
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
atggtgattc gcgcggattt tagcgaagat catgcggcgg cggcgatttt tgaaaaaacc 240
aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgcataaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc gtgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctttc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaatttttt 780
taa 783
<210> 13
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
atggtgattc gcgcggattt tagcgaagat catgcggcgg cggcgatttt tgaaaaaacc 240
aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgaagaaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc gtgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctggc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaatttttt 780
taa 783
<210> 14
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgaacttta aagaaaaata tggcgaatgg ggcattattc tgggcgcgac cgaaggcgtg 60
ggcaaagcga ccgcggaaaa aattgcggaa aacggcatga acgtggtgct ggtgggccgc 120
cgcgaagaag cgctgaaaga actgggcgcg agcattagcg aaaaatatgg cgtggaaaac 180
atggtgattc gcgcggattt tagcgaagat catgcggcgg cggcgatttt tgaaaaaacc 240
aaagatctgg atatgggctt tatgagctat gtggcgtgcc tgaagaaatt tggcaaactg 300
caggataccg attgggaaag ccataaacgc atgctgaacg tgaacattaa cacctttctg 360
gaatgctttt atcattatat gggcattttt accaaacaga aacgcggctg cgtgattaac 420
tatagcagcc tgaccggcgt gaccagcagc gtgtataacg cgcagtatgg cgcgggcaaa 480
gcgtatattg cgaaactgac cgaagcggtg gcgtatgaaa gccgcgattg cgtggatgtg 540
atggtggcga ccctgggcag caccattacc ccgagctttc tgaaaaacca gccgggcggc 600
gaagcgggcg aagcggcgat taaaaaagcg atgaccccgg aagcgaccat tgatgaaatt 660
tttaaacaga ttggcaaagt gcgcagcctg gtggtgggcg aagtgaaccg ccaggcggtg 720
catcattggc attgcgatat tagcgcggat gaagcggcgg aatatatggg caaatttttt 780
taa 783
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagctatgtg gcgtgcctgn nkaaatttgg caaactgcag g 41
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctgcagttt gccaaatttm nncaggcacg ccacatagct c 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaccggcgtg accagcagcn nktataacgc gcagtatggc g 41
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgccatactg cgcgttatam nngctgctgg tcacgccggt c 41
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcagcaccat taccccgagc nnkctgaaaa accagccggg cgg 43
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccgcccggct ggtttttcag mnngctcggg gtaatggtgc tgc 43
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cggaatatat gggcaaattt nnktaaaagc ttgcggccgc actc 44
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagtgcggcc gcaagctttt amnnaaattt gcccatatat tccg 44

Claims (10)

1.一种7β-HSDH酶突变体，其特征在于，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型7β-HSDH酶相比，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位、第151位、第193位、第260位进行两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。
2.根据权利要求1所述的7β-HSDH酶突变体，其特征在于，所述的两两联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述的7β-HSDH酶突变体，其特征在于，所述的三个联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第151位由脯氨酸突变为丙氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
或，当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求1所述的7β-HSDH酶突变体，其特征在于，所述的四个联合突变为：
当SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第95位由组氨酸突变为赖氨酸，第151位由脯氨酸突变为缬氨酸，第193位由色氨酸突变为苯丙氨酸，第260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述的7β-HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5.权利要求2-4任一项所述的7β-HSDH酶突变体的编码基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
或，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的7β-HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
6.含有权利要求5所述的编码基因的载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体为pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体。
8.含有权利要求5所述的编码基因的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌或枯草芽孢杆菌。
9.权利要求1-4任一项所述的7β-HSDH酶突变体、权利要求5所述的编码基因、权利要求6或7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞在制备熊去氧胆酸中的应用。
10.一种制备熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
S1.配置反应体系，包含：1-10g/L权利要求1-4任一项所述的7β-HSDH酶突变体，50-200mM pH9.0磷酸钠缓冲液，0.1-0.5g/L辅酶NADPH，40-100g/L7-酮基石胆酸，7-17g/L异丙醇；控制反应体系温度为30℃，进行搅拌反应；
S2.反应24h后进行HPLC检测，即得熊去氧胆酸。
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