CN104388496A - 一种酶法降解几丁质生产n-乙酰氨基葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：步骤1，微生物发酵产几丁质酶；步骤2，粗酶液的获得；步骤3，浓缩酶液；步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖。本发明首次提出一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，该方法中产酶培养基成本低廉，生产周期短；浓缩酶液所用材料可重复再利用，操作过程简单，酶活回收率高；降解过程中采取了防止染菌措施，实现了以低价值的几丁质为原料高效率迅速生产具有高医疗价值N-乙酰氨基葡萄糖的目的，具有显著的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法。
背景技术
甲壳素(C8H13O5N)n ，又名几丁质、甲壳质或壳多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键结合起来的聚合物，是一种含氮多糖类物质，为虾、蟹、昆虫等甲壳的重要成分。分子结构为长链状，由8000个单体组成的多糖，为自然界的一种半透明而坚固的材料。几丁质能通过化学法和生物酶法被降解成几丁寡糖及单糖，目前常用的化学降解法具有环境污染巨大、反应效率低、产品质量差、过程不易控制等缺点，已逐步被生物酶法降解几丁质取代。
N-乙酰氨基葡萄糖是壳多糖保健食品系列中最新的第三代保健机能性食品添加剂，可作低热量的甜味剂，也可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品添加剂。主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿癌能起到抑制和治疗作用，此外，N-乙酰氨基葡萄糖对于骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。
目前报道的微生物发酵所产几丁质酶酶活普遍较低，在降解几丁质生产 N-乙酰氨基葡萄糖时转化效率低，难以满足工业化生产需求。因此对酶液进行浓缩，提高降解效率是很有必要的。传统酶浓缩方法包括盐沉，反渗透等方法，存在诸多问题：盐沉过程酶活损失大，操作繁琐；凝胶吸附法成本高昂，难以推广。此外，几丁质降解产物既可以作为菌体利用的碳源又可作为氮源，转化过程难以控制，极易染菌。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通过调控优化微生物产酶、对酶液进行浓缩，转化过程中采取抑菌措施，进而能高效、安全的降解几丁质生产几丁寡糖产品。
为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
选产几丁质酶的菌株作为种子，在37℃、200 rpm下培养得种子液，再以体积分数5%~10%接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量40-60%，培养温度24℃~37℃，转速为200~500 rpm，通气量1vvm~3vvm，初始pH7.0~8.0，发酵72~96h后收集发酵液；
步骤2，粗酶液的获得
将步骤1获得的发酵液低温高速离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，低温贮存，备用；
步骤3，浓缩酶液
将步骤2中所得得到的几丁质粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测粗酶液和浓缩酶液酶活，计算回收率；
步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖
利用步骤3中获得的浓缩酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系的温度为25-37℃，搅拌速度为200 rpm，转化24-72 h，液相法检测N-乙酰氨基葡萄糖浓度。
作为优选的是，所述产几丁质酶的菌株为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 (CGMCC NO：3438；ATCC BAA-2140)或Chitinibactersp.GC72（CCTCC NO ：M2014113）。
作为优选的是，步骤3，浓缩用变色硅胶或无色硅胶与变色硅胶的混合物。
作为优选的是，步骤3，浓缩温度为4℃，浓缩时间2-12h。
作为优选的是，步骤4，还包括占转化体系体积分数为0.1-0.2%的抗生素，所述所述抗生素为卡纳或四环素。
测酶活所用方法为DNS法：将1.9 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）和0.5 mL 1%的胶体几丁质加100μl酶液组成的反应体系，37℃水浴30 min，沸水浴5 min中止反应，加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却至室温，离心后取上清液，在波长535 nm下测吸光度，以灭活的等量酶液作空白对照。
有益效果
（1）利用硅胶及透析袋浓缩几丁质酶液，较传统浓缩酶液的方法具有操作简单，成本低，高酶活回收率的优势。硅胶吸水快，能很直观看到吸水情况，节约生产时间，不需要外界能量辅助，且能重复利用。
（2）采用高浓度酶液生产N-乙酰氨基葡萄糖效率高，快速，大大降低了生产成本。
（3）采用往转化体系中加入适量抗生素，可有效地防止染菌，降低了安全隐患。
（4）转化体系是经过实验优化，转化效率高。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
选用Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1菌株作为种子，接种到培养基（2 g/L葡萄糖，2 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.4 g/LMgSO4·7H2O，pH 7.0）上，37℃、200rpm下培养12 h，再以体积分数5%的接种量接入装有产酶发酵培养基（3 g/L粉粒几丁质，3 g/L菊芋粉，3 g/L尿素，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O ，0.5 g/LMgSO4·7H2O）的7.5 L发酵罐，装液量4.5L，在温度为26℃，转速为250rpm，通气量为1 vvm，初始pH7.5下发酵72 h后收集发酵液。
步骤2，粗酶液的获得
将步骤1获得的发酵液在4℃离心机中8000g离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，4℃贮存，备用；
步骤3，浓缩酶液
将步骤2中所得到的几丁质酶粗酶液，装入透析袋后，埋入干燥剂硅胶中放入4℃冰箱，当硅胶颜色从蓝色变成红色变化，重新换成干燥的硅胶，浓缩12h，经过测量浓缩后体积，得0.5倍体积分数浓缩酶液。用DNS法测粗酶液为0.70U/mL和浓缩酶液酶活为1.3 U/mL，几丁质酶活回收率为93%。
步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖
利用步骤3中获得的浓缩酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系（40 g/L粉粒几丁质、100ml浓缩的几丁质酶液、体积分数为0.1%的四环素）100 mL， 在温度37℃，200 rpm下搅拌转化24 h。液相测N-乙酰氨基葡萄糖浓度为35 g/L，产率87.5%。
实施例2
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
选用Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1菌株作为种子，接种到培养基（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/LMgSO4·7H2O，pH 7.0）上， 37℃、200 rpm下培养12 h，再以体积分数5%的接种量接入装有产酶发酵培养基（4 g/L粉粒几丁质，4 g/L菊芋粉4 g/L，尿素0.7 g/LKH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/LMgSO4·7H2O）的7.5L发酵罐，装液量4.5L，在温度26℃，转速为250 rpm，通气量为2vvm，初始pH7.5下发酵72 h后发酵收集发酵液。
步骤2，粗酶液的获得
将步骤1获得的发酵液在4℃离心机中8000g离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，4℃贮存，备用。
步骤3，浓缩酶液
将步骤2中所得到的几丁质酶粗酶液，装入透析袋后，埋入干燥剂硅胶中放入4℃冰箱，当硅胶颜色从蓝色变成红色变化，重新换成干燥的硅胶，浓缩5h经过测量浓缩后体积，得2/3倍体积分数浓缩酶液。用DNS法测粗酶液为0.79 U/mL和浓缩酶液酶活为1.35 U/mL，几丁质酶活回收率为85.2%。
步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖
利用步骤3中获得的浓缩酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系（40 g/L粉粒几丁质 、200 mL浓缩的几丁质酶液、体积分数为0.15%四环素）200 mL，在温度37℃ ，200 rpm下搅拌转化24 h。液相测N-乙酰氨基葡萄糖浓度为36.5g/L，产率91.3%。
实施例3
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
选用Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1菌株作为种子，接种到培养基（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/LMgSO4·7H2O，pH 7.0）上， 37℃、200 rpm下培养12 h，再以体积分数5%的接种量接入装有产酶发酵培养基（4 g/L粉粒几丁质，4 g/L菊芋粉4 g/L，尿素0.7 g/LKH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/LMgSO4·7H2O）的7.5L发酵罐，装液量4.5L，在温度为26℃，转速为250 rpm，通气量为2vvm，初始pH7.5下发酵72 h后收集发酵液。
步骤2，粗酶液的获得
将步骤1获得的发酵液在4℃离心机中8000g离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，4℃贮存，备用。
步骤3，浓缩酶液
将步骤2中所得到的几丁质酶粗酶液，装入透析袋中，埋入干燥剂硅胶中放入4℃低温恒温摇床，当硅胶颜色从蓝色变成红色变化，重新换成干燥的硅胶，浓缩12h经过测量浓缩后体积，得1/3倍体积分数浓缩酶液。用DNS法测粗酶液为0.78 U/mL和浓缩酶液酶活为2.12 U/mL，几丁质酶活回收率为90.5%。
步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖
利用步骤3中获得的浓缩酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系（40 g/L粉粒几丁质、200mL浓缩的几丁质酶液、体积分数为0.1%卡纳和体积分数为0.1%四环素）200 mL，在温度37℃，200 rpm下搅拌转化24 h。液相测N-乙酰氨基葡萄糖浓度为39 g/L，产率97.5%。
对比例
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
选用Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1菌株作为种子，接种到培养基（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/LMgSO4·7H2O，pH 7.0）上， 37℃、200 rpm下培养12 h，再以体积分数5%的接种量接入装有产酶发酵培养基（4 g/L粉粒几丁质，4 g/L菊芋粉4 g/L尿素0.7 g/LKH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/LMgSO4·7H2O）的7.5L发酵罐，装液量4.5L，在温度为26℃，转速为250 rpm，通气量为2vvm，初始pH7.5下发酵72h后收集发酵液。
步骤2，粗酶液的获得
将步骤1获得的的发酵液在4℃离心机中8000g离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，4℃贮存，备用。
步骤3，生产N-乙酰氨基葡萄糖
利用步骤2中粗酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系（40 g/L粉粒几丁质、200mL几丁质粗酶液、体积分数为0.1%的卡纳和体积分数为0.1%的四环素）200 mL，在温度37℃，200 rpm下搅拌转化24 h。液相测N-乙酰氨基葡萄糖浓度为19 g/L，产率47.5%。
通过实施例1-3和对比例的结果可知，本发明的方法生产N-乙酰氨基葡萄糖浓度高，产率高，其中在转化过程中，酶液的浓缩倍数从不浓缩到浓缩3倍时，N-乙酰氨基葡萄糖浓度从19g/L变成39g/L，产率从47.5%变为97.5%。
Claims (5)
1.一种酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
选产几丁质酶的菌株作为种子，在37℃、200 rpm下培养得种子液，再以体积分数5%~10%接种量接入装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量40~60%，培养温度24℃~37℃，转速为200~500 rpm，通气量1vvm~3vvm，初始pH7.0~8.0，发酵72~96h后收集发酵液；
步骤2，粗酶液的获得
将步骤1获得的发酵液低温高速离心，分离菌体，收集上清液，得到几丁质酶粗酶液，低温贮存，备用；
步骤3，浓缩酶液
将步骤2中所得到的几丁质酶粗酶液，低温透析浓缩得到浓缩酶液，测粗酶液和浓缩酶液酶活，计算回收率；
步骤4，生产N-乙酰氨基葡萄糖
利用步骤3中获得的浓缩酶液无菌转化几丁质，其中，转化体系的温度为25-37℃，搅拌速度为200 rpm，转化24-72 h，液相法检测N-乙酰氨基葡萄糖浓度。
2.根据权利要求1所述的酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于：所述产几丁质酶的菌株为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1或Chitinibactersp.GC72。
3.根据权利要求1所述的酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于：步骤3，浓缩用变色硅胶或无色硅胶与变色硅胶的混合物。
4.根据权利要求1所述的酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于：步骤3，浓缩温度为4℃，浓缩时间2-12h。
5.根据权利要求1所述的酶法降解几丁质生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于：步骤4，还包括占转化体系体积分数为0.1-0.2%的抗生素，所述所述抗生素为卡纳或四环素。
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