CN101838342B - 一种微藻胞外多糖的膜分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微藻胞外多糖的膜分离方法。采用径向流微滤技术去除脱藻培养液中较大粒径的悬浮杂质，再利用切向流超滤技术分离培养液中的微藻胞外多糖。相对于目前微藻多糖提取分离技术复杂的操作过程和有限的处理能力，该技术可实现对微藻胞外多糖的规模化快速分离，从而为微藻养殖企业提供从大量脱藻培养液中高效分离生物活性多糖。

Description

一种微藻胞外多糖的膜分离方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术和生物分离工程领域，具体涉及微藻胞外多糖的分离方法。

技术背景

微藻及相关产品与人类的食物和健康密切相关，因而使得微藻产业获得了异常旺盛和强劲的发展态势，当今的微藻产业以每年超过万吨的产量和逾13亿美元的产值而备受关注。我国的微藻产业化始于20世纪50年代，80年代开始工业化生产，在国家相关政策的大力扶持和社会各界的广泛关注下，近十几年来我国微藻产业发展非常迅速，并取得了显著的成就，各种微藻养殖单位和企业纷纷建成投产，养殖种类包括螺旋藻、小球藻、红球藻、念珠藻等，产品主要涉及微藻细胞、藻类蛋白等。在能源危机日趋严重的今天，利用微藻生产再生能源(生物柴油)也是备受瞩目的课题。

随着微藻产业的兴起与稳步发展，微藻多糖的抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、降血糖以及免疫调节等功效也逐渐被人们所认识和接受，为这类产物作为药物、药物中间体、功能食品或化妆品来开发提供了基础。例如，我们从地木耳、葛仙米等食药两用的念珠藻中提取分离的多糖具有极强的生物活性(包括免疫调节活性)和特殊的化学结构(如念珠藻糖醛酸；nosturonic acid)。然而，由于微藻自身的特点，目前国内外微藻多糖的提取分离技术仍处于操作复杂、水平较低的发展状态，难以形成实用的规模化制备技术，使得从微藻获取这类产物在技术上难以和高等植物或大型海藻相媲美。而另一方面，我国微藻培养和产品开发已经成为新兴的生物技术产业，如螺旋藻、小球藻、红球藻、盐藻、念珠藻等已实现规模化养殖，其中尤以螺旋藻产业发展最为蓬勃，除了大型螺旋藻生产基地外，还有一系列相关的食品、保健品、化妆品等多种产品。由于微藻自身的特点和生产工艺等因素，微藻在其生长过程中会不断地分泌胞外产物(包括大量的胞外多糖)到其培养基中，但目前在进行微藻大规模生产时，由于缺乏产品深加工技术，除微藻细胞本身被收获利用外，大量的胞外活性产物均随脱藻培养液一起被废弃。这些产物如能加以收集并合理开发利用，将能提升微藻的产业价值，从而进一步促进微藻产业的迅速、健康发展。

目前微藻胞外多糖的分离纯化多采用传统的方法，即去除藻细胞-减压浓缩-乙醇沉淀-透析-除蛋白-冷冻干燥，这种方法不仅费时费力而且效率较低，难以进行规模化生产。随着技术的进步和加工工艺的发展，各种膜材料逐渐用于生物分离工艺，从而使原本复杂的分离工艺变得简单易行。与传统分离方法相比，膜分离方法具有效率高、工作条件温和、可连续操作等优点，因此在工业上得到了越来越广泛的应用。其中，径向流微滤技术采用径向流动原理，原料液从微滤膜套筒圆周流向套筒圆心，与传统的膜过滤相比，其流向的有效膜过滤面积加大，柱长增加，既可线性增加样品的处理量而分离条件和处理时间又没有明显变化。超滤技术是利用膜的选择性透过原理，将大分子截留于膜上而允许小分子物质透过。在传统的超滤过程中随着超滤的进行，由于浓差极化现象而使大分子物质在膜介质表面不断堆积，造成超滤膜的通量大大降低，影响分离效率，因此在实际应用中常采用错流过滤或切向流过滤来提高超滤效率。在切向流超滤技术中，原料液的流向平行于超滤膜，从而可以及时将沉积在超滤膜表面的大分子溶质随着料液的流动而转移，有效缓解膜通量下降过快的问题。通过滤液回流和重复超滤，可对滤液中溶质进行快速浓缩和分离。

发明内容

本发明的目的就是根据上述现有技术的状况而提供一种微藻胞外多糖的膜分离方法，该方法快速且可规模化。

为达到上述目的，本发明对微藻培养液依次进行下述步骤以分离其胞外多糖：

1、径向流微滤，除去微藻培养液中的杂质；

2、切向流超滤，分离微藻培养液中的微藻胞外多糖。

上述微藻胞外多糖包括螺旋藻、红球藻、硅藻、小球藻、念珠藻等微藻在培养过程中向培养液中分泌的多糖。

为了保证径向流微滤和切向流超滤的速度和效率，其径向流微滤中的径向流速应控制在≥1.0L/min；其切向流超滤中的跨膜压力应控制在≥0.5bar。

实际应用中，当微藻培养液中残留的藻细胞及其碎片等杂质较多时，为了节省径向流微滤的时间，应对其进行相应的预处理。

下面结合本发明的工作过程对本发明进一步阐述如下：

1、径向流微滤：在蠕动泵的驱动下对微藻培养液采用径向流微滤去除其中的杂质。微滤时，调节流速至≥1.0L/min。在径向流微滤过程中透过液流量与微藻培养液中的含杂程度密切相关，杂质越少，微滤时透过液流量下降的速度就越缓慢，高流量微滤维持的时间就越长；反之，则随着微滤的进行滤膜表面沉积的杂质会增多，透过液流量就会急剧下降，造成膜两侧压力差减小，最终导致微滤难以继续进行。如果微滤流速降至≤0.5L/min，表明微滤膜污染严重，此时可更换膜组件并清洗系统。其清洗方法可以是：先用40-50℃的温水依次正向、反向清洗微滤膜各8-12分钟，再用0.05-0.12mol/L的NaOH溶液依次正向、反向清洗微滤膜各8-12分钟，最后用纯水冲洗8-12分钟以确保除去残留的NaOH和降解的杂质。

为了防止微滤时透过液流量下降的速度过快，可对含杂质较多的微藻培养液依次进行下列除杂预处理：1)沉降处理。微藻培养结束后，根据微藻自身的形态和生理特点对其培养液进行沉降处理。对螺旋藻、念珠藻等易于沉降的丝状藻类，可使其自然沉降10-24小时；对小球藻、硅藻等单细胞藻类，可加入50-150mg/L明矾进行絮凝沉降至上层培养液澄清。2)预过滤。将经上述沉降处理得到的澄清培养液依次用纱布、150-200目网布和350-500目网布过滤，以除去残留的藻细胞及其碎片等杂质，目的是对培养液进行进一步处理，得到微滤料液，以有效缓解后续径向流微滤时对微滤膜组件的堵塞。

2、切向流超滤：经径向流微滤后的滤过液在蠕动泵驱动下进行切向流超滤。选择截留分子量为3,000-10,000Da的超滤膜，选择跨膜压力≥0.5bar，在20-35℃下进行超滤。在切向流超滤技术中，滤液平行于滤膜方向流动，被截留的大分子物质随着料液的循环流动而不断地被转移，降低了滤膜表面溶质的浓度和堆积程度，从而使浓差极化现象得到缓解，因而超滤膜通量下降并不显著，可以较长时间持续运行。在跨膜压力的推动下小分子和水透过超滤膜成为滤过液，大分子物质仍被截留在料液中因而其浓度逐渐增加(超滤的浓缩模式)。当料液浓缩到一定程度时，可向料液中补加一定量的纯水，补加流量和此时的超滤膜通量保持相同，可以进一步去除残留在料液中的小分子物质，最终达到分离和纯化胞外多糖的目的(超滤的透析过滤模式)。在整个切向流超滤过程中，将这两种模式结合起来(即开始时采用浓缩模式而达到一定浓度时转变为透析过滤模式)，可以使超滤达到最佳分离效果。将截留所得浓缩液2-10L在-50℃--70℃下真空冷冻干燥，可得固体状的微藻胞外多糖。在超滤过程中，如果透过液流量下降至起始时的一半以下时，需按照步骤1中所述的方法对超滤系统及膜组件进行清洗。在超滤过程中维持膜通量的方法为：1)在超滤过程中可通过调节料液温度、压力及进料流速来缓解超滤膜通量的下降程度。2)在跨膜压力恒定的情况下通过调节料液进口压力和回流排放压力的比例可缓解超滤膜通量的下降。跨膜压力主要由料液进口压力、回流排放压力和透过液排放压力来决定。由于透过液排放压力通常近似为零，跨膜压力即为料液进口压力和回流排放压力的平均值。膜通量，即常说的膜的水通量，指在单位时间内单位膜面积透过的水的体积。它一般采用纯水在恒定压力、恒定温度条件下进行试验而得到。

膜通量表示为：J＝V/(A×t)

其中：J——膜通量[L/(m²×h)]

      V——透过液体积(L)

      A——面积(m²)

      T——时间(h)

本发明操作条件温和，易于线性放大，可广泛应用于规模化生产。相对于常规的多糖制备工艺更有利于维持微藻多糖及糖复合物的生物活性，这对后续产品开发极为重要。本发明为提高微藻生产企业的产业价值、拓宽微藻产品类型和提高微藻资源利用率提供一条有效途径。

附图说明

图1为不同跨膜压力下超滤膜通量随超滤时间而变化的曲线图。

图2为不同温度下超滤膜通量随超滤时间而变化的曲线图情况。

附图中：h-时间(小时)，J-膜通量，1-对应0.5bar压力下的曲线图，2-对应0.6bar压力下的曲线图，3-对应0.7bar压力下的曲线图，4-对应25℃下的曲线图，5-对应35℃下的曲线图，6-对应45℃下的曲线图。

具体实施方式

下面以实施例的方式对本发明作进一步介绍。

实施例1：螺旋藻胞外多糖的分离和制备

螺旋藻系国内外微藻规模化养殖中最常见的一种，大量研究证明螺旋藻含有丰富的营养物质，并在增强免疫、调节机体代谢功能等方面有积极作用。螺旋藻多糖是从螺旋藻中分离出来的一类具有提高免疫力、抗衰老、抗肿瘤和促进细胞生长等功能的天然活性产物。

本发明中螺旋藻胞外多糖的规模化分离和制备步骤如下：

1、澄清预滤：1)沉降处理。将培养30天的螺旋藻培养液450L自然沉降12小时，上层即为澄清脱藻培养液；2)预过滤。将上述脱藻培养液依次经两层纱布、200目网布和500目网布进行预过滤。

2、径向流微滤除杂质。在环境温度下调节料液流速至1L/min，通过径向流微滤获得微滤透过液。当流速降至0.5L/min时，更换膜组件并清洗系统。清洗方法：先用40-50℃的温水清洗微滤膜8-12分钟，再用0.05-0.12mol/L的NaOH溶液清洗微滤膜8-12分钟，最后用纯水冲洗8-12分钟以确保除去残留的NaOH和降解的杂质。

3、切向流超滤分离螺旋藻胞外多糖。选择截留分子量为5000Da的超滤膜，调整蠕动泵转速、进料压力调节阀和回流排放阀来调节料液进口压力和回流排放压力。对比研究了不同跨膜压力(通过设置不同的料液进口压力和回流排放压力的组合来获得不同的跨膜压力，见表1)和进料口温度(25℃、35℃和45℃)对超滤膜通量变化的影响。结果表明，当跨膜压力维持在0.5bar-0.7bar范围内，超滤通量保持在25-40L/m²h，且膜通量下降程度缓慢，因此在控制膜污染的条件下，以0.7bar作为跨膜压力可以最大程度地提高超滤通量、减少超滤时间(图1)；当改变进料口温度时发现较高的温度(35℃和45℃)会使超滤膜通量下降较快，因此，一般超滤过程在室温下操作即可(图2)。随着切向流超滤的进行，由于超滤的浓缩模式效应，料液浓度逐渐增加，超滤膜通量会逐渐下降，当超滤透过液流量减少至起始时的一半以下时，更换膜组件并清洗系统。清洗方法：先用40-50℃的温水清洗微滤膜8-12分钟，再用0.05-0.12mol/L的NaOH溶液清洗微滤膜8-12分钟，最后用纯水冲洗8-12分钟以确保除去残留的NaOH和降解的杂质。经24小时切向流超滤后，得4.5L浓缩的超滤透过液。将上述超滤浓缩液经-55℃真空冷冻干燥，得螺旋藻胞外多糖35.5g。

表1  在切向流超滤中采用的不同压力组合及其相应的跨膜压力(bar)

实施例2：雨生红球藻胞外多糖的分离和制备

1、澄清预滤：1)培养液沉降处理。将培养8天的雨生红球藻培养液450L自然沉降12小时，上层即为澄清脱藻培养液；(2)预过滤。将上述脱藻培养液依次经过两层纱布、200目网布和500目网布进行预过滤。

2、径向流微滤除杂质。在环境温度下调节料液流速至1L/min，通过径向流微滤获得微滤透过液。

3、切向流超滤分离雨生红球藻胞外多糖。选择截留分子量为5000Da的超滤膜，调节料液进口压力为0.9bar、回流排放压力为0.5bar(即跨膜压力为0.7bar)，在室温下超滤24小时得5L浓缩的超滤透过液。将上述超滤浓缩液经-55℃真空冷冻干燥，得雨生红球藻胞外多糖14.9g。

实施例3：小球藻胞外多糖的分离和制备

1、澄清预滤：1)培养液沉降处理。取培养10天的小球藻培养液145L，加入100mg/L明矾，絮凝沉降12小时，上层即为澄清脱藻培养液；2)预过滤。将上述脱藻培养液依次经过两层纱布、200目网布和500目网布，进行预过滤。

2、径向流微滤除杂质。在环境温度下调节料液流速至1L/min，通过径向流微滤获得微滤透过液。

3、切向流超滤分离小球藻胞外多糖。选择截留分子量为5000Da的超滤膜，调节料液进口压力为0.9bar、回流排放压力为0.5bar(即跨膜压力为0.7bar)，在室温下超滤7.4小时得2L浓缩的超滤透过液。将上述超滤浓缩液经-55℃真空冷冻干燥，得小球藻胞外多糖0.5g。

实施例4：硅藻胞外多糖的分离和制备

1、澄清预滤：1)培养液沉降处理。取培养15天的硅藻培养液90L，加入100mg/L明矾絮凝沉降12小时，上层即为澄清脱藻培养液；2)预过滤。将上述脱藻培养液依次经过两层纱布、200目网布和500目网布进行预过滤。

2、径向流微滤除杂质。在环境温度下调节料液流速至1L/min，通过径向流微滤获得微滤透过液。

3、切向流超滤分离硅藻胞外多糖。选择截留分子量为5000Da的超滤膜，调节料液进口压力为0.9bar、回流排放压力为0.5bar(即跨膜压力为0.7bar)，在室温下超滤4.8小时得1L浓缩的超滤透过液。将上述超滤浓缩液经-55℃真空冷冻干燥，得硅藻胞外多糖16.9g。

实施例5念珠藻胞外多糖的分离和制备

1、澄清预滤：1)分离藻体与培养液。培养30天的葛仙米等念珠藻培养液20L，分别经过200目滤布过滤，分离藻体与培养液。2)预过滤。将上述脱藻培养液再依次用两层和四层200目滤布进行过滤以进一步去除残留藻体。

2、径向流微滤除杂质。在室温下调节进料液流速为1L/min，将上述滤液通过径向流微滤获得透过液。

3、切向流超滤浓缩透过液。选择截留分子量为5000Da的超滤膜，调节料液进口压力为0.7bar、回流液出口压力为0.3bar(即跨膜压力为0.5bar)，进料液流速为1L/min，在室温下将上述透过液超滤0.5小时得大约1L胞外聚合物浓缩液。将所得的胞外物浓缩液经-55℃真空冷冻干燥，得念珠藻胞外聚合物0.45g。(n＝3，取平均值，RSD＜0.1)。较高的跨膜压力可减缓膜通量下降的速度和程度，故应在操作条件许可的情况下尽可能提高跨膜压力。

Claims (1)

1.一种微藻胞外多糖的膜分离方法，其特征在于对微藻培养液进行包括有下述步骤和条件的分离：

步骤1、根据薇藻的类型对其微藻培养液进行澄清预处理；其中：1)对螺旋藻、念珠藻的丝状藻类的微藻培养液，先自然沉降10～24小时以使其澄清，再依次用纱布、150～200目网布、350～500目网布对其澄清后的微藻培养液进行过滤；2)对硅藻、小球藻的单细胞藻类的微藻培养液，先按50～150mg/L的量加入明矾以使其进行絮凝沉降，至上层培养液澄清后，再依次用纱布、150～200目网布、350～500目网布对其澄清后的微藻培养液进行过滤；

步骤2、控制径向流速≥1.0L/min，对经步骤1澄清预处理后的微藻培养液进行径向流微滤，以除去微藻培养液中的杂质；

步骤3、选择截留分子量为3000～10000Da的超滤膜，控制跨膜压力≥0.5bar、温度20℃～35℃，对经步骤2微滤后的微藻培养液进行切向流超滤，以分离出微藻培养液中的微藻胞外多糖；

所述的微藻胞外多糖为螺旋藻、硅藻、小球藻、念珠藻在培养过程中向培养液中分泌的多糖。