CN1302013C - 一种活性小球藻多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种活性小球藻多糖的制备方法,属于海洋生物技术。将脱脂后蛋白核小球藻粉用20倍的纯水混匀,用超声波细胞破碎仪于1000W破碎800S,再于100℃的沸水中水浴4小时,离心沉淀,去除藻体,再加入三氯乙酸(TCA)至终浓度3%以去除蛋白,离心沉淀后小球藻溶液用NaOH调PH至6.0-6.5;用0.1μm的微滤膜过滤,去除浓缩液,将清液再用3DK的超滤膜过滤,收集浓缩液,用80%的乙醇沉淀,将沉淀溶解后冷冻干燥得纯度为60.03%的小球藻多糖,得率4.76%。获得的提取物具有强的免疫调节活性,可用于药品和保健食品的基料,具有增强机体免疫力、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等功能。
Description
一、技术领域
本发明一种活性小球藻多糖的制备方法,属于海洋生物技术,用于研制开发医药保健品和功能食品的基料。
二、背景技术
海洋生物资源丰富、种类繁多、数量庞大,呈现原始性和多样性特点。海洋生物活性物质结构新颖、功能独特是新药研究开发和现代医药保健品开发的当今世界科学研究的活跃领域,美国国立肿瘤研究所每年筛选3万个新的抗癌化合物,有5%来自海洋生物。迄今海洋生物中已发现3000余种新型活性物质,其中包括生物碱类、萜类、大环聚酯类、肽类、聚醚类、及多糖类等化合物。美国、加拿大和日本均制定了开发利用海洋生物研究计划,广泛开展了对海洋生物活性物质的筛选。近30年类,海洋天然产物化学的研究取得了令人注目的成果,从种类丰富的海洋生物中分离出许多结构新颖、功能独特,具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤和抗突变、抗心血管病的生物活性物质。
对海洋生物活性物质的研究,已展现出诱人的前景,尤其在抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎,以及作用于神经系统和心血管系统等方面。当前医药保健品发展趋势,将由陆地转向海洋,从海洋生物资源中开发研究医药保健品和功能食品潜力巨大。海洋生物抗肿瘤研究院(National Cancer Institute)从世界不同海域采集的各种海洋生物进行了筛选,发现海藻、苔藓虫、海兔、海绵、海鞘中某些活性成分可望研究成新颖的海洋药物和海洋食品。但海洋生物中活性物质一般都以微量形式存在,从而限制了其获取和生产,因之其获取和生产的可能性一直是未来实际应用的难点。海洋生物资源具有广阔的综合利用前景,从海洋生物体内获取有功效的初生代谢产物与次生代谢产物,可发展海洋天然药物,也可开发海洋生物保健品、海洋功能食品。利用海洋生物活性物质新颖的结构作为先导物,可设计合成治疗疑难病的创新药物。
海藻多糖是从海藻中提取的大分子糖类,目前研究最多的品种有褐藻胶、琼胶、卡拉胶等,它们在食品、医药、生物工程等领域得到了广泛应用,如用于固定化细胞及固定化酶载体的褐藻胶和琼胶。已开发出动物细胞培养的贴壁素、伤口粘合剂等产品。
海洋生物活性物质研究过程中,分离提取是最关键的步骤之一。海洋生物种类繁多,但生物活性物质含量低微,经典的沉淀、结晶、吸附、萃取、离子交换技术等提取技术对于海洋活性物质的提取和纯化存在较大的困难和局限性。海洋生物活性物质的提取大都采用有机溶剂萃取的方法,存在着溶剂回收困难,工序繁琐,对环境污染严重等缺点。现代分离技术如膜分离技术、超临界流体萃取技术在海洋活性物质的提取、分离和纯化中有重要的应用前景。超临界流体技术是利用超临界流体在超过气液共存状态时的温度、压力时,来溶解某种固体、液体或它们中的某些组分,并且利用这种能力从原料中提取有用成分或脱除有害的成分,从而达到分离提纯的目的。超临界流体技术能够从天然物质中选择性地提取、分离和纯化所需组分,CO2不与生理活性物质发生化学反应,无毒,无污染,易于从产品中清除,并且可以循环使用。膜分离技术在分离过程中不涉及相变、无二次污染,又由于分离中具有生物膜浓缩富集的功能,同时它操作方便、结构紧凑、维修费用低,易于自动化,因而它是现代分离技术中一种效率较高的分离手段,可以取代传统的过滤、吸附、冷凝、重结晶、蒸馏和萃取的等分离技术,所以膜分离技术在分离过程中具有重要作用。海洋生物中存在大量具有独特生理活性的天然产如藻胆蛋白、EPA和多糖等,亟待开发利用,超临界CO2萃取技术及膜分离技术对于分离提纯此类天然活性物质又具有比传统提取方法独到的特点,避免海洋生物活性成分在整个提取过程中采用有毒的有机溶剂介入,从而保证其具有绿色产品的特色。该技术的运用最大限度保留了产品的原型风味、避免有效成份在提取过程中破坏或损失,能较大的保持产品的纯天然性。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种提取高纯度及高活性小球藻多糖的制备方法。该方法简便,成本低廉,易得,小球藻多糖无毒、安全和高活性。所提取的小球藻多糖得率、纯度较高,具有较高的免疫调节作用的功能。
技术方案
1、海藻多糖的制备方法,其特征在于:
(1)称取100克脱脂后的蛋白核小球藻粉,加入2L纯水混匀,用超声波细胞破碎仪于1000W破碎800S,再于100℃的沸水中水浴4小时,离心沉淀,去除藻体,再加入三氯乙酸(TCA)至质量比终浓度为3%以去除蛋白,离心沉淀后小球藻溶液用NaOH调PH至6.0-6.5;
(2)小球藻溶液在进口压力0Psi,温度40℃条件下用0.1μm的微滤膜过滤,去除浓缩液,将上清液再用3KD的超滤膜过滤,温度25-40℃,进口压15Psi,回流压11Psi,收集浓缩液。
(3)将浓缩液中加入乙醇溶液,至浓缩液与乙醇的体积比终浓度为1∶4进行沉淀,将沉淀物用40℃纯水溶解后冷冻干燥即获得小球藻多糖。
有益效果
本发明采用超声波破壁、热水浸提及膜分离技术相结合,提取的得率可达到4.76%以上,纯度可达到60%以上。所提取的小球藻多糖经动物实验验证,具有较高的免疫调节作用的功能。本发明方法简便,成本低廉,易得,小球藻多糖无毒、安全和高活性。所得小球藻多糖进一步纯化后可分为分子量差异较大的两个组分,经高效液相色谱(HPLC)测得其分子量分别为81877Da和1749Da左右。对两个组分进行了简单的结构和组分鉴定,GC显示组分1的主要单糖为甘露糖(relative mass 78.0%)和葡萄糖(13.2%),组分2的主要单糖为甘露糖(76.5%)和葡萄糖(10.5%)以及一种不知名的单糖(8.4%)。
用所提取的粗多糖动物免疫实验,进行非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能评价,其中中、高剂量组在细胞免疫和体液免疫的试验中都表现出了显著增高的结果,证实了小球藻多糖具有免疫调节功效。
四、附图说明
图1小球藻多糖对小鼠迟发性变态反应的影响(耳肿胀法)
五、发明的具体实施方式
实施例1
(1)称取100克脱脂后的蛋白核小球藻粉,加入2L纯水混匀,用超声波细胞破碎仪在1000W的功率下破碎800S。
(2)将破壁后的小球藻溶液在100℃的沸水中水浴4小时,以3000转/min的速度离心10分钟,去除沉淀;再加入三氯乙酸(TCA)至质量比终浓度为3%,静置片刻,以4000转/min的速度离心10分钟,去除沉淀;再用NaOH调PH至6.1。
(3)将提取液用0.1μm的微滤膜过滤(进口压0Psi,温度40℃),去除浓缩液。再将清液再用3KD的超滤膜过滤(温度25℃,进口压15Psi,回流压11Psi),收集浓缩液。
(4)将浓缩液中加入乙醇溶液,至浓缩液与乙醇的体积比终浓度为1∶4进行沉淀,将沉淀物用40℃纯水溶解后冷冻干燥即获得多糖含量为60.03%的小球藻多糖,得率4.76%。
实施例2
(1)称取100克脱脂后的蛋白核小球藻粉,加入2L纯水混匀,用超声波细胞破碎仪在1000W的功率下破碎800S。
(2)将破壁后的小球藻溶液在100℃的沸水中水浴4小时,以3000转/min的速度离心10分钟,去除沉淀;再加入三氯乙酸(TCA)至质量比终浓度为3%,静置片刻,以4000转/min的速度离心10分钟,去除沉淀;再用NaOH调PH至6.4。
(3)将提取液用0.1μm的微滤膜过滤(进口压力0Psi,温度40℃),去除浓缩液,再将清液再用30KD的超滤膜过滤(温度35℃,进口压15Psi,回流压11Psi),收集浓缩液1;再将过30KD的超滤膜的清液用1KD的超滤膜过滤(温度35℃,进口压15Psi,回流压11Psi),收集浓缩液2。
(4)将浓缩液1冷冻干燥得多糖组分1(得率5.74%,多糖含量为23.59%);将浓缩液2冷冻干燥得多糖组分2(得率3.91%,多糖含量为5.63%)。
所得小球藻多糖进一步纯化后可分为分子量差异较大的两个组分,经高效液相色谱HPLC测得其分子量分别为81877Da和1749Da左右。对两个组分进行了简单的结构和组分鉴定,GC显示组分1的主要单糖为甘露糖(relative mass 78.0%)和葡萄糖(13.2%),组分2的主要单糖为甘露糖(76.5%)和葡萄糖(10.5%)以及一种不知名的单糖(8.4%)。用所提取的粗多糖做动物免疫实验,进行非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能评价,其中低剂量组的小球藻多糖在非特异性免疫和体液免疫的试验中都表现出了显著增高的结果,而中、高剂量组在非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫的试验中均表现出了显著增高的结果,充分地说明了小球藻粗多糖具有较强的免疫调节功效。
小球藻多糖的非特异性免疫功能
表1可见,正常对照组的小鼠在30天的生长期中,体重均值由原来的19.64克显著升高到了41.96克,低、中、高三个剂量的试验组中试验小鼠体重的增加趋势都与阴性对照组没有显著差异。阴性对照组的小鼠的脾指数均值和胸腺指数均值分别为0.41mg/10g体重和0.16mg/10g体重,三个试验组无论脾指数均值还是胸腺指数均值都与正常对照组没有显著差异。小球藻多糖对小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响从表2的数据结果可以见到,阴性对照组的巨噬细胞的吞噬率均值为15.25%,低、中、高三个剂量组对应的巨噬细胞吞噬率均值分别为16.95%、23.00%和26.25%,可见吞噬率随着样品剂量的增加呈现出了不断升高的趋势,且中、高剂量组的增强效果经统计分析有显著性差异;阴性对照组的巨噬细胞的吞噬指数均值为0.2035,三个剂量组对应的巨噬细胞吞噬指数均值分别为0.2185、0.2970和0.3630,可见吞噬指数随着样品剂量的增加呈现出了不断升高的趋势,同样的,其中、高剂量组的增强效果经SAS统计分析有显著性差异。表1小球藻多糖对小鼠免疫脏器重量的影响
组别 | 初始体重(g) | 30天体重(g) | 脾指数(mg/10g体重) | 胸腺指数(mg/10g体重) |
阴性对照组低剂量小球藻多糖组中剂量小球藻多糖组高剂量小球藻多糖组 | 19.64±1.13a19.58±1.15a19.97±0.78a19.84±1.34a | 41.96±1.17a42.35±0.78a42.52±0.83a41.98±0.96a | 0.41±0.05a0.42±0.03a0.41±0.04a0.42±0.04a | 0.16±0.02a0.17±0.03a0.16±0.03a0.17±0.03a |
表2小球藻多糖的非特异性免疫效果(吞噬率和吞噬指数)
组别 | 初始体重(g) | 30天体重(g) | 吞噬率(%) | 吞噬指数 |
阴性对照组低剂量小球藻多糖组中剂量小球藻多糖组高剂量小球藻多糖组 | 19.57±1.01a19.81±0.88a19.71±1.20a19.77±1.18a | 42.12±1.10a42.41±0.79a42.33±1.06a42.35±1.09a | 15.25±1.99c16.95±2.74c23.00±3.23b26.25±3.13a | 0.20±0.02c0.22±0.03c0.30±0.02b0.36±0.04a |
小球藻多糖的细胞免疫功能
图1可知,随着试验剂量的增加,低、中、高三个剂量组的小鼠耳肿胀率出现了不断增加的趋势,其中中、高剂量组的迟发性超敏反应与阴性对照组相比显著增强。
小球藻多糖的体液免疫功能评价
低、中、高三个剂量组的小球藻粗多糖对抗体积数的增加均有显著地促进作用(表3),与阴性对照组10.3的抗体积数相均值比,对应的抗体积数均值分别增加到了22.10、32.10和50.10。
表3小球藻多糖的对小鼠抗体数的影响
组别 | 初始体重(g) | 30天体重(g) | 抗体积数 |
阴性对照组低剂量小球藻多糖组中剂量小球藻多糖组高剂量小球藻多糖组 | 19.51±1.32a19.85±1.02a19.42±0.82a19.64±1.09a | 42.18±1.00a42.09±0.92a42.41±0.74a42.47±0.58a | 10.30±2.00d22.10±5.95c32.20±6.09b50.10±12.64a |
非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫是评价受试物免疫调节功能的三项主要指标,其中如果有两个以上(含两个)功能检测结果为阳性,即可判定该受试物具有免疫调节效果。在本试验中,低剂量组的小球藻粗多糖只在非特异性免疫和体液免疫的试验中都表现出了显著增高的结果,而中、高剂量组在非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫的试验中均表现出了显著增高的结果,充分地说明了小球藻粗多糖具有较强的免疫调节功效。
Claims (1)
1、一种活性小球藻多糖的制备方法,其特征在于:
(1)称取100克脱脂后的蛋白核小球藻粉,加入2L纯水混匀,用超声波细胞破碎仪于1000W破碎800S,再于100℃的沸水中水浴4小时,离心沉淀,去除藻体,再加入三氯乙酸至质量比终浓度为3%以去除蛋白,离心沉淀后小球藻溶液用NaOH调PH至6.0-6.5;
(2)小球藻溶液在进口压力0Psi,温度40℃条件下用0.1μm的微滤膜过滤,去除浓缩液,将上清液再用3KD的超滤膜过滤,温度25-40℃,进口压15Psi,回流压11Psi,收集浓缩液;
(3)将浓缩液中加入乙醇溶液,至浓缩液与乙醇的体积比终浓度为1∶4进行沉淀,将沉淀物用40℃纯水溶解后冷冻干燥即获得小球藻多糖。
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