CN1137900C - 黄精多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明黄精多糖的提取方法；其特征在于：黄精多糖的提取方法是将黄精切成小块，加水，煮沸提取后，过滤，再离心，药渣再提取二次，将三次提取液合并，离心处理，得上清液减压浓缩，加入乙醇液，搅拌静置，分离取沉淀物，加去离子水洗涤，收集水洗液减压浓缩，加入乙醇沉淀，静置，分取沉淀物，乙醇洗涤三次，弃去醇洗液，沉淀，在真空干燥，取出、粉碎。
Description
本发明是属于一种提取黄精多糖的方法。
多糖具有多种生理功能，因而多糖药物近年来发展迅速。目前，从天然产物或发酵产物中分离制备多糖，国内外多采用物理、化学方法。一般将原药粉碎、脱脂后，用水、稀酸或碱提取，提取液浓缩后，先用三氯乙酸或氯仿-正丁醇法去除杂蛋白，然后透析去除小分子杂质，浓缩后冻干或用有机溶剂沉淀即获得多糖产物。多糖的精制多采用离子交换和凝胶过滤方法。上述多糖制备方法存在以下足：1、多糖中含有酚型化合物，因而具有较深的黄色、棕色。这些颜色用活性炭无法脱色，用氧化剂则容易使多糖降解；2、提取过程复杂时间长、成本高，规模化生产难度大；3、精制多糖时用离子交换介质多为纤维和葡聚糖凝胶衍生物，本身就是多糖，当受到微生物和某些化学因素作用时，糖制品容易受到介质降解产物的污染。总之，以上方法，不易获得高纯度的多糖。
本发明目的是开发以黄精生药为原料，提取工艺简单，又能得到高纯度黄精多糖的提取方法。
本发明是这样实现：
黄精多糖的提取方法是将生黄精生切成0.4～2cm3小块，加放入相当于生黄精重量4～16倍量水，煮沸提取1～4小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留，药渣另加入相当于生黄精重量8～12倍的水，煮沸提取1～2小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留，再将药渣加入相当于生黄精8～12倍的水，煮沸提取1～2小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留；将三次提取液合并，离心处理，将上清液减压-0.03～-0.06mm汞柱、温度为45～60℃下浓缩至相对密度1.08～1.25，放置至室温，加入相当于生黄精重量4～8倍的95％(体积/体积)的乙醇液，搅拌静置12～48小时，分离取沉淀物，加相当于生黄精重量0.5～2倍的去离子水洗涤，收集水洗液减压至-0.03～-0.06mm汞柱、温度为45～60℃下浓缩至相对密度1.10～1.35，加入相当于生黄精重量0.5～2倍量的95％(体积/体积)乙醇沉淀，静置12～48小时，分取沉淀物；以相当于生黄精重量0.5～2倍量的95％(体积/体积)乙醇洗涤三次，弃去醇洗液，沉淀物在压力0.5～1.5mpa、温度为40～70℃下真空干燥，取出、粉碎。黄精多糖降脂作用，黄精多糖能降低血清CHO、LDL、LP(a)浓度，但
以LDL、LP(a)浓度降低更明显；黄精多糖降低主动脉内膜泡沫细胞形成。黄精多糖降糖作用，黄精多糖治疗后，能降低血糖及血清糖化血红蛋白的含量。
本发明黄精多糖的提取方法，提取方法简单，能降脂，能降低血糖及血清糖化血红蛋白的含量。
黄精多糖的提取方法是将生黄精生切成1cm3小块，加放入相当于生黄精重量8倍量水，煮沸提取2小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留，药渣另加入相当于生黄精重量12倍的水，煮沸提取1小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留，再将药渣加入相当于生黄精12倍的水，煮沸提取1小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留；将三次提取液合并，离心处理，将上清液减压-0.03mm汞柱、温度为60℃下浓缩至相对密度1.08，放置至室温，加入相当于生黄精重量8倍的95％(体积/体积)的乙醇液，搅拌静置48小时，分离取沉淀物，加相当于生黄精重量0.5倍的去离子水洗涤，收集水洗液减压至-0.06mm汞柱、温度为60℃下浓缩至相对密度1.10，加入相当于生黄精重量0.5倍量的95％(体积/体积)乙醇沉淀，静置24小时，分取沉淀物；以相当于生黄精重量1倍量的95％(体积/体积)乙醇洗涤三次，弃去醇洗液，沉淀物在压力0.5mpa、温度为50℃下真空干燥，取出、粉碎。
黄精多糖降脂作用
1、材料与方法
1.1实验动物 新西兰纯种兔30只，雌雄各半，5月龄，体重2.4±0.2kg，随机分5组：血脂康组、舒降之组、黄精1、2、3组，每组6只。
1.2每毫升含生药10g的黄精多糖，急性毒性试验黄精多糖小鼠灌胃给药的LD50为75ml·kg-1即相当于含生约750g·kg-1。提示治疗剂量无毒副作用。
1.3方法
1.3.1高脂血症动物模型的建立
用常规饲料加5％猪油和0.5％胆固醇喂养动物，10天后禁食10小时测定血脂浓度，待形成高血脂症实验模型后分别给于常规降脂药物及实验药物，并维持高脂饮食一个月至实验结束。
1.3.2给药方法 血脂康组：300mg·kg-1·d-1血脂康加入40ml饮水溶解，分二次于动物进食后喂服；舒降之组：5mg·kg-1·d-1舒降之加入20ml饮用水，于动物进食后一次喂服，黄精1、2、3组：分别将0.4ml、0.8ml、1.6ml·kg-1·d-1的黄精多糖溶于40ml饮用水，分二次于动物进食后喂服。所有实验动物给药时间均为一个月。
1.3.3血脂测定 实验前随机选择12只动物禁食10小时测定其血脂含量，给药一个月后禁食10小时检查全部实验动物血脂含量。测定方法为钟点法。
1.3.4主动脉形态及光镜观察，实验后处死全部动物，取其主动脉进行大体形态观察，并取其部分主动脉用10％甲醛固定后石腊包埋切片，HE染色和光镜观察。
1.4统计处理
实验数据以x±S表示，统计分析为配对t检验，多个均数之间两两比较用q检验，多个标本比较用x2检验。
2、结果
2.1高胆固醇饮食的动物血脂变化(表1)
表1高脂饮食后动物血脂变化
n TG(mmol/L) CHO(mmol/L) HDL(mmol/L) LDL(mmol.L) LP(a)(mg/L)高脂饮食前12 0.63±0.20 1.25±0.34 0.74±0.19 0.35±0.17 148.9±13.1高脂饮食后30 0.45±0.11 10.07±1.58* 0.89±0.11 9.62±1.55* 640.8±143.6* *P＜0.01
从表1可看出，经高胆固醇饮食喂养后，试验动物CHO、LDL、Lp(a)均显著升高，形成了明显的高脂血症。
2.2各组实验动物用药前后的血脂变化(表2)
表2各实验组治疗前后血脂变化
TG CHO HDL LDL LP(a)
n 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后血脂廉组6 0.34±0.81 0.29±0.09 11.08±1.95 8.20±5.31 0.92±0.17 1.02±0.29 10.04±2.04 7.05±5.06 712.9±100.6 32.4±12.3*舒降之组6 0.44±0.17 0.34±0.12 10.96±1.79 6.06±3.92Δ 0.88±0.09 0.92±0.24 9.754±1.54 4.98±3.87Δ700.1±180.6 43.3±14.3*黄精1组 6 0.46±0.06 0.50±0.14 9.91±0.99 12.13±6.31 0.83±0.09 0.76±0.18 8.84±1.07 11.14±6.22 573.8±151.1 50.8±9.9*黄精2组 6 0.49±0.03 0.44±0.25 0.38±1.16 6.76±3.81 0.91±0.11 1.13±0.36 9.30±1.10 5.52±3.76Δ 600.8±150.1 52.9±15.1*黄精3组 8 0.52±0.06 0.66±0.33 11.21±1.91 5.85±1.99* 0.92±0.10 1.22±0.51 10.07±1.89 3.35±1.64* 640.5±107.8 45.3±14.0*与治疗前比较，*P＜0.01，ΔP＜0.05。
从表2可看出，黄精多糖3组、舒降之组治疗后血清CHO、LDL、LP(a)浓度显著降低，但前者更为显著；黄精2组治疗后血清LDL、LP(a)浓度明显降低；黄精1组除LP(a)下降外，其余各指标均无明显变化。
1.3实验后各组动物血脂变化比较(表3)
表3 实验后各组动物血脂变化比较
n TG CHO HDL LDL LP(a)血脂康组6 0.29±0.09 8.20±5.31 1.02±0.29 7.05±5.06 32.4±12.3舒降之组6 0.34±0.12 6.06±3.92 0.92±0.24 4.98±3.87 43.3±14.3黄精1组 6 0.50±0.14 12.13±6.31 0.76±0.18 11.14±6.22 50.8±9.9黄精2组 6 0.44±0.25 6.76±3.81 1.13±0.36 5.52±3.76 52.9±15.1黄精3组 6 0.66±0.33 5.85±1.99 1.22±0.51 4.35±1.64 45.3±14.0
P均＞0.05
表3表示实验末各治疗组之间血脂浓度的变化无显著差异。
2.4主动脉粥样硬化情况
2.4.1大体形态观察，血脂康组有1例样本主动脉内膜可见少量脂质条纹形成，其余实验动物均未见明显的脂质条纹或粥样斑块形成。
2.4.2光镜观察实验动物主动脉内膜见不同程的泡沫细胞形成。
其结果见表4
表4主动脉内膜泡沫细胞形成情况
检验样本数分组 合计 发生率
有泡沫细胞形成 无泡沫细胞形成血脂康组 6 0 6 100％舒降之组 3 3 6 50％黄精1组 2 4 6 33.3％黄精2组 2 4 6 33.3％黄精3组 1 5 6 16.7％**与其它各组比较，P＜0.05
从表4可看出，黄精多糖3组主动脉内膜泡沫细胞形成显著少于血康组和舒降之组(P＜0.05)。
黄精多糖降糖作用
1、材料与方法
1.1实验动物 用BALB/C小鼠24只，雌雄各半，2月龄，体重23±2g，随机分4组：美吡达组、糖脉康组、黄精多糖1、2组，每组6只。
1.2药物来源每毫升含生药10g的黄精多糖，急性毒性试验黄精多糖小鼠灌胃给药的LD50为75ml·kg-1即相当于含生药750g·kg-1提示治疗剂量无毒副作用。
1.3方法
1.3.1糖尿病动物模型的建立
小鼠腹腔注射链脲佐菌素40mg·kg-1·d-1连续5天。10天后禁食6小时剪尾测定其血糖含量，待形成糖尿病模型后给予对照及实验药物。
1.3.2给药方法
美吡达组：8mg·kg-1·d-1美吡达加入生理盐水0.5ml溶解，每日一次灌胃给予；糖脉康组：12.5g·kg-1·d-1糖脉康加入1ml生理盐水溶解，分二次灌胃给予；黄精多糖1、2组，分别将1ml、4ml·kg-1·d-1(相当于生药10g、40g·kg-1·d-1)的黄精多糖溶入生理盐水1ml，分二次灌胃给予。所有实验动物给药时间为6周。
1.3.3检测方法 实验前每组随机选择3只动物禁食6小时后剪尾测定其血糖含量，注射链脲佐菌素后同上法检测实验动物血糖含量，实验末(给药6周后)禁食6小时取眶动脉血测定血糖及糖化血红蛋白(HbA1C)含量。检测方法分别为葡萄糖氧化酶法和柱层析法。
1.4统计处理
实验数据以x±S表示，统计分析为配对t检验和多个均数之间两两比较q检验。
2、结果
2.1实验动物注射链脲佐菌素后血糖变化(表1)
表1实验性糖尿病动物血糖变化
n FBS(mmol/L) P值注射前 12 5.55±0.61
0.000注射后 24 8.85±0.99
从表1可看出，实验小鼠注射链脲佐菌素后空腹血糖(FBS)显著升高，形成了典型的实验糖尿病模型。
2.2各组实验动物治疗前后血糖变化(表2)
表2各实验组用药后血糖变化
FBS(mmol/L) P值
n 疗前 治疗后美吡达组 6 8.93±0.69 6.33±1.04 0.001糖脉康组 6 8.25±0.45 7.73±2.34 0.607黄精1组 6 9.75±0.72 6.43±1.22 0.000黄精2组 6 8.95±0.65 7.50±0.59 0.002
从表2可看出，经黄精多糖及美吡达治疗后，FBS降低具有非常显著性差异(P＜0.01)，糖脉康治疗后FBS下降无显著差异(P＞0.05)。
3.3实验后各组动物FBS及HbA1C含量的变化(表3)
表3实验后各组FBS、HbA1c含量变化
n FBS(mmol/L) HbA1c(％)美吡达组 6 6.33±1.04* 3.12±0.42糖脉康组 6 7.73±2.34* 3.35±0.2黄精1组 6 6.43±1.22* 2.45±0.36Δ黄精2组 6 7.50±0.59* 2.06±0.22Δ*各组间比较，P＞0.05；Δ与美吡达组及糖脉康组比较，P＜0.01
从表3可看出，各治疗组的降糖效果比较无显著性差异(P＞0.05)；但黄精多糖1、2组降低HbA1C作用与美吡达组及糖脉康组比较有非常显著性差异(P＜0.01)。
Claims (1)
1、黄精多糖的提取方法，其特征在于：黄精多糖的提取方法是将生黄精生切成0.4～2cm3小块，加入相当于生黄精重量4～16倍量水，煮沸提取1～4小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留，药渣另加入相当于生黄精重量8～12倍的水，煮沸提取1～2小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留，再将药渣加入相当于生黄精重量8～12倍的水，煮沸提取1～2小时，温度为100℃，提取液过200目尼龙筛网，然后离心，提取液保留；将三次提取液合并，离心处理，将上清液减压-0.03～-0.06mm汞柱、温度为45～60℃下浓缩至相对密度1.08～1.25，放置至室温，加入相当于生黄精重量4～8倍的95％(体积/体积)的乙醇液，搅拌静置12～48小时，分离取沉淀物，加相当于生黄精重量0.5～2倍的去离子水洗涤，收集水洗液减压至-0.03～-0.06mm汞柱、温度为45～60℃下浓缩至相对密度1.10～1.35，加入相当于生黄精重量0.5～2倍量的95％(体积/体积)乙醇沉淀，静置12～48小时，分取沉淀物；以相当于生黄精重量0.5～2倍量的95％(体积/体积)乙醇洗涤三次，弃去醇洗液，沉淀物在压力0.5～1.5mpa、温度为40～70℃下真空干燥，取出、粉碎。
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