CN111019010A - Nigella sativa种籽多糖、提取方法和制备治疗2型糖尿病药物的应用 - Google Patents
Nigella sativa种籽多糖、提取方法和制备治疗2型糖尿病药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法,具体为:Nigella sativa种籽用水煎煮,过滤,滤液加无水乙醇至终浓度为70±5 V%,静置,收集沉淀,水溶后Sevage法除蛋白,取上清液加无水乙醇至终浓度为70±5 V%,静置,沉淀经洗涤、冻干即为Nigella sativa种籽多糖。本发明经实验发现:Nigella sativa种籽多糖可以显著降低小鼠的FBG、糖化血清蛋白GSP、甘油三酯TG、总胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL‑C、TNF‑α、IL‑6和IL‑1β水平,显著增加胰岛素INS)、高密度脂蛋白胆固醇HDL‑C和总抗氧化能力T‑AOC表达水平。肠道菌群组成分析显示,f_Muribaculaceae_Unclassified菌属和Bacteroides菌属在模型组丰度显著降低,而Nigella sativa种籽多糖显著增加了其丰度,说明其可以通过调节肠道微生物群改善糖尿病小鼠的异常状态,是治疗2型糖尿病的理想药物。
Description
技术领域
本发明属于多糖药物技术领域,具体涉及一种Nigella sativa种籽多糖、提取方法及其在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。
背景技术
2型糖尿病(T2DM)是一种复杂的慢性代谢紊乱性疾病,主要是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏引起的胰腺β-cell功能障碍;其特点是糖、脂类和蛋白质代谢紊乱,同时胰岛素抵抗伴有低度慢性炎症的产生。T2DM可引起多种脏器损伤,从而产生多种并发症。例如:糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病神经病变及心脑血管病变等,已成为全球主要的健康问题。
2型糖尿病的日益流行已成为21世纪全球公共卫生关注的问题,环境因素和遗传因素等导致了糖尿病的流行加速。目前,饮食和运动与药物治疗相结合是治疗糖尿病的常用策略,临床上T2DM的药物治疗主要是口服降糖药和胰岛素注射。然而,低血糖是这些药物的常见副作用,长期注射胰岛素也可增强胰岛素抵抗,因此对2型糖尿病的控制刻不容缓。
肠道菌群及其代谢产物与宿主处于相对稳定的生态平衡,对维持人体健康和预防疾病发挥着重要作用。肠道菌群的组成或其功能的异常可能导致机体能量失衡和代谢紊乱,包括对脂肪组织、肌肉和肝脏代谢的影响。近年来,对肠道菌群研究的热度日益上升,越来越多的研究人员希望通过调节肠道菌群平衡来预防和治疗疾病。
Nigella sativa为毛莨科Nigella属一年生草本植物,原产于西南亚,其种籽油作为食用油在中东和北非国家被广泛使用,同时,也用于保健食品对抗疾病,在食品中应用广泛。Nigella sativa种籽提取物及其种籽油具有抗菌、抗氧化、增强免疫等作用。多糖是Nigella sativa种籽中重要的活性物质之一。中国专利申请CN201811415332.0公开了一种测定黑种草Nigella sativa籽油中亚油酸含量的方法,主要用于批量Nigella sativa籽油中亚油酸的含量测定,简单高效。目前,尚无Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠治疗的相关报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷,提供一种可用于治疗2型糖尿病的Nigella sativa种籽多糖,其治疗效果显著,且无毒副作用,不会引起耐药性。
本发明还提供了上述Nigella sativa种籽多糖的提取方法及其在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法,其具体为:将Nigella sativa种籽用水煎煮,过滤,滤液加无水乙醇至终浓度为70±5V %,静置,收集沉淀,水溶后Sevage法除蛋白,取上清液加无水乙醇至终浓度为70±5V %,静置,沉淀经洗涤、冻干即为Nigella sativa种籽多糖。
进一步优选的,可以将Nigella sativa种籽用水煎煮2-4次,煎煮水温80-85℃,合并滤液,减压浓缩,浓缩液加无水乙醇至终浓度为70V %,冰箱中静置过夜,离心分离,收集沉淀。
进一步优选的,取上清液加无水乙醇至终浓度为70V %,冰箱中静置过夜,沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗,冻干即为Nigella sativa种籽多糖。
上述Nigella sativa种籽多糖的提取方法,进一步优选,将Nigella sativa种籽用水煎煮3次,第一次煎煮2 h,第二次煎煮1 h,第三次煎煮0.5 h。
本发明提供了采用上述提取方法提取得到的Nigella sativa种籽多糖。
本发明还提供了上述Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。进一步的,Nigella sativa种籽多糖具体用量可以是140 mg/kg、70 mg/kg等。
和现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明从Nigella sativa种籽中提取获得Nigella sativa种籽多糖,并通过测定Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠各项生化指标,考察其调节肠道菌群,治疗2型糖尿病的效果,实验结果证明:Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠疗效显著,且无毒副作用。
附图说明
图1为alpha diversity分析绘制的rank-abundance曲线(A)和rarefactioncurve曲线(B);
图2为Top30的优势菌群在属水平上的相对丰度。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍,但本发明的保护范围并不局限于此。
本发明中,如无特殊说明,乙醇均指体积浓度。
实施例1
一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法,具体为:取Nigella sativa种籽3.7 kg,加水至淹没Nigella sativa种籽,用水煎煮三次(煎煮水温80-85℃,第一次煎煮2 h,第二次煎煮1 h,第三次煎煮0.5 h)。合并滤液,减压浓缩,浓缩液加无水乙醇至乙醇终浓度为75%,冰箱中静置过夜(12 h),离心分离,收集沉淀,沉淀用水溶后采用Sevage法除蛋白(选用体积比为4∶1的氯仿—正丁醇混合液,采用本领域常规技术即可)。取上清液加无水乙醇至终浓度为70 %,冰箱中静置过夜(12 h),沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗,冷冻干燥(- 50 ± 5℃,12 h)即为Nigella sativa种籽多糖,约37 g。
小鼠2型糖尿病应用实验
1)试验动物
SPF级的昆明雄性小鼠,体重18-22 g,动物购买于河南省实验动物中心。许可证号:SCXK(豫)2017-0001。
2)实验试剂
链脲佐菌素(STZ):Sigma-Aldrich公司(批号:S0130)。高脂饲料:北京博爱港生物技术有限公司。达乐自动码血糖仪:韩国I-SENS, INS.。糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和总抗氧化能力(T-AOC)由南京建成生物工程研究所提供,胰岛素(INS)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)由上海华蓝化学科技有限公司提供。
3)实验方法:小鼠2型糖尿病模型的建立
60只SPF级的昆明雄性小鼠适应性饲养一周(温度25 ± 2 ℃,光照12 h/d,湿度40-45%),喂养标准饲料,自由饮水。一周后,除正常空白对照(BC)组 (n = 10)喂养标准饲料外,其他小鼠均喂养高脂饲料。喂养4周后,高脂小鼠腹腔注射剂量为100 mg/kg的STZ溶液,两周后筛选空腹血糖值>16.7 mmol/L的糖尿病小鼠。
4)实验方法:Nigella sativa种籽多糖的给药治疗
将糖尿病小鼠随机分为5组(n = 10):模型对照(MC)组、阳性对照(PC)组、Nigella sativa种籽多糖高剂量(HD)组、Nigella sativa种籽多糖中剂量(MD)组、Nigella sativa种籽多糖低剂量(LD)组。空白对照组和模型对照组按0.1 mL/10 g灌胃生理盐水,阳性对照组灌胃二甲双胍(350 mg/kg,0.1 mL/10 g),Nigella sativa种籽多糖高、中、低剂量组分别以140 mg/kg、70 mg/kg和35 mg/kg,0.1 mL/10 g灌胃给药。
灌胃给药4周,禁食不禁水12-14 h,摘眼球取血,于4 ℃,3500 rpm/min离心10min取血清,检测小鼠INS、GSP、TG、TC、LDL-C、HDL-C、IL-6、IL-1β、TNF-α和T-AOC水平。
5)粪便DNA提取和高通量测序
每组取3只小鼠的盲肠内容汇集物约0.2 g,使用TIANamp Stool DNA试剂盒进行总基因组DNA的提取,扩增16S rRNA的V3和V4高变区。另外,通过PCR向16S rRNA的PCR产物末端加上带有Index的接头,以便进行下一代测序(NGS)。通过酶标仪检测DNA文库浓度,将文库定量到10 nM,在Illumina MiSeq平台上进行双端测序。本次研究16S rRNA扩增测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
双端测序得到的正反向reads首先进行两两拼接,过滤拼接结果中含有N 的序列,保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤,去除嵌合体序列,最终得到的序列用于OTU聚类,使用Vsearch (1.9.6) 进行序列聚类(序列相似性设为97%),参考数据Silva 132进行序列比对比分析。对OTU的代表性序列进行物种分类学分析,并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果,采用对样本序列进行随机抽平的方法,作Rarefaction曲线和 Rank-Abundance曲线图反映物种丰富度和均匀度,用于alphadiversity分析。
6)数据处理:结果采用均值 ± SD值表示,数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较其显著性差异。
7)试验结果:
表1:Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响
由表1可知,链脲佐菌素STZ造模后,通过对小鼠空腹血糖水平的测定,与空白对照组相比,模型对照组和各给药组小鼠的初始血糖水平明显高于空白对照组,说明造模成功(P<0.001)。与模型组相比,在给药第20天后,血糖水平开始缓慢下降,其中HD组血糖水平下降最为显著(P<0.001)。
表2:Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠TC、LDL-C、TG和GSP水平的影响
由表2可知,与空白对照BC组相比,模型对照MC组小鼠血清中TG、TC、LDL-C和GSP水平均极显著升高(P<0.001)。给药治疗后,与模型对照MC组相比,HD组TG水平极显著下降(P<0.001),PC组和LD组的TC、LDL-C水平并没有得到改善(P>0.05),而HD组和MD组显著降低了TC、LDL-C和GSP的水平。
表3:Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠HDL-C、INS、T-AOC水平的影响
由表3可知,与空白对照BC组相比,模型对照MC组小鼠血清中HDL-C、INS、T-AOC水平均极显著降低(P<0.001)。给药治疗后,与模型对照MC组相比,PC组和HD组HDL-C、INS、T-AOC水平均显著升高。
表4:Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠骨骼肌IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达水平的影响
由表4可知,通过对细胞因子的测定,与空白对照BC组相比,模型对照MC组小鼠血清中IL-6和TNF-α水平极显著升高(P<0.001),IL-1β水平显著升高(P<0.01)。给药治疗后,与模型对照MC组相比,PC组和HD组的IL-6和TNF-α水平均显著降低(P<0.01),IL-1β水平有所降低(P<0.05)。
Rank-Abundance曲线可反映物种丰度和物种均匀度,物种丰度由曲线在横轴上的长度来反映,曲线在横轴上的范围越大,物种的丰度越高;物种均匀度由曲线的平滑度来反映,曲线越平坦,表示物种的均匀度越高。由图1A可知,物种的丰度较高,曲线光滑样品之间均匀度较高。rarefaction curve曲线用于判断样本量是否充分以及估计物种丰富度,如图1B所示,物种的积累曲线趋于平缓,表示随着抽取的数据量的加大,检测到的OTU数目不再增加,表明测序数据量合理,可进行下一步分析。
为更进一步了解肠道菌群的变化,从每组中选择出优势菌种并在属水平上进行分析。如图2所示,我们对比分析了5个相对丰度较高的菌属,且这5种优势菌属来源于丰度较高的厚壁菌门和拟杆菌门。发现经Nigella sativa种籽多糖治疗后,HD组的拟杆菌门丰度明显高于MC组,且拟杆菌门中f_Muribaculaceae_Unclassified菌属和Bacteroides菌属的丰度也明显高于MC组,与研究报道的结果一致,揭示高剂量的Nigella sativa种籽多糖可能通过增加拟杆菌的丰度来调节机体代谢异常,有助于缓解T2DM。
Nigella sativa种籽多糖NSSP高剂量组能显著降低小鼠的FBG、GSP、TG、TC、LDL-C、TNF-α、IL-6和IL-1β水平,显著增加INS、HDL-C和T-AOC的表达水平。肠道菌群组成分析显示,f_Muribaculaceae_Unclassified菌属和Bacteroides菌属在模型组丰度显著降低,而NSSP高剂量组显著增加了其丰度,说明Nigella sativa种籽多糖NSSP可以通过调节肠道微生物群改善糖尿病小鼠的异常状态。
综上说明:本发明Nigella sativa种籽多糖可以通过调节肠道微生物来改善2型糖尿病状态,是治疗2型糖尿病的理想药物。
Claims (6)
1.一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法,其特征在于,Nigella sativa种籽用水煎煮,过滤,滤液加无水乙醇至终浓度为70±5V %,静置,收集沉淀,水溶后Sevage法除蛋白,取上清液加无水乙醇至终浓度为70±5V %,静置,沉淀经洗涤、冻干即为Nigella sativa种籽多糖。
2.根据权利要求1所述Nigella sativa种籽多糖的提取方法,其特征在于,将Nigella sativa种籽用水煎煮2-4次,煎煮水温80-85℃,合并滤液,减压浓缩,浓缩液加无水乙醇至终浓度为70V %,冰箱中静置过夜,离心分离,收集沉淀。
3.根据权利要求2所述Nigella sativa种籽多糖的提取方法,其特征在于,取上清液加无水乙醇至终浓度为70V %,冰箱中静置过夜,沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗,冻干即为Nigella sativa种籽多糖。
4.根据权利要求2或3所述Nigella sativa种籽多糖的提取方法,其特征在于,将Nigella sativa种籽用水煎煮3次,第一次煎煮2 h,第二次煎煮1 h,第三次煎煮0.5 h。
5.采用权利要求1至4任一项所述提取方法提取得到的Nigella sativa种籽多糖。
6.权利要求5所述Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。
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