CN1293101C - 银耳多糖，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物 - Google Patents
银耳多糖，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种银耳多糖，并提供了其制备方法，将银耳孢子、银耳子实体加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60%，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80%，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。同时提供了以活性银耳多糖组分为主要药物或与其它药物组方，可用于增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎。
Description
技术领域：
本发明公开一种银耳多糖，同时提供了其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，属于中药有效成分提取物应用技术领域。
背景技术：
本发明所称的银耳(Tremella fuciformis Berk)又称白木耳(简称TF)，从古自今我国民间作为具滋补保健作用的药食真菌佳品，银耳孢子(简称TFS)为固体培养获得。
在我国市场上已有销售银耳孢子制成的胶囊制剂，银耳保健品更是种类繁多，但均存在着一些不足。1、工艺不合理：银耳孢子原料药中含有大量的培养基和不溶物，原料药直接装入胶囊，未经过提取、分离、纯化，对多糖成分来说很难在胃肠道被吸收。银耳子实体的保健品多为水提物，产品不利于长期保存和运输。2、给药途径不合理，在胃肠道吸收速率极低。3、无规范化质量标准：由于原料药未经提取、分离，有效成分含量低，影响药品质量的控制。
发明内容：
本发明提供一种具有药用价值的银耳多糖。
本发明还提供了从银耳、银耳孢子中提取上述物质的制备方法，适用于工业化生产。
本发明进一步提供了以活性银耳多糖组分为主要药物或与其它药物组方用于增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药物。
银耳多糖是通过以下两种提取方法获得的：
方法1
将银耳孢子加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。
方法2
取银耳子实体去托盘洗净加水煎煮，过滤取滤液，反复3次，合并滤液，浓缩加乙醇沉淀得银耳多糖粗品，加水配制成水溶液，经活性炭过柱两次，其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。
经过药理学实验筛选，上述化合物具有增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药理活性。
按药剂学方法，可以将本发明的银耳多糖制备成多种临床药物剂型作为增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡、抗炎的药物，所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。特别是作为注射用制剂。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。
本发明可以组合物的形式通过口服、直肠、静脉、肌肉注射或胃肠外给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。
本发明的药物优选含有1％-99％的银耳多糖和99％-1％的赋形剂(包括其它配伍的药物)，优选含有30％-80％的银耳多糖和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的银耳多糖和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
下述的药理实验证实了银耳多糖药物制剂具有增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、降血糖、抗溃疡等药理活性：
1、注射用银耳多糖的抑瘤作用
1.1注射用银耳多糖对小鼠肝癌H22的生长抑制
结果表明，注射用银耳多糖对小鼠肝癌H22具有一定的生长抑制作用，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为16.10％、20.90％、34.83％，存在剂量效应关系，环磷酰胺20mg/kg的平均抑瘤率为69.205，见表1。
表1 注射用银耳多糖对小鼠肝癌H22的生长抑制作用(X±S)
| 组别 | 剂量 | 动物数(前/后) | 瘤重(g) | 抑瘤率(％) | P值 |
| 对照组环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 | 20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg | 20/1820/1512/1112/1012/10 | 1.87±1.010.67±0.401.53±0.931.58±1.241.21±0.67 | -64.218.215.535.2 | ＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05 |
1.2注射用银耳多糖对小鼠肉瘤S180的生长抑制作用
结果表明，注射用银耳多糖对小鼠肉瘤S180具有明显的生长抑制作用，存在一定的剂量效应关系，实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为28.93％、33.03％、42.43％，环磷酰胺20mg/kg的平均抑瘤率为73.77％，见表2。
表2 注射用银耳多糖对小鼠肉瘤S180的生长抑制作用(X±S)
| 组别 | 剂量 | 动物数(前/后) | 瘤重(g) | 抑瘤率(％) | P值 |
| 对照组环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 | 20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg | 20/1520/1212/1112/1212/10 | 1.94±0.870.58±0.461.43±0.961.32±0.671.14±0.76 | -70.126.331.941.2 | ＜0.001＞0.05＜0.05＜0.05 |
2、注射用银耳多糖对放化疗小鼠的生白作用
对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞减少的治疗作用
结果表明，ip环磷酰胺100mg/kg3天后可使小鼠外周血白细胞明显降低，一直持续到第12天，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.001)。注射用银耳多糖50、100mg/kg于给药第3～15天对环磷酸胺所致小鼠外周血白细胞减少均有明显对抗作用，与模型组比较差异显著(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，25mg/kg对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞减少除给药第6天有明显对抗作用外(P＜0.05)，其它时间均无明显影响，见表3。
表3 注射用银耳多糖对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞减少的对抗作用
| 组别 | WBC(109/L，X±S，n＝10) | |||||
| 0d | 3d | 6d | 9d | 12d | 15d | |
| 正常对照组模型组注射用银耳多糖25mg/kg50mg/kg100mg/kg | 8.76±2.418.78±2.528.80±2.638.76±2.718.73±2.87 | 8.56±3.063.75±1.73***4.96±2.136.29±2.49#6.93±2.51## | 8.63±2.822.39±1.60***4.22±1.285.23±1.92###5.32±1.97### | 8.45±1.194.53±1.98***6.74±3.166.73±2.15#7.81±1.13### | 8.92±2.267.03±1.37*8.69±3.069.57±2.14##9.73±1.75## | 8.78±1.617.28±2.269.71±3.3411.04±3.87##10.43±1.32## |
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001：与模型组比较#P＜0.05##P＜0.01，###P＜0.001
3、注射用银耳多糖对放射损伤所致小鼠外周血白细胞减少的对抗作用
结果表明，小鼠放射损伤后外周血白细胞明显降低，一直持续到第9天，与正常对照组比较差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。注射用银耳多糖50、100mg/kg于给药第6～15天对放射损伤所致小鼠外周血白细胞减少均有明显对抗作用，与模型组比较差异显著(P＜0.01或P＜0.001)，25mg/kg除给药第6及15天有明显对抗作用外(P＜0.05)，其它时间均无明显影响，见表4。
表4 注射用银耳多糖对放射损伤所致小鼠外周血白细胞减少的对抗作用
| 组别 | WBC(109/L，X±S，n＝10) | |||||
| 0d | 3d | 6d | 9d | 12d | 15d | |
| 正常对照组模型组注射用银耳多糖25mg/kg50mg/kg100mg/kg | 7.56±1.617.61±1.787.53±1.477.71±2.077.82±2.15 | 7.59±2.343.58±1.62***4.08±1.184.22±1.584.48±1.41 | 7.53±1.983.19±1.64***4.81±1.34#5.31±1.43##5.69±1.50## | 7.58±2.145.46±1.82*6.74±3.168.84±1.70###9.55±2.02### | 7.82±2.037.22±1.538.73±2.1111.91±3.93##11.76±2.35### | 8.04±1.877.00±1.969.70±2.89#11.82±3.03###12.73±2.92### |
注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001：与模型组比较#P＜0.05##P＜0.01，###P＜0.001
4、注射用银耳多糖对葡萄糖所致高血糖的影响
240只小鼠分为6组，每组40只，第1，2组sc生盐水10ml/kg，第3组sc胰岛素2u/kg，4，5，6组sc TF 200mg，100mg及50mg/kg，每天一次共给药7天，末次给药后30min，除第1组外其余各组均iv葡萄糖2g/kg，第1组iv等体积生理盐水5ml/kg，分别于iv葡萄糖后5′，30′，60′及120′每组分别处死10只小鼠，测血糖含量，结果见表5。
表5 注射用银耳多糖对葡萄糖所致高血糖的影响(
X±SD)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | iv葡萄糖后不同时间血糖含量(mg/dl) | |||
| 5′ | 30′ | 60′ | 120′ | ||
| 正常模型胰岛素多糖 | 2u/kg20010050 | 139.9±36.25332.6±51.46△△△352.0±54.23254.1±51.37**346.9±33.91377.4±27.51 | 116.2±13.30209.1±37.09△△△154.1±32.31**112.0±27.44***147.8±66.19*188.4±59.11 | 118.7±16.75169.41±35.27△△△133.9±11.58**125.2±27.13**112.9±18.39**108.70±27.39** | 141.9±25.07162.7±28.35157.7±19.21119.4±23.14**149.6±49.30105.0±17.63** |
模型组与正常对照组比较△△△P＜0.001
给药组与模型组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001
5、注射用银耳多糖对免疫的促进作用
(1)银耳多糖对免疫器官重量的影响
取体重16g左右的昆明种小鼠20只，分对照和给药两组，雌雄各半。给药组腹腔注射银耳多糖，每只2mg×7d，对照组给等量生理盐水，给药结束后次日解剖，用眼眶放血法将小鼠处死。取出脾脏和胸腺并称重，结果见表。
表6 注射用银耳多糖对小鼠脾脏和胸腺重量的影响
| 多糖 | 鼠数 | 给药途径 | 剂量 | 脾指数±SD | 胸腺指数±SD |
| 对照组银耳多糖 | 1111 | ipip | /100×7 | 61.30±3.3189.56±8.03* | 44.92±3.5240.88±3.61** |
*P＜0.01，**P＞0.05
由表6可见，银耳多糖可明显增加小鼠脾脏重量，与对照组比较，脾指数增加0.46倍，但对胸腺的影响不明显。
(2)银耳多糖对巨噬功能的影响
取体重18-22g，华北种小鼠20只，由爬片法观察银耳多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响，结果见表7。
表7 注射用银耳多糖对腹腔细胞吞噬功能的影响
| 多糖 | 鼠数 | 给药途径 | 剂量 | 吞噬百分数±SD | 吞噬指数±SD |
| 对照组银耳多糖 | 1010 | ipip | /100×7 | 57.4±2.690.0±1.6* | 1.38±0.094.37±0.34* |
*P＜0.001
由表7可见，银耳多糖可明显增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能，与对照组比较，吞噬指数增加了3.17倍，吞噬百分数增加1.57倍。
6、注射用银耳多糖对机体损伤的修复的保护作用
银耳多糖的抗炎作用
取体重250-300g威斯塔种大白鼠10只，按文献大白鼠足肿胀法进行实验。用0.1ml 10％鸡蛋清溶液致炎，结果见表8。
表8 注射用银耳多糖对抗炎症的作用
| 多糖 | 鼠数 | 给药途径 | 剂量 | 致炎后肿胀率±SD | |||
| 1hr | 3hr | 5hr | 7hr | ||||
| 对照组银耳多糖 | 55 | ipip | /60 | 54.7±8.730.5±3.8* | 54.3±2.026.1±4.4* | 41.6±6.014.2±4.6* | 23.8±4.19.8±3.4 |
*P＜0.05
由表8可见，银耳多糖在致炎后1h即表现出较好地对抗炎症的作用。
7、注射用银耳多糖抗溃疡作用
对大鼠应激型溃疡的影响
将大鼠随机分组，首次灌胃(po)给药后即禁食，次日再给药一次，共2次。末次给药后1h，将大鼠头朝下，四肢绑于木架上。16h后，处死动物，剖腹，结扎幽门，取出全胃，注入10ml生理盐水，结扎贲门。然后将全胃浸泡于1％甲醛溶液中固定。沿胃小弯剪开胃，平展于玻璃板上。按文献方法评定溃疡等级。实验结果见表9。统计表明，二种多糖对大鼠应激型溃疡均有明显抑制作用。
表9 银耳多糖对大鼠应激型溃疡的作用
| 药物 | 剂量mg/kg×d | 动物数 | 溃疡等级X±SD | P值 |
| 对照银耳多糖银耳孢子多糖 | 70×270×2 | 666 | 4.33±0.51.66±2.31.50±1.6 | ＜0.05＜0.01 |
8、注射用银耳多糖的抗肝炎作用
银耳多糖对甲氯化碳所致大鼠谷-丙转氨酶升高的保护作用
将大鼠随机分组。对照组给生理盐水：四氯化碳组于实验么3，6，9天ip5％四氯化碳麻油溶液；银耳多糖组均给药9d，并于给药第3，6，9天同时ip5％四氯化碳麻油溶液。第10天断头取血，以常规方法测定谷-丙转氨酶活力单位，见表10。
表10 银耳多糖对四氯化碳所致谷-丙转氨酶升高的影响
| 药物 | 动物数量 | 给药途径 | 剂量 | 谷转氨酶(unit) | P值 | |
| 多糖(mg/kg×d) | 5％CCL4(mg/100g×d) | |||||
| 对照组5％CCL4银耳多糖+5％CCL4 | 876 | poipip | 200×9 | 0.5×30.5×3 | 45.56±6.02106.08±4.8171.18±2.24 | ＜0.01 |
四氯化碳组与对照组比较谷-丙转氨酶升高133％，ip给予银耳多糖加四氯化碳与对照组比较，谷-丙转氨酶升高56％，上述实验均为用银耳孢子及子实体制备的注射用银耳多糖试验取得的结果。
具体实施方式
实施例1
取银耳孢子100g，配成10％的水溶液，搅拌6小时，离心(5000转)20分钟，上清液过活性炭柱二次(其中颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)离心(立式离心机，16000转)，上清液，缓慢加入乙醇至50％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液缓慢加入乙醇至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(13g)。
实施例2
取银耳孢子100g，配制5％的水溶液，保持40-60℃充分搅拌6小时，离心(10000转)20分钟，上清液过活性炭柱二次(其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)，离心(立式离心机16000转)，上清液，缓慢加入乙酸至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液缓慢加入乙醇至80％，充分搅拌，离心(16000转)，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(15.6g)。
实施例3
取银耳子实体100g，洗净，去托盘、杂质，加60倍量水，煎煮5小时，沙布过滤，反复3次，合并3次煎煮液，浓缩至3000ml，加乙醇至85％，收集沉淀(粗多糖40g)，取粗多糖配成10％的水溶液，搅拌至全部溶解，过活性炭柱二次(其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)离心(立式离心机，16000转)，上清液，缓慢加入乙醇至50％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液缓慢加入乙醇至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(9.6g)。
实施例4
取银耳子实体100g，洗净，去托盘、杂质，加60倍量水，煎煮4小时，沙布过滤，反复3次，合并3次煎煮液，浓缩至3000ml，加乙醇至85％，收集沉淀(粗多糖45g)，取粗多糖配成5％的水溶液，搅拌至全部溶解，过活性炭柱二次(其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，取150g湿法装柱，用水洗至无色)，滤液经100℃水浴加热20分钟，冷却至室温后冷藏24小时(0-4℃)离心(立式离心机，16000转)，上清液缓慢加入乙醇至60％，充分搅拌，离心(16000转)，上清液加入乙醇至80％，收集沉淀物(半成品)，配液后G4漏斗过滤，滤液分装灭菌，冻干制成成品(10.2g)。
Claims (1)
1、一种银耳多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将银耳孢子加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次；
或者将银耳子实体去托盘洗净加水煎煮，过滤取滤液，反复3次，合并滤液，浓缩加乙醇沉淀得银耳多糖粗品，加水配制成水溶液，经活性炭过柱两次；
其中，颗粒活性炭经40目筛再用沸水处理3次，湿法装柱，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏24小时，将树脂、鞣质等杂质除去；
2)将步骤1所述活性炭过柱后的溶液离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。
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