CN116284488A - 一种滇黄精多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滇黄精多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：将滇黄精药材片浸泡于乙醇溶液中，蒸制、烘干；称取烘干后的药材片适量，打成粗粉，回流脱脂；将脱脂后的滇黄精粉末与水混合后进行提取，过滤，浓缩，在浓缩液中加入乙醇沉淀，离心分离沉淀；将沉淀物洗涤后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；将酶解液透析两次，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心分离沉淀；将沉淀物洗涤后加蒸馏水溶解，再通过大孔树脂脱色，去蛋白质处理后，加入乙醇沉淀，离心分离沉淀物，将沉淀物进行干燥，即得滇黄精多糖。本发明方法能有效的提取滇黄精中的多糖，提取的多糖纯度达90％以上，其免疫促进作用远远超出普通滇黄精多糖。
Description
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种滇黄精多糖的提取方法。
背景技术
滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)为百合科黄精属多年生草本植物，以根茎入药，是我国常用的传统中药，被历版中国药典收载。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳等症。其主产于云南，习称“大黄精”，质量较佳，是云南重要的道地药材。滇黄精主要成分为黄精多糖、皂甙、黄酮、维生素、微量元素等。
现代植物化学和药理实验证明，滇黄精多糖是滇黄精中的主要活性成分之一，具有各种重要生物活性，例如免疫调节，抗氧化，抗糖尿病，抗动脉粥样硬化等作用。多糖又称多聚糖，是由糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物。现有技术中，滇黄精水提醇沉后的多糖通常还会含有较多的杂质，如蛋白质，色素，小分子物质等。为了开发利用天然药物资源，亟需更深入地研究滇黄精多糖的提取方法，进一步提升滇黄精多糖的提取效率和生物学功效，为研制开发滇黄精功能性保健食品、药品和化妆品创造条件。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种滇黄精多糖的提取方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
提供一种滇黄精多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
S1、将新鲜的滇黄精切片，将药材片浸泡于乙醇溶液中，蒸制、烘干；
S2、称取烘干后的滇黄精药材片适量，打成粗粉，回流脱脂；
S3、将脱脂后的滇黄精粉末与水混合后进行提取，过滤，浓缩，在浓缩液中加入乙醇沉淀，离心分离沉淀；
S4、将步骤S3的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；
S5、将酶解液透析两次，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心分离沉淀；
S6、将步骤S5的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，再通过大孔树脂脱色，去蛋白质处理后，加入乙醇沉淀，离心分离沉淀物，将沉淀物进行干燥，即得滇黄精多糖。
进一步地，步骤S1中，乙醇溶液的乙醇含量为30～40％，蒸制时间为1.0～1.5h。
进一步地，步骤S2中，按质量比药材∶乙醇＝1∶2的比例进行回流脱脂。
进一步地，步骤S3中，将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10～25∶1加入蒸馏水提取三次，过滤，合并滤液后浓缩至原体积的五分之一。
进一步地，在浓缩液中加入4～6倍量的无水乙醇，静置18～24h后于5000r/min条件离心10～15min。
进一步地，步骤S4中，将沉淀物依次用2～4倍量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解1～2h，得到酶解液。
进一步地，步骤S5中，将酶解液经分子量为100000～200000的透析袋进行第一次透析，透析时间为48～72h，取保留液经分子量为1000000～1200000的透析袋进行第二次透析，透析时间为24～48h。
进一步地，步骤S6中，大孔树脂脱色的具体条件为：按体积比待脱色溶液：大孔树脂＝2～5：1的比例在20～30℃温度下脱色15～25min。
进一步地，步骤S6中，采用Sevage法去蛋白，脱色液与Sevage溶液的体积比为1～3：1。
进一步地，Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比2～4：1。
本发明的有益效果为：
本发明方法能有效的提取滇黄精中的多糖，且能除去多糖中的色素、蛋白质、小分子类物质等杂质，不会破坏多糖的结构，提取的多糖纯度达90％以上，其免疫促进作用远远超出普通滇黄精多糖，大大提高了经济效益。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
一种滇黄精多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
S1、将新鲜的滇黄精切片，将药材片浸泡于乙醇含量为30％的乙醇溶液中，蒸制1.0h、烘干。
S2、称取烘干后的滇黄精药材片适量，打成粗粉，按质量比药材∶乙醇＝1∶2的比例进行回流脱脂。
S3、将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10∶1加入蒸馏水提取三次，过滤，合并滤液后浓缩至原体积的五分之一，在浓缩液中加入4倍量的无水乙醇，静置18h后于5000r/min条件离心10min分离沉淀。
S4、将步骤S3的沉淀物依次用2倍量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2倍量蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解1h，得到酶解液。
S5、将酶解液经分子量为100000的透析袋进行第一次透析，透析时间为48h，取保留液经分子量为1000000的透析袋进行第二次透析，透析时间为24h。取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心分离沉淀。
S6、将步骤S5的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，按体积比待脱色溶液：大孔树脂＝2：1的比例在20℃温度下脱色15min。采用Sevage法去蛋白，脱色液与Sevage溶液的体积比为1：1。Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比2：1。去蛋白质处理后，加入乙醇沉淀，离心分离沉淀物，将沉淀物进行干燥，即得滇黄精多糖。经测定该滇黄精多糖纯度为93.8％。
实施例2
一种滇黄精多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
S1、将新鲜的滇黄精切片，将药材片浸泡于乙醇含量为35％的乙醇溶液中，蒸制1.5h、烘干；
S2、称取烘干后的滇黄精药材片适量，打成粗粉，按质量比药材∶乙醇＝1∶2的比例进行回流脱脂。
S3、将脱脂后的滇黄精粉末按液料比20∶1加入蒸馏水提取三次，过滤，合并滤液后浓缩至原体积的五分之一，在浓缩液中加入5倍量的无水乙醇，静置20h后于5000r/min条件离心12min分离沉淀。
S4、将步骤S3的沉淀物依次用3倍量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用3倍量的蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解1.5h，得到酶解液。
S5、将酶解液经分子量为150000的透析袋进行第一次透析，透析时间为60h，取保留液经分子量为1100000的透析袋进行第二次透析，透析时间为36h。取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心分离沉淀；
S6、将步骤S5的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，按体积比待脱色溶液：大孔树脂＝3：1的比例在25℃温度下脱色20min。采用Sevage法去蛋白，脱色液与Sevage溶液的体积比为2：1。Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比3：1。去蛋白质处理后，加入乙醇沉淀，离心分离沉淀物，将沉淀物进行干燥，即得滇黄精多糖。经测定该滇黄精多糖纯度为95.5％。
实施例3
一种滇黄精多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
S1、将新鲜的滇黄精切片，将药材片浸泡于乙醇含量为40％的乙醇溶液中，蒸制1.5h、烘干；
S2、称取烘干后的滇黄精药材片适量，打成粗粉，按质量比药材∶乙醇＝1∶2的比例进行回流脱脂。
S3、将脱脂后的滇黄精粉末按液料比25∶1加入蒸馏水提取三次，过滤，合并滤液后浓缩至原体积的五分之一，在浓缩液中加入6倍量的无水乙醇，静置24h后于5000r/min条件离心115min分离沉淀。
S4、将步骤S3的沉淀物依次用4倍量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用4倍量的蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解2h，得到酶解液。
S5、将酶解液经分子量为200000的透析袋进行第一次透析，透析时间为72h，取保留液经分子量为1200000的透析袋进行第二次透析，透析时间为48h。取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心分离沉淀；
S6、将步骤S5的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，按体积比待脱色溶液：大孔树脂＝5：1的比例在30℃温度下脱色25min。采用Sevage法去蛋白，脱色液与Sevage溶液的体积比为3：1。Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比4：1。去蛋白质处理后，加入乙醇沉淀，离心分离沉淀物，将沉淀物进行干燥，即得滇黄精多糖。经测定该滇黄精多糖纯度为94.6％。
对比例
申请号为201711362351.7的中国发明专利公开的一种滇黄精多糖的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：
S1、精确称取干燥的滇黄精药材粗粉适量，按质量比药材∶95％乙醇＝1∶2的比例进行回流脱脂2h，过滤得渣，挥干溶剂，备用；
S2、将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10∶1加入适量水，浸提3次，每次提40分钟，合并滤液，60℃减压浓缩至1∶1.5，加入体积分数为95％的乙醇，搅拌均匀后，以乙醇终浓度70％在室温下进行醇沉，24小时后收集沉淀；将醇沉后的上清液减压浓缩到原药材重量的1.0倍体积，再加入95％的乙醇，以乙醇终浓度70％在室温下再进行醇沉24小时，收集沉淀；合并沉淀部分，冷冻干燥，得滇黄精粗多糖；
S3、将所得的滇黄精粗多糖配成0.3～0.5g/mL浓度溶液后上D-101大孔树脂脱色素，每次上样量为27g；蒸馏水洗脱，洗脱流速为2mL/min，洗脱至无糖，苯酚-硫酸比色成阴性；收集洗脱液浓缩，加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％，醇沉24小时，收集沉淀，干燥得滇黄精粗多糖；
S4、采用等点电法除去所得的滇黄精粗多糖中的蛋白；
S5、将脱蛋白后的粗多糖溶液置于透析袋中，再将透析袋置于加满水的玻璃容器中，放置于磁力搅拌器上，用蒸馏水透析4次，每12h换一次水，最后将袋内液体浓缩然后加95％乙醇使溶液乙醇浓度达到70％以达到多糖析出的目的，静置，4000rpm离心15min，弃上清，沉淀减压干燥后即得滇黄精多糖。
为验证本发明的滇黄精多糖具有较强的免疫促进作用，现进行以下动物实验。
将40只体重(20±2)g的小鼠随机分为4组(空白对照组、阳性对照组、高剂量组、低剂量组)，每组10只。空白对照组给予生理盐水，高剂量组、低剂量组分别给予实施例1制得的滇黄精多糖，阳性对照组给予对比例制得的滇黄精多糖，其剂量见下表；除空白对照组，其他各组均以灌胃方式给药，连续给药7d。末次给药24h后，经小鼠尾静脉注入4倍1％明胶稀释的印度墨汁0.1ml/10g，分别于2min和6min眼眶后取血20μl，并将其加入到0.1％碳酸钠溶液2ml中，摇匀，以0.1％碳酸钠溶液做空白对照，在分光光度计600nm波长处侧光密度值，OD1表示2min的光密度值，OD2表示6min的光密度值。根据公式计算廓清指数K，K值经体重及肝脾重量换算后，得吞噬指数α。
试验结果见下表。
| 组别 | 剂量(mg/kg) | K | α |
| 空白对照组 | 0.5ml | 0.0159±0.013 | 8.2354±0.541 |
| 低剂量组 | 200 | 0.0059±0.006 | 4.3657±0.885 |
| 中剂量组 | 500 | 0.0045±0.004 | 3.5987±0.556 |
| 高剂量组 | 1000 | 0.0031±0.003 | 3.0145±0.229 |
| 阳性对照组 | 1000 | 0.0081±0.004 | 5.3652±0.620 |
由上表可知，阳性对照组与空白对照组相比，廓清指数和吞噬指数均明显降低，且有显著差异，说明阳性对照组的滇黄精多糖具有免疫增强作用。高剂量组、低剂量组与阳性对照组相比，廓清指数和吞噬指数也明显降低，且有极显著差异，这这说明本发明的滇黄精多糖比常规提取的滇黄精多糖具有更强的免疫促进作用。
本发明方法能有效的提取滇黄精中的多糖，且能除去多糖中的色素、蛋白质、小分子类物质等杂质，不会破坏多糖的结构，提取的多糖纯度达90％以上，其免疫促进作用远远超出普通滇黄精多糖，大大提高了经济效益。
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将新鲜的滇黄精切片，将药材片浸泡于乙醇溶液中，蒸制、烘干；
S2、称取烘干后的滇黄精药材片适量，打成粗粉，回流脱脂；
S3、将脱脂后的滇黄精粉末与水混合后进行提取，过滤，浓缩，在浓缩液中加入乙醇沉淀，离心分离沉淀；
S4、将步骤S3的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；
S5、将酶解液透析两次，取第二次渗出液浓缩，乙醇沉淀，离心分离沉淀；
S6、将步骤S5的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤后加蒸馏水溶解，再通过大孔树脂脱色，去蛋白质处理后，加入乙醇沉淀，离心分离沉淀物，将沉淀物进行干燥，即得滇黄精多糖。
2.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S1中，乙醇溶液的乙醇含量为30～40％，蒸制时间为1.0～1.5h。
3.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S2中，按质量比药材∶乙醇＝1∶2的比例进行回流脱脂。
4.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S3中，将脱脂后的滇黄精粉末按液料比10～25∶1加入蒸馏水提取三次，过滤，合并滤液后浓缩至原体积的五分之一。
5.根据权利要求4所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S3中，在浓缩液中加入4～6倍量的无水乙醇，静置18～24h后于5000r/min条件离心10～15min。
6.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S4中，将沉淀物依次用2～4倍量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍量蒸馏水溶解，加入蛋白酶酶解1～2h，得到酶解液。
7.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S5中，将酶解液经分子量为100000～200000的透析袋进行第一次透析，透析时间为48～72h，取保留液经分子量为1000000～1200000的透析袋进行第二次透析，透析时间为24～48h。
8.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S6中，大孔树脂脱色的具体条件为：按体积比待脱色溶液：大孔树脂＝2～5：1的比例在20～30℃温度下脱色15～25min。
9.根据权利要求1所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，步骤S6中，采用Sevage法去蛋白，脱色液与Sevage溶液的体积比为1～3：1。
10.根据权利要求9所述的滇黄精多糖的提取方法，其特征在于，Sevage溶液为氯仿和正丁醇的混合溶液，混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比2～4：1。
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