CN1049221C - 人参寡糖素、人参单体寡糖及其制备工艺和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术。将人参初生壁细胞系通过愈伤组织继代培养和悬浮培养得到的细胞进行预处理，冰冻干燥得细胞壁干物质，然后进行酸水解，采用0.7-1N HCl在90-98℃温度下反应1-1.5小时，得聚合度(DP)由3～12个单糖组成的人参寡糖素；再通过活性碳柱、离子交换柱、生物凝胶柱分离得分段的寡糖组分，用HPLC分离得人参三糖至人参十二糖的单体寡糖。人参单体寡糖、人参寡糖素混合物可用于制备免疫增强药、抗癌辅助药，并可用作为植物次级代谢物的诱导子。

Description

人参寡糖素、人参单体寡糖及其制备工艺和应用

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及由人参初生壁细胞培养分离纯化得到的人参寡糖素，即聚合度(DP)由3～12个单糖组成的人参混合寡糖，以及进一步分离得到的分段寡糖组分及人参单体寡糖，它们的制备工艺，以及它们在作为免疫增强药、抗癌辅助药、食品、植物培养细胞的生长诱导子、植物次级代谢物的诱导子方面的应用。

美国Albershcim等把结构多糖降解碎片中有活性的分子称为寡糖素(Oligosaccharin)，国际上最早发现的寡糖素是一个从能感染大豆的真菌Phytophythora f.sp.Glycinea细胞壁或菌丝体中得到的有活性的葡七糖，以前认为仅起保护的植物细胞壁中的结构多糖，被发现是具有特异的生物功能的调节分子，也能与蛋白质、核酸一样作为信息分子对植物的生长发育、形态建成及抗病菌侵染等有重大意义，因此美国、日本等国科学家迄今已从分离纯化及结构鉴定，寡糖素的合成，结构与功能，作用机理方面对植物寡糖素进行了研究，如文献Augur C，et al，1992 Pl.Physiol 99：180-185报道了从假威槭悬浮培养液细胞壁中分离得到的木葡聚糖，具抗生长素活性；文献LerougeP，et al，1990，Nuture，344：781-784报道，从根瘤菌在感染苜蓿过程中产生的DP为4，浓度10-9M的根瘤寡糖能诱导苜蓿形成根瘤，文献Priem Betal，1992，PlantPhysiol 98：399-401报道从成熟果胶分解得到的DP-6，用量1mg/g果实的甘露糖寡糖能促进绿蕃茄合成乙烯和催熟。目前国内外均未见从人参培养细胞中获取优质人参寡糖的报导，分离提取寡糖工艺步骤多，所用溶剂较贵，仪器要求精密度高。为了寻找一种细胞生长快且寡糖素含量高的新的植物寡糖素生产资源，达到促进寡糖素工业化生产进程速度，本发明采用经济价值较高的人参(Panax-ginseng)为材料，用细胞培养这一生物技术手段达到生产人参以及人参寡糖素的目的，提供理化性质优良、聚合度(DP)由3-12个单糖组成的水溶性混合物，提供聚合度(DP)由6-7个单糖组成的人参混合寡糖，提供人参三糖至人参十二糖单体寡糖。

本发明同时提供了从人参细胞培养生产上述人参寡糖素及单体寡糖的工艺，以及由该工艺生产的产品用作为免疫增强药、抗癌辅助药、食品、植物培养细胞的生长诱导子、植物次级代谢的诱导子。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

由人参细胞培养分离纯化而得的聚合度DP由3-12个单糖组成的人参寡糖素混合物。

由人参寡糖素分离而得人参单体寡糖，将上述人参寡糖素混合物通过活性碳性，离子交换柱、生物凝胶柱分离得到分段寡糖组分，然后经HPLC分离得人参三糖 至人参十二糖的单体寡糖，其中人参六糖结构式如(I)所示：

制备人参寡糖素、单体寡糖的工艺，包括将人参初生壁细胞系通过愈伤组织继代培养和悬浮培养得到的细胞进行预处理，冰冻干燥得细胞壁干物质，然后进行酸水解，采用0.7-1N HCl在90-98℃温度下反应1-1.5小时，得人参寡糖素；再将上述人参寡糖素液通过活性碳柱、离子交换柱、生物凝胶柱分离得分段的寡糖组分，用HPLC分离得人参三糖至人参十二糖的单体寡糖。

上述工艺中，人参愈伤组织和悬浮细胞培养用MS培养，附加2mg/l 2，4-D，0.1mg/l KT，26±1℃下暗培养，培养20-25天为一个周期。

酸水解条件优选范围采用1N HCl在90℃温度下反应1小时。

本发明提供了一种免疫增强药，含本发明的混合寡糖和制药可接受的载体。

一种免疫增强药，含本发明的单体寡糖和制药可接受的载体。

一种抗癌辅助药，含本发明的混合寡糖和制药可接受的载体。

一种抗癌辅助药，含本发明的单体寡糖和制药可接受的载体。

一种植物次级代谢物的诱导子，含本发明的混合寡糖。

一种植物次级代谢物的诱导子，含本发明的单体寡糖。

本发明的上述技术方案是按照如下技术路线来进行的：

人参愈伤组织的诱导及继代培养→悬浮培养→细胞预处理(去除脂溶部分和蛋白部分)→干细胞酸水解→中和、过滤→活性碳柱→离子交换柱→BiO-P-2柱→硅胶(G)柱→HPLC(ODS半制备柱)→FAB-MS和NMR→完全水解检测单糖种类→作出结构鉴定→对植物组织细胞培养的影响试验。

为了更好地说明本发明的实质内容和有益效果，下面将更具体地阐述本发明的技术方案和应用试验。

用常规的植物愈伤组织诱导和悬浮细胞培养方法得到人参培养细胞，将细胞破碎匀浆后过滤，用80％乙醇抽提出脂溶部分舍去，再用Se-vage法去除溶液中蛋白质，除去滤液，将剩余部分冰冻干燥后进行酸水解(0.7-1NHCl，1-1.5小时，90-98℃)中和，在4℃条件静置，滤去沉淀，得到含3-12个单糖的人参寡糖素混合物溶液。

将以上所得溶液通过活性碳柱去除色素，Dowex 50(H⁺)离子交换柱除去Na⁺，再用生物凝胶柱分离，得到四段具有活性的人参寡糖素片段(DP1，2+DP3，4，5+DP6，7，8+DP9，10，11，12)，最后用HPLC分离得到3-12的单体寡糖。分析单糖的分子结构。

为了达到更好效果，本发明在酸水解过程中，采用严格控制水解条件，酸浓度偏大得到的寡糖素中聚合度小的部分占很大比例。酸浓度过小，多糖部分含量又偏大；水解完成后要及时冷却用NaOH中断反应，防止水解反应继续进行。同时本发明采用与已有技术不同的溶剂，用0.7-1N HCl，沸腾条件下反应1-1.5小时即可。已有技术多数采用三氟醋酸或酶解作为溶剂，成本高，用量大，难于工业化生产。

同时，为了去除人参寡糖素初品中的部分杂质，如盐类、皂甙及色素类，故在分离之前采用活性碳柱和Dowex(H⁺)柱纯化。在分离寡糖素过程中，由于其在紫外上无吸收，使HPLC的应用受到限制，目前国内外多采用在其还原未端接一具有紫外吸收基团(如ABBE，对氨基苯甲酸己酯衍生物等)的办法来分离，但这种办法给以后活性鉴定带来了麻烦。

本发明是采用对照法，即将2，4-二硝基苯肼与寡糖反应，接在寡糖的还原未端，以便于HPLC上紫外检测，根据其峰型和保留时间与寡糖片段大小规律，作为参照物，在相同条件下重复做未反应寡糖的分离，在相应的保留时间内(稍靠前)分部收集，簿层层折(TLC)检测后，相同部分合并。分别作FAB-MS和NMR测定，分析其结构和构型、构象，随后用酸完全水解后，纸层折测定其单糖组成。

通过本发明上述工艺制备的人参寡糖素及单体寡糖对红花细胞及之中α-生育酚，三七和人参细胞及之中人参皂甙，紫草细胞及紫草素以及红豆杉细胞生长及之中紫杉醇含量的影响可由下试验结果来说明：

1、本发明生产的人参寡糖素混合物能促进红花(Carthamusiinctorius)培养细胞的生长及提高细胞中α-生育酚的含量，其中以人参二糖、人参三糖、人参五糖等三种寡糖的效果较为显著；加入寡糖后1-3天，α-生育酚的含量即提高，同时加入人参一糖、二糖、三糖、可使红花细胞生长速率提高18.11％，α-生育酚含量比对照提高3.5倍，其产率比对照提高4.3倍。

2、本发明生产的人参寡糖素使三七细脆悬浮培养细胞的生长提高22.7％，使皂甙产率提高近一倍，具体试验为加入15PPm的本发明的聚合度含3-12个单糖的混合物。

3、本发明生产的单体寡糖人参七糖和人参八糖在滇紫草愈伤组织培养中能促进色素合成的最适浓度分别为2.5ppm，而在较低浓度时(1.0-2.5ppm)则轻微抑制色素合成。

4、本发明生产的单体寡糖人参六糖对云南红豆杉悬浮培养细胞生长和紫杉醇含量的影响如下表所示：

寡糖素浓度PPm	生长速率g/l.d	紫杉醇含量(％)
			细胞中        培养基中        总含量
		1.05.010.0对照		0.3220.3500.2710.256	0.0164       0.0074          0.02380.0190       0.0205          0.03950.0108       0               0.01080.0098       0.0039          0.0137

可见，人参六糖较低浓度对细胞生长和紫杉醇含量有显著的诱导作用，特别是5PPm人参六糖对增强紫杉醇的合成和促进细胞生长的效果最为明显，使红豆杉悬浮培养细胞及培养液的紫杉醇总含量提高了188.32％；使红豆杉悬浮培养细胞生长速率提高了36.72％。而到10ppm浓度时作用反而下降。

5、本发明生长的人参寡糖素及单体寡糖药理实验结果表明能显著提高小鼠免疫功能，对放、化疗后白细胞和血小板再生有显著作用；对体外培养人肺泡癌细胞有很好抑制作用。

6、本发明生产的人参寡糖素能明显增加马铃薯的试管结薯数，比公认效果好的香豆素和矮壮素好。

由上述本发明技术方案和活性作用结果表明本发明的有益效果为：

(1)、本发明以生产人参寡糖素为目的，与国内外其他发明均不相同，人参培养细胞生长快且寡糖素含量高，人参细胞生长速率达15g干重/升，人参寡糖素含量平均在10％以上，而人参生药的寡糖素含量低于千分之一。

(2)、本发明提供的人参寡糖素混合物，寡糖组分以及单体寡糖理化性质优良，易溶于水，对光、热、PH2-12稳定，能耐121℃、15磅以上高压蒸汽灭菌，贮藏期3年以上，产品稳定，具多种活性功能。单体寡糖结构新颖，为β-构型，1→4和1→3连接方式，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，是国际公认活性高的结构。

(3)、本发明的制备工艺稳定、简单适用，得率高，成本低，适于工业化生产，含量测定方法准确、重复性好、快速、简单适用。

1.本发明的人参寡糖素(GOD)的免疫活性试验(见表1)：

表1人参寡糖素(GOB)的免疫活性(ICR♀小鼠18-21克，SRBC致敏后给药5天，第6天解剖测定)

样品名称	剂量mg/kg×d	给药途径	鼠数	免疫器官重量mg/10g体重
								脾	胸腺	淋巴结	肝脏
				对照人参寡糖	N.S.×550×5	ipip	99					75±1270±12	33±1129±9	24±1023±5	545±85562±38

样品名称	PFC104  细胞	淋巴细胞增殖3H-TdR cpm掺入	补体Cμg/10μl血清	IgGμg/10μl血清
					对照人参寡糖	598±27596±22	6585±110412183±1079↑ ***	14.2±2.416.3±1.7↑ *	237±60208±45

与对照比较：^*P＜0.05，^***P＜0.01.结论：人参寡糖能使T细胞增殖加速，并提高血清补体C3水平，有免疫增强活性。2.本发明的人参寡糖素(GOD)对放、化疗血象的影响试验：表2人参寡糖GOB+放疗对B¹⁶黑色素瘤小鼠血象变化影响的观察

项目        g/l      x10¹²/l   x10⁹/l  x10⁹/l     ％    ％组别         血红蛋白    红细胞    白细胞    血小板    中性  淋巴正常鼠          113        5.65      8.10       123      27    73生理盐水对照    93         4.23      11.09      201      63    37GOB^150mg _×12次   84         4.38      11.47      211      65    35⁶⁰CO^500CGY _×1次  84         3.29      5.97       108      54    46⁶⁰CO+GOB^500CGY _500mg×12

              96     3.89    6.56    108    48    52⁶⁰CO+GOB^500CGY _100mg×12

              88     4.57    6.30    151    41    59⁶⁰CO+GOB^500CGY _150mg×12

              76     3.56    7.00^*  163^*  41    59*P＜0.05表3人参寡糖GOB+化疗对Lewis肺癌小鼠血象变化影响的观察项目               g/l     x10¹²/l x10⁹/l x10⁹/l   ％  ％组别             血红蛋白  红细胞   白细胞  血小板  中性  淋巴正常鼠             113     5.65      8.10    123     27   73生理盐水对照       93      4.06      11.21   179     63   37GOB_50mg×12         82      4.38      11.47   211     65   35COB_100mg×12        76      4.28      12.63     198     71    29GOB_150mg×12        84      4.38      11.47     211     65    35GOB_200mg×12        67      4.76      9.43      117     71    29环磷酰胺_100mg×2

               89      4.77      7.90      137     45    55环磷酰胺+GOB^100mg×2 _100mg×12

               90      4.76      8.60      205     67    33环磷酰胺+GOB^100mg×2 _300mg×12

               86      4.90      8.70^*    213^*  61    38*P＜0.05

如表2所示，单用GOB对小白鼠血象的各项指标均无明显改变、小鼠经⁶⁰Co 500CGY照射一次加GOB150mg/kg比单用⁶⁰Co照射组白细胞升高1.03×10⁹/L，血小板提高55×10⁹/L.环磷酰胺100mg/Kg加GOB200mg/Kg组比单用环磷胺组白细胞升高0.8×10⁹/L，血小板提高76×10⁹/L(表3)，从各实验组的统计数据看出，GOB浓度为100-200mg/Kg时与放、化疗联用，对白细胞及血小板有一定的保护作用，尤其是对血小板的升高较为明显。上述各组同时取骨髓制片观察，结果与外周血象一致。

3、本发明人参寡糖素GOB急性毒性实验结果：

供试药品：本发明的GOB(人参寡糖)5％以生理盐水稀释供用。

方法和结果  按新药审批办法技术要求，昆明种小鼠80只，体积18-23g，雌雄各半，分别测定ig和ivGOB急性毒性，

(一)灌胃给药5％  GOB    剂  量    n    体重    给药后即         一周死亡率

        (g/kg)          (g)     时表现0.35ml/10g    3.5     20  19±1.5  吱叫，震颤，不吃食   8/20×2                                24小时后发生死亡0.25ml/10g    1.25    20  19±1.9  同    上             2/20(二)尾静脉给药ml/10g     n      体重(g)     一周死亡率         LD₅₀(g/Kg)0.25       10     21±1.2       8/100.213      10     21±1.6       5/10         1.04(0.93--1.16)0.18       10     19±1.9       3/100.15       10     19±1.2       1/10结论：GOB5％供试液ig或iv均显示一定毒性，ig中毒死生在于24h后，ivLD50为1.04/kg，ig 1.25g/kg亦发生死亡(10％)，3.5g/kg死亡率达40％，限于给药体积和浓度无法求出灌胃的LD50，但从绝对数量看，本品属于低毒物质：

4、本发明人参寡糖素(GOB)对体外培养人肺癌细胞的抑制作用试验：表4 GOB对体外培养人肺癌细胞的作用

结论：加入195μg的GOB时有95％的癌细胞胞浆内出现大量空泡，约7％的癌细胞核出现固缩，对癌细胞生长的抑制率为71.4％。加入100μg的GOB时有92％的癌细胞胞浆出现空泡，核无固缩，对癌细胞生长的抑制率为22.1％。GOB为10μg时有21％的癌细胞胞浆内有少量空泡，细胞核正常，对癌细胞生长无抑制。GOB为1μg时对癌细胞的胞浆、核及细胞生长均无影响。

5、本发明人参寡糖素(GOB)治疗白细胞减少症44例临床试验表5 GOB治疗各类白细胞减少症的疗效

病种	例  数	疗    效
			显效            有效          无效          有效率
		慢性特发性化疗所致幅射所致其它		201635	4               10             6            70％3               7              6            62.5％/               3              /            100％/               /              5            0％
合计	44		7(15.9％)      20(45.5％)    17(38.6％)       61.4％

结论：A、本项目临床观察的GOB，经分析，系含有β连键的寡糖化合物。药物毒性试验未发现有任何毒性，更无致癌致病作用，临床观察进一步证明无毒付作用，安全可靠。

B、经44例临床观察证明，GOB对于因幅射所致及化疗后白细胞减少，及原因不明的慢性待发性白细胞减少症，有升高白细胞的作用，近期有效率为69.2％(27/39)。

本组观察的化疗后白细胞减少病例，大多为白血病及恶性淋巴瘤患者，10例有效中，7例在服GOB2周内白细胞明显上升，而6例无效的病例，多数为疾病晚期，骨髓中正常细胞效严重抑制。

C、本组中部分I_gG偏低或低下的病例，服GOB后I_gG有所上升。结合GOB有促进乙型肝炎表面抗原(HB₅A₉)阳性者阴转的作用，提示本药可能具有提高体液免疫功能的作用。

D、在观察中发现，部分有植物神经功能紊乱的病例服GOB后病状有明显改善，可能具有调节植物神经功能的作用。

6、GOB治疗乙肝及乙肝表面抗原携带者临床试验(见表6、表7)

表6 GOB治疗乙肝及乙肝表面抗原携带者9例结果

     H_BSAg         eAg           GTP           TTT           ZnT组别   服前  服后     服前  服后    服前  服后    服前  服后    服前  服后患者1  1∶128  1∶64  阳性  阳性    20    5       3      4      7     8患者2  1∶32   1∶16  阳性  阳性    90    25      8      7      14    12患者3  1∶128  1∶32  阳性  阳性    6     8       4      6      8     /患者4  1∶128  1∶256 阴性  阴性    60    10      14     8      14    12患者5  1∶8    1∶8    /    阴性    2     3       5      4      11    9患者6  1∶512  1∶128 阳性  /       5     15      5      6      10    10患者7  1∶512  1∶512 阴性  阳性    90    10      10     8      11    10患者8  1∶64   1∶128  /    阳性    30    10      4      6       9    9患者9  1∶64   1∶8    /    阴性    /     /       /      /      /     /结论1 由于病例少(仅9例)，治疗时间短(15天)，服药量少，故未发现表

  面抗原转阴者。

2 试药GOB对乙肝表面抗原阳性者四例中，四例滴度均有下降，其

  中一例下降较明显。

3 肝功能不正常者均转为正常，尤以GTP下降较为明显。

4 治疗期间未发现任何付作用。多有增进食欲，改善睡眠的反应。

表7 GOB试治乙肝17例化验指标观察结果项目          服药前病例      服药后病例

         阳性  阴性   转阴  滴度  无变化  上升  备注

                            下降病毒  HBsAg   17    0      1     9      3      4    对三个抗原项目

  HBeAg   9     8      3     5      1      0    ，1个全无效，另指标  抗HBC   16    1      2     2      7      5    外16例在不同方

          异常  正常   正常  /      /      /    有不同程度好转转氨酶        13    4      6     1      1      5    ，有效率达94.1％

结论：经过治疗，总有效率为94.1％。多数病人反应食欲增加，乏力减轻，部分病人肝区痛消失，2例肝大者复查正常；且未发现毒付作用。依据症状、体征、化验指标评定疗效，近期结果属痊愈1例，显效4例，进步8例，无效4例，总计有效13例，占76.5％，如单纯计算表面抗原，转阴及滴度下降共10例，有效率为58.8％，一例典型病例，疗后抗HBC先转阴，随后HBsAg、GTP两次阴转及正常。

附图说明：

附图1，与2，4-二硝基苯肼反应的本发明的寡糖素HPLC分离图；

附图2，与2，4-二硝基苯肼反应的本发明的寡糖素HPLC分离DP6(7峰)的FAB--MS图；

附图3，与2，4-二硝基苯肼反应的本发明的寡糖素HPLC分离DP6(7峰)¹³CNMR图；

图4，本发明的DP6寡糖的FAB--MS图；

附图5，本发明的DP6寡糖的FAB--MS联动图；

附图6，本发明的DP6寡糖¹³CNMR图

附图7，本发明的DP6寡糖结构图

附图8，与2，4-二硝基苯肼反应的本发明的DP6寡糖结构图。

下面将通过实施例来说明本发明的实质性内容，但本发明的技术方案、产品并非局限于此。

实施例1，由人参细胞培养制备一组聚合度DP由3-12个单糖组成的人参寡糖素混合物。

采用人参根诱导出愈伤组织，暗培养于附加2，4-D 0.2PPm、KT0.1PPm的MS培养基上，培养温度为26±0.5℃，25天继代一次，形成细胞系，然后将上述人参初生壁细胞系通过愈伤组织继代培养(用50ml三角瓶，10ml MS固体培养基，附加2mg/l，2.4-D和0.1mg/l KT)和悬浮细胞培养(500ml和1000ml三角瓶，20％ MS液体培养基)，26±1℃，暗培养，120转/min振荡培养，25天为一个周期。

将冰冻干燥的500克人参寡糖素细胞加入蒸溜水后，在匀浆机上，4000rpm离心15分钟，用滤纸过滤，蒸馏水冲洗三次，弃去滤液，加入3倍体积80％乙醇在室温下浸泡24小时，过滤后，弃去滤液，滤渣用3倍体积的氯仿∶戊醇或丁醇(4∶1)60℃条件下回流6小时，滤去液体后用丙酮和水洗涤干燥后得细胞壁干物质480克。

细胞壁干物质用1N HCl，于90℃在转动容器中进行酸水解反应1.5小时。水解结束后，立即冷却终止反应，滤去沉淀，滤液用NaOH中和至PH7.0，于4℃下静置过夜后，滤去沉淀得聚合度DP由3-12个单糖组成的人参寡糖素混合物14升，糖含量测定约含糖50g。

实施例2  制备DP3，4，5、DP6，7，8、DP9，10，11，12寡糖组分：

先采用实施例1的方法得到聚合度由3-12个单糖组成的人参寡糖素混合物14升，滤液经活性碳脱色后，过Dowex 50(H⁺)离子交换柱(1.0×15cm)，双蒸水洗脱，除去钠离子，流出液浓缩。再用Bio-Gel-P-2(1.0×50cm)柱层析，得到DP3，4，5、DP6，7，8、DP9，10，11，12寡糖组分。然后进行寡糖素组分的鉴定：TLC检测Bio-Gel-P-2柱层析后的寡糖，溶剂系统是正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1或甲醇∶水＝25∶1，后者有些拖尾。正相板为高效板GF254(青岛海洋化工厂制，下同)。蔗糖标准品对照，展开后，凉干，喷α-萘酚硫酸溶液(15％a-萘酚乙醇溶液10.5ml，浓硫酸6.5ml，乙醇40.5ml与水4ml相混合)，烘烤3-6min显色。一般Bio-Gel-P-2能得到去除两头(单，双和多糖)的分段寡糖素片段，显色后为一紫红长带，其中有些点为兰色，而蔗糖一般显兰色。

收集Rf介于原点和蔗糖标准品之间的组分。浓缩这部分溶液后，重复上Bio-Gel-P-2柱则可得分段的寡糖素。得到12g糖类干物质。

实施例3 制备人参六糖：

先用实施例1的方法得到聚合度为3-12个单糖的人参寡糖素混合物，再用实施例2的方法得到聚合度为6-8单糖的寡糖组分，约2g，将Bio-Gel-P-2分到的II峰浓缩后过硅胶G柱，收集MeoH∶H2O＝25∶1部分，浓缩后得1.2g寡糖干物质，与2，4-二硝基苯肼反应寡糖的HPLC(ODS柱)分离如附图1所示，收集图中T峰，作FAB＝MS(附图2)和¹³CNMR(附图3)测出过DP6寡峰。

未反应寡糖在相同条件下，在保留时间4.5-5min内分三段收集，TLC检测，重复两次进行分离，得到一个19mg组分，该组分易溶于水，在甲醇等有机溶剂中呈白色絮状沉淀，冰冻干燥后为白色无定形粉未。经TLC检测，蔗糖标准品作为对照，Rf值为0.59(如附图4所示)，交FAB--MS和NMS数据表明其结构与前述2，4-二硝基苯肼反应寡糖HPLC分离DP6六糖相同。

取上述HPL分得DP6寡糖样品与5mg完全酸水解后，经过纸层折，测定DP6寡糖的单糖种类为Glc，Gal，Man三种；同时作FAB-MS和NMR图谱，得出人参六糖具有如附图5的结构，与2，4-二硝基某肼反应的结构图如附图6所示。

Claims (5)

1、人参六糖，结构式如(I)所示：

2、制备人参六糖的工艺，其特征是包括将人参初生壁细胞系通过愈伤组织继代培养和悬浮培养得到的细胞进行预处理，冰冻干燥得细胞壁干物质，然后进行酸水解，采用0.7-1N HCl在90-98℃温度下反应1-1.5小时，得含人参三糖至人参十二糖12种单糖的人参寡糖素混合物，再将上述混合物通过活性碳柱、离子交换柱、生物凝胶柱分离得分段的人参寡糖素片段，用HPLC分离得人参三糖至人参十二糖的单体糖，即得人参六糖。

3、人参六糖的应用，由人参六糖加入相应的制药可接受的载体得一种免疫增强药。

4、人参六糖的应用，由人参六糖加入相应的制药可接受的载体得一种抗癌辅助药。

5、人参六糖作为植物次级代谢物的诱导子，该诱导子含权利要求1的人参六糖。

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