CN108559006A - 采用产pufa的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法及其应用 - Google Patents

采用产pufa的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明要提供了一种从产PUFA的微藻发酵废液中制备胞外多糖的方法，包括下述步骤：(1)将微藻培养液进行固液分离，得到不含藻细胞的微藻发酵废液；(2)微藻发酵废液通过微滤膜，得到微滤透过液；(3)将微滤透过液通过超滤膜，得到超滤透过液和浓缩液，并收集浓缩液；(4)将超滤浓缩液在40‑80℃条件下进行浓缩，得到浓缩浆；在65‑85℃，真空条件下烘干，即得微藻胞外多糖。本发明不但减少了废水的排放，具有良好的社会效益；同时还实现了高效制备微藻胞外多糖，并对提取的胞外多糖进行应用，大大增加了经济效益，因此具备广阔的市场应用前景。

Description

采用产PUFA的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及微藻培养领域，具体涉及一种从产PUFA的微藻发酵废液中制备胞外多糖的方法及其应用。
背景技术
多糖在自然界分布极广且用途广泛，在医药、食品、化妆品、废水及重金属离子处理、造纸、印刷等领域均有应用。近些年来，微生物来源的多糖越来越引起人们的广泛注意。而随着研究的深入，学者们发现多种微藻的胞外多糖具有很强的生物学活性，微藻胞外多糖的研究也更加引起人们的关注。
微拟球藻(Nannochloropsis)、裂壶藻(Aurantiochytrium)与寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)具有优越的生产多不饱和脂肪酸(PUFA)的能力，是应用于工业化培养生产ω-3多不饱和脂肪酸(特别是EPA和DHA)的藻种。目前这类微藻的年产量近5000吨，培养生产过程中每年所产生的发酵废液超过10万吨，尚未得到有效利用。近年研究发现，微拟球藻、裂壶藻与隐甲藻在培养过程中能产生大量的胞外多糖；然而，目前这类微藻胞外多糖的纯化制备技术及应用开发研究还极为有限。
专利CN 105331656 A涉及了一种寇氏隐甲藻胞外多糖的制备方法以及该胞外多糖的应用；专利CN 103204951 B涉及了一种裂殖壶藻胞外多糖的分离纯化方法。但在这些专利中，采用的仍然是传统的胞外多糖的“醇沉”分离纯化方法，即去除藻细胞-浓缩-透析-醇沉-干燥的工艺。“醇沉”法不仅费时费力，而且效率较低，因此难以进行规模化生产。在醇沉过程中，由于单糖往往伴随着多糖同时被醇沉下来，单糖的去除率较低，因此，需要多次醇沉，耗费酒精和人工较多，生产成本较高；同时，传统的热浓缩方式，耗用大量的蒸汽，对生产成本和产品质量有较大影响。
随着技术的进步和加工工艺的发展，各种膜材料逐渐用于生物分离工艺，从而使原本复杂的分离工艺变得简单易行。与传统分离方法相比，膜分离方法具有效率高、工作条件温和、可连续操作等优点，因此，在工业上得到了越来越广泛的应用。专利CN 101838342A介绍了一种微藻胞外多糖的膜分离方法，利用径向流微滤去除培养液中杂质，利用切向流超滤分离胞外多糖。但该方案只针对单一方向上的单一参数进行了优化(径向流流速与切向流跨膜压力)进行了优化，而未对微滤与超滤孔径与截留分子量进行优化，从而对产物纯度造成影响。
专利CN 103406080 A介绍了一种利用细菌来源的胞外多糖作为共轭亚油酸微胶囊壁材的方法。但该方法使用了复凝聚法制备，制备步骤复杂，且使用了冷冻干燥技术作为最后的成胶囊技术，能源消耗大，成本高且形成微胶囊容易聚集分散性差。
发明内容
针对上述问题，本发明要提供了一种从产PUFA的微藻发酵废液中制备胞外多糖的方法。本发明不但减少了废水的排放，具有良好的社会效益；同时还实现了高效制备微藻胞外多糖，并对提取的胞外多糖进行应用，大大增加了经济效益，因此具备广阔的市场应用前景。
本发明的技术方案是：
采用产PUFA的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法，包括下述步骤：
(1)将微藻培养液进行固液分离，得到的液体部分即为不含藻细胞的微藻发酵废液；所述微藻发酵废液为微拟球藻发酵废液、裂壶藻发酵废液或寇氏隐甲藻发酵废液。
(2)将步骤(1)得到的微藻发酵废液通过微滤膜，得到微滤透过液；其中，微滤膜的孔径在0.02-0.5μm，温度为15-40℃，工作压力为：进压1.5-4.5bar，出压0.5-1.0bar；所述的微滤所用膜为有机膜或陶瓷膜。
(3)将步骤(2)中的微滤透过液通过超滤膜，得到超滤透过液和浓缩液，并收集浓缩液；其中，所述超滤膜的截留分子量为2000-30000Da，温度为20-40℃，工作压力为：进压7-10bar，出压1-3bar；所述超滤膜的材料为聚丙烯腈PAN、聚碳酸酯PC、聚丙烯PP、聚偏氟乙烯PVDF、聚醚砜PES、聚乙烯PE、聚氯乙稀PVC和聚砜PS复合膜中的一种。
(4)将步骤(3)中的超滤浓缩液在40-80℃条件下进行浓缩，直至固形物含量为40-70％，得到浓缩浆；将所述浓缩浆进一步在65-85℃，真空压力-0.08--0.1Mpa的条件下烘干，至水分的重量分数为1-6％，即得微藻胞外多糖。所述微藻胞外多糖的纯度>70％。
微藻胞外多糖的应用，将所述微藻胞外多糖应用于生物吸附。所述生物吸附的对象为重金属离子，所述生物吸附包括吸附步骤和解吸附步骤。所述吸附步骤为：调整含金属离子溶液的pH值至1-7，向溶液中添加生物质吸附剂，即微藻胞外多糖；所述微藻胞外多糖的添加量为每升溶液10-40克；搅拌，过滤，得到富集了金属离子的吸附物；所述解吸附步骤为：将上述富集了金属离子的吸附物加入到碱性碳酸钠溶液或盐溶液(如氯化钠)中进行解吸附。所述微藻胞外多糖为微拟球藻胞外多糖或裂壶藻胞外多糖。与常规化学吸附剂(如活性氧化铝等)相比，微藻胞外多糖作为重金属吸附剂时，无毒无污染，因此具有良好的生物安全性；同时吸附和再生操作简单，方便实用，方便产业化应用。
微藻胞外多糖的应用，将微藻胞外多糖用于制作微胶囊新型壁材。具体操作方法为：按照质量比囊芯物：壁材(微藻胞外多糖溶液)：乳化剂＝1:(2.5-2.98):(0.02-0.05)准备好，将囊芯物与乳化剂在40-60℃下搅拌20-40min形成稳定的预乳液，然后将作为壁材的微藻胞外多糖溶液在40-60℃并缓慢搅拌下，逐滴添加到预乳液中，经喷雾干燥获得微胶囊产品。所述多糖溶液为寇氏隐甲藻胞外多糖溶液或裂壶藻胞外多糖溶液。与现有技术相比，本发明所述的将微藻胞外多糖用于制作微胶囊新型壁材的方法，步骤大大简化，成本大幅度降低，为产业化的实现奠定了基础。
本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种从产PUFA的微藻发酵废液中制备胞外多糖的方法，打破了传统方法的“除藻细胞-浓缩-透析-醇沉-冷冻干燥”的工艺，具有所得藻多糖纯度高、提取效率高、工作条件温和、可连续操作等优点。
2.使用本方法获得的微藻胞外多糖具有纯度高的特点，同时降低了PUFA生产工艺中废水的处理量，使其更加绿色环保。
3.本发明所得的微藻胞外多糖可以应用于多种行业，如用作生物吸附剂，食品微囊粉壁材等，大大提高了该微藻胞外多糖的经济价值。
附图说明
图1是从产PUFA的微藻发酵废液中制备胞外多糖的工艺流程。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：裂壶藻发酵废液制备胞外多糖
本发明裂壶藻胞外多糖提取方法按下述步骤进行：
1、裂壶藻培养液来源：将保存在甘油管的藻株裂壶藻SD006(CGMCC No：8383)接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养24h，获得一级种子；将一级种子接入二级种子培养基，在28℃的摇床中，以200rpm的转速，培养12h，获得二级种子。种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，柠檬酸钠0.5g/L，海水晶15g/L；将二级种子液加入培养培养基中，葡萄糖120g/L，酵母提取物15g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁5g/L，海水晶15g/L，维生素B1 30mg/L，维生素B6 30mg/L，维生素B125mg/L，生物素2mg/L。温度控制在28℃，pH值保持在6.5，通气量1.0VVM培养过程中，培养时间90小时。培养结束即为裂壶藻培养液。将所得裂壶藻培养液使用碟片式离心机进行固液分离，所得液体即为裂壶藻发酵废液。
2、微滤过滤：将上述裂壶藻发酵废液2500Kg通过微滤过滤，得到培养液的微滤透过液2050Kg和450Kg的湿菌体，透过液的透光率为87％。微滤过滤所用的膜材料是孔径为200nm的陶瓷膜，具体工艺条件是：操作温度为30-40℃，进压为1.5bar，出压为0.5bar，压力差为1.0bar。
3、超滤过滤：将步骤2所得的微滤透过液2050Kg通过超滤过滤得超滤透过液1750Kg和300Kg超滤浓缩液，超滤透过液的透光率为98％。超滤所用的膜材料是截留分子量为30000Da的PVDF的超滤膜，工艺条件是：操作温度为40℃，进压为7bar，出压为1bar，压力差为6bar。
4、浓缩：将步骤3超滤所得的超滤浓缩液300Kg在浓缩温度为40℃下继续将裂壶藻胞外多糖浓缩至固形物含量70％的胞外多糖浓缩浆18.5Kg。
5、真空干燥：将步骤4得到的18.5kg胞外多糖浓缩浆在真空度为-0.08MPa，干燥温度85℃的真空干燥箱进行烘干，干燥时间50h，得到10.5kg胞外多糖粗品(水分含量1％)。得到裂壶藻胞外多糖总糖含量70.71％，肽含量9.35％，单糖3.24％。
实施例2：寇氏隐甲藻发酵废液制备胞外多糖
本发明寇氏隐甲藻胞外多糖提取方法按下述步骤进行：
1、寇氏隐甲藻培养液来源：将保存在甘油管的藻株寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)SD401(CGMCC No：12239)接入种子培养基中，30℃，200rpm，培养30h，获得一级种子；将一级种子接入二级种子培养基，在30℃的摇床中，以200rpm的转速，培养24h，获得二级种子。种子培养基为葡萄糖30g/L，酵母提取物10g/L，玉米浆5g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁3g/L，柠檬酸钠0.5g/L，海水晶15g/L；将二级种子液加入培养培养基中，葡萄糖120g/L，酵母提取物20g/L，玉米浆15g/L，磷酸二氢钾8g/L，硫酸镁4g/L，海水晶15g/L，维生素B150mg/L，维生素B6 50mg/L，维生素B12 10mg/L，生物素5mg/L。温度控制在30℃，pH值保持在7.0，通气量1.2VVM培养过程中，培养时间110小时。培养结束即为寇氏隐甲藻培养液。将所得寇氏隐甲藻培养液使用碟片式离心机进行固液分离，所得液体即为寇氏隐甲藻发酵废液。
2、微滤过滤：将上述寇氏隐甲藻发酵废液3000Kg通过微滤过滤，得到培养液的微滤透过液2200Kg和800Kg的湿菌体，透过液的透光率为84％。微滤过滤所用的膜材料是孔径为20nm的陶瓷膜，具体工艺条件是：操作温度为15-20℃，进压为4.5bar，出压为1.0bar，压力差为3.5bar。
3、超滤过滤：将步骤2所得的微滤透过液2200Kg通过超滤过滤得超滤透过液1960Kg和240Kg超滤浓缩液，超滤透过液的透光率为95％。超滤所用的膜材料是截留分子量为2000Da的PAN的超滤膜，工艺条件是：操作温度为20℃，进压为10bar，出压为3bar，压力差为7bar。
4、浓缩：将步骤3超滤所得的超滤浓缩液240Kg在浓缩温度为80℃下继续将寇氏隐甲藻胞外多糖浓缩至固形物含量40％的胞外多糖浓缩浆30.7Kg。
5、真空干燥：将步骤4得到的30.7kg胞外多糖浓缩浆在真空度为-0.1MPa，干燥温度65℃的真空干燥箱进行烘干，干燥时间60h，得到9.8kg胞外多糖粗品(水分含量6％)。得到寇氏隐甲藻胞外多糖总糖含量72.35％，肽含量10.61％，单糖4.34％。
实施例3：微拟球藻发酵废液制备胞外多糖
本发明微拟球藻胞外多糖提取方法按下述步骤进行：
1、微拟球藻培养液来源：将保存的藻株微拟球藻(Nannochloropsis sp.)接入种子培养基中，25℃，200rpm，培养60h，获得种子。种子培养基为BG11培养基，其中硝酸钠1.5g/L，磷酸氢二钾400mg/L，硫酸镁375mg/L，柠檬酸50mg/L，柠檬酸铁铵24mg/L，硝酸钴0.05mg/L，海水晶15g/L。将种子接入管道式培养系统后，温度控制在25℃，pH值保持在7.0，通入足量空气，二氧化碳气通入量为0.5％，培养时间200小时左右。培养结束即为微拟球藻培养液。将所得微拟球藻培养液使用管式离心机进行固液分离，所得液体即为微拟球藻发酵废液。
2、微滤过滤：将微拟球藻发酵废液3500Kg，通过微滤过滤，得到培养液的微滤透过液3290Kg和170Kg的湿菌体，透过液的透光率为82％。微滤过滤所用的膜材料是孔径为500nm的陶瓷膜，具体工艺条件是：操作温度为15-20℃，进压3.5bar，出压1.0bar，压力差为2.5bar。
3、超滤过滤：将步骤2所得的微滤透过液3290Kg通过超滤过滤得超滤透过液2850Kg和340Kg超滤浓缩液，超滤透过液的透光率为91％。超滤所用的膜材料是截留分子量为10000Da的PP的超滤膜，工艺条件是：操作温度为30℃，进压为8.0bar，出压为2.5bar，压力差为5.5bar。
4、浓缩：将步骤2超滤所得的超滤浓缩液340Kg在浓缩温度为70℃下继续将微拟球藻胞外多糖浓缩至固形物含量50％的胞外多糖浓缩浆67.2Kg。
5、真空干燥：将步骤3得到的67.2kg胞外多糖浓缩浆在真空度为-0.09MPa，干燥温度70℃的真空干燥箱进行烘干，干燥时间50h，得到11.5kg胞外多糖粗品(水分含量4％)。得到微拟球藻胞外多糖总糖含量73.52％，肽含量8.73％，单糖2.87％。
实施例4：微拟球藻胞外多糖用作生物吸附剂
微拟球藻胞外多糖对金属离子的吸附步骤为：获取含金属离子的溶液，调整溶液的pH值为2，向溶液添加实施例3制备的生物质吸附剂(微拟球藻胞外多糖)，所述生物质吸附剂的添加量为每升溶液20克，搅拌过滤得到富集有金属离子的生物质吸附剂。经测量，微拟球藻胞外多糖的吸附率可达89.4％。此外，此胞外多糖在PH＝14时吸附率只有26.3％，PH＝6时吸附率为76.4％，PH＝4时的吸附率为80.9％，PH＝1时的吸附率为94.2％。
解吸附的步骤为：将上述吸附了金属离子的吸附剂加入到碱性溶液或盐溶液中进行解吸附，测量微拟球藻吸附剂的解吸附率。微拟球藻吸附剂在0.3mol/L的碳酸钠溶液中、25℃的条件下进行，解吸附率为97.5％，而在氯化钠盐溶液中的解吸附率为85.9％。
实施例5：裂壶藻胞外多糖用作生物吸附剂
裂壶藻胞外多糖对金属离子的吸附步骤为：获取含金属离子的溶液，调整溶液的pH值为3，向溶液添加实施例1制备的生物质吸附剂(裂壶藻胞外多糖)，所述生物质吸附剂的添加量为每升溶液15克，搅拌过滤得到富集有金属离子的生物质吸附剂。经测量裂壶藻胞外多糖的吸附率可达92.6％。此外，此胞外多糖在PH＝12时吸附率为30.5％，PH＝5时吸附率为63.1％，PH＝1时的吸附率为95.8％。
解吸附的步骤为：将上述吸附了金属离子的吸附剂加入到碱性溶液或盐溶液中进行解吸附，测量裂壶藻吸附剂的解吸附率。裂壶藻吸附剂在0.1mol/L的碳酸钠溶液中、25℃的条件下进行，解吸附率为93.7％，而在氯化钠盐溶液中的解吸附率为87.5％。
实施例6：寇氏隐甲藻胞外多糖用于制备微胶囊
以寇氏隐甲藻胞外多糖作为壁材：将DHA油脂、吐温80边搅拌边加到明胶溶液中，600rpm、40℃下搅拌40min形成稳定的预乳液，然后将实施例2制备的寇氏隐甲藻胞外多糖溶液在600rpm、40℃下逐滴添加到预乳液中，此时预乳液中含有50g/L明胶、50g/L寇氏隐甲藻胞外多糖、40g/L DHA油脂、2g/L吐温80，余量为水。600rpm下，反应1h，经喷雾干燥得到寇氏隐甲藻胞外多糖DHA油脂微胶囊产品。
所得微胶囊产品中，DHA油脂的含量为26.7％。
实施例7：裂壶藻胞外多糖用于制备微胶囊
以裂壶藻胞外多糖作为壁材：将DHA油脂、吐温80边搅拌边加到明胶溶液中，400rpm、60℃下搅拌20min形成稳定的预乳液，然后将实施例1制备的裂壶藻胞外多糖溶液在400rpm、60℃下逐滴添加到预乳液中，此时预乳液中含有50g/L明胶、50g/L裂壶藻胞外多糖、33g/L DHA油脂、5g/L吐温80，余量为水。400rpm下，反应0.5h，经喷雾干燥得到裂壶藻胞外多糖DHA油脂微胶囊产品。
所得微胶囊产品中，DHA油脂的含量为22％。
表1各种微胶囊产品的过氧化值(POV)
微胶囊产品的过氧化值数据是表示微胶囊被氧化程度的指标。过氧化值越高说明微胶囊被氧化程度越高，品质越差。
由表1可知，实施例6和实施例7所制备的各种微胶囊产品与普通明胶DHA微胶囊相比，其过氧化值(POV)的绝对值均降低了07-3.5meq/kg，相对值则降低了将近60％-80％。这说明，采用本发明制备的裂壶藻胞外多糖和寇氏隐甲藻胞外多糖制备的DHA微胶囊，抗氧化性能得到了显著提升，大大提升了微胶囊产品的品质，具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。

Claims (10)

1.采用产PUFA的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)将微藻培养液进行固液分离，得到的液体部分即为不含藻细胞的微藻发酵废液；
(2)将步骤(1)得到的微藻发酵废液通过微滤膜，得到微滤透过液；其中，微滤膜的孔径在0.02-0.5μm，温度为15-40℃，工作压力为：进压1.5-4.5bar，出压0.5-1.0bar；
(3)将步骤(2)中的微滤透过液通过超滤膜，得到超滤透过液和浓缩液，并收集浓缩液；其中，所述超滤膜的截留分子量为2000-30000Da，温度为20-40℃，工作压力为：进压7-10bar，出压1-3bar；
(4)将步骤(3)中的超滤浓缩液在40-80℃条件下进行浓缩，直至固形物含量为40-70％，得到浓缩浆；将所述浓缩浆进一步在65-85℃，真空压力-0.08--0.1Mpa的条件下烘干，至水分的重量分数为1-6％，即得微藻胞外多糖。
2.根据权利要求1所述的采用产PUFA的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的微滤所用膜为有机膜或陶瓷膜。
3.根据权利要求1所述的采用产PUFA的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法，其特征在于：步骤(3)中所述超滤膜的材料为聚丙烯腈PAN、聚碳酸酯PC、聚丙烯PP、聚偏氟乙烯PVDF、聚醚砜PES、聚乙烯PE、聚氯乙稀PVC和聚砜PS复合膜中的一种。
4.根据权利要求1所述的采用产PUFA的微藻发酵废液制备胞外多糖的方法，其特征在于：步骤(4)所得到的微藻胞外多糖的纯度>70％。
5.根据权利要求1所述的采用产PUFA的微藻发酵废液中制备胞外多糖的方法，其特征在于：所述微藻发酵废液为微拟球藻发酵废液、裂壶藻发酵废液或寇氏隐甲藻发酵废液。
6.如权利要求1所述的微藻胞外多糖的应用，其特征在于：将所述微藻胞外多糖应用于生物吸附；所述微藻胞外多糖为微拟球藻胞外多糖或裂壶藻胞外多糖。
7.根据权利要求6所述的微藻胞外多糖的应用，其特征在于：所述生物吸附的对象为重金属离子，所述生物吸附包括吸附步骤和解吸附步骤；所述吸附步骤为：调整含金属离子溶液的pH值至1-7，向溶液中添加生物质吸附剂，即微藻胞外多糖；所述微藻胞外多糖的添加量为每升溶液10-40克；搅拌，过滤，得到富集了金属离子的吸附物；所述解吸附步骤为：将上述富集了金属离子的吸附物加入到碱性碳酸钠溶液或盐溶液(如氯化钠)中进行解吸附。所述微藻胞外多糖为微拟球藻胞外多糖或裂壶藻胞外多糖。
8.如权利要求1所述的微藻胞外多糖的应用，其特征在于：所述微藻胞外多糖的溶液作为壁材，用于制备微胶囊。
9.根据权利要求8所述的微藻胞外多糖的应用，其特征在于：制备所述微胶囊所需的囊芯物、壁材、乳化剂的质量比为1：(2.5-2.98)：(0.02-0.05)。
10.根据权利要求8或9所述的微藻胞外多糖的应用，其特征在于：所述微藻胞外多糖溶液作为壁材，用于制备微胶囊的具体步骤为：将囊芯物与乳化剂在40-60℃下搅拌20-40min形成稳定的预乳液，然后所述将微藻胞外多糖溶液在40-60℃并缓慢搅拌下，逐滴添加到预乳液中，经喷雾干燥获得微胶囊产品；所述多糖溶液为寇氏隐甲藻胞外多糖溶液或裂壶藻胞外多糖溶液。
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