JPH08502023A

JPH08502023A - ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン溶液の分画

Info

Publication number: JPH08502023A
Application number: JP5519670A
Authority: JP
Inventors: ジー．エル．ショール，ロバート; チョー，ミアン−オク; ノー，クワン
Original assignee: エンゾン，インコーポレーテッド
Priority date: 1992-10-13
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1996-03-05
Also published as: EP0665850A4; US5478805A; CA2146869A1; AU678169B2; NZ254661A; AU4688093A; US5312808A; EP0665850A1; WO1994009027A1

Abstract

(57)【要約】約８５，０００ダルトンより大きな分子量とヘモグロビン分子当たり少なくとも５ポリアルキレンオキシド結合の置換度とを有するポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンを含有するヘモグロビン含有溶液は、哺乳動物におけるヘモグロビン尿症を随伴しない。ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンを同時に分画及び精製する方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン溶液の分画発明の背景本発明は、哺乳動物におけるヘモグロビン尿症の発生を実質的に回避するポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンに関する。本発明は、ポリアルキレンオキシド置換の度合いによって、複合化ヘモグロビンを分離すると同時にエンドトキシン及びリン脂質を除去する方法にも関する。近年、ヘモグロビンをベースとする血液代用物の開発が進んでいる。かかる輸血液は、酸素担体及び血漿増量剤として用いる全血又は分画血液への代用物として役立つ。全血及び分割血液の使用は、免疫又は非免疫反応及びエイズの如き感染症の危険のために、益々疎んじられている。ヘモグロビンへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の複合化はその抗原性を弱めて循環におけるその滞留時間を伸ばす。しかしながら、４０，０００ダルトン未満のヘモグロビン単量体サブユニットのＰＥＧ複合体を投与されている交換輸血ラットにおいて、肉眼ヘモグロビン尿症が、IwashitaとAjisaka，Organ-Dir ected Toxic.：Chem．Indicies Mech.，Proc．Symp.，（Brownら編，Pergamon， Oxford，England 1981），97-101によって報告された。ＰＥＧ複合化反応がヘモグロビン四量体の単量体サブユニットへの解離をもたらしていたのである。５０，０００ダルトンを越える分子量を有する複合体を輸血した場合には、ヘモグロビン尿症は認められなかった。AjisakaとIwashita，Biochem ．Biophys．Res．Commun.，97（3），1076-81（1980）は、これら単量体ヘモグロビンサブユニットのＰＥＧ複合体が９．５と１２ｍｍＨｇの間にＰ５０を有することを開示した。そのような高い酸素親和性は、酸素を組織に送達するには効果がない。 IwasakiとIwashita，Artif．Organs，10（5），411-16（1986）は、ピリドキサール化されたＰＥＧ−ヘモグロビン複合体の調製を開示している。この複合体は、１２３，０００±１８，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、ヘモグロビン分子当たり４〜５のＰＥＧが複合化している。しかしながら、この物質は、ラットに輸血した場合、依然として２４時間で尿中へ５％を排泄した。米国特許第４，３０１，１４４号は、約３００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリアルキレンオキシドとの種々のポリアルキレンオキシドヘモグロビン複合体を開示している。その置換度は、ヘモグロビン分子当たり約４〜約１２０ポリアルキレンオキシド結合である。この複合体は、未修飾ストローマ不含ヘモグロビンよりも２〜４倍長い循環半減期を有するとして開示されている。米国特許第４，４１２，９８９号は、ポリアルキレンオキシドに複合化した種々のエフェクター分子修飾ヘモグロビンを開示している。これらポリアルキレンオキシドは、約３００〜約２０，０００ダルトンの分子量とヘモグロビン当たり約１〜約２０結合の置換度を有している。循環半減期がストローマ不含ヘモグロビンより４〜７倍長いことが報告されている。米国特許第４，６７０，４１７号は、米国特許第４，３０１，１４４号及び第４，４１２，９８９号のヘモグロビン−ポリアルキレンオキシド複合体が、ポリアルキレンオキシドとの反応の間にそのヘモグロビンも変性してしまうので、適していないことを報告している。カルボキシルアルキレンエーテル基を有するポリアルキレンオキシドへの種々のヘモグロビンの複合体は、溶液として与えられる。二量体又は三量体分子間架橋複合体が形成されるかどうかに依って、ヘモグロビン当たり４〜６のポリアルキレンオキシド結合が形成される。それら開示されたポリアルキレンオキシドは３００〜２０，０００ダルトンの分子量の範囲であり、ヘモグロビンはエフェクター分子で修飾されていてもよい。しかしながら、カルボキシルアルキレンエーテル結合によるヘモグロビンへのポリアルキレンオキシドの複合化は、商業的に非現実的である。如何なる特定の理論にも拘束されないが、この先行技術は、特定の低分子量ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体がヘモグロビン尿症の原因であるという可能性を見逃していると考えられる。今回、８５，０００ダルトンより大きな分子量と５又はそれを越えるポリアルキレンオキシド結合の置換度を有するポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体で、このポリマーとヘモグロビンとの間に用いられる結合に関係なく、ヘモグロビン尿症が実質的に除去されることが発見された。この分子量的特徴は、置換度と組み合わさって、形状、嵩及び／又は電荷によって腎臓の濾過を立体的に妨害し、かくして哺乳動物におけるヘモグロビン尿症を容易には起こさないポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン分子を提供するのである。発明の要旨従って、本発明によれば、約８５，０００ダルトンより大きな分子量とヘモグロビン分子当たり少なくとも５ポリアルキレンオキシド結合の置換度を有するポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンを含有する溶液が提供される。本発明の溶液は、哺乳動物におけるヘモグロビン尿症を随伴しない。本発明は、雑多な置換度のポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体を含有する溶液を分画する方法も包含する。この方法は、複合化ヘモグロビン分子の等電点がポリアルキレンオキシド置換の度合いによって変動するという事実を利用するものである。本法は、置換度が多様なポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体は、多様なアニオン固定相に結合できるという事実を利用するものである。緩衝液イオン強度及びｐＨの適当な条件下での溶離によって、これら複合体を置換度だけが異なる画分に分割することができる。意外にも、混合ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体の溶液の分画に適するアニオン固定相及び条件もその結合をもたらし、かくして、その溶液からのＤＮＡ、エンドトキシン又はリン脂質の如き生理学的に許容できない物質を除去できることも発見された。従って、本発明は、ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン（ＰＡＯ−Ｈｂ）複合体を同時に分画及び精製する方法を提供する。この方法は：溶液中のＰＡＯ−Ｈｂ複合体を、約８５，０００ダルトン未満の分子量とヘモグロビン分子当たり５未満のポリアルキレンオキシド結合の置換度とを有するＰＡＯ−Ｈｂ複合体及び生理学的に許容できない物質に選択的に結合する能力があるアニオン交換樹脂に接触させて、約８５，０００ダルトンより大きな分子量とヘモグロビン分子当たり５ポリアルキレンオキシド結合より高い置換度を有する複合化ヘモグロビンの画分がその樹脂に結合しないようにし；そしてその樹脂に結合しない複合化ヘモグロビンの画分を回収することを含む。好ましくは、この同時分画／精製法を行うのに用いられるアニオン交換樹脂は、４級アミンで被覆される。上記の方法は、本発明のポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体をより低分子量でより低置換の画分から分離するので、あらゆるエンドトキシン又はリン脂質の複合体の最終精製としても役立つ。本発明の結果として、先行技術の方法に随伴するヘモグロビン尿症及び他の毒性の問題を実質的に回避するヘモグロビン溶液を提供することが可能である。更に、単一のアニオン交換クロマトグラフィー樹脂−溶離緩衝液の組み合わせで、このＰＡＯ−Ｈｂ複合体を正確な分子量範囲及び置換度のものに精製及び分画することができる。好ましい態様の詳細な説明本発明のポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン（ＰＡＯ−Ｈｂ）複合体は、哺乳動物に投与したときに先行技術組成物に随伴するヘモグロビン尿症の問題を克服するものである。これら複合体は、好ましくは、生理学的に許容できる溶液で投与される。これら複合体は、約８５，０００ダルトンより大きな分子量と５又はそれより高いポリアルキレンオキシドの置換度とを有する。本発明の溶液中におけるＰＡＯ−Ｈｂ複合体の量は、技術者の必要に応じて変動してもよい。しかしながら、殆どの状況においては、このヘモグロビン溶液は、約１．０〜約１０．０重量％のポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体を含有すると考える。より好ましい溶液は、約３．０〜約７．０重量％、最も好ましくは、約４．０〜約６．０重量％の複合体を含有する。平均置換度、従って平均分子量は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）測定法によって測定することができる。この技術は周知であって、本質的に慣用的なものである。分子量は、結合の平均数にポリアルキレンオキシドの分子量を乗じることによって決定される。次いで、これをヘモグロビンの分子量、つまり約６４，０００ダルトンに加える。分子量は、マルチライトチャネルレーザー光散乱法によって測定してもよい。この方法も本質的に慣用的なものである。分子量及び置換度は、溶液の粘度がその溶液を投与される哺乳動物の生理学的血液粘度を越えないように選ばれるべきである。ヒトについては、この粘度は３７℃で約４．５から約５．０ｃｐｓの範囲である。好ましい溶液は、約９０，０００〜約１２０，０００ダルトンの分子量、最も好ましくは約９５，０００〜約１１０，０００ダルトンの分子量を有するポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体を含有する。これら溶液は、好ましくは、この好ましい範囲を下回る分子量を有するポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体を実質的に含まない。また、好ましい溶液は、ヘモグロビン分子当たり少なくとも約９結合の平均置換度を有する複合体に制限される。より好ましい溶液は、ヘモグロビン分子当たり少なくとも約１１結合の平均置換度を有する複合体に制限される。これら好ましい溶液は、この好ましい範囲を下回る置換度を有するポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体を実質的に含まない。本発明の目的のために、実質的に含まないとは、これら溶液が、上記の分子量及びポリアルキレンオキシド置換度パラメーターを下回るヘモグロビン複合体を約５重量％を越えては含有しないこと、好ましくは、かかる種を約１重量％未満しか含有しないことを意味する。加えて、本発明の溶液は、１８より高い平均置換度を有するＰＡＯ−Ｈｂ複合体も実質的に含まない。かかる重度に複合化した種はヘモグロビン尿症を随伴しない一方で、それらはヘモグロビンの目的のための及び／又は哺乳動物組織への酸素供給のための最適さに劣ると考えられる。かかる種は、当該技術分野の熟練の範囲内でＰＡＯ−Ｈｂ複合化反応及び／又は分離法を制御することにより本発明溶液から除くことができる。これらポリアルキレンオキシドには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール及びそれらのブロック共重合体が含まれる。本発明に用いるのに適するには、ポリアルキレンオキシドは、室温で水に溶解しなければならない。従って、ブロック共重合体のブロック共重合度は、室温でポリマーを非水溶性にするほど大きなものであるべきではない。約１，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリアルキレンオキシドが、本発明に用いるのに適している。約２，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量を有するポリアルキレンオキシドが好ましい。これら複合化ヘモグロビンは、必要性に依って、あらゆる適切な哺乳動物源、つまりヒト又は非ヒトからのヘモグロビンから調製することができる。現時点で最も商業的に現実味のあるヘモグロビンは、ヒト及び反芻動物ヘモグロビン、特にウシヘモグロビンである。ヒトヘモグロビンは、ヒト全血から得ることができ、採血したばかりのものであっても血液銀行の古い供給物からのものであってもよい。ヒトヘモグロビンは、胎盤からでもヒト血液ドナーセンターから得られるパックされた赤血球からでも得ることができる。ヘモグロビンは、トランスジェニック家畜動物又は細胞の樹立を含む組換え法により産生させることもできる。かかるトランスジェニック動物は、野生型ヒト、変異ヒト又は突然変異誘発ヒトヘモグロビンを発現することができる。本発明の溶液は、多様な複合化ヘモグロビンの混合物を含有することもできる。ウシ又はヒツジの如き反芻動物ヘモグロビンも有用である。ウシヘモグロビンは、例えば、屠殺場から得られる。動物源の選択は臨界的ではなく、むしろ商業的需要に基づいてなされるであろう。本発明の生成物は、獣医的最終用途も有している。従って、多様な動物源が本発明の生成物及び方法に適している。ヘモグロビンを赤血球から抽出する方法は決定的ではない。抽出されたヘモグロビンは、好ましくは、ゲル血餅又は動的濁度リムルスアメーバ様細胞分解産物（ＬＡＬ）測定法により測定して約９．１ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシン濃度しか有さない。そのリン脂質レベルは、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）脂質測定法により測定して検出されない。しかしながら、０．５０ｍｇ／ｍＬまでのリン脂質レベルが許容されるが、ここに記載した方法に従って除いてもよい。好ましくは、ヘモグロビンは、１９９２年７月１４日に出願された、係属中で普通に所有されている米国特許出願第９１３，１３８号に開示された方法により分離される。なお、この出願のこの開示内容は、それへの参照によってここに組み入れられるものとする。ヘモグロビンは、好ましくは、この特許出願に開示された方法によりエンドトキシン及びリン脂質についても精製されている。この複合体は、ポリアルキレンオキシドのヒドロキシル末端及びヘモグロビンのリシン残基のフリーのアミノ基を共有結合させることによって形成される。ヒドロキシル末端ポリマーをタンパク質又はポリペプチドのフリーのアミノ基と複合化させるあらゆる当該技術分野で認識されている方法が、本発明で用いるのに適している。典型的には、まず、末端ヒドロキシル基を活性化させる。これは、フリーのアミノ基と反応できる機能性誘導体へのヒドロキシル基の転化を意味している。ポリアルキレンオキシド活性化の一例は、普通に所有されているDavisへの米国特許第４，１７９，３３７号に開示されたポリアルキレンオキシドの塩化シアヌル活性化である。なお、この特許の開示内容は、それへの参照によってここに組み入れられるものとする。ポリアルキレンオキシドを活性化するもう１つの当該技術分野で認識されている方法では、対応するスクシニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する。この周知の操作は、Abuchowskiら，Cancer B iochem．Biophys.，7，175-86（1984）に開示されている。本発明の好ましい側面においては、タンパク質アミノ基と活性化ポリアルキレンオキシドとでウレタン結合が形成される。好ましくは、このウレタン結合は、普通に所有されている米国特許第５，１２２，６１４号に記載されているように形成される。なお、その開示内容は、参照によってここに組み入れられるものとする。この特許は、ポリアルキレンオキシドのＮ−スクシンイミドカーボネート誘導体の形成を開示している。ヘモグロビンとポリアルキレングリコールのＮ−スクシンイミドカーボネートとの複合体も、１９８９年１１月２２日に出願された係属中で普通に所有されている米国特許出願第４４０，５５３号及び１９９０年１１月２０日に出願された親出願の米国特許出願第６１６，１２９号に記載されているように調製することができる。これら出願の開示内容は、参照によってここに組み入れられるものとする。しかしながら、出願第４４０，５５３号に開示された脱酸素工程及び出願第６１６，１２９号に開示された部分脱酸素工程は、今日では、任意なもので所望により省略してもよい。複合化方法に関わらず、この反応は、複合化の度合いが変動するポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンの混合物を形成する。この混合物には、少量の残留未複合化ポリアルキレンオキシド及びヘモグロビンも含まれる。この混合物は、典型的には、リン酸、塩素及び重炭酸アニオンの１種又は２種以上を含有する反応緩衝液中の溶液で存在する。ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン（ＰＡＯ−Ｈｂ）反応生成物の混合物は、好ましくは、約１．０〜約１０．０重量％ＰＡＯ−Ｈｂ複合体を含有する緩衝溶液中で分画される。適する溶液は、約８．０〜約９．０、好ましくは約８．７〜約９．０のｐＨを有する。この緩衝液は、約２５〜約１１０ミリオスモル／ｋｇの重量オスモル濃度も有する。約３３〜約１００ミリオスモル／ｋｇの重量オスモル濃度範囲が好ましく、約６７〜約１００ミリオスモル／ｋｇの範囲が特に好ましい。この溶液は、好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ＮａＨ₂ＰＯ₄、ＮａＨＣＯ₃、ＮａＢＯ₄、（ＮＨ₄）₂ＣＯ₃及びグリシンＮａＯＨから選択される１又は２以上の緩衝性塩を含有する。ホウ酸ナトリウム緩衝液が本発明に用いるのに適している。用いられる反応緩衝液に依存して、複合化ヘモグロビンの溶液を最初に緩衝交換しなければならない。この緩衝交換により、分画に要する重量オスモル濃度を有する溶液が与えられる。しかしながら、かかる交換は本質的に慣用的なものであり、例えば、限外濾過によって行うことができる。典型的には、ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン溶液を低分子量カットオフ（３０，０００〜５０，０００ダルトン）膜で限外濾過する。ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン（ＰＡＯ−Ｈｂ）複合体の分画は、好ましくは、溶液中のＰＡＯ−Ｈｂ複合体を、８５，０００ダルトン未満の分子量及びヘモグロビン分子当たり５ポリアルキレンオキシド結合未満の置換度を有する複合体に選択的に結合できるアニオン交換媒体と接触させることにより行われる。この分画は、種々の置換度の複合化ヘモグロビン分子が、やはり幾分予測可能な様式で変動する等電点を有するであろうという事実によって達成される。例えば、ヘモグロビンの等電点は、そのタンパク質の表面上で利用可能なリシン残基の数によって決定される。これらリシン残基は、ポリアルキレンオキシド結合の結合点としても役立つ。従って、ヘモグロビンへのポリアルキレンオキシド結合の置換度が増加するにつれて等イオン点が低下し、アニオン交換樹脂に結合するポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体の能力は弱まる。極性の強いアニオン交換樹脂を用いることは、本発明の方法に特に好ましい。この理由によって、４級アミン被覆アニオン交換樹脂が用いられる。４級アミン樹脂はポリマー性又はシリカ性マトリックスのいずれに被覆してもよいが、ポリマー性マトリックスが好ましい。支持マトリックス上に被覆された多くのテトラメチルアミン、若しくは４級メチルアミンアニオン交換樹脂が市販されている。本発明で用いるのに適する市販の４級アニオン交換樹脂に含まれるものは、ポリマーマトリックス上に４級アミン樹脂を被覆した、フランス，ガレン（Garenne ）のＩＢＦにより製造されている、マサチューセッツ州モールバラのSepracorのたックス上にテトラメチルアミノエチル樹脂を被覆した、ニュージャージー州ギブスタウンのEM-Separatorsにより製造されていミン樹脂を被覆した、ぺンシルバニア州モントゴメリービルのる。マサチューセッツ州ミルフォードのMilliporeにより製造されているQMA Acc ell及びニュージャージー州フィリップスバーグのJTBakerにより製造されている PEI樹脂も用いることができる。混合ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体の溶液を分画するには、ＨＰＬＣよりもむしろ慣用的な液体クロマトグラフィーが好ましく用いられる。即ち、ＨＰＬＣの技術は、ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンの混合溶液の分画には決定的ではない。慣用的な液体クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣよりも容易に商業的大規模生産技術に適合できる。更に、装置、処理時間のコストの軽減及びエンドトキシン汚染の危険性の軽減により、大きな経済的利益も得られる。クロマトグラフィーカラムは、軸方向又は半径方向に流れるように設計され、そして約１．６〜約１０００ｃｍの直径を有するベきである。カラムの長さは、約５〜約１０００ｃｍであるべきである。かかるカラムは、典型的には、約１ｍＬ〜約７８５Ｌのアニオン交換クロマトグラフィー樹脂を保持するであろう。クロマトグラフィー装置、アニオン交換樹脂、及び緩衝液は、標準操作を用いて発熱物質不含化されるべきである。典型的には、アニオン交換樹脂を慣用手段によりカラムに詰めて平衡にする。複合化ヘモグロビン溶液と同じｐＨ及び重量オスモル濃度を有する緩衝液が用いられる。次いで、複合化ヘモグロビン溶液を分当たり約０．１〜約０．５Ｌの速度でカラムに吸着させる。充填が終了したら、そのカラムに溶離緩衝液を流して、ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンの画分を溶離する。これら画分は、本質的に均質な分子量と置換度の画分である。この溶離方法は決定的なものではなく最終ユーザーのニーズに依存するであろう。８５，０００ダルトンより大きな分子量と５又はそれを越えるポリアルキレンオキシド結合の置換度とを有する好ましいポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン画分を回収する。この画分は、上記範囲内のｐＨ及び重量オスモル濃度を有する溶離緩衝液の無勾配流を用いる一工程溶離法により得ることができる。溶離緩衝液は、好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ＮａＨ₂ＰＯ₄、ＮａＨＣＯ₃、ＮａＢＯ₄及び（ＮＨ₄）₂ＣＯ₃から選択される１又は２以上の塩を含有する。好ましい画分は、低分子量複合体及び４又はそれより少ないポリアルキレンオキシド結合を有するヘモグロビンを実質的に含まない。次いで、低分子量低結合種、並びにあらゆる未複合化ヘモグロビンを慣用技術によりカラムから逆流洗浄してもよい。上記重量オスモル濃度範囲内で濃度が上昇してゆく勾配溶離法及び複数無勾配工程を用いる技術も用いることができる。濃度が上昇してゆく勾配工程及び複数無勾配溶離工程は、ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体の画分の継続的溶離をもたらすであろう。各画分内のポリアルキレンオキシド結合の度合いは実質的に均質となろう。しかしながら、各画分についてのポリアルキレンオキシド結合の度合いは、溶離時間とともに低下するであろう。フロースルー（flow-through）クロマトグラフィーの技術も用いることができ、その場合は、まず、複合化ヘモグロビン溶液と同じｐＨと重量オスモル濃度を有する緩衝液で慣用手段によりカラムを平衡にする。次いで、複合化ヘモグロビン溶液を、分当たり約０．１〜約０．５Ｌの速度でカラムに充填する。ヘモグロビン尿症に関係する結合度を有するヘモグロビン複合体はカラムに結合する一方で、ヘモグロビン尿症を起こさない複合体は流れ抜けて即座に回収される。フロースルークロマトグラフィーに好ましい緩衝液は、２０ｍＭＮａＨＣＯ₃ である。好ましいクロマトグラフィー樹脂は、ポリマーマトリックス上に４級アミン樹脂を被覆した、ぺンシルバニア州モントゴメリービルのTosoHaasにより及びフロースルークロマトグラフィー法は本質的に慣用的なものなので、不当に実験をしなくても、当業者は、開示した緩衝液及びクロマトグラフィー樹脂で本発明方法に適用することができる。溶離の温度範囲は約４〜約２５℃である。好ましくは、約６〜約１５０℃、最も好ましくは約８℃で溶離を行う。ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン画分の溶離は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収により検出する。画分回収は、単純時間溶離グラフによって行ってもよい。次いで、好ましいヘモグロビン画分をプールして、ポリアルキレンオキシド− ヘモグロビン複合体の溶離緩衝液中の溶液を得る。これら複合体は、約８５，０００ダルトンより大きな分子量と５又はそれを越える結合の置換度とを有する。典型的には、プールした画分は、約１．０〜約１０．０重量％のポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体の濃度を有するが、実際の量は変動するであろう。プールしたヘモグロビン画分を、好ましくは、当業者にとって周知である担体の如き生理学的に許容できる製剤上の担体に含める。例えば、生理学的に許容できる製剤上の担体は約７．８のｐＨを有してもよく、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、Ｎａ₂ＨＰＯ₄（３ｍＭ）及びＮａＨＣＯ₃（３０ｍＭ）を含有するリン酸／生理食塩水緩衝系が含まれる。必要に応じて、プールした画分を、限外濾過の如き緩衝液交換技術により生理学的に許容できる製剤上の担体に移してもよい。複合化ヘモグロビン画分の回収後、そのクロマトグラフィーカラムを洗浄して、カラムに結合した物質を除去するべきである。次いで、カラムを再び平衡にして、次に分画されるポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンを充填する準備をしてもよい。本発明は、上記の分画法を行うと、アニオン交換樹脂への結合によって生理学的に許容できない物質も同時に除去され得るという意外な発見も包含する。例えば、ＤＮＡ、エンドトキシン又はリン脂質の如き生理学的に許容できない普通に存在する副生成物がアニオン交換樹脂に結合することが見出された。かくして、ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンは、分画されると同時に精製されもする。しかしながら、アニオン交換樹脂と接触させる前に、ＰＡＯ−Ｈｂ複合体及びそれを含有する溶液がこれら不純物を実質的に含まないようにするのが好ましい。好ましい方法の例は以下の通りである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合化したウシヘモグロビンの４ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０±０．１中の５〜６重量％溶液約２４Ｌを、長さ６０ｃｍ、直径２５ｃｍの液体クロマトグラフィーカラムに充填する。このカラムには、 DEAE-spherodex（フランス，ガレンのＩＢＦによるもの）の如き４級アミンアニオン交換樹脂３０Ｌが詰められており、上記緩衝液で平衡にされている。ＰＥＧ −ヘモグロビン溶液を分当たり０．５０Ｌの速度で充填し、それが完全に吸着されたら、この緩衝液を無勾配で流し始めてこのカラムからＰＥＧ−ヘモグロビンを溶離させる。ヘモグロビン分子当たり約６〜約１１ＰＥＧ結合の結合度を有するＰＥＧ−ヘモグロビン画分の溶離をＵＶ検出器で検出する。この時点で、溶離液の回収を始めて、溶離液ＰＥＧ−ヘモグロビンピークがピーク振幅の５パーセントまで低下するまで続ける。上記の操作により、プールしたときに、一般に約１．０〜約１０．０重量％、典型的には２．０重量％の濃度範囲内のＰＥＧ−ヘモグロビン濃度を有するＰＥＧ−へモグロビン画分が一般に生成する。このプール画分は、典型的には、ゲル血餅又は動的濁度ＬＡＬ測定法により測定して、０．１ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンレベルを有する。リン脂質レベルは、ＨＰＬＣ液体測定法により測定して検出されない。次いで、この画分のプールを標準技術を用いて将来使用するために約−２０℃の温度で長期間保存しても、すぐに使用するために２〜８℃の温度で保存してもよい。本法を他のポリマー−ヘモグロビン複合体を分画するのに適用して、そのポリマー複合体をポリマー置換度のみが異なる画分に分割することができる。上記ｐＨ及び重量オスモル濃度の緩衝液を用いると、この方法は、ＤＮＡ、エンドトキシン及びリン脂質の如き生理学的に不適合な物質についてかかる他のポリマー− ヘモグロビン複合体の精製をもするであろう。本発明のこの側面は、ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが分画され、同時に、ＤＮＡ、エンドトキシン及びリン脂質の如き不要な物質について精製され得る多才な方法を提供する。これは、不純物を実質的に含まず、かつ哺乳動物においてヘモグロビン尿症が起こるのを実質的に回避できるポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン複合体の単離を可能にする。薬学的に許容できる製剤上の担体中のこれら複合体の溶液が、ヘモグロビンをベースとする無細胞輸血液として用いるのに特に適している。かかる輸血液は、酸素担体及び血漿増量剤として用いるための全血又は分画血液への代用物として許容できる。以下の非限定的実施例は、本発明の一定の側面を説明するものである。これら実施例は、本発明の有効範囲を制限することを意図したものではない。全ての部及びパーセンテージは特に断らない限り重量基準であり、全ての温度は摂氏である。実施例実施例１ウシヘモグロビン−ポリエチレングリコール複合体の調製凍結ウシヘモグロビン（ｂＨｂ）（１２．４％，２５Ｌ）を４℃で一晩解凍した。この解凍ｂＨｂを２５Ｌの反応緩衝液（０．８ＭＮａＣｌ及び０．２ＭＮａ₂ＨＰＯ₄）と混合して５０Ｌの６．２％ｂＨｂ溶液にした。温度を８℃±０．２℃に維持しながら、１ＭＫＨ₂ＰＯ₄溶液を添加することによってｐＨを７．８に調節した。このヘモグロビン溶液を、ガス透過膜を用いて窒素ガス気流下で脱酸素して、７５〜８０％デオキシｂＨｂのレベルを達成した。米国特許第５，１２２，６１４号の方法に従って調製した１２モル過剰のポリエチレングリコール −スクシンイミジルカーボネート（ＳＣ−ＰＥＧ）をこのデオキシｂＨｂ溶液に添加して、その反応混合液を８℃で２時間攪拌した。ＰＥＧ反応が完了したときに、３０ｍＭシステインをこの反応溶液中に添加して、１ＭＫＨ₂ＰＯ₄又はＮａＯＨのいずれかでｐＨを８．０＋０．１に調節した。次いで、この反応溶液を０．２２ミクロンDuraporeフィルターを用いて濾過した。次いで、限外濾過装置（Ce ntrasette30K）を用いて、この反応溶液を３．３ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０ ±０．２）と緩衝液交換した。実施例２３０×６０ｃｍカラムに３．３ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０±０．１）中の３０ＬのＤＥＡＥ−spherodex（フランス，ガレンのＩＢＦ）を詰めた。このカラムを０．２ＮＮａＯＨで発熱物質不含化して、４カラム容量（１２０Ｌ）の発熱物質不含の３．３ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡にした。ＰＥＧ− ｂＨｂについてのＤＥＡＥ−spherodexの能力を測定したら４０ｍｇ／ｍｌであった。実施例１のＰＥＧ−ｂＨｂの５重量％溶液２４Ｌをこのイオン交換カラムに充填した。残りのＰＥＧ−ｂＨｂ溶液を−２０℃で保存した。このカラムを３カラム容量（９０Ｌ）の３．３ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０±０．１）で洗浄して未反応ＰＥＧを除いた。次いで、ＰＥＧ−ｂＨｂを７０Ｌの１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で溶離した。次いで、この溶離ＰＥＧ−ｂＨｂを配合緩衝液中への限外濾過によって緩衝液交換した。この配合緩衝液は、次の塩を５５０Ｌの蒸留水に溶解することによって調製したものである。次いで、１ＭＫＨ₂ＰＯ₄（ＨＣｌ又はＨ₃ＰＯ₄も用いることができるだろう）を添加することによってこの配合緩衝液のｐＨを７．８±０．１に調節した。次いで、イオン交換カラムから回収した精製ＰＥＧ−ｂＨｂ溶液の容量を５０Ｌ蒸留水及び１０Ｌ配合緩衝液を詰め込んだ５０Ｋ Centrasette（Filtron）を用いて約５±０．１重量％ＰＥＧ−ｂＨｂに濃縮することにより、緩衝液交換を行った。５５０Ｌ配合緩衝液（２０倍）を使い切るまで限外濾過を継続した。この透析が完了したことをチェックしてから、得られた溶液をDuraporeフィルター（０．２２ミクロン，Millipore）で３００ｍＬ血液バッグ中に滅菌濾過して−２０℃で保存した。ＰＥＧ−ｂＨｂの結合度を周知技術であるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）測定法により測定すると約９であった。この溶液はリン脂質を含んでいなかった。実施例３６７ｍＭホウ酸緩衝液を溶離緩衝液として用いた以外は、実施例２の操作に従ってＰＥＧ−ｂＨｂ溶液を分画した。溶離画分の平均結合度は、ＴＮＢＳ測定法によって測定して、ヘモグロビン分子当たり１１ＰＥＧであった。実施例４実施例１のＰＥＧ−ｂＨｂを蒸留水で透析して過剰の塩を除いた。この透析ＰＥＧ−ｂＨｂを、１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄緩衝溶液（ｐＨ８．０３）で前もって平衡にしておいたＤＥＡＥ−spherodexカラムに充填した。このカラムを２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄緩衝溶液（ｐＨ８．０３）で連続的に溶離した。回収した画分を遠心分離により濃縮した。溶離緩衝液の濃度が上昇するにつれて、画分の結合度が低下するのが確認された。実施例５ここに記載した通りに調製した幾つかのＰＥＧ−ｂＨｂ溶液を交換輸血（E.T. ）により実験用ラットに投与した。この実施例では、種々のＰＡＯ−Ｈｂ結合度の溶液を輸血して、本発明溶液を投与した哺乳動物においてヘモグロビン尿症が見られないことを証明した。試験結果を以下の表に示す。サンプルが異なる濃度であったので、同じ投与量にするために、動物達に異なるレベルで交換輸血を行った。これら溶液によっては、検出できる程度の尿細管壊死は生じなかった。ヘモグロビン尿症と腎傷害間の関係を調べるためにデザインされたヘモグロビン尿症実験で、組織病理学によって、５０％E.T.で０．１ｍｇＨｂ／ｍＬ尿未満を生じるＰＥＧ−Ｈｂは、検出できる程度の尿細管壊死を生じないのに反して、０．１ｍｇＨｂ／ｍＬ尿より多く生じるＰＥＧ−ｂＨｂは、温和な急性細管壊死をもたらすということが確認された。上の表から分かるように、上に示したサンプルは、腎毒性も病的ヘモグロビン尿症も随伴しない。請求の範囲に記載した本発明から逸れることなく、上記の特徴を変化させたもの及び組み合わせたものを多く利用することができる。かかる変更は、本発明の精神及び範囲から逸脱するものとみなされない。かかる修飾はすべて、以下の請求の範囲内に包含されると考える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ノー，クワンアメリカ合衆国 08873 ニュージャージー州ソマーセット，12ティーエイチストリート 32番地

Claims

【特許請求の範囲】１．約８５，０００ダルトンより大きな分子量とヘモグロビン分子当たり少なくとも５ポリアルキレンオキシド結合の置換度とを有するポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンを含むポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン含有溶液であって、哺乳動物におけるヘモグロビン尿症をもたらさない溶液。２．前記溶液中における前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンの濃度が約１〜約１０重量％である、請求項１の溶液。３．前記溶液中における前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンの前記濃度が約３〜約７重量％である、請求項２の溶液。４．前記溶液中における前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンの前記濃度が約４〜約６重量％である、請求項３の溶液。５．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが約９０，０００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１の溶液。６．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが約９５，０００〜約１１０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項５の溶液。７．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが、ヘモグロビン分子当たり少なくとも約９ポリアルキレンオキシド結合の平均置換度を有する、請求項１の溶液。８．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが、ヘモグロビン分子当たり少なくとも約１１ポリアルキレンオキシド結合の平均置換度を有する、請求項７の溶液。９．前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びそれらのブロック共重合体からなる群から選ばれる、請求項１の溶液。 10．前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールを含む、請求項１の溶液。 11．前記ポリアルキレンオキシドが約１，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１の溶液。 12．前記ポリアルキレンオキシドが約２，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１１の溶液。 13．前記ヘモグロビンが哺乳動物ヘモグロビン含む、請求項１の溶液。 14．前記ヘモグロビンがヒトヘモグロビン含む、請求項13の溶液。 15．前記ヘモグロビンが反芻動物ヘモグロビン含む、請求項13の溶液。 16．前記反芻動物ヘモグロビンがウシヘモグロビン含む、請求項15の溶液。 17．前記ヘモグロビンが、組換え法により産生されるヘモグロビン含む、請求項１の溶液。 18．前記ポリアルキレンオキシドが、前記ヘモグロビンのリシン残基のフリーのアミノ基と複合化される、請求項１の溶液。 19．前記ポリアルキレンオキシドが、ウレタン結合によって前記ヘモグロビンの前記リシン残基と複合化される、請求項18の溶液。 20．低分子量で低結合度のポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビン種を実質的に含まない、請求項１の溶液。 21．前記の低分子量で低結合度の種が、約１重量％未満のレベルで存在する、請求項20の溶液。 22．ポリアルキレンオキシド−ヘモグロビン（ＰＡＯ−Ｈｂ）複合体を同時に分画及び精製する方法であって、以下の工程を含む方法。（ａ）溶液中のＰＡＯ−Ｈｂ複合体を（ｉ）約８５，０００ダルトン未満の分子量とヘモグロビン分子当たり５未満のポリアルキレンオキシド結合の置換度とを有するＰＡＯ−Ｈｂ複合体及び（ii）生理学的に許容できない物質に選択的に結合する能力があるアニオン交換媒体に接触させて、約８５，０００ダルトンより大きな分子量とヘモグロビン分子当たり５ポリアルキレンオキシド結合より高い置換度とを有する複合化ヘモグロビンを含む画分が前記樹脂に結合しないようにし；そして（ｂ）前記樹脂に結合しない複合化ヘモグロビンを含む前記画分を回収する。 23．前記アニオン交換媒体が、ポリマー性又はシリカ性マトリックス上に被覆された４級アミン被覆アニオン交換樹脂を含む、請求項22の方法。 24．前記アニオン交換媒体が、４級アミン被覆アニオン交換樹脂及びポリエチレンイミン被覆アニオン交換樹脂からなる群から選ばれる、請求項22の方法。 25．前記ＰＡＯ−Ｈｂ複合体を含有する前記溶液が、約８．０〜約９．０のｐＨを有する、請求項22の方法。 26．前記ＰＡＯ−Ｈｂ複合体を含有する前記溶液が、約８．７〜約９．０のｐＨを有する、請求項25の方法。 27．前記ＰＡＯ−Ｈｂ複合体を含有する前記溶液が、約２５〜約１１０ミリオスモル／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項22の方法。 28．前記ＰＡＯ−Ｈｂ複合体を含有する前記溶液が、約３３〜約１００ミリオスモル／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項27の方法。 29．前記ＰＡＯ−Ｈｂ複合体を含有する前記溶液が、約６７〜約１００ミリオスモル／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項２８の方法。 30．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが、前記溶液中に約１〜約１０重量％の量で存在する、請求項22の方法。 31．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが、約３〜約７重量％の量で存在する、請求項30の方法。 32．前記ポリアルキレンオキシド複合化ヘモグロビンが、約４〜約６重量％の量で存在する、請求項31の方法。 33．前記溶液が、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄、Ｎａ₂ＣＯ₃、ＮａＨＣＯ₃、ＮａＢＯ₄及び（ＮＨ₄）₂ＣＯ₃からなる群から選ばれる１又は２以上の生理学的塩を含む、請求項22の方法。 34．前記溶液が、ＮａＢＯ₄及びＮａＨＣＯ₃からなる群から選ばれる緩衝溶液を含む、請求項22の方法。 35．前記接触工程が、ＰＡＯ−Ｈｂ複合体の前記溶液を、クロマトグラフィーカラム内の前記アニオン交換媒体で分離することを含む、請求項22の方法。 36．前記回収工程が、前記樹脂に結合しない複合化ヘモグロビンの前記画分を、約２５〜約１１０ミリオスモル／ｋｇの重量オスモル濃度で約８．０〜約９．０のｐＨを有する溶離緩衝液で溶離することを含む、請求項35の方法。 37．前記溶離工程が、複合化ヘモグロビンの前記画分を、前記溶離緩衝液の単一の無勾配流で溶離することを含む、請求項36の方法。 38．前記溶離工程が、複合化ヘモグロビンの前記画分を、前記溶離緩衝液の前記濃度範囲内で濃度が上昇してゆく前記緩衝液の複数の無勾配流で溶離することを含む、請求項36の方法。 39．前記溶離工程が、複合化ヘモグロビンの前記画分を、前記溶離緩衝液の前記濃度範囲内で濃度が上昇してゆく前記緩衝液の勾配流で溶離することを含む、請求項36の方法。 40．前記ポリアルキレンオキシドが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びそれらのブロック共重合体からなる群から選ばれる、請求項22の方法。 41．前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールを含む、請求項40の方法。 42．前記ポリアルキレンオキシドが約１，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項22の方法。 43．前記ポリアルキレンオキシドが約２，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項42の方法。 44．前記ヘモグロビンが哺乳動物ヘモグロビン含む、請求項22の方法。 45．前記ヘモグロビンがヒトヘモグロビン含む、請求項44の方法。 46．前記ヘモグロビンが反芻動物ヘモグロビン含む、請求項44の方法。 47．前記反芻動物ヘモグロビンがウシヘモグロビン含む、請求項46の方法。 48．前記ヘモグロビンが、組換え法により産生されるヘモグロビン含む、請求項 22の方法。 49．前記ポリアルキレンオキシドが、前記ヘモグロビンのリシン残基のフリーのアミノ基と複合化される、請求項22の方法。 50．前記ポリアルキレンオキシドが、ウレタン結合によって前記ヘモグロビンの前記リシン残基と複合化される、請求項49の方法。