KR0184858B1 - 폴리믹신 복합체 - Google Patents

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로쓰 비엠, 하우스 한스-루돌프
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Abstract

폴리믹신 복합체
본 발명은 폴리믹신 B-덱스트란 복합체와 같은 수용성 폴리믹신-담체 복합체에 관한 것이다. 상기는 혈류내에서 보다 큰 반감기를 가지며 고유 폴리믹신 보다 현저하게 높은 효능과 낮은 독성을 갖는다.

Description

폴리믹신 복합체
본 발명은 신규한 폴리믹신 복합체와 그의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.
내독소 또는 지다당류는 그람-음성 세균의 세포벽으로부터 유도된 구조 분자이다. 혈류내로 도입시, 이들은 체온의 조절을 방해하고 열을 발생시킬 수 있다. 상기는 또한 독성 효과를 가지며, 심장, 폐 및 신장의 기능부전에 이르게 한다. 내독소-관련 질병들은 중환자실의 환자들 사이에서 주된 사망 원인이다.
항생작용 가운데 특이한 것은 내독소 분자의 지질 A영역에 결합함으로써 내독소의 중화를 수행하는 폴리믹신, 특히 폴리믹신 B(PMB)의 능력이다. 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) (Baerosporus)로부터의 폴리믹신 B는 고도로 하전된 양친매성 환형 펩티도리피드이다. 상기는 특히 면역 기능이 손상된 개체들에게서 발생하는 다양한 진균 감염에 대항하는데 또한 유용하다.
그러나, PMB는 이를 이상적인 항생물질 보다 못한 것으로 만드는 몇몇 성질을 갖는다. 첫째로, 상기는 체내에서 짧은 반감기를 가지며, 따라서 효과적이기 위해서는 반복 투여가 필요하다. 두 번째로, 상기 물질이 신장을 통과함에 따라 광범위한 손상을 일으킬 수 있다. 세 번째로, 다량 투여시 상기는 호흡 마비를 일으키는 신경독 성질을 갖는다.
본래, 연구원들은 폴리믹신을 움직이지 않거나 고정된 분자에 결합시켰었다. PMB의 세파로즈로의 결합이 기재되어 있는 이젝쿠츠(Issekutz)의 문헌[J. Immunol. Methods. 61 (1983) 275-281]참조. 상기 복합체들은 정제 기법에 유용한 반면, 생체내의 치료용으로는 적합하지 않다.
약리학적 활성, 증가된 지속성 또는 감소된 기관 독성을 얻기 위한 하나의 접근법은 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 고분자량 거대 분자에 대한 약제의 결합을 포함한다. 그러나 이러한 중합체 결합 분야에서의 시도는 단지 제한된 성과만 거두었을 뿐이다. 예를들면, 프로카인아미드(항부정맥 약제)의 결합된 형태는 활성이 적으며 고유 프로카인 아미드 보다 더 짧은 반감기를 나타냈다(Schacht et al., Ann. NY Acad. Sci (1985) 446 199-211). 유사하게, 담체에 결합된 프로스타글란딘 유사물인 B245는 고유 분자보다 (수차의 대수 차수만큼) 덜 효과적이다[Bamford et al., Bioch. Biophys. Acta 886 (1986) 109-1181]. 생물학적 효능의 감소가 또한 칼리크레인, 아프로티니, 브래디키닌 [Odya et al., Biochem, Pharmacol. 27 (1978) 173-179] 및 종양 치료 약제인 당노루비신(Hurwitz et al., J. Appl. Biochem. 2 (1980) 25-35] 및 마이토마이신 C [Takakura et al., Cancer Res. 44 (1984) 2505-2510]의 결합된 형태에서 나타났다. 결합된 효소는 또한 입체 장애 및 감소된 기질 접근에 기인한 생물학적 활성의 감소라는 단점을 갖게 된다[Blomhoff et al., Biochem. Biophys. Acta 757 (1983) 202-208; Marshall et al., J. Biol. Chem. 251 (1976) 1081-1087; Foster, Experientia 31 (1975) 772-3; Wileman et al., J. Pharm. Pharmacol. 35 (1983) 762-765[. 그러나, 결합시킨후 순환성 반감기의 개선에 대한 몇가지 예가 존재한다[Wileman 의 상기 문헌 ; Kaneo, Chem. Pharm. Bull. 37 (1989) 218-220].
혈류내에서 더 오래 머무르고/머무르거나 치료 투여량에서 신경 또는 신장독성을 갖지 않는 폴리믹신의 형태를 개발하는 것이 바람직하다.
본 발명은 수용성인 폴리믹신-담체 복합체, 예를들면 폴리믹신 A-, B-또는 E-담체 복합체, 특히 PMB-담체 복합체에 관한 것이다. 상기는 내독소를 중화시키는 용도를 나타낸다. 상기는 보다 효과적이고 독성이 보다 적기 때문에 고유 폴리믹신을 투여하는 것보다 개선되었다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 다음의 정의를 적용한다:
-LD0은 PMB 또는 그의 복합체의 최고 비독성 투여량이다;
-LD100은 정상적인 시험 동물내로 주사했을 때 90내지 100%의 치사율이 발생하는 PMB 또는 그의 복합체의 투여량이다;
-PD100은 과민화된 시험 동물내로 주사했을 때 적어도 95%가 생존하는 폴리믹신 B 또는 그의 결합된 형태의 투여량이다;
-치료 치수(TI)는 LD100을 PD100으로 나눔으로써 계산한다.
본 발명에서 정의된 바와 같이 복합체는 25℃에서 적어도 0.5mg/㎖, 바람직하게는 25℃에서 적어도 1㎎/㎖의 수용성을 가진다면 수용성이다. 상기 복합체들은 수용성이며 주사가능하고, 비-매트릭스이며, 콜로이드이고, 가교결합되지 않았으며, 비-거대분자 및/또는 비-미립자이다.
폴리믹신에 결합시킬 수 있는 담체는 수용성 복합체를 형성할 수 있고, 균일하고, 비-독성이며, 비-발암성이고, 비-자극성이며 비-면역성인 분자들중에서 선택한다. 상기는 통상적으로 생물중합체이다. 상기 담체는 덱스트한 또는 하이드록시 에틸 전분(HES)과 같은 다당류, 알부민과 같은 단백질 및 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리비닐 알콜과 같은 중합체를 포함한다. 덱스트란이 가장 바람직하다.
생물중합체 부분, 즉 복합체의 담체 부분의 크기는 변화시킬 수 있다. 전형적으로 상기는 분자량 25,000 내지 500,000, 바람직하게는 50,000 내지 300,000 보다 바람직하게는 79,000 내지 200,000의 범위이다. 선택된 생물중합체의 크기는 혈류내에서 복합체의 유효 순환시간을 지속시키는데 상당히 기여할 수 있다. 일반적으로, 생물 중합체가 클수록 복합체는 더 오래 순환하면서 머무르게 된다. 따라서 체내에서 복합체가 지속되는 시간이 예정된 시간에 상응하도록 생물중합체의 크기를 조정할 수 있다.
본 발명의 복합체를 통상적인 방법으로 제조할 수도 있다.
폴리믹신 B를 예로서 취하면, 상기는 세균성 내독소에 결합된 5개의 γ-아미노 그룹을 갖는다. 적어도 1개의 γ-아미노 그룹을 사용하여 담체에 PMB를 확실히 결합시킬 수 있지만, 5개 모두의 부위를 상기 목적을 위해 사용할 수 없거나, 또는 상기 복합체는 내독소-중화활성이 부족하다. 다양한 화학 반응을 사용하여 상기 담체들에 폴리믹신을 결합시킬 수 있다. 중합체 분자당 결합된 PMB분자의 수는 결합 반응동안 반응물의 비를 다양화시킴으로써 영향 받을 수 있다. 일반적으로 복합체는 물을 기준으로 1 PMB:15 생물중합체 내지 200PMB:1 생물중합체를 함유하고, 보다 바람직하게 복합체는 1 내지 10PMB:1생물중합체 및 가장 바람직하게는 1 내지 3PMB:1 생물중합체를 갖는다. 높은 PMB: 생물중합체 비율을 갖는 복합체는 보다 낮은 비율을 갖는 복합체보다 더 큰 효능을 갖는 것 같다.
폴리믹신-담체 복합체, 보다 특별히 PMB-덱스트란 복합체를 제조하는 하나의 방법은 카바메이트를 통한 연결이다(방법 A). 상기 방식(하기 실시예1에 상세히 설명함)으로 제조한 PMB-덱스트란 복합체는 고유 PMB의 항-내독소 활성을 보유하며 또한 고유 PMB에 의해 나타나는 급성 신경독성이 없는 것으로 밝혀졌다. 상기 결합된 형태는 또한 만성 독성을 감소시킴으로써 고유 PMB의 치료 지수보다 2내지 5배 개선된 치료 지수를 나타낸다.
결합된 폴리믹신 덱스트란을 제조하는 두 번째 방법은 아민 결합을 통한 것이다(방법 B). 상기 방법(하기 실시예 2에 상세히 설명함)으로 제조한 PMB-덱스트란 복합체는 동일한 일반적인 항-내독소 활성을 보유하거나 또는 고유 PMB보다 활성이 더 크다. 상기 결합된 형태는 고유 PMB에 의해 나타나는 어떠한 급성 신경 독성도 전혀 없으며 만성 독성을 감소시킴으로써 고유 PMB에 의해 나타나는 치료 지수 보다 33배 개선된 치료 지수를 나타낸다. 특히, 한 PMB-덱스트란 복합체는 시험된 투여량에서 어떤 측정 가능한 독성도 없으며 우수한 항-내독소 활성을 보유하여, 결과적으로 치료 지수가 80배 개선된다.
또한, 놀랍게도 상기 방법에 의해 제조되어 신속하게 정제된 복합체는 TI에서 60내지 120배의 개선을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 명세서 및 특허청구범위 전체에 걸쳐 사용된 신속하게 정제된 이라는 것은 약 12 내지 24시간, 바람직하게는 약 18시간 동안 상기 물질을 분자 체 크로마토그래피, 탈염겔, 또는 아미콘(Amicon)한외 여과를 사용하여 결합되지 않은 PMB로부터 정제시키는 것을 의미한다(이에 비해 연장된 투석 시간은 7내지 10일이다). 따라서 상기 방법으로 제조되어 신속하게 정제된 복합체는 본 발명의 또다른 바람직한 실시태양을 포함한다.
그러나, 상기 개략된 2개의 방법중 어느 하나로부터 수득한 폴리믹신-담체 복합체는 정제하기 어렵다. 처음에는, 복합체로부터 고유 PMB를 분리하기 위해서 10일간의 연장된 투석을 시도하였다. 비록 투석 주머니 내부의 단백질 수준이 점근선(asymptote)에 도달하고, 겔 투과 컬럼 크로마토그래피가 단일의 고분자량 종류를 나타내지만, 상기 물질은 여전히 결합되지 않은 PMB를 함유하였다. 연장된 투석을 압력 투석(아미콘) 여과로 대체하여도 결과는 마찬가지이다. 상기 방법으로 정제된 복합체는 PMB와 같은 효력을 가지지만, 여전히 PMB의 1/3내지 1/5의 독성을 함유한다. 이론에 얽매이려는 의도는 아니지만, 상기는 유리PMB와 복합체 사이에 그의 분리를 어렵게 하는 어떤 화학적 결합이 있음을 나타낸다. 동물에게 주사할 때 상기 유리PMB는 그자체가 분리되어 독성 문제를 야기시킨다.
하기 방법(방법 C)(하기 실시예4에 상세히 설명함)은 상기 어려운 점들을 제거한다. PMB-덱스트란 복합체와 같은 폴리믹신-덱스트란 복합체를 저급 알콜, 바람직하게는 메탄올중에 침전시킨 다음 원심분리시켜 모으고 초음파로 재용해시킨다. 상기 방법을 통상적으로 적어도 3번, 및 바람직하게는 7내지 10번 반복하고 생성된 물질은 예를들면 겔 투과 크로마토그래피 및 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 순도를 평가한다. 단백질이 상기 어느 한 방법에 의해 검출되는 경우, 침전-재용해 공정을 반복한다. 상기 방법으로 정제된 복합체를 본 명세서에는 초-순수 폴리믹신-복합체로서 지칭하며 일반적으로 총단백질 1㎎당 결합되지 않은 폴리믹신 20㎍미만 및 바람직하게는 총 단백질 1㎎단 결합되지 않은 폴리믹신 10㎍미만을 갖는 것으로서 개시할 수 있다.
따라서 본 발명의 또하나의 실시태양은 하기 a)내지 b)를 포함하는 수용성 폴리믹신-덱스트란 복합체의 제조 방법이다:
a) 폴리믹신을 덱스트란에 적절히 결합시켜 수용성 폴리믹신-덱스트란 복합체를 형성하고;
b) 생성된 복합체를 저급 알콜중에 침전시키고;
c) 복합체를 재현탁시키고;
d) 복합체가 결합되지 않은 폴리믹신을 실질적으로 함유하지 않을 때까지 b) 및 c)단계를 반복한다.
결합되지 않은 폴리믹신을 실질적으로 함유하지 않음이란 본 명세서에서 물을 기준으로 복합체 대 결합되지 않은 폴리믹신의 비가 적어도 95:1, 바람직하게는 적어도 99:1인 것으로서 정의한다. 저급 알콜은 예를들면 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알콜이며, 바람직하게는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알콜이다(예를들면 n-부탄올 또는 이소프로판올, 보다 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올), 폴리믹신은 PMB가 바람직하다.
초-순수 복합체는 실질적으로 독성이 없으며 결과적으로 상기에 대해 LD100을 정할 수 없다. 100㎎/㎏의 투여량에서 독성이 관찰되지 않는다. 보다 더 높은 농도에서는 용액이 너무 점성이어서 주사할 수 없다. 상기는 정맥 주사로 5㎎/㎏의 LD0와 정맥주사로 9.5㎎/㎏의 LD100을 갖는 고유 PMB와 대조적이다. 따라서, 초-순수 PMB 복합체의 치료 지수는 감소된 독성으로 인해 고유 PMB 보다1000배 더 높다.
고유 폴리믹신 보다 복합체를 사용하는데 있어서 두 번째 잇점은 상기 복합체가 더 긴 활성 지속 기간을 가지며 따라서 예방적으로 사용할 수 있다는 것이다. 따라서 본 발명의 한 실시태양은 세균성 내독소의 존재에 의해 야기된 질병의 예방적 치료가 필요한 개체에게 예방 효과량의 폴리믹신의 수용성 복합체, 바람직하게는 PMB와 담체(특히 덱스트란) 및 적절한 경우 약학적으로 허용가능한 또하나의 담체 또는 희석제(예: 불활성 용액)를 투여함으로써 상기 질병을 예방하는 것이다. 복합체는 실질적으로 독성이 없으므로, 장기간 영양을 공급하기 위한 액성 음식에 의존하는 환자들과 같이 부패에 의한 충격에 민감할 수 있는 환자에게 이를 통상적으로 예방적으로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 적절한 경우 추가의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제(예: 불활성 용액)와 함께 수용성 폴리믹신-담체 복합체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 수용성 폴리믹신-담체 복합체를 적절한 경우 추가의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제(예: 불활성 용액)와 혼합함을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 세균성 내독소의 존재에 의해 야기된 질병의 치료가 필요한 개체에게 내독소-중화량의 폴리믹신의 수용성 복합체, 특히 PMB와 담체(특히 덱스트란) 및 불활성 용액을 투여함을 포함하는 상기 질병의 치료방법에 관한 것이다. 폴리믹신이 또한 세균 또는 진균 감염에 대향하는데 효과적이므로, 본 발명의 또다른 실시태양은 세균 또는 진균 감염의 치료를 필요로 하는 개체에게 살균 또는 살진균 효과량의 폴리믹신과 담체(특히 덱스트란)의 수용성 복합체 및 불활성 용액을 투여함을 포함하는 상기 감염의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리믹신-담체 복합체를 폴리믹신 그 자체를 사용할 때와 같은 방법으로 사용할 수 있다. 즉, 세균 또는 진균 감염에 대한 항생물질로서 단독으로 사용하거나 또는 다른 살균제 및/또는 소염제와 함께 사용할 수 있다. 상기를 예를 들면 근육내, 정맥내, 척수내, 결막하 또는 국부적으로 투여할 수도 있다. 따라서 근육내 주사용 제제는 전형적으로 멸균수, 생리 식염수 또는 약 1%프로칸·HC1중의 효과적인 양의 PMB-복합체를 포함한다. 정맥내 제제는 전형적으로 5% 덱스트로스 및 멸균수중의 효과적인 양의 PMB-복합체를 포함한다. 척수내 제제는 전형적으로 생리 식염수중의 효과적인 양의 PMB-복합체를 포함한다. 국부적으로 눈에 사용하기 위해서, 점안액으로서는 효과량을 물 또는 생리 식염수 , 및 임의로 글리세린 및 황산 구리와 혼합할 수 있으며, 또는 연고 또는 현탁액으로 제조할 수 있다. 국부 적용을 위해서, 특히 화상을 입은 부위용 크림은 전형적으로 액체 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 및 유화 왁스와 같은 불활성 성분의 기재중에 효과량의 폴리믹신-복합체를 포함한다.
사용되는 폴리믹신-복합체의 양은 특정 환자에게 전형적으로 처방되는 (치료할 상태, 및 환자의 연령 및 체중과 같은 요인들을 고려하여)고유 폴리믹신의 양 및 사용된 특정 폴리믹신-복합체의 활성을 근거로 한다. 종종, 폴리믹신 복합체의 효과적인 증가된 활성, 감소된 독성 및 활성의 증가된 지속 기간에 기인하여 고유 폴리믹신에 비해 50%이하로 투여량이 감소될 수 있다.
본 발명을 하기의 비제한적인 실시예를 참고로 예시한다. 모든 온도는 섭씨(℃)로 나타낸다.
실시예1 : PMB의 덱스트란으로의 화학적 결합
(방법 A : 카바메이트 결합)
덱스트란(79,000 또는 200,000 MW) 2g을 물 20㎖중에 용해시키고 0℃로 냉각시키며, 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP) 5내지 300㎎을 가하고 30초 동안 혼합한다. 트리에틸아민(2.0M, CDAP 5㎎당 0.04㎖)을 격렬하게 교반하면서 적가하고 전체 반응 혼합물을 10N HC1 1㎖를 함유하는 80㎖의 빙냉 무수 에탄올로 옮긴다. 덱스트란이 침전되며, 침전물을 0°에서 5분동안 1000xg에서 원심분리에 의해 제거하고, pH 9.0에서 0.25M 중탄산나트륨 완충액 20내지 50㎖중에 재용해시킨다. 상기 혼합물에 PMB(분말이나 물중에 미리 용해시킨 것) 600내지 1000㎎을 가하고 8°에서 24시간 동안 교반한다. 이어서 전체 반응 혼합물을 분자량 50,000의 차단 투석 관으로 옮기고 6내지 10일 동안 발열물질을 함유하지 않는 0.05M 인산염 완충액에 대해 투석한다. 최종 투석된 반응 혼합물을 브래드포드(Bradford) 시약(Bio Rad, Richmond, CA, USA)을 사용하여 208㎚ 또는 595㎜에서 분광측정법에 의해 단백질 함량에 대해 측정 한다.
대조용으로서 고유 PMB를 사용하는 닌히드린 반응에 의해 유리 아미노 그룹을 결정한다. 질소 및 탄소 함량에 대한 분석은 CHN 원소 분석기를 사용하여 행한다.
하기 표에서, 몰비는 결합에 사용된 덱스트란의 농도(23.7μ몰)를 투석후의 최종 PMB-단백질 농도(μ몰) (208㎚ 분석을 근거로)로 나눔으로써 결정한다. 덱스트란은 약해서 dx로 쓴다. C:N비는 덱스트란 2g당 물분자 450으로 추정한다. 결합/PMB는 닌히드린 반응을 근거로, PMB를 덱스트란에 결합시키는 결합의 수에 대한 추정치이다. ND는 결정되지 않음이다.
[실시예 2]
PMB의 덱스트란으로의 화학적 결합
(방법 B: 아민결합)
덱스트란(79,000 또는 200,000 MW) 1.25g을 증류수 20㎖중에 용해시키고 이어서 0.071 내지 0.71g의 과요오도산나트륨을 가한다. 22°에서 1시간후에 반응 혼합물을 DEAE A25 양이온 교환 수지(Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA)를 함유하는 칼럼으로 옮기고 혼합물을 수획하여 20내지 25㎖의 단일 분획으로 모은다. 이어서 산화된 덱스트란을 80내지 200㎖의 중탄산나트륨 또는 붕산나트륨 완충액(pH8.5 내지 9.0)내에 용해시킨 PMB 2g과 혼합하고 60분후에, 40㎖의 0.05 내지 25% 수소화붕소 나트륨을 1회 또는 수회 첨가처리한다(각 처리를 30분 내지 24시간 지속함). 상기 반응을 30분동안 진행시키고 이어서 8°에서 7내지 10일동안 발열물질을 함유하지 않는 0.05M 인산나트륨 완충액에 대해 투석한다. 최종 투석된 반응 혼합물을 실시예1에 개시한 바와 같이 단백질 함량과 유리 아미노 그룹에 대해 분석한다.
연장된 투석에 의한 정제에 덧붙여, 다수의 대표적인 샘플을 18시간동안 투석을 이용하여 신속하게 정제하고, G-100 세파덱스 칼럼(Pharmacia. Inc., Piscataway, NJ, USA)상에서 정제시키고 YM-100 아미콘 필터를 사용하여 아미콘 여과 유니트상에서 농축시킨다.
하기 표에서 결합에 사용한 덱스트란의 양(6.25μ몰)을 투석후의 최종 PMB 단백질의 μ몰 (208㎚데이타를 근거로)로 나눔으로써 몰비를 결정한다. 질소 퍼센트를 CHN 원소 분석기를 사용하여 결정한다. 결합/PMB를 닌히드린 반응에 의해 추정한다.
[실시예 3]
PMB-복합체의 항-내독소 활성
A. 내독소-유도된 치사율
CB57BL/c 수컷 마우스(18내지 22g, Jackson Labs)를 이 연구 전체에 걸쳐 사용한다. 갈라노스등(Galanos et al.)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 5939]에 개시된 바와 같이 동물에게 내독소(0111B4, List Biologicals 제품, Palo Alto, CA, USA)와 갈락토스아민을 제공하여 과민해지도록 한다. 내독소와 갈락토스아민(320㎎/㎏)을 매일의 변동을 피하기 위해서 13:00 내지 15:00 사이에 동물당 0.5㎖의 발열물질을 함유하지 않는 등장성 염수로 복강내로 주사한다. 투여량-반응 연구로부터, 0.01㎎/㎏ 내독소가 85 내지 95% 치사율을 발생시킴을 결정한다. 동물을 주사후 6일동안 매일 관찰한다.
B. PMB(고유 및 결합된 형태) 유도된 치사율
민감하지 않은 쥐에 있어서 PMB(고유 및 결합된 형태)의 본래 독성에 대해서 평가한다. CB75BL/c 수컷 마우스(18-22g, Jackson. Labs)를 상기 연구 전체에 걸쳐 사용한다. 고유 PMB 또는 결합된 PMB를 복강내 주사(0.5㎖/동물)로 동물에게 제공하고 치사율을 7일동안 측정한다. 100% 치사율을 발생시키는 PMB(고유 및 결합된 형태)의 투여량을 다양화시킴으로써 LD100을 결정한다. 각 투여량에 대해서 10 내지 20마리의 동물을 사용한다.
C. PMB 항-내독소 평가
PMB(고유 및 결합된 형태)를 복강내 주사전에 60분동안 내독소와 예비혼합하거나 또는 단일 복강내 주사로서 상기 물질을 함께 투여함으로써 내독소를 중화시키는 상기의 능력에 대해 평가한다. PMB(고유 및 결합된 형태)의 농도를 다양화시키는 반면, 각 주사 용적을 동물당 0.5㎖로 일정하게 유지한다. 결합된 PMB에 의한 보호를 고유 PMB와 (단백질 ㎎/㎏으로)비교한다. 대조용(내독소, 갈락토스아민 및 비히클)을 각 연구에서 또한 포함한다. 각각의 그룹은 10 내지 17마리의 동물을 갖는다.
그룹들 사이 또는 대조용과 관련된 생존의 통계적 분석을 연속성에 대한 에이트의 보정(Yate's correction)을 사용한 X2검정(Chi-square)분석을 이용하여 수행한다.
D. 치료 지수의 결정
LD100을 PD100으로 나눔으로써 PMB(고유 및 결합된 형태)에 대한 치료 지수(TI)를 결정한다. 하기 표에서, 처리란 상기 실시예 1 및 2에 나타낸 복합체를 지칭한다.
[실시예 4]
초-순수 PMB-덱스트란 복합체
(방법 C : 알콜 침전)
1. 제조
PMB-덱스트란 복합체를 상기 실시예2에 개시된 바와같이 실질적으로 제조하여 RXN 1/50으로 표시된 복합체를 수득한다.
복합체, 즉 백색의 응집물을 60% 메탄올중에 침전시키고, 원심 분리에 의해 수획하고 이어서 초음파로 재용해시킨다. 상기 과정을 7번 반복하고 생성된 물질을 겔 투과 크로마토그래피 및 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 순도에 대해서 평가한다. 겔 투과 크로마토그래피에 의해서는 유리 PMB가 검출되지 않았지만, RP-HPLC는 총 단백질 ㎎당 결합되지 않은 PMB 48㎍을 나타낸다. 이어서 복합체를 3회 추가로 침전시켜 결합되지 않은 PMB를 제거한다.
2. 생물학적 활성
생성된 초-순수 PMB-덱스트란 복합체를 상기 실시예 3, C에 개시된 바와같이 내독소-유도된 치사율 시험에서 고유 PMB와 비교한다.
정맥내 주사로 1㎎/㎏에서 초-순수 PMB-복합체는 적어도 6시간동안 LD90의 내독소 공격에 대해 70% 보다 높은 보호를 제공한다. 정맥내 주사로 10㎎/㎏에서 상기 복합체는 내독소의 투여후에 1.5시간의 치료 보호를 제공한다. 따라서 PMB-복합체는 예방용으로 적합하다.
초-순수 PMB-복합체는 놀랍게도 고유 PMB와 비교하여 감소된 독성을 갖는다. 고유 PMB는 정맥내 주사로 5㎎/㎏의 LD0와 정맥내주사로 9.5㎎/㎏의 LD100을 가져서, 독성의 이른 개시와 좁은 치료 범위를 제시한다. 초-순수 PMB-복합체는 100㎎/㎏보다 큰 LD0를 가지며 그의 본래의 비-독성 때문에 LD100을 확립하는 것은 불가능하다. 하기 표에서의 비교는 PMB(고유 및 결합된 형태)의 최고의 비-독성 투여량 사이에서 행한다.

Claims (10)

  1. 전신 순환에 사용하기 적합한 크기의, 폴리믹신과 담체의 수용성 복합체(단, 폴리믹신이 폴리믹신 E인 경우 담체는 단백질 담체가 아님).
  2. 제1항에 있어서, 상기 담체가 덱스트란 또는 하이드록시에틸 전분과 같은 다당류; 알부민과 같은 단백질; 또는 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 알콜과 같은 중합체인 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리믹신이 PMB인 복합체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 담체가 덱스트란인 복합체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 담체가 덱스트란인 복합체.
  6. 제5항에 있어서, PMB가 카바메이트 결합을 통해 결합된 복합체.
  7. 제5항에 있어서, PMB가 아민 결합을 통해 결합된 복합체.
  8. a) 폴리믹신을 덱스트란에 적절히 결합시켜 수용성 폴리믹신-덱스트란 복합체를 형성하고; b) 생성된 복합체를 저급 알콜중에 침전시키고; c) 복합체를 재현탁시키고; d) 복합체가 결합되지 않은 폴리믹신을 실질적으로 함유하지 않을 때까지 b) 및 c)단계를 반복함을 포함하는 제4항에 따른 폴리믹신-덱스트란 복합체의 제조방법.
  9. 추가의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 제1항에 따른 복합체를 포함하는 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 실질적으로 무독성인 주사가능한 복합체.
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