JPH03220198A - ポリミキシン複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なポリミキシン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ）に、また、その製造方法および使用方法に関する
ものである。

エンドトキシンまたはリポ多糖類は、ダラム陽性菌の細
胞壁より誘導される構造分子である。これらは、血流中
に導入されると体温調節を阻害して発熱の原因となり得
る。これらはまた毒性効果を有し、心臓障害、肝障害お
よび腎臓障害に導く。

エンドトキシン関連疾病は、集中治療病棟の患者の死因
となる。

抗生物質の中でも独特なものは、エンドトキシン分子の
脂質Ａ領域に結合することにより達成されるポリミキシ
ン、特にポリミキシンＢ　（ＰＭＢ）のエンドトキシン
を中和する能力である。

バチルス・ポリミキサ（Ｂ、アエロスポルス）よりのポ
リミキシンＢは高度に帯電した両親媒性（ａｍｐｈｉｐ
ｈｉｌｉｃ）の環状ペプチド脂質（ｐｅｐｔｉｄｏｌｉ
ｐｉｄ）である。ポリミキシンＢはまた、種々の菌類感
染症、特に免疫抑制された（　ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒ
。

ｍ１ｓｅｄ）固体に生ずるものの防除にも有用である。

しかし、ＰＭＢ　は理想的な抗生物質とは言えない幾つ
かの性質を有している。第１に、体内での半減期が短（
、有効であるためには反復投与が必要である。第２に、
腎臓を通過する際に広範囲の損傷の原因となる。第３に
、高い投与量では神経毒性を有し、これが呼吸麻痺の原
因となる。

従来、研究者らはポリミキシンを不動（ｉｍｍｏｂｉｌ
ｅ）分子、または固定分子に複合させていた。たとえば
、ＰＭＢ　のセファローズへの結合を記述しているイソ
セクッツ（Ｉｓｓｅｋｕｔｚ）　、免疫学的方法雑誌（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　６１　（
１９８３）　２７５〜２８１を参照されたい。これらの
複合体は、生成技術においては有用であるが、生体内の
治療的使用には適していない。

薬学的活性、持続性の増大、または器官毒性の減少を達
成するための一つのアプローチには、大分子量の高分子
物質、たとえばデキストラン、ポリエチレングリコール
またはポリビニルピロリドンへの薬品の配合が含まれて
いる。しかし、この重合体複合体の領域での試みは限定
された成功しか得られていない。たとえば、ブロカイン
アミド（抗不整脈薬）の複合体形状は単独の（ｎａｔｉ
ｖｅ）プロカインアミトよりも活性が少な（、かつ、短
い半減期を示す（シャハト（Ｓｃｈａｃｈｔ）ら、ニュ
ーヨーク科学アカデミ−年報（＾ｎｎ、　ＮＹ　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、）（１９８５）、　４４６１９９−２１
１）。同様に、担体に結合したプロスタグランジン類似
物Ｂ２４５は単独の分子より（数桁（ｂｙ　５ｅｖｅｒ
ａｌ　ｌｏｇ　ｏｒｄｅｒｓ）　）有効性が少ない［バ
ムフォード（Ｂａｍｆｏｒｄ）ら、ビオキミカ・ビオフ
ィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃ
ｔａ）　８８６　（１９８６）　１０９−１１８１　。

生物学的能力の減少はまた、カリクレイン、アプロチニ
ン、ブラジキニン［オーシャ（Ｏｄｙａ）ら、生化学薬
学（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、）　２７　
（１９７８）　１７３−１７９］および抗腫傷薬ダウノ
ルビシン［フルウイソツ（Ｈｕｒｗｉｔｚ）ら、応用生
化学雑誌（Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　２
　（１９８０）　２５−３５コおよびミドマイシンＣ［
タカクラ（Ｔａｋａｋｕｒａ）ら、　ｆａＴｉｆ容（Ｃ
ａｎｃｅｒＲｅｓ、）　　４４　（１９８４）　２５０
５−２５１０］の複合形状に関しても記述されている。

複合酵素も、立体障害と基質接近（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
　ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の減少とによる生物学
的活性の減少を受ける［ブロムホー２０８：７−シャル
（Ｍａｒｓｈａｌｌ）ら、生物化学雑ｐｅｒｉｅ叶り）
　３１　（１９７５）　７７２−３　；ワイルマン（ｉ
′ｉｌｅｍａｎ）ら、薬物薬学雑誌（Ｊ、　Ｐｈａｒｍ
、　Ｐｈａｒｍ些射、）　３５　（１９８３）　７６２
−７６５３゜しかし、配合後の循環器内（ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｏｒｙ）半減期が改良される若干の例も存在する［
ワイルマン、上掲論文；カネオ（Ｋａｎｅｏ）　、化学
薬学雑誌（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ。

すｕｌｌ、）　　３７　　（７９８９）　　２１８　−
　　２２０１　。

血流中により永く存在し、かっ／または治療的投与量に
おいて神経毒性もしくは腎臓毒性を持たない形状のポリ
ミキシンを開発することが望ましい。

本発明は、水に可溶なポリミキシン−担体複合体、たと
えばポリミキシンＡ−１Ｂ−またはＥ−担体複合体に、
特にＰＭＢ−担体複合体に関するものである。これらは
エンドトキシンの中和における使用が示されている。こ
れらは単独のポリミキシンよりも有効であり、かつ毒性
が少ないので、単独のポリミキシンの投与に対する改良
である。

本件明細書中で使用するには以下の定義を適用する： Ｌ　Ｄ　ｏはＰＭＢ　またはその配合体の最高無毒性投
与量である； ＬＤｌｏｏは、正常な試験動物に注射した場合に９０−
１００％の致死率という結果を与えるＰＭＢ　またはそ
の複合形状の投与量である； ＰＤＩＯＩＩは、増感された試験動物に注射した場合に
少なくとも９５％生存という結果を与えるポリミキシン
Ｂまたはその複合形状の投与量である； 治療指数（ＴＩ）は、Ｌ　Ｄ　＋００をＰ　Ｄ　＋ｏ。

で割って計算する。

本件明細書における定義では、複合体は２５℃において
少なくとも０．５　ｍｇ／＋＋１の、好ましくは２５℃
において少なくとも１ｍｇ／ｍｆの水に対する溶解度を
有する場合に水溶性である。この種の複合体は水溶性か
つ注射可能、無基質（ｎｏｎ−ｍａｔｒｉｘ）、コロイ
ド状、非架橋、非高分子量であり、かつ／または非粒状
である。

ポリミキシンに複合し得る担体は、水溶性複合体を形成
し得る、均一な、無毒性の、非発癌性の、非刺激性の、
かつ非免疫原性の分子から選択する。

通常は生体重合体である。この種の担体には多糖類たと
えばデキストランまたはヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ
）、タンパク質たとえばアルブミン、ならびに重合体、
たとえばポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコー
ルおよびポリビニルアルコールが含まれる。デキストラ
ンが最も好ましい。

生体重合体部分のサイズ、すなわち複合体の担体部分は
変えることができる。典型的には２５、０００ないし５
００．０００の、好ましくは５０．０００ないし３００
．０００の、より好ましくは７９．０００ないし２００
．０００の分子量範囲である。選択した生体重合体のサ
イズは、複合体の血流中衛環の有効時間の長さに有意の
影響を与える可能性がある。

一般には、生体重合体が大きければ複合体がより長く循
環中に留まるであろう。したがって、生体重合体のサイ
ズにより、複合体の体内持続時間をあらかじめ定めた時
間に相当する値に調節することができる。

本発明記載の複合体は通常の手法で製造することができ
る。

ポリミキシンＢを例にとれば、これは細菌性エンドトキ
シンに結合する５個の　γ−アミノ基を有する。少なく
とも１個のγ−アミノ基をＰＭＢ　を担体に確実に結合
させるのに使用することができるが、５個の部位全てを
この目的に使用することはできず、全てを使用すれば複
合体はエンドトキシン中和活性を失ってしまう。ポリミ
キシンをこれらの担体に結合させるには、種々の化学反
応を使用することができる。重合体１分子あたりの結合
したＰＭＢ分子数は、結合反応中に反応剤の比率を変え
ることにより影響を与えることがてきる。本複合体は一
般には、モル比基準でＩＰＭＢ・１５生体重合体ないし
２００　ＰＭＢ　：　１生体重合体を含有し、より好ま
しくは本複合体は１−１−１ＯＰ：１生体重合体を、さ
らに好ましくは１−１−３Ｐ：１生体重合体を有する。

高いＰＭＢ　：生体重合体比率を有する複合体は、低い
比率を有する複合体よりも大きな能力を有するように思
われる。

ポリミキシン−担体複合体、より特定的にはＰＭＢ−デ
キストラン複合体を製造する一つの方法は、カルバミン
酸エステル結合を経由するもの（方法Ａ）である。この
様式で製造したＰＭＢ−デキストラン複合体（詳細は下
の実施例１を参照）は単独のＰＭＢの抗エンドトキシン
活性を保持することが見いだされており、加えて、単独
のＰＭＢ　が示す激しい神経毒性が欠如していることも
見いだされている。これらの複合形状はまた、慢性毒性
が減少していることにより、単独のＰＭＢ　より２−５
倍改良された治療指数をも示す。

複合されたポリミキシン−デキストランを製造する第２
の方法は、アミン結合を経由するもの（方法Ｂ）である
。この手法で製造した　ＰＭＢ−デキストラン複合体（
詳細は下の実施例２を参照）は単独のＰＭＢ　　と同一
の一般的抗エンドトキシン活性を保持するか、または、
単独のＰＭＢよりも活性が大きい。これらの複合形状は
単独のＰＭＢ　に見られる激しい神経毒性のいかなるも
のも完全に欠如しており、慢性毒性が減少していること
により、単独のＰＭＢ　で見られる治療指数より３３倍
の改良を示す。特に、ＰＭＢ−デキストラン複合体の１
種は試験した投与量において測定可能な毒性が全く欠如
しており、良好な抗エンドトキシン活性を保持しており
、結果的に治療指数の８０倍の改良が得られている。

さらに、驚くべきことには、この方法により製造し、“
迅速精製した”配合体がＴＩ　　の６０ないし１２０倍
の改良を示すことが見いだされている。本明細書および
特許請求の範囲を通じて使用する“迅速精製した”は、
本物質がモレキュラ−ンーブクロマトグラフィー、脱塩
ゲル、またはアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ）超遠心を用いて
非結合ＰＭＢから精製され、（７−１０日の長期透析時
間とは対照的に）約１２−２４時間、好ましくは約１８
時間で得られたことを意味する。したがって、これらの
方法により製造し、迅速精製した複合体は本発明の他の
一つの好ましい態様を構成する。

しかし、上に概括した２種の方法のいずれかで得られる
ポリミキシン−担体複合体は精製するのが困難である。

単独のＰＭＢ　を複合体から分離するためにまず、１０
日の長期透析が試みられた。透析袋内部のタンパク質レ
ベルは漸近線に達したが、ゲル透過クロマトグラフィー
は単一の大分子１種を示し、物質はなお非結合のＰＭＢ
　を含有していた。加圧透析（アミコン）濾過を長期透
析に置き換えた場合にも結果は同一であった。

この手法で精製した複合体はＰＭＢ　と平衡点（ｅｑｕ
ｉｐｏｉｎｔ）にあったが、なおＰＭＢ　の毒性の１７
３ないし１１５を保持していた。理論に拘束されること
は望まないが、“遊離の”ＰＭＢ　と配合体との間のあ
る種の化学的な結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）がその
分離を困難にしているように思われる。動物への注射に
際しては、“遊離の”ＰＭＢはそれ自体分解して毒性問
題の原因となる。

以下の方法（方法Ｃ）（詳細は下の実施例４を参照）は
上記の困難を取り除くものである。ポリミキシン−デキ
ストラン複合体、たとえばＰＭＢ−デキストラン複合体
を低級アルコール、好ましくはメタノール中で沈澱させ
、続いて遠心的に回収し、超音波で再溶解させる。この
方法を通常は少なくとも３回、好ましくは７ないし１０
回繰り返し、得られる物質の純度を、たとえばゲル透過
クロマトグラフィーおよび逆相高圧液体クロマトグラフ
ィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により評価する。いずれかの方
法によりタンパク質が検出されれば、沈澱−再溶解工程
を繰り返す。この手法で精製した複合体を“超純（ｕｌ
ｔｒａ−ｐｕｒｅ）”ポリミキシン複合体と呼び、一般
には、全タンパク質１ｍｇあたり２０μｇ未満の非複合
ポリミキシンを、好ましくは全タンパク質１ｍｇあたり
１０μｇ未満の非配合ポリミキシンを有するものとして
記述することができる。

かくして、本発明のその他の態様は、 ａ）　ポリミキシンをデキストランに適当に複合させて
水溶性ポリミキシン−デキストラン複合体を形成し； ｂ）　得られる複合体を低級アルコール中で沈澱させ： Ｃ）　この複合体を再懸濁させ。

ｄ）　複合体が非結合のポリミキシンを実質的に含有し
な（なるまで段階ｂ）およびＣ）を反復する ことよりなる水溶性ポリミキシン−デキストラン複合体
の製造方法である。

ここて、“実質的に非結合のポリミキシンを含有しない
”は、複合体の非結合ポリミキシンに対する比率がモル
基準で少なくとも９５：１、好ましくは少なくとも９９
：１であることとして定義される。上記の低級アルコー
ルは、たとえば１ないし１０個の炭素原子を有するもの
であり、好ましくは１ないし４個の炭素原子を有するも
の、たとえばｎ−ブタノールまたはイソプロパツール、
より好ましくはメタノールまたはエタノールである。ポ
リミキシンは好ましくは　ＰＭＢ　である。

超純複合体は実質的に毒性を持たず、その結果、これに
はＬＤ＋ｏｏが得られない。１００　ｍｇ／ｋｇの投与
量では毒性は見られない。より高い濃度では溶液があま
りに粘稠で注射できない。このことは、５　ｍｇ／ｋｇ
の生体内ＬＤ０と９．５ｍｇ／ｋｇのＬ　Ｄ　＋　ｏ。

とを有する単独のＰＭＢ　とは対照的である。したがっ
て、超純ＰＭＢ複合体の治療指数は、毒性が減少してい
るために、単独の　ＰＭＢ　より　１００倍高い。

単独のＰＭＨに替えて複合体を使用することの第２の利
点は、複合体がより長い活性持続時間を有し、したがっ
て予防的に使用し得ることである。したがって、本発明
の態様の一つは、この種の予防的処置を必要とする対象
に予防的有効量のポリミキシン、好ましくはＰＭＢ　お
よび担体、好ましくはデキストラン、ならびに適宜に医
薬として許容し得るその他の担体または希釈剤、たとえ
ば不活性溶媒の水溶性複合体を投与することによる、細
菌性エンドトキシンの存在に起因する疾病の予防である
。本複合体は実質的に毒性を持たないので、敗血症のン
ヨック症状を起こし易い患者、たとえば長期栄養補給用
の液体食品に依存している患者に日常的に、予防的に投
与することができる。

本発明はまた、水溶性ポリミキシン−担体複合体を適宜
にその他の医薬として許容し得る担体または希釈剤、た
とえば不活性溶媒とともに含有する医薬組成物に関する
ものでもある。

本発明はまた、水溶性ポリミキシン−担体複合体を適宜
にその他の医薬として許容し得る担体または希釈剤、た
とえば不活性溶媒と混合することよりなる医薬組成物の
製造方法に関するものでもある。

本発明の他の一つの態様は、処置を必要とする対象にエ
ンドトキシン中和量のポリミキシン、特にＰ　Ｍ　Ｂ　
および担体、特にデキストラン、ならびに不活性溶液の
水溶性複合体を投与することよりなる、細菌性エンドト
キシンの存在に起因する疾病の処置である。ポリミキシ
ンは細菌感染症または菌類感染症の防除にも有効である
ので、本発明の他の態様は、処置を必要とする対象に殺
細菌的に、または殺菌的に有効な量のポリミキシンおよ
び担体、特にデキストラン、ならびに不活性溶液の水溶
性複合体を投与することよりなる、細菌感染症または菌
類感染症の処置方法である。

本発明記載のポリミキシン−担体複合体は、ポリミキシ
ン自体の使用に適合する手法で使用することができる。

すなわち、本件複合体は細菌感染症または菌類感染症用
の抗生物質として単独で、または他の殺細菌剤および／
または抗炎症剤と組み合わせて使用することができる。

本件複合体は、たとえば筋向に、静脈内に、包膜内に（
１ｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）　、結膜下に（ｓｕｂｃ
ｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌｌｙ）または局所的に投与する
ことができる。部内注射用の配合剤は、典型的には滅菌
水、生理的食塩水または約１％のプロカイン・ＨＣｌ中
の有効量のＰＭＢ複合体よりなるものである。静脈内複
合剤は典型的には５％デキストローズおよび滅菌水中の
有効量のＰＭＢ　複合体よりなるものである。

包膜内複合剤は典型的には生理的食塩水中の有効量のＰ
　Ｍ　Ｂ　複合体よりなるものである。局所的な眼科的
使用には、有効量を水または生理的食塩水および任意に
グリセリン、ならびに点眼薬用硫酸銅と混合してもよく
、また、軟膏または懸濁液にすることもできる。局所適
用用の、特に火傷領域用のクリームは、典型的には不活
性成分、たとえば液体ヘテロラタム、プロピレングリコ
ール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよ
び乳化性ロウ中の有効量の　ＰＭＢ　複合剤よりなるも
のである。

ポリミキシン複合体の使用量は、特定の患者に典型的に
処方されるであろう単独のポリミキシンの量（処置する
条件ならびに患者の年令および体重のような要因を考慮
に入れて）と使用する特定のポリミキシン複合体の活性
とを基準とする。ポリミキシン複合体の有効活性が増加
しているため、その毒性が減少しているため、また、活
性の持続時間が増加しているために、単独のポリミキシ
ンと比較して５０％までの投与量の減少をしばしば実現
することができる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を引用して説明する
ことができる。全ての温度は摂氏温度である。

実施例　１　：　ＰＭＢ　のデキストランへの化学的複
合 （方法Ａ；カルバミン酸エステル 結合） デキストラン（分子量７９．０００または２００．００
０）２ｇを２０ｍｎの水に溶解させ、０℃に冷却し、テ
トラフルオロホウ酸１−シアノ−４−ジメチルアミノピ
リジニウム（ＣＤＡＰ）　５−３００　ｍｇを添加し、
３０秒間混合する。トリエチルアミン（０，２Ｍ５ＣＤ
ＡＰ　５　ｍｇに対して０．０４薦りを激しく撹拌しな
から滴々添加し、全反応混合物を１ｍｌのｌ０ＮＨＣＩ
を含有する８０ｍ１の水冷絶対エタノールに移す。デキ
ストランが沈澱するので、この沈澱を０°Ｃで５分間、
１０００　Ｘ　ｇで遠心して取り出し、２０　　５０＋
＋１の０．２５Ｍ炭酸水素Ｎａ緩衝液にｐＨ９，０で再
溶解させる。この混合物に６００−１００　ｍｇのＰＭ
Ｂ　（粉末の、または水に予備溶解させた）を添加し、
８°Ｃで２４時間撹拌する。ついで、全反応混合物を分
子量５０、０００遮断（ｃｕｔ−ｏｆｆ）の透析用チュ
ーブに移し、０．０５Ｍの発熱性物質を含有しない（ｐ
ｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）　’Ｊン酸緩衝液に対して６
−１０日間透析する。透析した最終的な反応混合物のタ
ンパク質含有量を分光法により、２０８　ｎｍにおける
吸収で、またはブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）
試薬（ビオラッド（Ｂｊｏ　Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ、　ＣＡ、　ＵＳＡ）を用いて５９５　ｎｍで測定す
る。

ニンヒドリン反応を用い、対照体として単独のＰＭＢ　
を使用して遊離のアミノ用いて測定する。

窒素含量および炭素含量の分析はＣＨＮ元素分析計を用
いて行う。

以下の表において、“モル比”は、複合に使用したデキ
ストランの濃度（２３，７マイクロモル）を透析後の最
終的な　ＰＭＢ−タンパク質のマイクロモルで表した濃
度（２０８ｎｍでの分析値を基準にする）で割って決定
する。デキストランは“ｄｘ”と略記する。“Ｃ：Ｎ”
比はデキストラン２ｇあたり４５０分子の水を想定する
。“結合／ＰＭＢ”は、ニンヒドリン反応を基準にした
、ＰＭＢがデキストランに付着している結合数の推定値
である。“ＮＤ”は“測定していない”である。

反応ＣＤＡＰ Ａ　　　２１Ｍモル Ｂ１０６μモル ＢＢ　　１０６μモル ０５３２μモル ＣＣ５３２μモル Ｄ　　１０６４μモル ＤＤ　１０６４μモル Ｅ　　２１２８μモル 複合反応の概要 モル比　　　ＣＡＮ比　結合／ＰＭＢ ｌｄｘ：　０．２３　ＰＭＢ　ＮＤ　　　　　ＮＤｌｄ
ｘ：　１．６２　ＰＭＢ　Ｉｄｘ：１．５２　ＰＭＢ　
３．０１ｄｘ：　１．９５　ＰＭＢ　ｌｄｘ：１．９０
　ＰＭＢ　１．１１ｄｘ：　３．７０　ＰＭＢ　Ｉｄｘ
：３．２５　ＰＭＢ　３．０１ｄｘ：　４．９９　ＰＭ
Ｂ　ｌｄｘ：５．００　ＰＭＢ　２．２１ｄｘ：　６．
６２　ＰＭＢ　ｌｄｘ：８．７０　ＰＭＢ　１．７Ｉｄ
ｘ：　８．８１　ＰＭＢ　ＮＤ　　　　　１．３１ｄｘ
：１０．９　　ＰＭＢ　ＮＤ　　　　　２．１実施例　
２　：　ＰＭＢ　のデキストランへの化学的複合 （方法Ｂ；アミン結合） デキストラン（分子量７９．０００または２００．００
０）１．２５ｇを２０＊１の蒸留水に溶解させ、ついで
過ヨウ素酸Ｎａ　Ｏ，０７１−０，７１ｇを添加する。

２２℃で１時間ののち、この反応混合物をＤＥＡＥＡ２
５カチオン交換樹脂（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ、、
　ＵＳＡ）　）を含有するカラムに移し、この混合物を
回収し、２０−２５ｍ１の単一分画に貯蔵する。ついで
、この酸化したデキストランを８０−２００　ｍｌの炭
酸水素Ｎａ緩衝液またはホウ酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ８，５
−９，０）に溶解させた２ｇのＰＭＢ　　と混合し、６
０分後、４０菖１の０．０５−２５％ホウ水素化Ｎａを
単一処理で、または多重処理で、各処理を３０分ないし
２４時間継続して添加する。この反応を３０分間進行さ
せ、ついで８℃で７−１０日間、０．０５Ｍ発熱性物質
非含有リン酸Ｎａ緩衝液に対して透析する。実施例１に
記載したものと同様にして、透析した最終的な反応混合
物のタンパク含有量と遊離のアミノ基とを分析する。

長期透析による精製に加えて、数個の代表的な試料を１
８時間の透析を用いて迅速精製し、Ｇ１００セフアデツ
クス（５ｅｐｈａｄｅｘ）カラム（ファルマシア社）で
精製し、アミコン濾過装置でＹＭ−１００アミコン濾過
器を用いて濃縮する。

以下の表において、モル比は複合に使用したデキストラ
ンの量（６，２５マイクロモル）を透析後の最終的な　
ＰＭＢ−タンパク質のマイクロモル数（２０８ｎｍでの
データを基準にする）で割って決定する。窒素百分率は
ＣＨＮ元素分析計を用いて測定する。結合／ＰＭＢ　は
、ニンヒドリン反応により推定する。

反応ＮａＩ０４（ｇ） １１５０　０．０１４ １／１０　０．０７１ １１５　　０．１４２ １／４　　０．１７８ １／２’　　０．３５５ 原料１０．７１０ 複合反応の概要 モル比 ｌｄｘ　：　　３．６４　ＰＭＢ ｌｄｘ　：　　１２．９　　ＰＭＢ ｌｄｘ　：　　２６．８　　ＰＭＢ Ｉｄｘ　：　　２９．８　　ＰＭＢ ｌｄｘ　：　　３９．６　　ＰＭＢ ｌｄｘ　：　１５１　　　ＰＭＢ 窒素％ ２１ １．０５ １．７１ ２．７６ ７４ ６．９１ 京反応混合物は濁り、透析後にも濁っている活性 Ａ、　　エンドトキシン誘起致死率 この研究を通じて雄のＣＢ５７ＢＬ／ｃマウス（１８−
２２ｇ、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｓ
））を使用する。ガラノス（Ｇａｌａｎｏｓ）ら９会衆
国国立科学アカデミー報文集（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵＳＡ）　７６　（１９７９）　
５９３９に記載されたものと同様にして、試験動物にエ
ンドトキシン（リストビオロジカル（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃ＾、　
ＵＳＡ）製の０１１１Ｂ４）とガラクトサミンとを投与
して増感する。エンドトキシンとガラクトサミン（３２
０ｍｇ／ｋｇ）とを０．５ｍｌの発熱性物質非含有等張
食塩水に入れて各試験動物に、日差による変化（ｄｉｕ
ｒｎａｌ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を避けるため１３：０
０ないし１５：００に、腹膜内に注射する。投与量一応
答の研究から、０．０１　ｍｇ／ｋｇのエンドトキシン
が８５−９５％の致死率を生むことが測定される。試験
動物は注射後６日間、毎日観察する。

Ｂ、　　　ＰＭＢ（単独および複合形状）誘起致死率Ｐ
ＭＢ　（単独の、および複合形状の）を、非増感マウス
におけるその固有の毒性に関して評価する。この研究を
通じて雄のＣＢ５７ＢＬ／ｃマウス（１ｇ　−２２ｇ、
シャクソン研究所）を使用する。

試験動物に単独のＰＭＢ　または複合ＰＭＢ　を腹膜内
注射により投与（１動物あたり０．５ｔ／）し、致死率
を７日間監視する。ＰＭＢ　（単独の、および複合形状
の）の投与量を変えて、１００％致死率を与える　ＬＤ
ｌｏｏを測定する。各投与量ごとに１０ないし２０匹を
使用する。

Ｃ，ＰＭＢの抗エンドトキシン評価 ＰＭＢ　（単独の、および複合形状の）を腹膜内注射の
前にエンドトキシンと６０分間予予備金するか、または
、単一の腹膜内注射と同一の基剤を同時投与して、その
エンドトキシンを中和する能力に関して評価する。ＰＭ
Ｂ　（単独の、および複合形状の）の濃度は変化させる
が、各注射の体積は１動物あたり０．５ｍｌの一定値に
保つ。複合ＰＭＢ　による保護を単独のＰＭＢ　　と比
較する（体重１ｋｇあたりのタンパク質のｌ１１ｇ数で
表して）。対照例（エンドトキシン、ガラクトサミンお
よびビークル）も各実験に含ませる。各グループは１０
ないし１７匹を有する。

連続性に関するイエート（Ｙａｔｅ）の補正を用いる　
χ−二乗分析を使用して、グループ間の生存率の統計的
分析、または対照例との比較による分析を行う。

ｔＤ＋ｏｏをＰ　Ｄ　１００で割ってＰＭＢ　（単独の
、および複合形状の）の治療指数（ＴＩ）を決定する。

下の表において“処置”は、上記の実施例１および２に
現れる配合体を言う。

抗エンドトキシンデータ ＬＤｌｏｏ　　　ＰＤ＋ｏ。

（ｍｇ／ｋｇ）　　　（ｍｇ／ｋｇ）　　　Ｔ　Ｉ２５
　　　　　２　　　　１２．５ ２５　　　　　２　　　　１２．５ ＞３０　　　　　１　　　　＞３０ ＞２８　　　　　＞２　　　　＞１４ ＮＤ　　　　　　５　　　　ＮＤ Ｉ４０　　　　　２　　　　７０ ８３　　　　　０．２　　４１５ 約４０−６０　　０．０５８００−１２００＞２１２　
　　　　０．２　　＞１０６０＞　２１２　　　　２０
　　　　＞　１０．６処置 単独のＰＭＢ’ 単独のＰＭＢ２ １７５本 １／２１＊ 原料２ 原料３ １迅速精製物質 ２ＰＭＢ　または複合体を腹膜内注射の前にエンドトキ
シンと６０分間反応させる ３　ＰＭＢ　または複合体をエンドトキシンと同時に注
射する 本各商は複合反応に使用した過ヨウ素酸ナトリウムの量
を基準とした反応条件を表す。７１０　ｍｇにこの商を
掛けると各試料に使用した過ヨウ素酸ナトリウムの量が
（ｍｇで）得られる。

実施例　４・紐線ＰＭＢ−デキストラン複合体（方法Ｃ
：アルコール沈澱） １、　製造 上記の実施例２に記載したものと実質的に同様にしてＰ
ＭＢ−デキストラン複合体を製造し、“ＲＸＮＩ１５０
”と呼ばれる複合体を得る。

白色の凝集体であるこの複合体を６０％メタノール中で
沈澱させ、遠心により回収し、ついで超音波再溶解させ
る。この工程を７回繰り返し、得られる物質の純度をゲ
ル透過クロマトグラフィーおよび逆相高圧液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により評価する。ゲル透
過クロマトグラフィーによっては遊離のＰＭＢは検出さ
れないが、ＲＰ−ＨＰＬＣは全タンパク實ＩＢあたり４
８μｇの非配合ＰＭＢ　を示す。ついで、この複合体を
さらに３回沈澱させて非複合ＰＭＢを除去する。

２、　生物学的活性 得られる紐線ＰＭＢ−デキストラン複合体を単独のＰＭ
Ｂ　と、上記の実施例３．Ｃ９に記載したエンドトキシ
ン誘起致死試験において比較する。

ｌ　ｍｇ／ｋｇの静脈内投与において紐線ＰＭＢ　配合
体は、少なくとも６時間のＬＤ、。エンドトキシン誘発
試験（ｃｈａｌｌ、ｅｎｇｅ）に対して〉７０％の保護
を与える。１．Ｏｍｇ／ｋｇの静脈内投与においては、
この複合体はエンドトキシンの投与後１．５時間、治療
的保護を与える。したがって、このＰＭＢ　複合体は予
防的使用に適している。

本紐線ＰＭＢ　複合体は、単独のＰＭＢ　と比較して、
毒性が驚くほど減少している。単独のＰＭＢ　は５　ｍ
ｇ／ｋｇの静脈内ＬＤ、と９．５　ｍｇ／　ｋｇの静脈
内ＬＤ、。。とを有し、毒性の早期開始と狭い治療範囲
とを示唆している。本件紐線ＰＭＢ複合体は＞　１００
　ｍｇ／ｋｇのしＤｏを有し、その固有の無毒性のため
にＬＤ、。。を得ることは不可能であった。下の表にお
いては、ＰＭＢ　（単独の、または複合形状の）の間で
最高無毒性投与量の比較を行った； 生物学的活性 ＬＤ、ＰＤ、ｏ。

処置　　　　　（ｍｇ／ｋｇ）’　　　（ｍｇ／ｋｇ）
２Ｔ　ＩＰ　Ｍ　Ｂ　　　　　　　　　　５　　　　　
０．１　　　　５０超純ＰＭＢ 複合体　　　　＞　１００　　　　０．１　　＞　１０
００’　ＰＭＢ　（単独、または複合形状）を静脈内注
射により投与し、致死率を７日間にわたって監視した ２ＰＭＢ　（単独、または複合形状）を大腸菌０１１１
　Ｂ４エンドトキシン（０，５μｇ／ｋｇ）のＬＤ、。

腹膜内注射の１−３分前に静脈内注射により投与した 本発明の生なる特徴および態様は以下のとおりである。

１、ポリミキシンと担体との水溶性複合体。

２　上記の担体が多糖類たとえばデキストランもしくは
ヒドロキシエチル澱粉、タンパク質たとえばアルブミン
、または重合体たとえばポリビニルピロリドン、ポリエ
チレングリコールもしくはポリビニルアルコールである
ことを特徴とする上記の第１項記載の複合体。

３、上記のポリミキシンがＰＭＢ　であることを特徴と
する上記の第１項記載の複合体。

４、上記の担体がデキストランであることを特徴とする
上記の第２項記載の複合体。

５、上記の担体がデキストランであることを特徴とする
上記の第３項記載の複合体。

６、ＰＭＢ　がカルバミン酸エステル結合を通じて結合
していることを特徴とする上記の第５項記載の複合体。

７、ＰＭＢ　がアミン結合を通じて結合していることを
特徴とする上記の第５項記載の複合体。

８、ａ）　ポリミキシンをデキストランに適当に配合さ
せて水溶性ポリミキシン−デキストラン複合体を形成し ｂ）　得られる複合体を低級アルコール中で沈澱させ Ｃ）　この複合体を再懸濁させ： ｄ）　複合体が非複合のポリミキシンを実質的に含有し
なくなるまで段階ａ）およびｂ）を反復する ことよりなる、上記の第４項記載のポリミキンンーデキ
ストラン複合体の製造方法。

９、上記の第１項記載の複合体をその他の医薬として許
容し得る担体または希釈剤とともに含有する医薬組成物
。

１０、実質的に無毒性の上記の第１項記載の注射可能な
複合体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポリミキシンと担体との水溶性複合体。 ２、ａ）ポリミキシンをデキストランに適当に配合させ
   て水溶性ポリミキシン−デキストラン配合体を形成し； ｂ）得られる複合体を低級アルコール中で沈澱させ； ｃ）この複合体を再懸濁させ； ｄ）複合体が非結合のポリミキシンを実質的に含有しな
   くなるまで段階ｂ）およびｃ）を反復する ことよりなるポリミキシン−デキストラン複合体の製造
   方法。 ３、特許請求の範囲第１項記載の複合体を、医薬として
   許容し得る担体または希釈剤とともに含有する医薬組成
   物。