JPS62283101A - 制癌作用物質複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分訃〕 本発明は、キャリアーと、制癌作用物質とをアルドヘキ
ソピラノース環の開裂したデキストラン（以下、開裂デ
キストランともいう）を介して結合させてなる癌細胞へ
の集積性の優れた制癌作用物Ｍ？１合体の新規製造方法
に関する。

さらに詳しくは、反応に供する開裂デキストランに改良
を加えることにより高収率で制癌作用物質複合体を製造
する方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点］今日、多
数の制癌作用物質が制癌剤として開発され、臨床応用さ
れているが、これらはいずれも癌細胞に対し非特異的で
あって、正常細胞に対しても毒性を有するため、制癌剤
単独による治療効果はあまり得られていない。

このことから、制癌作用物質を癌細胞に対して親和性を
有する物質（キャリアー）と結合させて複合体とし、こ
の複合体を特異的に癌細胞に到達させて制癌作用を発揮
させようとする治療法のアイデアが生まれた。この一つ
として、Ｅ、　Ｉｌｕｌｗｉら（Ｅｕｒｏｐ、　Ｊ、　
Ｃａｎｃｅｒ、　Ｖｏｌ、１４．１２１３−１２２０．
１９７８年）により島表面１允原に対する抗体にデキス
トランを介し、制癌作用を有するアドリアマイシン、ダ
ウンマイシン等を結合させた複合体が開発された。この
複合体の製法は、開裂デキストランのアルデヒド基に抗
体等のキャリアーのアミノ基と制癌作用物質の７ミノ基
とを結合させるというものである。

しかし、この方法で複合体を調製した場合、開裂デキス
トラン中には多数のアルデヒド基が残存しているためキ
ャリアー（一般的にはタンパク質が使用される）との過
剰の結合が起こりやすく、分子の巨大化した化合物が生
成し、目的とする複合体の収呈の低下をきたすという問
題点がある。

従って、本発明の目的は、キャリアー、制癌作用物質お
よび開裂デキストランとが効率よく反応し、高収量で当
該複合体を製造しうる方法を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる目的を達成するために、本発明者等は、より効率
的なキャリアー・開裂デキストラン・制癌作用’Ｔｈ質
複合体の調製研究を行ってきたところ、スペーサとして
使う開裂デキストランのアルデヒド基の５〜７０％程度
、好ましくは１０〜４０％、さらに好ましくは３０％程
度を保護した後に、当該保護された開裂デキストランを
制癌作用物質およびキャリアーと反応させることによっ
て高収量で前記複合体が得られることを見出して本発明
を完成した。

Ｉ！すち、本発明は開裂デキストランに制癌作用物質お
よびキャリアーを反応させることによる制癌作用物質　
開裂デキストラン・キャリアーからなる制癌作用物質複
合体の製造方法において、開裂デキストラン１分子中の
５〜７０％程度、好ましくは１０〜４０％程度のアルデ
ヒド基を保護した後に、当該反応に供することを特徴と
する制癌作用物質複合体の製造方法である。

本発明において開裂デキストランとしては、好適には分
子１１０００〜２００万の範囲のものが用いられ、下式
（１）で示されるアルドヘキソピラノース環の開裂した
部分を１０〜１００％含むデキストランであって、その
５〜７０％程度、好ましくは１０〜４０％、さらに好ま
しくは３０％程度のアルデヒド基の保護は、アルデヒド
基と反応性の基を有する化合物によって行われ、たとえ
ばアミン基を存する化合物が例示され、勿論、制癌作用
物質及びキャリアー以外のアルデヒド基と反応性の基を
有する化合物が使用されることはいうまでもない。当該
アミノ基を有する化合物としては、特に以下の様なアミ
ノ酸が例示される。

中性アミノ酸、 脂肪族アミノ酸〔グリシン、７ラニン、バリン、ロイノ
ン、イソロイノンなど〕、オキソアミノ酸〔セリン、ス
レオニンなど〕、合流アミノ酸〔ノステイン、ソスチン
、メチオニンなど〕、芳香族アミノ酸〔フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファンなど〕 酸性アミノ酸： アスパラギン酸、グルタミン酸など 塩基性アミノ６１： ヒスチジン、リシン、アルギニンなど イミノ酸残基ニ プロリン、オキソプロリンなど α−アミノ酸以外のアミノ酸： β−アラニン、６−アミノ−ｎ−カプロン酸などデキス
トランのアルドヘキソピラノース環の開裂は、通常酸化
によって行われる。酸化剤としては、過ヨウ素酸ナトリ
ウムを用いることが好ましい。例えば、デキストランｔ
ｇに対して約１３０〜１８５０ｍｇの割合で酸化剤を添
加し、１〜２４時間反応を行う。反応の終了後、たとえ
ば反応液を蒸溜水に対し１０〜３０時間透析し、好まし
くは凍結乾燥を行って開裂デキストランを得る。開裂デ
キストランはその１０〜１００％程度、特に２０〜８０
％のアルデヒド基が開裂されていることが好ましい。

本発明において、当該開裂デキストラン中のアルデヒド
基の５〜７０％の保護は、例えば次のようにして行われ
る。即ち、例えば１０〜１００％開裂デキストランの１
００ｍｇに対して、約１２０〜１８００μｍｏｌ　の割
合でアミノ基を有する化合物等のアルデヒド基と反応性
の基を有する化合物を（アミノ基を有する化合物を使用
する場合にはＮ　ａ　［３Ｈｚ　ＣＮ等の還元剤と共に
）添加し、３〜２４時間反応を行う。かくして、開裂デ
キストランの５〜７０％のアルデヒド基がアミノ基を有
する化合物等で保護された化合物を得る。この際、アル
デヒド基とアミノ基を存する化合物が、ン。

フの塩基を形成した後、還元されて２級アミン化合物が
得られる。２級アミン化合物とする理由は、シッフの塩
基不安定であり、これを安定化させるためである。

当該保護された開裂デキストランは制癌作用物質および
キャリアーと反応させる。その際の反応順序は特に制限
されないが、好ましくは、先ず制癌作用物質と反応させ
、得られた化合物をキャリアーと反応させることが好ま
しい。

なお、当該保護された開裂デキストランはそのまま制癌
作用物質とキャリアー、たとえば抗体等のタンパク質の
結合に用いるが、反応に供するアルデヒド基が少ない場
合（たとえばアルデヒド基の保護が過剰に行われた場合
、デキストランの開裂度が少ない場合等）、後の反応（
制癌作用物質およびキャリアーとの反応）のために新た
なアルデヒド基を必要とするので、該化合物は、再度酸
化等の手段でアルドヘキソピラノース環の開裂を行って
もよい。酸化剤の添加量は、所望する酸化の程度に応じ
て適宜選択されるが、たとえば該化合物の１００ｍｇに
対して、約１００〜３２０ＩＩ＋ｇに相当する量である
。酸化剤の添加後、ｌ〜２４時間反応を行い、反応終了
後、透析し、さらに凍結乾燥し、５〜７０％程度、好ま
しくは１０〜４０％程度、さらに好ましくは３０％程度
のアルデヒド基が保護された開裂デキストランを得る。

また、保護に用いる化合物の量を調節することにより再
酸化の工程を省略して該化合物を得ることも可能である
。

得られた化合物は、好ましくは、先ず制癌作用物質と反
応させる。

制癌作用物質は、アルデヒド基と反応性の基（たとえば
アミン基）を存するものであればよく、また、かかる反
応性の基を有しないものについても、当該制癌作用物質
に適当な化合物を反応させてアルデヒド基と反応性のも
のに導くことによって本発明に使用しうる。好適な制癌
作用物質としては、例えば、ダウツマイン／、マイトマ
イノンＣ、アドリアマイシンなどがあげられる。開裂デ
キストランと制癌作用物質との反応は、開裂デキストラ
ンの１分子に対して制癌作用’ｌｙｔ？ｊ２〜１００分
子を結合させることが好ましい。当該反応に際しては、
たとえば、ｐ１１６〜９において水性溶媒（好ましくは
、リン酸環ｔｉｉ　’ｔｆｌ　）中に、開裂デキストラ
ンをｇ終濃度約ｌθ〜３０Ｗ／Ｖ％、制癌作用物質を最
終濃度約０．５〜５Ｗ／Ｖ％の３１合で加えて、１−１
５時間程度反応させることが好適である。

かくしてデキストラン−制癌作用物１７１合体が得られ
る。未反応の制癌作用物質は、たとえばトヨバールＩＩ
Ｗ４０などによる吸着クロマトグラフィー、その他自体
既知の手段にて除去される５次いで、デキストラン−制
癌作用物ｎ７１合体とキャリアー（運搬体）との反応が
行われる。キャリアーは制癌作用物質を癌局所に集中的
に運搬するだめに結合させられるものであり、従って、
癌細胞と親和性を有し、かつアルデヒド基と反応性の基
を存するものであれば特に制限はなく、たとえば免疫グ
ロブリン、癌特異抗体、フィブロネクチン、トランスフ
ェリン、フィブロネクチンが好適に例示される０反応は
、前記デキストラン−制癌作用物１！複合体の５〜３０
Ｗ／Ｖ％を含有するｌ容液に、タンパク賞等のキャリア
ーをその終濃度が、例えばＯ，１〜３Ｗ／Ｖ％になるよ
うな割合で添加し、４〜３５℃で１２〜４０時間反応さ
せることによって実施される。

このようにして得られた本発明に関する複合体は、ゲル
濾過イオン交換樹脂、抗原−セファロースなどにアプラ
イして精製することができる。

かくして得られた本発明の方法で得られた複合体は、例
えば除菌ｄ！過を行った後、分注し、凍結乾燥して乾燥
製剤とされる。

本発明複合体は、ヒトを始めとする哺乳動物の癌に対し
て効率良く集中するので、少量投与で有効であり、本発
明の複合体に結合せしめた制癌作用物質に応した制癌作
用を発揮する。

本発明の複合体はたとえば静脈内投与、点滴静注される
。当２８１２合体は製薬上許容される賦形剤、希釈剤等
、たとえば注射用蒸溜水、生理食塩液等を使用して、た
とえば注射剤、点滴剤として製剤化される０本発明複合
体の投与量は、投与対象の種類、症状、体重、年齢等に
応じて変わりうるちのであり、１０ｍｇ〜１０ｇの本発
明複合体を適当な１容媒０．５〜５００＠１に溶解し、
１日１回または数回に分けて投与される。

〔作用・効果〕

本発明の製造法によれば、開裂デキストランのアルデヒ
ド基の５〜７０％が保護されているので効率よく制癌作
用物質およびキャリアーと反応して目的とする複合体を
製造することが出来、また本発明の方法によって製造さ
れた複合体は保存安定性に優れている。

本発明の製造方法により、複合体の生成率が、６０〜８
０％に上昇する。

〔実施例〕

実施例１ １、スペーサーの調製（１） １）デキストランの酸化 デキストランＴ−１０を５ｇ秤量後４５０ｄのＴ溜水に
溶解し過ヨウ素酸ナトリウム３．３ｇおよび６．６ｇを
含む水溶液５０ａ７をそれぞれ添加し、暗所・室温で５
時間撹拌して、デキストランＴ−１０のグルコース残基
を部分酸化した。この反応液を水に対して−Ｔｌ透析後
凍結乾燥を行い、２５％及び５０％開裂デキストランを
得た。

２）グリシンによる修飾 １）で得られた２５％及び５０％開裂デキストラン１ｇ
を秤星後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解
し、グリシンを固体のまま３４７ｍｇおよび６９５ｍｇ
を各々２５％及び５０％開裂デキストラン溶液に添加し
、同時にシアノ水素化はう素ナトリウム２９２ｍｇ及び
５８３ｍｇを含む水溶液１０献をそれぞれ加えて室温で
５時間反応させ、生じるノノフ塩基を還元した。この反
応溶液を水に対し一夜透析後、残存のグルコース残基を
酸化する目的で過ヨウ素酸ナトリウムを２．７ｇ添加し
、暗所・室温にて５時間反応を行った。この反応液を水
に対して一夜透析、凍結乾燥を行いデキストランＴ−１
０の残存グルコース残基が全て酸化された開裂デキスト
ラン（それぞれアルデヒドの２５％及び５０％が各々グ
リシンで修飾されている）をスペーサーとして得た。

実施例２ ２、スペーサーの調製（２） ｌ）デキストランの酸化 デキストランＴ−１０を５ｇ秤量後、４５０ｓ７の蒸溜
水に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム２．６ｇを含む水溶
？＆５０　ＩＩ／を添加して暗所・室温で５時間攪拌し
てデキストランＴ−１０のグルコース残基を部分酸化し
た。この反応液を水に対して一夜透析後凍結乾燥を行い
、２０％開裂デキストランを得た。

２）システィンによる修飾 ｌ）で得られた２０％開裂デキストラン１ｇを秤看後５
０ＩＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解し、シス
ティンを固体のまま６００ｍｇ添加し同時にシアノ水素
化はう素ナトリウム２３４ｍｇを含む水溶液ＩＯ＠７を
加えて室温で５時間反応、生しるシッフ塩基を還元した
。この反応溶液を水に対し一夜透析後残存のグルコース
残基を過ヨウ素酸ナトリウム２．７ｇで再び酸化した０
反応は暗所・室温にて５時間行い、その後この反応液を
水に対して一夜透析、凍結乾燥を行いデキストランＴ−
１０の残存グルコース残基が全て酸化された開裂デキス
トラン（アルデヒド基の２０％がシスティンで修飾され
ている）を得た。

実施例３ ３、スペーサーの調製（３） ｌ）デキストランの酸化 ｌ）デキス）う７Ｔ−１０を５ｇ秤５ｉ後、５００−の
蒸溜水に溶解し過ヨウ素酸ナトリウム２０ｇを添加して
暗所・室温下５時間反応を行い、デキストランＴ−１０
のグルコース残基を全て酸化した。この反応液を水に対
して一夜透析後、凍結乾燥を行い１００％開裂デキスト
ランを得た。

２）グリシンによる修飾 ｌ）で得られた１００％開裂デキストラン１ｇを秤量後
１００＠７の５０＋＊Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に
溶解し２４０ｍｇ及び４８０ｍｇのグリシンを１０−の
水に溶解後、先のデキストラン？８？＆にそれぞれ添加
した。続いてシアノ水素化はう素ナトリウム２４０また
は４８０ｍｇをそれぞれ添加し、室温下５時間の攪拌を
行い、得られた反応液を水に対して透析、凍結乾燥を行
い２５％及び５０％開裂デキストランをそれぞれ得た。

実施例４ ４、スペーサーの調製（４） ｌ）デキストランの酸化 デキストランＴ−５００を５ｇ秤量後４５０　ｍｌの蒸
溜水に溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム１．３２ｇを含む
水溶液５０−を添加し、暗所・室温で５時間撹拌し、デ
キストランＴ−５００の１０％のグルコース残基を酸化
した。この反応液を水に対して一夜透析後凍結乾燥を行
い、１０％開裂デキストランを得た。

２）６−アミノ−ｎ−カプロン酸による修飾１０％酸化
デキストラン１ｇを５０＋ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）　　１００−に溶解し、６−アミノ−ｎ−カプロン
酸を固体のまま３２４１Ｉｇ添加し同時にシアノ水素化
はう素ナトリウム１２０ｍｇを含む水溶？＆　１０　ａ
ｒｌを加え室温で５時間反応を行った。

この反応液を水に対して一夜透析後、残存のグルコース
残基を全て酸化するためこの溶液に過ヨウ素酸ナトリウ
ム３．２ｇを加え暗所・室温下５時間反応を行った。こ
の反応溶解液を水に対し一夜透析後凍結乾燥を行い開裂
デキストラン（１０％のアルデヒド基が６−アミノ−ｎ
−カプロン酸で修飾されているもの）を得た。

実施例５ ５、スペーサーの調製（５） １）デキストランの酸化 デキストランＴ−７０を５ｇ秤ｆｆｉ後、４５０Ｉ１１
７の蒸溜水に溶解し過ヨウ素酸ナトリウム７、９３　ｇ
を含む水溶液５０１Ｉｌを添加し暗所・室温下５時間攪
拌を行った。この反応液を水に対して一夜透析後、凍結
乾燥を行いデキストランＴ−７０の６０％のグルコース
残基が酸化された６０％開裂デキストランを得た。

２）アラニンによる修飾 ６０％酸化デキストランｔｇを５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ６、０）　　ｌ　ＯＯ−に７８解し、アラニンを固
体のまま１．３２　ｇ添加し、続いてシアノ水素化はう
素ナトリウム９３３ｍｇを含む水溶ｉｉ　１０　ｌｌ１
１を加えて室温で５時間反応を行った。この反応液を水
に対し一夜透析後、過ヨウ素酸ナトリウムを２．６ｇ加
え暗所・室温で５時間反応し残存のグルコース残基を全
て酸化した。その後この溶液を水に対し一夜透析後、凍
結乾燥を行い開裂デキストラン（６０％のアルデヒド基
がアラニンにより修飾されている）を得た。

実施例６ ６、複合体の調製ｆｉｌ 制癌剤としてアドリアマイシン（ＡＤＲ）を用い、この
ものを１０ｍｇ秤５に２ｊｌｔ、先にｊＦＩ製した開裂
デキストラン（２５％のアルデヒド基がグリンンにより
修飾されたもの）１０ｗｇと２　ｐａｌ（１）　５０ｍ
Ｍ’Ｊン酸緩衝１（ｐＨ７，５）中で室温下３時間反応
を行った。その後、この反応液をキャリアーとして用い
た１ｇ０２００ｍｇを金色５０ＩＩＭリン酸緩衝液（ｐ
ｌ＋７．５　）　８　ｍｌに添加、室温下２４時間反応
を行った。この反応溶液を高速ゲル濾過分析に供したと
ころ反応液中のアドリアマイシンの７５％が＋ｇｃと複
合体を形成していた。その分子量は約２０万であった。

実施例７ ７、複合体の調製（２） ダウノマイシンをｔｏｍｇ秤量後、先に調製した開裂デ
キストラン（２０％のアルデヒド基がシスティンにより
修飾されたもの）ｌｏｍｇと２−の５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）中で室温下３時間反応を行った。その
後、この反応液をキャリアーとして用いた抗ＡＦＰモノ
クローナル抗体２００ｍｇを含Ｌ５０ＩＩＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）　　８ａ／に添加し、室温下２４時間
反応を行った。この反応溶液を高速ゲル濾過分析に供し
たところダウノマイシン−抗ＡＦＰモノクローナル抗体
を結合した複合体の生成率は８０％であり、その分子量
は約２０万であった。また抗体価はもとの抗体の９５％
を保持していた。

実施例８ ８．７ｉ１合体の調製（３） 開裂デキストランＴ−５００（１０％のアルデヒド基が
６−アミノ−ｎ−カプロン酸により修飾されている）５
０ｍｇに対してアドリアマイシン５０ｍｇを５０１リン
酸ｌ工衝液（ｐｌ＋　７．５　）　　５　ｃａｌ中で３
時間攪拌を行いアドリアマイシン−酸化デキストランを
得た。この溶ン夜をフィブロネクチン６０ｎｇを含む５
０ｍＭリン酸緩衝？ｅｉ　（ｐＨ７、５）　　５０　ｍ
ｌ中に添加し室温で２４時間の反応を行いアドリアマイ
シン−フィブロネクチンを結合した複合体を得た。

このものの高速ゲル濾過クロマトグラフィーによる分析
によれば、加えたアドリアマイシンの７８％が？Ｍ会合
体形成していた。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルドヘキソピラノース環の開裂したデキストラ
   ンに制癌作用物質およびキャリアーを反応させることに
   よる制癌作用物質・アルドヘキソピラノース環の開裂し
   たデキストラン・キャリアーからなる制癌作用物質複合
   体の製造方法において、アルドヘキソピラノース環の開
   裂したデキストラン１分子中の５〜７０％程度のアルデ
   ヒド基を保護した後に、当該反応に供することを特徴と
   する制癌作用物質複合体の製造方法。
2. （２）アルデヒド基の保護が、アルドヘキソピラノース
   環の開裂したデキストランをアミノ基を有する化合物と
   反応させることによって行われることを特徴とする特許
   請求の範囲第（１）項記載の制癌作用物質複合体の製造
   方法。
3. （３）アルドヘキソピラノース環の開裂したデキストラ
   ン１分子中の１０〜４０％程度のアルデヒド基が保護さ
   れていることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項ま
   たは第（２）項記載の制癌作用物質複合体の製造方法。
4. （４）制癌作用物質がアドリアマイシンまたはダウノマ
   イシンである特許請求の範囲第（１）項または第（２）
   項記載の制癌作用物質複合体の製造方法。
5. （５）キャリアーがガンマグロブリン、癌モノクローナ
   ル抗体、フィブロネクチン、トランスフェリン、フィブ
   リノーゲンから選ばれる特許請求の範囲第（１）項また
   は第（２）項記載の制癌物質作用複合体の製造方法。