JPS63503138A - 診断および治療用抗体複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 診断および治療用抗体複合体 本分囲夏ｌ且 本発明は、薬物、トキシン、キレータ−、ホウ素化合物および検出し得る標識の ような診断または治療成分の抗体への複合体に関し、該診断または治療成分は最 初アミノデキストランまたは長さが少なくとも５０個のアミノ酸ポリペプチドの ようなポリマー担体へ担持され、そしてこの中間体が抗腫瘍抗体のような目標指 向体へ部位特異的に複合化される。生成する複合体は診断または治療成分を目標 組織または器管へ指向し、そこで診断または治療効果が実現される。

目標指向治療効果を得るため抗体へ細胞毒薬物を複合化することは既知である。

特に、メソトレキセート（ＭＴＸ）は抗体へ複合化することができ、そしていく らかの選択的細胞毒性が観察されたことは既知である。細胞毒薬物の抗体担持量 を増すことにより、そのような複合体の選択性および細胞毒性を増強することが 望ましい。

しかしながら、一つの抗体への個々の薬物分子多数の複合化は結局その免疫反応 性を減じ、該影響は薬物約１０分子以上が担持される時に見られる。

薬物を抗体へ複合化される中間ポリマー担体へ複合化することが提案されている 。これは薬物分子の多数が担体自身のより少ない部位において抗体へ結合するこ とができ、そのため免疫反応性がそれほど重大に損傷されないという利点を有す る。

一つのアプローチは、Ｇａｒｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａ ｎｃｅｒ、　３１　：６６１−６７０．１９８３によって報告されているように 、ＭＴＸをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）へ結合し、そして次に中間体を抗体へ 不規則に結合することであった。これら著者はＢＳＡ　（平均分子量７０，００ ０）へＭＴＸ約３約３予 体複合体はもとの抗体のそれの約２８％だけの免疫反応性を持っていた。

ポリマー担体としてポリリジンの使用はＲｙｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　７５　：　３８６７−３８７０． 　１９７８に報告された。これらの著者は担体あたりＭＴＸ１３分子を担持する ことができ、そして免疫反応性は貧弱であることを発見した。加えて、大部分帯 電したアンモニウム基の形にあるポリマーの高いアミン含量は、複合体が正常細 胞に付着し、細胞毒効果の選択性を無効にした。

Ｒｏｗｌａｎｄの米国特許第４．０４６．７２２は、細胞毒剤の複数の分子が分 子量５０００ないし５００，０００のポリマー担体へ共有結合され、そして担持 した担体がペンダントアミンもしくはカルボキシル基へのランダム結合によって 担体へ共有結合した抗体複合体を開示する。共有結合は複合体の一方の成分のア ミン基と他方の成分のカルボキシル基との間にアミド結合を生ずる直接縮合によ り、または抗体上のアミン基への担体のアミン基のグルタルアルデヒド結合によ って実現される。再びこれは抗体の免疫反応性の損失の不利益と、そして抗体お よび／または担体の架橋のいくらかのリスクを有する。Ｇｈｏｓｅｅｔ，　ａｔ ．、　Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ．＋　６１−６５７−６７６ ＋　１９７８は、ガン治療に有用な他の抗体結合細胞毒剤を開示するが、再び共 有結合は抗体の酸化した炭水化物部分へではない。これら参考文献は、薬物担持 ポリマー担体はよく知られていること、しかし過去におけるそれらの抗体への結 合モードは抗体上のペンダントアミンまたはカルボキシル基を介してランダムで あったことを示す。

放射性金属および／または磁気共鳴増強剤として作用することができる金属イオ ンのためのキレート化基は、大部分はポリペプチド鎖上のペンダントアミン、カ ルボキシル、スルフヒドリルまたはフェニル基へのランダム結合を含む。種々の 方法によって抗体へ共有結合されている。トキシンおよびホウ素付加体はまた標 的療法のため種々の方法によって抗体へ結合されており、ホウ素基は一旦それら が結合した抗体標的指向担体によって腫瘍または他の病巣部位へ局在化されたな らば熱中性子照射によって活性化される。酵素、ＤＮＡセグメント、螢光性化合 物等のような検出し得る標識はアッセイに使用するため再びベンダンキ基へのラ ンダム結合によって抗体へ結合される。

抗体へのランダム結合および架橋の望ましくない効果を回避する試みとして、Ｍ ｃＫｅａｒｎらは１９８３年９月１４日に公開されたヨーロッパ特許出願第８８ ，６９５号において、抗体の炭水化物部分を酸化し、生成したカルボニル基（ア ルデヒドおよび／またはケトン基）へ遊離アミン基を有する化合物をシッフ塩基 形成および場合により還元的安定化によって結合することを含む抗体複合体の製 造方法を開示する。この文献はキレータ−１薬物、トキシン、検出し得る標識等 のような種々の化合物の抗体の酸化された炭水化物部分への部位特異性結合を開 示する。結合をもっと容易に開裂させるか、または標的部位において開裂に抵抗 性とするため、これら化合物と抗体との間のスペーサーを提供するため、短いペ プチドリンカ−が開示されている。酸化した炭水化物のアミノデキストランのよ うなポリマーへの結合も開示されているが、しかしイムノアッセイに用いられる ような、抗体のポリマー被覆ビーズ、プレートまたは管のような不溶性支持体へ の結合の環境に躍られる。この文献には薬物、キレータ−等のような機能性分子 を担持したポリマー担体を抗体の酸化した炭水化物部分へ共有結合し、診断剤ま たは治療剤として使用するための可溶性複合体を製造する示唆はない。

従って診断または治療成分を標的組織または器官へ選択的に指向させるため、ま たは高能率および高感度イムノアッセイまたは免疫組織学的用途のため、免疫反 応性の最小の減少を高担持と組合わせる、薬物、トキシン、キレータ−、ホウ素 化合物または検出し得る標識のような診断的または治療的成分の抗体複合体に対 する需要が存在し続ける。

本発所二且ｍ 本発明の一目的は、標的部位における診断または治療効果を増強するため、診断 または治療成分の複数の分子が抗体へ結合している、標的指向抗体への診断また は治療成分の複合体を提供することである。

本発明の他の目的は、複合体がもとの抗体と実質上同じ免疫反応性を有する、抗 体への診断または治療成分の複合体を提供することである。

本発明の他の目的は、複合体が認知し得るほど非標的細胞または組織へ結合せず 、そして薬物またはトキシンの全身副作用を最小化しつつ、標的化複合体が腫瘍 細胞または感染部位へ侵入し、または標的部位においてその治療成分を放出し、 そして標的においてその殺腫瘍または抗菌作用を達成する、抗ガンもしくは抗病 変抗体への抗腫瘍性もしくは抗菌性薬物、またはトキシンの複合体を提供するこ とである。

本発明の他の目的は、シンチグラフまたは磁気共鳴造影のための標的化造影剤と して使用するための、またはラジオアイソトープ療法のための標的化治療剤とし て使用するための、複数のキレータ−を含む抗体複合体を提供することである。

本発明の他の目的は、中性子活性化治療剤として使用するための、複数のホウ素 付加体を含む抗体複合体を提供することである。

本発明の他の目的は、イムノアッセイまたは免疫組織学のための試薬として使用 するための、複数の検出し得る標識を含んでいる抗体を提供することである。

本発明の他の目的は、前述の性質を有する抗体複合体を製造する方法を提供する ことである。

本発明の他の目的は、診断および治療成分の病変および感染部位への標的化した 放出のため前記抗体複合体を使用する、またはイムノアッセイまたは免疫組織学 的用途において増強した検出のため複数の標識を担持する前記複合体を使用する 、診断および治療方法を提供することである。

明細書および請求の範囲をさらに検討するとき、本発明のそれ以外の目的および 利益は当業者に明らかになるであろう。

本分尻ｑ皿！ これらの目的は、少なくとも１個の残存アミン基を有するポリマー担体へ共有結 合した複数の薬物、トキシン、キレータ−、ホウ素付加体または検出し得る標識 を含み、担持させた該担体が前記少なくとも１個のアミノ基により抗体の炭水化 物部分へ還元したシッフ塩基形成によって共有結合している抗体複合体を提供す ることによって達成することができる。

本発明はさらに、 （ａｌ　少な（とも１個の残存アミン基を有し、複数の薬物、トキシン、キレー タ−、ホウ素付加体または検出し得る標識分子がそれへ共有結合したポリマー担 体を酸化した炭水化物部分を有する抗体へ反応させる工程、および （ｂｌ　生成するシンフ塩基付加物を還元的に安定化させる工程を含む抗体複合 体の製造方法を含む。

本発明はまた、本発明の抗体複合体を使用する、診断および治療方法を含む。

詳亙広星論 本発明による抗体複合体の一般的製造方法は、その炭水化物部分が酸化されてい る抗体を、複数の薬物、トキシン、キレータ−、ホウ素付加体または検出し得る 標識を担持し、そして少なくとも１個の遊離アミン官能を有する担体ポリマーと 反応させることを含む。

これは当初のシッフ塩基（イミン）結合をもたらし、該結合は最終複合体を形成 する２級アミンへ還元によって安定化される。

担体ポリマーは、好ましくはアミノデキストラン（ＡＤ）または少なくとも５０ 個のアミノ酸鎖長のポリペプチド（Ｐ　Ｐ）であるが、他の実質上均等なポリマ ー担体も使用することができる。最終抗体複合体は、生体内診断または治療剤と して使用する時、投与の容易性および効率的な標的化のため、ヒト血清に可溶で あることが望ましい。このため担体ポリマー上の可溶化官能は最終複合体の血清 溶解度を増強するであろう。特に、アミン部分上にヒドロキシル官能を持ったア ミノデキストランが好ましいであろう。

アミノデキストランとの複合体の製造プロセスは、通常デキストランポリマー、 有利には約１０．０００ないし１００，０００、好ましくは約３０．０００ない し６０，０００　、そしてさらに好ましくは約４０，０００の平均分子量（ＭＷ ）のデキストランから出発する。デキストランは次に、アルデヒド基を発生する ようにその炭水化物環の一部の制御された酸化を実現するため酸化剤と反応させ られる。酸化は慣用操作に従って、糖分解化学試薬、例えばＮａｌ０ａによって 都合よ〈実施される。

約４０．０００のＭＷのデキストランに対しては約５０ないし１５０゜好ましく は約１００個のアルデヒド基が、他のＭＷデキストランについては約同割合のア ルデヒド基が発生するように酸化剤の量を調節するのが便利である。アルデヒド 基、および後でのアミン基の多過ぎる数は、ポリマーがその時ポリリジンのよう に挙動するので有利でない。少な過ぎる数は薬物、トキシン、キレータ−、ホウ 素付加体または標識分子の望ましい担持より少ない担持を生じ、不利である。

酸化したデキストランは次にポリアミン、好ましくはジアミン、およびさらに好 ましくはモノ−またはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適当なそのような アミンは、例えばエチレンジアミン、プロピレンジアミンまたは類似のポリメチ レンジアミン、ジエチレントリアミンもしくは類似のポリアミン、１，３−ジア ミノ−２−ヒドロキシプロパンもしくは類似のヒドロキシル化ジアミンもしくは ポリアミン等を含む、以前の研究者は一般にエチレンジアミンを使用していたが 、しかし本発明者らは１．３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンのような可溶 化ジアミンによってより良い結果が得られることを示した。アルデヒド官能のシ ッフ塩基（イミン）基への実質上完全な変換を確実にするため、アルデヒド基に 対して過剰のアミンが使用される。

生成する中間体の還元的安定化は、シッフ塩基中間体を還元剤、例えばＮａＢＨ ４，ＮａＢＨ３ＣＮ等と反応させることによって実施される。

イミン基の２級アミン基への実質上完全な還元と、そして未反応アルデヒド基の ヒドロキシル基への還元を確実にするため、過剰の還元剤が使用される。生成す る付加物は、架橋したデキストランを除去するため慣用のサイジングカラムの通 過によってさらに精製することができる。ＡＤ上の利用し得る１級アミノ基の数 の推定は秤量したサンプルとトリニトロベンゼンスルホン酸との反応および４２ ０ｎｍにおける光学密度の標準との相関関係によって実施することができる。こ の方法は通常アルデヒド基の計算数のＡＤ上の１級アミン基への実施上完全な変 換をもたらす。

アミン官能を導入するためのデキストランの他の慣用の誘導体化方法、例えば臭 化シアンとの反応および続いてジアミンとの反応も使用することができる。

ＡＤは次に中間付加体を形成するため、例えばジシクロへキシル力シルボジイミ ド（Ｄ　ＣＣ）またはその水溶性誘導体を使用し、慣用手段によって調製した活 性化形、好ましくはカルボキシル活性化誘導体の形の、担持すべき特定の薬物、 トキシン、キレータ−、ホウ素付加体、または標識の誘導体と反応させる。

メソトレキセート（ＭＴＸ）は本発明による複合体製造に使用するための典型的 薬物であり、そして操作を例証するために使用されるであろう。当業者には自明 な適当な方法で修飾した他の薬物、トキシン、キレ−クー、ホウ素付加体および 標識に対して類似の工程が使用されるであろう。ＭＴＸの活性化は、任意の慣用 のカルボキシ活性化試薬、例えばＤＣＣにより、場合によってその後活性エステ ルを形成するためＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯ３ｕ）との反応によって 便利に実施される。反応は通常極性中性溶媒、例えばジメチルホルムアミド（Ｄ ＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等巾で実施される。他の活性化エス テル、例えばｐ−ニトロベンゾエート等も混合無水物と同様に使用することがで きる。ＤＣＣ／ＨＯ３ｕ活性化は緩和であり、そして活性化したＭＴＸはＡＤと 水性媒体中で反応できるので好ましい。

ＡＤに対する活性化したＭＴＸの割合は、好ましくはＡＤ上の利用できるアミノ 基の約半数が活性化Ｍ　Ｔ　ＸＯカルボキシル基とアミド結合をつくるような割 合である。このようにもし約４０，０００の出発ＭＷを持っているＡＤ上に約１ ００のアミン基が利用可能であれば、これらの約５０までが活性化ＭＴＸと反応 しなければならない。

ＭＴＸ　：　ＡＤ約５０＝１の割合を使用し、ＭＴＸ約２５ないし５０分子が通 常導入される。付加物の溶解度減少によるその初期沈澱のため、より高い担持を 達成することは困難である。

他の薬物のために使用すべき改変の例示として、５−フルオロウラシル（５−Ｆ Ｕ）の担持は５−フルオロウリジンをその炭水化物において例えば過ヨウ素酸塩 を使用して酸化し、この中間体をアミノデキストランと反応させ、そしてシッフ 塩基付加物を還元安定化することによって実行することができる。シクロヘキシ イミドは、そのシクロヘキサノンカルボニルのアミノデキストランアミン基との 直接反応と次に還元安定化か、またはその側鎖ヒドロキシルをジイソチオシアネ ートリンカ−の過剰と反応させ、そしてイソチオシアネート誘導体のアミノデキ ストラン上のアミンとの反応により、またはイミド窒素の例えばハロ酸またはへ ロエステルとの反応および生成するカルボキシル誘導体の例えばＤＣＣによる活 性化およびアミノデキストラン上のアミンとの縮合によって担持することができ る。

他の例証は抗生物質マイトマイシンＣおよびその類縁体によって提供される。こ の分子はアミン官能と環状イミンとを有し、そのどちらもアルキル化活性化基、 例えばスクシンイミジルオキシイオドアセテートまたはスルフォスフシンイミジ ルオキシ（４−イオドアセチル）アミノベンゾエートと反応させることができ、 生成する中間体は次にアミノデキストラン上のアミン基をアルキル化するために 使用される。代わりに、カルボキシル基を例えば無水コハク酸を使用して導入し 、次に例えばＤＣＣにより活性化し、そして活性化した中間体を前のように連結 することができる。

トキシン、例えばアメリカヤマゴボウ抗ビールスタンパク（ＰＡＰ）またはりチ ンＡ−チェーン等は、グルタルアルデヒド縮合により、またはタンパクの活性化 したカルボキシル基のアミノデキストラン上のアミンとの反応によってアミノデ キストランへ結合することができる。

ポリペプチド担体をＡＤＯ代わりに使用することができるが、しかしそれは鎖中 にアミノ酸を少なくとも５０個、好ましくは１００ないし５００個のアミノ酸を 持たなければならない。これらアミノ酸の少なくともいくつかはりジン残基か、 またはペンダントカルボキシル基を有するグルタミン酸もしくはアスパラギン酸 残基でなければならない。リジン残基のペンダントアミンおよびグルタミン酸お よびアスパラギン酸のペンダントカルボキシルは、薬物、トキシン、キレータ− 、ホウ素付加体または標識分子を該ポリマーへつげるのに便利である。適当なそ のようなＰＰ０例は、例ばポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸 、それらの共重合体、およびこれらアミノ酸とそして生成した担持した担体と抗 体複合体へ所望の熔解性質を与えるための他のもの、例えばセリンとの混合ポリ マーを含む。

前に挙げた特定例のほかに、腫瘍細胞またはヒトに感染し病変をおこすことがあ る微生物に対し細胞毒効果を有する多数の薬物およびトキシンが知られている。

それらはメルクインデックス等の薬物およびトキシンの要約に見られる。任意の そのような薬物をこの分野で良く知られた慣用の手段によってＡＤまたはＰＰ上 へ担持することができ、そして前記のものの類似によって例証される。

放射性金属または磁気共鳴増強剤のためのキレータ−はこの分野でよく知られて いる。典型例はエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリ アミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体である。これらは典型的にはその側鎖に キレ−クーが担体へそれによって結合し得る基を持っている。そのような基は例 えばベンゾ　。

イルイソチオシアネートを含み、それによってＤＴＰＡまたはＥＤＴＡは抗体の アミン基へ結合することができる。本発明においては、この同じ基がＡＤまたは ＰＰ上のアミン基へキレータ−を連結するために使用される。代わりに、キレー タ−上のカルボキシル基またはアミン基は、すべて良く知られた方法によって活 性化により、またはあらかじめ誘導体としそして次にカンプリングによってＡＤ またはＰＰへ結合することができる。例えば、Ｇａ−６７に対するキレータ−で あるフェロキサミンは、グルタレートまたはアスパルテート残基を含んでいるＰ Ｐの活性化カルボキシル基へ連結できる、または活性化カルボキシル、イソチオ シアネートもしくは類似の基を含有るすように適当なリンカ−で活性化し、そし てリジン残基をその中に持っているＡＤまたはＰＰ上のアミンへ結合することが できる遊離アミノ基を持っている。

ＡＤのアミンへキレータ−を連結するための他の方法はキレータ−の官能に応じ 当業者には自明であろう。担体のアミンまたはカルボキシル基へのそのような連 結は既知であり、そしてＡＤまたはＰＰ担体ポリマーへの連結に容易に適応させ ることができる。キレータ−上の他の官能も、例えばスルフヒドリルへはアルキ ル化によりチオエーテルの形成、ヒドロキシルへはアシル化により好ましくはウ レタンもしくはエステルの形成、芳香環へは後で担体ヘカンプリングするためカ ルボキシルまたはアミンへ変換し得る基へジアゾカフブリングのように自明であ ろう。

酵素、螢光化合物、電子転移剤および類似物のような標識もこの技術分野におい て良く知られた慣用方法によって担体へ連結することができる。これらから製造 した標識した担体と抗体との複合体は、標識の抗体への直接結合によって製造し た抗体複合体のように、イムノアッセイまたは免疫組織学に使用することができ る。しかしながら、本発明により複合体の複数の標識の担持は、標的抗原への抗 体の低い程度しか得られないアッセイまたは組織学的操作の感度を増大すること ができる。

ホウ素付加体、例えばカルボランは、抗体へ結合させそして病巣へ標的化させる 時、熱中性子照射によって活性化し、高い細胞毒性短距離効果を生ずるアルファ 線放出によって崩壊する放射性原子へ変換することができる。ホウ素付加体と、 そして磁気共鳴増強剤の高担持はそれらの効果を強めるのに非常に重要である。

カルボラン類は、この技術において良く知られているようにペンダント側鎖上の カルボキシル官能を持つようにつくることができる。このカルボキシル基の活性 化と担体上のアミンとの縮合によるこれらカルボランのＡＤまたはＰＰへの結合 は、有用な担持担体の製造を可能とする。

抗体との付加体の複合化は、抗体の炭水化物部分を酸化し、そして生成したアル デヒド（またはケトン）カルボニルを担持後担体上に残っているか、または薬物 、トキシン、キレータ−、ホウ素付加体または標識を担持後それへ導入されたア ミノ基と反応させることによって実現される。典型的には、ＡＤのアミンのすべ ては該担体の担持に使用されず、そして残っているアミンは酸化した担体と縮合 してシッフ塩基付加物を形成し、それは通常水素化ホウ素還元剤により還元安定 化される。

例えば、ＭＴＸ−ＡＤ付加体は、メソトレキセート療法に応答するｌｉｔ瘍によ って生成もしくは関連する抗原へ特異的に結合する任意の抗体へ複合化させるこ とができる。そのような抗原の例は、ヒトじゅう毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、 ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）。

アルファフェトタンパク（ＡＦＰ）、乳房粗大のう胞病タンパク。

乳房上皮細胞抗原、および他の乳房、肺、卵巣、生殖細胞、脳、リンパ腫および 白血病抗原である。そのような抗原に対する抗体は、適当な動物宿主をＩｉ製し た抗ガン抗原またはＩｔ瘍もしくは正常層管７紐織および／または細胞で免疫化 することによって発生させることができる。

これらの抗原および／または細胞はモノクロナール抗体を生産するハイブリドー マを製造する慣用方法に使用することもできる。ヒトまたは霊長類ハイブリドー マモノクロナール抗体は、遺伝子工学およびハイブリドーマ技術の組合わせによ って製造することができる。

次の工程は、複合体のために選定した抗体の炭水化物部分の酸化を含む。これは 化学的、例えばＮａ１Ｏ＋または他の糖分解剤により、または酵素的、例えばニ ューラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼによって便利に実施される。

後者は例えばＢａｎｊｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　１３　：　１５１−１６３．１９７４に報告 されているように、アミノ部分を抗体へ連結するために良く知られた便利な方法 である。

酸化した抗体とＭＴＸ／ＡＤ付加物の割合は、平均約１〜３個の付加物が抗体へ 連結されるように調節される。これは複合体のＭＷを約３００，０００以下にし 、これは細胞摂取および固形腫瘍への拡散を妨害することなく適切な担持を増強 し、同時に血流から複合体の急速な排出を回避または少なくとも軽減するのに望 ましい。分子の炭水化物部分へ部位特異性態様でＭＴＸ−ＡＤ複合体の抗体への 結合は、抗体結合活性を保存し、同時に薬物の高担持を許容する。

本発明によって他の複合体を製造するためには類似の操作が使用される。担持し たＰＰ担体は、好ましくは抗体の酸化した炭水化物部分との縮合のために残って いる遊離リジン残基を持っている。担体上のカルボキシルは、もし必要なら例え ばＤＣＣによる活性化とそしてジアミンの過剰との反応によってアミンへ変換す ることができる。

担体への薬物の担持は薬物の力価、担体標的化の効率、そしてその標的へ到達し たときの複合体の有すＪ性に依存するであろう。大部分の場合、担体上に少なく とも２０．好ましくは５０．そしてしばしば１００以上の薬物の分子を担持させ ることが望ましい。本発明による複合体として、薬物をそれが循環甲部分的にま たは完全に無毒化する能力は、該薬物の全身的副作用を減らし、そして複合化し ない薬物の全身的投与が許容されないときその使用を許容する。例えば、ＭＴＸ およびシクロヘキシイミドはしばしば全身的に投与する時あまりに毒性である。

しがし担体上で抗体へ複合した薬物の多くの分子の投与は全身毒性を軽減しなが ら療法を可能にする。

トキシンは薬物よりしばしばより少なく担持されるであろうが、および場合によ って２０分子以上担持し、そして標的化放出のため抗体へ少なくとも１個の担体 チェーンを担持するのが有利である。

先に述べたように、特にキレート化すべき金属イオンが磁気共鳴増強用の常磁性 イオンである時は、担体ヘキレーターの多数の分子を担持させ、複合体を形成す ることが高度に有利である。そのような場合、高分子量担体ポリマー鎖が好まし く使用され、そして２個以上の担持担体が抗体の炭水化物部分へ縮合される。例 えば、平均分子量１００，０００のデキストランがらっ（ったＡＤ、好ましくは ２−ヒドロキシ−１，３−ジアミノプロパンからつくったＡＤ、および好ましく はデキストランあたり約１００ないし２００アミノ基を含んでいるＡＤを用い、 慣用のサイクリックＤＴＰＡｉ作を用い、または側鎖上に活性化したカルボキシ ルを有する、または側鎖上に他の反応性アシル化基、例えばイソチオシアネート を有する、または側鎖上にアルキル化官能、例えばアルファヨードベンジルもし くはヨードアルキル基を有する他の誘導体の過剰と反応させることにより、約１ ００個のＤＴＰＡキレータ−基が連結される。抗体の酸化した炭水化物部分への い（つかの担持した担体ポリマーチェーン、好ましくは１．５ないし４チエーン の連結は、キレータ−複合体が慣用手段により、好ましくは金属不合溶液中にお いてそしてトランスキレート化剤を使用して金属イオンで担持された後、単−抗 体上に１５０ないし４００個の常磁性イオンの担持を許容するであろう。

生体内診断および治療用途のための本発明の抗体複合体の投与は、診断もしくは 治療成分が抗体へ直接連結している、または担持した担体が抗体のアミノ酸残基 上のアミンもしくはカルボキシル基へ非部位特異性態様でランダムに結合するこ とによって連結されている、同一または類似の薬物、トキシン、キレータ−１ま たはホウ素付加体の複合体に類似の方法によるであろう。そのような投与モード は例証目的のためにここに既に引用した参照中に例示されており、そして文献に 広く見られるであろう。そのためそれらは当業者に良（知られているであろう。

もっと精密な投与法がそれぞれの剤について、再びこの分野で良く知られている ように必要であろう。

ＭＴＸ−ＡＤ−Ａｂの投与は、処理すべき腫瘍のタイプおよび位置に応じて種々 の方法で実施することができる。例えば、投与は静脈内、動脈内、腹腔内、胸膜 内、包成内、皮下、局所カテーテルを通る注入、または直接の病巣内注射による ことができる。

複合体は一般にリン酸緩衝化食塩水中の無菌水溶液として投与されるであろう。

複合体的１０ないし２００■の投与単位が通常毎日数日の期間投与されるであろ う。患者の感受性を減らすため、投与量を減らすか、および／または他のスペシ スからの抗体および／または低アレルギー性抗体、例えば混成ヒトもしくは霊長 類抗体を使用することが必要となり得る。

静脈内、動脈内、または胸膜内投与は通常肺、乳房および白血病Ｉ！ｆｆｉ瘍の ために使用される。腹腔内投与は卵巣腫瘍に推奨される。包成内投与はｌ１ｉｉ ｆ　ｌｌ！瘍および白血病に推奨される。皮下投与はホジキンス病、リンパ腫お よび乳ガンに推奨される。カテーテル注入は転移した肺、乳房または肝臓の生殖 細胞がんに有用である。病巣内投与は肺および乳房病巣に有用である。

上記例示は本発明による複合体の一般的投与方法を示すであろう。

熱中性子活性化療法のためのホウ素付加体担持担体の複合体は同様な方法で通常 実施され、そして中性子放射が実施される前に非標的化複合体が消失するまで持 つことが有利であろう。そのような消失は例えば米国特許第４．６２４．８４６ から知られているように、第２の抗体の使用によって加速することができる。

さらに考究することなく、当業者は以上の説明を使用して、本発明をその全範囲 にわたって利用することができるものと信じられる。

従って以下の好ましい具体例は単に例示と考えるべきであり、記載の残部の限定 と考えてはならない。以下の実施例においてすべての温度は未補正の摂氏で表わ され、特記しない限りすべての部およびパーセントは重量による。

実施例１ アミノデキストランの製造 トランを精製するように水溶液中でＮａｌ０４（０，３３ｇ　）で部分酸化する 。混合物を１１９所で室温で１時間かきまぜる。溶液をアミコンセル（ＹＭ　１ ０膜、肚Ｃｏ　＝　１０．０００）によって濃縮し、セファデックスＧ−２５カ ラムによって精製する。物質を凍結乾燥し、白色粉末８９８ｇ　（収率８９．８ ％）を得る。

ポリアルデヒドデキストラン（８００■、　０．０２ミリモル）をＨ２Ｏ８０献 に溶かし、次に１．３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（２００ｍｇ、　２ ．１５ミリモル）と室温で２４時間反応させる。水素化ホウ素ナトリウム（１１ ，８ｍｇ、　０．３１１　ミリモル）を加え、室温で２４時間反応させる。物質 をＹト１０およびＸＭ−５０を通して膜口過し、小分子を除き、同時に分子量を 選定した範囲に制御する。

アミノ基のレベルを参照物質としてグルコサミンを用い、ＴＮＢＳ（）リニトロ ベンゼンスルホン酸）によってアッセイする。ＮＨ２レベルは１００／デキスト ランと実測される。

実施例２ メソトレキセート／アミノデキストラン中間体の製造（ａｌ　メソトレキセート の活性化 乾燥反応バイアル中へ、無水ＤＭＦ中のメソトレキセ−１−４５，４■（０，１ ミリモル、シグマ）を注射器で導入する。無水ＤＭＦ７５９０μｌ中のＮ−ヒド ロキシスクシンイミド（２３■、０．２　ミリモル。

シグマ）溶液と、無水ＤＭＦ　７５０μβ中の１，３−ジシクロへキシルカルボ ジイミド（４１，５■、０．２ミリモル、シグマ）の溶液を加える。反応混合物 を暗所で無水条件下室温で１６時間がきまぜる。白色沈澱を遠心し、透明溶液を シールしたびん中に一２０’Ｃで貯える。

山）　アミノデキストランとの反応 アミノデキストラン（１０ｍｇ　、　２．５ｘｌＯ−’ミリモル）を２−のＰＢ ３．ｐＨ７，２中に溶かす。活性化したＭＴＸ　（１２５Ｘ１０−４ミリモル） を徐々に加える。溶液を室温で５時間かきまぜ、そしてセファデックスＧ−２５ カラムによってｉ製する。ボイド容積を集め、反応緩衝液に対して透析する。凍 結乾燥後、製品２．１■（収率２１％）が得られる。メソトレキセート結合は３ ７０ｎｍにおける吸収により、３８メソトレキセート／デキストランであると決 定される。

実施例３ 抗体複合体の製造 ［８１抗体の酸化 抗ＣＥＡモノクロナール抗体をメタ過ヨード酸ナトリウムによって選択的に酸化 し、炭水化物部分上にアルデヒド基を生成させる。

操作は以下のとおりである。ＰＢＳ、ｐＨ７，２中の抗体（２■／献）をメタ過 ヨード酸ナトリウム（２，８４ｎ　ｇ　／ｍ）　２０μｌと暗所中室温で９０分 間反応させる。次にエチレングリコール（２μりを加える。１５分後酸化した抗 体をセファデックスＧ−２５カラムにより精製する。ＩｇＧ分画を集め、約１ボ に濃縮し、以下の複合化に使用する。

（ｂ）　複合化 酸化した抗体（約２■）をＰＢＳ、ｐＨ７，２中の実施例２に従って製造したメ ソトレキセート／アミノデキストラン中間体（２，５ｔｇ＋６２．５　Ｘ　１０ −６　ミリモル）と反応させる。溶液は４℃で４８時間反応させる。生成するシ ンフ塩基を水素化シアノホウ素（抗体より１０倍過剰）により安定化する。セフ ァクリルＳ−３００上のサイジングクロマトグラフィーの後、複合体は対照ピー クとして現れ、そして集められる。タンパク濃度はローリ−アッセイによって１ ．０５■（収率５２．５％）であると決定される。メソトレキセートの濃度は３ ７０ｎｍ　（＝６５００）における吸収によって決定される。この複合体はＩｇ Ｇ分子あたりメソトレキセート９１分子を含有することが見られ、これは少なく とも２個のデキストランブリフジが抗体へ結合していることを示す。

この複合体の免疫反応性を間接的螢光標識技術を使用してフローサイトメトリー によって調べる。データを未修飾抗体と比較し、そしてこの方法による複合化は 抗体の免疫反応性を変えないことを示す。

実施例４ ５−ＦＵ抗体複合体の製造 平均分子量１０．０００のポリリジンを過ヨード酸塩で酸化した５−フルオロウ リジンと反応させる。縮合生成物を水素化ホウ素ナトリウムで還元安定化する。

担持したＰＰはポリマー上に平均４０個の５−ＦＵ基を有する。担持した担体と 酸化した抗体との実施例３に類偵の操作による縮合は、１ないし３個の担体グル ープが結合した複合体をつくる。

実施例５ キレート複合体の製造 分子量１００．０００のアミノデキストランをサイクリックＤＴＰＡと反応させ 、その上に平均１００ＤＴＰＡを有する担持担体をつくる。

生成した担持担体と酸化した抗体との縮合、続いて還元安定化は、免疫反応性の 無視し得る減少を伴って抗体あたり工ないし３個の担体グループを持った複合体 を与える。

ガドリニウム（ＩＩＩ）イオンによる、またはインジウム−■、ガリウム−６７ 、テクネチウム−９９ｍによる担体の担持はシンチグラフまたは磁気共鳴造影の ための高度に担持された複合体をつくる。例えばイツトリウム−９０の担持は治 療的に有用な標的化剤をつくる。

実施例６ ＭＴＸ複合体の細胞毒性 ＬＳＩ７４Ｔ　（結腸アデノカルチノーマ）細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで処理 し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０，１０％ＦＣ３，１０００μ／献ペニシリン 、　１０００μｇ／ｍＲストレプトマイシン、　２５　ｍＭ　Ｆｌｅｐｅｓ　） で洗い、そして各処理について６検体づつ１００μβ中４×１０細胞／ウエルに おいてマイクロタイターウェルストリップへ加える。４時間、３７℃、６％ＣＯ ２の後、抗体−メソトレキセート複合体を適当な対照（遊離ＭＴＸ、遊離ＭＴＸ ＋遊離抗体）と共に加える。細胞を追加の２４時間３７℃、６％ＣＯ２において インキュベートし、その時７５−５ｅ−セレノメチオニン０．１μＣｉを１６な いし１８時間加える。プレートは４回洗浄する。個々のウェルを分離し、ガンマ カウンターでカウントする。約３μｈの投与量における複合体は細胞死亡率約５ ０％を生ずる。

実施例７ 腫瘍治療 肺の両方の葉に拡散転移した小細胞カルチノーマを有する婦人患者を１０■／威 の濃度でＰＢＳ中ＭＴＸ−ＡＤ−抗ＣＥＡ抗体複合体１００■の溶液の静注によ って処置する。処置前および複合体最終投与３０日後のＣＡＴ走査は腫瘍体積の ６０％縮小を示す。

以上の実施例は、本発明の一般的にまたは特定的に記載した反応剤および／また は作業条件をもって以上の実施例に使用したものを置き換えることによって同様 の成功度をもってくり返すことができる。

以上の説明から、当業者は本発明の必須の特徴を容易に確かめることができ、そ の精神および範囲を逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるため 、本発明の種々の改変および修飾をなすことができる。

手続補正書 特許庁長官　殿　昭和６３年　８月／！′日ＰＣＴ／ＵＳ８７１００４０６ ２、発明の名称 診断および治療用抗体複合体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　センター、フォア１、モレキュラー、メデイシン、アンド、イζユノロ ジー ６、補正による増加する発明の数　なし７、補正の対象 請求の範囲 ７、補正の内容 別紙のとおり （？！　正　の　内　容　） 請求の範囲 １、少な（とも１個の残存遊離アミン基を有するポリマー担体へ共有結合した複 数分子の薬物、トキシン、キレータ−、ホウ素イ寸加体または検出し得る標識分 子を含み、担持した前記担体番よ前記の少なくとも１個のアミノ基を通して抗体 の炭水化物−分へ還元したシッフ塩基結合によって共有結合されて（、ｓる抗体 複合体。

２、前記抗体はモノクロナール抗体である第１項の抗体複合体。

３、前記複合体はヒトＩｆ［Ｌ清中に可溶である第１項の抗体複合体。

４、前記担体は７ミノデキストランか、またしま長さ力（少なくともアミノ酸５ ０個のポリペプチドである第１項の抗体複合体。

５、前記抗体は抗ガン抗体である第１項の抗体複合体。

６、前記抗ガン抗体は、肺、乳房、結腸直腸、肝臓、す（１）Ｑ、尿号生器、胃 、腎臓、リンパ腺または表皮細胞力ンによってつくられるもしくは関連する抗原 へ特定的に結合する第５項の抗体複合体。

７、前記抗体は非ガン性感染または炎症病変Ｇこよりてつくられるもしくは関連 する抗原へ特定的に結合する第１項の抗体複合体。

８、前記抗体は正常層管もしくは組織の特定タイプに１等徴８′：Ｊな抗原へ特 異的に結合する第１項の抗体複合体。

９、前記ポリマーはアミノデキストランである第１項の抗体複合体。

１０、前記アミノデキストランはデキストランと１．３−ジアミノ−２−ヒドロ キシプロパンの縮合生成物である第９項の抗体複合体。

１１、前記アミノデキストランはその上に約５０なｔ、）Ｌｉ２Ｑ（ＩＮのアミ ノ基を持っている第９項の抗体複合体。

１２、前記複合体はアミノデキストラン１分子当たりメソトレキセート約２５な いし５０分子を有する第１１項の抗体複合体。

１３、前記複合体は抗体あたりメソトレキセートーアミノデキストラン部分１な いし３個を有する第１２項の抗体複合体。

１４、前記ポリマーは長さが少なくとも５０ｆＩＩｉｌのアミノ酸のポリペプチ ド鎖である第１項の抗体複合体。

１５、前記ポリマー担体は細胞毒剤の複数分子を担持している第１項の抗体複合 体。

１６、前記細胞毒剤は抗ガン薬物である第１５項の抗体複合体。

１７、前記抗ガン薬物はメソトレキセート、５−フルオロウラシル、シクロヘキ シイミド、ダウノマイシン、デキソルビシン、クロラムブシル、トレニモン、フ ェニレンジアミンマスタード、アドリアマイシン、プレオマイシン、シトシンア ラビノシドまたはシクロフォスフアミドである第１６項の抗体複合体。

１８、前記細胞毒剤はトキシンである第１５項の抗体複合体。

１９、前記トキシンはリチンもしくはその八−鎖、またはアメリカヤマゴボウ抗 ビールスクンバクである第１８項の抗体複合体。

２０、前記ポリマー抗体は抗生物質の複数分子を担持している第１項の抗体複合 体。

２１、前記抗生物質は抗ビールス、抗カビまたは抗微生物薬物である第２０項の 抗体複合体。

２２、前記抗生物質はマイトマイシン、アドリアマイシンまたはそれらの類縁体 である第２０項の抗体複合体。

２３、前記抗体ポリマーはホウ素付加体の複数分子を担持している第１項の抗体 複合体。

２４、前記ホウ素付加体はカルボラン誘導体である第２３項の抗体複合体。

２５、前記担体ポリマーはキレータ−の複数分子を担持している第１項の抗体複 合体。

２６、前記キレータ−は放射性金属のキレ−クーである第２５項の抗体複合体。

２７、前記キレータ−は磁気共鳴増強全屈イオンのためのキレータ−である第２ ５項の抗体複合体。

２８、前記キレータ−は、（ａｌエチレンジア、ミンチトラ酢酸もしくはジエチ レントリアミンペンタ酢酸の誘導体か、（ｂ）デフェロキサミンか、または（ｅ ）　１．２−もしくは１，３−ジカルボニル化合物のビスチオセミカルバゾンで ある第２５項の抗体複合体。

２９、前記ポリマー担体は検出し得る標識の複数分子を担持している第１項の抗 体複合体。

３０、前記標識は酵素、螢光化合物または電子転移剤である第２９項の抗体複合 体。

３１、４ａ）薬物、トキシン、キレータ−、ホウ素付加体または検出し得る標識 の複数分子がそれへ共有結合した、そして少なくとも１個の残存遊離アミン基を 有するポリマー担体を、酸化した炭水化物部分を持っている抗体と反応させる工 程、および（ｂｌ生成するシッフ塩基付加物を還元安定化する工程を含んでいる 抗体複合体の製造方法。

３２、無菌の薬剤学的に許容し得る注射用ビヒクルに担持されたシンチグラフ造 影剤の形の第２６項の抗体複合体。

３３、無菌の薬剤学的に許容し得る注射用ビヒクルに担持された磁気共鳴造影剤 の形の第２７項の抗体複合体。

３４．無菌の薬剤学的に許容し得る注射用ビヒクルに担持されたヒトの処置のた めの治療組成物の形の第５項、第７項、第８項、第１５項、第１６項、第１８項 、第２０項、第２３項、および第２６項の抗体複合体。

３５、免疫組織学のための診断組成物の形の第２９項の抗体複合体。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１個の残存遊離アミン基を有するポリマー担体へ共有結合した複 数分子の薬物、トキシン、キレーター、ホウ素付加体または検出し得る標議分子 を含み、担持した前記担体は前記の少なくとも１個のアミノ基を通じて抗体の炭 水化物部分へ還元したシッフ塩基結合によって共有結合されている抗体複合体。 前記抗体はモノクロナール抗体である第１項の抗体複合体。 前記複合体はヒト血清中に可溶である第１項の抗体複合体。 前記担体はアミノデキストランか、または長さが少なくともアミノ酸５０個のポ リペプチドである第１項の抗体複合体。 前記抗体は抗ガン抗体である第１項の抗体複合体。 前記抗ガン抗体は、肺、乳房、結腸直腸、肝臓、すい臓、尿性器、胃、腎臓、リ ンパ腺または表皮細胞ガンによってつくられるもしくは関連する抗原へ特定的に 結合する第５項の抗体複合体。 ７．前記抗体は非ガン性感染または炎症病変によってつくられるもしくは関連す る抗原へ特定的に結合する第１項の抗体複合体。 ８．前記抗体は正常器管もしくは組織の特定クプに特徴的な抗原へ特異的に結合 する第１項の抗体複合体。 ９．前記ポリマーはアミノデキストランである第１項の抗体複合体。 １０．前記アミノデキストランはデキストランと１，３−ジアミノ−２−ヒドロ キシプロパンの縮合生成物である第９項の抗体複合体。 １１．前記アミノデキストランはその上に約５０ないし１５０個のアミノ基を持 っている第９項の抗体複合体。 １２．前記複合体はアミノデキストラン１分子当たりメソトレキセート約２５な いし５０分子を有する第１１項の抗体複合体。 １３．前記複合体は抗体あたりメソトレキセートーアミノデキストラン部分１な いし３個を有する第１２項の抗体複合体。 １４前記ポリマーは長さが少なくとも５０個のアミノ酸のポリペプチド鎖である 第１項の抗体複合体。 １５．前記ポリマー担体は細胞毒剤の複数分子を担持している第１項の抗体複合 体。 １６．前記細胞毒剤は抗ガン薬物である第１５項の抗体複合体。 １７．前記抗ガン薬物はメソトレキセート、５ｒ−フルオロウラシル、シクロヘ キシイミド、ダウノマイシン、デキソルビシン、クロラムブシル、トレニモン、 フェニレンジアミンマスクード、アドリアマイシン、プレオマイシン、シトシン アラビノシドまたはシクロフォスフアミドである第１６項の抗体複合体。 １８．前記細胞毒剤はトキシンである第１５項の抗体複合体。 １９．前記トキシンはリチンもしくはそのＡ−鎖、またはアメリカヤマゴボウ抗 ビールスタンパクである第１８項の抗体複合体。 ２０．前記ポリマー抗体は抗生物質の複数分子を担持している第１項の抗体複合 体。 ２１．前記抗生物質は抗ビールス、抗カピまたは抗微生物薬物である第２０項の 抗体複合体。 ２２．前記抗生物質はマイトマイシン、アクチノマイシンまたはそれらの類縁体 である第２０項の抗体複合体。 ２３．前記抗体ポリマーはホウ素付加体の複数分子を担持している第１項の抗体 複合体。 ２４．前記ホウ素付加体はカルボラン誘導体である第２３項の抗体複合体。 ２５．前記担体ポリマーはキレーターの複数分子を担持している第１項の抗体複 合体。 ２６．前記キレーターは放射性金属のキレーターである第２５項の抗体複合体。 ２７．前記キレーターは磁気共鳴増強金属イオンのためのキレーターである第２ ５項の抗体複合体。 ２８．前記キレーターは、（ａ）エチレンジアミンテトラ酢酸もしくはジエチレ ントリアミンペンタ酢酸の誘導体か、（ｂ）デフェロキサミンか、または（ｃ） １，２−もしくは１，３−ジカルボニル化合物のビスチオセミカルバゾンである 第２５項の抗体複合体。 ２９．前記ポリマー担体は検出し得る標識の複数分子を担持している第１項の抗 体複合体。 ３０．前記標識は酵素、螢光化合物または電子転移剤である第２９項の抗体複合 体。 ３１．（ａ）薬物、トキシン、キレーター、ホウ素付加体または検出し得る標識 の複数分子がそれへ共有結合した、そして少なくとも１個の残存遊離アミン基を 有するポリマー担体を、酸化した炭水化物部分を持っている抗体と反応させる工 程、および（ｂ）生成するシッフ塩基付加物を還元安定化する工程を含んでいる 抗体複合体の製造方法。 ３２．（ａ）ガンまたは他の病理学的病変によって産生されるまたは関連する抗 原へ特異的に結合する、放射標識された抗体と、そして（ｂ）無菌の薬剤的に許 容し得る注射ビヒクルとよりなるシンチグラフ造影剤組成物において、前記放射 標識された抗体が第２６項の抗体複合体である改良。 ３３．（ａ）ガンまたは他の病理学的病変によって産生されるまたは関連する抗 原へ特異的に結合する、磁気共鳴増強金属イオンで標識された抗体と、そして（ ｂ）無菌の薬剤的に許容し得る注射ビヒクルとよりなる磁気共鳴造影剤組成物に おいて、前記の標識した抗体は第２７項の抗体複合体である改良。 ３４．（ａ）第５項、第７項、第８項、第１５項、第１６項、第１８項、第２０ 項、第２３項および第２６項のいずれかの抗体複合体と、そして（ｂ）無菌の薬 剤的に許容し得る注射ビヒクルとを含むヒトの処置のための治療組成物。 ３５．第１項の抗体複合体を含み、前記ポリマー担体は検出し得る標識の複数分 子を担持しているイムノアッセイまたは免疫組織学のための診断組成物。