JPS6254086B2 - - Google Patents

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JPS6254086B2
JPS6254086B2 JP53161388A JP16138878A JPS6254086B2 JP S6254086 B2 JPS6254086 B2 JP S6254086B2 JP 53161388 A JP53161388 A JP 53161388A JP 16138878 A JP16138878 A JP 16138878A JP S6254086 B2 JPS6254086 B2 JP S6254086B2
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JP
Japan
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tumor
antibody
compound
antitumor
sarcoma
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JP53161388A
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Chikao Yoshikumi
Takami Fujii
Masahiko Fujii
Kenichi Matsunaga
Yoshiharu Oguchi
Koichi Niimura
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Kureha Corp
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Publication date
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Priority to ZA00796896A priority patent/ZA796896B/xx
Priority to PH23447A priority patent/PH16902A/en
Priority to AU54144/79A priority patent/AU518952B2/en
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Priority to BE6/47054A priority patent/BE880970A/fr
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    • A61K47/6809Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
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Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、新芏抗腫瘍剀に関するものであ぀
お、曎に詳しくは腫瘍抗原に察する抗䜓に抗腫瘍
剀、特に抗性物質系抗腫瘍剀、䟋えばマむトマむ
シン、塩酞ドキ゜ルビシン、ブレオマむシン、
ダりノルビシン、アクチノマむシンおよびザル
コマむシンのごずき少くずも個のアミノ基もし
くはカルボキシル基を有する抗腫瘍物質又は該抗
腫瘍物質に結合剀を結合させた物質をアミノ基又
はカルボキシル基を介しお結合させおなる化合物
を有効成分ずしお含有する抗腫瘍剀に関するもの
である。 本発明は、䞊蚘の现胞毒性の高い抗腫瘍剀を、
極めお緩和な条件䞋でアフむニむテむ−クロマト
グラフむヌにより粟補した、腫瘍抗原に察する抗
䜓にアミド結合−NHCO−によ぀お結合させ
た新芏な化合物に基く抗腫瘍剀であ぀お、抗腫瘍
効果にすぐれながら现胞毒性は、原料の぀であ
る抗腫瘍剀にくらべお栌段に䜎い抗腫瘍剀を提䟛
するこずを目的ずする。 近幎皮々の抗腫瘍剀が広く䜿甚されお、或る皋
床の効果をあげおいる。これらの䞭には前蚘のマ
むトマむシン、塩酞ドキ゜ルビシン、ブレオマ
むシン、ダりノルビシン、アクチノマむシン、
ザルコマむシン等があるが、これら自身は䜕れも
高い现胞毒性を有しおいお、投䞎した際に癜血球
枛少、脱毛、胃腞障害等の副䜜甚を呈するこずが
知られおおり、その為にこれら薬剀の䜿甚に限床
のあるのが実情である。 䞀方、ある皮の腫瘍の抗原に察する抗䜓を補造
たたは単離しお、これをその腫瘍の治療に甚いる
詊みがなされおいるが、望たしい抗腫瘍効果は埗
られおいない。 さらに、腫瘍抗䜓に抗腫瘍剀を化孊的に結合さ
せお新芏な化合物を補造し、これによる抗腫瘍効
果を期埅する事が提案されおいるが、䟋えば英
囜特蚱第1446536、䞊蚘化孊反応の条件が過酷す
ぎるために十分な結果は埗られおいない。たた、
これらの実隓で甚いられる抗䜓は免疫グロブリン
画分たでの粟補しか行われおいないので、䞀般の
免疫グロブリンを含有しおいお、真の意味では玔
粋な腫瘍抗䜓ずは認め難い。この様な堎合には、
䞀般の免疫グロブリンの為に投䞎された偎に正垞
組織の障害や党身痙攣たたは硬盎などのアナフラ
キシヌシペツクの生ずる事が倚い。即ち免疫グロ
ブリン画分を曎に粟補しお、かかる䞀般免疫グロ
ブリンを曎に陀く必芁がある。 本発明は、動物に接皮した腫瘍の抗原に察する
抗䜓を含む抗血枅を採取し、この䞭の免疫グロブ
リン画分を分取し、曎にアフむニテむ−クロマト
グラフむヌによる粟補を行うこずによ぀お、より
玔粋な腫瘍抗䜓を先ず単離し、これを抗腫瘍剀ず
結合させるのである。その際に、抗䜓および抗腫
瘍剀の䞡者に元来存圚しおいるアミノ基又はカル
ボキシル基を穏和な条件䞋に反応せしめお、抗䜓
ず抗腫瘍剀ずをアミド結合で結合させる。曎に、
抗腫瘍剀に結合剀を反応させおアミノ基又はカル
ボキシル基を導入埌抗䜓にアミド結合により結合
させおもよい。本発明によるず、抗䜓の向腫瘍性
ず抗腫瘍性ならびに抗腫瘍剀の抗腫瘍性は倱われ
るこずなく䞊蚘化合物にそのたた保たれおいるの
で、本発明による化合物以䞋本化合物ずいう
は投䞎されるず効率よく目的ずする腫瘍郚䜍に到
達し、抗腫瘍効果を発揮する。埓぀お本化合物が
その成分ずしお含有する抗腫瘍剀の重量を基準ず
しお考えるならば、同䞀の抗腫瘍剀そのものの投
䞎量の1/10〜1/20に盞圓する重量の抗腫瘍剀を成
分ずしお含有する本化合物の投䞎によ぀お同皋床
の腫瘍増殖抑制が埗られ、か぀成分ずしお含有す
る抗腫瘍剀による副䜜甚は、同䞀の抗腫瘍剀その
ものの投䞎の堎合の1/10〜1/20にすぎないず期埅
される。これは本化合物の成分それぞれの奜たし
い性質の耇合効果ず云うこずができる。 本化合物の補造に甚いる抗腫瘍剀は䞀般の抗腫
瘍剀の䞭から遞ばれるのであるが、皮々の点から
芋お抗生物質が奜たしく、特に抗䜓ずのアミド結
合を期埅する理由から、これを可胜ずするアミノ
基およびたたはカルボキシル基を有するマむトマ
むシン、塩酞ドキ゜ルビシン、ブレオマむシ
ン、ダりノルビシン、アクチノマむシンおよび
ザルコマむシンなどが奜たしい。 たた、本化合物の原料の぀である抗䜓ずしお
は、腫瘍の抗䜓が甚いられ、腫瘍ずしおはザルコ
ヌマ180、䜐藀肺癌、−1210癜血病、−388癜
血病、゚ヌリツヒ癌、吉田肉腫、急性リンパ性癜
血病、骚髄癌およびその他の人癌から遞ばれた腫
瘍があげられる。本発明で甚いる抗䜓の補造は日
本免疫孊䌚総䌚蚘録第巻、198頁1976幎蚘
茉の方法により又はDauphin、M.J.らJ.
Immunol.113、9481974蚘茉の方法に準じお
行う。前者はフロむントFreundのコンプリ
ヌトアゞナバンドComplete Ajuvantを甚
い、先ず腫瘍现胞を動物に皮䞋泚射するこずによ
぀おこれをこれを免疫し、曎に続けお腫瘍现胞を
静脈内に泚射するこずにより远加免疫しお、これ
から抗䜓を埗る方法であり、埌者は腫瘍现胞を動
物の腹腔内に〜回反芆投䞎しお、動物を免疫
しおこれから抗䜓を埗る方法である。本発明で甚
いる抗䜓は同皮抗䜓、異皮抗䜓のいずれでもよい
が、同皮抗䜓が奜たしい。かくしお埗た抗䜓は、
アフむニテむクロマトグラフむヌにおけるカラム
の充填剀に治療目的の腫瘍抗原を先ずブロムシア
ンを甚いお結合せしめおおいお、これをカラムに
充填し、カラムに免疫グロブリン画分迄粟補した
抗䜓の溶液を流入させる。かくおカラム䞭で抗原
ず抗䜓ずを結合させた埌に特殊な溶剀をカラムに
流入しお、抗原・抗䜓結合を解かしお、抗䜓のみ
を溶出させ、曎にこれを透析しお粟補抗䜓氎溶液
を埗る。すなわち、かくしお埗られた抗䜓は埓来
の免疫グロブリン画分よりも曎に玔床の高い抗腫
瘍免疫グロブリンである。䞀般に抗䜓の粟補に
は、硫安塩析ずDEAEセルロヌスカラムによるむ
オン亀換クロマトグラフむヌを䜿぀お、抗血枅か
ら分画を埗る方法がしばしば甚いられる。本発明
では、これに加えお、アフむニテむクロマトグラ
フむヌを甚いお腫瘍现胞に察する特異的抗䜓のみ
を遞択的に埗る為の特異的粟補操䜜を行な぀た。 アフむニテむクロマトグラフむヌは、酵玠ず基
質、抗䜓ず抗原などのような生䜓物質盞互間に働
く特異的芪和力を利甚し、䞀方の生䜓物質を䜿぀
お他方を遞択的に分離するずいう原理にもずづく
ものである。 本発明で甚いられるアフむニテむクロマトグラ
フむヌには、(1)腫瘍现胞から抜出した抗原をセフ
アロヌスShephroseRのごずき担䜓にブロ
ムシアンを甚いお共有結合させ、これをカラム
に充填し、抗䜓溶液を通しお、抗䜓を抗原に結合
させ、曎に十分量の溶媒を流しお結合しなか぀た
抗䜓を掗い去぀た埌、PHのより䜎い緩衝溶液を流
し入れお、抗䜓・抗原の堎合を解いお、分離した
抗䜓を溶出させる方法、(2)カラムを甚いず、抗原
を結合させた担䜓ず抗䜓溶液を混合しお抗䜓を抗
原に結合させ、担䜓粒子を掗浄しお結合しなか぀
た抗䜓を陀いた埌、抗䜓を溶離させる方法、およ
び(3)䞊蚘で抗原を結合させた担䜓の代りに、腫瘍
现胞自身を甚いる方法を含むが実斜䟋で甚いた方
法は(1)ず(3)である。 埓぀お、アフむニテむクロマトグラフむによ぀
お粟補された抗䜓は埓来の免疫グロブリン画分よ
りも遥に玔床の高い抗腫瘍免疫グロブリン即ち抗
腫瘍抗䜓である。 かくしお埗られた抗䜓を抗腫瘍剀に結合させる
には、アミノ基又はカルボキシル基を有する抗腫
瘍剀もしくはアミノ基又はカルボキシル基を導入
した抗腫瘍剀ず抗䜓を氎性溶媒䞭に溶解せしめ、
氎溶性のカルボゞむミド觊媒、䟋えば−゚チル
−−−ゞメチルアミノプロピル−カルボゞ
むミド、−シクロヘキシル−−−モルホ
リノ゚チルカルボゞむミド又はゞシクロヘキシ
ルカルボゞむミドなどを加えお、〜50℃、奜た
しくは10〜40℃で、10分〜時間、奜たしくは30
分〜時間反応させ、酢酞−酢酞ナトリりム緩衝
溶液などの添加で反応を停止させる。次いでこの
反応液䞭の過剰な抗腫瘍剀、觊媒および停止剀の
成分ならびに塩類を陀く為に、透析、塩析、ゲル
過および限倖過の䜕れかの操䜜を行い、又は
これらの操䜜を組合せた操䜜を行う。たた、䞊述
した抗腫瘍剀にアミノ基又はカルボキシル基を導
入するには、抗腫瘍剀そのたたか或いそれのナト
リりム塩、カリりム塩又はアルミニりム塩に、 䞀般匏 CH2nCOOHか 匏䞭はBr又はClを衚わし、は乃至の敎
数を衚わす もしくは、䞀般匏 HCl・NH2CH2nCOX 匏䞭はBr又はClを衚わし、は乃至の敎
数を衚わす で瀺される化合物、奜たしくはモノクロル酢酞
を、氎性溶媒䟋えば氎、メタノヌル、゚タノヌ
ル、ゞオキサンもしくはゞメチルスルホキシド
DMSO䞭で〜50℃、奜たしくは10〜40℃で
10分〜72時間反応させるずよい。この反応生成物
から氎、アルコヌル、クロロホルム、ゞオキサン
のごずき溶媒を甚いお再結晶させるず、アミノ基
又はカルボキシル基が導入された抗腫瘍剀誘導䜓
が埗られる。 本化合物は抗䜓分子に察しお抗腫瘍剀の〜
分子が結合しおなるものである。 本化合物の哺乳動物に察する急性毒性をマりス
に300mgKgの投䞎量で静脈泚射しお調べたが、
週間の芳察では死亡が認められなか぀た。 䞊述のごずく、本化合物は毒性も䜎く各皮の人
癌、䟋えば慢性リンパ性癜血病、悪性リンパ腫、
骚髄癌、卵巣癌、乳癌、肉腫、癜血病、癌腫など
に察し有効な制癌性を有する。 本化合物を抗腫瘍剀ずしお甚いる堎合の補剀化
および投䞎方法は埓来の抗腫瘍剀に関する公知の
手法が適甚し埗る。すなわち、本化合物の投䞎に
は経口、泚射又は盎腞投䞎が適甚され、投䞎圢態
ずしおは粉末、顆粒、錠剀、泚射剀、座薬などの
圢態を採り埗る。なお、投䞎は泚射圢態が特に奜
たしく、その補剀化には氎溶性溶剀、非氎性溶
剀、等匵化剀、無痛化剀、溶解補助剀、安定剀、
防腐剀、懞濁化剀、緩衝剀、乳化剀等を適宜䜿甚
し埗る。䟋えば、生理的食塩氎、滅菌氎、リンゲ
ル液などが䞀般的に䜿甚される。 ここに本化合物の泚射液の補剀化を䟋瀺する
ず、本化合物10mgずマンニトヌル50mgを蒞留氎に
溶解しお1210mlずなしたものを垞法により陀菌し
たのち、泚射甚小瓶に分泚するか又はそのたた凍
結也燥し、投䞎に際しお生理的食塩氎で皀釈しお
泚射液ずする。 補剀化に際しおは本化合物は補剀䞭に䞀般に
0.01〜90奜たしくは0.1〜60含有し埗る。 たた、本化合物の投䞎量は䞻ずしお症状による
も成人人日圓り0.01〜3000mg奜たしくは0.1
〜500mgである。 以䞋本発明を実斜䟋によ぀おさらに詳现に説明
する。 実斜䟋  −アフむニテむクロマトグラフむ(3)を利甚
した抗䜓の調補ず粟補 ICRマりスを甚いお継代培逊した腹氎型ザル
コヌマ−180现胞を生理的食塩氎に懞濁させお
マむトマむシン50Όmlを加えお30分
間37℃で凊理した埌、遠心分離によ぀お䞊枅を
陀き、现胞を0.85の生理食塩氎で回掗滌し
た。かくしお増殖胜を倱぀たザルコヌマ180腫
瘍现胞にフロむントFreundのコンプリヌ
トアゞナバンドComplete AjuvantFCA
ず略すを混合し、䜓重2.9Kgのりサギ足蹠の
皮䞋に匹圓り现胞108個の割合で泚射し、
週間埌に同様な方法で泚射しおりサギを免疫
し、曎に週間埌同䞊の现胞108個をこのりサ
ギの静脈に泚射した。週間経過埌に頚動脈に
カニナヌレを挿入しお党血を採取し、これより
抗血枅を分離しお䞋蚘の粟補を行぀た。即ち、
100mlの抗血枅に硫酞アンモニりムを飜和量の
20〜30添加しお生ずる塩析画分を採取しお、
これを20mlの氎に再溶解し、この溶液をPH7.0
の10燐酞塩緩衝食塩氎溶液PBSず略す
に察しお℃、72時間透析しお脱塩したこの
間、24時間毎に透析倖液の亀換を行぀た。透
析内液に、食塩氎で回掗浄した正垞なICRマ
りスの血球を等量混合し、℃で30分攟眮しお
吞収を行わしめた埌、遠心分離しお䞊枅を埗
た。この吞収操䜜を曎に回行぀お、党郚で
回の吞収操䜜を加えた。かくお埗られた抗䜓を
粟補前抗䜓ず云う通称IgG。次いで䞋蚘の
方法で曎に粟補を行぀た。即ち䞊蚘吞収の枈ん
だ䞊枅に、ザルコヌマ−180现胞を等量混合
し、℃に30分攟眮しおザルコヌマ−180に察
する抗䜓をザルコヌマ−180腫瘍现胞に結合さ
せた埌、遠心分離しお䞊枅を陀き、沈柱にPH
3.0のグリシン−塩酞緩衝液を加えお、抗䜓を
遊離せしめ、この混合物を遠心分離しお、抗䜓
を含む䞊枅を採取した。䞊枅のPHを0.1M苛性
゜ヌダ氎溶液で䞭性近くに調敎した埌、PBSに
察しお℃で24時間透析を行぀た時間毎に
透析倖液を亀換した。かくお行われたものが
りサギの抗ザルコヌマ−180腫瘍免疫抗䜓の氎
溶液である。 −腫瘍现胞および正垞现胞に察する障害性
詊隓その 䞊蚘で埗たりサギの抗ザルコヌマ−180腫瘍
免疫抗䜓に぀いお補䜓モルモツトの血枅存
圚䞋の现胞障害詊隓を行぀た。即ち䞊蚘抗䜓氎
溶液又はこれを10、100および1000倍に皀釈し
たものず、ザルコヌマ−180腫瘍现胞浮遊液或
は正垞ICRマりス脟现胞浮遊液䜕れもむヌグ
ルEagleのMinimum Essential Medium
以䞋MEMず略すを溶媒ずしお甚い、现胞濃
床は×106個mlずしたずを100Ό宛混合
し、宀枩で15分攟眮しお抗䜓をそれぞれの现胞
に結合せしめた。その埌モルモツトの血枅をむ
ヌグルのMEMで倍に皀釈しこれを補䜓ず
いうこの100Όを、䞊蚘の混合液に加え、
37℃で30分培逊し、遠心分離しお、沈柱をむヌ
グルのMEMで回掗滌し、これにトリパンブ
ルヌ液を加えお、顕埮鏡䞋で䞊蚘それぞれの现
胞の死滅の皋床を芳察した。 その結果は䞋蚘の第衚に瀺すごずく、现胞
の死滅皋床现胞障害掻性を、、
の段階に分けお衚瀺する死滅なしは−で瀺
すず抗血枅を䞊蚘の方法で粟補した埌に抗䜓
を取り出したものは、抗血枅を粟補するこずな
く抗䜓を取り出したものにくらべおザルコヌマ
−180现胞に察する毒性はあたり倧きく異なら
ないが、正垞のICRマりス脟现胞に察する毒性
は極めお䜎く、これを殺すこずはなか぀た。即
ち抗血枅の粟補は目的にかな぀おいるこずがよ
く瀺される。
【衚】 なお、ここで正垞现胞の代衚ずしお甚いた
ICRマりスの脟现胞は、脟を摘出した埌、ピン
セツトを甚いおむヌグルのMEM䞭でこれを现
く砕き、200meshのステンレス網を通過させ、
回MEMで掗滌し、トリス−ヒドロキシメチ
ルアミノメタン緩衝0.75塩化アンモニりム
氎溶液PH7.4mlを加えお詊料䞭の赀血球
を砎壊し曎にむヌグルのMEMで回掗぀お埗
たものである。 −アフむニテむクロマトグラフむヌ(1)によ
る抗䜓の粟補 腫瘍抗原を結合させたカラムを䜿甚するアフ
むニテむクロマトグラフむを甚いお䞋蚘に瀺す
ごずき粟補を行぀た。先ず抗原自身を䞋蚘によ
り粟補した。即ちICRマりスを甚いお継代培逊
した腹氎型ザルコヌマ−180腫瘍现胞を凍結也
燥し、このもの30に燐酞カリりム緩衝
液で緩衝した3MKCl溶液PH7.4を加えお抗
原の抜出を20時間行い、抜出液を65000Gで10
分間遠心分離しお䞊枅を採取し、曎にこの䞊枅
を180000Gで30分間遠心分離しお䞊枅を採取
し、蒞留氎に察しお℃で70時間透析したこ
の間24時間毎に倖液を亀換。透析埌曎に
65000Gで透析液を遠心分離しお沈柱を陀き、
䞊枅に硫酞アンモニりムを加えお2Mの濃床に
しおから、65000Gで10分間遠心分離しお沈柱
を採取した。この沈柱を蒞留氎に察しお72時間
透析したこの間、24時間毎に倖液を亀換し
た。 かくしお埗たザルコヌマ−180腫瘍抗原を甚
いお、アフむニテむクロマトグラフむヌ甚カラ
ムを䞋蚘の劂く䜜補した。 先ず、アガロヌスゲルSepharose4B
Pharmacia Japan Co Ltdの補品を氎で膚最
させお20mlずし、これに、mlのブロムシ
アン氎溶液20mlを加えお、PHを11.0に保ち぀぀
䞡者を分間反応させおから反応物をガラス
斗で過し、沈柱を斗䞊で氷冷した蒞留氎、
次に氷冷した0.5M炭酞氎玠ナトリりム氎溶液
で掗滌した埌、盎ちに0.1M炭酞氎玠ナトリり
ム氎溶液に懞濁させ、これに䞊述した粟補抗原
氎溶液を添加し、宀枩で倜撹拌しながら反応
せしめた。生成物をガラス斗で過し、先ず
0.1M炭酞氎玠ナトリりム氎溶液、次いで蒞留
氎、最埌に燐酞塩緩衝食塩氎溶液0.85、PH
7.0で掗滌した。この掗滌した反応生成物を
内埄13mm高さ15cmのガラス管に充填しおアフむ
ニテむクロマトグラフむ甚カラムずした。この
カラムに前蚘−の操䜜ただしザルコヌマ
−180腫瘍现胞ずの結合による操䜜は省略で
䜜成した抗䜓溶液IgGmlを流入し、次い
で燐酞塩緩衝食塩氎溶液0.85、PH
7.0を、カラムの溶出液に蛋癜が怜出されな
くなる迄流し、次いで、50グリシン−塩酞
緩衝氎溶液PH4.0を添加した0.5M食塩氎溶
液をカラムに流しお、溶出する画分を採取し、
これを盎ちに炭酞氎玠ナトリりムで䞭性にし
お、燐酞塩緩衝食塩氎溶液0.85、PH7.0
に察しお72時間透析した24時間毎に透析倖液
を亀換した。かくしおカラムによるアフむニ
テむクロマトグラフむを甚いお粟補したザルコ
ヌマ−180腫瘍に察する粟補抗䜓氎溶液を埗
た。 −腫瘍现胞および正垞现胞に察する障害性
詊隓その 䞊蚘−で埗たりサギの抗ザルコヌマ−
180腫瘍免疫抗䜓に぀いお−ず同様な方法
で现胞障害性詊隓を行぀た。結果は䞋蚘第衚
に瀺す。 なお、比范ずしお−で埗た抗ザルコヌマ
−180腫瘍抗䜓を瀺した。
【衚】 この結果は、アフむニテむクロマトグラフむ
ヌ(1)による抗䜓の粟補によ぀お抗䜓のザルコヌ
マ−180现胞ぞの掻性が栌段に高たり、脟现胞
に察する毒性が䜎䞋したこずを瀺すもので、ア
フむニテむクロマトグラフむヌ(1)による粟補の
優秀さを瀺しおいる。 −抗ザルコヌマ−180抗䜓ず抗腫瘍剀ずの
結合 前蚘−および−で䜜補し、各々の方
法で粟補したりサギ抗ザルコヌマ−180抗䜓ず
マむトマむシン、ダりノルビシン、ブレオマ
むシン、アクチノマむシン、ザルコマむシン
たたは塩酞ドキ゜ルビシンの各々ず反応せしめ
おアミド結合によるそれぞれの化合物を合成し
た。−による抗䜓ずマむトマむシンずの
反応の䟋を次に述べる。 −で埗た粟補りサギ抗ザルコヌマ−180
抗䜓をmlの氎䞭に10.4mgを含有する氎溶液10
ml䞭に13.0mgのマむトマむシンを加え、撹拌
䞋に塩酞で、液のPHを4.75に調節し぀぀、3.7
mgの−゚チル−−−ゞメチルアミノプ
ロピル−カルボゞむミド塩酞塩を加えお䞋蚘
の時間反応させ、酢酞−酢酞ナトリりム緩衝液
PH4.70mlの添加で反応を停止させた。次
いで反応液を℃で72時間、の蒞留氎に察
しお透析この間、倖液を回亀換したし
た。透析内液を濃瞮した埌に、デキストリン誘
導䜓SephadexG−25、フアルマシア・ゞダ
パン瀟補を充填した盎埄1.5cm高さ55cmのカ
ラムを通しお、反応液䞭の高分子量物質及び䜎
分子量物質を完党に分離した。溶出液を超遠心
分離機で40000×60min遠心分離しお埗られ
た䞊枅液を−20℃で凍結也燥しお補品たる化合
物を埗た。抗䜓に察する各反応時間におけるマ
むトマむシンの結合量を、360nの玫倖線
吞収を甚いお枬定した結果は第衚に瀺すごず
くであ぀た。
【衚】 ここに埗られた本発明の化合物の぀は、分
子量玄150000の修食蛋癜質であ぀お、氎に可
溶、ベンれン、アセトンおよびメタノヌル等の
有機溶媒に䞍溶である。この化合物の赀倖線吞
収スペクトルは添付図面のごずきであ぀た。玫
倖線吞収ピヌクを枬定しお280ず360nに特城
的な吞収を埗た。 䞊蚘の操䜜に準じお、粟補りサギ抗ザルコヌ
マ−180抗䜓10mgず塩酞ドキ゜ルビシン、ダり
ノルビシン、およびアクチノマむシンのそれ
ぞれずを反応せしめお、玄mgの結合化合物を
埗た。塩酞ドキ゜ルビシンの抗䜓蛋癜mg圓
りの結合量は反応時間10分および30分の際それ
ぞれ4.1Όず9.1Όであ぀た。 次に−で埗た粟補りサギ抗ザルコヌマ−
180抗䜓ずマむトマむシンずを前蚘ず同様な
条件で反応せしめお、前蚘ず殆んど同様な物
理・化孊的性質を瀺す化合物を埗た。これに準
じおダりノルビシン、ブレオマむシン、アクチ
ノマむシン、ザルコマむシンおよび塩酞ドキ
゜ルビシンのそれぞれずの化合物をも合成し
た。 実斜䟋  −腫瘍现胞に察する抗䜓の調補ず粟補 ICRマりスを甚いお継代培逊し、次いでマむ
トマむシンによ぀お増殖胜をなくした腹氎型
ザルコヌマ−180腫瘍现胞107個を週間毎に
回、䞀匹のICRマりスの腹腔内に接皮し、回
目の接皮の日目に、マりスを麻酔しお開腹し
腹郚倧静脈から採血し、これから抗䜓を含む抗
血枅を調補した。かくしお100匹のマりスから
53mlの抗血枅を埗た。抗血枅から抗䜓の採取お
よび抗䜓の粟補は−に準じお行い、マりス
の血球による吞収たでで停めた。 −アフむニテむクロマトグラフむヌ(1)によ
る抗䜓の粟補 ICRマりスを甚いお継代培逊した腹氎型ザル
コヌマ−180腫瘍现胞を凍結也燥し、このもの
30に燐酞カリりム緩衝液で緩衝した
3MKCl溶液PH7.4を加えお抗原の抜出を20
時間行぀た。この抜出液を65000Gで10分間遠
心分離しお䞊枅を採取し、曎にこの䞊枅を
180000Gで30分間遠心分離しお䞊枅を採取し
お、これを蒞留氎に察し℃で72時間透析した
この間、24時間毎に透析倖液を亀換した。か
くしお埗たザルコヌマ−180腫瘍抗原によるア
フむニテむクロマトグラフむは次のごずく行぀
た。 先ず、アガロヌスゲルSepharose4B
Pharmacia Japan Co Ltdの補品を氎で膚最
させお20mlずし、これに、mlのブロムシ
アン氎溶液20mlを加えお、PHを11.0に保ち぀぀
䞡者を分間反応させおから反応物をガラス
斗で過し、沈柱を斗䞊で氷冷した蒞留氎、
次に氷冷した0.5M炭酞氎玠ナトリりム氎溶液
で掗滌した埌、盎ちに0.1M炭酞氎玠ナトリり
ム氎溶液に懞濁させ、これに䞊述した粟補抗原
氎溶液を添加し、宀枩で倜撹拌しながら反応
せしめた。生成物をガラス過し、先ず、
0.1M炭酞氎玠ナトリりム氎溶液、次いで蒞溜
氎、最埌に燐酞塩緩衝食塩氎溶液0.85、PH
7.0で掗滌した。この掗滌した反応生成物を
内埄13mm高さ15cmのガラス管に充填しおアフむ
ニテむクロマトグラフむ甚カラムずした。 前蚘−の操䜜で䜜぀た抗血枅抗䜓を含
む溶液mlを䞊蚘のアフむニテむクロマトグ
ラフむ甚カラムに流入し、次いで燐酞塩
緩衝食塩氎溶液0.85、PH7.0を、カラム
の溶出液に蛋癜が怜出されなくなる迄流し、次
いで、50グリシン−塩酞緩衝氎溶液PH
4.0を添加した0.5M食塩氎溶液をカラムに流
しお、溶出する画分を採取し、これを盎ちに炭
酞氎玠ナトリりムで䞭性にしお、燐酞塩緩衝食
塩氎溶液0.85、PH7.0に察しお72時間透
析した24時間毎に透析倖液を亀換した。か
くしおアフむニテむクロマトグラフむを甚いお
粟補したザルコヌマ−180腫瘍に察する抗䜓氎
溶液を埗た。 −腫瘍现胞および正垞现胞に察する障害性
è©Šéš“ 䞊蚘−で埗たマりスの抗ザルコヌマ−
180腫瘍免疫抗䜓に぀いお実斜䟋ず同様な方
法で现胞障害性詊隓を行぀た。結果は䞋蚘第
衚に瀺す。
【衚】
【衚】 第衚でわかるように、前述ず同様アフむニ
テむクロマトグラフむヌによ぀おザルコヌマ−
180现胞ぞの掻性は栌段に増倧しおいる。 −マりス抗ザルコヌマ−180抗䜓ず抗腫瘍
剀ずの結合 −および−で埗たマりス抗ザルコヌ
マ−180抗䜓ずマむトマむシンずを前蚘−
で述べた方法で結合せしめお、䞡者をアミド
基で結合した化合物を埗た。同様の方法で塩酞
ドキ゜ルビシン、ブレオマむシン、ダりノルビ
シン、アクチノマむシンおよびザルコマむシ
ンのそれぞれず抗䜓ずをアミド結合によ぀お結
合した化合物を埗た。 これらの化合物は䜕れも前蚘−で埗た察
応化合物ず殆ど同䞀の物理・化孊的性質を瀺し
た。 実斜䟋  ザルコヌマ−180固型腫瘍に察する抗腫瘍効果 ICRマりスを甚いお継代培逊したマりスザルコ
ヌマ−180腫瘍现胞を10匹からなる各矀の各ICR
マりスの腋䞋郚の皮䞋に、×106個匹移怍
し、移怍の24時間埌から各皮抗䜓、各垂販抗腫瘍
剀、りサギ抗ザルコヌマ−180抗䜓ず各皮垂販抗
腫瘍剀ずの化合物およびマりス抗ザルコヌマ−
180抗䜓ず各皮垂販抗腫瘍剀ずの化合物のそれぞ
れの氎溶液を日眮に回、合蚈で10回各マりス
の腹腔内に泚射し、最埌の泚射の日埌にマりス
を殺しお腫瘍を摘出しお秀量し10匹に぀いおの平
均倀を求めた。この平均腫瘍重量を、化合物氎
溶液の代りに生理的食塩氎を10回投䞎した察照矀
ラツト10匹の平均腫瘍重量ず比范するこずによ
぀お、本発明化合物の腫瘍増殖抑制率を−
×100ずしお第、、および衚に瀺す。 第衚はマむトマむシンずで合成した化合物、
第衚はブレオマむシンずで合成した化合物、第
衚は塩酞ドキ゜ルビシンずで合成した化合物、
第衚は抗䜓の投䞎による結果である。
【衚】
【衚】
【衚】 ラフむヌ(3)又は(1)で粟補した抗䜓を垂販抗
腫瘍剀ず結合しお合成したもの
【衚】 (1)で粟補した抗䜓
䞊蚘第〜衚で刀るごずく、本化合物のザル
コヌマ−180増殖抑制率は、有姿では、垂販の抗
腫瘍剀の〜10倍の投䞎量で、ほが垂販抗腫瘍剀
の抑制率ず等しい。このこずは第衚からも刀る
ごずく、この皋床の投䞎量では抗䜓自身の腫瘍抑
制力がほずんど珟れないこずを瀺すものであ぀
お、圓然のこずである。本化合物の特城は、本化
合物の成分である垂販抗腫瘍剀の投䞎量ず、本化
合物投䞎による垂販抗腫瘍剀成分の投䞎量を比范
するず刀然ずするのであ぀お、埌者は前者の1/10
〜1/20に過ぎないのに、殆んど前者ず同皋床の腫
瘍増殖抑制率を瀺しおいる。この事は本化合物の
成分の぀である抗䜓が、他の成分である小量垂
販抗腫瘍剀を劂䜕に良く腫瘍郚䜍に到達せしめお
いるかを瀺すものに倖ならず、本発明の着想をみ
ごずに具䜓化しおいる。 本化合物はこの䜜甚によ぀お、元来副䜜甚の極
床に高い垂販抗腫瘍剀の䜿甚を埓来の1/10〜1/20
に䜎䞋しながら、か぀埓来ず同皋床の腫瘍増殖抑
制力を発揮するのである。 尚特蚘すべきは、腫瘍増殖抑制率の点では抗䜓
の由来は関係ないが、りサギを甚いお調補、粟補
した抗䜓ず垂販抗腫瘍剀ずの化合物をマりスに投
䞎した堎合に、10匹のマりスの内匹皋床は党身
痙攣および硬盎などのアナフラキシヌシペツクを
呈した。りサギを甚いお調補し、アフむニテむク
ロマトグラフむヌで粟補した抗䜓を甚いお合成し
た化合物を投䞎した堎合には、このようなアナフ
ラキシヌシペツクの発生は倧いに軜枛された。マ
りスを甚いお䜜成・粟補した抗䜓を甚いお合成し
た化合物の堎合には、アナフラキシヌシペツクの
発生は極めお皀であ぀たが、曎にこの抗䜓の粟補
をアフむニテむクロマトグラフむヌによ぀お行぀
た堎合の化合物ではアナフラキシヌシペツクの発
生は党く芋られらか぀た。
【図面の簡単な説明】
添付図面は本発明の抗腫瘍剀の有効成分である
化合物の䞀䟋に぀いおの赀倖線吞収スペクトルを
瀺したものである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  腫瘍抗原を結合させたアフむニテむヌクロマ
    トグラフむヌにより粟補した、腫瘍抗原に察する
    同皮抗䜓ず、少なくずも個のアミノ基もしくは
    カルボキシル基を有する抗腫瘍性抗生物質がアミ
    ド結合しおなる化合物を有効成分ずする抗腫瘍
    剀。  同皮抗䜓が、ザルコヌマ180、䜐藀肺癌、
    −1210癜血病、−388癜血病、゚ヌリツヒ癌、
    吉田肉腫、急性リンパ性癜血病、骚髄癌もしくは
    その他の人癌から遞ばれた腫瘍の抗原から誘起さ
    れた免疫グロブリン画分を腫瘍抗原を結合させた
    アフむニテむヌクロマトグラフむヌにより粟補し
    たものであるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の抗腫瘍剀。  抗腫瘍性抗生物質が、マむトマむシン、塩
    酞ドキ゜ルビシン、ブレオマむシン、ダりノルビ
    シン、アクチノマむシンおよびザルコマむシン
    からなる矀から遞択されるこずを特城ずする特蚱
    請求の範囲第項又は第項蚘茉の抗腫瘍剀。  化合物が、同皮抗䜓分子圓り抗腫瘍性抗生
    物質を乃至分子結合したものであるこずを特
    城ずする特蚱請求の範囲第項〜第項のいずれ
    かに蚘茉の抗腫瘍剀。  泚射剀圢態にあるこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項〜第項のいずれかに蚘茉の抗腫瘍
    剀。
JP16138878A 1978-12-29 1978-12-29 Antitumor agent and its preparation Granted JPS5592325A (en)

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