JPH0651643B2 - 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 - Google Patents
殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法Info
- Publication number
- JPH0651643B2 JPH0651643B2 JP58005807A JP580783A JPH0651643B2 JP H0651643 B2 JPH0651643 B2 JP H0651643B2 JP 58005807 A JP58005807 A JP 58005807A JP 580783 A JP580783 A JP 580783A JP H0651643 B2 JPH0651643 B2 JP H0651643B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- modified
- mitomycin
- cytocidal
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6881—Cluster-antibody conjugates, i.e. the modifying agent consists of a plurality of antibodies covalently linked to each other or of different antigen-binding fragments covalently linked to each other
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
- Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規な殺細胞性修飾免疫グロブリンとその製造
方法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合する免疫
グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
ト中のアミノ基にマイトマイシンＣ誘導体を結合せしめ
て成る新規な殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法に
関する。
方法に関する。更に詳しくは、殺すべき細胞（以下標的
細胞という）のもつ特定の抗原と選択的に結合する免疫
グロブリンあるいはその抗原結合部位を含むフラグメン
ト中のアミノ基にマイトマイシンＣ誘導体を結合せしめ
て成る新規な殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法に
関する。
抗体蛋白質に、水溶性カルボジイミドの存在下、大量の
マイトマイシンＣを作用させて抗体のカルボキシル基に
マイトマイシンＣを直接結合せしめることは公知である
（特開昭５５−92325）。
マイトマイシンＣを作用させて抗体のカルボキシル基に
マイトマイシンＣを直接結合せしめることは公知である
（特開昭５５−92325）。
本公知方法のごとく、アミノ基とカルボキシル基の間に
アミド結合を形成せしめる縮合剤１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用いる
方法においては、抗体蛋白質分子内のアミノ基とカルボ
キシル基の間で分子内反応や、抗体分子間での同様な反
応が起こり、そのため、抗体の抗原認識活性を低下せし
めたり、治療剤として不適当な高分子アグリゲートを形
成したりする。
アミド結合を形成せしめる縮合剤１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用いる
方法においては、抗体蛋白質分子内のアミノ基とカルボ
キシル基の間で分子内反応や、抗体分子間での同様な反
応が起こり、そのため、抗体の抗原認識活性を低下せし
めたり、治療剤として不適当な高分子アグリゲートを形
成したりする。
又、その様な不都合を極力さけるためには、上記の方法
で用いるアミノ成分であるマイトマイシンＣを、大過剰
に反応させる必要があり、工業的に適当な方法とは言い
難い。
で用いるアミノ成分であるマイトマイシンＣを、大過剰
に反応させる必要があり、工業的に適当な方法とは言い
難い。
又、抗体蛋白質をシアノゲンブロマイドで処理し、ひき
つづき大量のマイトマイシンＣを作用させることによっ
て抗体とＭＭＣの結合物を得ることも公知である（特開
昭５６−135421号）。
つづき大量のマイトマイシンＣを作用させることによっ
て抗体とＭＭＣの結合物を得ることも公知である（特開
昭５６−135421号）。
しかし、本方法によって得られる結合体においては、抗
体蛋白質分子に結合したマイトマイシンＣは１分子であ
り、工業的に適した方法とは言い難い。
体蛋白質分子に結合したマイトマイシンＣは１分子であ
り、工業的に適した方法とは言い難い。
本発明者らは、鋭意研究の結果活性エステル基をその構
造中に含むマイトマイシンＣ誘導体を免疫グロブリンに
作用させ、免疫グロブリンがもつアミノ基に結合させて
得られる修飾免疫グロブリンは、優れた選択的殺細胞能
を有することおよび工業的に極めて有利に製造し得る修
飾免疫グロブリンであることを知見し、本発明に到達し
た。
造中に含むマイトマイシンＣ誘導体を免疫グロブリンに
作用させ、免疫グロブリンがもつアミノ基に結合させて
得られる修飾免疫グロブリンは、優れた選択的殺細胞能
を有することおよび工業的に極めて有利に製造し得る修
飾免疫グロブリンであることを知見し、本発明に到達し
た。
即ち、本発明は一般式〔Ｉ〕 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン及び一般式
〔II〕 で表わされるマイトマイシンＣ誘導体を、免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴と
するその製造方法である。
〔II〕 で表わされるマイトマイシンＣ誘導体を、免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴と
するその製造方法である。
一般式〔Ｉ〕および〔II〕において、Ｒは２価の有機基
を表わすが、好ましくは炭素数２〜７個のアルキレン基
であり、エチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン
基，ペンタメチレン基，２−メチルトリメチレン基等を
挙げることができる。特に好ましいのはトリメチレン基
である。また一般式〔II〕において、Ｘで表わされる活
性エステルのアルコール残基としては、サクシンイミジ
ル基，５−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミジル
基，フタルイミジル基，ｐ−ニトロフエニル基，2,4−
ジニトロフエニル基，2,4,5−トリクロロフエニル基，
ペンタクロロフエニル基等を挙げることができる。
を表わすが、好ましくは炭素数２〜７個のアルキレン基
であり、エチレン基，トリメチレン基，テトラメチレン
基，ペンタメチレン基，２−メチルトリメチレン基等を
挙げることができる。特に好ましいのはトリメチレン基
である。また一般式〔II〕において、Ｘで表わされる活
性エステルのアルコール残基としては、サクシンイミジ
ル基，５−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミジル
基，フタルイミジル基，ｐ−ニトロフエニル基，2,4−
ジニトロフエニル基，2,4,5−トリクロロフエニル基，
ペンタクロロフエニル基等を挙げることができる。
本発明において、免疫グロブリンとは、殺すべき細胞の
もつている特定の抗原と選択的に結合しうる免疫グロブ
リンをいう。かかる免疫グロブリンとしては、例えば、
次の様なものがある。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球
等の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫されたヒ
ト，サル，ウマ，ウシ，ヤギ，ヒツジ，ウサギ，モルモ
ツト，ハムスター，ラツト，マウス等の動物から分離さ
れた抗血清より、エタノール分画，硫安分画，イオン交
換あるいは分子節カラムクロマトグラフイー等の公知の
手段によって調整されるグロブリン（抗体）、あるいは
標的細胞で免疫した動物より採取された抗体産生細胞を
発癌生のある物質で癌化させて得られる細胞の培養液、
あるいは抗体産生細胞を骨髄腫細胞等と細胞融合させて
得られた融合細胞（ハイプリドーマ）から選別された目
的とする抗体産生性のクローンの培養液からまたはこれ
を動物に接種してその血清または腹腔液からも本発明の
免疫グロブリンを得ることができる。免疫グロブリンに
は、IgG,IgA,IgM,IgD,IgEの５種類があることが知られ
ているが、そのどれでも本発明に用いることができる。
もつている特定の抗原と選択的に結合しうる免疫グロブ
リンをいう。かかる免疫グロブリンとしては、例えば、
次の様なものがある。腫瘍細胞あるいは特定のリンパ球
等の標的細胞あるいはそれらを含む組織で免疫されたヒ
ト，サル，ウマ，ウシ，ヤギ，ヒツジ，ウサギ，モルモ
ツト，ハムスター，ラツト，マウス等の動物から分離さ
れた抗血清より、エタノール分画，硫安分画，イオン交
換あるいは分子節カラムクロマトグラフイー等の公知の
手段によって調整されるグロブリン（抗体）、あるいは
標的細胞で免疫した動物より採取された抗体産生細胞を
発癌生のある物質で癌化させて得られる細胞の培養液、
あるいは抗体産生細胞を骨髄腫細胞等と細胞融合させて
得られた融合細胞（ハイプリドーマ）から選別された目
的とする抗体産生性のクローンの培養液からまたはこれ
を動物に接種してその血清または腹腔液からも本発明の
免疫グロブリンを得ることができる。免疫グロブリンに
は、IgG,IgA,IgM,IgD,IgEの５種類があることが知られ
ているが、そのどれでも本発明に用いることができる。
本発明に於いて免疫グロブリンはそのまゝでも、或は抗
原と結合し得る部分を含む限りにおいては、そのフラグ
メント（例えば、Fab,Fab′,Fab′の２量体Ｆ(ab′)2）
でも用いることができる。
原と結合し得る部分を含む限りにおいては、そのフラグ
メント（例えば、Fab,Fab′,Fab′の２量体Ｆ(ab′)2）
でも用いることができる。
免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、分子中に末
端アミノ基や構成アミノ酸のリジンに由来するアミノ基
を複数個有しているので、かかるアミノ基を利用して本
発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンが製造される。利用
されるアミノ基の個数は１〜２０個が好ましい。即ち、
本発明の一般式〔Ｉ〕で表される殺細胞性修飾免疫グロ
ブリンは、一般式〔II〕で表わされるマイトマイシンＣ
誘導体を免疫グロブリンまたは、そのフラグメントと反
応せしめることにより製造される。本反応は、免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントのpH５〜８の緩衝液の溶
液（蛋白濃度は好ましくは0.5〜１００mg/mlに調整す
る）に、０〜４０℃で攪拌しながら、少量の溶媒、例え
ば、N,Nージメチルホルムアミド，メタノール，エタノ
ール，アセトン等に溶かした一般式〔II〕で表わされる
マイトマイシンＣ誘導体（好ましくは前者１モルに対し
１〜５０モル）を添加し、１５分〜１２時間行われる。
その後、反応混合物をゲル過あるいは透析することに
よって未反応のマイトマイシンＣ誘導体と低分子反応生
成物を除き、殺細胞性修飾免疫グロブリンを精製するこ
とができる。
端アミノ基や構成アミノ酸のリジンに由来するアミノ基
を複数個有しているので、かかるアミノ基を利用して本
発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンが製造される。利用
されるアミノ基の個数は１〜２０個が好ましい。即ち、
本発明の一般式〔Ｉ〕で表される殺細胞性修飾免疫グロ
ブリンは、一般式〔II〕で表わされるマイトマイシンＣ
誘導体を免疫グロブリンまたは、そのフラグメントと反
応せしめることにより製造される。本反応は、免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントのpH５〜８の緩衝液の溶
液（蛋白濃度は好ましくは0.5〜１００mg/mlに調整す
る）に、０〜４０℃で攪拌しながら、少量の溶媒、例え
ば、N,Nージメチルホルムアミド，メタノール，エタノ
ール，アセトン等に溶かした一般式〔II〕で表わされる
マイトマイシンＣ誘導体（好ましくは前者１モルに対し
１〜５０モル）を添加し、１５分〜１２時間行われる。
その後、反応混合物をゲル過あるいは透析することに
よって未反応のマイトマイシンＣ誘導体と低分子反応生
成物を除き、殺細胞性修飾免疫グロブリンを精製するこ
とができる。
本発明において用いる一般式〔II〕で表わされるマイト
マイシンＣ誘導体は、例えば、次に示す合成ルートによ
りマイトマイシンＣと二塩基性カルボン酸の酸無水物を
出発原料として合成することができる。好適に用い得る
酸無水物としては、コハク酸無水物，グルタル酸無水
物，３−メチルグルタル酸無水物等を挙げることができ
る。
マイシンＣ誘導体は、例えば、次に示す合成ルートによ
りマイトマイシンＣと二塩基性カルボン酸の酸無水物を
出発原料として合成することができる。好適に用い得る
酸無水物としては、コハク酸無水物，グルタル酸無水
物，３−メチルグルタル酸無水物等を挙げることができ
る。
活性エステルのアルコール部に由来する残基Ｘとして
は、例えば、 がある。
は、例えば、 がある。
本発明において得られた殺細胞性修飾免疫グロブリン
は、殺すべき標的細胞に対し特異的増殖抑制活性を有す
る。
は、殺すべき標的細胞に対し特異的増殖抑制活性を有す
る。
以下、実施例により本発明を詳述する。
参考例１ ウサギ抗Ｌ1210免疫グロブリンの精製 マウス白血病Ｌ1210細胞１×１０６個をフロイント完全
アジユバンドとのエマルジヨンとし、家兎に静脈注射し
た。その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約１×１
０６個のＬ1210細胞をアジユバンドと共に皮下注射し、
最終投与日から８日後に採血した。得られた血液をプー
ルし、血清を分離し、その血清を５６℃、３０分間加
熱、非働化した。こうして得られた抗Ｌ1210血清２００
mlに、硫安の飽和水溶液２００mlを加えて、生じた沈澱
を遠心分離によって分取した。この沈澱を0.1Ｍリン酸
緩衝液(pH7.6)50mlに溶解し、更に同緩衝液に対して十
分に透析した。この透析内液を同じ緩衝液で平衡化した
ジエチルアミノエチルセルロースカラム（３×９４cm）
にかけて、未吸着分画として目的とするウサギ抗1210Ig
G抗体を含む溶液を得た。
アジユバンドとのエマルジヨンとし、家兎に静脈注射し
た。その後更に、１週間間隔で３回、それぞれ約１×１
０６個のＬ1210細胞をアジユバンドと共に皮下注射し、
最終投与日から８日後に採血した。得られた血液をプー
ルし、血清を分離し、その血清を５６℃、３０分間加
熱、非働化した。こうして得られた抗Ｌ1210血清２００
mlに、硫安の飽和水溶液２００mlを加えて、生じた沈澱
を遠心分離によって分取した。この沈澱を0.1Ｍリン酸
緩衝液(pH7.6)50mlに溶解し、更に同緩衝液に対して十
分に透析した。この透析内液を同じ緩衝液で平衡化した
ジエチルアミノエチルセルロースカラム（３×９４cm）
にかけて、未吸着分画として目的とするウサギ抗1210Ig
G抗体を含む溶液を得た。
参考例２ マウスモノクロナル抗ＭＭ４６免疫グロブリンの精製 マウスの乳癌細胞ＭＭ４６に対するマウスのモノクロナ
ル抗体IgG 2b産生性のハイブリドーマ（瀬戸ら、ジャー
ナルオブイムノロジー(Journal of Immunology)第１２
８巻、第２０１項、１９８２年参照）をＢＡＬＢ／Ｃヌ
ードマウスに移植し、１０日後その腹水液をえた。
ル抗体IgG 2b産生性のハイブリドーマ（瀬戸ら、ジャー
ナルオブイムノロジー(Journal of Immunology)第１２
８巻、第２０１項、１９８２年参照）をＢＡＬＢ／Ｃヌ
ードマウスに移植し、１０日後その腹水液をえた。
こうして得られた腹水液４mlを0.1Ｍリン酸緩衝液，pH
8.0に透析した後、同緩衝液に平衡化したプロテインＡ
セフアロースCL-4Bカラム(1.5×22cm)にかけた。同緩衝
液でカラムを充分洗浄し、次に、0.1Ｍクエン酸緩衝液p
H4.5で非特異的免疫グロブリンを溶出した後、0.1Ｍク
エン酸緩衝液，pH3.5で目的とするマウスモノクロナル
抗ＭＭ４６抗体IgG2b(10mg)を溶出した。溶出した抗体
は、５０％飽和硫安により沈澱させ、少量の0.9％塩化
ナトリウム溶液に再溶解した後、0.1Ｍ塩化ナトリウム
を含む0.1Ｍリン酸緩衝液，pH7.5（以下、緩衝液Ａと省
略する）に充分透析した。
8.0に透析した後、同緩衝液に平衡化したプロテインＡ
セフアロースCL-4Bカラム(1.5×22cm)にかけた。同緩衝
液でカラムを充分洗浄し、次に、0.1Ｍクエン酸緩衝液p
H4.5で非特異的免疫グロブリンを溶出した後、0.1Ｍク
エン酸緩衝液，pH3.5で目的とするマウスモノクロナル
抗ＭＭ４６抗体IgG2b(10mg)を溶出した。溶出した抗体
は、５０％飽和硫安により沈澱させ、少量の0.9％塩化
ナトリウム溶液に再溶解した後、0.1Ｍ塩化ナトリウム
を含む0.1Ｍリン酸緩衝液，pH7.5（以下、緩衝液Ａと省
略する）に充分透析した。
実施例１ (イ)殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造 上記参考例２において精製したマウスモノクロナル抗Ｍ
Ｍ４６抗体IgG2b9.74mgを溶解した5.1mlの緩衝液Ａに、
１ａ−（４−サクシンイミジルオキシカルボニルブチリ
ル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサン0.71mgを
溶解したジメチルホルムアミド0.1mlを、ゆるやかな撹
拌下に少量ずつ添加し、以後４℃で５時間放置し反応さ
せた（抗体１分子にマイトマイシンＣ誘導体２０分子を
加え、反応させたことになる）。反応液は、0.9％塩化
ナトリウム溶液に平衡化したセフアデツクスＧー２５カ
ラム(1.0×４８cm)にかけ、未反応のマイトマイシンＣ
誘導体及び低分子反応生成物を除いて、目的とする殺細
胞性修飾免疫グロブリン溶液4.3mlをえた。
Ｍ４６抗体IgG2b9.74mgを溶解した5.1mlの緩衝液Ａに、
１ａ−（４−サクシンイミジルオキシカルボニルブチリ
ル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサン0.71mgを
溶解したジメチルホルムアミド0.1mlを、ゆるやかな撹
拌下に少量ずつ添加し、以後４℃で５時間放置し反応さ
せた（抗体１分子にマイトマイシンＣ誘導体２０分子を
加え、反応させたことになる）。反応液は、0.9％塩化
ナトリウム溶液に平衡化したセフアデツクスＧー２５カ
ラム(1.0×４８cm)にかけ、未反応のマイトマイシンＣ
誘導体及び低分子反応生成物を除いて、目的とする殺細
胞性修飾免疫グロブリン溶液4.3mlをえた。
３６０nmにおける吸光度から、結合したマイトマイシン
Ｃ残基の濃度は20.9μｇ／mlであり、一方バイオ・ラド
プロテインアツセイによる蛋白量の定量（エム ブラ
ッドフォード(M.Bradford),アナリテイカル バイオケ
ミストリー(Analitical Biochemistry)第７２巻，第２
４８項，１９７６年参照）からigG2bの濃度は1.30mg/ml
となった。これから、IgG2b抗体１分子当りのマイトマ
イシンＣ残基の結合数は7.7個と推定された。
Ｃ残基の濃度は20.9μｇ／mlであり、一方バイオ・ラド
プロテインアツセイによる蛋白量の定量（エム ブラ
ッドフォード(M.Bradford),アナリテイカル バイオケ
ミストリー(Analitical Biochemistry)第７２巻，第２
４８項，１９７６年参照）からigG2bの濃度は1.30mg/ml
となった。これから、IgG2b抗体１分子当りのマイトマ
イシンＣ残基の結合数は7.7個と推定された。
(ロ)殺細胞性修飾免疫グロブリンのin vitro癌細胞増殖
抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６のin vitro培養細胞に対し、上記
(イ)で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリンを、マイト
マイシンＣ相当の濃度で０〜1500ng/mlになるように添
加して４８時間培養後、トリパンブルー染色法により生
細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、比較として、Ｍ
Ｍ４６細胞に対し何ら特異的な親和生をもたない無関係
の蛋白質であるウシ血清アルブミンを、上記(イ)と類似
の方法によって、１ａ−（４−サクシンイミジルオキシ
カルボニルブチリル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマ
イトサンによって修飾した、修飾ウシ血清アルブミンを
もちいた。結果を第１図に示した。
抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６のin vitro培養細胞に対し、上記
(イ)で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリンを、マイト
マイシンＣ相当の濃度で０〜1500ng/mlになるように添
加して４８時間培養後、トリパンブルー染色法により生
細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、比較として、Ｍ
Ｍ４６細胞に対し何ら特異的な親和生をもたない無関係
の蛋白質であるウシ血清アルブミンを、上記(イ)と類似
の方法によって、１ａ−（４−サクシンイミジルオキシ
カルボニルブチリル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマ
イトサンによって修飾した、修飾ウシ血清アルブミンを
もちいた。結果を第１図に示した。
第１図より修飾アルブミンは、非常に弱い活性しか示さ
ないのに対し、本発明の修飾免疫グロブリンでは、濃度
依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この修飾免疫グ
ロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６細胞に特異的に
反応し作用したことが分かる。
ないのに対し、本発明の修飾免疫グロブリンでは、濃度
依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この修飾免疫グ
ロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６細胞に特異的に
反応し作用したことが分かる。
なお、培養条件は以下の通りであった。
培養条件： 実施例２ (イ)参考例１で得られたウサギigG5.3mgを含有する1.0ml
の0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)に、氷冷下１ａ−（４−サ
クシンイミジルオキシカルボニルブチル）−７−アミノ
−９ａ−メトキシマイトサンの７０mMDMF溶液１２μｌ
を加え、４°で一夜放置して反応せしめた。沈澱を遠心
分離した後、上澄をセフアデツクスＧ−２５（１×４０
cm，１０mMリン酸緩衝液−0.14Ｍ塩化ナトリウム(pH7.
0)にかけて、高分子域の画分を集めると、目的物である
MMC誘導体で修飾されたウサギIgGが得られた。
の0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)に、氷冷下１ａ−（４−サ
クシンイミジルオキシカルボニルブチル）−７−アミノ
−９ａ−メトキシマイトサンの７０mMDMF溶液１２μｌ
を加え、４°で一夜放置して反応せしめた。沈澱を遠心
分離した後、上澄をセフアデツクスＧ−２５（１×４０
cm，１０mMリン酸緩衝液−0.14Ｍ塩化ナトリウム(pH7.
0)にかけて、高分子域の画分を集めると、目的物である
MMC誘導体で修飾されたウサギIgGが得られた。
(ロ)上記(イ)で得られた修飾ウサギIgGに結合したマイト
マイシンＣ残基量を紫外線吸により下記のごとく決定し
た。即ち、修飾ウサギIgGは２８０nmと３６０nmに吸収
極大を示したが、２８０nmの吸光度よりIgGの蛋白質濃
度を、３６０nmの吸光度より、マイトマイシンＣ残基の
濃度を求めた。２つの濃度の比は、IgG１分子に含有さ
れるマイトマイシンＣ残基数を表わすが、(イ)で得られ
た修飾グロブリンでは、IgG１分子に、マイトマイシン
Ｃ残基が、7.6個含有されることが判明した。
マイシンＣ残基量を紫外線吸により下記のごとく決定し
た。即ち、修飾ウサギIgGは２８０nmと３６０nmに吸収
極大を示したが、２８０nmの吸光度よりIgGの蛋白質濃
度を、３６０nmの吸光度より、マイトマイシンＣ残基の
濃度を求めた。２つの濃度の比は、IgG１分子に含有さ
れるマイトマイシンＣ残基数を表わすが、(イ)で得られ
た修飾グロブリンでは、IgG１分子に、マイトマイシン
Ｃ残基が、7.6個含有されることが判明した。
本実施例で得られた修飾免疫グロブリンは、マウス白血
病L1210細胞に対し、殺細胞性を示した。
病L1210細胞に対し、殺細胞性を示した。
実施例３ (イ)殺細胞性修飾免疫グロブリンのin vitro癌細胞増殖
抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６ のin vitro培養細胞に対し、上記
実施例１の(イ)で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリン
を、マイトマイシンＣ相当の濃度で０〜1500ng/mlにな
るように添加して４８時間培養後、トリパンブルー染色
法により生細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、比較
の為に１ａ−（４−サクシンイミジルオキシカルボニル
ブチリル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサンに
よる修飾を施していない抗ＭＭ４６免疫グロブリンを対
照としてもちいた。結果を第２図に示した。
抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６ のin vitro培養細胞に対し、上記
実施例１の(イ)で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリン
を、マイトマイシンＣ相当の濃度で０〜1500ng/mlにな
るように添加して４８時間培養後、トリパンブルー染色
法により生細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、比較
の為に１ａ−（４−サクシンイミジルオキシカルボニル
ブチリル）−７−アミノ−９ａ−メトキシマイトサンに
よる修飾を施していない抗ＭＭ４６免疫グロブリンを対
照としてもちいた。結果を第２図に示した。
第２図より、未修飾の免疫グロブリンが全く活性を示さ
ないのに対し、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンに
は濃度依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この殺細
胞性修飾免疫グロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６
細胞に特異的に反応し作用したことが分る。
ないのに対し、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリンに
は濃度依存性の強い増殖抑制活性が認められ、この殺細
胞性修飾免疫グロブリンがその標的細胞であるＭＭ４６
細胞に特異的に反応し作用したことが分る。
なお、培養条件は以下の通りであった。
培養条件： (ロ)殺細胞性修飾免疫グロブリンのin vitro癌細胞増殖
抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６のin vitro培養細胞に対し、上記実
施例１の(イ)で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリン
を、マイトマイシンＣ相当の濃度で０〜１５００ng/ml
になるように添加して４８時間培養後、トリパンブルー
染色法により生細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、
比較の為に、ＭＭ４６細胞に対し何らと特異的な親和性
をもたない正常マウスの非特異的免疫グロブリンを、上
記実施例１の(イ)と類似の方法によって、１ａ−（４−
サクシンイミジルオキシカルボニルブチリル）−７−ア
ミノ−９ａ−メトキシマイトサンによって修飾し、対照
としてもちいた。結果を第３図に示した。
抑制活性の測定 マウス乳癌ＭＭ４６のin vitro培養細胞に対し、上記実
施例１の(イ)で製造した殺細胞性修飾免疫グロブリン
を、マイトマイシンＣ相当の濃度で０〜１５００ng/ml
になるように添加して４８時間培養後、トリパンブルー
染色法により生細胞数を顕微鏡下に測定した。この時、
比較の為に、ＭＭ４６細胞に対し何らと特異的な親和性
をもたない正常マウスの非特異的免疫グロブリンを、上
記実施例１の(イ)と類似の方法によって、１ａ−（４−
サクシンイミジルオキシカルボニルブチリル）−７−ア
ミノ−９ａ−メトキシマイトサンによって修飾し、対照
としてもちいた。結果を第３図に示した。
第３図より、修飾した非特異的免疫グロブリンが非常に
弱い活性しか示さないのに対し、本発明の殺細胞性修飾
免疫グロブリンには濃度依存性の強い増殖抑制活性が認
められ、この殺細胞性修飾免疫グロブリンがその標的細
胞であるＭＭ４６細胞に特異的に反応し作用したことが
分かる。
弱い活性しか示さないのに対し、本発明の殺細胞性修飾
免疫グロブリンには濃度依存性の強い増殖抑制活性が認
められ、この殺細胞性修飾免疫グロブリンがその標的細
胞であるＭＭ４６細胞に特異的に反応し作用したことが
分かる。
なお、培養条件は以下の通りであった。
培養条件： 比較例１ マウスモノクロナール抗ＭＭ４６抗体ＩｇＧ２ｂ１０mg
を０．１Ｎ食塩水に溶解して得た溶液に水溶性カルボジ
イミド〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド〕５mgを加え、pHを６に調整しつつ
室温下に２時間反応させた。反応液を電気永動法（ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル使用）により調べたところ、
ＩｇＧ部のバンドに加えて、高分子量域に新たにＩｇＧ
の２量体を示すバンドが認められた。
を０．１Ｎ食塩水に溶解して得た溶液に水溶性カルボジ
イミド〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド〕５mgを加え、pHを６に調整しつつ
室温下に２時間反応させた。反応液を電気永動法（ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル使用）により調べたところ、
ＩｇＧ部のバンドに加えて、高分子量域に新たにＩｇＧ
の２量体を示すバンドが認められた。
一方、実施例１で得られた殺細胞性修飾免疫グロブリン
は単一なバンドを示した。
は単一なバンドを示した。
第１〜３図は、本発明の殺細胞性修飾免疫グロブリン
の、マウス乳癌ＭＭ４６細胞に対する増殖抑制効果を示
す。
の、マウス乳癌ＭＭ４６細胞に対する増殖抑制効果を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 武田 由美子 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 原 健 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物医学研究所内 (56)参考文献 特開 昭55−92325（ＪＰ，Ａ) 大河原信ほか編「合成試薬」（昭55−６ −１）講談社Ｐ．134〜135
Claims (4)
- 【請求項１】一般式〔Ｉ〕 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン。
- 【請求項２】式〔Ｉ〕において、Ｒが炭素数２〜７のア
ルキレン基を表わす特許請求の範囲第１項記載の殺細胞
性修飾免疫グロブリン。 - 【請求項３】式〔Ｉ〕において、Ｒがトリメチレン基を
表わす、特許請求の範囲第１項または第２項記載の殺細
胞性修飾免疫グロブリン。 - 【請求項４】一般式〔II〕 で表わされるマイトマイシンＣ誘導体を、免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントと反応せしめることを特徴と
する、一般式〔Ｉ〕 で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58005807A JPH0651643B2 (ja) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
| DE8484300170T DE3479806D1 (en) | 1983-01-19 | 1984-01-11 | Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof |
| EP84300170A EP0114730B1 (en) | 1983-01-19 | 1984-01-11 | Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof |
| US06/571,898 US4487714A (en) | 1983-01-19 | 1984-01-18 | Cytocidal modified immunoglobulin and process for the preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58005807A JPH0651643B2 (ja) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59134734A JPS59134734A (ja) | 1984-08-02 |
| JPH0651643B2 true JPH0651643B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=11621349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58005807A Expired - Lifetime JPH0651643B2 (ja) | 1983-01-19 | 1983-01-19 | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4487714A (ja) |
| EP (1) | EP0114730B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0651643B2 (ja) |
| DE (1) | DE3479806D1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59186924A (ja) * | 1983-04-08 | 1984-10-23 | Kureha Chem Ind Co Ltd | ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 |
| JPS61204133A (ja) * | 1985-03-05 | 1986-09-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 抗マウス膀胱癌抗体と抗腫瘍性物質との結合物 |
| US4843147A (en) * | 1986-11-06 | 1989-06-27 | University Of British Columbia | Anhydrous enhanced coupling of proteins |
| US4952394A (en) * | 1987-11-23 | 1990-08-28 | Bristol-Myers Company | Drug-monoclonal antibody conjugates |
| US5008183A (en) * | 1988-05-10 | 1991-04-16 | Bio-Research Laboratories, Inc. | Assay system for detecting antibody and a method of producing non-human immune antibody |
| US9604896B2 (en) | 2014-09-03 | 2017-03-28 | Eastman Chemical Company | Halogen-free catalyst system and method for producing benzoic acid |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4045420A (en) * | 1973-05-29 | 1977-08-30 | Syva Company | Non-oxo-carbonyl containing benzoyl ecgonine and cocaine compounds polypeptide and derivatives thereof |
| GB1541435A (en) * | 1975-02-04 | 1979-02-28 | Searle & Co | Immunological materials |
| IL47372A (en) * | 1975-05-27 | 1979-10-31 | Yeda Res & Dev | Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same |
| US4263279A (en) * | 1975-08-19 | 1981-04-21 | Yeda Research & Development Co. Ltd | Pharmaceutically active compositions containing adriamycin and daunomycin |
| US4026879A (en) * | 1976-03-23 | 1977-05-31 | Hoffmann-La Roche Inc. | Antigen-containing propranolol derivatives |
| US4069105A (en) * | 1977-03-03 | 1978-01-17 | Syva Company | Lidocaine antigens and antibodies |
| US4243654A (en) * | 1978-09-11 | 1981-01-06 | Syva Company | Oxazepam derivatives for immunoassay reagents |
| US4223013A (en) * | 1978-12-29 | 1980-09-16 | Syva Company | Amitriptyline conjugates to antigenic proteins and enzymes |
| JPS5592325A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-12 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Antitumor agent and its preparation |
| US4315851A (en) * | 1978-12-29 | 1982-02-16 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition having antitumor activity |
-
1983
- 1983-01-19 JP JP58005807A patent/JPH0651643B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-01-11 DE DE8484300170T patent/DE3479806D1/de not_active Expired
- 1984-01-11 EP EP84300170A patent/EP0114730B1/en not_active Expired
- 1984-01-18 US US06/571,898 patent/US4487714A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 大河原信ほか編「合成試薬」（昭５５−６−１）講談社Ｐ．１３４〜１３５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0114730B1 (en) | 1989-09-20 |
| EP0114730A2 (en) | 1984-08-01 |
| DE3479806D1 (en) | 1989-10-26 |
| EP0114730A3 (en) | 1986-11-12 |
| US4487714A (en) | 1984-12-11 |
| JPS59134734A (ja) | 1984-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4401592A (en) | Pharmaceutical composition having antitumor activity | |
| US5030719A (en) | Cytotoxic antibody conjugates and a process for preparation thereof | |
| US4507234A (en) | Conjugate having cytotoxicity and process for the preparation thereof | |
| US4350626A (en) | Antitumor hybrid and process for the preparation thereof | |
| US4738843A (en) | Anti-tumor substance of immunoglobulin and melphalan and process for producing the same | |
| US4400376A (en) | Immunological preparations | |
| JP3360108B2 (ja) | 二つのエフェクター機能を有する二元特異性異種抗体 | |
| JPS6221000B2 (ja) | ||
| JPH021129B2 (ja) | ||
| JPS5843926A (ja) | 選択性制癌剤 | |
| JPH048411B2 (ja) | ||
| JPH07223969A (ja) | チオエーテル結合体の製造法 | |
| HU184736B (en) | Process for preparing anticarcinogenic immunoglobuline derivatives | |
| JPH0651643B2 (ja) | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 | |
| US4357273A (en) | Antitumor protein hybrid and process for the preparation thereof | |
| JPS6254086B2 (ja) | ||
| EP0539584B1 (en) | Reagent for diagnosing mycoplasma pneumoniae | |
| JPS6041617A (ja) | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造法 | |
| JPS61155334A (ja) | 殺細胞性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 | |
| JPH0428720B2 (ja) | ||
| JPS611622A (ja) | 細胞毒性複合体及びその製造法 | |
| JPS59227828A (ja) | 抗腫瘍性修飾免疫グロブリン及びその製造方法 | |
| JPS62116522A (ja) | 抗腫瘍剤 | |
| JPS62190200A (ja) | 抗腫瘍蛋白複合体およびその製造方法 | |
| JPH0428719B2 (ja) |