JPH02256700A - 細胞毒性薬物コンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、有機化学、免疫学、および薬化学の分野に属
すものであり、患者に細胞毒性薬物をターゲット投与（
標的指向性投与）するのに有用な細胞毒性薬物コンジュ
ゲートを提供するものである。薬物コンジュゲートのタ
ーゲット化は、細胞毒性薬物で処置すべき細胞に関連す
る抗原を認識する抗体を使用することによって行われ、
この抗体により、細胞毒性薬物が細胞にまで運搬される
。

本発明はさらに、該コンジュゲートを合成するのに使用
される中間体をも提供するものである。

［従来技術と本発明が解決しようとする課題］癌患者の
化学療法治療は、医学実務として十分に確立されている
。しかし、使用される薬物は、細胞毒性であり、患者に
とって重大な副作用を示すので、最大の配慮を払って投
与されるべきものである。メトトレキセート属の薬物は
有効であり、使用されることが多い薬物であるが、著し
く有害である。本発明は、特別の細胞指向性抗体を使用
して薬物をその薬物によって死滅させるべき細胞に向か
わせることによって、患者の危険性を減少させるもので
ある。薬物は特定の細胞に指向せしめられるので、患者
の体内を循環する薬物は減少し、従って、副作用および
毒性全般が減じられる。

［課題解決のための手段］ 本発明は、式（■）： Ａｂ［ＣＯ−Ｘ＝Ｎ−ＨＮ−Ｍコｍ　　　　　　　（１
）［式中、ｍは１から約１０までの整数であり、Ａｂは
、望ましくない細胞に関連する抗原を認識する生理学的
に許容され得る抗体、または抗原を認識するそのフラグ
メントであり、 Ｘは、以下の式： ％式％（［） で示されるリンカ−であり、 Ｒは、水素、フェニル、または１つもしくは２つのニト
ロ基、ハロゲン基、シアノ基もしくはトリフルオロメチ
ル基で置換されているフェニルであり、 ■ １’（＋は、水素、アミノ、アミ／−Ｃ，−Ｃ，アルキ
ル、ヒドロキシ−Ｃ，−Ｃ４アルキル、またはグアニジ
／−Ｃ，−Ｃ，アルキルであり、ｎは、０から５までの
整数であり、 Ｍは、式（■）： （Ｖ） Ｒ’ｌ２、Ｃｏ、Ｓｏ−、Ｃｏ　　（ＣＨＲ）ｓ、また
はＣｏ−ＮＨであり、 Ｒ５は、水素、またはＣ，−Ｃ，アルキルであり、Ｓは
、■または２であり、 ＣＯＲ” ＳＯｘ　　（ＣＨ−）ｓ　　ＣＨＮＨ （■）または ＣＯＲ’ Ｃｏ−（ＣＨＲ）ｕ−ＣＨ−ＮＨＣＩＫ）であり、上記
式中、ｔは、■がら６までの整数、Ｕは１から２２まで
の整数、 Ｒ８は、水素、または生理学的に許容され得る塩を完成
させる部分） で示されるメトトレキセート薬物であるコで示される細
胞毒性薬物コンジュゲートを提供するものである。

さらに、本発明は、式： ％式％］ ［式中、Ｒ８はＯ、（ＯＣＨ，）、、または（ＯＣＨ，
ＣＨ３）！であり、ＡｂＳＸおよびｍは、前記の定義と
同意義であるコ で示される一連の誘導化抗体をも提供するものである。

また、本発明は、望ましくない細胞の増殖を制御する方
法であって、本発明のコンジュゲートを患者に非経口的
に投与することを特徴とする方法、および本発明のコン
ジュゲートを非経口投与用媒質中に分散させてなる医薬
製剤をも提供するものである。

さらに、本発明は、上記の誘導化抗体を式：％式％ で示される薬物ヒドラジドと反応させることを特徴とす
る、式（１）で示されるコンジュゲートの製造方法をも
提供するものである。

本発明の薬物コンジュゲートは、抗体、リンカ−１およ
びヒドラジド形態のメトトレキセート薬物から構成され
る。本発明のコンジュゲートの望ましい治療活性は、主
として、抗体のおかげで標的細胞付近に薬物が到達した
後に抗体からメトトレキセート薬物が放出されるよう設
計されたリンカ−から得られる。以下に、本発明コンジ
ュゲートの前記３つの主成分について個々に説明し、次
に本コンジュゲートの合成について説明し、最後に、本
コンジュゲートの合成例およびその生物学的試験を示す
。

広径 本発明コンジュゲートの抗体部分における必須の特性は
、望ましくない細胞に関連する抗原を認識できることで
ある。メトトレキセート薬物は多種多様の細胞に対して
細胞毒性が高く、また標的細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒ
ｎａｌｉｚｅｄ）　した場合にその十分な活性を示すこ
とが理解されている。したがって、抗体の選択に当たっ
ては、メトトレキセート薬物によって死滅するかまたは
そうでなくても制御される細胞を認識し、これと結合し
、かつ内在化される能力の点に関して選択するのが好ま
しい。

抗体の供給源は、本発明にとって重要ではない。

それは、ｒｇＧ、ＩｇＡＳ　ＩｇＭ、ＩｇＥおよびｒｇ
Ｄなどの免疫グロブリンのあらゆるクラスまたはサブク
ラスから選択することができる。同様に、メトトレキセ
ート薬物の作用が有用である細胞を抗体が標的とする限
り、起源の種は限定されない。

現在、当分野では、薬物コンジュゲートとしてモノクロ
ーナル抗体が最もよく使用されており、本発明において
もこれを用いるのが好ましい。しかし、ポリクローナル
抗体が排除されるわけではない。比較的新しい型の抗体
はキメラ抗体であるが、これは、所望の抗体の抗原結合
領域をコードし、かつ他の所望のアミノ酸配列をもコー
ドしている修飾ＤＮＡを発現せしめる組換え技術によっ
て実験室内で調製される。すなわち、ある種由来のある
部分と別の種由来の他の部分からなるキメラ抗体を得る
ことができ、これを本発明に用いることができる。

処置すべき細胞を標的とし、かつ患者にとってそれ自身
毒性でない限り、抗体の起源と性質は重要でない。当業
者であれば、候補の抗体を用いたコンジュゲートの調製
は容易であり、またそれらを評価することができる。便
宜のため、抗体およびコンジュゲートを評価する方法を
若干説明する。

まず、抗体は、相当量の抗体を調製するのに充分な安定
性を有するハイブリドーマから生産するべきである。抗
体自体は、精製が容易なものであるべきであり、特に、
相当な濃度で化学的操作をするのに充分な水溶性を有し
ているべきである。

初めに、候補の抗体を用いて調製したコンジュゲートを
抗原結合能について評価する。遊離抗体の結合能からは
若干減少することが予想されるが、これは許容される。

次いで、このコンジュゲートを試験し、抗原ポジティブ
な（陽性の）細胞に対するそのインビトロ細胞毒性を測
定する。有効なコンジュゲートは、同じ検定において、
遊離薬物よりも若干低い細胞毒性を有するかもしれない
。次いで、この最初の２つの試験によって認められたコ
ンジユゲートを、ジョンソン等［Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎ
ｄ　Ｌａｇｕｚｚａ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４７
．３１１８−２２　（１９８７）］が教示しているヌー
ドマウスヒト腫瘍異種移植モデルにおいて評価する。候
補のコンジュゲートは、遊離薬物、遊離薬物と遊離抗体
との混合物、および非−標的性免疫グロブリンとのコン
ジュゲートに対し、ヌードマウスにて試験されるべきで
あり、これらのすべてよりも改善された活性または安全
性を示すべきである。投与量範囲の試験は、この異種移
植モデルにおいて行なうべきである。

異種移植モデルにおいて効果があったコンジュゲートを
、ヒトで観察されるパターンと同様のパターンで目的の
抗原を発現することが知られている動物によって試験す
る。このような試験においてコンジュゲートが抗原に対
して有意な結合度を生じ、かつ異種移植モデルから予想
される治療的用量において毒性がそれほどでない場合に
は、その候補のコンジュゲートは治療上の可能性を有す
ると考えることができる。

現在知られている多数の抗体が本発明に使用することが
できる。好ましい特異的な抗体は、Ｌ／ＩＣ２であり、
この抗体はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン［ロックビル、メリーランド］にＨＢ９６８２とし
て寄託されているノ＼イブリドーマから産生される。

ＡＴＣＣハイブリドーマであるＨＢ２１から産生される
抗体５Ｅ９Ｃ１１は、多数の腫瘍から発現されるトラン
スフェリンレセプターを認識する。

ナショナル・キャンサー・インステイチュート（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）から
入手可能な、Ｂ７２．３と称される抗体は、乳癌および
結腸癌の両者から発現される抗原を認識する。

非腫瘍抗原に対して反応性を有する２つの重要な抗体は
０ＫＴ３と０ＫＴ４であり、それぞれ末梢Ｔ−細胞とヒ
トＴ−ヘルパー細胞に結合する。

これらは、それぞれＣＲＬ８００１およびＣＲ，Ｌａ２
Ｏ２としてＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマか
ら産生される。

様々な治療目的に有用な抗体の供給源を以下のとおり追
加する。免疫変調（ｉＩｍＩｏｕｎｅ　ｌ１ｌｏｄｕｌ
ａｔｉｏｎ）および腫瘍治療に有用な抗−ヒトリンパ球
および単核細胞抗体は、ＡＴＣＣ培養物ＨＢ２、ＨＢ２
２、ＨＢ４４、ＨＢ７８およびＨＢ１３６から産生され
る。腫瘍治療に有用な抗−トランスフェリンレセプター
抗体は、ＡＴＣＣ培養物ＨＢ８４から産生される。ＡＴ
ＣＣ培養物ＨＢ　８０５９は、結腸直腸癌モノシアロガ
ングリオシドに対する抗体を産生じ、培養物ＨＢ８１３
６は、免疫変調およびＴ−細胞白血病の治療に有用な、
成熟ヒＩ−Ｔ−細胞表面抗原に対する抗体を産生ずる。

当業者なら、さらに別の候補抗体の入手先を容易に調べ
ることができる。容易に入手可能な抗体についての特に
有用な情報源は、リンスコッツ・ディレクトリ−・オブ
・イムノロジカル・アンド・バイオロジカル・リージェ
ンツ（Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’　ｓ　Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ　
ｏｒ　Ｉｍｉｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｏｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ）　［リンスコッツ・
ディレクトリ−（９４９４１カリフオルニア、ミル・バ
リー、グレンφドライブ４０番）から発行］である。１
９８４年版には、６０種以上の腫瘍関連モノクローナル
抗体が挙げられており、それぞれの市販光が少なくとも
１つ挙げられている。

種々の望ましくない細胞が本発明のコンジュゲートによ
って処置できることは理解されるであろう。メトトレキ
セート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）薬物は、様々なタ
イプの癌細胞に対して効果的であることがよく知られて
おり、したがって癌細胞は、本発明のコンジュゲートに
よって標的とされるべき好ましい細胞の１つであると考
えられる。

具体的には、悪性腫瘍を持続成長させる細胞、および抗
−腫瘍免疫の進行を制御する免疫系の細胞がさらに考え
られる。標的とされるべき特異的なタイプの癌関連細胞
としては、扁平上皮癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、
神経膠腫細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌細胞、移行性細胞
癌細胞、肉腫細胞、腫瘍脈管系を支持する細胞、ならび
に白血病およびリンパ腫などのリンパ球腫瘍の細胞が挙
げられる。

しかし、メトトレキセード薬物は、多くの別のタイプの
細胞に対しても細胞毒性を示す。したがって、抗体を適
切に選択して本発明のコンジュゲートを使用すれば、例
えばウィルス粒子に感染した細胞、種々の有害物質に感
染したＴ細胞、および自己免疫疾患の進行を促進するか
もしくは制御する免疫系の細胞などの望ましくない細胞
を殺すかまたは改変することができる。

抗体のフラグメントを適切に選択しても、それが無傷の
抗体と同一の効果を有することは理解されるであろう。

したがって、本発明の実施において、処置すべき細胞に
関連する抗原を認識する抗体フラグメント、好ましくは
Ｆ（ａｂ５）ｘフラグメントは無傷の抗体と同様に有用
であり得る。

リンカ−基が抗体と反応して結合する正確な機序は式（
Ｉ）においては示されておらず、完全にはわかっていな
い。この反応は、以下で説明するように、おそらくアシ
ル化であり、抗体分子上の多数の部位がアシル化を受け
る。最も普通には、抗体のアシル化は、リジン部分の遊
離アミノ基上で進行するものと考えられる。しかし、こ
のアシル化は、ヒドロキシ基、フェノール基、イミダゾ
ール環およびおそらくは他の部分をも攻撃するであろう
。

式（１）は、ｌから約１０個のリンカー−薬物部分を抗
体各分子に結合させることを示している。

当然ながら、コンジュゲートのある一群は、抗体に対す
る薬物−リンカ−の割合に範囲を有した分子を本質的に
含有するものであり、したがって抗体分子１個当たりの
上記の部分の数は、平均の数である。多（の薬物分子を
各抗体分子に結合させれば、高価である抗体を最も有効
に使用することができることは容易に知れる。しかしな
がら、薬物−リンカ一部分における非常に多くの分子の
結合は、しばしば抗体の抗原認識能および結合能に悪影
響を及ぼすものであり、したがってｍに関して妥当な値
を見いださなければならない。一般には、ｍの好ましい
値は、約４から約１０であり、他の好ましい値は約３か
ら約８である。

４」二重に虹竺二五薬惣 本発明のコンジュゲートに使用される細胞毒性薬物はメ
トトレキセート、アミノプテリン、または式（ＶＩ）で
示されるそれらの誘導体であるが、本明細書では、それ
らの化合物は集合的にメトトレキセート薬物と呼ぶ。メ
トトレキセート薬物は、ヒドラジド形態で使用される。

それら薬物における各種の不斉中心の立体特異的形態は
示していない。当業者であれば、その薬物の立体化学は
、当該技術分野で明確に説明されているように、その活
性に影響を及ぼすものであることは理解できるであろう
。メトトレキセート薬物の通常の立体化学構造が、本発
明のコンジュゲートに係る中間体の製造時に使用される
のが好ましいが、式（Ｖｒ）の化合物には、すべての立
体化学的形態が包含される。

メトトレキセート薬物ヒドラジドとリンカ−との間の結
合は、アルキリデンヒドラジド結合である。しかし、そ
の結合は、溶液、特に生理学的溶液中では他の形態で存
在し得ることは理解されるであろう。その二重結合を開
裂させ、官能基またはプロトンをその窒素または炭素原
子に結合させることが可能である。その結果、ヒドロキ
シ基または他の酸素連結種が先の二重結合の一方に結合
し、アミノ連結部分が同様に結合し得る。水は、これら
原子の１つと弱く結合し得る。さらに、抗体部分もそれ
ら原子の１つと弱い結合を形成し得、１つよりも多くの
このような反応が起こって混合物が形成される場合があ
る。しかし、このような生成物は、一過性のものである
ので、本明細書では、本発明のコンジュゲートを、一般
的でありかつ安定な形態であるアルキリデンヒドラジド
形態として記載する。

式（Ｖｌ）において、ｒＣ，Ｃ３アルキル」なる用語に
はメチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルが包含
され、好ましくはメチルまたは水素を挙げることができ
る。

式（■）の薬物内で変動し得る種々の基を個々に説明し
、この中で好ましい定義を述べる。好ましいメトトレキ
セート薬物ヒドラジドが好ましい構成基から形成されて
いることは理解されるであろうし、また適当な文献知識
を有する薬化学者であれば、このような薬物ヒドラジド
を調製できる。

基、Ｒ３は、硫黄、酸素、アミンまたはメチレンなどの
架橋基であり、後２つはＣ，−Ｃ，アルキルで任意に置
換されることもある。このような基の代表は、アミノ、
メチレン、メチルアミノ、プロピルアミノ、１．１−プ
ロピレン、および１，１−インブチレンである。好まし
いＲ３基は、アミノおよびメチルアミノである。

基：Ｒ’は、カルボニル、スルホニル、アセチル、プロ
ピオニル、またはカルボキサミドなどの架橋基である。

後３つの場合には、カルボニル基が基：２と結合する。

最も好ましいＲ′基は、カルボニル、およびアセチルで
あるが、プロピオニルも好ましい。

基：Ｚは、Ｒ４基と結合するアミ７基をその一端に有し
ており、また他端に、基：　＝Ｎ−ＨＮと結合するカル
ボニル基またはスルホニル基を有している。式（■）で
示されるＺ基はグルタミン酸から誘導され、ｔが１でな
いならば、ポリグルタミン酸残基を構成する。しかし、
式（■）で示される好ましいＺ基は、ｔが１の基である
。

式（■）で示される２基は、スルホニルで終止し、した
がって相当するスルホン酸の残基である。式（■）の基
は、１または２個のメチレン基を有し、好ましくは２個
有す。

式（ＩＸ）で示されるＺ基は、メチレン基を１から２２
個有することがある、様々な長さのアミノ酸である。式
（ＩＸ）で示される基の好ましいクラスは、メチレン基
ｌから１０個を含有するものであり、より好ましくはメ
チレン基３から８個を有するものである。

最も好ましい２基は、ｔが１である式（■）で示される
基、およびＵが３から８である式（ＩＸ）で示される基
である。

式（■）、（■）および（［）で示される基では、遊離
形の、または塩形態のカルボキシ基、Ｒ１１が存在して
いる。それらの塩類は、カルボン酸の生理学的に許容さ
れ得る塩を形成し得るあらゆる部分から形成される。ア
ルカリ金属およびハロゲン化塩が特に適当である。した
がって、本発明を実施するには、ナトリウム、カリウム
、およびリチウム塩、ならびに塩酸、臭化水素、および
フッ化水素塩が特に有用である。しかし、他の薬化学的
に許容され得る塩も有用である。例えば、トリエチルア
ミン、トリエタノールアミン、エチルジメチルアミンな
どが、テトラアルキルアンモニウム塩、（ベンジルまた
はフェニル）トリアルキルアンモニウム塩などの第４級
アンモニウム塩と同様に有用である。アンモニウム塩の
中でも、テトラブチルアンモニウム、ベンジルトリメチ
ルアンモニウム、およびテトラメチルアンモニウムが代
表であり、好ましい塩である。しかし、薬化学者は頻繁
にカルボン酸塩を使用するが、Ｒ＠が塩形成部分である
それらの塩類は、生理学的に許容され得る塩を形成する
あらゆる塩基から調製することができる。

式（Ｖｌ）で示される基を誘導するために必須の中間体
は、薬化学の分野に属し、当業者であれば、それらのい
ずれをも入手することができる。メトトレ牛セード薬物
の合成に関する有用な参照文献には、ローマンら（Ｒａ
ｈｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｈｈａｂｒａ）のＭｅｄｉｃｉｎ
ａｌ　ＲｅｔＲｅｖ、　８．第１巻、９５−１５５（１
９８８）　ｒメトトレキセートおよびその類縁体の化学
」がある。

リンカ− リンカ−基であるＸは、一端がカルボニルに、他端がヒ
ドラジドに結合される有機基である。

式（ｆｆ）で示されるリンカ−基は、（ＣＨ−）ｎ部分
カ例又はメチレン、エチレン、プロピレン、ベンチレン
などのアルキレン基である。

基；Ｒは、水素、または１つもしくは２つの電子求引基
で置換されていることもあるフェニルである。したがっ
て、Ｒ基には、フェニル、３−ニトロフェニル、２，４
−ジクロロフェニル、３−ブロモ−５−フルオロフェニ
ル、４−シアノフェニル、３−トリフルオロメチルフェ
ニル、２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル、
３−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェニルなどがあ
り得る。本明細書中で使用しているハロゲンなる用語は
、クロロ、ブロモおよびフルオロを意味する。水素は好
ましいＲ基であり、非置換フェニルはその他の好ましい
Ｒ基であり、３番目に好ましいＲ基はモノ置換フェニル
である。

式（ＩＩＩ）で示される基は、架橋性アリール基：Ａｒ
がフェニル、またはピロリルであるアルキルアリール部
分である。フェニルＡｒ基は、メタまたはパラ位で連結
され、パラ位が好ましい。式（ＩＩＩ）で示される基の
（ＣＨＪｎ部分は、式（旧の対応する基と同一である。

すなわち、ｎがＯの場合には、その基は単結合以上のも
のではないが、この基は既述のアルキレン基となり得る
。ｎが０であるのが好ましく、さらにｎが２−４である
ものも好ましい。

式（■）で示される基は、１つまたは２つのアルキレン
架橋を含むこともあるアミド結合リンカ−である。式（
ＩＶ）の基におけるアルキレン基；（ＣＨｔ）ｎは、式
（ＩＩ）の基において既述したものと同一である。式（
ＩＶ）の基の設計に当たって、２つの任意のアルキレン
架橋は独立して考えることができる。即ち、ｎが両者と
もにＯである場合、または一方がＯであり、他方が１か
ら５までの整数である場合、または両者ともに１から５
までの整数である場合である。好ましくは、両者ともに
ｎが１から４までの基：　（ＣＨｔ）ｎのアルキレン基
であり、より好ましくはｎが２または３のアルキレン基
である。

式（Ｖ）で示される基は、比較的複雑なアミド連結基で
あり、アミノ酸部分を含んでいることが多い。その（Ｃ
Ｈｔ）ｎ基は、既述の式（Ｉｔ）の場合と同じである。

そのペンダント基は、アミノ、ヒドロキシまたはグアニ
ジ／　［ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ，］で置換されたＣ
、−Ｃ，アルキル基であり得る。したがって、それには
、例えばアミノメチル、２−アミノエチル、４−アミノ
ブチル、２−ヒドロキシメチル、３−ヒドロ牛ジプロピ
ル、４−ヒドロキシブチル、グアニジノメチル、２−グ
アニジ／エチル、および４−グアニジノブチルなどの基
が挙げられる。Ｒｉはさらに、水素またはアミンであっ
てもよい。好ましいＲ１基は、アミノ、ヒドロキシメチ
ル、アミノアルキル、特に４−アミノブチル、およびグ
アニジ／アルキル、特に４グアニジノブチルである。

基：Ｒ″は、ｎがＯの場合は単結合であるか、または１
から５個の炭素原子のアルキレン基、フェニルまたはピ
ロリルであり得る。フェニルＲ１基はメタまたはパラ位
で連結されている。基：（ＣＩ（ｚ）ｎは既述の式（Ｉ
Ｉ）の基の場合の対応するアルキレン基と同じであり、
同じ価を有する場合がある。

式（ＩＩ）、（Ｉ［Ｉ）、（■）および（Ｖ）で示され
る最も好ましいリンカ−基は、４−ベンジリデン、４−
メチルベンジリデン、および２−エチルアミ／カルボニ
ル−４−ベンジリデンである。

誘導化抗体 誘導化抗体は、リンカ−中間体との反応によって改変さ
れた抗体から構成される、コンジュゲートを合成するた
めの中間体である。そのリンカ−基は、メトトレキセー
ト薬物ヒドラジドと最終工程で反応するカルボニルまた
はそのジ（メチルまたはエチル）アセタールを末端に有
している。したがって、このリンカ−のＸ基は、誘導化
抗体中、−〇または（ＯＣＨ３）、または（ＯＣＨｔ　
ＣＨｓ　）　ｔを末端に有する。カルボニル形態が好ま
しいが、アセタールは満足のいく反応剤であるので、そ
れを使用するのが好都合用ある場合には、それを使用す
るとよい。

変動因子、Ｘおよびｍが、既に説明した誘導化抗体にお
いて同じ価値を有している。好ましい誘導化抗体は、好
ましいＸ基から形成された、好ましい数ｍのリンカ−基
と結合している好ましい抗体から構成されているという
点で、好ましいコンジュゲートに相当するものである。

合成 本発明のコンジュゲートは、一般に当業界で現在使用さ
れている方法と同様の方法によって調製される。好まし
くは、最初にリンカ−を抗体と反応させ、次いで最終工
程としてそのリンカ−をメトトレキセート薬物のヒドラ
ジドと反応させる。

この合成方法の利点は、メトトレキセート薬物の立体化
学的な形態が最も容易に保存される点てあしたがって、
本合成の最初の工程（群）は、一端を抗体と、さらに他
端をメトトレキセート薬物と反応させるべき適当な形態
のリンカ−を調製することである。次いで、得られたリ
ンカ−を抗体に結合させて誘導化抗体を調製し、最後に
、メトトレキセート薬物をそのリンカ−のカルボニルま
たはアセタール末端に結合する。抗体が反応混合物中に
存在している限りは、本方法は、抗体の損傷を防ぐのに
適当な温和な条件下で実施しなければならないことは理
解されるであろう。

本合成は、以下の反応式で表すことができる：Ａｂ　＋
　ｍ［Ｒ７−Ｃｏ−Ｘ＝Ｒ”］　］置Ａｂ［ＣＯ−Ｘ＝
Ｒ＠ｌ＋Ａｂ［ＣＯ−Ｘ４”］］置　＋　　ｍ［ＨｔＮ
ＨＮ−Ｍ］　　→　Ａｂ［ＣＣ０−Ｘ４−ＩＮ−コ謂［
式中、Ｒ？はカルボン酸活性基であり、Ａｂ、Ｘ。

Ｒ１およびｍは既述の定義と同意義であるコ。

この式中、基Ｒ７は、アシル化剤として使用すルタメに
カルボン酸を活性化するのに通常使用されている周知の
基の中から選択される。例えば、スクシンイミドオキシ
、フタルイミドオキシ、メタンスルホニルオキシ、トル
エンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシ、ベ
ンゾトリアゾリルオキシ、クロロ、ブロモ、アジド、な
どが、通常上記の活性基として使用される。好ましい活
性基は、スクシンイミドオキシ、フタルイミドオキシ、
およびベンゾトリアゾリルオキシである。

この反応を行っている間は、ペンダントＲ′置換分の一
部である遊離アミ７基を、簡便かつ容易に除去できる保
護基でブロックする。このような基は、Ｇｒｅｅｎ、　
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａ
ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｊｏｈｎ　１ｌｉｌｅ
ｙ　＆　５ｏｎｓ＋ニユーヨーク、　１９８１に包括的
に論じられている。ここで使用される基は、抗体への損
傷を回避できる程に温和な条件下で取り外しができなけ
ればならない。そのような保護基は化学者には周知であ
るが、特に有用な保護基を例示すれば、アセト酢酸エチ
ル、シトラコン酸エチル、およびジメチルマレイン酸エ
チルがある。

リンカ−中間体、Ｒ’−Ｃｏ−Ｘ＝Ｒ”は比較的単純な
化合物であり、これは購入することができ、または常法
によって容易に製造することができる。カルボキサミド
連結（リンケージ）を有するこれらのリンカ−中間体は
、リンカ−中間体の一端を形成するところの第１級アミ
ンを、その中間体の他端を形成するところの活性化カル
ボン酸と反応させることによって最も簡便に製造される
。

このような反応は、温和な水性塩基中において、環境温
度またはそれよりも若干温度を上げて行うことができ、
数時間のうちに良好な収量で反応が進行する。

本発明のコンジュゲートの合成に係る各種の工程を行う
ことで、本方法を行う装置の処理能力を、または収率を
最大にすることができる。すべての場合ではないが、大
刀は抗体自体が反応中で最も高価なものであり、したが
って方法の最善化には、抗体に基づいて収量を最大にす
ることが要求される。したがって、実際の最善の実施条
件は、個々の使用抗体の最大の安定性条件に依存するこ
とになる。このように、最善の実施条件には、抗体を最
大に利用し、抗体を反応混合物に暴露する時間を最小に
するために、メトトレキセート薬物を大過剰に使用する
ことが必要であろう。

カルボン酸活性基は、リンカ−中間体のカルボン酸上に
、例えばジシクロへキシルカルボジイミドまたは他のエ
ステル化試剤を使用することによって容易に設置される
。このような反応は、不活性有機溶媒、例えばジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、塩素化炭化水素などの溶媒中
で行われ、約０−５０℃の範囲の緩和な温度で実施する
ことができる。リンカ−中間体の製造は、以下の製造例
でさらに説明する。

リンカ−中間体を抗体と反応させるための条件の選択に
当たって第１の注意事項は、抗体の安定性の維持である
。その反応は、抗体を傷付けない組成の水性媒質中で実
施しなければならない。具体的には、適当な水性媒質は
、ホウ酸イオンの濃度が約０．１−０．５モル濃度のホ
ウ酸緩衝液である。本反応を実施できる他の適当な水性
媒質は、生理緩衝化食塩水である。その反応媒質のｐＨ
域は約７−９の若干塩基性であるべきである。その反応
媒質を水性にする一方で、少量の有機溶媒を存在させて
も悪くなく、都合の良い場合もある。

例えば、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、テト
ラヒドロフラン、ジオキサン、またはグリコールエーテ
ルなどの有機溶媒の少量にリンカ−中間体を溶解し、そ
の有機溶媒溶液を抗体の水性媒雪中溶液に加える。

一般に、その反応は、抗体の溶解性が概して高くないの
で、比較的低濃度で行う必要がある。例えば、抗体の濃
度は通常、水性媒質ＩＲｅ当たり約５−２５ｗｇの範囲
である。

既述したように、リンカ−と薬物の１から約１０モルを
抗体１モルに結合させる。そのコンジュゲート比率を得
るためには、通常、過剰量のリンカ−中間体を使用する
ことが必要である。アシル化条件下での抗体と活性エス
テルとの反応性は若干変動し得るが、一般に本反応では
、抗体１モル当たり約５から約１５モルのリンカ−中間
体を使用する。

このアシル化反応は、温度約Ｏ℃から約４０’Ｃの範囲
で数分から数時間進行させる。温度を上昇させれば、抗
体にとって有害である場合があることは明白であり、と
りわけ本反応は本質的に速いので、低温で実施すること
を特に推奨する。

リンカ−中間体基を適切に含有した誘導化抗体を調製し
た場合、以下の実施例で説明するように、得られた反応
混合物を常法によってクロマトグラフィーに供し、誘導
化抗体を非反応のリンカ−中間体と分離する。精製をこ
の時点で行わない場合には、メトトレキセート薬物は最
初の反応混合物中にある過剰のリンカ−中間体と反応し
て消費される。

最後に、メトトレキセート薬物のγ−ヒドラジドを誘導
化抗体と反応させて薬物コンジュゲートを完成させる。

この反応は、リンカ−中間体の終止基であるケトンまた
はアルデヒド、またはそれらのアセタールを薬物ヒドラ
ジドと反応させる単純な反応である。それは、水性媒質
中、適当な環境温度で十分に進行する迅速な反応である
。理想的には、得られたアシル化抗体は、メトトレキセ
ート薬物の反応にとって十分な反応媒質を形成し、かつ
クロマトグラフィーでの良好な分離を可能にさせる溶液
で溶出するクロマトグラフィーで精製する。この２つの
目的にとっては希釈水性緩衝液が適当である。

例えば、特に有用な反応媒質は希釈アセテート緩衝液で
あり、より具体的にはｐＨ約５から約７の若干酸性ｐＨ
のＯ，１Ｍ酢酸ナトリウムである。

しかし、この反応は、ｐＨが若干酸性である限りは、ホ
ウ酸緩衝液、生理緩衝化食塩水などの中でも行うことが
できる。既述したように、溶媒が抗体を損傷する傾向を
示さない限りは、この反応媒質中に少量の有機溶媒が存
在していても有害ではない。

メトトレ牛セードヒドラジドとの反応は、約１時間から
約１日の反応時間行う。反応混合物中の抗体量に基づい
て収量が最大になるような温度を選択して約０−４０℃
の範囲の反応温度を使用する。

最後に、常法によるクロマトグラフィーによって、本発
明の薬物コンジュゲートを精製、単離する。生理緩衝化
食塩水を使用して薬物コンジュゲートを溶出するのが、
特に便利である。患者に投与するのに適した濃度で本発
明薬物コンジュゲートを溶出することができるであろう
が、通常は、減圧　透析などによって本フンジ−ゲート
を濃縮することが必要である。

本発明の薬物コンジュゲートの合成を、以下に記載した
製造例および実施例によってさらに説明する。

製造例Ｉ メトトレキセート−γ−ヒドラジド １００ｊＩＱ容量のフラスコに、Ｌ−グルタミン酸・５
−メチルエステル１．６１ｇ（１０ミリモル）を加えた
。それに、ｔ−ブチルアセテート６０ｘ（ｌを加え、得
られた混合物を手短に撹拌した。

次いで、それに７０％過塩素酸１．５８ｇ　（１１ミリ
モル）を十分に撹拌しながら滴加した。このｌ物を窒素
雰囲気下に２日間撹拌し、次いで０１５Ｎ塩酸１００ｍ
＋２で３回抽出した。水層をまとめ、重炭酸ナトリウム
３０ｇで中和した。この中性溶液をジエチルエーテルで
３回（総量１５０　ｘＱ）抽出し、有機層をまとめ、塩
水（ブライン）で洗浄した。次いで、洗浄した有機溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、環境温度で減圧下に蒸発さ
せ、きれいな油１．１８ｇ　（５，４ミリモル）を得た
。これはＬ−グルタミン酸・５−メチル−１−ｔ−ブチ
ルジエステルであることを同定した。

オーブン乾燥した１００１１（ｌ容量フラスコにトリエ
チルアミン０．９９ｚ（１（６，６ミリモル）、ジエチ
ル・シア／ホスホネートＩｘ＆（６，６ミリモル）、お
よび酸化バリウムから減圧下に蒸留したばかりのジメチ
ルホルムアミド４Ｍを加えた。

撹拌下に、この溶液に、２，４−ジアミノ−６−［Ｎ−
メチル−Ｎ−（４−カルボキシフェニル）アミノコプテ
リジン・三水和物５０６ｘｇ　（１，３ミリモル）を加
えた。撹拌して中間生成物が溶解したなら、その混合物
を８０℃に加熱し、次いでトリエチルアミン０．２０ｉ
Ｉ２（１，４ミリモル）および上記のようにして製造し
たし一グルタミン酸ジエステル３４２ｘｇをジメチルホ
ルムアミド１１Ｑに加えた。得られた混合物を８０℃で
２時間撹拌し、次いで冷却し、減圧下に溶媒を除去した
。

得られた残渣をクロロホルム３００ｚＲ中に取り、重炭
酸ナトリウム５％溶液で洗浄した。水層をクロロホルム
で抽出し、有機層をまとめ、硫酸ナトリウムで乾燥Ｉ７
、減圧下に濃縮してオレンジ色のｔｌ、３５ｇを得、次
いでこれをクロロホルム中１０％メタ／−ルで溶出する
シリカゲル１５０ｇのクロマトグラフィーにかけた。生
成物を含有するフラクションをまとめて濃縮し、γ−カ
ルボキシがメチルエステル形態であり、α−カルボキシ
が（−ブチルエステル形態であるメトトレキセートジエ
ステル体６４５１ｇを得た。

上記中間生成物を別のロフトであるが同じ化合物（全量
６９７スｇ（１，３ミリモル））と−緒にし、メタノー
ル１２ｊｌｆｆに溶解した。それに無水ヒドラジン１７
０１ｇ　（５，３ミリモル）を加え、得られた混合物を
窒素雰囲気下に環境温度で６日間撹拌した。次いで、溶
媒を減圧下に除去し、得られた残渣をシリカゲル１５０
ｇのクロマトグラフィーに付し、クロロホルム中１５％
メタノールで溶出し、メトトレキセート−α−ｔ−ブチ
ルエステル−γ−ヒドラジド４７Ｃ）ｙｇ（０，９ミリ
モル）を得た。

この中間生成物をＩＮ塩酸１２０旺に溶解し、５５℃に
５０分間加熱した。次いで、減圧下に濃縮して固形物と
し、得られた残渣を０．０１Ｍ酢酸アンモニウム（１）
Ｈ８）８０ｘ１２に取った。この溶液を４℃で３日間保
存し、次いでこの直前に使用したものと同一の緩衝液（
緩衝液Ａ）と１゜０Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ８）（緩
衝液Ｂ）との勾配法によって溶出するセファロースファ
ーストフローＱ　［５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆ
ｌｏｗ　Ｑ、ファルマシ乙Ｉｎｃ、　、ビスカッタウェ
イ、ＮＪ］３００次Ｑのクロマトグラフィーにかけた。

１００％の緩衝液Ｂで溶出する生成物を含有するフラク
ションをまとめ、凍結乾燥を繰り返し、痕跡量の酢酸ア
ンモニウムを除去した。得られた収量は、メトトレキセ
ート−γ−ヒドラジド３２６Ｊ＋ｇ　（０，７ミリモル
）であった。

製造例２ Ｌ／ＩＣ２抗体の生産 凍結したＬ／ＩＣ２ハイブリドーマのバイアルは、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクシコンから受託番
号ＨＢ　　９６８２の下で入手することができる。３７
℃水浴中でバイアルを渦巻かせながらバイアル内容物を
解凍し、生細胞を回収する。次いで、その細胞懸濁物を
平衡塩類溶液［グランド・アイスランド・バイオロジカ
ル・カンパニー（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ、ギ
ブコ）、ニューヨーク１４０７２、グランド・アイスラ
ンド、スタレー・ロード３１７５番コで１：２に希釈し
、その懸濁液を、血清を通過させて下層まで２００９で
遠心し、極低温用培地から細胞を分別する。上清を吸引
し、得られた細胞ペレット中の細胞を、３７℃、５％二
酸化炭素雰囲気下、７７５組織培養フラスコ中、１０％
０％ラン血清、２Ｉ＋１ＭＬ−グルタミン（ギブコ）お
よび５０Ｍｇ／ｚ（ｌ硫酸ゲンタマイシン（ギブコ）を
加えた培養培地［ベントレックスＨＬ−１（Ｖｅｎｔｒ
ｅｘ　ＨＬ−１）、ベントレックス・ラボラトリーズ、
ＭＥ、ボートラントコ中に懸濁する。殆ど全面成長の培
養物から上清を採取し、残った細胞を遠心して除去する
。細胞不含の上清をプロティンＡセファロースカラム（
ファルマシア）に通過させ、その上清から抗体を精製す
る。抗体はこのカラムに結合し、培養培地は、０．０１
Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中に洗浄排出され
る。次いで、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ
３゜５）を用いてそのカラムから抗体を溶出する。溶出
した抗体を１Ｍ　トリツマ緩衝液［Ｔｒｉｚｍａ　ｂｕ
ｒｆｅｒ、シグマ、ＭＯ，セントルイス］（ｐＨ７，４
）で素早く中和し、０．０１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，４）および０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有した
減圧透析機［Ｂ　ｉｏ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ、　ＯＲビーベルトンコを用いて透析し、濃縮
する。抗体調製物を０．２μｌ孔（ボア）に通して滅菌
濾過し、使用時まで４°Ｃで保存する。

製造例３ ２５０３１１２容量フラスコに、ジオキサン１００ｘａ
中、４−カルボキシベンズアルデヒド３ｇ（２０ミリモ
ル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｇ　（
２０ミリモル）を加えた。この混合物を５−１０分間撹
拌し、次いでジシクロへキシルカルボジイミド４．１ｇ
（２０ミリモル）を加えた。環境温度で１時間この混合
物を撹拌した後、濾過した。得られた濾液を減圧下に蒸
発させ、白色固体９．４ｇを得、これを温インプロパツ
ール２５１１２から再結晶した。この中間生成物をイン
プロパツールでトリチュレートし、４−カルボキシベン
ズアルデヒドの所望のＮ−スクシンイミドエステル体２
．１　ｇ　（８，５ミリモル）を得た。

さらに中間生成物のバッチを製造し、全量１０ｇ（４０
ミリモル）のＮ−スクシンイミドエステルを、β−アラ
ニン３．６ｇ（４０ミリモル）のＩＮ水酸化ナトリウム
４０ｘＱおよび水約１００５１１２中溶液に加えた。そ
のｐＨを８以上に維持しながら、その混合物を１．５時
間撹拌した。次いで、混合物を濾過し、得られた濾液の
ｐａｌを、２Ｎ塩酸を用いてｐＨ１，９にまで酸性にし
た。全量１５０ｊ１１２の酢酸エチルで３回抽出し、得
られた有機層をまとめ、塩水で洗浄した。次いで、有機
層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に留去して白色固
体の３−（４−ホルミルフェニルカルボニルアミノ）プ
ロピオン酸４．６ｇ（２１ミリモル）を得た。

この中間生成物１００ｍｇ　（０，４５ミリモル）、ジ
シクロへキシルカルボジイミド１０３１０３ｉ。

５ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド５７．５
ｘｇ　（０，５ミリモル）およびジオキサン１０１１Ｑ
を小フラスコに入れ、得られた混合物を窒素雰囲気下に
環境温度で撹拌した。薄層クロマトグラフィーによって
、この反応の進行を観察し、ジシクロへキシルカルボジ
イミド７５ｘｇ　（０，３６ミリモル）およびＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド４５ｍｇ　（０，４ミリモル）を
それぞれ追加した。

４時間後、この反応混合物を濾過し、得られた濾液を減
圧下に留去して固形物を得た。不純物を含む生成物的２
００ｘｇを得、これをジクロロメタ２９５％イソプロパ
ツールで溶出するシリカゲル３０ｇのクロマトグラフィ
ーにかけた。生成物を含有するフラクションをまとめ、
若干の不純物を含む所望の中間生成物８１ｍｇ　（０，
２５ミ！Ｊモル）を得た。

製造例４ ２５８ｎｍおよび２８０ｎｍのＵＶ分析によッテ、得ら
れたフラクションを評価し、生成物を含有するフラクシ
ョンをまとめ、濃度８．５ｍｇ／ｘρの溶液状（１１１
，５ｘＱ）の所望の生成物９４８ｍｇ　（６，３μ１ｄ
ｏｌ）を得た。この誘導化抗体におけるコンジュゲート
比率は、抗体１モル当たりリンカ−４，８モルであった
。

実施例１ １００ｍＱ容量フラスコに環境温度で、０．３４Ｍホウ
酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）７６、　ｌｘＱ中の抗体Ｌ／
ｌｃ２　（１０２６ｉ＋ｇ、６．８μｌ１ｏｌ）溶液を
加え、次いでアセトニトリル３．３ｘ（ｌ中、製造例３
で得た活性エステル１４．１ｍｇ　（４４μｍ。

１）を加えた。この混合物を環境温度で１時間撹拌した
。次いで、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）で溶
出するセファデックスＧ２５（ファルマシア）９０ｇの
クロマトグラフィーにかけた。

誘導化抗体４７２ｍｇ　（３，１μｍｏりを含有する、
製造例４の生成物の５５．６１Ｑ部分量を、０゜１Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，６）８７ｚＣを追加して希釈し
た。

メトトレキセート−γ−ヒドラジドの部分量１０１ｉｇ
１０１ｉμａ＋ｏｌ）をアセトニトリル７．２Ｒ１１お
よび１Ｍモノ塩基性カリウムリン酸緩衝液２１．６ｆｆ
（２中に取った。５Ｎ水酸化ナトリウムを少量この溶液
に加え、次いで得られた溶液に抗体溶液を加えた。氷酢
酸を用いてこの反応混合物のｐＨを５．８にまで酸性に
調節し、環境温度で１６時間撹拌した。次いで、遠心し
、上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデックス
Ｇ２５クロマトグラフイーカラム（９０ｇ）２個を用い
たクロマトグラフィーに供した。

全ｆｆｔ２０２．８ｘＩ２の溶液をこのクロマトグラフ
ィーから採取し、２８０および３７０ｎｍのスペクトル
を観察する紫外線分光測定によって分析した。

この分析により、溶液には０．０１８ｘｇ／ｘＱのメト
トレキセートおよび１．８７ｇｇ／ｘｃの抗体が含有さ
れていることが判明した。したがって、コンジュゲート
比率はモル濃度からみると３．０であった。

この生成物溶液を冷所で生理緩衝化食塩水に対して減圧
透析し、本実施例の生成物溶液を、同様に操作して得た
生成物溶液２１２１Ｑと一緒にした。透析によってその
容量をｔｏｓｚｇまで減じた。

得られた生成物を、雌性ヌードマウスの異種移植片とし
て確立しているヒト腫瘍Ｔ２２２　［マスイ（Ｍａｓｕ
ｉ）らのカンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、　４４．１００２
−０７（１９８４）］に対して評価した。マウスに腫瘍
を移植した後、３．６および９日後に、本コンジュゲー
トを以下の表に示すような投与１１（メトトレキセート
ヒドラジド含量に基づく）でマウスに静脈内投与（注射
）した。腫瘍移植後２．３および４週に、腫瘍を測定し
たので、得られた結果を、非処置対照マウスの腫瘍増殖
と比較した処置マウスにおける腫瘍増殖の阻害率として
以下の表に示す。ポジティブ対照動物は非結合型のメト
トレキセート−γ−ヒドラジドで処置し、コンジコゲー
ト処置動物と比較した。この処置の毒性を、毒性の兆候
を示した各々５匹のマウス処置群における動物の数とし
て報告する。得られた結果は以下のようであった。

（以下余白） 鼻１に 実施例１　　４ｙｔｇ／ｋｇ ０．５ ＭＴＸ　　　２０ ヒドラジド　　　　　４ 実施例２ 実施例１に記載の方法を、以下に記載のような異なる条
件下で４回繰り返した。

Ａ、Ｏ，１Ｍ酢酸すトリウム（ｐＨ５，６）６７μＱお
よびアセトニトリル３３μａに溶解したメトトレ牛セー
ドーγ−ヒドラジド０．６７ｍｇ部分量を、製造例４に
記載した中間生成物２．２ｍｇを含有するＯ、１Ｍ酢酸
ナトリウム溶液１３１１２と一緒にし、得られた混合物
を１１時間放置した。

次いで、バイオゲルＰ　６　（Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ６、バ
イオラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド、Ｃ＾９４８０４）
　５　、９　ｇのクロマトグラフィーにかけ、コンジュ
ゲート溶液５１１２を得た。これは、抗体１モル当たり
メトトレキセート３．２モルのコンジュゲート比率であ
る所望のコンジュゲート０．６ｍｇを含有しでいること
を見いだした。

Ｂ、上記Ａで使用したメトトレキセート−γ−ヒドラジ
ド溶液を同量、製造例４の中間生成物０゜４２ｍｇを含
有する中間生成物溶液０．９５ｉ＆と一緒にし、この混
合物を１１時間放置した。これを上記Ａに記載したよう
にクロマトグラフィーにかけ、コンジュゲート比率がＬ
／ｌｃ２抗体１モ抗体１リル当トレキセート５．４モル
のコンジュゲート０．１１ｇｇを含有するコンジュゲー
ト溶液４．７５ｚＩ２を得た。

Ｃ，アセトニトリル５０μＱおよびＩＭ　リン酸緩衝液
（ｐＨ５，８）１００μＱに溶解したメトトレ牛セード
ーγ−ヒドラジド０．７ｘｇを、０゜１Ｍ酢酸ｔ）、Ｉ
Ｊ’ｙム（ｐＨ５，６）　　１ｘ（ｌ　に溶解した製造
例４の中間生成物２．２ｍｇと一緒にした。

この混合物を１１時間放置し、上記Ａに記載したように
クロマトグラフィーにかけ、抗体１モル当たりメトトレ
キセート３．３モルのコンジュゲート比率であるコンジ
ュゲーＮ、３ｍｇを含有するコンジュゲート溶液５．３
ｊｌ１２を得た。

Ｄ、アセトニトリル５０μσおよび１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ５，８）１５０１１ρに溶解したメトトレキセート
−γ〜ヒドラジド０．７ｉｇを、０゜ＩＭ酢酸ナトトリ
ムＩｉＲ中、実施例４の中間生成物２．２ｍｇと一緒に
した。この混合物を１４時間放置した後、上記Ａに記載
したようにクロマトグラフィーにかけ、コンジュゲート
比率３．３のコンジュゲート体１．７ｘｇを含有するコ
ンジュゲート溶液５．３村を得た。

コンジュゲートの制御した濃縮物を培養培地に加えるこ
とによって、上記ＣおよびＤの反応生成物を、組織培養
中の腫瘍Ｔ２２２細胞の増殖の阻害能に関して評価した
。対照として使用した遊離抗体Ｌ／　Ｉ　Ｃ２は１６　
ＩＩＩａｇ／ｘＱで細胞増殖を３７％阻害し、１６０　
ｍｃｇｈＱでは９８％阻害した。

上記実施例Ｃのコンジュゲートは、メトトレキセート−
γ−ヒドラジド含量に基づいて０．００１３　ｍｃｇ／
ｚ（ｌで１３％、０　、０１３　ｍｃｇ／ｌｌＲで８７
％増殖を阻害した。

上記実施例りのコンジュゲートは、メトトレキセート−
γ−ヒドラジド含量に基づいて０．００１６　ｒｍｃｇ
／ｘ（ｌで２１％、０　、０１６　ｍｃｇ／ｘ（ｌで９
２％細胞の増殖を阻害した。

製造例５ 抗ＫＬ／　Ｉ　Ｃ２カルボニル−４−ベンズアルデヒド ４−カルボキシベンズアルデヒド・Ｎ−スクシンイミド
エステル０．３１ｘｇを上記製造例３に記載したように
製造した。それをジメチルホルムアミド１００μａに溶
解し、０．３４Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）２．１
ｘｒｌ中、抗体Ｌ／１ｃ２（１８，９ｍｇ）に加えた。

この混合物を環境温度で１．５時間撹拌し、次いでＯ，
１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６）で溶出するバイオゲ
ルＰ６（６ｇ）のクロマトグラフィーにかけた。溶液６
．２厘ａ部分量を得、これを２５６および２８０ｎｍの
スペクトルを観察するＵＶ分析によって分析した。

この分析により、抗体１モル当たりリンカ−５゜２モル
のリンカ−のコンジュゲート比率であり、濃度２．６ｇ
ｇｌ峠の誘導化抗体１６．ｌＪＩｇが得られたことを確
認した。

実施例３ コンジュゲート 誘導化抗体１０．４ｊ１ｇ　（０，０６９μｍｏｌ）を
含有する、製造例５に記載の溶液４ＲＩ２を、ジメチル
ホルムアミド２５０μｅ中、メトトレキセート−γ−ヒ
ドラジド３．２ｊ＋ｇ　（６，８μｍｏｌ）と−緒にし
た。この混合物を環境温度に６時間放置し、次いで冷蔵
庫に入れた。２日後、この混合物を遠心し、得られた上
清をバイオゲルＰ６（生理緩衝化食塩水で溶出）にかけ
、溶液８．５１ρを得、これを、２８０および３７０ｎ
ｍのスペクトルを観察するＵＶ分析によって分析した。

この分析により、生成物が、抗体１モル当たり６．４モ
ル薬物のコンジュゲート比率を有しており、この溶液が
０．６４ｘｇ／ｙ、Ｑのコンジュゲートを含有している
ことを確認した。

組織培養中のＴ２２２腫瘍細胞の増殖の阻害能について
、得゛られた生成物を評価した。このコンジュゲ−１・
は、メトトレキセート含量に基づいて、０、０３５μｇ
／ｘ（ｌの濃度で細胞増殖の７０％を阻害を示すことが
見いだされた。

製造例６ 抗体Ｌ　／　Ｉ　Ｃ２Ｆ　（ａｂ’　）　ｔ　７ラグメ
ントペブ’／７１２．６Ｒｇ／Ｍ（ｌのペプシン溶液２
，４ｘＱを生理緩衝化食塩水２７０籾中、Ｌ／ＩＣ２抗
体１．５ｇに加えることによって、抗体Ｌ／ＩＣ２のＦ
　（ａｂ’　）ｙフラグメントを調製した。この混合物
を３７°Ｃに２時間２０分間保存した後、トリエタノー
ルアミンを添加して反応を停止させた。

次いで、０．１５Ｍ酢酸ナトリウムで溶出するセファロ
ース・ファスト・フロー・カラムのクロマトゲラフイー
によって生成物を濃縮した。得られたＦ　（ａｂ’　）
ｙを含有するフラクションをまとめ、透析によって濃縮
し、抗体Ｌ／ＩＣ２のＦ　（ａｂ’　）＊フラグメント
９９２ｘｇを含有する生成物溶液１００ｘＱを得た。

製造例７ トゲラフイーにかけた。生成物を含有するフラクション
をまとめ、溶Ｈ９，６ｘＱ中に、抗体１モル当たす２．
８モルのコンジュゲート比率の誘導化抗体フラグメント
１９ｍｇ　（０，１９μｍｏｌ）を得た。

実施例４ デヒド 製造例６で調製したＬ／　Ｉ　Ｃ２Ｆ　（ａｂ’　）！
フラグメントを、０．３４Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ８
゜６）中で透析し、Ｆ（ａｂ５）ｙフラグメント２３ｙ
ｔｇ（０，２３μｌｌ１ｏｌ）を溶液３．８村として得
た。この溶液を、アセトニトリル１０２μｆｆ中、３−
（４−ホルミルフェニルカルボニルアミノ）プロピオン
酸・Ｎ−スクシンイミドエステル０．４４ｍｇ（１，４
μｍｏｌ）と−緒にした。この混合物を環境温度で１時
間撹拌し、次いで得られた溶液を、０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，６）で溶出するセファデックスＧ２５　
（１１ｇ）のカラムによるクロマンシュゲート 製造例７で調製した、誘導化抗体フラグメント８ＪＩｇ
　（０，０８μｍｏｌ）を含有する誘導化抗体フラクメ
：ｙ　ト溶１（１２，７ｘ（ｌ　ニ、ＩＭ！／ン＃！衝
液（ｐＨ５，６）０．４７婦を加えた。この溶液に、最
小量の０．１Ｍ酢酸ナトリウムに溶解したメトトレキセ
ート−γ−ヒドラジド３．７ｉｇ　（７，９μｍｏｌ）
を加えた。希塩酸によってこの混合物のｐＨを５．６に
戻しに環境温度で１７時間撹拌した。次いで、遠心し、
得られた上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデ
ックスＧ２５（１１ｇ）のカラムのクロマトグラフィー
にかけた。ＵＶ分析ニヨッテ、０．９５ｍｇ／ｘ９　で
含有する溶液状のコンジュゲート５．８ｇｇが得られ、
そのコンジュゲート比率は１モル当たり２．１モルであ
ることが判明した。

このコンジユゲートを、組織培養中で、Ｔ２２２腫瘍細
胞に対して試験し、メトトレキセート−γ−ヒドラジド
含量に基づいて濃度０．００４６ｍｃ　ｇ　／　ｚ（ｌ
で２２％程度、細胞増殖を阻害し、また濃度０．０４６
ｍｃｇ／ｘＱで８３％細胞増殖を阻害することが判明し
た。

製造例８ エステル フラスコに、５−ホルミルピロール−２−イルカルボン
酸１３９ｘｇ、ジシクロへキシルカルボジイミド２４７
ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１３８ｘｇ、およ
びジメチルホルムアミドＩＯ峠を加えた。この混合物を
窒素雰囲気下、環境温度で２時間撹拌し、減圧下に溶媒
を除去して粗製の活性エステル３９１ｇを得た。

この残渣をアセトニトリルＬｘ（ｌ中に取った。

すべての残渣が溶液を形成したわけではなかった。

この不均一な混合物を、β−アラニン８９ｘｇの０．５
Ｎ水酸化ナトリウム２ｚ（ｌ溶液にゆっくりと加えた。

同時に、ＩＮ水酸化ナトリウムを加え、そのｐＨを７．
５から８の間に維持した。次いで、その混合物を環境温
度で１時間撹拌し、濾過した。得られた濾液を希塩酸で
酸性にし、塩化ナトリウムを飽和させて酢酸エチルで抽
出した。

次いで、それを乾燥し、濃縮してオレンジ色の油を得、
それをジクロロメタ２９１０％メタノールで溶出するシ
リカゲルカラムのクロマトグラフィーにかけた。生成物
を含有するフラクションを減圧下に濃縮し、３−　（５
−ホルミルビロール−２−イルカルボニルアミノ）プロ
ピオン酸４９ｍｇを得た。

この中間生成物３１ｙｇをジオキサン３ｚｆｆ中に取り
、それにジシクロへキシルカルボジイミド３５＋ｇ、お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１９＊ｇを加えた。

得られた混合物を窒素雰囲気下に環境温度で２時間撹拌
し、次いて濾過して減圧下に濃縮した。得られた残渣を
、ジクロロメタ７９５％メタノールで溶出するシリカゲ
ルクロマトグラフィーにかけ、所望の中間体活性エステ
ル約６Ｒｇを得た。

製造例９ ド 抗体００７Ｂは、抗体ＫＳＩ／４を産生するハイブリド
ーマから誘導されたサブクローンであるハイブリドーマ
から産生される［バルキ（Ｖａｒｋｉ）らの、　Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　４４．６８１−８６（１９８
４）に記載されている］。０．３４Ｍホウ酸塩緩衝液に
１５３１ｇ／酎で含有させた抗体００７Ｂ　　１１０５
ｘの溶液を、製造例８の中間体活性エステル１．２９３
Ｉｇを含有する中間体のアセトニトリル溶液３００μＱ
と一緒にした。この混合物を環境温度で１時間撹拌し、
次いでＯ，１，Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５６）で溶出す
るセファデックスＧ２５カラム（１０ｇ）のクロマトグ
ラフィーにかけた。生成物を含有するフラクションをま
とめ、２８０ｎｍおよび３００ｎｍのカーブを測定する
Ｕｖ分析によって分析した。生成物は、標題中間生成物
を総量８３．２ｘｇ含有する、濃度５．７ｘｇ’／ｍＱ
の溶液１４．６ｘ（に含有されていた。コンジュゲート
比率は、３．６であった。

実施例５ シュゲート ０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．１５Ｍ　リン酸イオ
ンを含有する緩衝液（ｐＨ５，６）中、４８ｇｇ／ｚ＆
で存在する、製造例９の中間生成物１５ｘｇの溶液３．
ＩＪＩＱを、酢酸ナトリウム緩衝液０．２村中、メトト
レキセート−γ−ヒドラジド４．７Ｒｇと一緒にした。

その添加後、ｐＨを５゜６に調節し、得られた混合物を
環境温度で約２４時間撹拌した。次いで、遠心し、得ら
れた上清を、生理緩衝化食塩水で溶出するセファデック
ス６２５カラム（１０ｇ）のクロマトグラフィーに供し
た。生成物を含有するフラクションをまとめ、０゜２２
ミクロンフィルターで濾過し、所望のコンジュゲート９
．９ｍｇを含有する生成物溶液６．０５＋σを得、それ
を、２５０および２８０ｎｍのスペクトルを観察する紫
外線分光測定によって分析すると、コンジュゲート比率
は２．３であった。このコンジュゲートの結合能をラジ
オイムノアッセイによって、非コンジュゲート化００７
Ｂ抗体と比較して評価した。このコンジュゲートと抗体
の力価カーブは、実質的に同様であり、このことはリン
カ−および薬物とのコンジュゲートによっては抗体の結
合能は実質的に変化しないことを示している。

製造例１０ 抗体ＫＳＩ／４を濃度２０ｚｇ／ｍνで、０．３４Ｍホ
ウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）中で透析した。

その抗体溶液１ｊ１１２を、ジメチルホルムアミドに２
０肩ｇ／ｘ（ｌ溶液として加えた３−（４，４−ジェト
キシブチルアミ７カルボニル）プロピオン酸・Ｎ−スク
シンイミドエステルと反応させた。１つのケースでは活
性エステルの量は０．２４Ｂであり、他のケースでは０
．４８ｇｇであった。これら２つの反応混合物を２時間
撹拌し、次いで生理緩衝化食塩水で溶出するバイオゲル
Ｐ６のクロマトグラフィーにかけた。

最初の反応で得られた生成物は、所望の中間生成物１７
．８ｍｇであり、次の反応で得られた生成物は、所望の
中間生成物１５．６ｘｇであった。

実施例６ ト 上記の製造例１０で調製した誘導化抗体１ｘｃｔ全、０
．３４Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，６）中、メトトレキ
セート−γ−ヒドラジドと反応させた。

製造例１０の最初の生成物の場合は、その３．５肩ｇを
、ジメチルホルムアミド溶液としてのメトトレキセート
−γ−ヒドラジド２．３ｍｇと反応させた。第２の生成
物の場合、その量は２．９ｍｇであり、メトトレキセー
ト〜γ−ヒドラジドの量は２゜Ｏｘｇであった。次いで
、各場合とも、得られた反応混合物のｐＨを４．９に調
節した。次ぎに、３７°Ｃで１８時間反応させ、得られ
た生成物を、生理緩衝化食塩水で溶出するバイオゲルＰ
６のクロマトグラフィーにかけた。

各反応における生成物を含有するフラクションをまとめ
、２７９および３７０ｎｍのカーブを観察する紫外線分
光測定によって分析した。最初の反応の生成物は、コン
ジュゲート比率２．０の所望のコンジュゲート２．”７
ｍｇであった。第２の反応の生成物は、コンジ−ゲート
比率３．９の生成物２．６ｍｇであった。

本発明のコンジュゲートは、本発明の重要な構成要素で
ある、望ましくない細胞の増殖を阻害するための方法に
有用である。したがって、本発明はさらに、医薬製剤、
最も好ましくは患者の体内への注射に適した非経口用製
剤をも包含する。このような製剤は、普通に薬化学の分
野で使用されている方法によって調製される。本発明の
コンジュゲートは、生理食塩水、および非経口投与して
安全であり得る他の水溶液などの生理学的に許容され得
る液に良好に溶解する。

非経口投与用生成物は、使用前に素早く再製できるよう
に、製剤化され、固体、好ましくは凍結乾燥形態に分散
されることが多い。このような製剤は、本発明にとって
有用な製剤である。それらの調製法は、薬化学者には十
分知られるところであり、一般に、等強性を与えるため
に無機塩の混合物を含有させ、また乾燥調製物が再構成
時に素早く溶解できるようにラクトンなどの分散化剤を
含有させる。このような製剤は、高度に精製した水を用
いてメトトレキセート薬物に基づいて既知の濃度にまで
再構成する。

本発明のコンジュゲートの最適な投与量、および投与計
画は、患者の状態を勘案して、治療する医師によって決
定されなければならない。

当然ながら、一連の各投与毎に数日または数週間の間隔
をあけた分割した投与形態で投与するのが普通である。

本発明のコンジュゲートは、様々な用量範囲で有効であ
るが、通常、１週間当たりの投与量は、メトトレキセー
ト薬物的５０から約１０００ｘｇ／ｘ”以内に抑え、よ
り好ましくは約２００から約４００肩ｇ／ｌである。

本発明のコンジュゲートを投与するのに使用される製剤
例を以下に示し、理解の一助とする。

製剤例１ 実施例のコンジュゲート　　　　１００１ｇ生理食塩水
　　　　　　　　　　　１０ｇ（１低温で保存し、静脈
内投与する。

製剤例２ 実施例３のコンジュゲート　　　　１ｇラクトース ０１１ｇ 生理食塩水　　　　　　　　　１００肩ｅ低温で凍結乾
燥し、室温またはそれ以下の温度で保存し、投与するた
めに精製水を用いて再構成する。

製剤例３ 実施例４のコンジュゲート　　　　１ｇ分散化剤　　　
　　　　　　　　　２５ｇｇ生理食塩水　　　　　　　
　　１００酎低温で凍結乾燥し、室温またはそれ以下の
温度で保存し、投与するために精製水を用いて再構成す
る。

製剤例４ 実施例５のコンジュゲート　　１００１ｇ生理食塩水　
　　　　　　　　　１０村低温度で保存し、静脈内に投
与する。

製剤例５ 実施例６のコンジュゲート　　　　５ｇ分散化剤 ８０ｍｇ 生理食塩水 ５００村 低温で凍結乾燥し、室温またはそれ以下の温度で保存し
、投与するために精製水を用いて再構成する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式（ I ）： Ａｂ［ＣＯ−Ｘ＝Ｎ−ＨＮ−Ｍ］＿ｍ（ I ）［式中、
   ｍは１から約１０までの整数であり、Ａｂは、望ましく
   ない細胞に関連する抗原を認識する、生理学的に許容さ
   れ得る抗体または抗原を認識するそのフラグメントであ
   り、 Ｘは、以下の式： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （ＣＨ＿２）ｎ−Ａｒ−ＣＨ＝（III） （ＣＨ＿２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ＿２）ｎ−ＣＨ＝
   （IV）または、 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） で示されるリンカーであり、 Ｒは、水素、フェニル、または１つもしくは２つのニト
   ロ基、ハロゲン基、シアノ基もしくはトリフルオロメチ
   ル基で置換されているフェニルであり、 Ａｒは、▲数式、化学式、表等があります▼または▲数
   式、化学式、表等があります▼であり、 Ｒ＾１は、水素、アミノ、アミノ−Ｃ＿１−Ｃ＿４アル
   キル、ヒドロキシ−Ｃ＿１−Ｃ＿４アルキル、またはグ
   アニジノ−Ｃ＿１−Ｃ＿４アルキルであり、Ｒ＾２は、
   ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼ であり、 ｎは、０から５までの整数であり、 Ｍは、式（VI）： ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （ここに、Ｒ＾３は▲数式、化学式、表等があります▼
   、▲数式、化学式、表等があります▼、Ｓ、またはＯで
   あり、Ｒ＾４は、ＣＯ、ＳＯ＿２、Ｃｏ−（ＣＨ＿２）
   ｓ、またはＣＯ−ＮＨであり、 Ｒ＾５は、水素、またはＣ＿１−Ｃ＿３アルキルであり
   、ｓは、１または２であり、 Ｚは、▲数式、化学式、表等があります▼（VII） ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII）または ▲数式、化学式、表等があります▼（IX） であり、上記式中、ｔは、１から６までの整数、ｕは１
   から２２までの整数、 Ｒ＾６は、水素、または生理学的に許容され得る塩を完
   成させる部分） で示されるメトトレキセート薬物である］ で示される細胞毒性薬物コンジュゲート。 ２、抗体がモノクローナルまたはキメラ抗体、または抗
   原を認識するそのフラグメントである請求項１に記載の
   コンジュゲート。 ３、Ｘが、（ＣＨ＿２）ｎ−Ａｒ−ＣＨ＝、または▲数
   式、化学式、表等があります▼ である請求項１または請求項２に記載のコンジュゲート
   。 ４、Ｚが、▲数式、化学式、表等があります▼で あり、ｔが１である請求項３に記載のコンジュゲート。 ５、Ｒ＾３が、Ｎ（Ｒ＾５）であり、Ｒ＾４がＣＯであ
   る請求項１から請求項４までのいずれかに記載のコンジ
   ュゲート。 ６、請求項１から請求項５までのいずれかに記載のコン
   ジュゲートを活性成分として含有し、１つまたはそれ以
   上の非経口投与用担体または希釈剤を共に含有してなる
   医薬製剤。 ７、式：Ａｂ［ＣＯ−Ｘ＝Ｒ＾８］ｍ ［式中、Ｒ＾８はＯ、（ＯＣＨ＿３）＿２、または（Ｏ
   ＣＨ＿２ＣＨ＿３）＿２であり、Ａｂ、Ｘおよびｍは、
   請求項１から請求項３までのいずれかに記載の定義と同
   意義である］ で示される誘導化抗体。 ８、抗体がモノクローナルまたはキメラ抗体、または抗
   原を認識するそのフラグメントである請求項７に記載の
   誘導化抗体。 ９、請求項１から請求項５までのいずれかに記載のコン
   ジュゲートを製造するための方法であって、 式：Ａｂ［ＣＯ−Ｘ＝Ｒ＾８］ｍ ［式中、Ａｂ、Ｘおよびｍは請求項１から請求項３まで
   のいずれかに記載の定義と同意義であり、Ｒ＾８は請求
   項７における定義と同意義である］で示される誘導化抗
   体を式： Ｈ＿２ＮＨＮ−Ｍ ［式中、Ｍは請求項１における定義と同意義である］ で示される薬物ヒドラジドと反応させることを特徴とす
   る方法。