JPH072895A - 抗体−薬物複合体 - Google Patents

抗体−薬物複合体

Info

Publication number
JPH072895A
JPH072895A JP6082952A JP8295294A JPH072895A JP H072895 A JPH072895 A JP H072895A JP 6082952 A JP6082952 A JP 6082952A JP 8295294 A JP8295294 A JP 8295294A JP H072895 A JPH072895 A JP H072895A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
drug
reaction
protecting group
alkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP6082952A
Other languages
English (en)
Inventor
Russell Lavern Barton
ラッセル・レイバーン・バートン
Stephen Lyle Briggs
スティーブン・ライル・ブリッグズ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of JPH072895A publication Critical patent/JPH072895A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新しい免疫複合体とその製造中間体を提供す
る。 【構成】 式(Ｉ)： 【化１】 ［Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞または組織に関連す
る抗原を認識する抗体またはその抗原結合性断片を表
す。Ｒは反応に利用できるカルボニル官能性を有する薬
物を表す。Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保
護基を表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレン
を表す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ(アルキル)−
を表す。Ａは 【化２】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
ンを表す)。ｎは１から１０までの整数を表す。］で示
される生理学的に許容できる免疫複合体とその製造中間
体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】薬化学の分野では疾患を治療および防止す
るためのより特異的でより強力な薬物が徐々に開発され
てきた。しかしつい最近まで薬物を必要とする身体の特
定の部分に薬物を誘導するための手段はなかった。した
がって必要な特異的効果を有し、身体に他の影響を持た
ない薬物で患者を治療できることも少なくはないが、今
なお全身性の投与を行う必要がある。他方、もし治療を
必要としている器官、組織、さらには細胞に薬物を誘導
できるとすれば、薬物はそれを必要としているところに
濃縮されるので、極めて少ない投与量でよいことが多く
なるであろう。患者にとっての安全面と薬物の経済性に
関する利点は歴然としている。この数年の間、免疫学の
分野では薬物を必要とする位置に関連する特異的な抗原
に対する抗体に薬物を結合させることによって、そのよ
うな標的治療を行おうと試みてきた。今やこのような抗
体-薬物複合体に関する特許と科学的報文は数多くあ
る。しかし現在までのところ、医療用として認可された
抗体-薬物複合体はない。
【０００２】本発明は式(Ｉ)：
【化７】 ［Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞または組織に関連す
る抗原を認識する抗体またはその抗原結合性断片を表
す。Ｒは反応に利用できるカルボニル官能性を有する薬
物を表す。Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保
護基を表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレン
を表す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ(アルキル)−
を表す。Ａは
【化８】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
ンを表す)。ｎは１から１０までの整数を表す。］で示
される生理学的に許容できる薬物複合体を提供する。
【０００３】また本発明は式(ＩＩ)：
【化９】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保護基を表
す。Ｒ3'はカルボン酸活性化基、−ＯＨまたはその塩を
表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレンを表
す。Ｐはアミノ保護基を表す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−ま
たは−Ｎ(アルキル)−を表す。Ａは
【化１０】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
ンを表す)。］で示される中間体をも提供する。
【０００４】さらに本発明は式(ＩＩＩ)：
【化１１】 ［Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞または組織に関連す
る抗原を認識する抗体またはその抗原結合性断片を表
す。Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保護基を
表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレンを表
す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ(Ｃ1〜Ｃ6アルキ
ル)−を表す。Ｐはアミノ保護基を表す。Ａは
【化１２】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
ンを表す)。ｎは１から１０までの整数を表す。］で示
される修飾された抗体または抗体断片をも提供する。
【０００５】また本発明は本発明の複合体と非経口投与
できる媒質からなる医薬組成物と、薬物での治療を必要
とする患者に本発明の複合体を投与することからなる治
療法をも提供する。
【０００６】本明細書ではすべての温度を一貫して摂氏
温度で表す。百分率や濃度などの表現はすべて特にこと
わらない限り重量単位である。薬物複合体の濃度と投与
量に関する記載はすべて複合体中に含まれる薬物の量ま
たは濃度に換算されている。
【０００７】本明細書では本発明の化合物を概してマロ
ネート(マロン酸誘導体：malonate)と呼ぶ。しかしＹが
アミン官能基を表す化合物の場合、正確にはこれをマロ
ナメート(malonamate)と呼ぶべきであることは理解され
るであろう。そのような化合物を特に意味する場合には
マロナメートという用語を使用する。Ｒ1がアルキルを
表す化合物を記述する際にもマロネートという用語を使
用する。
【０００８】「カルボン酸保護基」という用語は、他の
場所で反応を行っている間のカルボン酸の保護に有用な
有機基を意味する。そのような基は合成化学、とりわけ
ペプチド化学では極めて広範囲に使用されており、保護
基は有機化学者には十分に知られている。この問題に関
してとりわけ便利な教科書はGreeneのProtective Group
s in Organic Synthesis(第2版,John Wiley and Sons,
ニューヨーク,1991)である。酸保護基はGreeneの著書の
第５章に議論されている。本発明との関連で最も好まし
い保護基は低級アルコキシ基(すなわちＣ1〜Ｃ4アルコ
キシ)、とりわけエトキシである。好ましく便利な酸保
護基にはさらにメトキシメトキシ、テトラヒドロピラニ
ルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、ベンジルオキ
シメトキシ、フェナシルオキシおよび置換フェナシルオ
キシ、２,２,２-トリクロロエトキシおよび他のハロエ
トキシなどと、アミノ、エチルアミノ、ピロリジノ、モ
ルホリノ、ピペリジノ、ジエチルアミノエチルアミノ、
モルホリノエチルアミノ、ベンジルメチルアミノエチル
アミノなどのアミド形成基が含まれる。
【０００９】「カルボン酸活性化基」という用語はカル
ボン酸の反応性を増大させるために有機合成化学で使用
される基を包含する。そのような基は合成化学者らが頻
繁に使用するものであり、ベンゼンスルホニルオキシ、
メタンスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ、
フタルイミジルオキシ、スクシンイミジルオキシ、クロ
ロ、ベンゾトリアゾリルオキシ、ブロモ、アジドなどを
含む。本発明において好ましい活性化基はＮ-スクシン
イミジルオキシ、ベンゾトリアゾリルオキシおよびフタ
ルイミジルオキシである。
【００１０】「カルボン酸の塩を完成させる部分」とい
う用語は、酸素原子を介して結合していてカルボン酸の
塩を形成する化学部分であって、一般に理解されている
ものを意味する。例えばアルカリ金属、アミン基および
４級アンモニウム基などの塩形成部分が望ましい。より
具体的には、ナトリウム、カリウムおよびリチウム部分
がより好ましい。さらに例えばアンモニウム、テトラメ
チルアンモニウム、ジエチルジプロピルアンモニウムな
どの４級アンモニウム基が有用であり、状況に応じて適
宜これらを選択することができる。さらにメチルアミン
やブチルアミンなどのアミン類も塩の形成に便利であ
る。
【００１１】「アルキレン」という用語は、非環式飽和
炭化水素から誘導される２価の基であって、アルキレン
がメチレンである場合を除いて遊離の結合が同じ炭素原
子上にないものを意味する。本発明での使用に適したア
ルキレンにはメチレン、エチレン、トリメチレン、メチ
ルエチレン、テトラメチレン、エチルエチレン、２-メ
チルトリメチレンなどが含まれる。
【００１２】「アリーレン(arylene)」という用語は、
ベンゼン、メチルベンゼン、イソプロピルベンゼン、
１,３-ジメチルベンゼン、１,２-ジメチルベンゼンなど
の単環式アレンから誘導される２価の基を意味する。
【００１３】「アミノ保護基」という用語は、本発明の
免疫複合体を合成する間のヒドラジドの保護に有用であ
ることが当該技術分野で知られている数多くの保護基を
意味する。上述のGreeneの著書の第７章(これは参考文
献として本明細書の一部を構成する)には数多くのアミ
ノ保護基が列挙されている。ベンズアルデヒドとそのメ
トキシ誘導体は好ましいアミノ保護基である。
【００１４】本発明の薬物複合体は、抗体、ある種の化
学物質である薬物および抗体と薬物を連結する有機化学
基から構成される。また本発明は、その複合体の製造に
使用される中間体マロネートと、活性型のマロネート中
間体と抗体または抗体断片との反応によって製造される
修飾された抗体をも提供する。まず抗体と薬物について
個別に議論し、次にマロネート中間体とその合成につい
て説明し、最後に複合体の例を示すことにする。
【００１５】抗体 本発明の薬物複合体の機能が薬物の生物学的効力と抗体
の抗原選択性によって決定されることは理解されるであ
ろう。特定の薬物がある細胞に送達されて利益をもたら
す時、その細胞に関連する抗原を認識するであろう抗体
を選択する。例えば薬物が抗新生物剤であるとすれば、
腫瘍細胞に関連する抗原を認識する抗体を選択する。抗
新生物剤などの抗増殖剤はさらに心血管疾患の治療にも
適用される。血管形成術後にしばしば再発狭窄症が起こ
ることは現在ではよくわかっている。血管形成術によっ
てアテローム性動脈硬化斑を除去した領域に抗増殖剤を
部位特異的に送達することは、再閉塞を遅延または防止
するうえで有用であろう。薬物がセファロスポリンなど
の抗細菌剤である場合には、細菌抗原を認識する抗体を
選択する。使用する薬物の特徴に応じて、ある場合には
細胞によって内部化される抗体またはその抗原結合性断
片を選択することが好ましいであろうし、表面抗原を認
識することによって細胞表面に留まる抗体またはその抗
原結合性断片(例えばＦａｂやＦ(ａｂ')2)を使用するこ
とが好ましい場合もあろう。
【００１６】抗体の供給源は本発明にとって決定的な問
題ではない。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ
などを含む免疫グロブリンのいずれのクラスまたはサブ
クラスから選択してもよい。同様に、薬物の効果が有益
である細胞を抗体が標的にする限り、起源の種は決定的
な問題ではない。
【００１７】当該技術分野の現状として薬物複合体には
モノクローナル抗体が頻繁に使用されており、本発明に
おいてもそれらの使用が好ましい。しかしポリクローナ
ル抗体を除外するわけではない。モノクローナル抗体の
エピトープ特異性を保持している遺伝子的に操作された
抗体も現在の当該技術分野では知られており、これらは
免疫原性の低い分子を提供する。そのような遺伝子的に
操作された抗体も本発明によって包含される。キメラ抗
体は１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８
１６５６７号に記述されている。米国特許第４８１６５
６７号(Cabilly)の内容はすべて参考文献として本明細
書の一部を構成する。遺伝子的に操作された抗体を生産
するもう１つの方法はやはり１９８９年３月２８日に発
行された米国特許第４８１６３９７号に記述されてい
る。米国特許第４８１６３９７号(Boss)の内容もすべて
参考文献として本明細書の一部を構成する。１９８７年
９月３０日に公開された欧州特許公開第０ ２３９ ４０
０号に教示されているように、米国特許第４８１６３９
７号の方法はさらに洗練されたものになっている。欧州
特許公開第０ ２３９ ４００号(Winter)の教示は、本発
明の免疫複合体の成分として使用するモノクローナル抗
体の遺伝子操作にとって好ましい形式である。Winterの
技術は、ヒト抗体の相補的決定領域ＣＤＲをネズミモノ
クローナル抗体のＣＤＲで置換することによって、ヒト
抗体の特異性をＣＤＲ領域の供給源であるネズミ抗体の
特異性に変換するものである。このＣＤＲ技術は、最小
限度のネズミ配列を含有し、それゆえに免疫原性の低い
分子を与える。一本鎖抗体技術も遺伝子的に操作された
抗体の１種であり、現在の当該技術分野ではよく知られ
ている。Bird,R.E.ら,1988,Science 242:423-426を参照
のこと。一本鎖抗体技術は、重鎖と軽鎖の結合領域をポ
リペプチド配列で結合することによって、それが由来す
るところの抗体の結合特異性を有する単一のポリペプチ
ドを作成するものである。上述の遺伝子操作法は、免疫
原性形式を低くする一方で親抗体の結合特性を保持して
いる分子を作成するための手段を当業者に数多く提供す
るものである。したがって遺伝子的に操作した抗体を得
て、それを本発明で使用することができる。
【００１８】免疫学の進歩によって抗体の選択は今や好
みの問題になっているが、抗体と複合体を評価する方法
に関するいくつかの議論を便宜上以下に記載する。第１
に、抗体は妥当な量の抗体を製造できるほど安定なハイ
ブリドーマによって生産されるべきである。抗体そのも
のは精製しやすいものであるべきで、具体的には妥当な
濃度で化学操作ができるほどに水溶性であるべきだ。
【００１９】候補抗体を用いて製造した複合体をまず抗
原結合能に関して評価する。当業者は抗原結合能の減少
を容易に決定できることを理解するであろう。競争的放
射線免疫検定法(ＲＩＡ)とフローサイトメトリー(flow
cytometry)は、元の抗体と比較して複合体の結合能が減
少しているかどうかを決定するための最も便利な手段の
うちの２つである。遊離の抗体の結合能よりわずかに減
少することは予期されることであり、許容できる。次に
抗原陽性細胞に対するインビトロ効力(例えば抗癌剤の
場合には細胞毒性)を決定するための試験をする。有効
な複合体は細胞に高濃度の薬物を送達するというその能
力ゆえに、同じ検定法では遊離の薬物よりもいくらか低
い効力を持つことができる。次に、最初の２つの試験で
許容された複合体をJonsonおよびLaguzza,Cancer Resea
rch 47,3118-22(1987)が教示しているヌードマウスヒト
腫瘍異種移植モデルで評価する。ヌードマウスでは候補
複合体を遊離の薬物、遊離の薬物と遊離の抗体、非誘導
性免疫グロブリンとの複合体に対して試験すべきであ
り、候補複合体は改善された効力または総合的な安全性
を示すべきである。投与量範囲の研究は異種移植モデル
で行われるべきである。異種移植モデルで効力のあった
複合体を、ヒトに認められるものと類似する様式で目標
の抗原を発現させることがわかっている動物での試験に
付す。このような試験で複合体が抗原に対して有意な程
度の結合をもたらし、異種移植モデルで治療的であると
予測される投与量での毒性があまりない場合、その候補
複合体は治療的な潜在能力を持っているとみなすことが
できる。
【００２０】適切に選択された抗体の断片が無傷の抗体
と同じ効果を持つことは理解されるであろう。免疫グロ
ブリンを切断して２価または１価の断片にするためにそ
れぞれタンパク質加水分解酵素であるパパインとペプシ
ンを使用することは当業者の知るところである。したが
って本発明を実施する場合、処置すべき細胞に関連する
抗原を認識する抗体の断片(とりわけＦ(ａｂ')2断片)は
まさに無傷の抗体と同じく有用であり得る。Ｆａｂ断片
も有用である。
【００２１】リンカー基が抗体と反応して抗体に結合す
る正確な機構は式(Ｉ)または(ＩＩＩ)には示されていな
いし、完全にはわかっていない。この反応はおそらく後
述するようなアシル化であり、抗体分子のいくつかの位
置がアシル化の対象になる。最も一般的にはリジン部分
の遊離のアミノ基上で抗体のアシル化が進行すると思わ
れる。しかしアシル化はヒドロキシ基、フェノール基、
イミダゾール環およびおそらくは他の部分をも攻撃する
ことができる。
【００２２】式(Ｉ)と(ＩＩＩ)は抗体１分子に１〜１０
個のリンカー薬物部分が結合していることを示してい
る。当然のことながら、複合体のあるバッチは抗体に対
する薬物-リンカーの比率がある範囲にわたる分子を必
然的に含有するであろうから、抗体１分子あたりのこの
ような部分の数は平均数である。当然のことながら、各
抗体分子にいくつかの薬物分子を結合させると、高価な
抗体が最も効率よく使用されることになる。しかし過剰
な分子数の薬物-リンカー部分を結合させることは通
常、抗原を認識してそれに結合するという抗体の能力に
有害な影響を与えるので、ｍの値については妥協点を見
いださなくてはならない。一般にｍの好ましい平均値は
３〜８である。複合比は、薬物、リンカー、ペプチド結
合などを検出するために選択された波長で免疫複合体の
吸光度を測定し、次いでその吸光度データと様々な成分
の吸光係数から１抗体あたりの薬物の平均量を導き出す
ことによって、容易に決定される。
【００２３】免疫学者は本発明で使用するために数多く
の抗体を入手することができるし、関連する雑誌の各号
にはいつも有用な抗体が開示されている。本発明の実施
に応用することができる抗体を総括的に列挙することは
不可能であるし、その必要は全くない。一般的な免疫学
者や化学者はAmerican Type Culture Collection(米国
メリーランド州ロックビル)のカタログや米国94941カリ
フォルニア,ミル・バレイ,グレン・ドライブ40番のLins
cott's Directoryが発行しているLinscott'sDirectory
of Immunological and Biological Reagentsなどの供給
源から抗体を選択することができる。American Tissue
Culture Collectionを以下ＡＴＣＣと呼ぶ。ＡＴＣＣか
ら入手することができる特定のハイブリドーマについて
述べる時はＡＴＣＣがその特定のハイブリドーマに割り
当てた受託番号に言及する。したがって、腫瘍、細菌、
カビ、ウイルス、寄生虫、マイコプラズマまたは組織適
合性抗原ならびに病原体表面抗原、毒素、酵素、アレル
ゲンおよび生理学的に重要な細胞と組織に関連する他の
種類の抗原など、基本的にいずれの決定因子に対して
も、抗体を選択することは当業者にとって単純な問題で
ある。
【００２４】本発明の最も好ましい使用は、具体的には
偏平癌腫細胞、腺癌細胞、小細胞癌腫細胞、グリオーマ
(glyoma)細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌腫細胞、遷移細胞
癌腫細胞、肉腫細胞、腫瘍脈管構造を支持する細胞およ
び白血病やリンパ腫などのリンパ様腫瘍を含む癌細胞に
細胞毒性剤を送達する際の使用である。上述のすべての
細胞を標的にする適当な抗体が利用可能であり、その供
給源はLinscottに見つけることができる。あるいは、従
来の方法によってそのような抗体を製造する際に必要な
ハイブリドーマをＡＴＣＣや他の細胞系収集物から入手
することができる。
【００２５】現在知られているいくつかの抗体は本発明
の抗癌的側面での使用にとってとりわけ興味深い。本発
明の目的にとって好ましい抗体はＡＴＣＣから入手する
ことができ、これらには次のものが含まれる：Ｌ／１Ｃ
２，ＨＢ９６８２；ＣＣ８３，ＨＢ９４５３；ＣＣ９
２，ＨＢ９４５４；ＣＣ１１，ＨＢ９４５５；ＣＣ１１
２(これはMaytag１２としても知られている)，ＨＢ９４
５６；ＣＣ３０，ＨＢ９４５７；ＣＣ４６，ＨＢ９４５
８；ＣＣ４９，ＨＢ９４５９およびＣＣ１５，ＨＢ９４
６０。本発明の目的にとってＣＣ４９，ＨＢ９４５９は
とりわけ好ましい。
【００２６】本発明の抗体-薬物複合体を上述の抗体の
いくつかを使用して製造した。これらの抗体-薬物複合
体(免疫複合体)はインビトロ検定とヌードマウス異種移
植モデルで活性を発揮した。
【００２７】もう１つの興味深い抗体はＫＳ１／４であ
り、この抗体はVarkiら,Cancer Research 44,681-86(19
84)に初めて開示された。非腫瘍抗原に対する反応性を
持つ２つの興味深い抗体はＯＫＴ３とＯＫＴ４であり、
これらはそれぞれ末梢Ｔ-細胞とヒトＴ-ヘルパー細胞に
結合する。これらはそれぞれＡＴＣＣにＣＲＬ８００１
およびＣＲＬ８００２として寄託されているハイブリド
ーマによって生産される。
【００２８】様々な医療用途に有用な抗体のさらなる供
給源は次のものである。免疫調節と腫瘍療法に有用な抗
ヒトリンパ球および単核細胞抗体はＡＴＣＣの培養物Ｈ
Ｂ２、ＨＢ２２、ＨＢ４４、ＨＢ７８およびＨＢ１３６
によって生産される。腫瘍療法に有用な抗トランスフェ
リン受容体抗体はＡＴＣＣの培養物ＨＢ８４によって生
産される。ＡＴＣＣの培養物ＨＢ８０５９は結腸直腸癌
腫モノシアロガングリオシドに対する抗体を生産し、培
養物ＨＢ８１３６は免疫調節とＴ-細胞白血病療法に有
用な成熟ヒトＴ-細胞表面抗原に対する抗体を生産す
る。ＡＴＣＣのハイブリドーマＨＢ９６２０はＣＥＭ２
３１.６.７と呼ばれる抗癌胎児性抗原を生産する。小細
胞癌腫の診断と治療に有用なモノクローナル抗体はStei
n,RおよびGoldberg,D.(1991),Chest 99:1466-1476に概
説されている。
【００２９】したがって免疫学者や薬物誘導分野の知識
がある人々は、一般的に知られているこの分野の刊行物
や上述の実例と説明を手助けにして、薬物で処置するこ
とを望む細胞に適当な薬物を誘導するための抗体を容易
に選択することができる。
【００３０】モノクローナル抗体の製造法と精製法は免
疫学者にはよく知られている。Selected Methods in Ce
llular Immunology(Mishell,BおよびShiigi,S編,1980,
W.H.Freeman and Company,ニューヨーク州ニューヨー
ク)は、ハイブロドーマを培養し、腹水を生産し、抗体
を精製する方法を実験書のレベルで詳述している。
【００３１】薬物 上述のマロネートリンカーを用いて薬物と抗体を連結す
る方法が本発明の要旨であることと、薬物と抗体がどち
らも本発明を制約しないことは理解されるであろう。式
(Ｉ)において、薬物の反応に利用できるカルボニル基の
少なくとも１つが実際にヒドラジドとの結合を形成して
いる場合に、「薬物」が反応に利用できるカルボニル官
能性を持つと定義されることは当業者の認識するところ
である。ヒドラジドとの結合に先立って反応に利用でき
るカルボニル官能性を１つだけ持っている薬物は、ヒド
ラジドに結合した後は反応に利用できるカルボニル官能
性を保持しないのであるが、それでもこれらは薬物の定
義に包含される。したがって本発明のマロネートリンカ
ーは、これを治療用または予防用の薬物に応用する場
合、マロネートと結合できる化学官能性を持つという薬
物に関する必要性と、その薬物が有益に作用する細胞を
標的にするという抗体に関する必要性によってのみ制約
され、有益に使用される。本発明が提示するヒドラジド
連結機構は薬物が反応に利用できるカルボニル(例えば
アルデヒドやケトンなど)官能性を持つことを必要とす
る。さらに当然のことながら薬物は、標的部位で免疫複
合体から薬物またはその誘導体が放出される時に、反応
に利用できるアルデヒドまたはケトンカルボニル官能基
とヒドラジドリンカーとの反応が薬物の活性を破壊しな
いような性質のものでなくてはならない。反応に利用で
きるカルボニル官能基を持つ薬物は「リンカー」のヒド
ラジド部分との反応時にシッフ塩基を形成する。「リン
カー-薬物」部分の生体内(インビボ)加水分解によって
薬物のカルボニル官能基が再生するので、もし薬物の生
物学的活性が免疫複合体への組込み時に修飾されたとす
れば、この加水分解によって薬物の活性が回復する。し
たがって本発明のリンカーは、例えば抗細菌剤、抗ウイ
ルス剤、抗カビ剤、抗ガン剤、抗マイコプラズマ剤など
を含む基本的にすべての種類の薬物と関連づけて使用す
ることができる。このようにして構築された薬物複合体
は、対応する薬物が有効であるような通常の用途に有効
であり、格別の利益を有する領域に薬物を誘導するとい
う抗体に固有の能力ゆえに、より優れた効力を持つ。
【００３２】米国特許第５０１０１７６号と第４６７１
９５８号は薬物の複合化に付すことができる薬物と他の
化合物に関する情報を記載しており、これらの特許の薬
物に関する開示は参考文献として本明細書の一部を構成
する。数多くの科学的刊行物と書籍が、本発明の免疫複
合体が用途を見いだすところの無数の医療領域で使用さ
れる医薬物質を総括的に列挙している。例えばUSAN and
USP Dictionary of Drug Names(United States Pharma
copeia Convention,Inc.,20852メリーランド州ロックビ
ル,ツインブルック・パークウェイ12601番)は、薬物に
関する現在のＵＳＰおよびＮＦ名について構造、名称お
よび医療領域を記述している。上述のように薬物は反応
に利用できるカルボニル官能性を介して反応するので、
薬物を選択する際の唯一の制約はカルボニル基と所望の
治療活性が存在するということである。
【００３３】本発明での使用にとって最も好ましい有効
な種類の薬物は細胞毒性剤の類、具体的には癌療法に使
用されるものである。そのような薬物には一般にアルキ
ル化剤、抗増殖剤、チューブリン結合性剤などが含まれ
る。好ましい種類の細胞毒性剤には例えばアントラサイ
クリン族の薬物、ビンカ薬物、ミトマイシン類などが含
まれる。とりわけ好ましい薬物にはダウノマイシンとそ
の誘導体が含まれ、ドクソルビシンはとりわけ好まし
い。概説した好ましい化合物に当業者が化学修飾を施す
ことによってカルボニル官能性を導入してもよいことは
理解されるであろう。また好ましい複合体が好ましい薬
物から製造されることも理解されるであろう。
【００３４】中間体 本発明の中間体マロネートは抗体および薬物と反応させ
る中間体である。したがって中間体マロネートは抗体と
薬物を結合させるリンカーの前駆体であり、それゆえに
好ましい中間体マロネートはその構造を好ましい複合体
に付与する。この中間体はマロン酸の誘導体であり、既
知の手法か、有機化学者が容易に発想する手法に従って
製造される。
【００３５】合成 本合成の多くの段階において、他の官能基で所望の反応
を行っている間に出発物質と中間体上の様々な反応性官
能基を保護する必要があることは有機化学者には理解さ
れるであろう。したがって一般に反応が終了した後でこ
れらの保護基を除去する必要がある。このような保護段
階と脱保護段階は有機化学では全くの従来技術であり、
本明細書で完全に説明する必要はないであろう。しかし
保護基に関する上述のGreeneの教科書が、ヒドロキシ
基、チオール基、アミン基などを含む一般に認められる
反応性官能基のすべてについて保護基を完全に説明して
おり、これらの保護基を導入および除去する方法を概説
していることを注記しておく。
【００３６】中間体マロネートの合成
【化１３】 有機化学の当業者は一般的知識と一般的な文献をもとに
あらゆる中間体マロネートを製造することができる。理
解を確実なものにするために説明を行い、反応式を示
す。説明では特定の反応(例えばＳ１、Ｓ２)を取り上げ
て反応式に言及する。反応式には略号に続けて例示とし
て代表的な基を記載する。
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【００３７】Ｒ1はアルキルを表し得るが、中間体マロ
ネートの製造に好ましい出発物質はカルボン酸保護基Ｒ
1がカルボキシ基のうちの１つ上にあるマロン酸誘導体
から出発する(Ｓ１を参照のこと)。他方のカルボキシ基
は同じもので置換されていてもよいし、違うもので置換
されていてもよい。異なる場合は、Ｒ2基はＲ1基よりも
除去しやすいものでなければならない。この出発物質を
ハロアルカノエート(ハロアルカン酸エステル)またはア
ミノアルカノエート(アミノアルカン酸エステル)と反応
させる(Ｓ２を参照のこと)。ここではアルキル鎖の長さ
がメチレン基(Ｑ)を与える。アミノが鎖の末端にあるア
ミノアルカノエートを使用することによってＹがアミノ
である中間体を製造する。アルカノエートのエステル部
分は酸保護基である。
【００３８】出発化合物のＲ2基を除去し、それによっ
て生成したカルボン酸をアルカノエートと反応させるこ
とによってこの反応を行う。この反応は、例えばシクロ
ヘキサジエンの存在下で水素化触媒を使用することによ
る最初の還元によって成功裏に行われた。別法として、
貴金属触媒などの適当な触媒の存在下で水素化を行うこ
ともできる。
【００３９】また水性溶媒(水性アセトンなど)中で強塩
基(とりわけ水酸化リチウム)を用いてＲ2エステルを破
壊することによってこの反応を行うこともできる。カル
ボン酸陰イオンが形成した時にハロアルカノエートを添
加すると(とりわけ酸補集剤の存在下では)中間体マロネ
ートが極めて迅速に形成する。しかしアミノアルカノエ
ートとの反応では、マロネートを形成させるために上述
の活性化基の１つを加えることによってカルボン酸を活
性化すべきである。Ｒ1がアルキルを表す場合、Ｒ2エス
テルの分解には単純な加水分解を用いる。Ｒ1とＲ2が共
にエステルである場合には、水素添加か１等量の塩基に
よる加水分解を用いてＲ2エステルを分解する。
【００４０】反応Ｓ２では酸保護基を伴う中間体マロン
アミドが生成する。この第１の中間体を、生成するアル
コールと反応させるための無水物(酢酸無水物など)およ
びルイス酸(塩化亜鉛など)の存在下で適当なオルトギ酸
アルキルと反応させることによってアルコキシメチレン
基を挿入する(Ｓ３を参照のこと)。この反応は１００〜
２００℃の範囲の高温で行われ、数時間で完了する。
【００４１】上記の反応は後述の反応と同様に著しく過
剰な量の出発物質を必要としない。一般的な有機化学の
場合と同じく、より高価な反応物が確実に完全に消費さ
れるように比較的安価な反応物をやや過剰に使用するこ
とが望ましい。この規則は典型的には極めて高価で製造
と精製が困難な抗体自身との反応の場合にはとりわけ的
を得ている。しかし一般には、成分のコストと装置の処
理量を念頭に置いて、その工程の経済性を最大化するよ
うに過剰量の反応物を選択することができるのであっ
て、ただ単に反応を起こらせるためだけに過剰の量を使
用する必要はない。
【００４２】段階Ｓ４では保護基を付加することによっ
てジヒドラジドを遮断する。数多くのアミノ保護基が当
該技術分野では知られている(上述のGreeneの著書の第
７章を参照のこと)。ベンズアルデヒドは好ましいアミ
ノ保護基であり、２,４-ジメトキシベンズアルデヒドは
とりわけ好ましい。本発明の化合物を合成する際に使用
する他のアミノ保護基の選択は充分に一般的な有機化学
者の能力の範囲内である。好ましい保護基はヒドラジド
と二重結合を形成するので、式(ＩＩ)と(ＩＩＩ)ではヒ
ドラジドと保護基の間に二重結合が書いてある。本発明
の化合物の合成に使用しやすい数多くの保護基はヒドラ
ジド部分と単結合を形成し、これらも本発明によって予
期されるところであるので本発明の範囲に包含される。
【００４３】薬物との反応 Ｓ３ で得た中間体マロネートを、アルコキシ基が置換さ
れるような条件下で、Ｓ４で得た保護ジヒドラジドと反
応させる(Ｓ５)。一般にこの反応は、反応物のいずれと
も反応しない有機溶媒かそのような有機溶媒の水性混合
物中０〜５０℃という温和な条件下で、通常は温和な塩
基(重炭酸アルカリ金属、炭酸アルカリ金属、水酸化ア
ルカリ金属など)の存在下で行われる。この反応は一般
に定量的であり、著しく過剰な量を必要としない。しか
し通常は誘導体化した薬物をかなり注意深く精製するこ
とが重要であるから、生成物の単離には高圧下でのクロ
マトグラフィーや他の高性能な手法を必要とするであろ
う。誘導体化した薬物を抗体と反応させることによって
複合体を完成させるので、誘導体化した薬物に伴う反応
性の不純物は抗体の反応性部位を消費し、それによって
製造に費用のかかる抗体を浪費することになる。
【００４４】修飾された抗体の合成 抗体を活性型の中間体マロネートと反応させる(Ｓ７：
ここに中間体マロネートのＲ3'基は上に説明したような
カルボン酸活性化基である)。カルボジイミド(とりわけ
ジシクロヘキシルカルボジイミド)などの従来の試薬を
用いてカルボン酸上に活性化基を置く。使用した保護基
に応じて酸保護基Ｒ3を適当な方法で除去した後にこの
ような反応を行う。活性化基との反応は不活性有機溶媒
(ジオキサン、テトラヒドロフラン、塩素化炭化水素な
ど)中で行われ、約０〜５０℃の範囲の穏やかな温度で
行うことができる。
【００４５】中間体マロネートを抗体と反応させる際の
条件を選択するうえで第１の問題点は抗体の安定性を維
持するということである。この反応は抗体を傷つけない
組成の水性媒質中で行わなくてはならない。Ｓ７を参照
のこと。特に好適な水性媒質はホウ酸イオン濃度が約
０.０５〜０.５Ｍの範囲にあるホウ酸緩衝液である。反
応媒質のｐＨはわずかに塩基性、すなわち約７.４〜８.
６の範囲にあるべきである。反応媒質は水性であるべき
だが、少量の有機溶媒が存在しても有害ではなく、少量
の有機溶媒の存在は極めて都合のよい場合もある。例え
ば中間体マロネートをジメチルホルムアミドやジオキサ
ンなどの少量の有機溶媒に溶解し、その有機溶液を水性
媒質中の抗体溶液に加えることは最も有利であり得る。
【００４６】抗体の溶解度は一般に高くないので、一般
的には比較的低濃度でこの反応を行う必要があろう。例
えば抗体の濃度は通常は約５〜２５ｍｇ／ｍｌ-水性媒
質の範囲である。
【００４７】上述のように抗体１モルにつき１モルから
約１０モルまでのリンカーおよび薬物を結合させる。こ
のような複合比を得るために、通常は過剰量のリンカー
中間体を使用する必要がある。アシル化条件下における
抗体と活性エステルの反応性はいくぶん変化し得るが、
一般的には抗体１モルにつき約９モルから約１５モルま
でのリンカー中間体をこの工程で使用する。
【００４８】０〜３７℃の温度でこのアシル化反応を数
分から数時間進行させる。高温は明らかに抗体にとって
有害であり得る。特にこの反応は元来迅速であるから、
低温で操作することがより望ましい。
【００４９】正しい位置にリンカー基を有する誘導体化
抗体を製造し終えたら、その反応混合物を後述の実施例
に示すゲル濾過などの従来の手法でクロマトグラフィー
に付すことによって、誘導体化された抗体を未反応のリ
ンカー中間体から分離することができる。
【００５０】複合体の合成 薬物が複数の反応性部位を持っている場合、通常は使用
する意図のない薬物の反応性基を遮断する必要がある。
そのような遮断は上述のように保護基を用いて行われ、
有機化学者にとって特に困難な点はない。
【００５１】修飾した薬物を製造し、複合体製造の最終
段階としてそれを抗体と反応させる場合、抗体との反応
に関する上述の注意点をそのまま適用することができ
る。抗体の量と誘導体化した薬物の量の間の比率の選択
には同じ原則があてはまる。抗体が耐え得る条件なら一
般にどのような条件でも薬物は耐え得るであろうから、
一般に反応条件は抗体の安定性を考慮して選択されなけ
ればならない。修飾した抗体を製造し、最終段階で薬物
と反応させる場合には、抗体の安定性を保証する注意を
遵守しなければならない。
【００５２】したがって好ましい方法は修飾した抗体を
製造し、それを最終段階で薬物と反応させることであ
る。修飾した抗体(抗体-リンカー)の薬物との複合化に
先立ってジヒドラジドから保護基を除去する必要があ
る。脱遮断の方法は数多く利用可能であるが、溶液のｐ
Ｈを約５まで(ｐＨ約４.６がとりわけ好ましい)低下さ
せることによって保護基を除去することが好ましい。保
護基の脱離を容易にするために過剰量のヒドラジドまた
は他の１級アミンが存在することが好ましい。
【００５３】修飾した抗体と薬物の反応は上述のように
比較的低温度で、抗体が耐え得る媒質中で行われなけれ
ばならない。例えばとりわけ好ましい反応媒質は酢酸ナ
トリウム緩衝液(とりわけｐＨが４.５〜約６の０.０５
〜０.２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液)である。有機溶媒が抗
体を損傷する傾向を持たない限り、上述のように反応媒
質中に少量の有機溶媒が存在しても有害ではない。
【００５４】最後に薬物複合体を通常はクロマトグラフ
ィー法によって単離精製する。患者への投与に適した濃
度でクロマトグラフィー媒質から複合体を溶出させるこ
とも可能であろう。しかし通常は複合体をクロマトグラ
フィーによって精製し、便利な溶媒(最も好ましくは生
理学的緩衝化食塩水)を用いて、その溶解度が許す限り
の最高濃度で溶出させる。
【００５５】組成物と使用法 本発明の免疫複合体は、とりわけこれを医薬組成物(こ
れも本発明の一側面である)として非経口投与する場
合、本発明の治療法で有用である。式(Ｉ)で示される免
疫複合体と非経口投与できる媒質からなるそのような組
成物は、薬化学で一般に使用される方法によって製剤化
される。例えば本発明の免疫複合体は血清タンパク質
(ヒト血清アルブミンなど)、緩衝物質(リン酸塩など)、
水、電解質および生理学的食塩溶液などの生理学的に許
容できる液体(担体)にかなり溶解する。非経口投与用の
製品はしばしば製剤化され、使用直前に再構成するため
に固形(好ましくは凍結乾燥型)に分配される。そのよう
な製剤は本発明の有用な組成物である。凍結乾燥組成物
の製造は当該技術分野ではよく知られている。一般にこ
のような組成物は、等張性を付与する無機塩の混合物
と、乾燥した調製物を再構成時に迅速に溶解させる調合
剤(乳糖など)を含む。使用にあたってこのような製剤を
高度に精製した水で再構成する。
【００５６】本発明の組成物における本発明の免疫複合
体の最も効果的な濃度は、複合体中に用いた薬物、薬物
と複合体の物理学的特性、組成物の最終形態によって決
まる。このような組成物を製造する分野の当業者は考慮
すべき変数と組成物成分の最適な比率を容易に認識する
であろう。同様に本発明の免疫複合体にとって最も効果
的な投与法は疾患／感染の重篤度と経過、患者の健康と
処置に対する応答、治療する医師の判断に依存する。し
たがって免疫複合体と付随するあらゆる化合物の投与量
は個々の処置に合わせて滴定されるべきである。さもな
くば、標準的な医学文献から薬物の比効力とそれらの適
当な投与量範囲に関する指針を得るべきである。
【００５７】本発明は感受性の哺乳類細胞または組織を
処置する方法であって、そのような処置を必要とする哺
乳動物に上記の式(Ｉ)で示される免疫複合体の有効量を
投与することからなる方法をも提供する。さらに本発明
は哺乳動物宿主内における病原体の成長を阻害する方法
であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に上記
の式(Ｉ)で示される免疫複合体の有効量を投与すること
からなる方法をも提供する。本発明の方法のもう１つの
態様には、複合化学療法で使用するための、異なる薬物
もしくは異なる抗体またはその抗原結合性断片を保持す
るいくつかの異なる免疫複合体の同時投与または逐次的
投与が含まれる。複合体に含まれる薬物での処置を必要
とする患者の治療に複合体と複合体を含む組成物を使用
する。特定の治療目的と投与すべき投与量範囲は、薬物
の種類と処置する患者の状態に依存する。標準的な医学
文献から薬物の比効力とそれらの適当な投与量範囲に関
する指針を得るべきである。
【００５８】本発明の様々な中間体と複合体の合成を以
下の実施例でさらに説明する。
【００５９】実施例１：マロネート中間体の製造 本発明のＢＡＭＭＥ-ＣＨリンカーの合成では下記の反
応計画を用いた。実施例１に関する反応計画を各反応に
対応するローマ数字で分類する。実施例１の各章は(ロ
ーマ数字で示した)下記の反応式に対応する。この反応
式はただ単に実施例１の各章をたどる当業者を助けるた
めに記載するだけである。反応物、溶媒、触媒などは各
章で完全に詳述するが、反応式では省略する場合もあ
る。
【化１７】
【化１８】
【００６０】反応Ｉ １０００ｍｌ一口丸底フラスコ中でマロン酸エチル(Ald
rich)１５.９ｇをＣＨ2Ｃｌ2１５０ｍｌに溶解した。塩
化メチレン２００ｍｌ中のカルボニルジイミダゾール１
９.５ｇを加えた。カルボニルジイミダゾールを添加し
ている間、激しいＣＯ2の発生が観察された。その反応
混合物を室温で１時間撹拌した。β-アラニンベンジル
エステルトシレート塩６３.３ｇを水２００ｍｌに懸濁
し、激しく撹拌した。酢酸エチル１５０ｍｌを加えた。
１Ｍ ＮａＯＨをｐＨ９になるまで添加した。次に酢酸
エチル層を取り出し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。次にこの
物質を濾過し、上記の反応混合物にゆっくりと添加し
た。反応を室温で約７２時間進行させた。過剰の溶媒を
減圧下で除去したところ、橙色のシロップ状物が残っ
た。その橙色シロップ状物を酢酸エチルに溶解し、食塩
水、１０％クエン酸、食塩水、飽和Ｎａ2ＣＯ3および食
塩水で順次洗浄した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、濾過した後、減圧下で濃縮したところ、橙
色のシロップ状物が残った。このシロップ状物を最少量
の酢酸エチルに溶解した。反応混合物が濁り始めるまで
ペンタンを加えた。次に反応混合物を６００ｍｌ熔融ガ
ラスブフナー中のシリカゲル６０に注いだ。次に生成物
を２５％酢酸エチル／ペンタン１Ｌで洗浄した。次に生
成物を４７×２５０ｍｍのシリカゲルカラムでさらに精
製した。このシリカゲルフラッシュカラムは予めヘキサ
ンで平衡化しておいた。溶出にはヘキサン中の酢酸エチ
ル勾配を用いた。生成物を含有する試料を減圧下で濃縮
して淡黄色シロップ状物１７.２ｇを得た。ＮＭＲ分析
によって所望の生成物であることを確認した。
【００６１】反応ＩＩ ２５０ｍｌ一口丸底フラスコ中で上記のマロネート７.
７９ｇを酢酸無水物１６.５４ｍｌとオルトギ酸トリエ
チル(triethylorthoformate)１１.４９４ｍｌに溶解し
た。ＺｎＣｌ2３７４ｍｇを加えた。この塩化亜鉛は完
全には溶解しなかった。この反応混合物を加熱し、３時
間還流した。３時間の反応の終了時に一部を取り出して
ＴＬＣで分析した。ＴＬＣ分析によって出発物質が残っ
ていないことがわかった。その反応混合物を減圧下で濃
縮して黄色の粘性の液体を得た。反応混合物の濃縮後に
残ったこの黄色い粘性の液体を塩化メチレンに溶解した
後、４７×２５０ｍｍのシリカゲルフラッシュカラムに
注いだ。このシリカゲルフラッシュカラムは予め塩化メ
チレンで平衡化しておいた。このカラムを塩化メチレン
１Ｌで溶出させた。５００ｍｌの分画を２つ集めた。第
１分画は酢酸無水物とオルトギ酸トリエチルを含有し、
第２分画は残りのオルトギ酸トリエチルと塩化亜鉛なら
びにいくらかの所望の生成物を含有した。次にこのカラ
ムを２０％エタノール／ヘキサン２Ｌで溶出させ、５０
０ｍｌの分画を集めた。第１〜第３分画は比率が約５
０：５０の２つの反応生成物の混合物を含有したが、第
４分画はＲｆが０.２５未満の物質を極わずかな量だけ
伴う生成物を含有した。第４分画を減圧下で濃縮して淡
黄色のシロップ状物０.１７３ｇを得た。次にこのカラ
ムを４０％酢酸エチル／ヘキサン１Ｌで溶出させ、５０
０ｍｌの分画を２つ集めた。４０％酢酸エチル分画は２
０％酢酸エチルの第１〜第３分画と類似する組成であっ
たので、２０％酢酸エチル溶出液の第１〜第３分画と一
緒にした。次にカラムを７０％酢酸エチル／ヘキサン２
Ｌで溶出させ、５００ｍｌの分画を４つ集めた。第１分
画と第２分画は不純物を含有しており、このクロマトグ
ラフィー分離の間に集めた他の分画と一緒にした。７０
％酢酸エチル溶出液の第３分画と第４分画は純粋(Ｒｆ
＝０.２５)であり、所望の生成物を含有するこれらの分
画を減圧下で濃縮して無色のシロップ状物１.６６ｇを
得た。この２つの純粋な試料、すなわち７０％酢酸エチ
ル溶出液の第３分画と第４分画のＮＭＲは、化合物(２)
のＥ-異性体１.６６ｇとＺ-異性体０.１７３ｇが得られ
たことを示した。不純な分画を、予め塩化メチレンで平
衡化しておいたシリカゲルフラッシュカラム(２４×２
１０ｍｍ)での再クロマトグラフィーに付した。このカ
ラムを塩化メチレンで溶出させ、５０ｍｌの分画を８つ
集めた。第２〜第４分画は不純物を含有したが、第５〜
第８分画はＲｆ＝０.４５の純粋な物質を含有した。次
にこのカラムを２０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出さ
せ、５０ｍｌの分画を９つ集めた。すべての分画がＲｆ
＝０.４５を含有し、これらを塩化メチレン溶出液の第
５〜第８分画と一緒にした。次にカラムを５０％酢酸エ
チル／ヘキサンで溶出させ、各５０ｍｌの分画を集め
た。第１８分画と第１９分画は純粋なＲｆ＝０.４５の
物質を含有し、これらを先のＲｆ＝０.４５の分画と一
緒にした。第２〜第２７分画はＲｆ＝０.４５とＲｆ＝
０.２５の混合物を含有しており、これらを一緒にし
た。次にカラムを酢酸エチル２００ｍｌで溶出させたと
ころ、その溶出液はＲｆ＝０.４５と０.２５の混合物を
含有しており、これらを上述のように一緒にした。一緒
にした第５〜第１９分画を減圧下で濃縮して淡黄色のシ
ロップ状物１.８３ｇを得た。第２０分画から最終分画
までを減圧下で濃縮して無色のシロップ状物(化合物
(２))１.８６ｇを得た。
【００６２】反応ＩＩＩ ５００ｍｌ一口丸底フラスコ中でカルボヒドラジド５ｇ
を水２５ｍｌに溶解した。氷酢酸５ｍｌを加えた。次に
２,４-ジメトキシベンズアルデヒド１.０ｇを約１０分
間かけて滴下した。ジメトキシベンズアルデヒドの添加
前に形成した白色の沈殿が完了した。その沈殿物を濾過
によって集め、水で洗浄した後、乾燥した。得られた白
色の結晶を、熱い溶液から不溶性物質を濾別した後に、
酢酸エチル／メタノールから再結晶した。その結晶を濾
過によって収集し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥すること
によって白色の結晶１.６５ｇを得た。ＮＭＲを用いて
反応式ＩＩＩの生成物であることを確認した。
【００６３】反応ＩＶ １０％Ｐｄ／Ｃ(Engelhard)０.５７ｇの懸濁液を無水エ
タノール７ｍｌ中に調製し、その懸濁液を無水エタノー
ル８ｍｌに溶解した化合物(２)１.３６ｇを含有する１
００ｍｌ一口丸底フラスコに移した。新たに蒸留したシ
クロヘキサジエン１.１ｍｌを加えた。そのフラスコを
ストッパーで封印し、その反応混合物を６０℃で５分間
加熱した。薄層クロマトグラフィーを用いて反応混合物
中に出発物質が存在しないことを確認した。次にＰｄ／
Ｃを除去するために反応混合物を濾過した。黄色い濾液
を減圧下で終夜濃縮した。淡黄色の固体物質０.９６７
ｇを得た。ＮＭＲを用いて化合物(３)であることを確認
した。
【００６４】反応Ｖ ２５ｍｌ一口丸底フラスコ中で反応ＩＩＩの生成物０.
９６ｇを乾燥ジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解した。
反応ＩＶの生成物０.８８ｇを加え、反応温度を約６５
℃に上昇させた。反応物が溶解した時に反応混合物を室
温に冷却し、撹拌した。次にその反応混合物を酢酸エチ
ルと食塩水中に抽出した。次に酢酸エチル溶液を食塩水
で２回洗浄した後、それをＭｇＳＯ4で乾燥した。酢酸
エチル溶液をＮａＨＣＯ3溶液中に抽出し、飽和させ
た。次にその水性塩基を酢酸エチルで２回洗浄した。次
にその水溶液を固形のクエン酸でｐＨ５に酸性化した。
酸性化の結果、ミルク状の混合物になった。その混合物
を酢酸エチル中に抽出した後、その酢酸エチルを食塩水
で洗浄した。その酢酸エチル溶液をＭｇＳＯ4で乾燥し
た後、減圧下で濃縮した。ＣＨ2Ｃｌ2でトリチュレート
すると白／淡緑色の結晶が得られ、これを濾過によって
収集した。次にその結晶をＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、乾燥し
て４８８.５ｍｇの固体を得た。その濾液を減圧下で濃
縮することによって淡橙色のシロップ状物２７５.２ｍ
ｇを得た。化合物(４)の構造をＮＭＲで確認した。
【００６５】反応ＶＩ １０ｍｌ一口丸底フラスコ中で反応Ｖの生成物０.２７
５ｇを乾燥ジメチルホルムアミド２ｍｌに溶解した。こ
の溶液にＮ-ヒドロキシスクシンイミド(Aldrich)１４０
ｍｇを加え、その混合物を成分が溶解するまで撹拌し
た。次にジシクロヘキシルカルボジイミド(Aldrich)１
６３ｍｇを加えた。このジシクロヘキシルカルボジイミ
ドは約３０秒で溶解した。室温で約１０分間の後、反応
混合物が濁り始め、ジシクロヘキシル尿素が沈殿し始め
た。その反応混合物を室温で終夜撹拌した。１６時間
後、ジシクロヘキシル尿素を濾過によって除去した。つ
ぎにその溶液を酢酸エチルと食塩水中に抽出した。酢酸
エチル溶液を食塩水で２回洗浄した後、その酢酸エチル
溶液をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して
橙色のシロップ状物を得た。反応混合物を一部をＣＨ2
Ｃｌ2／メタノール＝９／１の溶媒系で薄層クロマトグ
ラフィーを用いるクロマトグラフィーに付した。生成物
のＲｆは０.８０であった。出発物質のＲｆは０.６５で
あった。上記の残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、予めＣＨ2
Ｃｌ2で平衡化しておいた２０×１５０ｃｍのシリカゲ
ル６０フラッシュカラムに充填した。このカラムをＣＨ
2Ｃｌ2１００ｍｌで洗浄し、そのカラムを２％メタノー
ル／ＣＨ2Ｃｌ2で溶出させた。生成物バンドがカラムの
下方に移動するのを肉眼で見ることができた。分画を集
め、生成物を含有する分画を一緒にし、減圧下で濃縮し
た。この反応をＨＰＬＣで純度について評価した。ＨＰ
ＬＣはアミン反応性生成物が存在することを示した。こ
の物質をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、ＣＨ2Ｃｌ2で平衡化した
シリカゲル６０カラムに充填した。このカラムを酢酸エ
チルとＣＨ2Ｃｌ2の勾配で溶出させた。生成物を含有す
る分画を一緒にし、減圧下で濃縮して純粋な化合物(５)
４５.３ｍｇを得た。
【００６６】実施例２：免疫複合体の組み立て 化学リンカーを介した薬物の抗体への結合は下記の反応
式に記載の３段階で進行する。
【化１９】
【００６７】ＣＣ４９モノクローナル抗体を透析し、
０.５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８.６)中に２０ｍｇ／ｍｌに
なるように濃縮した。この１６０ｍｇのＣＣ４９抗体か
ら反応容器に取り出した。ＢＡＭＭＥ-ＣＨ-ＤＭＢ-リ
ンカー(実施例１の化合物(５))４.５７ｍｇとジメチル
ホルムアミド０.６０ｍｌを加えた。その反応液を約１
時間撹拌した。次に、得られた官能化抗体(化合物(６))
を１.６×１２ｃｍのFastFlow Q-SepharoseTM(Pharmaci
a)カラムを用いるアニオン交換クロマトグラフィーによ
って精製した。このカラムを０.５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ
８.１)で洗浄し、０.５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ８.１)中に
形成させた塩化ナトリウムの勾配で溶出させた。官能化
した抗体を含有する分画を集め、ほぼ最初の出発反応体
積にまで濃縮した。カルボヒドラジドの溶液を０.１Ｍ
酢酸ナトリウム中に調製して最終濃度を１００ｍＭカル
ボヒドラジド(ｐＨ８.６)とした。このカルボヒドラジ
ド溶液を最終体積が最初の体積の約４倍になるまで官能
化抗体溶液に加えた。その反応液を３０分間穏やかに撹
拌した。次に、カルボヒドラジド溶液の添加によって脱
遮断され、化合物(７)になった官能化抗体を最初の反応
体積まで濃縮した。その官能化抗体を、０.１Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液(ｐＨ４.６)を用いるSephadex G25m Col
umnTMでのゲル濾過によって精製した。最初のピークを
集め、元の出発体積に濃縮した。次にジメチルホルムア
ミド中の１０ｍＭドクソルビシン溶液を加えた。その反
応混合物を室温で終夜穏やかに撹拌した。次にSephadex
G25m ColumnTMと生理学的緩衝液(ｐＨ７.４)を用いて
反応生成物(８)を精製した。最初のピークを集め、タン
パク質が１５〜２０ｍｇ／ｍｌになるように濃縮した。
収率は４５〜６０％のタンパク質回収率であった。抗体
と薬物のＵＶ吸光度の相違に基づいて１抗体分子あたり
のドクソルビシンの量を計算した。平均置換比(複合比)
は５.８であると決定された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｃ 281/08 7188−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/28 8318−4Ｈ (72)発明者 スティーブン・ライル・ブリッグズ アメリカ合衆国46168インディアナ州プレ インフィールド、アイアンウッド・ドライ ブ708番

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞または組織に関連す
    る抗原を認識する抗体またはその抗原結合性断片を表
    す。Ｒは反応に利用できるカルボニル官能性を有する薬
    物を表す。Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保
    護基を表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレン
    を表す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ(アルキル)−
    を表す。Ａは 【化２】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
    ンを表す)。ｎは１から１０までの整数を表す。］で示
    される免疫複合体。
  2. 【請求項２】 式： 【化３】 ［Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保護基を表
    す。Ｒ3'はカルボン酸活性化基、−ＯＨまたはその塩を
    表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレンを表
    す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ(Ｃ1〜Ｃ6アルキ
    ル)−を表す。Ｐはアミノ保護基を表す。Ａは 【化４】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
    ンを表す)。］で示される化合物。
  3. 【請求項３】 式： 【化５】 ［Ａｂは薬物の送達が望まれる細胞または組織に関連す
    る抗原を認識する抗体またはその抗原結合性断片を表
    す。Ｒ1はＣ1〜Ｃ4アルキルまたはカルボン酸保護基を
    表す。ＱはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレンを表
    す。Ｙは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｎ(アルキル)−を表
    す。Ｐはアミノ保護基を表す。Ａは 【化６】 を表す(ここにＺはＣ1〜Ｃ4アルキレンまたはアリーレ
    ンを表す)。ｎは１から１０までの整数を表す。］で示
    される化合物。
  4. 【請求項４】 請求項１の免疫複合体を活性成分とする
    医薬組成物。
JP6082952A 1993-04-28 1994-04-21 抗体−薬物複合体 Withdrawn JPH072895A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5470493A 1993-04-28 1993-04-28
US054704 1993-04-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH072895A true JPH072895A (ja) 1995-01-06

Family

ID=21992956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6082952A Withdrawn JPH072895A (ja) 1993-04-28 1994-04-21 抗体−薬物複合体

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0622084A1 (ja)
JP (1) JPH072895A (ja)
CA (1) CA2121990A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015507925A (ja) * 2012-02-10 2015-03-16 ユニバーシティー オブ メリーランド，ボルティモア 抗体及びそのＦｃフラグメントの酵素化学的糖鎖改変
WO2019103050A1 (ja) * 2017-11-21 2019-05-31 京都薬品工業株式会社 タンパク質結合性薬物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045745A2 (en) * 1999-12-21 2001-06-28 Acambis Research Limited A reversible linkage technology for controlled conjugation
CN111378006A (zh) * 2018-12-28 2020-07-07 联宁（苏州）生物制药有限公司 一种用于抗体偶联药物的新型双臂中间体lnd1026-035及其合成方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5162512A (en) * 1982-03-09 1992-11-10 Cytogen Corporation Amine derivatives of anthracycline antibodies
WO1988001513A1 (en) * 1986-08-28 1988-03-10 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
US5028697A (en) * 1988-08-08 1991-07-02 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
US5010176A (en) * 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015507925A (ja) * 2012-02-10 2015-03-16 ユニバーシティー オブ メリーランド，ボルティモア 抗体及びそのＦｃフラグメントの酵素化学的糖鎖改変
WO2019103050A1 (ja) * 2017-11-21 2019-05-31 京都薬品工業株式会社 タンパク質結合性薬物

Also Published As

Publication number Publication date
EP0622084A1 (en) 1994-11-02
CA2121990A1 (en) 1994-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5556623A (en) Antibody-drug conjugates
AU646121B2 (en) Acid-labile linker molecules
US4401592A (en) Pharmaceutical composition having antitumor activity
US5824805A (en) Branched hydrazone linkers
US5116944A (en) Conjugates having improved characteristics for in vivo administration
US5028697A (en) Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
AU617380B2 (en) Drug-monoclonal antibody conjugates
JPS62181280A (ja) トリコテセン結合体を含む抗腫瘍剤
US5514794A (en) Antibody-drug conjugates
US5024834A (en) Thioether linked immunotoxin conjugates
JPH02131499A (ja) 細胞毒性薬物コンジュゲートおよびその製法
HU205135B (en) Process for producing monoclonal antibody nucleoside conjugates
EP0398305B1 (en) Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production
US20190290775A1 (en) Use of Antibody Drug Conjugates Comprising Tubulin Disrupting Agents to Treat Solid Tumor
TW201905000A (zh) 含有抗globo h抗體之抗體－藥物共軛物及其用途
US5144012A (en) Cytotoxic drug conjugates
CA2209767A1 (en) Biotherapy of cancer by targeting tp-3/p80
JPH072895A (ja) 抗体−薬物複合体
WO1993025225A9 (en) Liposomal formulations for administering to cancer patients
Calvete et al. In vitro and in vivo antitumor activity of ZENECA ZD0490, a recombinant ricin A-chain immunotoxin for the treatment of colorectal cancer
Yamaguchi et al. Production, binding and cytotoxicity of human/mouse chimeric monoclonal antibody‐neocarzinostatin conjugate
EP3223853B1 (en) Materials and methods relating to linkers for use in protein drug conjugates
US20230364257A1 (en) Antibody conjugate and method for enhancing immune effect function of antibody molecule
Kondejewski et al. Synthesis and characterization of carbohydrate-linked murine monoclonal antibody K20-human serum albumin conjugates
EP0283329A1 (fr) Conjugués d'hydrazide d'alcaloide de vinca lie a une immunoglobuline

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Withdrawal of application because of no request for examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20010703