JPS62142124A - ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤に関する。

近年、免疫化学の発展にともない、多くの腫瘍関連抗原
が発見され、それに対して選択的に結合する腫瘍特異抗
体が開発されてきた。さらに、これらの腫瘍特異抗体に
抗腫瘍性物質を結合させ、腫瘍部位へのみ薬剤を集中移
行させようという試みがなされている。ここで腫瘍特異
抗体は、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原を家兎、馬、羊
等に免疫する手法を用いて作製し、動物血清から免疫グ
ロブリン画分を得て使用している。最近では、腫瘍細胞
あるいは腫瘍関連抗原をマウスに免疫した１９、抗体産
生細胞を取り出し、Ｎ５−１等のマウスミエローマ細胞
と細胞融合さゼることによりモノクローンの抗腫瘍抗体
細胞を１；１で、そこから抗腫瘍抗体を取り出している
。

これらの試みは、抗腫瘍抗体単独あるいはある種の細胞
１８性物質を抗腫瘍抗体に結合させた形で行なわれてい
るが、実用化には至っていない。その理由は、上記の抗
腫瘍抗体は、異種動物に免疫して作製している為に、人
に対しては異種蛋白となるからである。つまり異種動物
から１９られる抗体をヒトに投与した場合、２回目以後
の投与ではアナフィラキシ−等の血清病をさけることが
出来ない為に、１回しか使用出来ないからであり、これ
は最大の欠点であった。これを解決するには同種抗体を
用いることが必要であり、ヒトリンパ球を用いたモノク
ローナル抗体は理想であるが、まだ研究途上である。

そこで、これらの欠点を改善し、実用性に関する事項を
解決するには、同種抗体の中から腫瘍細胞に集まる抗体
を検索する必要があった。そこで、本発明者らは、鋭意
種々の抗体の　　Ｉ−標識物の生体内分布の検討を行な
った。その結果、一般自然抗体が腫瘍部位に到達し、し
かも長く残留することを見出した。それら免疫グロブリ
ンに抗腫瘍性物質を結合させて、これを担癌個体に投与
すれば薬剤は腫瘍部位に良く留り、抗腫瘍効果を示すこ
とを知って、本発明を完成した。ヒト免疫グロブリン結
合抗腫瘍剤は、巽種動物由来抗Ｍ！瘍抗体に比べて頻回
投与が可能になったという点又腫瘍部位に長くとどまる
点で最大の特色と利点を有している。したがって本発明
は、実用性の高いヒ１〜免疫グロブリン結合抗Ｉｌ！Ｉ
！瘍剤を８右する新しいタイプの薬剤を提供するらので
ある。本発明は、り［１ラムブヂル、メルフアラン、八
〇　Ｎ　Ｕ　、シクロホスファミドなどのアルキル化剤
、マイトマイシンＣ１塩酸ドギソルビシン、塩酸ダウノ
ルビシン、プレオマイシン、アクチノマイシンＤ１ネオ
カルチノスタヂンなどの抗生物質、シタラビン、８−ア
ザグアニン、５−フルオロウラシル、メソトレキセート
、アミノプテリンナトリウム、ロイケリンなどの代謝拮
抗剤からなる群に属する細胞毒性の高い抗腫瘍性物質を
、極めて穏和な条件下で、ヒト免疫グロブリンに結合さ
せた新規な化合物に基づく抗Ｉｌ！Ｆ瘍剤であり、抗腫
瘍効果にすぐれながら、細胞毒性は原料の１つである抗
腫瘍性物質に比べて格段に低い抗腫瘍剤を提供すること
を目的とする。以下に本発明を訂しく説明する。

近年、種々の抗腫瘍剤が広く使用されており、ある程度
の効果をあげている。これらの抗腫瘍剤・として、クロ
ラムブチル、メルフ１ラン、ＡＣＮＵ、シクロホスファ
ミド、シタラビン、８−アリ”グアニン、５−フルオロ
ウラシル、メソトレギセ−ト、アミノプテリンナトリウ
ム、マイトマイシンＣ１塩酸ドキソルビシン、プレオマ
イシン、ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、ザルコ
マイシンのごときものが使用されているが、これらの物
質は、それ自体何れも高い細胞毒性を有していて、投与
した後に、白血球減少、脱毛、冑賜障害簀の副作用を呈
することが知られており、その為に、これらの薬剤の使
用に限度があるのが実情である。

また従来から、ＩＦ４！瘍細胞あるいば腫瘍関連抗原に
対する抗体を製造または単離して、これをその腫瘍の治
療に用いる試みがなされているが、望ましい抗腫瘍効果
は得られていない。ざらに、最近、抗腫瘍抗体に抗腫瘍
性物質を化学的に結合させて得られる新規な物質による
抗腫瘍効果を期待することが１２案されているが、上記
物質を（ｑるための化学反応の条件が過酷すぎるために
、十分な成果ｔよ１９られていない。また、これらの実
験で用いられる抗体は、安種動物の抗体を使用していた
ために、血清病等の副作用をさけることは出来なかった
。

そこで本発明者らは、異種動物から得られる抗腫瘍抗体
をアフィニティークロマトで精製を行なうという方法を
発明した（特願昭５３−１（１１３８８、昭５４−１４
２１５２、昭５４−１４２１５３　）。この方法を用い
れば高度に抗体を精製することが可能であるが、頻回投
与を行なうという点で問題が残っている。

そこで各種の抗体を用いて腫瘍到）ヱ性を鋭意検討した
ところ、自然抗体が高濃度で、腫瘍部位に移行し、その
滞留時間も他の臓器よりも長いことが判明した。この事
実に基づいて、クロラムブチル、メルフ７ラン、ＡＣＮ
Ｕ、シクロホスファミド、シタラビン、８−アザグアニ
ン、５−フルオロウラシル、メソトレキセート、アミツ
ブゾリンナトリウム、マイトマイシンＣ１塩酸ドキソル
ビシン、プレオマイシン、ダウノルビシン、アクチノマ
イシンＤ、ザルコマイシンをヒト免疫グロブリンに結合
せしめたところ好ましい抗腫瘍効果が１９られることか
判明した。さらにこの組合せの中でもメルフアランとそ
のエステル類は合成的に容易に得られる抗腫瘍剤であり
、安定性も高いことから、ヒト免疫グロブリンとメルク
アラン及びそのエステルとの結合体が最も好ましい。自
然抗体はヒト免疫グロブリン（ＩＱ）及び低分子抗体（
Ｆ　（ａｂ’）　２　）を包含する。

ヒト免疫グロブリンと抗腫瘍性物質の結合は次の方法に
より製造される。

抗腫瘍性物質を水性溶媒に溶解せしめる。水性７Ｂ媒は
Ｍ性水溶液、アルカリ性水溶液、中性水溶液、リン酸緩
衝液、ボウ酸すトリウｌＸ等である。

これに結合剤、例えばカルボジイミド、デキス］へラン
、グルタルアルデヒド、ジエチルマロンイミデート、イ
ソシアナート、ポリグルタミン酸より選択されたものを
加え、更にヒト免疫グロブリン（Ｆ　（ａｂ’）　２も
会む）を加え反応させる。反応温度は一３０℃乃〒５０
℃、好ましくは０℃乃至３０℃であり、反応時間は１分
乃至４８時間、好ましくは１０分乃至２５時間である。

反応物を塩析、沈澱、再し一晶、溶出、カラム分別等の
手段により精製し、結合体を１ミ７る。

本発明のヒト免疫グロブリンと抗腫瘍性１！ｌｌＪ買ど
の結合体く以下、本物質と略称する）の吐乳動物にス・
？する急性毒性をマウスに４０００■／に９の投与ｒｉ
ｂで静脈注射して調べたが、１週間の観察では死亡が認
められなかった。

さらに、ヒト免疫グロブリンをペプシン（Ｎ　ｉ　５ｏ
ｎｏｆｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　１３２１７７０　（１９７
０）　）　、プラスミン（Ｓｏｏｕｒｉｓ　Ｖｏｘ　５
ａｎｑ　１８７１　（１９６７））　、＋Ｊ−モライシ
ン（特願昭５Ｏ−１９８７１）　、パパイン、トリプシ
ン、キモトリプシンで酵素水解して１９られる低分子抗
体についても、抗腫瘍剤を結合せしめて検討を行なった
。これらの物質例えばＦ（ａｂ’）２でも毒性は４００
０ｍ９／に９以上であった。

したがって、本物質は、毒性が極めて低く、頻回投与も
可能でざらに各種の人癌に対して有効である。例えば、
急性白血病、悪性リンパ種、癌腫、肉腫、悪性繊毛上皮
種、急性骨髄性白血病、メラノーマ、急性リンパ性白血
病、骨１ｌｉｆｉ癌等に有効である。本物質を抗腫瘍剤
として用いる場合の製剤化法、および投与の方法として
は、抗Ｉｆ！ｍ剤に関する公知の方法を適用し得る。投
与方法としては、経口、非経口たとえば注射または直腸
投与があげられる。投与形態としては、粉末、顆粒、錠
剤、カプセル、または注射剤、座薬のいずれであってら
よい。特に錠剤あるいは注射による投与が好ましい。注
射薬の製剤には、生理的食塩水、滅菌水、リンゲル液等
の水溶性溶剤、非水溶性溶剤、等張化剤、無痛化剤、安
定剤、防腐剤、懸濁化剤、緩衝剤、乳化剤等を任意に用
いうる。

その−例を示すと、本物質１ｇとマンニトール５ｇを蒸
溜水に溶解して５０ｍとして常法で除菌した後、それを
注射用小瓶に分けたり、又はそのまま凍結乾燥して注射
剤とする。そして水剤は、使用に際し、生理的食塩水で
希釈して注射液とする。

本物質は製剤化中一般に０．０１〜９０％、好ましくは
０．１〜６０％含有することが出来る。

本物質の投与量は主として症状に左右されるが成人１人
１日当り０．１〜１０ｇ、好ましくは１〜６りである。

本発明によると、ヒト免疫グロブリンおよび酵素処理と
１・免疫グロブリンの向腫瘍性ならびに、抗腫瘍性物質
の抗腫瘍性は失われることなく上記化合物に保たれてい
るので、本物質は、投与されると効率よく目的とする腫
瘍部位に到達し、長明間残ひし、抗腫瘍効果を発揮する
。

本発明は、必ずしも抗体を抗腫瘍抗体から選ばなくても
ずむために工業的には大変有利であると言える。

双手に、本発明を実施例によって更に詳細に説明する。

実施例　１ ヒ１へ免疫グロブリンの分布 実用性のある抗体はいかなる抗体であるかを検索する為
に、抗３−１８０つυギ免疫グロブリン、正常ＩＣＲマ
ウス免疫グロブリン、ヒト免疫グロプリンの生体内分布
を調べる為に各物質に　　１−標識を行なった。

寸なわら、Ｗ、　Ｉｔ、　１ｌｕｒｔｅｒらＢｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｊ、　８９１１４（１９Ｇ３）の方法に従って
免疫グロブリンのタンパク負部分に　　Ｉ−標識を行な
った。方法はいずれも同様であるので一例をあげる。マ
イ１ヘマイシンＣ結合抗Ｓ　−１８０抗体を５＃ｌ！Ｊ
／ａｅの濃度になる様に０．５Ｍのリン酸！ｌ衝液（ｐ
Ｈ７，４）に溶かした。その０．５７ｄをスビック管に
入れ、そこに０．２５　ｌ１ｌｃｉのＮａ　　　Ｉを加
える。さらに０．０５Ｍのリン酸緩衝液２００ｐに溶か
した０、７＃＋９のクロラミンＴを加えて０°Ｃで１５
分間反応させた。続いて０．０５Ｍのリン酸緩衝液に溶
かしたご０亜硫酸ナトリウム（１，７５η）とＫｌ（１
０■）を加えて反応を停止した。反応液を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−２５（φ２．２ｃｍｘ　４０ｃｍ　）カラム
を用いて、未反応の放射性ヨード及び試薬を除去した。

このようにして　　Ｉ−標識マイトマイシン結合抗３−
１８０ウサギ免疫グロブリンを１！７だ。

以下同様にして　　Ｉ−標識正常ＩＣＲマウス免疫グロ
ブリン、　　　Ｉ標点ヒト免疫グロブリンを得た。これ
らを用いて生体内分布の検討を行なった。

すなわち、Ｓ　−１８０担癌ｌＣＲマウス（移植機２週
間）を用いて、静脈内に投与し、２４時間後と１４４時
間後に動物を屠殺して、解剖し、血液Ｓ−１８０腫瘍部
位、肝臓、腎臓、牌臓、消化器等の各臓器を取り出して
ウェル型のγ−カウンターでカウントを行ない、投与薬
剤の各組織重量当りの到達薬剤量という形で分布を以下
のように表示したく表−１）。

さらに　１４４時間後における各ｒｉＩＸ器に残存する
量の合計に対する各臓器にお【ノる吊の率を残存率とし
て表わすと下記表−２のようになる。

これらの結果は腫瘍抗原を異種動物に免疫して１！′？
られる異種抗体が優れた到達率を示すことを表わしてい
る。しかし、同種の自然抗体も特異抗体に比べて腫瘍到
達率は１１５〜１／１０と落ちるが、他の臓器に比べる
と腫瘍部位での残存率が高いということがここにτり明
した。このことから自然抗体がキャリヤーとして実用性
の高い抗体であることを知るに至った。

実施例　２ ヒト免疫グロブリンの調製 ヒト正常人血清１０００−に対し１０００ｄの０．００
５Ｍリン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳと略）を加えて希
釈する。この希釈血清に２０００ｄの飽和硫安水溶液（
ｐｔ１７．２＞を撹拌しながら徐々に加える。４℃で６
０分放置すると塩析物が析出沈澱してくるので８００Ｏ
ｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない沈澱を集める。

この沈澱をＰＢＳに溶かし、全Ｇを１０００ｍとする。

これに対し撹拌しながら、徐々に飽和硫安の２５０ｄを
加え２０％飽和とする。溶液が白濁し、沈澱を生ずる場
合はフィブリノーゲンであるので遠心除去を行なう。こ
の上清に飽和硫安の２５０ａｉ！を加え３３％飽和どす
る。６０分間放置した後８０００　ｒｐｍで３０分間遠
心分離を行ない沈澱を集める。この沈澱を１０００−の
ＰＢＳに溶解した後５００−の飽和硫安を加える。６０
分撹拌後ａｏｏｏｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない沈
澱を集める。得られた沈澱を３００ｄのＰＢＳに溶かし
て、ＰＢＳに対して透析を行ない硫安を除いた。さらに
透析終了後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（直径５ｒＪ
ＲＸ　５０ｃｌｒ　）を用いて、０．００５ＨｐＨ８，
０です通りするフラクシヨンを集めた。す通りの両分を
蒸溜水に対して透析して脱塩の後、凍結乾燥してヒト免
疫グロブリン１２．５９を得た。

実施例　３ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとマイトマイシンＣ，塩
酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマイシ
ン、アクヂノマイシン、ザルコマイシンの各々とを反応
せしめて、ヒト免疫グロブリン結合抗生物質を合成した
。以下に合成例を述べる。

３−１　ヱイ」ニヱゴ」仁Ｚぷ」口ζ合１．０ＳＪのヒ
ト免疫グロブリンを１００Ｒ１の蒸溜水に溶解する。そ
こに　１１１．３＃ｌ／のマイトマイシンＣを溶解さ往
る。１．ＯＮの塩酸水溶液で【）ト１を５．５に調整し
つつ、４℃で２６２．６ｍｇの１−エチル−３−（３−
ジメヂルアミノブロビル）−カルボジイミド塩酸塩を加
えてＦ記の時間反応させ、酢酸−酢酸プ１〜リウム緩衝
液（ＩｌｌＩ　５．５）　　５ｍの添加で反応を停止さ
せた。次いで、反応液を限外ろ過器を用いて１０ｄに＆
Ｊ縮脱稿を行なった。１０ｄの濃縮液をセファデックス
Ｇ−２５（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径
５ＣＩＲ１高ざ９０　Ｃｙｔのカラムを通して、反応液
中の高分子吊物質及び低分子量物質を完全に分離した。

溶出液を超達心分離で４９．０００　ｒＪｘ　１３０分
遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品
たる本物質を得た。ヒト免疫グロブリンに対する各反応
時間におけるマイトマイシンＣの結合＾１を３６０　ｎ
ｍの紫外線吸収を用いて測定した結果は、表−３に示す
ごとくであった。

表　　−３ 上記の操作に準じてヒ１−免疫グロブリン１．０ｇと塩
酸ドキソルごシン、塩酸ダウノルビシン、プレオマイシ
ンおよびアクチノマイシンＤのそれぞれと反応せしめて
約ａ　ｏ　ｏ　ｍｙの本物質を１ｑた。塩酸ビー１−ソ
ルビシンのヒト免疫グロブリン（ｍｇ）当りの結合量は
反応時間６０分、２４時間で人々４．８７Ｊ。

９．５Ｎであった。

災ｆ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとクロラムブチル、メル
フ７ラン（フェニルアラニンマスタード）△ＣＮＵ、ウ
ラムスヂン、シクロホスファミド、メルフアランメチル
エステルの各々と反応せしめて、アミド結合によるそれ
ぞれの化合物を合成した。以下その合成例を述べる。

４−１メルフアランの結合 １、Ｊ／のヒト免疫グロブリンを１００−の蒸溜水に溶
解する。そこに１００■のメルフアランを懸濁させる。

１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５に調部しつつ、４
℃で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）−カルボジイミド塩酸塩を加えて２４時間反応させ、
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（Ｆｉｌｌ　５．５）　　
５ａｅの添加で反応を停止させた。次いで反応液を限外
ろ過器を用いて１０ｔｄに濃縮脱塩を行なった。１０＃
Ｉｉ！の濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア・ジャパン社）を充填した直径５ｃｍ　、高さ９０Ｃ
ＩＭのカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低分
子間物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０
，０００９　Ｘ　６０分遠心分離して得られた上清液を
０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。この物質中
のタンパク含ｈ１はアルブミンを５準とした銅−フォリ
ン法により、アルキル化活性はＥｐＳｔｅｉｎの方法（
Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｊ、Δｎａ１．　Ｃｈｃｍ。

２７１４２３　（１９５５））でそれぞれ測定した。こ
の結果ヒト免疫グロブリン１ｒＩｔｇに対してメルフ７
ランが６Ｉ１９結合していることがわかった。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．Ｏｑとクロ
ラムブチル、ＡＣＮ’Ｕ、ウラムスチンのそれぞれと反
応せしめて約９００　ｍｇの本物質を得た。

ヒト免疫グロブリン（＃１ｇ）当りのクロラムブチルの
結合量は反応時間６０分、２４時間で夫々５．１ｉ。

１１．７ｉ隻であった。

４−３メルフアランメチルエステルの結合１．０ｓ（７
）ヒｌ−免疫グ［１プリンを１００　ｔｎｆｔの蒸溜水
にＦＪＶＩする。そこに　１００　ｍｇのメルフアラン
メチルエステルｊｎ酸塩を溶解さける。１．ＯＮの塩酸
水溶液でｐｌ＋を５．５に調節しつつ、４°Ｃで１−エ
ヂルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミドＪ２１ｉ酸塩を加えて２４時間反応させ酢酸−酢
酸す１−リウム緩衝液（ρ１１５．５）　　５ｍの添加
で９反応を停０ニさせた。次いで反応液を限外濾過器を
用いて１０ｍ１に濃縮脱稿を行なった。１（７の濃縮液
をレフ７デツクスＧ−２５（ファルマシア・ジャパン社
）を充填した直径５ｃｍ、高さ９０ｃＩＲのカラムを通
して反応液中の高分子量物質及び低分子間物質を完全に
分離した。溶出液を超遠心分離で４０．０００びＸ６０
分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製
品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリン■あたりの結
合量は１０巧であった。

友工五−１ 正常人由来ヒト免疫グロブリンとシタラビン、８−アザ
グアニン、５−フルオロウラシル、メソトレキｌ？−１
〜およびアミノプテリンナトリウムの各々と反応せしめ
て、アミド結合によるそれぞれの化合物を合成した。以
下にその合成例を述べる。

５−１メソトレキセートの結合 １．０ｇのヒト免疫グロブリンを　１００ｄの蒸溜水に
溶解スる。そこに１５１．３ｍｇのメソトレキセートを
溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液でｐＨを５．５に調
節しつつ、４℃で１−エヂルー３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて下記の時
間反応させ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５
）　　５−の添加で反応を停止させた。

次いで反応液を限外濾過器を用いて１０αｇに濃縮し脱
塩を行なった。１０１１ｔｌの濃縮液をセファデックス
Ｇ−２５（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径
５α、高さ９０αのカラムを通して反応液中の高分子ｈ
１物質及び低分子量物質を完全に分離した。

溶出液を超遠心分離で４０．ＯＯＯｇｘ　６０分遠心分
離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化
合物を得た。ヒト免疫グロブリンに対するメソトレキセ
ートの結合量を３０５　ｎｍの吸収を用いて測定した結
果は■タンパク当り　８．３埒であった。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１．０ｇとシタ
ラビン、８−アザグアニン、５−フルオロウラシル、ア
ミノプテリンナトリウムのそれぞれと反応せしめて約９
１０＃＋９の結合化合物を得た。ヒト免疫グロブリンｍ
ｙ当りのシタラビン結合量は反応６０分、２４時間で夫
々４．７埒、８．３／Ｊ９であった。

実施例　６ ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２の調製ヒト免疫グロ
ブリンの１ｇを１００−の０．１Ｎ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ４，５）に溶解さゼる。酵素と蛋白質との比率
を１／１００　　（重量／重む１）としてペプシンを加
え、３７℃で１６時間消化を行なう。

その液に固体のトリス塩酸塩を加えてｐＨ８，０として
反応を停止させる。反応液を限外濾過器により濃縮して
１０ｄとする。直径５ｃｙｒで高さ９０　Ｃｍのカラム
にセファデックスＧ　−１５０を充填し、そこに濃縮液
の５１ｄをチャージし、ｌ）Ｈ７のＰＢＳで溶出する。

３つのピークに分離するが第１番目のピークをＦ（ａｂ
’）２として集める。この両分を透析チューブにつめて
脱塩し凍結乾燥を行ないヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ
’）　、、を得た。

ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２の５００１？Ｊを５
０ａｉ！の蒸溜水に溶解する。そこに５５．６＃？のマ
イトマイシンＣを溶解させる。１．ＯＮの塩酸水溶液で
ｐＨを５．５に調整しつつ４℃で１３１．３４の１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド塩酸塩を加えて下記の時間反応させ、酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）　５ｄの添加で反応を
停止させた。次いで反応液を限外濾過器を用いて５ｄに
し濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・ジ
ャパン社）を充填した直径５Ｃｍ、高さ９０　ｃｍのカ
ラムを通して反応液中の高分子ＩＩＩ物質及び低分子吊
物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０，０
ＯＯＸ　６０分遠心分離して得られた。上清液を０℃で
凍結乾燥して製品たる化合物を得た。

ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２に対する、各反応時
間におけるマイトマイシンの結合量を３６０　ｎｍの紫
外線吸収を用いて測定した結果は表−４に示すごとくで
あった。

表　　−４ 上記の操作に準じてヒト免疫グ［ｌプリンＦ（ａｂ’）
２５００ｍｇと塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシ
ン、プレオマイシンおよびアクヂノマイシンＤのそれぞ
れと反応せしめて、約８００■の結合化合物を得た。塩
酸ドキソルごシンのヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ“）
２ｒＩｒｇ当りの結合量は反応時間６０分、２４時間で
夫々８．５埒、１９．６ＩＪ！Ｉであった。

上記の操作和準じてヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’　
）　２　５００Ｒｇとクロラムブチル、メルフアラン、
ＡＣＮＵ、ウラムスチン、メルフアランメチルニスデル
、シクロホスファミドの各々と反応せしめて約４００１
１１！Ｊの結合化合物を得た。メルフ７ランのヒト免疫
グロブリンＦ　（ａｂ’＞　２ｒｆｒｇ当りの結合量は
反応時間９０分、２４時間で夫々８．１埒、１７．６埒
であった。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’＞
　２　５００Ｒｇとシタラビン、８−アサクアニン、５
−フルオロウラシル、メソ１−レキセード、アミノプテ
リンナトリウムのそれぞれと反応せしめて約４００　ｍ
ｇの結合化合物を得た。メソトレキセートのヒト免疫グ
ロブリンＦ　（ａｂ’）　２η当りの結合量は反応時間
６０分、２４時間で夫々７．５Ｎ、１７，３埒であった
。

実施例　８ ザルコーマ１８０固型腫瘍に対する抗腫瘍効ＩＣＲマウ
スを用いて継代培養したマウスデルコーマ１８０腫瘍細
胞を１０匹からなる群の各ＩＣＲマウス腋下部の皮下に
１×１０６個／匹移植し、移植の２４時間侵から各種抗
体、各市販抗腫瘍剤、ヒト免疫グロブリン、ヒト免疫グ
ロブリンＦ（ａｂ’）２および各種抗！！瘍性物質との
結合物のそれぞれの水溶液を１日置きに１回合計１０回
各マウスの腹腔内に注射し、最後の注射の５日後にマウ
スを殺して腫瘍を摘出して秤量し１０匹についての平均
値を求めた。この平均腫１ｇＪ重Ｍ（Ｔ）を、結合物本
溶液の代りに生理的食塩水を１０回投与した対照群マウ
ス１０匹の平均腫瘍型ｆｆｉ　（Ｃ）と比較することに
よって、本発明結合物の腫瘍増殖抑制率を（１−Ｔ／Ｃ
）　ｘｌｏｏ（χ）として表−５，６および７に示す。

表−５はマイトマイシンＣとで合成した結合物、表−６
はプレオマイシンとで合成した化合物、表−７は塩酸ド
キソルごシンとで合成した化合物による結果である。

表　　−５ 表　　−６ 表　　−７ 実施例　９ 古川肉腫に対する抗腫瘍効果 ｏｏｎｒｙｕラットを用いて継代培養した吉田肉腫腹水
ｉ胞を１０匹からなる群の各口ｏｎｒｙｕラットの腹腔
内に１×１０６ｇ／匹移植し、移植の２４時間後からヒ
ト免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２
と各種抗腫瘍剤、それぞれ単独およびヒト免疫グロブリ
ン、ヒト免疫グ［１プリンＦ（ａｂ’）２と各秤抗腫瘍
性物質との結合物のそれぞれの水溶液を１日置きに５回
、合計で５回、各々のラットの腹腔内に注射し、試料投
与群の平均生存日数（Ｔ）および対照群の平均生存日数
（Ｃ）を求め、延命率（Ｔ　／　Ｃｘ　１ｏｏ）を算出
した。結果を表−８乃至表−１０に示す。

表　　−８ 表　　−９ 表　　−１０ 実施例　１０ マウス白血病ｐ　−３８８に対する抗腫瘍効果ＤＢΔ／
２マウスを用いて継代培養したＰ−３８８腹水細胞を１
０匹からなる群の各ＤＢＡ／２マウスの腹腔内に１×１
０６個／匹移植し、移植の２４時間後から各種抗腫瘍剤
、それぞれ単独およびヒト免疫グロブリン、ヒト免疫グ
ロブリンＦ（ａｂ’）２と各種抗腫瘍性物質との結合物
のそれぞれの水溶液を１日１回５日間連続、合計で５回
各マウスの腹腔内に注射し、試料投与群の平均生存日数
（Ｔ）ｄ３よび対照群の平均生存日数（Ｃ）を求め、延
命率（Ｔ　／　Ｃｘ　１００）を筒用した。結果を表−
１１乃至表−１３に示す。

表　　−１１ 表　　−１２ 表　　−１３ 実施例　１１ ５０ｈ＋ｙのデキストランを５００ｄの蒸溜水に溶解さ
せ、ｐＨを１ＮのＮａＯＨを加えて１１とする。室温で
、２５（ｌｒＩｔｇ／　ｔｒｄｌに調整したＢｒＣＮの
アセトニトリル溶液を、すばやく撹拌しながら加える。

ＮａＯＨを加えてｐ＋＋を１０．８〜１１．０に調整す
る。

ＢｒＣＮを加え終った後１０分ｐＨを保っておく。そこ
に２，５−の水に溶解した１　００Ｒｇのへ４サメブレ
ンジアミンを加えてｐＨを１ＮのＨＣｌにて９．０にあ
わせる。５分間、撹拌した後、２５０■のメルフアラン
を加えて、ｐＨを６．５におとしｐＨを１５分間そのま
まに保つ。反応終了後４℃で反応液を１０Ｉｄ、に濃縮
する。１０ｄの濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファ
ルマシア・ジャパン社）を充填した直径５ｃｍ、高さ９
０　Ｃｒｎのカラムを通して反応液中の高分子吊物質及
び低分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離
で４０．ＯＯＯｇｘ　６０分、遠心分離して得られた上
清液を０℃で凍結して製品たる化合物を１５７だ。この
結合物はメルフアラン−デキストラン結合体で１分子の
デキストランあたり３０分子〜５０分子のメルフアラン
が結合していた。この結合体１１０ＯＲとヒト免疫グロ
ブリンｉ　ｏｏＩＩＦｇとをグルタルアルデヒドを用い
て結合体を作成した。同様にしてヒト免疫グロブリンＦ
（ａｂ’）２を用いて結合体を得た。

５００■のデストランを５００７の蒸溜水に溶解させ、
ｌ）Ｈを１ＮのＮａＯＨを加えて１１とする。室温で２
５０ＦＪ／ａｆの濃度に調整したＢｒＣＮのアセトニト
リル溶液をすばやく撹拌しながら加える。

ＮａＯＨを加えてｐＨを１０．８〜１１．０に調整する
。

ＩＪ　ｒ　ＣＮを加え終った後１０分間ＤＨを保ってお
く。

そこに２．５−の水に溶解した１１０ＯＲのへキサメチ
レンジアミンを加えてｐＨを１ＮのＨＣｌにて９．０に
あわせる。５分間撹拌した後、２５０ＩＩｔｇのマイト
マイシンＣを加えてＤＨを６．５におとし、ｐＨを１５
分間そのままに保つ。反応終了後、４℃で反応液を１０
ｒｄに濃縮する。１０ｍの濃縮液をセファデックスＧ−
２５（）？ルマシア・ジャパン社）を充填した直径５Ｃ
ＩＲ，高さ９０　Ｃｒｒｔのカラムを通して反応液中の
高分子は及び低分子量物質を完全に分離した。

溶出液を超遠心分離で４ｏ、ｏｏｏｇＸ　６０分遠心分
離して得られた上清液を０°Ｃで凍結乾燥して製品たる
化合物を冑た。この結合物はマイトマイシンＣ−デキス
トラン結合体で１分子のデキストランあたり３０分子〜
５０分子のマイトマイシンＣが結合していた。

この結合体１００ｍｇとヒト免疫グロブリン１００　ｍ
ｇをグルタルアルデヒド最終１００埒／ｄとなる濃度で
加えて室温で１時間反応を行ないヒト免疫グロブリン結
合デキストラン−マイトマイシンＣを１９だ。

５００ＩｙＪのデキストランを５００ｄの蒸溜水に溶解
させ、ｐＨを１ＮのＮａＯＨを加えて１１とする。

室温で２５０ＩＩｔｇ／ｄの濃度に調整したＢｒＣＮの
アセトニトリル溶液をすばやく撹拌しながら加える。

Ｎ　ａ　Ｏｌ−１を加えてＩ）Ｈを１０．８〜１１．０
ニ調整Ｔる。

ＢｒＣＮを加え終った後１０分間ｐｌ−１を保っておく
。

そこに２．５ｄの水に溶解した１００ｍｇのへキサメチ
レンジアミンを加えてｐＨを１ＮのＨＣρにて９０にあ
わせる。５分間撹拌した後、２５０勺のメソトレｒセー
ドを加えてｐＨを６．５におとしてＤＨを１５分間その
ままに保つ。反応終了後、４℃で反応液を１０威に濃縮
する。１０ｍの濃縮液をセファデックスＧ−２５（ファ
ルマシア・ジャパン社）を充填した直径５ｃｍ、高さ９
０　Ｃｒｎのカラムを通して反応液中の高分子量）及び
低分子吊物質を完全に分離した。

溶出液を超遠心分離で４０，０００ｇ　ｘ　６０分遠心
分離して１７られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品た
る化合物を１！７た。この結合物はメソトレキセートー
デキストラン結合体で１分子のデキストランあたり３０
分子〜５０分子のメソトレキセートが結合していた。

この結合体１１０ＯＲとヒト免疫グロブリン１１ａｂ’
）２１２０ｑをグルタルアルデヒド最終１００ＩＪ９／
ｄとなる潤度で加え結合体を作製した。

同様にしてヒト免疫グロブリンを用いて結合体を得た。

実施例　１２ マイトマイシンＣｔ１．３ＩｙＪを０．（ＩＩＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ６，８＞　　１ｍに溶解させ、ここに１
％のグルタルアルデヒド水溶液２０Ｉｊｉを加えて室温
で８時間撹拌する。そこに　１００　ｍｇのヒト免疫グ
ロブリンを２０ｔｄのリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶
解した液を加えてさらに２時間室温で反応させる。反応
終了後、セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ジャ
パン社）を充填した直径５ＣＩ１１．高さ９０　Ｃｒｎ
のカラムを通して反応液中の高分子量及び低分子１物質
を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で４０．０（１
０ｇｘ　６０分遠心分頌して得られた上清液を０℃で凍
結乾燥　　　　□して製品たる化合物を得た。ヒト免疫
グロブリンに対するマイトマイシンＣの結合量は蛋白■
あたり、９．６埒であ。た。

アドリアマイシン１９６ｆｆｉ９を０．ＯＩＭのリン酸
Ｍ衝液（ｐＨ６，８）に１戒に溶解させる。ここに１％
のグルタルアルデヒド水溶液２０ρを加えて室温で８時
間撹拌する。そこにｉ　ｏ　ｏ　ｍｇのヒト免疫グロブ
リンを２０ｄのリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶解した
液を加えて、さらに２時間室温で反応させる。反応終了
後、セファデックスＱ−２５（ファルマシア・ジャパン
社）を充填した直径５ＣｒＲ，高さ９０　Ｃ，のカラム
を通して反応液中の高分子値及び低分子吊物質を完全に
分離した。溶出液を超遠心分離で４０．０００３×６０
分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製
品たる化合物を１ｑた。ヒト免疫グロブリンに対するア
ドリアマイシンの結合量は蛋白ηあたり、５．６埒であ
った。

同様にしてヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２を用いて
結合体を得た。

メソトレキセート２００ｒｒｒｇを０．０１Ｍのリン酸
緩衝′Ｉｊ、（ｐＨ６，８）　　１＋１に溶解させる。

ここに１％のクルクルアルデヒド水溶液２０ＩＪｉを加
えて室温で８１′１間撹拌り−る。そこに１００　ｍｇ
のヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’）　２を２０戒のリ
ン酸緩衝液（１）１１６．８）　ニ溶解した液を加えて
、さらに２１１．ｆ間室温で反応させる。反応終了後、
セファデックスＧ−２５（ファルマシア・ジャパン社）
を充填した直径５ｃｍ、高さ９０　ＣＩＲのカラムを通
して、反応液中の高分子量及び低分子吊物質を完全に分
離した。溶出液を超遠心分離で４０．　ｏｏｏｇＸ　６
０分遠心分離して１ｑられた上清液を０°Ｃで凍結乾燥
して製品たる化合物を得た。

ヒト免疫グロブリンＦ　（ａｂ’＞　２に対するメソト
レキセートの結合量は蛋白ｍｙあたり、７．８Ｎであっ
た。

実施例　１３ マイトマイシンＣ１１，３ｍｇとと１〜免疫グロブリン
の１００ｍｇを０．２Ｍのホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，
３）の１０ｄに溶解さ。ぜる。そこに５ｍｇのジエヂル
マロンイミデートを加えて全編で０１１を８６に保った
まま、１時間撹拌させる。さらに２．５でのジエブルマ
ロンイミデートを添加して１時間撹拌を行なった。反応
終了後、中性にｐＨをもどした後、４５％の飽和硫安を
加えてヒト免疫グロブリン−マイトマイシンＣ結合体を
沈澱させた。７０００　ｒｐｍで１５分間遠心分離を行
ない沈澱を集めた。沈澱を５ｍＭのリン酸緩衝液５ｍに
溶解し、蒸溜水に対して透析を行ない硫安が検出されな
くなるまで（７２ｈｒ）透析した。透析終了後、セファ
デックスＧ−２５（ファルマシア・ジャパン社）を充填
した直径５Ｃｍ１高さ９０　ｒ：ｔｔｔのカラムを通し
て反応液中の低分子吊物質を完全にのぞいた。溶出液を
一２０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免
疫グロブリンｍｇ当りの結合重は６．３埒であった。

同様にしてヒト免疫グロブリンＦ（ａｂ’）２を用いて
結合体を得た。

上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン１００１１＋！
Ｊどメルフアラン、アミノプテリンナトリウムとの反応
を行ない８５ｍｇの結合化合物を得た。

実施例　１４ 実施ＶＡ１１、実施例１２、実施例１３で合成した化合
物について実施例８，９．１０の抗腫瘍試験を用いて効
果を調べた結果を表−１４乃至族−１６に示した。

表　　−１４ 表　　−１５

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）正常人由来の免疫グロブリンに代謝拮抗剤を結合
   した化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
2. （２）免疫グロブリンがＦ（ａｂ′）＿２であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍剤。
3. （３）代謝拮抗剤が、シタラビン、８−アザグアニン、
   ５−フルオロウラシル、メソトレキセート及びアミノブ
   テリンナトリウムから成る群から選択されることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の抗腫瘍
   剤。
4. （４）水溶性カルボジイミドを用いて結合されることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
   に記載の抗腫瘍剤。
5. （５）イソシアナート、ジエチルマロンイミデート、グ
   ルタルアルデヒド、ポリグルタミン酸又はデキストラン
   を用いて結合されることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項乃至第３項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
6. （６）経口投与形態にあることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
7. （７）経口投与形態が顆粒であることを特徴とする特許
   請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
8. （８）経口投与形態が錠剤であることを特徴とする特許
   請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
9. （９）経口投与形態がカプセルであることを特徴とする
   特許請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
10. （１０）非経口投与形態であることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の抗腫瘍剤
    。
11. （１１）非経口投与形態が座薬であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍剤。
12. （１２）非経口投与形態が注射剤であることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍剤。