JPH0611714B2

JPH0611714B2 - ヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤

Info

Publication number: JPH0611714B2
Application number: JP61265119A
Authority: JP
Inventors: 浩一新村; 雅彦藤井; 孝美藤井; 謙一松永; 義春小口; 親雄吉汲
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-04-08
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1994-02-16
Anticipated expiration: 2009-02-16
Also published as: JPS62142124A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤に関する。

近年、免疫化学の発展にともない、多くの腫瘍関連抗原
が発見され、それに対して選択的に結合する腫瘍特異抗
体が開発されてきた。さらに、これらの腫瘍特異抗体に
抗腫瘍性物質を結合させ、腫瘍部位へのみ薬剤を集中移
行させようという試みがなされている。ここで腫瘍特異
抗体は、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原を家兎、馬、羊
等に免疫する手法を用いて作製し、動物血清から免疫グ
ロブリン画分を得て使用している。最近では、腫瘍細胞
あるいは腫瘍関連抗原をマウスに免疫した後、抗体産生
細胞を取り出し、ＮＳ−１等のマウスミエローマ細胞と
細胞融合させることによりモノクローンの抗腫瘍抗体細
胞を得て、そこから抗腫瘍抵抗を取り出している。

これらの試みは、抗腫瘍抗体単独あるいはある種の細胞
毒性物質を抗腫瘍抗体に結合させて形で行なわれている
が、実用化には至っていない。その理由は、上記の抗腫
瘍抗体は、異種動物に免疫して作製している為に、人に
対しては異種蛋白となるからである。つまり異種動物か
ら得られる抗体をヒトに投与した場合、２回目以降の投
与ではアナフィラキシー等の血清病をさけることが出来
ない為に、１回しか使用出来ないからであり、これは最
大の欠点であった。これを解決するには同種抗体を用い
ることが必要であり、ヒトリンパ球を用いたモノクロー
ナル抗体は理想であるが、まだ研究途上である。

そこで、これらの欠点を改善し、実用性に関する事項を
解決するには、同種抗体の中から腫瘍細胞に集まる抗体
を検索する必要があった。そこで、本発明者らは、鋭意
種々の抗体の¹²⁵Ｉ−標識物の生体内分布の検討を行な
った。この結果、一般自然抗体が腫瘍部位に到達し、し
かも長く残留することを見出した。それら免疫グロブリ
ンに抗腫瘍性物質を結合させて、これを担癌個体に投与
すれば薬剤は腫瘍部位に長く留り、抗腫瘍効果を示すこ
とを知って、本発明を完成した。ヒト免疫グロブリン結
合抗腫瘍剤は、異種動物由来抗腫瘍抗体に比べて頻回投
与が可能になったという点又腫瘍部位に長くとどまる点
で最大の特色と利点を有している。したがって本発明
は、実用性の高いヒト免疫グロブリン結合抗腫瘍剤を含
有する新しいタイプの薬剤を提供するものである。本発
明は、クロラムブチル、メルファラン、ＡＣＮＵ、シク
ロホスファミドなどのアルキル化剤、マイトマイシン
Ｃ、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、ブレオ
マイシン、アクチノマイシンＤ、ネオカルチノスタチン
などの抗生物質、シタラビン、８−アザグアニン、５−
フルオロウラシル、メソトレキセート、アミノプテリン
ナトリウム、ロイケリンなどの代謝拮抗剤からなる群に
属する細胞毒性の高い抗腫瘍性物質を、極めて穏和な条
件下で、ヒト免疫グロブリンに結合させた新規な化合物
に基づく抗腫瘍剤であり、抗腫瘍効果にすぐれながら、
細胞毒性は原料の１つである抗腫瘍性物質に比べて格段
に低い抗腫瘍剤を提供することを目的とする。以下に本
発明を詳しく説明する。

近年、種々の抗腫瘍剤が広く使用されており、ある程度
の効果をあげている。これらの抗腫瘍剤として、クロラ
ムブチル、メルファラン、ＡＣＮＵ、シクロホスファミ
ド、シタラビン、８−アザグアニン、５−フルオロウラ
シル、メソトレキセート、アミノプテリンナトリウム、
マイトマイシンＣ、塩酸ドキソルビシン、ブレオマイシ
ン、ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、ザルコマイ
シンのごときものが使用されているが、これらの物質
は、それ自体何れも高い細胞毒性を有していて、投与し
た後に、白血球減少、脱毛、胃腸障害等の副作用を呈す
ることが知られており、その為に、これらの薬剤の使用
に限度があるのが実情である。

また従来から、腫瘍細胞あるいは腫瘍関連抗原に対する
抗体を製造または単離して、これをその腫瘍の治療に用
いる試みがなされているが、望ましい抗腫瘍効果は得ら
れていない。さらに、最近、抗腫瘍抗体に抗腫瘍性物質
を化学的に結合させて得られる新規な物質による抗腫瘍
効果を期待することが提案されているが、上記物質を得
るための化学反応の条件が過酷すぎるために、十分な成
果は得られていない。また、これらの実験で用いられる
抗体は、異種動物の抗体を使用していたために、血清病
等の副作用をさけることは出来なかった。

そこで本発明者らは、異種動物から得られる抗腫瘍抗体
をアフィニティークロマトで精製を行なうという方法を
発明した（特願昭53-161388、昭54-142152、昭54-14215
3）。この方法を用いれば高度に抗体を精製することが
可能であるが、頻回投与を行なうという点で問題が残っ
ている。

そこで各種の抗体を用いて腫瘍到達性を鋭意検討したと
ころ、自然抗体が高濃度で、腫瘍部位に移行し、その滞
留時間も他の臓器よりも長いことが判明した。この事実
に基づいて、クロラムブチル、メルファラン、ＡＣＮ
Ｕ、シクロホスファミド、シタラビン、８−アザグアニ
ン、５−フルオロウラシル、メソトレキセート、アミノ
プテリンナトリウム、マイトマイシンＣ、塩酸ドキソル
ビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、アクチノマ
イシンＤ、ザルコマイシンをヒト免疫グロブリンに結合
せしめたところ好ましい抗腫瘍効果が得られることが判
明した。さらにこの組合せの中でもメルファランとその
エステル類は合成的に容易に得られる抗腫瘍剤であり、
安定性も高いことから、ヒト免疫グロブリンとメルファ
ラン及びそのエステルとの結合体が最も好ましい。自然
抗体はヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）及び低分子抗体（Ｆ
(ab′）_２）を包含する。

ヒト免疫グロブリンと抗腫瘍性物質の結合は次の方法に
より製造される。

抗腫瘍性物質を水性溶媒に溶解せしめる。水性溶媒は酸
性水溶液、アルカリ性水溶液、中性水溶液、リン酸緩衝
液、ホウ酸ナトリウム等である。これに結合剤、例えば
カルボジイミド、デキストラン、グルタルアルデヒド、
ジエチルマロンイミデート、イソシアナート、ポリグル
タミン酸より選択されたものを加え、更にヒト免疫グロ
ブリン（Ｆ(ab′）_２も含む）を加え反応させる。反応
温度は−30℃乃至50℃、好ましくは０℃乃至30℃であ
り、反応時間は１分乃至48時間、好ましくは10分乃至25
時間である。反応物を塩析、沈澱、再結晶、溶出、カラ
ム分別等の手段により精製し、結合体を得る。

本発明のヒト免疫グロブリンと抗腫瘍性物質との結合体
（以下、本物質と略称する）の哺乳動物に対する急性毒
性をマウスに4000mg/kgの投与量で静脈注射して調べた
が、１週間の観察では死亡が認められなかった。

さらに、ヒト免疫グロブリンをペプシン(Nison off Sci
ence 132 1770(1970)）、プラスミン(Sgouris Vox Sang
18 71(1967))、サーモライシン（特願昭50-19871）、
パパイン、トリプシン、キモトリプシンで酵素水解して
得られる低分子抗体についても、抗腫瘍剤を結合せしめ
て検討を行なった。これらの物質例えば(F(ab′）_２で
も毒性は4000mg/kg以上であった。

したがって、本物質は、毒性が極めて低く、頻回投与も
可能でさらに各種の人癌に対して有効である。例えば、
急性白血病、悪性リンパ種、癌腫、肉腫、悪性繊毛上皮
腫、急性骨髄性白血病、メラノーマ、急性リンパ性白血
病、骨髄癌等に有効である。本物質を抗腫瘍剤として用
いる場合の製剤化法、および投与の方法としては、抗腫
瘍剤に関する公知の方法を適用し得る。投与方法として
は、経口、非経口たとえば注射または直腸投与があげら
れる。投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセ
ル、または注射剤、座薬のいずれであってもよい。特に
錠剤あるいは注射による投与が好ましい。注射薬の製剤
には、生理的食塩水、滅菌水、リンゲル液等の水溶性溶
剤、非水溶性溶剤、等張化剤、無痛化剤、安定剤、防腐
剤、懸濁化剤、緩衝剤、乳化剤等を任意に用いうる。

その一例を示すと、本物質１ｇとマンニトール５ｇを蒸
溜水に溶解して50mlとして常法で除菌した後、それを注
射用小瓶に分けたり、又はそのまま凍結乾燥して注射剤
とする。そして本剤は、使用に際し、生理的食塩水で希
釈して注射液とする。本物質は製剤化中一般に0.01〜90
％、好ましくは0.1〜60％含有することが出来る。

本物質の投与量は主として症状に左右されるが成人１人
１日当り0.1〜10ｇ、好ましくは１〜６ｇである。

本発明によると、ヒト免疫グロブリンおよび酵素処理ヒ
ト免疫グロブリンの向腫瘍性ならびに、抗腫瘍性物質の
抗腫瘍性は失われることなく上記化合物に保たれている
ので、本物質は、投与されると効率よく目的とする腫瘍
部位に到達し、長期間残存し、抗腫瘍効果を発揮する。

本発明は、必ずしも抗体を抗腫瘍抗体から選ばなくても
すむために工業的には大変有利であると言える。

以下に、本発明を実施例によって更に詳細に説明する。

実施例１ヒト免疫グロブリンの分布実用性のある抗体はいかなる抗体であるかを検索する為
に、抗Ｓ−180ウサギ免疫グロブリン、正常ＩＣＲマウ
ス免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリンの生体内分布を
調べる為に各物質に¹²⁵Ｉ−標識を行なった。

すなわち、W.H.HurterらBiochem.J.89 114(1963)の方法
に従って免疫グロブリンのタンパク質部分に¹²⁵Ｉ−標
識を行なった。方法はいずれも同様であるので一例をあ
げる。マイトマイシンＣ結合抗Ｓ−180抗体を５mg/mlの
濃度になる様に0.5Ｍのリン酸緩衝液(pH7.4)に溶かし
た。その0.5mlをスピック管に入れ、そこに0.25mciのＮ
ａ¹²⁵Ｉを加える。さらに0.05Ｍのリン酸緩衝液200μ
に溶かした。0.7mgのクロラミンＴを加えて０℃で15分
間反応させた。続いて0.05Ｍのリン酸緩衝液に溶かした
ピロ亜硫酸ナトリウム（1.75mg）とＫＩ（10mg）を加え
て反応を停止した。反応液をSephadex G-25（ 2.2cm
×40cm）カラムを用いて、未反応の放射性ヨード及び試
薬を除去した。このようにして¹²⁵Ｉ−標識マイトマイ
シン結合抗Ｓ−180ウサギ免疫グロブリンを得た。以下
同様にして¹²⁵Ｉ−標識正常ＩＣＲマウス免疫グロブリ
ン、¹²⁵Ｉ標識ヒト免疫グロブリンを得た。これらを用
いて生体内分布の検討を行なった。

すなわち、Ｓ−180担癌ＩＣＲマウス（移植後２週間）
を用いて、静脈内に投与し、24時間後と144時間後に動
物を屠殺して、解剖し、血液Ｓ−180腫瘍部位、肝臓、
腎臓、脾臓、消化器等の各臓器を取り出してウェル型の
γ−カウンターでカウントを行ない、投与薬剤の各組織
重量当りの到達薬剤量という形で分布を以下のように表
示した（表−１）。

さらに144時間後における各臓器に残存する量の合計に
対する各臓器における量の率を残存率として表わすと下
記表−２のようになる。

これらの結果は腫瘍抗原を異種動物に免疫して得られる
異種抗体が優れた到達率を示すことを表わしている。し
かし、同種の自然抗体も特異抗体に比べて腫瘍到達率は
1/5〜1/10と落ちるが、他の臓器に比べると腫瘍部位で
の残存率が高いということがここに判明した。このこと
から自然抗体がキャリヤーとして実用性の高い抗体であ
ることを知るに至った。

実施例２ヒト免疫グロブリンの調製ヒト正常人血清1000mlに対し1000mlの0.005Ｍリン酸緩
衝食塩水（以下、ＰＢＳと略）を加えて希釈する。この
希釈血清に2000mlの飽和硫安水溶液（pH7.2）を攪拌し
ながら徐々に加える。４℃で60分放置すると塩析物が析
出沈澱してくるので8000rpmで30分間遠心分離を行ない
沈澱を集める。この沈澱をＰＢＳに溶かし、全量を1000
mlとする。これに対し攪拌しながら、徐々に飽和硫安の
250mlを加え20％飽和とする。溶液が白濁し、沈澱を生
ずる場合はフィブリノーゲンであるので遠心除去を行な
う。この上清に飽和硫安の250mlを加え33％飽和とす
る。60分間放置した後8000rpmで30分間遠心分離を行な
い沈澱を集める。この沈澱を1000mlのＰＢＳに溶解した
後500mlの飽和硫安を加える。60分攪拌後8000rpmで30分
間遠心分離を行ない沈澱を集める。得られた沈澱を300m
lのＰＢＳに溶かして、ＰＢＳに対して透析を行ない硫
安を除いた。さらに透析終了後、ＤＥＡＥ−セルロース
カラム（直径５cm×50cm）を用いて、0.005M pH 8.0で
す通りするフラクションを集めた。す通りの画分を蒸溜
水に対して透析して脱塩の後、凍結乾燥してヒト免疫グ
ロブリン12.5ｇを得た。

実施例３正常人由来ヒト免疫グロブリンとマイトマイシンＣ、塩
酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、ブレオマイシ
ン、アクチノマイシン、ザルコマイシンの各々とを反応
せしめて、ヒト免疫グロブリン結合抗生物質を合成し
た。以下に合成例を述べる。

3-1マイトマイシンＣの結合 1.0ｇのヒト免疫グロブリンを100mlの蒸溜水に溶解す
る。そこに111.3mgのマイトマイシンＣを溶解させる。
1.0Ｎの塩酸水溶液でpHを5.5に調整しつつ、４℃で262.
6mgの１−エチル−３−(3−ジメチルアミノプロピル)-
カルボジイミド塩酸塩を加えて下記の時間反応させ、酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）５m1の添加で反応
を停止させた。次いで、反応液を限外ろ過器を用いて10
mlに濃縮脱塩を行なった。10mlの濃縮液をセファデック
スＧ-25（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径
５cm、高さ90cmのカラムを通して、反応液中の高分子量
物質及び低分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠
心分離で40,000ｇ×60分遠心分離して得られた上清液を
０℃で凍結乾燥して製品たる本物質を得た。ヒト免疫グ
ロブリンに対する各反応時間におけるマイトマイシンＣ
の結合量を360nmの紫外線吸収を用いて測定した結果
は、表−３に示すごとくであった。

3-2 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン1.0ｇと塩酸ド
キソルビシン、塩酸ダウノルビシン、ブレオマイシンお
よびアクチノマイシンＤのそれぞれと反応せしめて約80
0mgの本物質を得た。塩酸ドキソルビシンのヒト免疫グ
ロブリン（mg）当りの結合量は反応時間60分、24時間で
夫々4.8μｇ，9.5μｇであった。

実施例４正常人由来ヒト免疫グロブリンとクロラムブチル、メル
ファラン（フェニルアラニンマスタード）ＡＣＮＵ、ウ
ラムスチン、シクロホスファミド、メルファランメチル
エステルの各々と反応せしめて、アミド結合によるそれ
ぞれの化合物を合成した。以下その合成例を述べる。

4-1メルファランの結合 1.0ｇのヒト免疫グロブリンを100mlの蒸溜水に溶解す
る。そこに100mgのメルファランを懸濁させる。1.0Ｎの
塩酸水溶液でpHを5.5に調節しつつ、４℃で、１−エチ
ル−３−(3−ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド
塩酸塩を加えて24時間反応させ、酢酸−酢酸ナトリウム
緩衝液（pH5.5）５m1の添加で反応を停止させた。次い
で反応液を限外ろ過器を用いて10m1に濃縮脱塩を行なっ
た。10m1の濃縮液をセファデックスＧ-25（ファルマシ
ア・ジャパン社）を充填した直径５cm、高さ90cmのカラ
ムを通して反応液中の高分子量物質及び低分子量物質を
完全に分離した。溶出液を超遠心分離で40,000ｇ×60分
遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品
たる化合物を得た。この物質中のタンパク含量はアルブ
ミンを標準とした銅−フォリン法により、アルキル化活
性はEpsteinの方法（Epstein J.Anal.Chem.27 1423(195
5))でそれぞれ測定した。この結果ヒト免疫グロブリン
１mgに対してメルファランが６μｇ結合していることが
わかった。

4-2 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン1.0ｇとクロラ
ムブチル、ＡＣＮＵ、ラウムスチンのそれぞれと反応せ
しめて約900mgの本物質を得た。ヒト免疫グロブリン（m
g）当りのクロラムブチルの結合量は反応時間60分、24
時間で夫々5.1μｇ，11.7μｇであった。

4-3メルファランメチルエステルの結合 1.0ｇのヒト免疫グロブリンを100mlの蒸溜水に溶解す
る。そこに100mgのメルファランメチルエステル塩酸塩
を溶解させる。1.0Ｎの塩酸水溶液でpHを5.5に調節しつ
つ、４℃で１−エチル−３−(3−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて24時間反応させ酢
酸−酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）５m1の添加で反応
を停止させた。次いで反応液を限外過器を用いて10m1
に濃縮脱塩を行なった。10m1の濃縮液をセファデックス
Ｇ−25（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径５
cm、高さ90cmのカラムを通して反応液中の高分子量物質
及び低分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分
離で40,000ｇ×60分遠心分離して得られた上清液を０℃
で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブ
リンmgあたりの結合量は10μｇであった。

実施例５正常人由来ヒト免疫グロブリンとシタラビン、８−アザ
グアニン、５−フルオロウラシル、メソトレキセートお
よびアミノプテリンナトリウムの各々と反応せしめて、
アミド結合によるそれぞれの化合物を合成した。以下に
その合成例を述べる。

5-1メソトレキセートの結合 1.0ｇのヒト免疫グロブリンを100m1の蒸溜水に溶解す
る。そこに151.3mgのメソトレキセートを溶解させる。
1.0Ｎの塩酸水溶液でpHを5.5に調節しつつ、４℃で１−
エチル−３−(3−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド塩酸塩を加えて下記の時間反応させ、酢酸−酢酸
ナトリウム緩衝液（pH5.5）５m1の添加で反応を停止さ
せた。次いで反応液を限外過器を用いて10m1に濃縮し
脱塩を行なった。10m1の濃縮液をセファデックスＧ−25
（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径５cm、高
さ90cmのカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低
分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で4
0,000ｇ×60分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍
結乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリン
に対するメソトレキセートの結合量を305nmの吸収を用
いて測定した結果はmgタンパク当り8.3μｇであった。

5-2 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン1.0ｇとシタラ
ビン、８−アザグアニン、５−フルオロウラシル、アミ
ノプテリンナトリウムのそれぞれと反応せしめて約910m
gの結合化合物を得た。ヒト免疫グロブリンmg当りのシ
タラビン結合量は反応60分、24時間で夫々、4.7μｇ、
8.3μｇであった。

実施例６ヒト免疫グロブリンF(ab′）_２の調製ヒト免疫グロブリンの１ｇを100m1の0.1Ｎ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.5）に溶解させる。酵素と蛋白質との比
率を1/100（重量／重量）としてペプシンを加え、37℃
で16時間消化を行なう。その液に固体のトリス塩酸塩を
加えてpH8.0として反応を停止させる。反応液を限外
過器により濃縮して10m1とする。直径５cmで高さ90cmの
カラムにセファデックスＧ−150を充填し、そこに濃縮
液の５m1をチャージし、pH７のＰＢＳで溶出する。３つ
のピークに分離するが第１番目のピークをＦ(ab′）_２
として集める。この画分を透析チューブにつめて脱塩し
凍結乾燥を行ないヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２を得
た。

実施例７ヒト免疫グロブリンF(ab′）_２と抗腫瘍剤との結合 7-1 ヒト免疫グロブリンF(ab′）_２の500mgを50m1の蒸溜水
に溶解する。そこに55.6mgのマイトマイシンＣを溶解さ
せる。1.0Ｎの塩酸水溶液でpHを5.5に調整しつつ４℃で
131.3mgの１−エチル−３−(3−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド塩酸塩を加えて下記の時間反応さ
せ、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）５m1の添加
で反応を停止させた。次いで反応液を限外過器を用い
て５m1にし濃縮液をセファデックスG-25（ファルマシア
・ジャパン社）を充填した直径５cm、高さ90cmのカラム
を通して反応液中の高分子量物質及び低分子量物質を完
全に分離した。溶出液を超遠心分離で40,000×60分遠心
分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる
化合物を得た。ヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２に対す
る、各反応時間におけるマイトマイシンの結合量を360n
mの紫外線吸収を用いて測定した結果は表−４に示すご
とくであった。

7-2 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンF(ab′）_２500m
gと塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノルビシン、ブレオ
マイシンおよびアクチノマイシンＤのそれぞれと反応せ
しめて、約800mgの結合化合物を得た。塩酸ドキソルビ
シンのヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２mg当りの結合量
は反応時間60分、24時間で夫々8.5μｇ、19.6μｇであ
った。

7-3 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２500
mgとクロラムブチル、メルファラン、ＡＣＮＵ、ウラム
スチン、メルファランメチルエステル、シクロホスファ
ミドの各々と反応せしめて約400mgの結合化合物を得
た。メルファランのヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２mg
当りの結合量は反応時間90分、24時間で夫々8.1μｇ、1
7.6μｇであた。

7-4 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２500
mgとシタラビン、８−アザグアニン、５−フルオロウラ
シル、メソトレキセート、アミノプテリンナトリウムの
それぞれと反応せしめて約400mgの結合化合物を得た。
メソトレキセートのヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２mg
当りの結合量は反応時間60分、24時間で夫々7.5μｇ、1
7.3μｇであった。

実施例８ザルコーマ180固型腫瘍に対する抗腫瘍効果ＩＣＲマウスを用いて継代培養したマウスザルコーマ18
0腫瘍細胞を10匹からなる群の各ＩＣＲマウス腋下部の
皮下に１×１０^６個／匹移植し、移植の24時間後から各
種抗体、各市販抗腫瘍剤、ヒト免疫グロブリン、ヒト免
疫グロブリンＦ(ab′）_２および各種抗腫瘍性物質との
結合物のそれぞれの水溶液を１日置きに１回合計10回各
マウスの腹腔内に注射し、最後の注射の５日後にマウス
を殺して腫瘍を摘出して秤量し10匹についての平均値を
求めた。この平均腫瘍重量（Ｔ）を、結合物水溶液の代
りに生理的食塩水を10回投与した対照群マウス10匹の平
均腫瘍重量（Ｃ）と比較することによって、本発明結合
物の腫瘍増殖抑制率を（１−Ｔ／Ｃ）×100(%)として表
−５，６および７に示す。表−５はマイトマイシンＣと
で合成した結合物、表−６はブレオマイシンとで合成し
た化合物、表−７は塩酸ドキソルビシンとで合成した化
合物による結果である。

実施例９吉田肉腫に対する抗腫瘍効果 Donryuラットを用いて継代培養した吉田肉腫腹水細胞を
10匹からなる群の各Donryuラットの腹腔内に１×１０^６
個／匹移植し、移植の24時間後からヒト免疫グロブリ
ン、ヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２と各種抗腫瘍剤、
それぞれ単独およびヒト免疫グロブリン、ヒト免疫グロ
ブリンＦ(ab′）_２と各種抗腫瘍性物質との結合物のそ
れぞれの水溶液を１日置きに５回、合計で５回、各々の
ラットの腹腔内に注射し、試料投与群の平均生存日数
（Ｔ）および対照群の平均生存日数（Ｃ）を求め、延命
率（Ｔ／Ｃ×100)を算出した。結果を表−８乃至表−10
に示す。

実施例10 マウス白血病Ｐ−388に対する抗腫瘍効果ＤＢＡ/2マウスを用いて継代培養したＰ−388腹水細胞
を10匹からなる群の各ＤＢＡ/2マウスの腹腔内に１×１
０^６個／匹移植し、移植の24時間後から各種抗腫瘍剤、
それぞれ単独およびヒト免疫グロブリン、ヒト免疫グロ
ブリンＦ(ab′）_２と各種抗腫瘍性物質との結合物のそ
れぞれの水溶液を１日１回５日間連続、合計で５回各マ
ウスの腹腔内に注射し、試料投与群の平均生存日数
（Ｔ）および対照群の平均生存日数（Ｃ）を求め、延命
率（Ｔ／Ｃ×100)を算出した。結果を表−11乃至表−13
に示す。

実施例11 11-1 500mgのデキストランを500mlの蒸溜水に溶解させ、pHを
１ＮのＮａＯＨを加えて11とする。室温で、250mg/m1に
調整したＢｒＣＮのアセトニトリル溶液を、すばやく攪
拌しながら加える。

ＮａＯＨを加えてpHを10.8〜11.0に調整する。ＢｒＣＮ
を加え終った後10分pHを保っておく。そこに2.5m1の水
に溶解した100mgのヘキサメチレンジアミンを加えてpH
を１ＮのＨＣｌにて9.0にあわせる。５分間、攪拌した
後、250mgのメルファランを加えて、pHを6.5におとしpH
を15分間そのままに保つ。反応終了後４℃で反応液を10
m1に濃縮する。10m1の濃縮液をセファデックスＧ−25
（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径５cm、高
さ90cmのカラムを通して反応液中の高分子量物質及び低
分子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で4
0,000ｇ×60分、遠心分離して得られた上清液を０℃で
凍結して製品たる化合物を得た。この化合物はメルファ
ラン−デキストラン結合体で１分子のデキストランあた
り30分子〜50分子のメルファランが結合していた。この
結合体100mgとヒト免疫グロブリン100mgとをグルタルア
ルデヒドを用いて結合体を作成した。同様にしてヒト免
疫グロブリンＦ(ab′）_２を用いて結合体を得た。

11-2 500mgのデストランを500mlの蒸溜水に溶解させ、pHを１
ＮのＮａＯＨを加えて11とする。室温で250mg/m1の濃度
に調整したＢｒＣＮのアセトニトリル溶液をすばやく攪
拌しながら加える。ＮａＯＨを加えてpHを10.8〜11.0に
調整する。ＢｒＣＮを加え終った後10分間pHを保ってお
く。そこに2.5m1の水に溶解した100mgのヘキサメチレン
ジアミンを加えてpHを１ＮのＨＣｌにて9.0にあわせ
る。５分間攪拌した後、250mgのマイトマイシンＣを加
えpHを6.5におとし、pHを15分間そのままに保つ。反応
終了後、４℃で反応液を10m1に濃縮する。10m1の濃縮液
をセファデックスＧ−25（ファルマシア・ジャパン社）
を充填した直径５cm、高さ90cmのカラムを通して反応液
中の高分子量及び低分子量物質を完全に分離した。溶出
液を超遠心分離で40,000ｇ×60分遠心分離して得られた
上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得た。こ
の結合物はマイトマイシンＣ−デキストラン結合体で１
分子のデキストランあたり30分子〜50分子のマイトマイ
シンＣが結合していた。

この結合体100mgとヒト免疫グロブリン100mgとをグルタ
ルアルデヒド最終100μｇ／m1となる濃度を加えて室温
で１時間反応を行ないヒト免疫グロブリン結合デキスト
ラン−マイトマイシンＣを得た。

11-3 500mgのデキストランを500mlの蒸溜水に溶解させ、pHを
１ＮのＮａＯＨを加えて11とする。室温で250mg/m1の濃
度に調整したＢｒＣＮのアセトニトリル溶液をすばやく
攪拌しながら加える。ＮａＯＨを加えてpHを10.8〜11.0
に調整する。ＢｒＣＮを加え終った後10分間pHを保って
おく。そこに2.5m1の水に溶解した100mgのヘキサメチレ
ンジアミンを加えてpHを１ＮのＨＣｌにて9.0にあわせ
る。５分間攪拌した後、250mgのメソトレキセートを加
えてpHを6.5におとしてpHを15分間そのままに保つ。反
応終了後、４℃で反応液を10m1に濃縮する。10m1の濃縮
液をセファデックスＧ−25（ファルマシア・ジャパン
社）を充填した直径５cm、高さ90cmのカラムを通して反
応液中の高分子量及び低分子量物質を完全に分離した。
溶出液を超遠心分離で40,000ｇ×60分遠心分離して得ら
れた上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化合物を得
た。この結合物はメソトレキセート−デキストラン結合
体で１分子のデキストランあたり30分子〜50分子のメソ
トレキセートが結合していた。

この結合体100mgとヒト免疫グロブリンF(ab′）_２120mg
をグルタルアルデヒド最終100μｇ／m1となる濃度で加
え結合体を作製した。

同様にしてヒト免疫グロブリンを用いて結合体を得た。

実施例１２ 12-1 マイトマイシンＣ11.3mgを0.01Ｍのリン酸緩衝液（pH6.
8）１m1に溶解させ、ここに１％のグルタルアルデヒド
水溶液20μを加えて室温で８時間攪拌する。そこに10
0mgのヒト免疫グロブリンを20m1のリン酸緩衝液（pH6.
8）に溶解した液を加えてさらに２時間室温で反応させ
る。反応終了後、セファデックスＧ−25（ファルマシア
・ジャパン社）を充填した直径５cm、高さ90cmのカラム
を通して反応液中の高分子量及び低分子量物質を完全に
分離した。溶出液を超遠心分離で40,000ｇ×60分遠心分
離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品たる化
合物を得た。ヒト免疫グロブリンに対するマイトマイシ
ンＣの結合量は蛋白mgあたり、9.6μｇであった。

12-2 アドリアマイシン196mgを0.01Ｍのリン酸緩衝液（pH6.
8）に１m1に溶解させる。ここに1%のグルタルアルデヒ
ド水溶液20μを加えて室温で８時間攪拌する。そこに
100mgのヒト免疫グロブリンを20m1のリン酸緩衝液（pH
6.8）に溶解した液を加えて、さらに２時間室温で反応
させる。反応終了後、セファデックスＧ−25（ファルマ
シア・ジャパン社）を充填した直径５cm、高さ90cmのカ
ラムを通して反応液中の高分子量及び低分子量物質を完
全に分離した。溶出液を超遠心分離で40,000ｇ×60分遠
心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾燥して製品た
る化合物を得た。ヒト免疫グロブリンに対するアドリア
マイシンの結合量は蛋白mgあたり、5.6μｇであった。

同様にしてヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２を用いて結
合体を得た。

12-3 メソトレキセート200mgを0.01Ｍのリン酸緩衝液（pH6.
8）１m1に溶解させる。ここに1%のグルタルアルデヒド
水溶液20μを加えて室温で８時間攪拌する。そこに10
0mgのヒト免疫グロブリンＦ(ab′）_２を20m1のリン酸緩
衝液（pH6.8）に溶解した液を加えて、さらに２時間室
温で反応させる。反応終了後、セファデックスＧ−25
（ファルマシア・ジャパン社）を充填した直径５cm、高
さ90cmのカラムを通して、反応液中の高分子量及び低分
子量物質を完全に分離した。溶出液を超遠心分離で40,0
00ｇ×60分遠心分離して得られた上清液を０℃で凍結乾
燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリンＦ(a
b′）_２に対するメソトレキセートの結合量は蛋白mgあ
たり、7.8μｇであった。

実施例13 13-1 マイトナイシンＣ11.3mgとヒト免疫グロブリンの100mg
を0.2Ｍのホウ酸ナトリウム（pH9.3）の10mlに溶解させ
る。そこに５mgのジエチルマロンイミデートを加えて室
温でpHを8.6に保ったまま、１時間攪拌させる。さら
に、2.5mgのジエチルマロンイミデートを添加して１時
間攪拌を行なった。反応終了後、中性にpHをもどした
後、45％の飽和硫安を加えてヒト免疫グロブリン−マイ
トマイシンＣ結合体を沈澱させた。7000rpmで15分間遠
心分離を行ない沈澱を集めた。沈澱を5mＭのリン酸緩衝
液５m1に溶解し、蒸溜水に対して透析を行ない硫安が検
出されなくなるので（72 hr)透析した。透析終了後、セ
ファデックスＧ−25（ファルマシア・ジャパン社）を充
填した直径５cm、高さ90cmのカラムを通して反応液中の
低分子量物質を完全にのぞいた。溶出液を−20℃で凍結
乾燥して製品たる化合物を得た。ヒト免疫グロブリンmg
当りの結合量は6.3μｇであった。

13-2 上記の操作に準じてヒト免疫グロブリン100mgとメルフ
ァラン、アミノプテリンナトリウムとの反応を行ない85
mgの結合化合物を得た。

実施例14 実施例11、実施例12、実施例13で合成した化合物につい
て実施例8,9,10の抗腫瘍試験を用いて効果を調べた結果
を表ー14乃至−16に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者小口義春東京都練馬区練馬３−10−13 第一呉羽荘 22号 (72)発明者吉汲親雄東京都国立市東２−19−46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】正常人由来の免疫グロブリンに代謝拮抗剤
を結合した化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項２】免疫グロブリンがＦ(ab′）_２であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】代謝拮抗剤が、シタラビン、８−アザグア
ニン、５−フルオロウラシル、メソトレキセート及びア
ミノプテリンナトリウムから成る群から選択されること
を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
抗腫瘍剤。
【請求項４】水溶性カルボジイミドを用いて結合される
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のい
ずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】イソシアナート、ジエチルマロンイミデー
ト、グルタルアルデビド、ポリグルタミン酸又はデキス
トランを用いて結合されることを特徴とする特許請求の
範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】経口投与形態にあることを特徴とする特許
請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の抗腫瘍
剤。
【請求項７】経口投与形態が顆粒であることを特徴とす
る特許請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】経口投与形態が錠剤であることを特徴とす
る特許請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】経口投与形態がカプセルであることを特徴
とする特許請求の範囲第６項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】非経口投与形態であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の抗
腫瘍剤。
【請求項１１】非経口投与形態が座薬であることを特徴
とする特許請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】非経口投与形態が注射剤であることを特
徴とする特許請求の範囲第１０項に記載の抗腫瘍剤。