JPH0228200A - 電荷調整によるタンパク質の薬物動力学の変更 - Google Patents

電荷調整によるタンパク質の薬物動力学の変更

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JPH0228200A
JPH0228200A JP1036405A JP3640589A JPH0228200A JP H0228200 A JPH0228200 A JP H0228200A JP 1036405 A JP1036405 A JP 1036405A JP 3640589 A JP3640589 A JP 3640589A JP H0228200 A JPH0228200 A JP H0228200A
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アルトン　シー．モーガン，ジュニア
Gowsala P Sivam
ゴウサラ　ピー．シバン
Paul G Abrams
ポール　ジー．アブラムス
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Poniard Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体内投与に基づいてそれらの薬物動力学的
性質及び免疫原性に影響を及ぼす電荷調整によるタンパ
ク質及び接合体に関する。この電荷調整は、接合体又は
接合されたタンパク質のタンパク質成分、抗体成分又は
抗体フラグメント成分の等電点の変化により明白である
。
〔発明の背景〕
本発明の詳細な説明する前、この明細書を通して使用さ
れる用語を定義することが有用である。
捜企体：用語“接合体”は、標的成分、例えば生物学的
応答モディファイア−（ＢＲＭ）　（たとえば、リンフ
ォカイン、インターフェロン、エリトロポエチン及びコ
ロニー刺激因子）、ペプチドホルモン、抗体又は抗体フ
ラグメント、好ましくはモノクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体フラグメン、及びエフェクター成分、たと
えば放射性核種、毒素、薬物、繊維素溶解性酵素又はＢ
ＲＭ分子を含んで成るいづれかの組成物に適用される。
エフェクター成分は、直接的に又は結合グループ、リガ
ンド（たとえば二官能価キレート剤）又はキャリヤー分
子（たとえばアルブミン、デキストラン、ポリ−１−リ
シン）を通して標的成分に結合され得る。
坑淋１」野εＬ乙上： 抗体フラグメントは、Ｈ鎖及びＬ頭上の可変領域及び第
１不変領域に相当する抗体分子の特異的結合領域を含ん
で成る。抗体フラグメントの例として、Ｆ（ａｂ’　）
２　、　Ｆａｂ’及びＦａｂフラグメントを挙げること
ができる。抗体フラグメントはまた、可変領域（Ｆ　ｖ
）のみを含むこともできる。抗体フラグメントはまた、
抗体の不変領域が種々の種からの不変領域又は免疫グロ
ブリンにより置換されているキメラ分子を含むこともで
きる。
免麦凰立：免疫原性は、宿主に投与される場合、免疫応
答を誘発するための標的タンパク質又は治療成分（体液
性又は細胞性）の能力の測定である。
本発明は、接合体及びそれらの成分部分の免疫原性に関
する。
盗悠又２バ又１： この明細書において、標的タンパク質は、細胞標的又は
他の標的部位に結合することができるタンパク質、たと
えば抗体及びそのフラグメント；リンフォカイン、たと
えばｌ　Ｌ−２、２；　３　、４　。
５及び６；α、β及びＴインターフェロン；エリトロポ
エチン５コロニー刺激因子、たとえばＧ−Ｃ５Ｆ。
ＧＭ−Ｃ３Ｆ及び？ｌ−Ｃ３Ｆ　　、他の生物応答モデ
ィファイア−及びペプチドホルモン、たとえばメラニン
細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）　、卵胞刺激ホルモン（Ｆ
ＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及びヒト成長ホルモ
ン（ＨＧＩＩ）　　ｉ繊維素溶解性酵素及び血清タンパ
ク質（たとえば低密度リポタンパク質）として定義され
るが、但しこれだけには限定されない。
血」半波…： 血清半減期は、標的タンパク質又はその接合体の投与さ
れた量の半分が血清又は血漿中に残存する時点である。
一連の時点に関する血清の決定は、ある物質への全身体
暴露を決定するために有用である曲線を生成することが
できる。
組換えＤＮＡ及びモノクローナル抗体技法の出現は、医
薬的に適用されるタンパク質に新たな興味をなげかけて
来た。これらの技法は、まず、少しづつの変化を伴なっ
て、実質的に精製された均質タンパク質の大規模な生産
を可能にした。タンハク質分子、たとえばインターロイ
キン−２、組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒトイン
シュリン、心房天然ペプチド、インターフェロン、腫瘍
関連抗原及びエフェクター細胞サブセットに対するモノ
クローナル抗体及びフラグメント及びその接合体が、ア
メリカ合衆国の市場に受は入れられ、又は現在多方面に
わたる臨床試験を受けている。
特に、薬物、毒素、放射性核種及び生物学的応答モディ
ファイア−に接合されたモノクローナル抗体を用いての
癌療法への“′マジック弾丸”アプローチに相当の興味
が存在する。つい最近の努力は、正常な組繊をそのまま
にしながら、腫瘍細胞を選択的に目標決定することがで
きる接合体を産生ずるために、特異的抗体、たとえばモ
ノクローナル抗体に対する細胞毒性又は抗腫瘍性薬物の
接合に向けられて来た。
多くの数の異なったクラスの物質が考慮されて来た。こ
れらの物質として、β−及びα−放射性同位体、植物及
び細菌性毒素及び種々の抗腫瘍性薬物、たとえば介在性
物質、抗代謝物、アルキル化剤及び抗生物質を挙げるこ
とができる。正常な組織に向けられた毒性を低めるため
に標的分子、たとえば抗体に化学療法薬物を接合するこ
とが所望される。
放射性同位体、薬物及び毒素並びに生物応答モディファ
イア−の接合体は、癌及び自己免疫疾患の治療及び移植
による拒絶反応の撤廃に有用であるかも知れない。抗体
に接合されたそれぞれのクラスの物質は、癌及び他の疾
病の治療及び診断のために有用である特性を有する接合
体を提供するが、しかしそれぞれのタイプの物質はまた
替在的な欠点も有する。
たとえば放射性療法用接合体は、腫瘍に達する抗体の低
用量及び抗体の循環レベルから吸収される放射線用量に
対する骨髄の感度により制限される。毒素接合体は、し
ばしば有効な細胞毒性物質であるが、しかし肝臓による
急速な血清解除を受ける。これが不十分な腫瘍伝達をも
たらす。細胞毒性薬物により形成された接合体は、通常
、毒素接合体よりも低い有効性のものである。しかしな
がら、細胞毒性薬物接合体は、肝臓及び細網内皮系統（
ＲＥＳ）によりほとんど急速に摂取されず、そして改良
された１１１１伝達特性をもたらす。
同様に、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）及
びインターロイキン−２（ＩＬ−２）並びにいくつかの
インターフェロンのような分子は、特徴的な短い血清半
減期を有する。これは、標的組織のための低められた生
物利用性及び多くの場合、低められた毒性をもたらす。
すべての４種のタイプの接合体に影響を及ぼす共通の問
題は、腫瘍部位又は可能性あるエフェクター細胞上の受
容体に達する抗体又は標的タンパク質に結合される毒胞
毒性物質（放射性核種、毒素又は薬物）の有効投与量の
制限である。
腫瘍部位への循環接合体の生物利用性を高めることが接
合体による治療及び診断の目標である。
正常細胞への接合体の非特異的結合は、抗体の非特異的
相互作用又は抗体に接合される物質により発生すること
ができる。抗体酸物の非特異的結合は、ＲＥＳＭｉ織の
細胞により生ずることができる。
抗体のＦｃＳ、Ｗ域は、抗体に結合されるＦｃ及び補体
成分の両者のための受容体と相互作用することができる
。ＲＥＳ細胞と抗体との非特異的相互作用を減じるため
に開発されて来た１つの方法は、１９８５年８月２０日
に提出された同時継続出願であるアメリカ特許出願筒７
６７．４９３号に開示されているように、両親媒性分子
、たとえばアニオン性界面活性剤による接合体の処理に
よるものである。この特許出願の全開示は、引用により
本明細書に組み込まれる。
接合体の生物利用性を高めるためのもう１つの方法は、
１９８６年１０月９日に提出された同時継続出願である
アメリカ特許出願筒９１７．１７６号に開示される。こ
の特許出願の全開示は、引用により本明細書に組み込ま
れる。アメリカ特許出願筒９１７．１７６号に開示され
ているように、不適切な抗体又は接合体が予備注入され
、それによって医薬的に活性的な接合体の非特異的取り
込みの機構を破壊する。
Ｆｃ受容体と接合体との非特異的相互反応が最少にされ
得るもう１つの方法は、接合体の標的成分として抗体フ
ラグメントを創造するためにタンパク質分解性酵素によ
り抗体のＦｃ部分を除去することである。標的物質とし
ての抗体フラグメントの使用は、なお非特異的相互作用
及び正常な細胞への接合体の結合の問題を排除しない。
例として、放射性核種／抗体イメージングの感度を高め
るために、研究者は放射性ラベルされた抗体をリンパ内
に注入し、疾病を担持するリンパ節を検出した。動物モ
デルでの成功にもかかわらず、その方法は、疾病及び非
疾病リンパ節の両者における放射性ラベルの非特異的蓄
積のために人には使用されなかった。この非特異性を克
服するために、抗体フラグメントが産生され、そして悪
性黒色腫の検出のためのこのルートにより投与された。
不適切な及び適切なＦａｂ抗体フラグメントは、皮下又
はリンパ内投与の後、腫瘍関連リンパ節に高められた蓄
積を示し、そして非関連リンパ節にはほとんど摂取され
なかった。（Ｎｅｌｐなど、、“Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒ
ｙ　５ｔａｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ　Ｌｙｍｐｈ。
ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ　ｉｎ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ
　Ｍｅｌａｎｏｍａ、”Ｊ、Ｎａｃｌ。
助ルー化：３４〜４Ｌ　１９８７゜）従って、リンパル
ートにより投与される場合、抗体フラグメントでさえ非
特異的相互作用を受けることができる。
接合体による正常な細胞への非特異的結合は、その非特
異的結合の性質を理解することによってさらに減じられ
得る。たとえば、放射性ラベルされた抗体の非特異的結
合は、放射性核種／キレートシステムの使用により高め
られ、そしてここで前記キレートは十分に安定していす
、放射性ラベルの浸出を可能にしない。たとえば、ＤＴ
Ｐ＾、すなわち通常使用されるインジウム−１１１（Ｉ
ｎ４１１）のためのキレートは、Ｉｎ−１１１を十分に
結合せず、放射性接合体からの浸出を可能にする（たと
えば１０％／１日）。次に遊離Ｉｎ−１１１は、トラン
スフェリンに結合することができ、そして次にそのトラ
ンスフェリンはＲＥＳ組織における受容体に結合する。
放射性核種の使用は、より安定したキレートシステムの
使用及び接合体からの分解に基づいて急速に排出される
放射性核種の使用により改良され得る。
癌療法目的のために有用な接合体は、多数回の投与を必
要とするであろう。接合体の標的タンパク質はネズミ（
マウス）起源のモノクローナル抗体又はモノクローナル
抗体フラグメントであるので、宿主の免疫応答は抗体又
は抗体に接合された物質に対して発生せしめられるであ
ろう。いづれかの受容媒介機構を通して、正常な組織、
特にＲＥＳＭｉ織中への非特異的摂取は、免疫適格Ｔ−
細胞及びＢ−細胞への提示によるマクロファージにより
ペプチドへの接合体の異化作用をもたらすであろう。次
にこれらのペプチドは、Ｔ−細胞依存性又は非依存性機
構及び生成される抗体応答により認識される。肝臓蓄積
を高める、抗体への毒素又は薬物の接合体はまた、抗体
及び抗体に接合される物質の両者の免疫原性を高めるで
あろう。
接合体の成分への抗体の発生は、ある器官、特にＲＥＳ
組織への循環接合体の非特異的摂取をさらに導び（こと
ができる。従って、生分布、血清除去、正常な器官への
蓄積及び排出のすべては、接合体の免疫原性の程度及び
患者への複数回の投与を付与する能力に影響を与える。
接合体は、標的イメージング又は治療のために有用な唯
一のタンパク質ではない。リンフォカイン様Ｉ　Ｌ−２
；　ｃｘ　、　Ｂ及びγインターフェロン〔これらすべ
ては“生物学的応答モディファイヤー　（ＢＲＭｓ）　
”と呼ばれる〕　；及びＴＮＦＩＩＩ瘍壊死因子）；並
びにＴＰＡ　（組織プラスミノーゲン活性化因子）は、
血管内又は血管外受容体の標的を決定するために生体内
投与を必要とする共通の特徴を共有する。これらのタン
パク質は、細胞性受容体への結合又は排出／異化作用の
いづれかにより、循環から除去され得る。どんな方法が
循環から除去されるタンパク質の最大量を説明するかを
評価することは困難であるが、しかしながら、受容体結
合を減じるタンパク質の変性はまた、その効果又は機能
をも減する。従って、排出／代謝の修飾は、これらの物
質の血清半減期を高めるために最良の手段を示すことが
できる。
これは、ＴＰＡ、すなわち血液凝塊の溶解及びイメージ
ングのために有用な物質のために最近説明されている。
ＴＰＡの血清半減期は、グリコジル化部位を有する突然
変異タンパク質を組・換え方法により産生じ、そして次
に真核細胞中で前記突然変異体を産生ずることによって
高められた（Ｌａｕなど、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
　　　５　：　９５３．１９８７）。Ｌａｕなどは、高
められた血清半減期の他に、ＴＰＡの低い用量が、グリ
コジル化されていないＴＰＡと同じ生体内繊維素溶解性
活性を得るために必要とされることを示した。グリコジ
ル化は、代謝及び排出をもたらす多くのタンパク質と共
にこれまで示されて来た。
従って、生体内投与されるタンパク質の血清半減期を高
める能力は、そのようなタンパク質の効力及び治療指数
に対して実質的な影舌力を有することができる。従って
、これらのタンパク質分子の非特異的摂取及排出を減じ
る方法が必要とされ、それによってそれらの血清半減期
及び従って標的組織のための有効性を改良する。
〔発明の目的及び要約〕
本発明の一般的な目的は、従来技術における上記問題を
排除し又は実質的に緩和することである。
本発明のより特定の目的は、−射的に標的タンパク質及
び特に標的組織上の接合体の摂取を、接合体の非特異的
蓄積、代謝及び排出を減じることにより高めることであ
る。
本発明の目的は、接合体が、その接合体に対する宿主の
強い免疫応答を伴わないで患者に複数回にわたって投与
され得るように、接合体、特にネズミ由来のモノクロー
ナル抗体又はそのフラグメントから作られた接合体の免
疫原性を減じることである。
本発明の目的は、治療用接合体の半減期を高め、そして
それによって標的部位への蓄積を高めることである。逆
に言えば、種々の目的のためには、イメージングのため
の接合体の半減期が初期の時点で高い標的対バックグラ
ウンドの割合を達成するために、高められた腎臓クリア
ランスにより低められ得る。
さらに本発明の目的は、血清半減期及び従って、他の医
薬的活性タンパク質及びペプチド、たとえばインターフ
ェロン、インターロイキン、Ｍｉ織プラスミノーゲン活
性化因子及びホルモンの標的組織のための有効性を改良
することである。
本発明の上記目的は、適切な等電点及び実効電荷を有す
る、抗体及びそのフラグメント、生物学的応答モディフ
ァイア−１他の標的タンパク質及び接合体の変性及び／
又は選択により達成される。
天然の標的タンパク質分子が所望する等電点を有しない
場合、電荷調整が、抗体タンパク質分子上のリシンアミ
ノ基又はＴカルボキシレートの試薬、たとえば無水琥珀
酸、エチレンジアミンとの１−エチル−３−（シアメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を通
しての接合により行なわれ得る。
接合体上の標的タンパク質、たとえば抗体又は抗体フラ
グメント又は生物学的応答モディファイア−の電荷調整
の結果は、少なくとも１０％の最少率での血清半減期の
変化である。好ましくは、接合体の血清半減期は、およ
そ５０％の率で高められ又は低められる（等電点シフト
に依存して）。
同様に、タンパク質、たとえばリンフォカイン、ＴＰＡ
及びＴＮＦの標的を決める他の生物学的応答モディファ
イア−の電荷調整は、電荷調整されたタンパク質のため
に高められた血清半減期を生ぜしめることができ、そし
てそれらの標的受容体のために高い有効性をもたらすこ
とができる。
（発明の特定の記載〕 手短に言及すれば、本発明においては、タンパク質及び
その接合体の生体内薬物動力学及び免疫原性が調節され
る。
本発明のタンパク質は一般的に、標的タンパク質である
。用語“標的タンパク質”とは、生体内で所望する標的
部位に結合することができるタンパク質を言及する。標
的タンパク質は、標的細胞又は他の標的部位上の受容体
、基質、抗原決定基又は他の結合部位に結合することが
できる。標的タンパク質の例として、抗体及び抗体フラ
グメント；血清タンパク質；繊維素溶解性酵素；ペプチ
ドホルモン；及び生物学的応答モディファイア−を挙げ
ることができるが、但しこれだけには限定されない。適
切な生物学的応答モディファイア−の中には、リンフォ
カイン、たとえばインターロイキン（たとえば、ＩＬ〜
１　、　ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ５及びＩ
Ｌ−６）又はインターフェロン（たとえばα。
β及びＴインターフェロン）、エリトロポエチン及びコ
ロニー刺激因子（たとえばＧ−ＣＳＦ、　ＧＭ−ＣＳＦ
及びＭ−Ｃ５Ｆ）が存在する。ペプチドホルモンとして
、メラニン細胞刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体
形成ホルモン及びヒト成長ホルモンを挙げることができ
る。繊維素溶解酵素として、組織タイププラスミノーゲ
ン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼを
挙げることができる。
これらのタンパク質は、所望する生物学的特性（すなわ
ち、標的部位に結合する能力又は親の非変性細胞と同じ
エフェクター活性を有する能力）が保持されるかぎり、
そのタンパク質の変異体、相同体及びフラグメントを産
生するために変性され得る。それらのタンパク質は、種
々の遺伝子工学又はタンパク賞工学技法を用いることに
よって変性され得る。
免疫複合体及び接合体の腎臓クリアランス及び代謝並び
に肝臓クリアランス及び代謝は、免疫複合体又は接合体
の変化により影響される。プロテオグリカンのパッチか
ら成る腎糸球体基底膜上に負の電荷が存在する。これら
のプロテオグリカン分子は、抗体と複合体形成されるカ
チオン抗原分子と相互作用することができる。９００，
０００又はそれ以上のカチオン分子は、基底膜緻密層を
通過しないであろう。Ｍａｎｎｉｋなど、、　’Ｉｍｍ
ｕｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｗｉｔｈ　Ｃａｔｉｏｎｉ
ｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　ｉｎ　Ｇ
ｌｏｍｅｒｕｌｉＭｏｒｅ　Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　
ｔｈａｎ　Ｃａｔｉｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ八
１ｏｎｅ、’　ＪへＩｍｍｕｎ、　３８　：　４２０９
〜１７（１９８７）を参照のこと。糸球体へのタンパク
質の結合は、免疫複合体の等電点を高める（より塩基性
に）につれて高まる。Ｖｏｇｔなと、、“Ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣａｔｉｏｎｉｚｅｄＡｎｔｉｇｅ
ｎ　１ｖｉｔｈ　Ｒａｔ　Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　Ｂａ
ｓｅｍｅｎｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　：Ｉｎ　５ｉｔｕ　
Ｉｍｍｕｎｅ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、
”　ＫｌｄｎｅＩｎｔ。
２２　：　２７（１９８２）を参照のこと。糸球体基底
膜上に位置する負の電荷は、沈着が抗体との複合体化に
より高められるけれども、抗体と複合体化されるか又は
されな（とも抗体分子との電荷相互作用を替在的に受け
ることができる。
抗体フラグメントは、完全なフラグメントよりもより早
い速度で腎臓の濾過システムに入る傾向があるので、そ
れらは糸球体基底膜とのより容易な電荷相互作用を受け
ることができるであろう。
さらに、よりカチオン性抗体又はフラグメントは、より
アニオン性抗体又はフラグメントよりも糸球体基底膜に
より容易に沈着される。糸球体基底膜上のカチオン性抗
体分子の沈着に関連する急速な腎クリアランスの結果は
、急速な血清クリアランス及び低められた血清半減期を
もたらす。この関係は、当業界における従来技術の観点
から驚くべきである。腎臓において効果的に結合する分
子、たとえば接合体は、比較的低い親和性を有する腎臓
において結合する接合体よりもより早い速度で循環から
除去される。従って、接合体の血清半減期は、その接合
体がよりカチオン性であるように選択され又は変性され
る場合、低められ、そして接合体がよりアニオン性であ
るように選択され又は変性される場合、その半減期は高
められる。
同様に、電荷された分子を認識することができ、そして
肝臓の胆汁システムを通して結合又は排出をより急速に
もたらすことができる肝臓において他のクリアランス機
構が存在する。
本発明は、抗体及びそのフラグメントの電荷による血清
半減期及び排出の間の関係を示して来た。
はとんどの抗体及びそのフラグメントは、長い血清半減
期のためには不適切である中性又は塩基性ｐｉを有し、
そして従ってより適切な実効電荷を付与するために変性
を必要とする。例として、モノクローナル抗体及びモノ
クローナル抗体フラグメントは、抗体フラグメントへの
タンパク質分解酵素によるフラグメント化の後、特徴的
な等電点及び等電点の特徴的変化を有する。等電点の変
化例は、第１図に示される。
典型的には、フラグメントは、完全な抗体に比べて塩基
性である。特別な例外は、フラグメント化の後、酸性シ
フトを行なうＮＲ−ＧＥ−０１抗体であった。−船釣な
例外は、フラグメント化に基づいて酸性シフトを受ける
γ２ｂサブクラスの抗体である。サブクラスにもかかわ
らず、モノクローナル抗体フラグメントは、中性、塩基
性又は酸性として分類され得る。Ｎｌ２−ＣＥ−０１抗
体は、高い酸性フラグメントの第３カテゴリーを形成し
た。
従って、標的成分としての親の完全な抗体と比較して、
抗体フラグメントを用いる接合体は、診断イメージング
目的のために使用される場合、より腎臓への集中、より
短い血清半減期及び良好な組織／血液比率を示すであろ
う。第１図を参照のこと。抗体フラグメントは、腎臓の
糸球体基底膜における生体内アンニオ性部位に結合する
高められた能力及び結合しないで直接的に排出される能
力ヲ通してより早い血清クリアランスを有する。
第２図に示されるように、より酸性の等電点を有する抗
体フラグメントは、中性又は塩基性ｐｉを有するフラグ
メントよりもより遅い血清クリアランス速度（すなわち
高められた血清半減期）を有する。等電点に関して３種
のカテゴリーの抗体フラグメントが存在し、そしてクリ
アランス速度に関しては、３種のカテゴリーのフラグメ
ントが存在する。中性又は塩基性フラグメントは最っと
も早く、そして酸性フラグメントはより遅い。高い酸性
フラグメント様ＮＲ−ＣＥ−０１は、めったに遭遇され
ない。酸性等電点を有する抗体フラグメントは、治療用
途を有する接合体のための好ましい標的物質であり、こ
こで高い標的部位局在を可能にする延長された血清半減
期が好まれる。従って、本発明は、その等電点に基づか
れる接合体の好ましい標的成分及びその接合体の所望す
る血清半減期を決定する方法を提供する。
本発明の第２の観点として、標的タンパク質及び／又は
その接合体は、その接合体の意図された使用に依存して
、より適切な血清クリアランス速度を有するように電荷
調整され得る。等電点の塩基性又は酸性シフトを引き起
こす試薬を使用するかどうかは、接合体の適用に依存す
る。たとえば、診断イメージング目的のために使用され
る接合体は、高められた血清クリアランスのために及び
初期段階での亮い腫瘍対バックグラウンド比率のために
中性又は塩基性抗体を必要とする。これは、フラグメン
トの中性性質であることができ、又は電荷調整により付
与され得る。より塩基性のフラグメントが、それぞれ６
−及び１３−時間の半減期を有する、短い半減期の同位
体様Ｔｃ−９９ｍ　（テクネチウム）及びｌ−１２３（
ヨー素）のために好ましい。
より長い半減期の同位体様Ｃｕ−６７（２，４ｄ）、　
Ｇａ−６７（５，２ｄ）、　Ｇａ−６８（６８分）、　
Ｚｒ−８９（３，３ｄ）、　Ｉｎ−１１１（２，８ｄ）
、　ｌ−１３１（８，１ｄ）、　Ｒｕ−９７（２，９ｄ
）、　Ｐｂ−２０３（２，２ｄ）及びＳｎ−１７７ｍ（
１４ｄ）が、より酸性のフラグメントを利用することが
できる。
治療適用のためには、長い血清半減期が、標的部位への
高められた局在化を可能にするために及び接合体の投与
された量の有用な部分を増強するために所望される。放
射性治療薬又は毒素接合体のためには、特定の器官内へ
の接合体の集中を伴わないで、局在化された標的部位に
より多くの合計用量を投与することが所望される。これ
は、少なくとも１／１０のｐｌ＋単位単位上４も高くな
いｐＨ単位の酸性シフトによりより酸性の等電点を有す
るように抗体、抗体フラグメント及び／又は接合体の電
荷を調整することによって達成される。好ましくは、等
電点酸性シフトは、約ｉｐ！（単位である。
４．０又はそれ以下（より酸性）のｐｒで、実質的にす
べてのイオン化できる基がタンパク質においてプロトン
付加される。よりアニオン性接合体は腎臓にはほとんど
保持されず、そして肝臓胆汁にはほとんど排出されず、
そしてより長く循環にとどまり、高められた腫瘍伝達を
もたらす。これは、正の実効電荷から負の実効電荷に標
的タンパク質における少なくとも１つのリシン残基を電
荷調整することによって達成される。
標的タンパク質及び／又は接合体の電荷調整は、アニオ
ン形成又はカチオン形成試薬による処理により達成され
る。＆１１換えＤＮＡ技法がまた、天然の分子以外のタ
ンパク質（多かれ少なかれリジン及びグルタミン酸残基
を有する）を産生ずるためにも使用され得る。標的タン
パク質は、接合体の形成前又は後、又は同時に処理され
得る。
電荷調整試薬は一般的に、直接的又は間接的に（たとえ
ばカルボジイミドカップリング試薬を通して）所望する
アミノ酸と反応するであろう官能基、及び正又は負に荷
電されたイオン基を含んで成る。
本発明の１つの態様において、電荷調整剤は、次の式：
　Ｘ−Ｇ−Ｙのものであり、ここでＸは電荷調整される
べきタンパク質上のアミノ酸と反応する官能基、又はそ
のような官能基の前駆体を表わす。その反応性Ｘ基は、
電荷調整剤とタンパク質との反応の間、前駆体から生成
せしめられる。
Ｙは、電荷された基（たとえば無機イオン）又はその前
駆体である。Ｙが前駆体である場合、電荷された基は、
電荷調整剤とタンパク質との反応の間に生成せしめられ
る。Ｙが変性されたアミノ酸に負の実効電荷を付与する
場合、その電荷調整剤はアニオン形成剤である。Ｙが変
性されたアミノ酸に正の実効電荷を付与する場合、その
電荷調整剤はカチオン形成剤である。ＧはＸ及びＹ基の
間の任意のスペーサーを表わし、そして脂肪族、アルケ
ン又は芳香族有機基から選択され得る。Ｇが脂肪族基、
たとえばメチレン鎖である場合、そのＧ基は好ましくは
、６個以下の炭素原子を含有する。
電荷調整剤がアニオン形成剤である場合、Ｙ基は電荷調
整されるべきタンパク質のリシン残基上で第一アミンと
反応することができる。リシン残基と反応するであろう
Ｙ基の例として、活性エステル（カルホキシル及びイミ
ドエステルの両者）、ヌレイミド及び無水物を挙げるこ
とができる。好ましい活性エステルの中に、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミジル、チオフェニル、２　、３　、５
　、６−チトラフルオロフエニル及び２，３，５．６−
チトラフルオロチオフエニルエステルが存在する。
リジンとアニオン形成剤との反応の他に、標的タンパク
質のＰｌにおける酸性シフトが、アルギニン残基（たと
えばグリオキサル、フェニルグリオキサル又はシクロヘ
キソンエジオン）の誘導体化によりもたらされ得る。
Ｙ基として使用され得る多くの負に電荷された基の中に
、ホスフェート、ホスフォネート、スルフェート、ニト
レート、ボレート、シリケート、カーボネート及びカル
ボキシル基が存在する。アニオン形成剤とタンパク質と
の反応の間に生成せしめられ得るＹ基の例は、無水物か
ら生成せしめられるカルボキシル基である。
有用なアニオン形成剤として、次のものを含んで成る化
合物を挙げることができるが、但しこれだけには限定さ
れない：無水物及び／又は少なくとも１種のＣ００Ｈ基
、たとえば無水琥珀酸、他の環状酸無水物、無水フタル
酸、無水マレイン酸、カルボキシル基により置換された
Ｎ−エチルマレイミド、脂肪族無水′ＪｊｙＪ（たとえ
ば無水酢酸）、芳香族無水物、ｐＨ−可逆性無水物（た
とえば無水シトラコン酸及び無水ジメチルマレイン酸）
、α−ハロ酸、たとえばブロモアセテート及びヨードア
セテート、及び上記Ｙ基の１つにより置換された二酸又
は三酸。Ｙ基により置換された二酸の１つの例として次
の式： で表わされる化合物を挙げることができ、ここでＹ基は
Ｎ−スクシイミジルエステルである。他のアニオン形成
試薬は、トリー及びテトラカルボン酸無水物、たとえば
アコニット酸、ベンゼンテトラカルボン酸、ピリジンテ
トラカルボン酸、ナフタレンテトラカルボン酸及びノル
ボルネンジカルボン酸無水物である。
電荷調整剤の１つの群は、それらに結合された電荷され
た基を有する糖に由来する。それらに結合された無機イ
オンを有する塘分子（たとえばグリコース−６−ホスフ
ェート）は市販されている。
アミノ酸との反応のための適切な官能基（すなわち上記
Ｙ基）は、そのような化合物に結合され得る。他方、電
荷調整剤は、非酵素的なグリコジル化反応によりタンパ
ク質に結合され得る。そのような糖由来のアニオン形成
試薬を用いての電荷調整の例は、下記の例８に示される
。
有用なカチオン形成剤は、抗体のカルボキシル基とのＥ
ＤＣＩ反応を通してエチレンジアミンを含む。
他の有用なカチオン剤は、トリエチレンテトラアミン、
４−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ、Ｎジメチルアミ
ノエチルアミン及びジメチルアミノヘンズアルデヒドを
包含する。カチオン試薬は、負の電荷から＋２の実効電
荷を有する正の電荷に標的タンパク質のグルタミン酸又
はアスパラギン酸アミノ酸を変性するであろう。従って
、本発明は、電荷調整された標的タンパク質を包含し、
ここで少なくとも１つのグルタミン酸又はアスパラギン
酸アミノ酸残基が正の実効電荷に変性される。
等電点の塩基性シフトは、少なくとも１／１０のｐＨ単
位〜４ｐＨ単位である。好ましくは、その塩基性等電点
シフトは、約１ｐＨ単位である。
好ましくは、無水琥珀酸の使用は、タンパク質分子に負
の電荷を付与することができる。変性され得るそれぞれ
のリシン残基に関しては、２種の電荷の変化が存在する
。アニオン形成試薬上の電荷された基がホスフェート又
はスルフェートである場合、電荷で−３の変化が、変性
されるそれぞれのリシン残基のために行なわれる。従っ
て、抗体又は接合体の等電点の劇的なシフトは、単に最
少のリシン変性により達成され得る。
上記のように、標的タンパク質又はその接合体は、電荷
調整をもたらすために、アニオン−又はカチオン形成試
薬と反応せしめられ得る。ある治療用ポリペプチド、た
とえば毒素は、それらから調製される接合体の生分布を
逆に影響を及ぼす特性を有する。たとえばその毒素は正
常な細胞上の受容体に結合することができる。従って、
治療用ポリペプチド及び（又は代わりに）標的タンパク
質を別々に（接合体形成の前）又はアニオン形成剤によ
り全接合体を処理することによって、電荷調整すること
が好都合である。
ポリペプチド毒素の例として、ハロ毒素アブリン、リシ
ン、ジフテリア毒素、プソイドモナスの内毒素（ＰＥ）
及びそれらのフラグメントを挙げることができる。正常
な組織上でのこれらの毒素のだめの受容体は、それらか
ら調製された接合体の組織、たとえば肝臓中への取り込
みを引き起こす。その結果として、正常な細胞への所望
としない毒性の運搬及び所望する標的部位への接合体の
運搬の減少が生じる。
本発明の１つの態様は、前記アニオン形成剤の１つによ
るポリペプチド毒素の処理を含む。その得られるリジン
の変性（細胞結合領域におけるリジンの変性を含む）は
、非標的細胞への毒素の結合を残し、それによって毒素
又はその接合体の血清半減期を高める。従って、そのよ
うな電荷調整された毒素を含んで成るより高い割合の接
合体が、生体内で所望する標的部位に運搬され得る。Ｐ
Ｅはひじょうに不十分なリシンである。但し、ＰＥタン
パク質において３５個のリシン残基のうち１２個を含む
細胞結合ドメインを除く。従って、アニオン形成試薬は
、最初にＰＥタンパク質の細胞結合ドメインに結合し、
そして他のドメイン（毒素の酵素活性を担当するドメイ
ンを含む）は単に最小限度に変性される。その細胞結合
領域における変性されたリシン残基上のその得られた負
の電荷は、細胞表面上の毒素のための受容体と電荷調整
された毒素との間に電子反撥を引き起こすことができる
。
ポリペプチド毒素、たとえばＰＥにおける多数のリシン
残基をアニオン形成試薬により変性することが所望され
る。細胞毒性の緩和は、誘導体化の程度にひじょうに類
似するように思われる。約８個又はそれ以上のスクシニ
ル基（無水琥珀酸との反応の結果として）によるＰＥの
誘導体化が、生体外細胞毒性アッセイにより測定される
場合、結腸癌１１７−２９細胞へのその毒性を１対数又
はそれ以上減じることが見出された。杓１２個又はそれ
以上のスクシニル基による誘導体化は、２対数又はそれ
以上その毒性を減じる。従って細胞受容体への毒素の結
合は、多数のリシン残基の変性により減じられ得る。従
って、細胞上の毒素受容体を通して非標的細胞への毒素
−標的タンパク質接合体の所望としない結合がまた、減
じられ得る。
毒素の酵素活性（所望とする治療効果のために必要とさ
れる）は、アニオン形成試薬によるリシン残基の変性に
より減じられない。電荷調整されたＰＥを含んで成る免
疫接合体は、標的細胞を選択的に殺すことができる。従
って本発明は、非標的（たとば正常な）細胞に対するポ
リペプチド毒素又はその接合体の毒性を減じる方法を汲
供し、そして該方法は、それらから調製された毒素又は
接合体とアニオン形成試薬との反応を含んで成る。
プソイドモナス内毒素のためには、好ましくはアニオン
形成試薬がその毒素のリシン残基と反応する。
電荷調整されたＢＲＭ、接合体又は接合体中に形成され
た電荷調整された抗体又は抗体フラグメントがしばしば
静脈内投与される。抗体、抗体フラグメント及び／又は
接合体の電荷調整は、リンパ又は皮下ルート投与により
投与される場合、電荷調整された抗体又は抗体フラグメ
ントを有する接合体に高い選択性を付与するであろう。
リンパ管及びリンパ節内においては、リンパ液が、血管
内での血液よりも遅い速度で移動する。従って、静脈内
投与によりは生じない、接合体と正常なリンパ組織との
間の非特異的な相互作用は、接合体のリンパ内投与に基
づいて増強されるであろうと思われる。これは、リンパ
内投与を通してリンパ節に維持される接合体、抗体又は
抗体フラグメントの高い濃度による。
腫瘍細胞は一般的に、腫瘍細胞が正常な細胞よりもそれ
らの細胞表面上に高い程度のシアル化された糖タンパク
質及び糖脂質を有する事実により負の表面実効電荷を有
する。同様に正常な細胞は、それらは腫瘍細胞のように
密集した負の電荷を存しないけれども、それらの膜上に
負の電荷の群を有する。従って、接合体中に創造される
抗体又は抗体フラグメントに負の実効電荷を付与するこ
とは、抗原の非特異的手段を通して、負に電荷された細
胞表面と負に電荷された接合体との接触する傾向をさら
に減じるであろう。接合体中に導入される電荷調整され
た抗体フラグメントのリンパ内投与は、腫瘍関連リンパ
節において腫瘍と非腫瘍細胞の間に高い選択性をもたら
すであろう。
抗体、抗体フラグメント及び生物学的応答モディファイ
ア−（例を参照のこと）を含んで成る標的タンパク質か
ら創造された電荷調整された接合体の排除及び／又は代
謝の低下が存在する。標的タンパク質の表面上に負の電
荷のより均一的な分布を作り出すことによって、非特異
的部位の蓄積が減じられる。これは、免疫適格細胞を代
謝し、そしてそれにペプチドを付与するマクロファージ
の能力を直接的に減じる。さらに、より均一の電荷分布
を有するペプチドは、はとんど免疫原性でない反復配列
を有するポリマーに類似するＴ−細胞依存性機構により
ほとんど認識されない。従って、電荷の蓄積及びプロセ
ッシング、並びに均一性の欠失は、低下された免疫原性
を導びくであろう。　スクシニル化されたタンパク質に
対する抗体の反応性は、これまで評価されていて、そし
て無水琥珀酸により減じられることが見出された。
しかしながら、これは高いレベルの抗原のリシン変性（
５０％〜９０％）、及び電荷反発によるタンパク質の変
性を必要とする。好ましくは、本発明の方法の好ましい
割合での無水琥珀酸の使用が、電ＲＪｍ整されるおよそ
１０％又はそれ以下の利用可能なリシン残基をもたらす
、電荷調整されたタンパク質の免疫原生は、これまで決
定されていない。
キメラ抗体は、Ｍｉ換えＤＮＡ技法により創造される。
そのキメラ抗体は、ヒトＨ鎖及びＬ鎖の不変領域及び側
鎖のネズミ可変領域を含むことができる。キメラ抗体は
、滅しられた免疫原性を有することが予期されるが、し
かし高い割合の抗イデイオタイプ抗体応答を引き起こす
ことができる。
適切な等電点による抗体成分の選択又は調整は、同様に
抗−イディオタイプ形成の割合を減じることができる。
次の例は、本発明の方法及び新規接合体並びに抗体組成
物のいくつかの使用を例示する。この例は例示的であっ
て、限定するものではない。
氾 脣丁Ｊ　−シフト 無水琥珀酸を、４０■７２００ｍの濃度でＤＭＳＯ又は
他の有機溶媒に溶解する。次に、無水琥珀酸を、抗体溶
液に無水琥珀酸：タンパク質のモル比が１：５．１：１
０及び１：２５であるようにして添加する。
その反応を室温で１５分間行なう。反応が完結した後、
琥珀酸と限外濾過（たとえばＡｍ１ｃｏｎ又はＣｅｎｔ
ｒｉｃｏｎ）により又はＧ−２５カラムを通してのゲル
濾過により除去する。等電点シフトの程度を、等電点電
気泳動により決定する。
炎Ｉ 」］。　−声　　シフト ０．１２５モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐａｌ５．
０）によりタンパク質濃度を約３〜５■／ｄに調節する
ことによって、陽性電荷物を抗体、抗体フラグメント及
び／又は接合体に添加する。続いてＨＤＣＩを水に溶解
し、そして種々のモル比で、但し一般的には１：３００
〜１　：　１０，０００　（タンパク質：　ＥＤ（Ｊの
比）でタンパク質に添加する。その反応は、活性化され
たカルボキシレートを生成し、そしてそれを次に種々の
モル比のエチレンジアミンにより接合せしめる。そのモ
ル比は通常、１　：　Ｌ２００〜１　：　３０，０００
　（タンパク質：エチレンジアミンの比）である。その
エチレンジアミン溶？ｆ１．を、０．１２５モルのリン
酸塩緩衝液により約５．０のｐａｌに調整する。
その混合物を、室温で約１時間撹拌する。反応が完結し
た後、非反応物質を、Ｇ−２５カラムによるゲル濾過に
より又は限外濾過により除去する。等電点における特徴
的なシフトを、等電点電気泳動により決定する。
貫主 本発明の抗体及び抗体フラグメントはリシン変性を受け
るので、抗体の免疫反応性及びに対する生化学的変性の
効果が評価される必要がある。代表的な完全な抗体及び
抗体フラグメントを、放射性ラベルされた抗体として標
的腫瘍細胞に結合するそれらの能力について評価した。
ＮＲ−Ｃｏ　−０４は、ＩｇＧ、抗−結腸癌ネズミモノ
クローナル抗体である。
ＮＲ−Ｃｏ　−０４を、前記に示された比率で無水琥珀
酸と反応せしめた。第１表に示されるように、無水琥珀
酸による電荷調整の後、ＮＲ−ＣＤ−０４は、標的細胞
に結合する抗体分子の割合において有効な変化を示さな
かった。ＮＲ−Ｃｏ−０４モノクロ一ナル抗体を、１．
０〜２．５Ｘ１０’個の標的細胞の濃度での細胞と共に
放射性ラベルされた抗体を３７°Ｃで１時間インキュベ
ートすることによって評価した。
非結合抗体の分離を、油を通して遠心分離によりもたら
した。結合の測定を、放射性ラベルされた抗体の純度及
び非特異的結合のために調整した。
星−上一表 放射性ラベルされた結合により評価される場合のスクシ
ニル化された抗体の免疫反応性 な　　し　　　　　　５７　　　　０１　　　　　　　
　　　５７１：５　　　　　５５　　　　０３　　　　
　　　　５３１：１０　　　　６３　　　　１３　　　
　　　　　５１Ｓ＝特異的十非特異的に結合された計数
、Ｎ５＝１００倍の寒冷競争抗体の存在下での非特異的
に結合された計数。
同様に、ＮＲ−Ｍｌ−０５、すなわち抗−黒色腫抗体の
Ｆａｂフラグメンは、無水琥珀酸による電荷調整の後、
その免疫反応性の保持を示した。しかしながら、側坑体
形が調整されていない抗体に対する競争ＥＬｒＳＡによ
り評価される場合、スクシニル化された抗体又はフラグ
メントは、第２表に示されるように、より効果的な競争
体であった。第２表においては、スクシニル化された抗
体を、標的細胞への結合のために１趨〜１０硝／ｄの範
囲内で滴定した。ビオチニル化された完全な抗体、すな
わちＮＲ−ＭＬ　−０５又はＮＩ？　−ＣＯ−０４を添
加し、そして競争の程度を評価した。競争を、変性され
た抗体及び変性されていない抗体との間で比較した。
１−又一表 競争ＥＬＩＳＡにより評価される場合のスクシニル化さ
れた抗体の免疫反応性 ＡＢ　　　−ヱ一　−ｍ−整一　１且」ＸＬＮＲ−ＭＬ
−０５Ｆａｂ　　　　　　な　　し　　　　　　１００
ｓａｔ　　　　　１５７ １０：１　　　　１６１ ２５：１９４ Ｎｌ２−ＣＯ−０４１ｇＧ　　　　　　な　　し　　　
　　　　８０５：１　　　　２４５ １０：１　　　　２４３ ２５：１　　　　８４ 第１及び第２表からのデータは、特に上記に概略された
パラメーター内での無水琥珀酸処理は標的抗原に結合す
ることができる抗体分子の数を変えないが、しかし抗体
の競争能力を増強する（親和性の増強を示す）ことを示
唆する。
拠土 ＩｇＧｆｆクラスのネズミモノクローナル抗体は一般的
に、抗体依存性の細胞媒介細胞毒性の有力な媒介体であ
る。いくつかのネズミモノクローナル抗体は、ヒト補体
による殺害を媒介する。１ｇＧ３サブクラスのネズミモ
ノクローナル抗体は一般的に、十分に溶解せず、しばし
ば冷蔵条件下で沈殿する。
低レベルでの無水琥珀酸処理は、試験されるモノクロー
ナル抗体の抗原結合能力を変性しなかった。モノクロー
ナル抗体のエフェクター機能をまた、ネズミＩｇＧ３の
ために評価した。ＮＲ−ＣＯ−０４は結腸癌に向けられ
た。抗体エフェクター機能は、補体媒介細胞毒性（Ｃ’
ＭＣ）及び抗体依存性、細胞媒介細胞毒性ＣＡＤＣＣ）
を包含する。これらの評価の結果は第３表に示される。
第３表において、Ｃ’ＭＣ活性は、無水琥珀酸により変
性された抗体対変性されていない対照のために同一であ
る。最っとも高い比率（１：２５）でさえ、エフェクタ
ー機能ＡＤＣＣ又はＣ’　ＭＣに対して効果は存在しな
い。
筆−主一表 抗体エフェクター機能に対するスクシニル化の効果 １ｍ！ｌ　　　Ａ［狙旺−Ω隨ル な　　し　　　　　　　　　１９．１ ５　　：　　Ｉ　　　　　　　　　Ｎ、Ｄ。
１０：１　　　　　　　　１８．９ ２５：１　　　　　　　　１９．１ 対　照’　　　　　２０．４ 」こ」逆Ｌ」Ｊ（Ｌ ６７．９ ６１．０ ６９．５ ６９．２ ７４．１ ０　： ＋　： ＮＲ−Ｃｏ−０４ＭＡＢ対照が、スクシニル化された抗
体と同じ条件下で処理された（但し無水琥珀酸は排除さ
れた）。
５００ｎｇ／ウェルで標的細胞及びＮＲ−Ｃｏ−０４Ｍ
ＡＢと共に正常な供与体単核細胞のインキュベーション
（３７”Ｃで４時間）に基づく％５１Ｃｒ解放度。エフ
ェクター：標的の比−２５：１゜エフェクター及び標的
細胞のみによるバックグラウンド解放度が引き算された
。
＊：補体源として１：４０の希釈度のヒ）ＡＢ血清及び
標的細胞と共にＮＲ−ＣＯ−０４ＭＡＲ（５００■／ウ
エル）のインキュベーション（３７°Ｃで１時間）に基
づく％５１Ｃｒ解放度。
従って、例３及び４からのデータは、免疫反応性及びエ
フェクター機能の両者が、電荷調整された抗体のために
保持されているように思えることを示す。驚くべきこと
には、その得られた電荷調整された分子は、免疫反応性
、ＡＤＣＣ又はＣ’ＭＣの付随する低下を伴わないで改
良された溶解性を示した。
尉ｉ 完全なモノクローナル抗体ＮＲ−Ｃｏ　−０４の投与は
、２４時間の血清半減期を有する完全な抗体の典型的な
血清クリアランスを示す。第３図を参照のこと。１：５
又は１：１０の無水琥珀酸による抗体の変性の後、血清
半減期は、クリアランスのα及びβ相の両者でひじょう
に高められる。
類似する結果が、血清半減期の有効な延長を伴って、抗
−黒色腫９．２．２７モノクロ一ナル抗体のＦ（ａｂ’
　）２フラグメントの電荷調整により得られる。
Ｎｌ２−Ｍｌ−０５のＦａｂフラグメントを、ＩＱ：１
及び２５：１で無水琥珀酸処理にゆだねる。腫瘍部位中
に蓄積する、ｇ当りの抗体フラグメントの用量の％は、
２０時間の犠牲点で１０：１の無水琥珀酸により高めら
れる。第４図を参照のこと。このモノクローナル抗体フ
ラグメントと共に無水琥珀酸のより高い提供は、抗体フ
ラグメントの免疫反応性を調整し、そしてこれはそのフ
ラグメントの低い腫瘍蓄積をもたらす。
第４図はまた、腫瘍：血液の比率が、電荷調整された抗
体フラグメント及び調整されていない抗体フラグメント
のために２０時点でほぼ同一であることを示す。これは
、腫瘍中に蓄積される全用量が電荷調整された抗体フラ
グメントにより高くなることを意味する。類似する結果
が９．２．２７Ｆ（ａｂ’　Ｌモノクローナル抗体フラ
グメントにより得られる。
試験の２０時点よりも早い時点では、放射性ラベルされ
た抗体フラグメントの腎臓蓄積に注目される劇的な相違
が存在し、そして電荷調整された（５：１〜２５：１の
モル比を提供する）抗体フラグメントは、低い腎臓蓄積
を有する（第５図を参照のこと）。従って、これらのデ
ータは、完全なモノクローナル抗体又はモノクローナル
抗体フラグメントの電荷調整が減じられた腎臓蓄積及び
排出を通して血清半減期を高めることによって腫瘍の取
り込みを高めることができることを示唆する。
従って、電荷調整された抗体又は抗体フラグメントの変
更された排出速度がより高い腫瘍蓄積を担当する。しか
しながら、例３に例示されるように、スクシニル化の後
、親和性の上昇がまた、％用ｆｆｉ／ｇ腫瘍の上昇を担
当することができる。
−例」− の　　　　に　　るスクシニル　の 電荷調整された抗体の免疫原性に対する効果を、異種ネ
ズミ抗体（電荷調整されているか又は調整されていない
かのいづれか）によりテンジクネズミを免疫化すること
によって試験した。ＮＲ−Ｃ００４の電荷調整は、ネズ
ミ抗体に対して宿主のテンジクネズミにより産生される
低レベルの抗グロフリンをもたらした。この結果は、１
回の注射を用いての免疫化手段及び数回の注射を用いて
の手段により生成された。これらの結果は、免疫原性を
減じ、そして患者が電荷調整されたネズミ抗体、抗体フ
ラグメント又は他の標的タンパク質の数回の注射を受け
ることができる確立を改良することができることを示唆
する。
氾 一スクシニル 無水琥珀酸を、４０■／２００Δの濃度で無水ＤＭＳＯ
（又は他の無水有機溶媒）中に溶解する（最終体積２３
１ｍ　、　１．７３Ｍ）。２５ｍのアリコートを、研究
用溶液として無水ｌＳＯ中、２．５　ｍｌまで（１，７
３Ｘ１０−”Ｍ）希釈する。その研究用溶液を、急速に
撹拌しながら、炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（ｐ）１８．
５〜９．０）中、タンパク質ン容ン夜（３〜５■／ｄ）
に所望するモル比（たとえば１：５．ｌ：１０，１：２
５の抗体又は抗体フラグメント：無水琥珀酸）で添加し
た。その反応を室温で１５〜３０分間行なう。
琥珀酸（無水物の象、速な加水分解に起因する）を、限
外濾過（たとえば八ｍ１ｃｏｎ又はＣｅｎ　ｔｒ　１ｃ
ｏｎ）により又は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５を用いて
ゲル濾過により除去する。調整されたタンパク質及び調
整されていないタンパク質の両者のＤＩを、等電点電気
泳動により決定する。
開主 グルコース−６−ホスフェート　　いての　−血！ 標的タンパク質を、アニオン形成試薬としてグルコース
−６−ホスフェートを用いて電荷調整する。その試薬を
、次の反応スケム： により示される非酵素グリコジル化反応においてタンパ
ク質に結合せしめ、ここで標的タンパク質はパＰ“とじ
て示され、そしてグルコース−６ホスフエートはそのタ
ンパク質上の第１アミンと反応する。その反応は、可能
性ある副反応（示されていない）を得るよりかむしろ、
所望する生成物を得るようにその反応を向けるためにＮ
ａＢＨ３ＣＮの存在下で行なわれる。リシン残基上の＋
１電荷は一２電荷に変化する。
放射性核種、薬物及び毒素並びに標的タンパク質の多く
の接合体が、不十分な腫瘍運搬特性、たとえば短い血清
半減期を有することは前記例から明らかである。接合体
に負の電荷を付与するための電荷調整、又は適切な等電
点を有する天然のフラグメントの予備選択が、それらの
血清半減期及び１１！１ｉ１への生物利用性を高めるこ
とができ、そして従ってそれらの効力を改良することが
できる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、いくつかの抗体及び抗体フラグメントによる
等電点（ｐＩ）のシフトを示す。抗体及びそれらのフラ
グメントは、ｐＨ３〜１０の等電点電気泳動上でｐｌに
ついて評価された。図面中のＷ。 Ｆ′及びＦは次の通りである；Ｗ−完全なモノクローナ
ル抗体；　Ｆ　’　−Ｐ（ａｂ’　ｌｌｚ　；及びＦ＝
Ｆａｂ又はＦａｂ’。 第２図は、いくつかの抗体フラグメントの血清クリアラ
ンス速度を示す。種々のｐＨ値（第１図を参照のこと）
を有するある抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントが
放射性ラベルされ、そしてＢａｆｆ１ｂ／Ｃマウス中に
注身した。血液は、一定の時間で針により採血された。 図中の印は次の通りである；口はＮＲ−ＣＥ　−０１で
あり；◇はＮｌ？−ＬＵ−１０であり：＋はＮｌ？　−
ＭＬ　−０５であり；ΔはＤ３であり；×はＮＲ肚−０
１であり；そしてはＮＲ−ＭＬ　−０６である。 第３図は、スクシニル化された完全な抗体の血清クリア
ランスを示す。ＮＲ−Ｃｏ−０４モノクロ一ナル抗体が
放射性ラベルされ、そして第２図におけるようにして評
価された。図面中の印は次の通りであるコロは調整され
ていないＮＲ−Ｃｏ　−０４モノクロ一ナル抗体であり
；◇は５：１のモル比（無水琥珀酸：抗体）により調整
されたＮＲ−Ｃｏ　−０４であり；そして＋は１０：１
のモル比での電荷調整？ある。第３図に示されるように
、電荷調整は、完全なモノクローナル抗体の血清維持を
高める。 第４図は、スクシニル化されたモノクローナル抗体フラ
グメントの完全な動物性分布及び腫瘍局在プロフィール
である。ＮＲ−ＭＬ−０５Ｆａｂがスクシニル化され、
放射性ラベルされ、そして標的腫瘍を担持するヌードマ
ウスに注射された。種々の粗織及び腫瘍の計数が投与後
２０時間で取られた。 無水琥珀酸：抗体の３種のモル比が示された。 第５図は、スクシニル化された（３種のモル比で）モノ
クローナル抗体の完全な動物性分布及び腫瘍局在プロフ
ィールである。方法は、第４図におけるのと同じであっ
た。但し、すべての放射性ラベルが腎臓から排出される
前、マウスは投与後６時間で殺された。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、治療投与のための接合体であって： 治療成分；及び 前記治療成分に結合され、そして少なくとも約１０％、
    電荷調整されていない接合体の血清半減期よりもその半
    減期を高めるために電荷調整された標的タンパク質を含
    んで成る接合体。 ２、前記治療成分を、リガンド内にキレートされた放射
    性核種、毒素、生物学的応答モディファイアー及び細胞
    毒性薬物から成る群から選択する請求項１記載の接合体
    。 ３、前記標的タンパク質の電荷調整が標的タンパク質の
    等電点の酸性シフトをもたらす請求項１記載の接合体。 ４、前記電荷調整を、標的タンパク質とアニオン形成試
    薬とを反応せしめることによって提供する請求項３記載
    の接合体。 ５、少なくとも約１０％、電荷調整されていない標的タ
    ンパク質の血清半減期よりもその半減期を高めるために
    電荷調整されている標的タンパク質を含んで成る接合体
    であって、それによって前記接合体は、電荷調整されて
    いない標的タンパク質を含むその対応する接合体よりも
    低い免疫原性であることを特徴とする接合体。 ６、診断イメージング投与のための接合体であって： 放射性核種イメージング剤；及び 前記放射性核種イメージング剤に結合され、そして少な
    くとも約１０％、電荷調整されていない接合体の血清半
    減期以下にその半減期を低めるために電荷調整された標
    的タンパク質を含んで成り、それによって前記接合体が
    急速な血清クリアランス及び高い標的部位対バックグラ
    ウンド比率を促進せしめることを特徴とする接合体。 ７、前記放射性核種イメージング剤を二官能価リガンド
    内にキレートする請求項６記載の接合体。 ８、前記標的タンパク質を、陽性に電荷されたアミノ酸
    上に標的タンパク質上のカルボキシル基を転換すること
    によって電荷調整する請求項６記載の接合体。 ９、前記標的タンパク質が、モノクローナル抗体又はそ
    のフラグメントである請求項１、５又は６のいづれか１
    項記載の接合体。 １０、前記標的タンパク質を、抗体、抗体フラグメント
    、リンフォカイン、インターフェロン、コロニー刺激因
    子、エリトロポエチン、ペプチドホルモン、血清タンパ
    ク質及び繊維素溶解性酵素から成る群から選択する請求
    項１、５又は６のいづれか１項記載の接合体。 １１、電荷調整された標的タンパク質であって；前記標
    的タンパク質の血清半減期を、電荷調整されていない標
    的タンパク質の血清半減期よりも少なくとも約１０％、
    酸性電荷調整により高め又は少なくとも約１０％、塩基
    性電荷調整により低めることを特徴とする標的タンパク
    質。 １２、前記標的タンパク質を、抗体、血清タンパク質、
    繊維素溶解性酵素、ペプチドホルモン、生物学的応答モ
    ディファイアー及びそのフラグメントから成る群から選
    択する請求項１１記載の標的タンパク質。 １３、前記標的タンパク質がモノクローナル抗体である
    請求項１１記載の標的タンパク質。 １４、少なくとも１つのリシンアミノ酸が電荷調整され
    又は少なくとも１つのグルタミン酸又はアスパラギン酸
    基が電荷調整されている電荷調整された標的タンパク質
    であって、前記標的タンパク質も、インターフェロン、
    コロニー刺激因子、エリトロポエチン、他の生物学的応
    答モディファイアー、ペプチドホルモン、組織プラスミ
    ノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ストレプトキナーゼ、
    ウロキナーゼ、他の繊維素溶解性酵素、血清タンパク質
    、抗体及びそのフラグメントから成る群から選択するこ
    とを特徴とする標的タンパク質。１５、増強された生体
    内標的部位特異性を有する接合体を調製するための方法
    であって：標的タンパク質の等電点のｐＨ単位の少なく
    とも１／１０の酸性シフトをもたらすために、タンパク
    質とアニオン形成試薬とを反応せしめることによって標
    的タンパク質を電荷調整し；そして 生体内治療投与のために電荷された接合体を形成するた
    めに、薬物、毒素、生物学的応答モディファイアー又は
    放射性核種に前記電荷調整された標的タンパク質を接合
    する（ここで前記電荷調整された接合体は、電荷調整な
    しに標的タンパク質により製造された接合体と比べてよ
    り長い血清半減期を有する）ことを含んで成る方法。 １６、前記アニオン形成試薬を、無水琥珀酸、無水環状
    酸、無水フタル酸、無水マレイン酸、αハロ酸、ブロモ
    アセテート及びヨードアセテートから成る群から選択す
    る請求項１５記載の方法。 １７、前記電荷調整された標的タンパク質を、薬物、毒
    素、生物学的応答モディファイアー又は放射性核種に結
    合基を通して接合せしめる請求項１５記載の方法。 １８、診断イメージング目的のために標的部位対放射性
    核種のバックグラウンド放射能の比を高めるための方法
    であって： 標的タンパク質の等電点のｐＨ単位の少なくとも１／１
    ０の塩基性シフトを引き起こすためにカチオン形成剤に
    より標的タンパク質を電荷調整し；そして 接合体を形成するために診断イメージング目的のために
    有用な放射性核種に前記電荷調整された標的タンパク質
    を接合することを含んで成る方法。 １９、増強された生体内標的部位特異性を有する接合体
    を調製するための方法であって：少なくとも１／１０の
    ｐＨ単位の接合体の等電点の酸性シフトをもたらすため
    にアニオン形成試薬により接合体を電荷調整し、それに
    よって電荷調整された接合体を形成する（ここで前記電
    荷調整された接合体は、電荷調整されていない対応する
    接合体よりも長い血清半減期を有する）ことを含んで成
    る方法。 ２０、診断イメージング目的のために標的部位対放射性
    核種のバックグラウンド放射能の比を高めるための方法
    であって、電荷調整された接合体のｐＨ単位の少なくと
    も１／１０の等電点の塩基性シフトを引き起こすために
    カチオン形成試薬により接合体を電荷調整することを含
    んで成る方法。 ２１、接合体の免疫反応性を高めるための方法であって
    、電荷調整された接合体のｐＨ単位の少なくとも１／１
    ０等電点のシフトを引き起こすためにアニオン形成試薬
    又はカチオン形成試薬のいづれかにより接合体を電荷調
    整することを含んで成る方法。 ２２、電荷調整されていない抗体の等電点に比べて少な
    くとも１／１０のｐＨ単位でシフトされる等電点を有す
    る電荷調整された抗体であって、前記電荷調整された抗
    体が電荷調整されていない抗体と比べて高められた免疫
    反応性を有することを含んで成る抗体。 ２３、標的タンパク質及びポリペプチド毒素を含んで成
    る接合体であって、前記毒素がアニオン形成剤との反応
    により電荷調整されることを特徴とする接合体。 ２４、前記標的タンパク質がまた、アニオン形成剤との
    反応により電荷調整される請求項２３記載の接合体。 ２５、前記アニオン形成剤が下記式： Ｘ−Ｇ−Ｙ 〔式中、Ｘはリシン残基上の第１アミンと反応性の官能
    基Ｘはその前駆体であり；Ｇは任意の有機スペーサーを
    表わし；そしてＹは負に電荷されたイオン又はその前駆
    体である〕のものである請求項２３又は２４記載の接合
    体。 ２６、前記アニオン形成剤が無水物及び／又は少なくと
    も１種のカルボン酸基を含んで成る請求項２５記載の接
    合体。 ２７、前記ポリペプチド毒素がプソイドモナス内毒素又
    はそのフラグメントである請求項２３又は２４記載の接
    合体。 ２８、アニオン形成剤により電荷調整された多数のリシ
    ン残基を有するポリペプチド毒素。 ２９、前記毒素がプソイドモナス内毒素又はそのフラグ
    メントである請求項２８記載のポリペプチド毒素。 ３０、請求項２８又は２９記載のポリペプチド毒素及び
    標的タンパク質を含んで成る接合体。 ３１、非標的細胞に対するポリペプチド毒素又はその接
    合体の毒性を減じるための方法であって、前記ポリペプ
    チド毒素とアニオン形成試薬とを反応せしめることを含
    んで成る方法。 ３２、前記ポリペプチド毒素がプソイドモナス内毒素又
    はそのフラグメントであり、そして前記アニオン形成試
    薬が前記毒素の多数のリシン残基と反応する請求項３１
    記載の方法。
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