JP2736255B2

JP2736255B2 - イムノグロブリン結合体

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Publication number: JP2736255B2
Application number: JP63055074A
Authority: JP
Inventors: イーアン・フアークワ・キヤンベル・マケンジー; ジエフリー・アラン・ピーターズ; マーク・ジヨン・スミス
Original assignee: FUARUMASHIA E ATSUPUJON SpA; YUNIBAASHITEI OBU MERUBORUN
Current assignee: FUARUMASHIA E ATSUPUJON SpA; YUNIBAASHITEI OBU MERUBORUN
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-10
Publication date: 1998-04-02
Anticipated expiration: 2013-04-02
Also published as: IE880701L; SE503402C2; DE3808166C2; AU622105B2; NL8800610A; US5798097A; NZ223834A; IL85688A0; HU205266B; PT86960A; NO881105D0; FI98706C; CA1329156C; FR2612074A1; NL195078C; GR1000059B; CN1045621C; IE64781B1; BE1001051A4; GR880100148A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はイムノグロブリン結合体、その製法およびそ
の使用に関する。

モノクローナル抗体（以下MoAbと略記する）を使用し
て腫瘍を抗新生物剤でねらい撃ちさせる一般的概念は知
られておりその治療上の重要性が現在評価されている。
一般にこの方法には選択的に局在集中できそして腫瘍細
胞を損傷させることができるものである抗体と毒性剤と
の結合体の製造が包含される。植物および細菌毒素のＡ
鎖と抗体とからイムノトキシンを構成させ、それらを抗
原に結合させてそしてインターナリゼーシヨンさせて細
胞を死なせることに主なる注意が向けられてきた。実際
上、腫瘍に対して特異的であると考えられる多くのMoAb
は正常な細胞のサブ集団とも反応性であり、その結果か
かる強力な毒素を利用することは非現実的でありうる、
何故ならそれは正常な組織にも損害を及ぼしうるからで
ある。植物毒素より安全な代替物はドキソルビシン、ビ
ンデシン（Vindesine）、クロラムブシル（Chlorambuci
l）、メルフアラン（Melphalan）およびメトトレキサー
ト（Methotrexate）のような慣用の抗癌性薬物に抗体を
結合させたものである。現在使用されている抗新生物剤
の毒性作用が非特異的であるので、それらを腫瘍抗原に
体するMoAbに結合させることにより治療指数を高める試
みがなされている。

胸腺由来のＴ−細胞による移植片拒否反応を抑制する
試みにおいては、抗胸腺細胞グロブリンを用いることに
よりＴ−細胞活性を低下させることにしばしば焦点があ
てられていた。より最近は、モノクローナル抗体の発達
に伴いＴ−細胞サブセツトをインビトロにおけるそれら
の機能に従いかつMoAbにより限定される特異的な表面抗
原の存在に従つて定義することができるようになつた。
それによりＴ−細胞が移植片拒否反応を調節する機構に
ついての研究が刺激されることとなりそしてその研究は
L3T4およびLy−２ネズミ抗原により限定されるヘルパー
／インデユーサーサブセツトおよび細胞障害性／サプレ
ツサーサブセツトに大別して集中的に行われている。抗
−汎Ｔ−細胞試薬であるOKT3MoAbはインビボでの効力が
証明されているが、最近の研究では20種の異なるネズミ
リンパ球抗原に対する20種のMoAbがマウスでインビボで
効力がなく、従つてインビボ研究には利用価値がないこ
とが判明した。それゆえこれら特異性の高いMoAbがより
強力になされ標的細胞を完全に除去できる方法を検査す
るのが適切である。かかる方法の一つがMoAbに結合され
た細胞障害性薬物の使用である。

薬物−MaAb接合体の臨床的な効力には癌の免疫化学療
法および種々の免疫調節障害と同種移植拒否反応の軽減
が包含される。多くの研究において、腫瘍会合抗原に体
するMoAbに結合された場合の毒薬および薬物の腫瘍細胞
に対する特異的な細胞障害性が示されている。しかしな
がら、毒素−抗体接合体は骨髄移植に先立ちＴ−細胞を
根絶させるために広範にインビトロで使用されてはいる
が、Ｔ−細胞を根絶させかつ移植片拒否反応におけるＴ
−細胞免疫調節について調査するのに薬物−MoAb接合体
をインビボ使用することはあまり強調されてこなかつ
た。

アントラサイクリン類は癌の化学療法において使用さ
れる抗新生物剤の重要な一群であり、そのうちドキソル
ビシンおよびダウノルビシンは固形腫瘍に対して有効で
ある。しかしながら抗体にダウノルビシンおよびドキソ
ルビシンを結合させると、その結合がアミノ基を介して
行われた場合は薬物の活性がかなり失われる。最近ダウ
ノルビシンがブロモダウノルビシンを経て14−位炭素原
子を介してMoAbに結合された。これら接合体はインビト
ロで活性を示した。しかしながらインビボ研究報告はな
い（Gallego氏他、「Int.J.Cancer」1984,33,737〜74
4）。さらに、ダウノルビシン−MoAb接合体が10μg/ml
より高い濃度で非特異的な毒性を示すことも示されてい
る。

今、イダルビシン（４−デメトキシ−ダウノルビシ
ン、以下Idaと略記する）がMoAbに結合されうることお
よびその接合体が選択的で強力なインビトロおよびイン
ビボ抗腫瘍活性を示すことが見出された。Ida−MoAb接
合体の非特異的な毒性は8.0ml/Kgより低い投与量ではイ
ンビボで証明されなかつた。このIda−MoAb接合体はダ
ウノルビシン−MoAb接合体よりインビトロおよびインビ
ボ効力が大きい。

さらに、異なるリンパ球サブ集団（L3T4⁺、Ly−2⁺お
よびThy−1⁺）と反応することが知られているMoAbにIda
を結合させることによりIda−MoAb接合体が細胞集団を
根絶させる能力を詳細に検べた。この方法が細胞を減少
させる驚くべき有効な手段であることを見出した。例え
ば、インビボでLy−2.1⁺細胞に対し何ら測定可能なほど
の作用を及ぼさない抗−Ly−2.1MoAbは細胞毒性薬剤で
あるIdaと結合することにより有効な細胞障害剤に変換
されうる。

Ly−２およびL3T4抗原に対するMoAbを用いることによ
り、Ida−MoAbが標的細胞をインビトロおよびインビボ
で除去しうることが今や示された。移植片拒否反応の原
因であるＴ−細胞サブセツトを特異的に減少させるのに
抗リンパ球グロブリンまたは抗−汎−Ｔ−細胞試薬例え
ばDKT3 MoAbより大きい効力を有するIda−MoAb接合体が
提供されうる。

本発明によれば、ヒト新生物に対して特異的であるモ
ノクローナル抗体にまたはその抗体の少くとも１個の抗
原結合部位を含有するその断片にＣ−14位で共有結合さ
れたIdaからなるイムノグロブリン結合体が提供され
る。

Idaは米国特許−Ａ−4,077,988号に記載されている。
抗体または抗体断片分子のそれぞれに対し２〜８個、よ
り好ましくは２〜６個のIda分子が共有結合されるのが
好ましい。このIda分子は必ずしもそうではないが一般
にモノクローナル抗体または抗体断片にその14−位で接
合する。これらは直接結合していることが好ましいが、
不活性担体またはリンカーが間に介在していることもで
きる。しかしながらIdaは代りにアミノ基を介してモノ
クローナル抗体または抗体断片に結合されることもでき
る。これは分解可能なペプチドスペーサー、デキストラ
ン担体、酸感受性スペーサーまたはポリグルタミン酸を
用いてなされうる。結合に用いられる基には、ポリ−Ｌ
−グルタミン酸およびポリ−Ｌ−アスパラギン酸のよう
な合成ポリアミノ酸のカルボン酸基が含まれ、またヒト
血清アルブミンのような不活性蛋白質またはカルボキシ
メチルデキストランのような官能性化したデキストラン
が担体として作用しうる。かかる担体は10〜60キロダル
トンの範囲の大きさでありうる。

代表的にはそれぞれの抗体または抗体断片はIdaが標
的として狙うことが望まれる細胞表面上の抗原に対して
特異的である。抗体または抗体断片はヒト新生物に対し
て特異的であることができる。Idaが標的として狙うこ
とが所望されうるヒト新生物の例をあげれば、乳癌、結
腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胸腺癌およびその他の
癌、肉腫および白血病である。分裂中の細胞、赤血球前
駆体細胞および種々の腫瘍の細胞上に存在するヒトトラ
ンスフエリンレセプター（TFR）に対して特異的な抗体
または抗体断片が用いられうる。適当な抗TFRモノクロ
ーナル抗体はLiCR−LON−HMy−２（HMy−２）細胞上の
トランスフエリンレセプターに対するものであることが
できる。

モノクローナル抗体または抗体断片はイムノグロブリ
ン接合体が投与される予定の種と同じ種であるのが好ま
しい。それゆえヒトまたはマウスのモノクローナル抗体
または抗体断片は代表的にはヒトにその接合体を投与す
ることが意図される場合に用いられる。また、抗体また
は抗体断片がIgGクラスのものであることも好ましい。
抗体断片はFab、Fab′またはＦ（ab′）_２フラグメント
であるのが好ましい。IgM抗体からタンパク分解的酵素
消化により誘導されうるIgMモノマーも用いられうる。

イムノグロブリン接合体は本発明により14−ハロ−Id
aをモノクローナル抗体またはその断片を反応させるこ
とからなる方法により調製されうる。14−置換基は弗
素、塩素、臭素または沃素であることができるが、しか
し臭素が好ましい。14−Br−Idaは米国特許Ａ−4,125,6
07号に記載されている。接合は従つて下記のことからな
る工程により行うことができる。

（ａ）モノクローナル抗体またはその断片を過剰モル
の14−ハロ−Idaと混合し、（ｂ）その混合物を18〜37℃で反応させ、（ｃ）すべての沈殿を分離し、（ｄ）未反応の出発物質をゲル過により除去し、そ
して（ｅ）薬物（Ida）を吸着クロマトグラフイーまたは
イオン交換クロマトグラフイーにより分離する。

工程（ａ）は代表的にはN,N−ジメチルホルムアミド
のような水混和性有機溶媒中で遂行される。工程（ａ）
における14−ハロ−Idaの過剰モルは０〜50倍が好まし
い。工程（ｂ）においては、反応は１〜８時間行われる
のが好ましい。代表的な反応温度は室温である。

しかしながら他の接合法も用いられうる。接合体がId
aとモノクローナル抗体または抗体断片との間に不活性
担体またはリンカーを挿入された形で有することが要求
される場合は、その担体またはリンカーは代表的にはは
じめにIdaのＣ−14炭素原子で結合しそして次に抗体ま
たは抗体断片に結合される。

本発明のイムノグロブリン接合体は癌を患つているヒ
トの治療に用いられうる。治療上有効な量の接合体が投
与されうる。癌は固形腫瘍、腹水腫瘍または白血病であ
ることができる。治療されうるヒトの新生物は前記して
ある。それぞれの接合体中のモノクローナル抗体または
抗体断片が異なる特異性を有する２種またはそれ以上の
接合体が投与されうる。

接合体は注射により投与されうる。このものは非経口
的例えば静脈投与される。また局所的にかまたは直接腫
瘍に投与されうる。患者に投与される接合体の量は治療
される腫瘍および患者の状態のような種々の因子の如何
によるであろう。しかしながら代表的には患者の体の面
積M²につき10〜200mgの接合体量が投与されうる。接合
体は他の化学療法剤と一緒に、または接合体の活性を高
める薬剤例えば血管作用剤または腫瘍壊死因子と一緒に
も投与されうる。

イムノグロブリン接合体は製剤上許容されうる担体ま
たは希釈剤と共に医薬組成物として製剤化される。任意
の適当な担体または希釈剤が用いられうる。適当な担体
または希釈剤には生理学的食塩溶液またはリンゲルブド
ー糖溶液が包含される。

以下の実施例により本発明を説明する。添付図面にお
いて、第１〜11図は実施例１に関し、そして第12〜16図
は実施例２に関するものである。より詳しくは以下に記
載されるとおりである。

本発明で用いられるアントラサイクリン誘導体の構造
を示せば次のとおりである。

アントラサイクリン誘導体：（ここでMoAbはモノクローナル抗体を示す）第１図は抗−Ly−2.1（0.5mg）へのイダルビシン（Id
a）の結合を示す。抗−Ly−2.1の１モル当りとり込まれ
たIdaのモル（■印）（左側縦座標）およびタンパク質
回収（・印）（右側縦座標）が反応混合物中のIdaのｎ
モル数（横座標）の函数として示される。

第２図はITT（１）75NS E3標的細胞上の抗−Ly−2.1
接合体の抗体希釈度（×10^-1）（横座標）に対するロゼ
ツト形成細胞％（縦座標）として測定された抗体力価を
表わす。連続希釈は抗−Ly−2.1（▲印）の0.5mg/ml溶
液に対して、あるいは抗体１モル当り２（・印）または
８（○印）モルのIdaを有する抗−Ly−2.1の0.5mg/ml溶
液に対して行われた。

第３図はE3細胞に及ぼすIda（■印）またはIda−抗−
Ly−2.1、Ida5モル／抗体モル（・印）の24時間アツセ
イにおける阻害作用を示し、〔³H〕チミジンとり込みの
阻害％（縦座標）がIda濃度（Ｍ）（横座標）に対して
プロツトされている。

第４図は（Ly−2⁺）E3細胞に及ぼすIda（■印）、Ida
−抗−Ly−2.1、Ida5モル／抗体モル（・印）またはIda
−抗−TFR、Ida5モル／抗体モル（○印）の30分間阻害
アツセイにおける阻害作用を示し、〔³H〕チミジンのと
り込みの阻害％（縦座標）がIda濃度（Ｍ）（横座標）
に対してプロツトされている。

第５図はE3標的細胞に及ぼすIda−抗−Ly−2.1、Ida5
モル／抗体モル（○印）および接合体＋抗−Ly−2.1
（・印）の30分間特異性アツセイにおける阻害作用を示
し、〔³H〕チミジンとり込みの阻害％（縦座標）がIda
濃度（Ｍ）（横座標）に対してプロツトされている。

第６図は２×10⁶個の細胞を皮下注射されたCBF₁マウ
スにおけるE3胸腺腫の生育を示す。マウス10匹ずつの群
に矢印で示される下記静脈処置をした。すなわち、PBS
（□印）、Ida（■印）、抗−Ly−2.1（▲印）、Ida−
抗−TFR（○印）またはIda−抗−Ly−2.1（・印）。平
均腫瘍寸法（cm²）（縦座標）が腫瘍接種後の日数（横
座標）に対してプロツトされている。誤差バーは平均の
±標準誤差を示す。

第７図は2.0×10⁶個のE3腫瘍細胞を皮下注射しそして
第４日目および５日目にIda−抗−Ly−2.1接合体で静脈
処置されたCBF₁マウスのそれぞれの腫瘍生長曲線を示
す。腫瘍寸法（cm²）（縦座標）が腫瘍接種後の日数
（横座標）に対してプロツトされている。

第８図は3.0×10⁶個の細胞を皮下注射されたCBF₁マウ
スにおけるE3胸腺腫の生長を示す。マウス10匹ずつの群
に矢印で示される下記静脈処置をした。すなわち、PBS
（□印）、抗−Ly−2.1（▲印）、Ida（■印）またはId
a−抗−Ly−2.1接合体（・印）。平均腫瘍寸法（cm²）
（縦座標）が腫瘍接種後の日数（横座標）に対してプロ
ツトされている。誤差バーは平均の±標準誤差を表わ
す。

第９図は3.0×10⁶個の細胞を皮下注射されたCBF₁マウ
スにおけるE3胸腺腫の生長を示す。マウス10匹ずつの群
に矢印で示される下記腫瘍内処置をした。すなわち、PB
S（□印）、抗−Ly−2.1（▲印）、Ida（■印）またはI
da−抗−Ly−2.1接合体（・印）。平均腫瘍寸法（cm²）
（縦座標）が腫瘍接種後の日数（横座標）に対してプロ
ツトされている。誤差バーは平均の±標準誤差を示す。

第10図は２×10⁶個の細胞を皮下注射されたヌードマ
ウスにおけるCOLO205ヒト腫瘍異種移植片の生長を示
す。マウス10匹ずつの群に矢印で示される下記静脈処置
をした。すなわち、PBS（△印）、遊離のIda（◆印）、
Ida−250−30.6接合体（・印）、Idaと250−30.6の混合
物（◇印）および250−30.6（▲印）。平均腫瘍寸法（c
m²）（縦座標）が腫瘍接種後の日数（横座標）に対して
プロツトされている。誤差バーは平均腫瘍寸法の±標準
誤差を示す。

第11図はIda−250−30.6の接合体で静脈処置（矢印）
された異種移植されたヌードマウスのそれぞれの腫瘍生
長曲線を示す。破線はPBSで処置されたマウスの平均腫
瘍寸法を示す。腫瘍寸法（cm²）（縦座標）が腫瘍接種
後の日数（横座標）に対してプロツトされている。

第12図は抗L3T4（0.5mg）に対するイダルビジン（Id
a）の結合を示す。抗−L3T4の１モル当りとり込まれたI
daのモル数（◆印）（左側縦座標）およびタンパク質回
収（・印）（右側縦座標）が反応混合物中のIdaのｎモ
ル数（横座標）の函数として示される。

第13図はITT（１）75NS E3標的細胞上の抗−Thy−１
接合体の抗体希釈度（×10^-1）（横座標）に対するロゼ
ツト形成細胞％（縦座標）として測定された抗体力価を
表わす。連続希釈は抗−Thy−１（◆印）または抗−Thy
−１１モル当りIda1（○印）、４（・印）または７
（◇印）モルを有する接合体と1.0mg/ml溶液について行
われた。

第14図はIda−抗−L3T4処置抗−L3T4処置 Ida−抗−Ly−2.1処置抗−Ly−2.1処置または未処置マウスの脾臓における多数のL3T4⁺おおびLy−2⁺細胞に
及ぼすIda−MoAbおよびMoAb処置の影響について示す。
ロゼツト形成細胞％（縦座標）が日数（横座標）に対し
てプロツトされている。

第15図はCBAマウスにおけるP388D1腫瘍移植片の生存
（Ｈ−２および非Ｈ−２差をこえて）に及ぼす組み合せ
Ida−MoAb接合体処置の影響について示す。マウス10〜1
5匹の群に8.0×10⁶個のP388D1腫瘍細胞を皮下注射しそ
して下記のものの一つを静脈投与した（矢印）。（ｉ）
PBS（◆）、（ii）抗−L3T4および抗−Ly−2.1（○）、
（iii）Ida−抗−L3T4（■）、（iv）Ida−抗−Ly−2.1
（・）および（ｖ）Ida−抗−L3T4およびIda−抗−Ly−
2.1（▲）。平均腫瘍寸法（cm²）（縦座標）が腫瘍接種
後の日数（横座標）に対してプロツトされている。誤差
バーは平均腫瘍寸法の±標準誤差を示す。

第16図はCBAマウスにおけるP388D1腫瘍移植片の生存
に及ぼすIda−抗−Thy−１接合体の影響について示す。
マウス10匹ずつの群に1.0×10⁷個のP388D1腫瘍細胞を皮
下注射しそして下記のうちの１つを静脈投与（矢印）し
た。（ｉ）PBS（□）、（ii）抗−Thy−１（・）および
（iii）Ida−抗−Thy−１（▲）。平均腫瘍寸法（cm²）
（縦座標）が腫瘍接種後の日数（横座標）に対してプロ
ツトされている。誤差バーは平均の±標準誤差を示す。

第17図は細胞８×10個／マウスを注射されたヌードマ
ウスにおけるCOLO205（30.6⁺、17.1⁺）異種移植片の生
長を示す。マウス10匹ずつの群に矢印で示される下記腹
腔内処置をした。PBS（□）、17.1−Ida（○）、30.6−
Ida（△）または30.6−Idaおよび17.1−Idaの混合物
（・）。平均腫瘍寸法（cm²）（縦座標）が腫瘍接種後
の日数（横座標）に対してプロツトされている。誤差バ
ーは平均の±標準誤差を示す。Idaの総量は200μｇであ
つた。

第18図は腫瘍断片（１〜5mg）を移植されたヌードマ
ウスにおけるLIM2210ヒト結腸腫瘍異種移植片の生長を
示す。マウス10匹ずつの群に矢印で示される下記静脈処
置をした。PBS（□）、17.1−Ida（◆）、JGT−13−Ida
（▲）、27.1−Ida（・）、30.6−Ida（○）。平均腫瘍
寸法（cm²）（縦座標）が腫瘍接種後の日数（横座標）
に対してプロツトされている。誤差バーは平均の±標準
誤差を示す。Idaの総量は80μｇであつた。

実施例１材料および方法腫瘍細胞この研究で検査される細胞系統には（Ly−2⁺）マウス
胸腺腫ITT（１）75NS E3変種（E3）（Smyth氏他、「J.N
atl Cancer Inst.」1986 76 503〜510）、（Ly−2^-、TF
R^-）リンパ腫EL4（Horowitz氏他、「Science」1968 160
533〜535）、（TFR⁺）ヒト細胞系統CEM（Foley氏他、
「Cancer」1965 18 522〜529）および（250−30.6⁺）ヒ
ト細胞系統COLO205が包含される。細胞はダルベツコ改
良イーグル培地（DME）またはRPMI1640培地（Flow Labo
ratories,Sydney,Australia）に10％熱不活化新生ウシ
血清（Flow）、2mMグルタミン（Commonwealth Serum La
boratories Sydney,Australia）;100μg/mlストレプト
マイシン（Glaxo,Melbourne,Australia）および100I.U.
/mlペニシリン（Commonwealth Serum Laboratories）を
補充したものの中でインビトロで保持した。E3腫瘍は
（C57BL/6×BALB/c）F₁マウス（CBF₁マウス）に連続継
代することによりインビボで保持した。腹水液から得ら
れた細胞を洗浄してpH7.3の燐酸塩緩衝食塩水（PBS）中
で２回遠心分離し（400g×５分）PBS中に再懸濁させそ
してマウスの腹壁中に皮下（s.c.）注射した。これらは
処理前に触診しうる腫瘍に発達した。マウスを一連の静
脈（i.v.）または腫瘍内（i.t.）処置にかけそして以後
の腫瘍寸法を腫瘍の垂直軸を通つてノギスにより毎日測
定した。データは平均腫瘍寸法として記録された（２つ
の直径±標準誤差の結果）。

マウス CABおよび（C57BL/6×BALB/c）マウス（CBF₁マウス）
およびヌード（nu/nu）マウスがDepartment of Patholo
gy,University of Melbourneで生産された。すべてが同
性同年令のマウス８〜10匹からなる実験群をそれぞれの
実験につき用いた。

モノクローナル抗体用いられるMoAbは（ｉ）マウスLy−2.1と特異的に反
応する抗−Ly−2.1（IgG 1）（Hogarth氏他の「Immunol
ogy」1982 46 135〜144）、（ii）ヒトトランスフエリ
ンレセプター（TFR）と反応するA3C6（抗−TFR）（Ig
G 1）（Panaccio氏他の「Immunology and Cell Biology
65,461〜472,1987」）および（iii）ヒト結腸癌細胞上
に存在する抗原に対して反応する250−30.6で示される
抗体であつた。

MoAbは腹水液から40％硫酸アンモニアを用いる沈殿、
PBS中への溶解および同じ緩衝液での透析により単離さ
れた。これら粗製調製物はタンパク質−Ａ−セフアロー
ス（Pharmacia Inc.,Piscataway,New Jersey）上に吸着
させ、PBS（pH7.3）で充分に洗浄しそして0.2Mグリシン
/HCl（pH2.8）を用いて溶離するか、またはアフイゲル
（Affigel）ブルーカラム（Bio−Rad Laboratories Pt
y.Ltd.,Sydney）に通した。中和に続き、MoAbをPBSで透
析し、等分して−70℃で貯蔵した。A3C6はCBAマウスを
２×10⁶個のLiCR−LON−HMy−２（HMy−２）細胞（OKT9
^+ve）を用いて１週間間隔で３週間腹腔内から免疫し、
最後の注射の３日後に脾臓をとり出しそしてP3−NSI−A
G−１（NS−１）細胞と融合させることにより得られ
た。

接合体の調製および定量化完全無欠の抗−Ly−2.1、抗−TFR MoAb、または250−
30.6（pH8.0のホウ酸塩緩衝液1ml中１〜2mg）を、N,N−
ジメチルホルムアミド（DMF）中に濃度10mg/mlで溶解さ
れた14−ブロモ−４−デメトキシダウノルビシン（Br−
Ida）の（１〜50）過剰モルと混合した。反応を室温で
４時間保持させ、次に遠心分離（400g×５分間）してす
べての沈殿を分離した。遊離のBr−Idaおよびその他の
未反応出発物質をセフアデツクスＧ−25カラム（PD−1
0、Pharmacia）を用いてゲル過クロマトグラフイーす
ることにより除去しそして次に接合体をPorapak Q（Mil
lipore）のカラムに通してすべての吸着された薬物を分
離した（Niederwieser氏他、「J.Chromatog.」1971 54
215〜223）。薬物−MoAb接合体中にとり込まれたIdaの
量は483nmでの吸収分光測定（E498＝3.4×10³M^-1cm^-1）
およびタンパク概算（Bradford氏の「Anal.Biochem.」1
976 72 248〜253）により測定された。

抗体活性結合法において用いられると同じ操作を受けた遊離の
MoAbに比較して、Ida−MoAb接合体の抗体活性を測定す
るのに羊の抗マウスイムノグロブリン（SAMG）を用いる
ロゼツト形成分析が用いらえた（Parish氏他、「J.Immu
nol.Methods」1978 20 173〜183）。

薬物活性（ａ） 24時間阻害活性：細胞（２〜５×10⁶/ml）100
μを平底ミクロ滴定プレートに加えそして37℃で１時
間インキユベートした。遊離のイダルビシン（Ida）（P
BS中に溶解）およびIda−MoAb接合体を無菌的に過し
そして滅菌PBS中で希釈した。遊離のIdaまたは接合体の
50μを各検体当りウエル２個を用いて細胞に加え、対
照ウエルにはPBS50μを加えた。そして細胞をCO₂7％
の下37℃で24時間培養した。

（ｂ） 30分間阻害アツセイ：細胞（２〜５×10⁶/ml）
200μを滅菌エツペンドルフ（Eppendorf）管に集め、
滅菌薬物または接合体中に再懸濁させそして37℃で30分
間混合した。次に細胞を遠心分離し（400g×５分）、生
育培地に再懸濁させそして各検体当りウエル２個ずつを
用いて100μずつをミクロ滴定プレートに種つけし16
〜24時間インキユベーシヨンした。これら２種のアツセ
イにおいてインキユベーシヨン期間終了後、１μCiの〔
³H〕−チミジンを含有する生育培地50μ（比活性＝5C
i/ミリモル、Amersham）を加え、そしてプレートを２〜
４時間インキユベーシヨンした。次に細胞を収穫し、乾
燥し、そして個々の検体を分離してβ−シンチレーシヨ
ンカウンターで計測した。〔³H〕−チミジンのとり込み
を対照のとり込みと比較した阻害％として表わした。任
意の時点での標準誤差が二重測定により生じそしてすべ
ての所定の実験ポイントで５％を越えなかつた。

毒性 CBAマウス10〜20匹ずつの群に種々の量のIdaまたはId
a−抗−Ly−2.1を１回静脈注射しそして生存するマウス
数を投与された薬物のmg/Kg量に対して記録した。これ
らのマウスの器官をとり出して秤量したのちホルマリン
固定してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。

結果接合体の調製および特性化 Br−Idaを数種のMoAb、すなわちヒトTFRに対する抗
体、ヒト結腸癌細胞上に存在する抗原に対する抗体（抗
体250−30.6）、およびマウスLy−２アロ抗原に対する
抗体に共有結合させた。反応条件はMoAbに添加されるBr
−Idaの過剰モルを変動させそして比較的高いIdaとり込
みと比較的低いタンパク質回収との間を妥協させること
によりその接合について設定された。Ida−抗−Ly−2.1
（第１図）、Ida−抗−TFRおよびIda−250−30.6（デー
タは示されず）は３〜５分子のIdaをとり込みタンパク
質回収は50％より大きかつた。Br−IdaとMoAbとの反応
は２種類の結合を生成しうる（前記アントラサイクリン
誘導体のＣおよびＤ）。どちらが存在するかを確定させ
るためには、接合体をpH4.5またはpH9.0に48時間露出さ
せ、放出された遊離の薬物をPorapak Qに吸収させそし
て検体を分光測定により再定量した。塩基（pH9.0）に
露出させると結合薬物の50％が放出されるが、一方pH4.
5では何らの損失もなかつた。このことは薬物の少くと
も50％がエステル結合（同上Ｄ）をしていることを示
す。なぜならエステル結合は塩基性条件に対し感受性で
あるがアミン結合は安定であるからである。

抗体活性接合の前および後における抗体の力価をロゼツト形成
法により計測しそして標的細胞の50％がロゼツトを示す
希釈度として測定された。２および８分子のIdaを含有
するIda−抗−Ly−2.1接合体はE3細胞に対して抗体力価
それぞれ1:56000および1:33000を有し、一方非接合抗体
力価は1:80000であつた（第２図）。２および６分子のI
daを含有するIda−250−30.6接合体はCOLO205細胞に対
する抗体力価それぞれに1:16000および1:11000を有し、
一方非接合抗体力価は1:33000であつた。従つて接合操
作により抗体活性が幾分か損失される。MoAbと６分子未
満のIda分子との接合体がインビトロおよびインビボ研
究に用いられた。Ida−抗−Ly−2.1接合体の溶解度およ
び抗体活性はこれらのIdaとり込みのレベルをはるかに
こえて低下することが注目された（データは示さず）。
有用にとり込まれうるIda分子の最大数は個々の抗体の
如何に応じ変動しよう。

イダルビシンおよびイダルビシン−MoAb接合体のインビ
トロ活性マウスITT（１）75NS E3細胞系統（Ly−2⁺TFR^-）およ
びヒトCEM細胞系統（Ly−2^-TFR⁺）に及ぼすIdaおよび２
種のIda−MoAb接合体のインビトロ細胞障害性を24時間
阻害アツセイにおいて測定しそしてID₅₀の値（〔³H〕−
チミジンとり込みにおける対照の50％阻害）を測定し
た。その結果を第３図および第１表に示す。Idaについ
てのID₅₀は試験した２種の細胞系統に対して1.0〜2.5×
10^-7Mの範囲であつた（第３図および第１表参照）。E3
に対するIda−抗−Ly−2.1のID₅₀は遊離のIdaのそれよ
り４倍大きく（第３図）そしてCEMに対するIda−抗−TF
RのID₅₀は遊離のIdaの場合より１〜２倍大きかつた（第
１表）。それゆえ、遊離のIdaはE3およびCEMの両方に対
してIda−抗−Ly−2.1およびIda−抗−TFRのそれぞれよ
り細胞障害性が大きかつた。しかしながらこれらIda−M
oAb接合体は批反応性の細胞系統（第１表）に対して細
胞障害性が1/10しかなく、このことはそれらの細胞障害
作用が特異的であり、それらの抗体活性保有から生ずる
ことを示している（第２図）。

Ida−250−30.6接合体は遊離のIdaより少し活性が劣
つていた。標的細胞系統COLO205に対し遊離のIdaはI.D.
₅₀6×10^-8Mを有するが接合体はI.D.₅₀3.5×10^-7Mを有し
ていた。

接合体が標的細胞に対するそれらの細胞障害作用にお
いて選択性を示すか否か検査するために、Ida−抗−Ly
−2.1およびIda−抗−TFRをE3（Ly−2⁺）細胞と30分間
インキユベートし、次に結合されなかつた接合体を洗い
去りそして細胞障害性について測定した。遊離のIdaに
ついてのID₅₀5.2×10^-7Mに比較してIda−抗−Ly−2.1接
合体はID₅₀6.2×10^-7Mを有していた（第４図）。対照す
ると、非反応性のIda−抗−TFR接合体はID₅₀5.0×10
^-6M、すなわち遊離のIdaのそれより10倍大きく、このこ
とはIda−抗−Ly−2.1接合体の抗体結合活性によりその
選択的細胞障害性が生じたことを示している。同様にし
てIda−250−30.6接合体および遊離の薬物をCOLO205（2
50−30.6＋ve）およびE3（250−30.6−ve）細胞系統と3
0分間インキユベートし次に洗浄して細胞障害アンツセ
イにかけた。いずれの細胞系統も遊離の薬物に対しては
同様の薬量応答を示した。すなわちCOLO205に対して9.2
×10^-7MそしてE3に対して9.8×10^-7Mであつた。しかし
ながら、Ida−250−30.6接合体は抗体非反応性E3細胞系
統に対してよりCOLO205に対して４倍毒性が大きかつ
た。CEM細胞系統およびIda−抗−Ly2.1を非反応性対照
として用いて同様の結果が得られた（データは示さ
ず）。さらに、標的細胞に対するIda−MoAb接合体の細
胞障害性が特異的であつて抗体結合部位にて起ることを
確認するために、遊離のMoAbを用いて接合体の細胞障害
性を阻害する研究を行つた。Ida濃度4.0×10^-6M（抗−L
y−2.1 2μｇ）で、E3細胞に対する抗−Ly−2.1接合体
の細胞障害は抗−Ly−2.1 50μｇ（250μg/ml）の添加
により70％低下し（第５図）、このことはIda−抗−Ly
−2.1接合体の細胞障害性がその抗体結合能力に直接関
連していることを示している。同様の対照結果は250−3
0.6でも得られた。すべてのアツセイにおいて遊離の抗
−Ly−2.1、抗−TFRおよび250−30.6が非細胞障害性で
あることに留意されるべきである（データは示さず）。

マウス胸腺腫ITT（１）75NS E3のインビトロ処置固形腫瘍の生長阻害を査定するために、腹部領域に2.
0×10⁶個のE3細胞を皮下接種されたCBF₁マウス（１群10
匹）の群に下記の１種を静脈注射した。すなわち、
（ｉ）PBS、（ii）抗−Ly−2.1、（ii）Ida、（iv）Ida
−抗−TFRまたは（ｖ）Ida−抗−Ly−2.1。マウスには
腫瘍接種後第４日目および５日目（腫瘍寸法＝0.1cm²）
にそれぞれIda 20μｇおよび／または抗−Ly−2.1 1200
μｇを与えた。

第１回目の処置の24時間以内で、Ida−抗−Ly−2.1処
置マウスは平均腫瘍寸法がPBS処置マウスのそれの20％
であつた（すなわち腫瘍塊の80％減少（第６図））。抗
−Ly−2.1単独および非特異的な抗−TFR MoAbに共有結
合したIdaはE3腫瘍の生長に影響を及ぼさないことが明
らかであつた。Ida単独を与えられたマウスの腫瘍は50
％まで減少したが、これらマウスのうち３匹は死亡しそ
して残りは体重が25％減少した。Ida−抗−Ly−2.1を与
えられたマウスのそれぞれの腫瘍生長曲線は処置期間中
10個の腫瘍のうち９個が退行したことを示し（第７
図）、事実腫瘍10個のうち５個は完全に退縮して再発せ
ず（＞200日）、処置完了時に生長し続けていた腫瘍（1
0のうち５）はPBSおよびIda−抗−TFR処置マウスの腫瘍
より生長速度が遅かつた。Ida−抗−Ly−2.1を用いる比
較的大きい腫瘍の静脈内処置を査定するためにもう一つ
の実験が行われた。CBF₁系マウス群（１群10匹）に3.0
×10⁶個のE3細胞を接種し、そして次にマウスに腫瘍接
種後第６日目（腫瘍寸法0.2cm²）および第７日目にIda
および抗−Ly−2.1をそれぞれ15μｇおよび900μｇ与え
た（第８図）。Ida−抗−Ly−2.1処置マウスは７日目ま
でで平均腫瘍寸法がPBS処置マウスのそれの50％そしてI
da−処置マウスのそれの66％であり、この傾向は研究の
終了時（第18日目）まで続いた。Ida−抗−Ly−2.1を与
えられたCBF₁マウス10匹のそれぞれの腫瘍生長曲線では
腫瘍塊のうちの４例が退行しそして１例が完全になくな
つたことが示された（＞200日、データは示されていな
い）。それゆえIda−抗−Ly−2.1は比較的大きい腫瘍に
対して有効であり、そしていずれの実験においてもIda
の抗腫瘍活性は抗−Ly−2.1MoAbに結合された場合にか
なり改善された。

ヒト結腸腫瘍COLO205のインビボ装置 Ida−抗−250−30.6接合体の効力をCOLO205異種移植
片を担持するヌード（nu/nu）マウスで評価した。

２×10⁶個の細胞を腹壁に皮下注射すると４日以内で
触診しうる塊が生じた（約0.1cm²）。次に１群10匹ずつ
のマウスに下記のものの１種を静脈注射した。すなわち
（ｉ）PBS、（ii）250−30.6、（iii）Ida＋250−30.6
（非接合）、（iv）Ida、または（ｖ）Ida−250−30.6
接合体、腫瘍接種後第４、５、６、10および12日目に総
量275μｇのIdaを連続５回静脈注射した。

PBSまたは未接合250−30.6で処置したマウスの群では
何ら明らかな治療効果が見られなかつた。Ida単独で
は、マウス10匹中２匹が生き延び、一方非接合Ida＋250
−30.6を与えられた群ではすべてのマウスが７日目まで
に死亡し、体重減少のような先に示された毒性の徴候を
有していた。Ida−250−30.6接合体を与えられたマウス
は腫瘍寸法が劇的に減少した。これらの結果を第10図に
示す。比較すると、それぞれのマウスについての腫瘍生
長曲線（第11図）ではマウス10匹のうち５匹の腫瘍が７
日目までに退縮したことが示され、次にこれら腫瘍は生
育し始めるが、10匹のうち２匹は腫瘍がなくなつた。こ
れらマウスは毒性による作用を何ら示さなかつた。

腫瘍内処置腫瘍内治療は動物およびヒトの腫瘍の免疫療法にとつ
て有用な技法であることが示されている。従つてIda−
抗−Ly−2.1接合体を直接固形E3腫瘍に投与した場合の
抗腫瘍活性を特性化する研究が行われた。3.0×10⁶個の
E3細胞を皮下に移植されたCBF₁マウス10匹ずつの群では
腫瘍接種５日後に腫瘍が発達した（0.1〜0.2cm²）。処
置は腫瘍接種後第５日目および第６日目に行われる２つ
の注射からなり、マウスには下記のうちの１種が与えら
れた、すなわち、（１）PBS、（２）Ida、（３）抗−Ly
−2.1、または（４）Ida−抗−Ly−2.1（総Ida量＝30μ
ｇ）。Ida−抗−Ly−2.1が最大の抗腫瘍活性を示し、遊
離のIdaおよび抗−Ly−2.1単独は直接腫瘍内に投与され
た場合は腫瘍生育に影響しなかつた。Ida−抗−Ly−2.1
処置されたマウスは第８日目で平均腫瘍寸法がPBS処置
マウスのそれの60％そして第13日目でPBS処置マウスの
それの30％であつた（第９図）。Ida−抗−Ly−2.1処置
マウスのそれぞれの腫瘍生長曲線（データは示されてい
ない）では処置完了３日後で１匹が完全に退縮し一方残
りのマウスは腫瘍生長の低下が遅延することが示され
た。

毒性急性毒性実験を行うためにCBA（Ly2.1⁺）マウス10匹
ずつの群にIda、Ida−抗−Ly−2.1またはIda−抗−TFR
のいずれかの種々の量を１回注射した。Idaを注射され
たマウスのすべてはもとの体重の25％までの当初体重減
少を示したがIda−MoAb接合体のいずれかで処置された
マウスでは何ら体重減少は観察されなかつた。第２表は
LD₅₀およびLD₁₀値に反映されるIdaおよびIda−MoAb接合
体の毒性を示す。そこに示されるように、Ida−抗−Ly
−2.1のLD₁₀は遊離Idaのほんの0.75mg/Kgに比較してIda
10.0mg/Kgであつた。さらに、Ida−抗−TFR接合体はLD
₁₀8.0mg/Kgであつた。Ida−MoAb接合体はLD₅₀の量まで
は試験されなかつた。これらの結果は遊離のIdaに比較
してIda−MoAb接合体の治療指数が大きいことを示して
いる。

組織病理学的結果急性作用：遊離のIdaの静脈投与（1.0mg/Kg）により
処置15日後に脾臓の白色髄の萎縮および心筋繊維の幾分
かの肥大が生じた（データは示さず）これと対照的に、
Ida−抗−Ly−2.1の１回量（2.4mg/Kg）は15および30日
後で何ら特異的な組織障害性を惹起しなかつたが肝細胞
の幾らかの膨潤が15日目に観察された。

実施例２材料および方法マウス（DBA/2×BALB/c）F₁およびCBAマウスがDepartment o
f Pathology,University of Melbourneで生産された。
すべてが同性同年令のマウス10〜20匹からなる実験群を
各実験につき用いた。

腫瘍細胞この研究で検査される細胞系統には（Ly−2⁺）マウス
胸腺腫ITT（１）75NS E3変種（E3）、（L3T4⁺）リンパ
腫EL4（Horowitz氏他、「Science」1968 160 533−53
5）、ヒト結腸癌Colo205（Semple氏他、「Cancer Re
s.」1978 38 1345−1355）および（Ly−2^-,L3T4^-）ヒト
Ｔ−細胞白血病CEM（Foley氏他、「Cancer」1965 18 52
2−529）が包含される。細胞は実施例１の記載と同様に
してインビトロで保持された。P388D1マクロフアージ細
胞系統は（DBA/2×BALB/c）F₁マウスへの連続継代によ
りインビボで保持した。腹水液から得られた細胞を洗浄
してpH7.3の燐酸塩緩衝食塩水（PBS）中で２回遠心分離
し（400g×５分）、PBS中に再懸濁させそしてマウスの
腹壁中に皮下注射するとそこで触診しうる腫瘍移植片に
発達した。マウスを一連の静脈処置にかけそして腫瘍寸
法を腫瘍の垂直軸を通つてノギスにより毎日測定した。
データは平均腫瘍寸法として記録された（２つの直径±
標準誤差の結果）。

モノクローナル抗体リンパ球の明確に区別されるサブ集団を特徴ずけるも
のである。マウス細胞表面抗原L3T4,Ly−２およびThy−
１に対するモノクローナル抗体がモデル系として用いら
れた。

用いられるMoAbは（ｉ）マウスLy−2.1と特異的に反
応する抗−Ly−2.1（IgG 2a）（Hogarth氏他の「Immuno
logy」1982 46 135−144）、（ii）マウスL3T4と特異的
に反応するH129.19（抗L3T4）（ラツトIgG2b）（Pierre
s氏他、「J.Immunology」1984 132 2775−2782）、およ
び（iii）マウスＴ−細胞と反応する抗−Thy−１（ラツ
トIgG2b）（Marshak Rothstein氏他の「J.Immunology」
1979 122 2491−2497）であつた。抗体は実施例１の記
載と同様にして単離し、精製しそして貯蔵した。抗体活
性は実施例１の記載と同様にして羊抗−マウスイムノグ
ロブリン（SAMG）を用いるロゼツト形成アツセイにより
測定された。

イダルビシン−モノクローナル抗体接合体の調製 MoAb（１〜2mg/ml）をN,N−ジメチルホルムアミド中
に溶解された14−ブロモ−４−デメトキシダウノルビシ
ン（Br−Ida）（10mg/ml）の５〜20モル過剰とpH8.0
（0.05Mホウ酸塩緩衝液）および室温で４時間混合し
た。実施例１の記載と同様にして反応を進行させ、精製
しそして得られる接合体中にとり込まれたIdaの量を測
定した。

薬物活性濃度１〜５×10⁶個/mlの細胞を用いて、実施例１に記
載されるようにして２種のアツセイ（24時間および30分
間）を行い薬物活性を査定した。

血清学抗体力価の測定およびL3T4⁺およびLy−2⁺細胞の数を
測定するためにこれら実験を通してロゼツト形成法を用
いた。この方法にはリンパ性細胞の表面上の抗体を検出
するために、羊赤血球（SRC）に結合したラツトイムノ
グロブリン（Ig）をも検出する結合性SAMGを必要とす
る。Ig⁺脾細胞はその表面IgがSAMGでのキヤツプ形成に
より除去されていた（25μおよび2ml、細胞10⁷個／μ
）。次に細胞をイムノグロブリンの再合成を阻止する
ために0.01％のナトリウムアジドを含有する培地中氷上
で保持した。

結果この研究は別々の相で行われた。

（ａ）３種の異なるIda−MoAb接合体のインビトロ特
性化、および（ｂ）次に腫瘍細胞同種移植片の拒否反応前またはそ
の期間中、Ｔ−細胞サブセツトを活動的に減少させるた
めにそれらを使用することについての例示。

接合体の調製および特性化マウスL3T4、Ly−２およびThy−１抗原に対するMoAb
にBr−Idaを共有結合させた。反応条件はMoAbに添加さ
れるBr−Idaの過剰モルを変動させそして比較的高いIda
とり込みと比較的低いタンパク質回収との間を妥協させ
ることによりその接合について設定された。Ida−抗−L
3T4（第12図）、Ida−抗−Ly−2.1およびIda−抗−Thy
−１（データは示さず）は３〜６分子のIdaをとり込
み、タンパク質回収は50％より大きかつた。

抗体活性接合の前および後における抗体の力価をロゼツト形成
法により計測しそしてE3標的細胞の50％がロゼツトを示
す希釈度として測定された。1,4および７分子のIdaを含
有するIda−抗−Thy−１接合体はそれぞれ抗体力価1:42
5000、1:170000および1:130000を有し、一方修飾されて
いない抗体力価は1:550000であつた（第13図）。すなわ
ち、Idaへの接合に際して抗体活性が幾分か損失され
る。しかしながら、４分子未満のIda分子がMoAbに接合
した接合体がインビトロおよびインビボ研究に用いられ
た。同様にIda−抗−Ly−2.1およびIda−抗−L3T4接合
体の抗体活性（データは示さず）はいずれの場合も６分
子より多いIda分子がMoAbにとり込まれるとかなり低下
した。

インビトロ薬物活性 Ida−MoAb接合体の細胞障害性を種々の反応性標的細
胞について24時間アツセイを用いて試験し、遊離Idaの
それと比較した。遊離Idaの活性はIda−MoAb接合体より
４〜10倍大きく、遊離Idaの試験された腫瘍細胞系統に
対するID₅₀（対照の〔³H〕−チミジンとり込みの50％阻
害）は6.6〜9.0×10^-8Mにあつた。Ida−抗−Ly−2.1接
合体は、Ly−２抗原が富化された在来細胞系統の変種で
あるITT（１）75NS E3細胞系統に対して試験された場合
に最も細胞障害性が大きい接合体であることが明らかで
あつた（ID₅₀＝4.3×10^-7M）。標的細胞に対する接合体
作用の選択性を検査するために、Ida−MoAb接合体を標
的細胞と３分間インキユベートし、次に結合されなかつ
た接合体を洗い去りそして細胞障害性について測定し
た。この30分間アツセイを用ると、非反応性のIda−MoA
b接合体は遊離Idaのそれにより10〜50倍大きいID₅₀を有
しており、このことはIda−MoAb接合体の細胞障害性に
とつて抗体結合が必須要件であることを示している。こ
の研究で用いられたMoAbのいずれも補体の非存在下では
標的細胞に対しインビトロで何ら細胞障害性作用を有し
なかつたことは注目されるべきである。結果を第３表に
まとめる。

インダルビシン−モノクローナル抗体接合体のインビボ
効力 Ida−MoAb接合体が脾臓からL3T4⁺またはLy−2⁺細胞を
選択的に減少させうる能力について試験することにより
その接合体のインビボ免疫抑制効力をMoAb単独のそれと
比較した。CBAマウスに第０、２、５および10日目の４
回、抗−Ly−2.1または抗−L3T4接合体（Ida30μg/MoAb
1.5mg）を静脈注射しそして脾臓中のLy−2⁺またはL3T4⁺
細胞の数をロゼツト形成アツセイにより監視した。各処
置につき２匹の処置マウスの脾臓細胞を毎日検査し、そ
してその結果を平均した（第14図）。正常マウスにおけ
る第０日目の総脾臓異細胞の約30％から第20日までのId
a−抗−L3T4処置マウスにおける約４％までL3T4⁺細胞の
数が速やかに低下した。これらL3T4⁺細胞は60日以上に
わたり減少したままであり次に徐々に増加がみられた。
抗−L3T4単独でのインビボ処置後の減少でもL3T4⁺細胞
数の急激な低下を招来した（30％から５％へ）。

Ida−抗−Ly−2.1接合体は脾臓Ly−2⁺細胞数を10日ま
でで25％から５％まで低下させた。しかしながら、Ly−
2⁺細胞の数は第15日目までに増加し始め、そして40〜50
日目までに正常に戻つた。抗−Ly−2.1MoAb単独ではLy
−2⁺細胞を有意に減少させることができなかつたことは
興味深い。未処置対照マウスにおけるLy−2⁺およびL3T4
⁺細胞数の変動はマウス間の自然の変異によると見なさ
れた。かくの如く、Ida−抗−L3T4およびIda−抗−Ly−
2.1のいずれも処置マウスの脾臓からMoAb単独より効果
的にそれぞれL3T4⁺またはLy−2⁺細胞を減少させうるこ
とは明らかであつた。Ida−抗−Ly−2.1接合体の作用は
重要である。何故なら抗−Ly−2.1MoAbは単独で用いら
れた場合は全く効力がないが、しかしIdaに結合された
場合は強力な免疫抑制剤に変換されうるからである。そ
れゆえ薬物−MoAb接合体により維持される減少は移植片
拒否反応におけるLy−2⁺およびL3T4⁺細胞のインビボに
おける役割を検査するのに適する。

腫瘍移植片の生存に及ぼすIda−抗−L3T4、Ida−抗−Ly
−2.1およびIda−抗−Thy−１の作用これらの実験においては、Ida−抗−L3T4、Ida−抗−
Ly−2.1およびIda−抗−Thy−１接合体をCBAマウスにお
けるP388D1腫瘍移植片の生存時間を高めるのに用いた。
この同種移植片はＨ−２（クラスＩおよびII）および非
−Ｈ−２障壁を包含するものである。

（ａ）接合体組み合せ処置１群10〜15匹ずつのCBAマウスの群に8.0×10⁶個のP33
8D1腫瘍細胞を皮下注射しそして第−１、第０（腫瘍接
種当日）、第３、第５および第10日目に下記のうちの１
つを静脈投与した、すなわち、（ｉ）PBS、（ii）抗−L
3T4および抗−Ly−2.1、（iii）Ida−抗−L3T4、（iv）
Ida−抗−Ly−2.1および（ｖ）Ida−抗−L3T4およびIda
−抗−Ly−2.1。投与されたIdaおよびMoAbの総量はそれ
ぞれ125μｇおよび5.75mgであつた。PBSおよびMoAb処置
両マウスの腫瘍移植片は14〜17日間生存し、最大平均腫
瘍寸法は0.31cm²であつた。このことは両未接合MoAbを
一緒にしたものが腫瘍移植片が生存しうるに有効にL3T4
⁺およびLy−2⁺細胞を減少させることができなかつたこ
とを示している（第15図）。さらに、Ida−抗−Ly−2.1
またはIda−抗−L3T4単独では移植片の生存期間を延長
させうるのみ（20〜28日）でありその最大平均腫瘍寸法
は0.40〜0.50cm²であつた。恐らくIda−抗−Ly−2.1ま
たはIda−抗−L3T4単独ではすべてのＴ−細胞を除去せ
ず、そして強力な抗原挑戦（全MHC相異で見られるよう
に）により残留するLy−2⁺およびL3T4⁺細胞の増殖およ
び拒否反応を惹起することができるのであろう。これと
比較してIda−抗−Ly−2.1およびIda−抗−L3T4接合体
の両方を組み合せると、14/15P388D1腫瘍移植片の拒否
反応を回避でき、マウスが殺されるまで寸法を増大させ
ることができた（第50日目、2.00cm²）。これら接合体
処置P388D1腫瘍のうちの少数が第８日目から第16日目ま
で幾分か寸法減少を示したことは注目される。しかしな
がらL3T4⁺およびLy−2⁺細胞を連続的に減少させると
（第10日目）、P388D1腫瘍移植片を一貫して生育させる
ことができた。

（ｂ） Ida−抗−Thy−１接合体１群当り10匹のCBAマウスからなる群に10⁷個のP388D1
腫瘍細胞を皮下注射しそして第−１、０、５および６日
目に下記のものの１つを静脈注射した、すなわち、
（ｉ）PBS、（ii）抗−Thy−１および（iii）Ida−抗−
Thy−１。投与されたIdaおよび抗−Thy−１の総量はそ
れぞれ130μｇおよび5.4mgであり、そしてPBS処置され
たマウスの腫瘍移植片は15日間生存した。抗−Thy−1Mo
Abの単独では腫瘍移植片が28〜32日間生存でき、最大平
均腫瘍寸法は0.58cm²（第６日目）であつた（第16
図）。Ida−抗−Thy−１処置マウスでは、腫瘍移植片の
30％が40日目までに完全に拒否され、一方残る70％は生
育を続け、結局は（第32日目）その群の平均腫瘍寸法を
高めることになつた。それゆえIda−抗−Thy−１は、Id
a−抗−Ly−2.1およびIda−抗−L3T4の組み合せと同様
にLy−2⁺およびL3T4⁺細胞を減少させることができ、従
つて大多数のP388D1腫瘍移植片が、通常は速やかな筈の
拒否反応を伴わずにCBAマウス中で生存できた。

実施例３実施例１記載の操作に従い、Idaとモノクローナル抗
体17.1（Jhompson et al.,Proc.Natl.Cancer.Inst.70,4
09〜419,1983,Murine IgG 2a）との間およびIdaとモノ
クローナル抗体30.6（Thompson et.al.,Br.J.Cancer 4
7,595〜605,Murine IgG 2b）との間で接合体を調製し
た。

ヒト結腸癌Colo205細胞（30.6⁺、17.1⁺）を実施例２
記載のようにして１マウス当り細胞８×10⁶個でヌード
マウスに皮下接種した。この接種されたマウスを次に一
連の腹腔内処置にかけた。腫瘍の寸法をノギスを用い、
腫瘍の垂直軸を通つて計測した。データは平均腫瘍寸法
として記録した（２つの直径±標準誤差の結果）。その
結果を第17図に示す。

実施例４実施例１記載の操作に従い、Idaとモノクローナル抗
体17.1との間、Idaとモノクローナル抗体JGT−13（マウ
スIgG1、結腸カルシノーマ上のカルシノエンブリオニツ
ク抗原とは反応性であるが通常組織とは反応性ではな
い）との間、Idaとモノクローナル抗体27.1（マウスIgG
1、多くの結腸腫瘍上のヒトミルクフアツトグロブリン
抗原とは反応性）との間、およびIdaとモノクローナル
抗体30.6との間で接合体を調製した。LIM2210ヒト結腸
腫瘍異種移植片（１〜5mg）をヌードマウスに移植（S
C）した。移植されたマウスを次に一連の静脈内愛処置
にかけた。腫瘍の寸法を腫瘍の垂直軸を通つてノギスで
測定した。データは平均腫瘍寸法として記録した（２つ
の直径±標準誤差の結果）。結果を第18図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗−Ly−2.1へのイダルビシン（Ida）の結合を
示す。第２図はITT（１）75NS E3標準細胞上の抗−Ly−2.1接
合体の抗体希釈度に対するロゼツト形成細胞％として測
定された抗体力価を表わす。第３図はE3細胞に及ぼすIda（■印）またはIda−抗−Ly
−2.1の24時間アツセイにおける阻害作用を示す。第４図は（Ly−2⁺）E3細胞に及ぼすIda（■印）、Ida−
抗−Ly−2.1（●印）またはIda−抗−TFR（○印）の30
分間阻害アツセイにおける阻害作用を示す。第５図はE3標的細胞に及ぼすIda−抗−Ly−2.1、Ida5モ
ル／抗体モル（○印）および接合体＋抗−Ly−2.1（●
印）の30分間特異性アツセイにおける阻害作用を示す。第６図は２×10⁶個の細胞を皮下注射されたCBF₁マウス
におけるE3胸腺腫の生育を示す（静脈処置）。第７図は2.0×10⁶個のE3腫瘍細胞を皮下注射しそして第
４日目および第５日目にIda−抗−Ly−2.1接合体で静脈
処置されたCBF₁マウスのそれぞれの腫瘍生長曲線を示
す。第８図は3.0×10⁶個の細胞を皮下注射されたCBF₁マウス
におけるE3胸腺腫の生長を示す（静脈処置）。第９図は3.0×10⁶個の細胞を皮下注射されたCBF₁マウス
におけるE3胸腺種の生長を示す（腫瘍内処置）。第10図は２×10⁶個の細胞を皮下注射されたヌードマウ
スにおけるCOLO205ヒト腫瘍異種移植片の生長を示す
（静脈処置）。第11図はIda−250−30.6接合体で静脈処置（矢印）され
た異種移植されたヌードマウスのそれぞれの腫瘍生長曲
線を示す。第12図は抗−L3T4（0.5mg）に対するイダルビシン（Id
a）の結合を示す。第13図はITT（１）75NS E3標的細胞上の抗−Thy−１接
合体の抗体希釈度に対するロゼツト形成細胞％として測
定された抗体力価を表わす。第14図はIda−抗−L3T4処置抗−L3T4処置 Ida−抗−Ly−2.1処置抗−Ly−2.1処置または未処置マウスの脾臓における多数のL3T4⁺およびLy−2⁺細胞に
及ぼすIda−MoAbおよびMoAb処置の影響について示す。第15図はCBAマウスにおけるP388D1腫瘍移植片の生存に
及ぼす組み合せIda−MoAb接合体処置の影響について示
す。第16図はCBAマウスにおけるP388D1腫瘍移植片の生存に
及ぼすIda−抗−Thy−１接合体の影響について示す。第17図は細胞８×10個／マウスを注射されたヌードマウ
スにおけるCOLO205（30.6⁺、17.1⁺）異種移植片の生長
を示す（腹腔内）。第18図は腫瘍断片を移植されたヌードマウスにおけるLI
M2210ヒト結腸腫瘍異種移植片の生長を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者イーアン・フアークワ・キヤンベル・マケンジーオーストラリア国3052ビクトリア．パークビル．グラツタンストリート（番地なし）．ザ・ユニバーシテイ・オブ・メルボルン内 (72)発明者ジエフリー・アラン・ピーターズオーストラリア国3052ビクトリア．パークビル．グラツタンストリート（番地なし）．ザ・ユニバーシテイ・オブ・メルボルン内 (72)発明者マーク・ジヨン・スミスオーストラリア国3052ビクトリア．パークビル．グラツタンストリート（番地なし）．ザ・ユニバーシテイ・オブ・メルボルン内審査官弘實謙二 (56)参考文献米国特許4125607（ＵＳ，Ａ) 米国特許4545985（ＵＳ，Ａ) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ. 33（1984）ｐｐ．737−744 Ｉｍｍｎｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．46 （1982）ｐｐ．135−144

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト新生物に対して特異的であるモノクロ
ーナル抗体にまたはその抗体の抗原結合部位の少なくと
も１個所を含有するその断片にＣ−14位で共有結合され
たイダルビシン（Ida）からなるイムノグロブリン結合
体。
【請求項２】２〜８個のイダルビシンの分子がそれぞれ
の抗体分子に共有結合されている請求項１記載の結合
体。
【請求項３】モノクローナル抗体またはその断片がヒト
トランスフェリンレセプターに対して特異的である請求
項１または２記載の結合体。
【請求項４】前記抗体またはその断片が乳、結腸、肺、
前立腺または卵巣の新生物に対して特異的である請求項
１または２記載の結合体。
【請求項５】14−ハロ−イダルビシンをモノクローナル
抗体またはその断片と反応させることからなる請求項１
記載のイミノグロブリン結合体の製法。
【請求項６】14−ハロ−イダルビシンが14−ブロモ−イ
ダルビシンである請求項５記載の方法。
【請求項７】（ａ）前記抗体またはその断片を過剰モル
の14−ハロ−イダルビシンと混合し、（ｂ）その混合物を18〜37℃で反応させ、（ｃ）沈殿を分離し、（ｄ）未反応の出発物質をゲル濾過により除去し、そし
て（ｅ）吸着されたイダルビシンを吸着クロマトグラフィ
ーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより分離することからなる請求項５または６記載の方法。
【請求項８】モノクローナル抗体またはその断片がヒト
トランスフェリンレセプターに対して特異的である請求
項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】モノクローナル抗体またはその断片が乳、
結腸、肺、前立腺または卵巣の新生物に対して特異的で
ある請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】製剤上許容され得る担体または希釈剤、
および活性成分として請求項１〜４のいずれか１項に記
載されているか、または請求項５〜９のいずれか１項記
載の方法により製造されたイムノグロブリン結合体を含
有する抗新生物用医薬組成物。