FI98706C

FI98706C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen immunoglobuliinikonjugaatin valmistamiseksi

Info

Publication number: FI98706C
Application number: FI881158A
Authority: FI
Inventors: Ian Farquhar Campbell Mckenzie; Geoffrey Allan Pietersz; Mark John Smyth
Original assignee: Univ Melbourne; Pharmacia & Upjohn Spa
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1997-08-11
Also published as: KR880010775A; FI881158A; GR880100148A; DK131588A; YU46858B; GB8805865D0; NO178954B; MY103231A; FI98706B; AU622105B2; NO881105D0; CN88101810A; AU1288188A; GR1000059B; CZ281193B6; IL85688A0; DK173792B1; JP2736255B2; CN1045621C; FR2612074B1

Description

98706

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen immunoglobuliini-konjugaatin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti 5 käyttökelpoisen immunoglobuliinikonjugaatin valmistamiseksi, joka käsittää ihmisen kasvaimelle spesifisen mono-klonaalisen vasta-aineen tai sen palasen, joka sisältää ainakin yhden antigeenin sitoutumiskohdan, ja 14-halogee-ni-idarubisiinia.

10 Yleinen ajatus kasvaimenvastaisten aineiden suun taamisesta kasvaimiin käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita (MoAb) on tunnettu ja sen terapeuttista merkitystä arvioidaan parhaillaan. Yleisesti tässä lähestymistavassa on kysymys vasta-aineen ja myrkyllisen aineen liittämises-15 tä yhteen, jolloin saadut liitännäiset kykenevät selektiivisesti paikallistamaan ja vahingoittamaan kasvainsoluja.

On pantu paljon huomiota sellaisten immunotoksiinien muodostamiseen kasvi- ja bakteeritoksiinien A-ketjuista ja vasta-aineista, jollaisten antigeenien sitoutuminen ja 20 sisään ottaminen johtaa solun kuolemaan. Käytännössä kykenevät monet monoklonaaliset vasta-aineet, joiden uskotaan olevan spesifisiä kasvaimille, myös reagoimaan normaalien solujen alajoukkojen kanssa ja siten voi olla epä-järkevää käyttää sellaisia voimakkaita toksiineja niiden 25 mahdollisten normaaleille kudoksille aiheuttamien vaurioiden vuoksi. Kasvitoksiineja turvallisempi vaihtoehto on ollut kytkeä vasta-aineita sellaisiin tavanomaisiin syö-vänvastaisiin lääkeaineisiin kuin doksorubisiiniin, vin-desiiniin, klorambusiiliin, melfalaaniin ja metotreksaat-30 tiin. Johtuen nykyään käytettyjen kasvainmenvastaisten aineiden epäspesifisistä myrkkyvaikutuksista on tehty yrityksiä lisätä niiden terapeuttista indeksiä kytkemällä ne kasvainantigeenien vastaisiin monoklonaalisiin vasta-aineisiin.

98706 2 Lääkeaine-MoAb -konjugaattien kliinisiin mahdollisuuksiin kuuluu syövän immunokemoterapia. Monet tutkimukset ovat osoittaneet toksiinien ja lääkeaineiden spesifisen solumyrkyllisyyden kasvainsoluille, kun ne ovat kyt-5 kettyinä monoklonaalisiin vasta-aineisiin, jotka on tuotettu kasvaimiin liittyviä antigeenejä vastaan.

Antrasykliinit ovat tärkeä ryhmä syövän kemotera-piassa käytettäviä kasvaimenvastaisia aineita, ja niihin kuuluvat doksorubisiini ja daunorubisiini ovat osoittaneet 10 tehokkuutta kiinteitä kasvaimia vastaan. Daunorubisiinin ja doksorubisiinin kytkeminen vasta-aineisiin johtaa kuitenkin lääkkeen vaikutuksen huomattavaan vähenemiseen, kun kytkeminen suoritetaan aminoryhmän kautta. Daunorubisiini on vastikään kytketty monoklonaalisiin vasta-aineisiin 15 hiiliatomin 14 kautta käyttämällä bromidaunorubisiinia. Nämä konjugaatit osoittivat aktiivisuutta in vitro. In vivo -kokeita ei ole kuitenkaan raportoitu (Gallego et ai, Int. J. Cancer, 1984, 33, 737-744). Lisäksi on ilmennyt, että daunorubisiini-MoAb -konjugaatit osoittavat epäspesi-20 fistä myrkyllisyyttä konsentraatioina > 10 pg/ml.

Olemme nyt todenneet, että idarubisiini (4-demetok-sidaunorubisiini, Ida) voidaan kytkeä monoklonaalisiin vasta-aineisiin ja että konjugaateilla on selektiivinen ja voimakas kasvaimenvastainen vaikutus in vitro ja in vivo.

25 Ida-MoAb -konjugaateilla ei ole ilmennyt epäspesifistä myrkyllisyyttä in vivo annoksina <8,0 mg/kg. Ida-MoAb -konjugaatit ovat in vitro ja in vivo tehokkaampia kuin daunorubisiini-MoAb -konjugaatit.

Siten tämä keksintö tarjoaa menetelmän immunoglobu-30 liinikonjugaatin valmistamiseksi. Keksinnön mukaiselle . menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuk sessa 1 esitetään.

Ida on kuvattu US-A-4 077 988:ssa. Edullisesti 2-8 ja mieluummin 2-6 Ida-molekyyliä on kovalenttisesti lii-35 tettynä kuhunkin vasta-aineen tai vasta-aineen palasen 98706 3 molekyyliin. Ida-molekyylit on yhdistetty suoraan 14-ase-massa monoklonaaliseen vasta-aineeseen tai vasta-aineen palaseen.

Tyypillisesti on kukin vasta-aine tai vasta-aineen 5 palanen spesifinen niiden solujen pinnalla olevalle antigeenille, joita vastaan Ida halutaan suunnata. Näin ollen vasta-aine tai vasta-aineen palanen on spesifinen halutulle kohdekudokselle eli ihmisen kasvaimelle. Esimerkkejä ihmisen kasvaimista, joita vastaan Ida voidaan haluta 10 suunnata, ovat rinta-, paksusuoli-, keuhko-, eturauhas-, munasarja-, kateenkorva- ja muut syövät, sarkoomat ja leukemiat. Voidaan käyttää ihmisen transferriinin reseptroil-le (TFR) spesifistä vasta-ainetta tai vasta-aineen palasta, joka reseptori on läsnä jakautuvien solujen, eryt-15 roidien edeltäjäsolujen ja erilaisten kasvainten solujen pinnalla. Sopiva anti-TFR -monoklonaalinen vasta-aine voidaan tuottaa LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2) -solujen pinnalla olevaa transferriinin reseptoria vastaan.

Monoklonaalinen vasta-aine tai vasta-aineen palanen 20 on edullisesti saman lajin, kuin jolle immunoglobuliini-konjugaatti on tarkoitus antaa. Sen vuoksi käytetään tyypillisesti ihmisen monoklonaalista vastaainetta tai vasta-aineen palasta, kun konjugaatti on tarkoitus antaa ihmisille. Samoin on vasta-aine tai vasta-aineen palanen 25 edullisesti IgG-luokkaa. Vasta-aineen palanen- voi olla

Fab-, Fabl- tai F(ab' )2-palanen. Voidaan myös käyttää IgM-monomeeria, joka voidaan saada IgM-vasta-aineesta proteo-lyyttisen entsyymin avulla pilkkomalla.

Immunoglobuliinikonjugaatit valmistetaan keksinnön 30 mukaan menetelmällä, joka käsittää 14-halogeeni-Idan liittämisen monoklonaaliseen vasta-aineeseen tai sen palaseen.

14-substituentti voi olla fluori, kloori, bromi tai jodi, mutta on mieluimmin bromi. 14-bromi-Ida on kuvattu US-A-4 125 607:ssä. Liittäminen voidaan siten suorittaa mene-35 telmällä, jossa: 4 98706 (a) sekoitetaan monoklonaalinen vasta-aine tai sen palanen molaarisen ylimäärän kanssa 14-halogeeni-Idaa, (b) annetaan seoksen reagoida lämpötilassa 18-37 °C, 5 (c) poistetaan mahdollinen saostuma, (d) poistetaan reagoimattomat lähtöaineet geeli-suodatuksen avulla ja (e) poistetaan adsorboitunut lääkeaine (Ida) ad-sorptiokromatografiän tai ioninvaihtokromatografiän avul- 10 la.

Vaihe (a) suoritetaan tyypillisesti veteen sekoittuvassa orgaanisessa liuottimessa, kuten esimerkiksi Ν,Ν-dimetyyliformamidissa. 14-halogeeni-Idan molaarinen ylimäärä vaiheessa (a) on 0-50 kertainen. Vaiheessa (b) 15 annetaan reaktion tapahtua 1-8 tunnin pituisen ajan. Reaktiolämpötila on tyypillisesti ympäristön lämpötila.

Keksinnön mukaisia immunoglobuliinikonjugaatteja voidaan käyttää syöpää sairastavan ihmisen hoitamiseen. Voidaan antaa terapeuttisesti tehokas määrä konjugaattia.

20 Syöpä voi olla kiinteä kasvain, vesivatsakasvain tai leu kemia. Yllä on mainittu ihmisen kasvaimia, joita voidaan hoitaa. Voidaan antaa kahta tai useampaa konjugaattia, jolloin kunkin konjugaatin monoklonaalisella vasta-aineella tai vasta-aineen palasella on erilainen spesifisyys.

25 Konjugaatti voidaan antaa ruiskeena. Se voidaan an taa ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta esimerkiksi laskimoon. Se voidaan antaa paikallisesti tai suoraan kasvaimeen. Potilaalle annettava konjugaatin määrä riippuu erilaisista tekijöistä, kuten esimerkiksi hoidettavasta kas-30 vaimesta ja potilaan tilasta. Tyypillisesti voidaan kuitenkin antaa annos 10 - 200 mg konjugaattia neliömetriä potilaan kehon pinta-alaa kohden. Konjugaatit voidaan antaa muiden kemoterapeuttisten aineiden tai sellaisten aineiden kanssa, jotka suurentavat konjugaattien aktiivi-35 suutta, esim. vasoaktiivisten aineiden tai kasvaimen nek-roositekijän kanssa.

li 98706 5

Immunoglobuliinikonjugaatit sekoitetaan farmaseuttisiksi valmisteiksi farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja- tai laimennusaineen kanssa. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa kantaja- tai laimennusainetta. Sopivia kan-5 taja- ja laimennusaineita ovat fysiologinen suolaliuos ja Ringerin dekstroosiliuos.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä. Oheisissa piirroksissa koskevat 1-12 esimerkkiä 1 ja kuvat 13-17 esimerkkiä 2. Tarkemmin sanoen: 10 kuvio 1 esittää antrasykliinijohdannaisten raken netta; kuvio 2 esittää idarubisiinin (Ida) liittämistä anti-Ly-2.1 reen (0,5 mg). Moolimäärä Idaa, joka on liittynyt moolia kohden anti-Ly-2.1:ä () (vasemmanpuolinen or-15 dinaatta) ja proteiinin takaisinsaanti (·) (oikeanpuoleinen ordinaatta) on esitetty reaktioseoksessa olevien Idan nmoolien lukumäärän (abskissa) funktiona; kuvio 3 esittää vasta-ainetiitteriä mitattuna prosenttimääränä rosetteja muodostavia soluja (ordinaatta) 20 vasta-ainelaimennosta (x 10'1) (abskissa) vastaan, kun kysymyksessä ovat anti-Ly-2.1 -konjugaatit ITT(l) 75 NS E3 -kohdesolujen pinnalla. Tehtiin laimennusarjoja pitoisuuden 0,5 mg/ml omaavasta liuoksesta, jossa oli joko anti-Ly-2. l:tä (δ) tai anti-Ly-2.1:tä, johon kuului 2 (·) tai 8 25 (o) moolia Idaa/mooli vasta-ainetta; kuvio 4 esittää Idan () tai Ida-anti-Ly-2.1:n, 5 moolia Idaa/moolia vasta-ainetta, (·) estävää vaikutusta E3-soluihin 24 tunnin kokeessa, ja siinä on esitetty graafisesti [3H]-tymidiinin sisäänoton prosenttinen estyminen 30 (ordinaatta) Idan konsentraation (M) (abskissa) funktiona; kuvio 5 esittää Idan () , Ida-anti-Ly-2.1: n, 5 moolia Idaa/mooli vasta-ainetta (·) tai Ida-anti-TFR:n, 5 moolia Idaa/mooli vasta-ainetta (o) estävää vaikutusta (Ly-2+)-E3-soluihin 30 minuutin estämiskokeessa ja siinä on 35 esitetty graafisesti [3H]-tymidiinin sisäänoton prosentti- 6 98706 nen estyminen (ordinaatta) Idan konsentraation (M) (abs-kissa) funktiona; kuvio 6 esittää Ida-anti-Ly-2.1:n, 5 moolia

Idaa/mooli vasta-ainetta (·) ja konjugaatin plus anti-5 Ly-2.1:n (o) estävää vaikutusta E3-kohdesoluihin 30 minuu tin spesifisyyskokeessa ja siinä on esitetty graafisesti [3H]-tymidiinin sisäänoton prosenttinen entsyyminen (ordinaatta) Idan konsentraation (M) (abskissa) funktiona; kuvio 7 esittää E3-kateenkorvakasvaimen kasvua 10 CBFj-hiirillä, joille on ruiskutettu ihon alle 2 x 106 solua. 10 hiiren ryhmille annettiin laskimoon hoitoina, jotka on merkitty nuolella; PBS:ä (□), Idaa (), anti-Ly-2.1:tä (δ), Ida-anti-TFR:ä (·) tai Ida-anti-Ly-2.1:tä On esitetty graafisesti keskimääräinen kasvaimen koko (cm2) 15 (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten i päivien (abskissa) funktiona. Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä.

kuvio 8 esittää yksittäisiä kasvaimenkasvukäyriä CBFi-hiirillä, joille on ruiskutettu ihon alle 2,0 x 106 20 E3-kasvainsoluja ja annettu hoitona laskimoon päivinä 4 ja 5 Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaattia. On esitetty graafisesti kasvaimen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona; kuvio 9 esittää E3-kateenkorvakasvaimen kasvua 25 CBFj-hiirillä, joille on ruiskutettu ihon alle 3,0 x 106 solua. 10 hiiren ryhmille annettiin laskimoon hoitona, jotka on merkitty nuolella; PBSrä (□), anti-Ly2.1:tä (δ), Idaa () tai Ida-anti-Ly-2.1-konjugaattia (·). On esitetty graafisesti kasvaimen keskimääräinen koko (cm2) (ordinaat-30 ta) kasvaimen istututtamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona. Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä; ja

II

98706 7 kuvio 10 esittää E3-kateenkorvakasvaimen kasvua CBFj-hiirillä, joille on ruiskutettu ihon alle 3,0 x 106 solua. 10 hiiren ryhmille annettiin kasvaimen sisään hoitoina, jotka on merkitty nuolella; PBSrä (□), anti-5 Ly-2.1:tä (δ), Idaa () tai Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaattia (·) . On esitetty graafisesti kasvaimen keskimääräinen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona. Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä; 10 kuvio 11 esittää COLO 205 -ihmisen kasvain-kseno- graftin kasvua paljailla hiirillä, joille on ruiskutettu ihon alle 2 x 106 solua. 10 hiiren ryhmille annettiin laskimoon seuraavat hoidot, jotka on merkitty nuolella; PPS (δ), vapaa Ida (♦), Ida-250-30.6 -konjugaatti (0), Idan ja 15 250-30.6:n seos (·) ja 250-30.6 (0). On esitetty graafi sesti kasvaimen keskimääräinen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona. Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä; keskimääräisen kasvaimen koon; 20 kuvio 12 esittää yksittäisiä kasvaimenkasvukäyriä paljailla hiirillä, joille oli sijoitettu ksenografi ja joita hoidettiin antamalla laskimoon (nuoli) Ida250-30.6 -konjugaattia. Katkoviivat esittää kasvaimen keskimääräistä kokoa PBS:llä hoidetuilla hiirillä. On esitetty graafi-25 sesti kasvaimen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona; kuvio 13 esittää idarubisiinin (Ida) liittämistä anti-L3T4:än (0,5 mg). Moolimäärä Idaa, joka on liittynyt moolia kohden anti-L3T4:ä (♦) (vasemmanpuoleinen ordinaat-30 ta) ja proteiinin takaisinsaanti (o) (oikeanpuoleinen ordinaatta) on esitetty reaktioseoksessa olevien Idan nmoo-lien lukumäärän (abskissa) funktiona; kuvio 14 esittää vasta-ainetiitteriä mitattuna prosenttimääränä rosetteja muodostavia soluja (ordinaatta) 35 vasta-ainelaimennosta (x 10'1) (abskissa) vastaan, kun on 8 98706 kysymyksessä anti-Thy-1 -konjugaatit ITT(l) 75NS E3 -koh-desolujen pinnalla. Tehtiin laimennussarjät pitoisuuden 1,0 mg/ml omaavasta liuoksesta, jossa oli joko anti-Thy-l:tä (♦) tai konjugaattia, joka sisälsi 1 (o), 4 (·) 5 tai 7 (0) moolia Idaa/mooli anti-Thy-1:tä; kuvio 15 esittää Ida-MoAb- ja MoAb-hoidon vaikutusta L3T4+- ja Ly-2+ -solujen lukumäärään pernasta hiirillä, joita on hoidettu Ida-anti-L3T4:llä {·-·), anti-L3T4:llä (a-a), Ida-anti-Ly-2.1:llä (·...·) anti-Ly-2.1:llä 10 (a... a), tai hoitamattomilla hiirillä (□...□ ja siinä on esitetty graafisesti prosenttimäärä rosetteja muodostavia soluja (ordinaatta) ajan päivinä (abskissa) funktiona; kuvio 16 esittää yhdistetyn Ida-MoaB -konjugoin-ti-hoidon vaikutusta P388Dl-kasvainsiirteen (yli H-2- ja ei-15 H-2-eroavuuksien) säilymiseen GBA-hiirillä. 10-15 hiiren ryhmille ruiskutettiin ihon alle 8,0 x 106 P388Dl-kasvain-solua ja ne saivat laskimoon yhtä seuraavista (nuoli): (i) PBS (♦), (ii) anti-L3T4 ja anti-Ly2.1 (o), (iii) Ida-an-ti-L3T4 (), (iv) Ida-anti-Ly-2.1 (·) ja (v) Ida-anti-L3T4 20 ja Ida-anti-L6-2.1 (δ). On esitetty graafisesti keskimääräinen kasvaimen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona. Virhe-janat esittävät + keskiarvon keskivirhettä; ja kuvio 17 esittää Ida-anti-Thy-1 -konjugaatin vaiku-25 tusta P388Dl-kasvainsiirteen säilymiseen CBA-hiirillä. 10 hiiren ryhmille ruiskutettiin ihon alle, 1,0 x 101 P388Dl-kasvainsolua ja ne saivat laskimoon (nuoli) yhtä seuraavista: (i) PBS (□), (ii) anti-Thy-1 (·) ja (iii) Ida-anti-Thy-1 (δ) . On esitetty graafisesti keskimääräinen 30 kasvaimen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jälkeisten päivien (abskissa) funktiona. Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä; kuvio 18 esittää COLO 205 (30, 6+, 17, 1+) -ksenograf-tin kasvua paljailla hiirillä, joille on ruiskutettu 8 x 35 10 solua/hiiri. 10 hiiren ryhmille annettiin hoitona vat-

II

98706 9 saontelon sisään, mikä on merkitty nuolella, PBS:ä (□) ; 17.1-Idaa (o); 30.6-Idää (δ) tai 30.6-Idan ja 17.1-Idan seosta (·). On esitetty graafisesti keskimääräinen kasvaimen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jäl-5 keisten päivien (abskissa) funktiona.

Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä. Kokonaisannos Idaa oli 200 pg.

Kuvio 19 esittää LIM2210-ihmisen paksusuolen kasvain -ksenograftin kasvua paljailla hiirillä, joille on 10 istutettu kasvaimen palanen (1-5 mg) . 10 hiiren ryhmille annettiin hoitona laskimoon, mikä on merkitty nuolella, PBS:ä (□); 17.1-Idaa (♦); JGT-13-Idaa (δ); 27.1-Idaa (·), 30,6-Idaa (o). on esitetty graafisesti keskimääräinen kasvaimen koko (cm2) (ordinaatta) kasvaimen istuttamisen jäl-15 keisten päivien (abskissa) funktiona. Virhejanat esittävät + keskiarvon keskivirhettä. Kokonaisannos Idaa oli 80 pg.

Esimerkki 1

Materiaalit ja menetelmät

Kasvainsolut 20 Tässä tutkimuksessa tutkittiin solulinjoja (Ly-2+)- hiiren kateenkorvakasvain ITT(l) 75NS E3 -muunnos (E3) (Smyth et ai, J. Natl. Cancer Inst. 1986 76, 503-510), (Ly-2‘, TFR') -imukudoskasvain-EL4 (Horowitz et ai, Science 1968 160, 533-535), TFR+) -ihmisen solulinja CEM (Foley et 25 ai, Cancer 1965 18, 522-529) ja (250-30.6+) -ihmisen solu-linja COLO 205. Soluja ylläpidettiin in vitro Dulbeccon muunnetussa Eagle'in elatusaineessa (DME) tai RPMI 1640 -elatusaineessa (Flow Laboratories, Sydney, Australia), johon oli lisätty 10 % lämmön avulla inaktivoitua vas-30 tasyntyneen vasikan seerumia (Flow), 2 mM glutamiinia (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australia); 100 pg/ml streptomysiiniä (Glaxo, Melbourne, Australia) ja 100 I.U./ml penisilliiniä (Commonwealth Serum Laboratories). E3-kasvainta ylläpidettiin in vivo suorittamalla sarja 35 siirtoja (C57BL/6 x BALB/C) Fj-hiiriin (CBFj-hiiriin) . Vesi- 10 98706 vatsanesteestä peräisin olevat solut pestiin ja sentrifu-goitiin (400 g x 5 min) kaksi kertaa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,3, uudelleensuspen-doitiin PBSreen ja ruiskutettiin ihon alle (s.c) hiirten 5 vatsan seinämään; näistä kehittyi käsintuntuvia kasvaimia ennen hoitoa. Hiirille annettiin sarja hoitoja laskimoon (i.v.) tai kasvaimen sisään (i.t) ja kasvainten myöhempi koko mitattiin päivittäin suorakulmamittaimella, mitaten kasvainten kohtisuorien akselien suunnassa. Tulokset il-10 moitettiin keskimääräisenä kasvaimen kokona (kahden läpimitan tulo + keskivirhe).

Hiiret CBA- ja (C57BL/6xBALB/c)-hiiret (CBFj)-hiiret) ja paljaat (nu/nu)-hiiret oli kasvatettu Melbournen yliopis-15 ton patologian laitoksessa. Kussakin kokeessa käytettiin 8-10 hiiren koeryhmiä, joissa kaikki hiiret olivat samaa sukupuolta ja samanikäisiä.

Monoklonaaliset vasta-aineet Käytettiin seuraavia monoklonaalisia vasta-aineita: 20 (i) Anti-Ly-2.1 (IgGl), joka kykenee reagoimaan hiiren

Ly-2.1-erityisrakenteen kanssa (Hogarth et ai, Immunology 1982, 46, 135-144) ja (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgGl), joka kykenee reagoimaan ihmisen transferriinin reseptorin (TFR) kanssa (Panaccio et ai, Immunology and Cell Biology 65, 25 461-472, 1987); ja (iii) vastaaine, jolla on nimitys 250-30.6 ja joka kykenee reagoimaan ihmisen paksusuolen karsinooman solujen pinnalla olevan antigeenin kanssa.

Monoklonaaliset vasta-aineet eristettiin vesivat-sanesteestä saostamalla 40 % ammoniumsulfaatilla, liuott-30 maila PBS:een ja dialysoimalla käyttäen samaa puskuri- liuosta. Nämä raakapreparaatit joko absorboitiin proteii-ni-A-Sepharoseen (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), pestiin perusteellisesti PBS:11a (pH 7,3) ja eluoitiin 0,2 M glysiini/HCl:11a (pH 2,8), tai niiden annettiin kulkea 35 Afficel blue -pylvään (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., li 98706 11

Sydney) läpi. Neutraloinnin jälkeen monoklonaalisia vasta-aineita dialysoitiin sitten PBS:ta vastaan, jaettiin eriin ja säilytettiin -70 °C:ssa. A3C6 saatiin immunisoimalla CBA-hiiret ruiskuttamalla vatsaontelon sisään viikon 5 väliajoin kolmen viikon ajan 2 x 106 LiCR-LON-HMy-2 (HMy-2) -solua (OKT9+v) , poistamalla pernat kolme päivää viimeisen ruiskeen jälkeen ja fuusioimalla P3-NS1-AG4-1 (NS-1) -solujen kanssa.

Konjugaattien valmistus ja kvantitatiivinen määrit- 10 täminen

Hyvässä kunnossa olevia vasta-aineita anti-Ly2.1, anti-TFR-MoAb tai 250-30.6 (1-2 mg/ml boraattipuskuri- liuoksessa, pH 8,0) sekoitettiin molaarisen ylimäärän (1-50) kanssa 14-bromi-4-demotoksidaunorubisiinia 15 (Br-Ida), joka oli liuotettu (N,N)-dimetyyliformamidiin (DMF) pitoisuudeksi 10 mg/ml. Reaktion annettiin tapahtua ympäristön lämpötilassa 4 tunnin ajan ennen sentrifugoin-tia (400 g x 5 minuuttia) mahdollisen saostuman poistamiseksi. Vapaa Br-Ida ja muut reagoimattomat lähtöaineet 20 poistettiin geelisuodatuskromatografiän avulla käyttäen Sephadex G-25 -pylvästä (PD-10; Pharmacia) ja konjugaattien annettiin sitten kulkea Porapak Q (Millipore) -pylvään lävitse adsorboituneen lääkkeen poistamiseksi (Nie-derwieser et ai, J. Chromatog, 1971 54, 215-223) . Lääkeai-: 25 ne-MoAb -konjugaatteihin yhdistynyt Ida-määrä määritettiin absorbanssispektrofotometrian avulla aallonpituudella 483 nm. (E498 = 3, 4 x 103M_1cm'1) ja proteiinimäärityksen avulla (Bradford, Anal. Biochem. 1976 72, 248-253).

Vasta-aineaktiivisuus 30 Käytettiin rosettienmuodostuskoetta käyttäen hyväk si vasta-ainetta lampaan anti-hiiren immunoglobuliini (SAMG) määritettäessä Ida-MoaB -konjugaattien vasta-aineaktiivisuus verrattuna vapaaseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joka oli läpikäynyt samat menettelyt, joita 35 käytettiin kytkemismenetelmässä (Parish ja McKenzie, J. Immunol. Methods 1978 20, 173-183).

12 98706 Lääkkeen aktiivisuus (a) 24 tunnin estämiskoe: 100 μΐ soluja (2-5 x 106/ml) lisättiin tasapohjaiselle mikrotiitterilevylle ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Vapaa idarubisiini 5 (Ida) (liuotettuna PBS:een) ja Ida-MoAb -konjugaatit suodatettiin aseptisesti ja tehtiin laimennoksia steriiliin PBS:een; lisätiin soluille 50 μΐ vapaata Idaa tai konju-gaattia käyttäen rinnakkaisia syvennyksiä kutakin näytettä varten; kontrollisyvennyksiin pantiin 50 μΐ PBS:ta ja so-10 luja kasvatettiin olosuhteissa 37 °C, 7 % C02 24 tunnin ajan.

(b) 30 minuutin estämiskoe: 200 μΐ soluja (2-5 x 106/ml) kerättiin steriileihin Eppendorf-putkiin, uudel-leensuspendoitiin steriiliin lääkeaineeseen tai konju- 15 gaattiin ja sekoitettiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Solut sentrifugoitiin (400 g x 5 min), uudelleensuspendoitiin kasvatusliuokseen ja 100 μ1:η annoksia sijoitettiin lähtö-viljelmiksi mikrotiitterilevylle, käyttäen rinnakkaisia syvennyksiä kutakin näytettä varten, ennen 16 - 24 tunnin 20 inkubaatiovaihetta. Kummassakin näistä kokeista lisättiin inkubaatioajan jälkeen 50 μΐ kasvatusliuosta, joka sisälsi 1 uCi [3H]-tymidiiniä (spesifinen aktiivisuus = 5 Ci/mmoo-li; Arnersham), ja levyjä inkuboitiin 2-4 tunnin ajan. Sitten solut koottiin ja kuivattiin, erotettiin yksittäi-25 siä näytteitä ja suoritettiin laskeminen beeta-tuikelasku-rissa. [3H]-tymidiinin otto ilmaistiin prosenttisena estymisenä kontrollien ottoon verrattuna. Kunkin pisteen keskivirhe perustuu kahteen rinnakkaiseen määritykseen eikä ylittänyt 5 % yhdessäkään annetussa koepisteessä.

30 Myrkyllisyys 10-20 CBA-hiiren ryhmille annettiin yhtenä ainoana ruiskeena laskimoon eri annoksia Idaa tai Ida-anti-Ly-2.1:tä ja hiirten hengissä säilyminen ilmoitettiin lääkkeen annoksen, ilmaistuna mg/kg, funktiona. Näiden 35 hiirten elimet poistettiin ja punnittiin ennen forma- I) 98706 13 liinikovettamista ja värjäämistä hematoksyliinillä ja eo-siinilla.

Tulokset

Konjugaattien valmistus ja karakterisointi 5 Br-Ida (kuvio 1) liitettiin kovalenttisesti erilai siin monoklonaalisiin vasta-aineisiin: ihmisen TFR:n vastaisiin, ihmisen paksusuolen syövän solujen pinnalla olevan antigeenin vastaisiin (vasta-aine 250-30.6) ja hiiren Ly-2 -alloantigeenin vastaisiin. Reaktio-olosuhteet liit-10 tämistä varten etsittiin vaihtelemalla monoklonaalisten vasta-aineiden joukkoon lisätyn Br-Idan molaarista ylimäärää ja tehden kompromissa Idan runsaamman liittymisen ja pienempien proteiinin takaisin saantien välillä. Ida-anti-Ly-2.1:een (kuvio 2), Ida-anti-TFR:iin ja Ida-250-30.6:een 15 {tuloksia ei ole esitetty) yhdistyi 3-5 molekyyliä Idaa proteiinin takaisinsaantien ollessa suurempia kuin 50 %. Br-Idan reaktio monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa saattoi johtaa kahden tyyppisiin sidoksiin (kuviot 1C ja D). Jotta saataisiin selvitettyä, kumpi oli läsnä, konju-20 gaatit pantiin pH:n 4,5 tai pH:n 9,0 vaikutuksen alaisiksi 48 tunnin ajaksi, irronnut vapaa lääkeaine adsorboitiin Porapak Q:hun ja näytteiden määrä mitattiin uudelleen spektrofotometrian avulla. Viisikymmentä prosenttia sitoutuneesta lääkeaineesta oli vapautunut emäksen (pH 9,0) 25 vaikutuksesta, kun taas pHrssa 4,5 ei ilmennyt häviötä. Tämä viittaisi siihen, että vähintään 50 % lääkeaineesta on kiinnittynyt esterisidoksella (kuvio ID) , sillä este-risidos on herkkä emäksisille olosuhteille, kun taas amiinisidos on niissä stabiili.

30 Vasta-aineaktiivisuus Määritettiin vasta-aineen tiitterit ennen liittämistä ja sen jälkeen käyttäen rosettienmuodostusmenetelmää ja ne määrättiin laimennokseksi, jossa 50 % kohdesoluista osoitti rosettien muodostamista. Ida-anti-Ly-2.1 -konju-35 gaatit, jotka sisälsivät 2 ja 8 molekyyliä Idaa, vasta-ai- 14 98706 netiitterit E3-soluja vastaan olivat vastaavasti 1:56 000 ja 1:33 000, kun taas konjugointimattoman vasta-aineen tiitteri oli 1:80 000 (kuvio 3). Ida-Ida-250-30.6 -konju-gaatit, jotka sisälsivät 2 ja 6 molekyyliä Idaa, vasta-ai-5 netiitterit COLO 205 -soluja vastaan olivat vastaavasti 1:16 000 ja 1:11 000, kun taas konjugoimattoman vasta-aineen tiitteri oli 1:33 000. Vasta-aineaktiivisuus on siten jonkin verran vähentynyt konjugointimenetelmän johdosta; in vitro ja in vivo -kokeissa käytettiin konjugaatteja, 10 joissa oli vähemmän kuin 6 Ida-molekyyliä monoklonaalisen vasta-aineen molekyyliä kohden. Todettiin Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaattien liukenevuus ja vasta-aineaktiivisuus vähenivät huomattavasti, kun Idaa oli yhdistynyt enemmän kuin nämä määrät (tuloksia ei ole esitetty). Suurin luku-15 määrä Ida-molekyylejä, joka voidaan liittää edullisesti, vaihtelee yksittäisen vasta-aineen mukaan.

Aktiivisuus in vitro ja idarubisiini ja idarubisii-ni-MoAb -konjugaatit

Idan ja kahden Ida-MoAb -konjugaatin solumyrkkyvai-20 kutus in vitro hiiren ITT(1)75NS E3 -solulinjalle (Ly-2* TFR') ja ihmisen CEM-solulinjalle (Ly-2'TFR+) määritettiin 24 tunnin estämiskokeessa ja määrättiin I.D.50-arvot ( [3H]-tymidiinin oton 50 % estyminen verrattuna kontrolleihin) . Tulokset on esitetty kuviossa 4 ja taulukossa 1.

25 Idan I.D.50 oli kummankin testatun solulinjan kohdalla väliltä 1,0-2,5 x 10~7M (kuvio 4, taulukko 1). Ida-anti-Ly-2. l:n I.D.50 oli solulinja E3 tapauksessa oli 4 kertaa suurempi (kuvio 4) ja Ida-anti-TFR:n I.D.50-arvot solulinja CEM tapauksessa olivat 1-2 kertaa suurempia kuin vapaan 30 Idan (taulukko 1). Vapaa Ida oli siten myrkyllisempi sekä E3:lle että CEM:ille kuin vastaavasti Ida-anti-Ly-2.1 ja Ida-anti-TFR. Nämä Ida-MoAb -konjugaatit osoittavat kuitenkin 10 kertaa vähäisempää solumyrkkyvaikutusta reagoimaan kykenemättämille solulinjoille (taulukko 1), mikä 35 osoittaa, että niiden solumyrkkyvaikutus oli spesifinen ja

II

15 98706 johtui niiden vasta-aineaktiivisuuden säilymisestä (kuvio 3) .

Taulukko 1

Idarubisiini- monoklonaalinen vasta-aine -konjugaattien 5 vaikutus kasvainsoluihin1

Keskimääräiset I.D.-arvot, jotka on määritetty

Kasvain- Ida-anti- Ida-anti- solulinja Idalle_Ly-2.1;lle TFRrlle_ E3 1,2 x KT7 4,3 x 10'7 2,3 x 10'6 10 (5)2 (3) (2) CEM 2,2 x 10‘7 2,0 x 10'6 3,0 x 10'7 _(5)_(2)_(3) ^ I«D·5q = [3H]-tymidiinin oton 50 % estyminen kontrolleihin 15 verrattuna.

2 = testattujen preparaattien lukumäärä.

Ida-250-30.6 -konjugaatit olivat hiukan vähemmän aktiivisia kuin vapaa Ida. Vapaan Idan I.D.50 oli 6 x 10~8M, kun sen sijaan konjugaatin I.D.50 oli 3,5 x 10‘7M koh-20 desolulinja COLO 205 tapauksessa.

Tarkoituksena tutkia, oliko konjugaattien solumyrk-kyvaikutus kohdesoluille selektiivinen, inkuboitiin Ida-anti-Ly-2.1:tä ja Ida-anti-TFR:ä 30 minuutin ajan E3 (Ly—2+) -solujen kanssa, ennen kuin sitoutumaton konju-25 gaatti pestiin pois ja mitattiin myrkyllisvys soluille.

Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaatin I.D.50 oli 6,2 x 10'7M, verrattuna vapaan Idan I.D.50-arvoon 5,2 x 10'7 (kuvio 5) Sen sijaan reagoimaan kykenemättömän Ida-anti-TFR -konjugaatin I.D.50 oli 5, 0 x 10'6M, s.o. 10 kertaa suurempi kuin vapaan 30 Idan, mikä osoittaa, että Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaatin vasta-aineensitoutumisaktiivisuus johti sen selektiiviseen solumyrkkyvaikutukseen. Samalla tavoin inkuboitiin Ida-250-30.6 -konjugaattia ja vapaata lääkeainetta 30 minuutin ajan COLO 205 (250-30.6 +ve) ja E3 (250-30.6 -ve) 98706 16 -solulinjojen kanssa ennen pesemistä ja solumyrkkyvaiku-tusmäärityksen suorittamista. Kummatkin solulinjat osoittivat samankaltaista annoksen suuruuteen suhtautumista vapaan lääkkeen kohdalla, s.o. 9,2 x 10‘7M COLO 205: llä ja 5 9, 8 x 10‘7M E3:lla. Ida-250-30.6 -konjugaatti oli kuitenkin 4 kertaa myrkyllisempi COLO 250:lie kuin vasta-aineen kanssa reagoimaan kykenemättömälle E3-solulinjalle. Samankaltaisia tuloksia saatiin käyttämällä CEM-solulinjaa ja Ida-anti-Ly-2.1:tä reagoimaan kykenemättömänä kontrollina 10 (tuloksia ei ole esitetty). Jotta saataisiin varmistettua solumyrkkyvaikutus kohdesoluihin oli spesifinen ja esiintyi vasta-aineen sitoutumiskohdassa, suoritimme kokeita, joissa pyrimme estämään konjugaatin solumyrkkyvaikutusta käyttämällä vapaata monoklonaalista vasta-ainetta. Käytet-15 täessä Idan konsentraatiota 4,0 x 10‘6M (2 pg anti-Ly-2.1) , oli anti-Ly-2.1 -konjugaatin solumyrkkyvaikutus E3-solui-hin 70 % vähäisempi sen jälkeen kun oli lisätty 50 pg (250 pg/ml) anti-Ly-2.1:tä (kuvio 6), mikä osoittaa, että Ida-anti-Ly-2. 1 -konjugaatin solumyrkkyvaikutus on suorassa 20 suhteessa sen vasta-aineen sitoutumiskykyyn. Samankaltaisia kontrollituloksia saatiin 250-30.6:11a. Huomattakoon, että kaikissa kokeissa oli vapaa anti-Ly-2.1, anti-TFR ja 250-30.6 vailla solumyrkkyvaikutusta (tuloksia ei ole esitetty) .

; 25 Hiiren kateenkorvakasvaimen ITT(1)75NS E3 in vitro -käsittely

Kiinteiden kasvainten kasvun estämisen tutkimiseksi CBF^hiirten ryhmiä (10 ryhmää kohden), joille oli istutettu ihon alle 2,0 x 10~6 E3-solua vatsan alueelle, hoidet-30 tiin antamalla ruiskeina laskimoon yhtä seuraavista: (i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1/ (iii) Ida; (iv) Ida-anti-TFR; tai (v) Ida-anti-Ly-2.1. Hiiret saivat 20 pg Idaa ja/tai 1200 pg anti-Ly-2.1:tä vastaavasti päivinä 4 ja 5 (kasvaimen koko =0,1 cm2) kasvaimen istuttamisen jälkeen.

98706 17 24 tunnin kuluessa ensimmäisestä hoidosta oli Ida-anti-Ly-2.1:llä hoidettujen hiirten kasvaimen keskimääräinen koko 20 % koosta, joka todettiin PBSrlla hoidetuilla hiirillä (s.o. kasvaimen massan 80 % pieneneminen (kuvio 5 7)); oli ilmeistä, että anti-Ly-2.1 yksin ja Ida kovalent- tisesti sidottuna epäspesifiseen anti-TFR-MoAb:een eivät vaikuttaneet E3-kasvaimen kasvuun. Pelkkää Idaa saavien hiirten kasvaimet pienenivät määrän 50 %:iin saakka; kuitenkin 3 näistä hiiristä kuoli ja muilla ruumiinpaino vä-10 heni 25 %. Ida-anti-Ly-2.1:tä saavien hiirten yksittäiset kasvaimenkasvukäyrät osoittivat 9 kasvaimen 10:stä takautuvan hoidon kestäessä (kuvio 8); 5 10:stä kasvaimesta todellakin takautui täysin eikä ilmaantunut uudelleen (> 200 päivää), ja ne kasvaimet, joiden kasvu jatkui hoidon 15 päättyessä (5 10:stä), kasvoivat hitaammilla nopeuksilla kuin PBS:lla ja Ida-anti-TFR:llä hoidettujen hiirten kasvaimet. Suoritettiin lisäkoe tarkoituksena tutkia suurempien kasvaimien hoitamista laskimoon annetulla Ida-anti-Ly-2.1:llä. CBFi~hiirten ryhmille (10 ryhmää kohden) istu-20 tettiin 3,0 x 106 E3-solua ja hiiret saivat sitten 15 pg ja 900 pg Idaa ja anti-Ly-2.1:tä vastaavasti päivinä 6 (kasvaimen koko =0,2 cm2) ja 7 kasvaimen istuttamisen jälkeen (kuvio 9). Ida-anti-Ly-2.1:llä hoidettujen hiirten keskimääräinen kasvaimen koko oli 50 I koosta, joka todettiin 25 PBS:lla hoidetuilla hiirillä ja 66 % koosta, joka todettiin Idalla hoidetuilla hiirillä päivänä 7 ja tämä kehityksen kulku jatkui kokeen päättämiseen asti (päivä 18) . Ida-anti-Ly-2.1:tä saavien 10 CBFj-hiiren yksittäiset kasvaimenkasvukäyrät osoittivat, että esiintyi 4 takautumista 30 ja 1 täydellinen kasvainmassa poistuminen (> 200 päivää; tuloksia ei ole esitetty). Ida-anti-Ly-2.1 oli siten tehokasta suurempia kasvaimia vastaan ja kummassakin kokeessa oli Idan kasvaimen vastainen aktiivisuus huomattavasti parempi, kun se oli kytkettynä anti-Ly-2.1-MoAb:een.

18 98706

Ihmisen paksusuolen kasvain COLO 205:n hoito in vivo

Tutkittiin Ida-anti-250-30.6 -konjugaatin vaikutusta paljaissa (nu/nu)-hiirissä, joilla oli COLO 205 -kseno-5 graftit

Ruiskutettaessa 2 x 106 solua ihon alle vatsan seinämään muodostui 4 päivän kuluessa käsintuntuva möykky (suurin piirtein 0,1 cm2) . 10 hiiren ryhmiä hoidettiin sitten antamalla ruiskeina laskimoon yhtä seuraavista: (i) 10 PBS; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 25030.6 (ei konjugoi-tu) ; (iv) Ida; (v) Ida-250-30.6 -konjugaatti. Annettiin kokonaismäärä 275 pg Idaa 5:n laskimoon annetun ruiskeen sarjana päivinä 4, 5, 6, 10 ja 12 kasvaimen istuttamisen jälkeen.

15 Mitään terapeuttista vaikutusta ei ilmennyt hiiri- ryhmillä, joita oli hoidettu PBS:11a tai konjugoimattomal-la 250-30.6:11a. Pelkän Idan tapauksessa säilyi 2 10:stä hiirestä hengissä, kun taas kaikki hiiret ryhmässä, joka sai konjugoimatonta Idaa plus 250-30.6:ta, olivat kuollei-20 ta päivään 7 mennessä ja olivat aikaisemmin osoittaneet myrkyllisyysoireita, kuten esimerkiksi painon menettämistä. Ida-250-30.6 -konjugaattia saavilla hiirillä voitiin todeta kasvaimen koon dramaattinen pieneneminen. Nämä tulokset on esitetty kuviossa 11. Sen sijaan yksittäisten 25 hiirten kasvaimenkasvukäyrät (kuvio 12) osoittivat, että 5:llä 10 hiirestä oli kasvain takautunut päivään 7 mennessä; nämä kasvaimet jatkoivat sitten kasvuaan, jolloin 2 10:stä hiirestä pääsi eroon kasvaimesta. Näillä hiirillä ei ilmennyt myrkyllisyyden aiheuttamia vaikutuksia.

30 Kasvaimen sisään annettu hoito

Kasvaimen sisään annetun hoidon on osoitettu olevan hyödyllinen tekniikka eläinten ja ihmisten kasvainten im-munoterapiassa. Sen vuoksi suoritettiin tutkimuksia karakterisoida Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaattien kasvaimen vas-35 täistä vaikutusta, kun ne annetaan suoraan kiinteään li 98706 19 E3-kasvaimeen. 10 CBF,-hiiren ryhmille joille oli istutettu ihon alle 3,0 x 106 E3-solua, kehittyivät kasvaimet (0,1-0,2 cm2) 5 päivää kasvaimen istuttamisen jälkeen. Hoidot käsittävät 2 ruisketta päivinä 5 ja 6 kasvaimen istut-5 tamisen jälkeen, jolloin hiiret saivat yhtä seuraavista hoidosta: (1) PBS; (2) Ida; (3) anti-Ly-2.1; tai (4) Ida-anti-Ly-2.1 (kokonaismäärä Idaa = 30 pg). Ida-anti-Ly-2.1 osoitti suurinta kasvaimen vastaista aktiivisuutta, ja vapaa Ida ja anti-Ly-2.1 yksin eivät vaikuttaneet kasvai-10 men kasvuun, kun ne annettiin suoraan kasvaimeen. Ida-an-ti-L6-2.1:llä hoidetttujen hiirten keskimääräinen kasvaimen koko oli 60 % koosta, joka todettiin PBS:11a hoidetuilla hiirillä päivänä 8 ja 30 % koosta, joka todettiin PBS:lla hoidetuilla hiirillä päivänä 13 (kuvio 10). Ida-15 anti-Ly-2.1:llä hoidettujen hiirten yksittäiset kasvaimen-kasvukäyrät (tuloksia ei ole esitetty) osoittivat 1 täydellisen takautumisen, kun taas jäljellä olevilla hiirillä ilmeni viivästynyt kasvaimen kasvun väheneminen 3 päivää hoidon päättämisen jälkeen.

20 Myrkyllisyys

Akuuttia myrkyllisyyttä tutkivia kokeita varten annettiin 10 CBA (Ly2.1+) -hiirelle yhtenä ainoana ruiskeena erilaisia annoksia joko Idaa, Ida-anti-Ly-2.1:tä tai Ida-anti-TFR:a. Kaikilla hiirillä, joille oli ruiskutettu : 25 Idaa, ilmeni aluksi painon menetystä, määrältään 25 %:iin saakka alkuperäisestä painosta; painon menetystä ei kuitenkaan havaittu hiirillä, joille oli annettu jompaa kumpaa Ida-MoAb -konjugaattia. Taulukossa 2 on esitetty Idan ja Ida-MoAb -konjugaattien myrkyllisyys LD50- ja LD10-arvo-30 jen perusteella. Kuten voidaan nähdä, oli Ida-anti-L6-2.1:n LD10 10,0 mg/kg Idaa, verrattuna vapaan Idan arvoon vain 0,75 mg/kg. Lisäksi Ida-anti-TFR -konjugaatin LD10 oli 8,0 mg/kg Ida-MoAb -konjugaatteja ei testattu LD50-annoksen suhteen. Nämä tulokset osoittavat Ida-MoAb-35 konjugaattien suuremman terapeuttisen indeksin vapaaseen Idaan verrattuna.

20 98706

Taulukko 2

Idarubisiini- monoklonaalinen vasta-aine -konjugaattien vaikutus CBA-hiiriin

Ida (mg/kg) 5 L. D. io L. D. so

Ida 0,75 3,00

Ida-anti-Ly-2.1 10,00 ei testattu

Ida-anti-TFR_15, 00_ei testattu 10 Kudospatologisia tuloksia

Akuutti vaikutus: Vapaan Idan (1,0 mg/kg) antaminen laskimoon johti valkoisen ytimen surkastumiseen pernassa 15 päivää käsittelyn jälkeen ja sydänlihassyiden lievään liikakasvuun (tuloksia ei ole esitetty). Sitä vastoin ei 15 yksi ainoa annos Ida-anti-Ly-2.1:tä (24, mg/kg) aiheuttanut mitään epäspesifistä myrkkyvaikutusta kudoksille 15 ja 30 päivän jälkeen, vaikka päivänä 15 havaittiin jonkin verran hepatosyyttien turvonneisuutta.

Esimerkki 2 20 Materiaalit ja menetelmät

Hiiret (DBA/2 x BALB/c)F,- ja CBA-hiiret oli kasvatettu Melbourne yliopiston patologian laitoksessa. Kussakin kokeessa käytettiin 10-20 hiiren koeryhmiä, joissa kaikki 25 hiiret olivat samaa sukupuolta ja samanikäisiä.

Kasvainsolut Tässä tutkimuksessa tutkittiin solulinjoja (Ly-2+)-hiiren kateenkorvakasvain ITT(1)75NS E3 -muunnos (E3), (L3T4+) -imukudoskasvain-EL4 (Horowitz et ai, Science 1968 30 160, 533-535), ihmisen paksusuolen karsinooman Colo 205 (Semple et ai, Cancer Res. 1978 38, 1345-1355) ja (Ly-2", L3T4') -ihmisen T-soluleukemian CEM (Foley et ai, Cancer 1965 18, 522-529). Soluja ylläpidettiin in vitro kuten on kuvattu esimerkissä 1. P388Dl-makrofaagisolulinjaa ylläpi-35 dettiin in vivo suorittamalla sarja siirtoja (DBA/2 x

II

21 o *? n ' : v i vj BALB/c) Fj-hiiriin. Vesivatsanesteestä peräisin olevat solut pestiin ja sentrifugoitiin (400 g x 5 min) kaksi kertaa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS, pH 7,3), uudelleensuspendoitiin PBSreen ja ruiskutettiin ihon alle 5 hiirten vatsan seinämään, missä ne kehittyivät käsintun-nettaviksi kasvainsiirteiksi. Hiirille annettiin sitten sarja hoitoja laskimoon ja kasvainten koko mitattiin päivittäin suorakulmamittaimella, mitaten kasvainten kohtisuorien akselien suunnassa. Tulokset merkittiin muistiin 10 keskimääräisenä kasvaimen kokona (kahden läpimitan tulo + keskivirhe).

Monoklonaaliset vasta-aineet Käytettiin mallijärjestelmänä monoklonaalisia vasta-aineita hiiren solupinnan antigeenejä L3T4, Ly-2 ja 15 Thy-1 vastaan, jotka ovat tunnusomaisia erilaisille lymfosyyttien alajoukoille.

Käytettiin monoklonaalisia vasta-aineita: (i) anti-Ly-2.1 (hiiren IgG2a), joka kykenee reagoimaan hiiren L6-2.1 -erityisrakenteen kanssa (Horgarth et ai, Immunolo-20 gy 1982 46, 135-144), (ii) H129.19 (anti-L3T4) (rotan

IgG2b), joka kykenee reagoimaan hiiren L3T4-erityisraken-teen kanssa (Pierres et ai, J. immunology 1984 132, 2775-2782) ja (iii) anti-Thy-1 (rotan IgG2b), joka kykenee reagoimaan hiiren T-solujen kanssa (Marshak-Rothstein et 25 ai, J. Immunology 1979 122, 2491-2497). Vasta-aineet eristettiin, puhdistettiin ja säilytettiin kuten on kuvattu esimerkissä 1. Vasta-aineaktiivisuus määritettiin roset-tienmuodostuskokeen avulla käyttäen vasta-ainetta lampaan anti- hiiren immunoglobuliini (SAMG), kuten on kuvattu 30 esimerkissä 1.

Idarubisiini- monoklonaalinen vasta-aine -konju-gaattien valmistus

Monoklonaalista vasta-ainetta (1-2 mg/ml) sekoitettiin 5-20 kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa 14-bro-35 mi-4-demetoksidaunorubisiinia (Br-Ida), joka oli liuotettu 22 98706 (N,N)-dimetyyliformamidiin (10 mg/ml) 4 tunnin ajan pH:ssa 8,9 (0,05 M boraattipuskuriliuos) ja ympäristön lämpötilassa. Reaktio edistyi, puhdistaminen suoritettiin ja saatuun konjugaattiin yhdistynyt Ida-määrä määritettiin kuten 5 on kuvattu esimerkissä 1.

Lääkkeen aktiivisuus

Suoritettiin kaksi koetta (24 tuntia ja 30 minuuttia) lääkkeen aktiivisuuden määrittämiseksi kuten on kuvattu esimerkissä 1, käyttäen solukonsentraatiota 1-5 x 10 106/ml.

Serologia

Kaikissa näissä kokeissa käytettiin rosettienmuo-dostusmenetelmää vasta-ainetiitterin ja L3T4+- ja Ly-2+ -solujen lukumäärien määrittämiseen. Tässä menetelmässä an-15 nettiin SAMGrn, joka myös tunnistaa lampaan punasoluihin (SRC) liittyneen rotan immunoglobuliinin (Ig), sitoutua lymfoidisolujen pinnalla olevien vasta-aineiden toteamiseksi, Ig+-pernasoluista poistettiin pinnan Ig suorittamalla "capping" eli immunoglobuliinimolekyylien yhteenkerää-20 minen SAMG:n avulla (25 μΐ ja 2 ml soluja konsentraationa lOVpl); solut pidettiin sitten jäähauteessa väliaineessa, joka sisälsi 0,01 % natriumatsidia immunoglobuliinin uu-delleensyntetisoinnin estämiseksi.

Tulokset : 25 Tutkimus suoritettiin erillisissä vaiheissa: (a) kolmen erilaisen Ida-MoAb -konjugaatin karakterisointi in vitro ja (b) myöhempi esitys niiden käytöstä T-solualaryh-mien aktiiviseen poistamiseen ennen kasvainsoluallograftin 30 hylkimistä tai sen aikana.

Konjugaattien valmistus ja karakterisointi

Br-Ida liitettiin kovalenttisesti hiiren antigeenien L3T4, Ly-2 ja Thy-1 vastaisiin monoklonaalisiin vasta-aineisiin. Reaktio-olsouhteet liittämistä varten etsit-35 tiin vaihtelemalla monoklonaalisten vasta-aineiden jouk-

II

98706 23 koon lisättävän Br-Idan molaarista ylimäärää ja tekemällä kompromissi suuremman Ida-määrän yhdistymisen ja alempien proteiinien takaisinsaantien välillä- Ida-anti-L3T4 (kuvio 13), Ida-anti-Ly-2.1 ja Ida-anti-Thy-1 (tuloksia ei ole 5 esitetty) olivat sitoneet 3-6 molekyyliä Idaa proteiinin takaisinsaantien ollessa suurempia kuin 50 %.

Vasta-aineaktiivisuus

Vasta-aineen tiitterit ennen liittämistä ja sen I jälkeen mitattiin rosettienmuodostusmenetelmän avulla ja 10 määrättiin laimennokseksi, jossa 50 % E3-kohdesoluista osallistui rosettien muodostamiseen. Ida-anti-Thy-1 -kon-jugaattien, jotka sisälsivät 1, 4 ja 7 molekyyliä Idaa, vasta-ainetiiteerit olivat vastaavasti 1:425 000, 1:170 000 ja 1:130 000, kun sen sijaan muuttamattoman vas-15 ta-aineen tiitteri oli 1:550 000 (kuvio 14). Vasta-aineak-tiivisuus vähenee siten, jonkin verran Idaan liitettäessä; in vitro ja in vivo -tutkimuksissa käytettiin kuitenkin konjugaatteja, jotka sisälsivät vähemmän kuin 4 Ida-mole-kyyliä monoklonaalisen vasta-aineen molekyyliä kohden.

20 Samalla tavoin oli sekä Ida-anti-Ly-2.1- että Ida-anti- L3T4 -konjugaattien vastaaineaktiivisuus vähentynyt huomattavasti (tuloksia ei ole esitetty), kun oli liittynyt enemmän kuin 6 Idamolekyyliä monoklonaalisen vasta-aineen molekyyliä kohden.

25 Lääkkeen aktiivisuus in vitro

Ida-MoAb -konjugaattien solumyrkkyvaikutusta testattiin erilaisiin reagoimaan kykeneviin kohdesoluihin käyttäen 24 tunnin koetta ja verrattiin vapaan Idan vaikutukseen. Vapaan Idan aktiivisuus oli 4-10 kertaa suurempi 30 kuin Ida-MoAb -konjugaattien, ja vapaan Idan I.D.5Q

([3H-]tymidiinin oton 50 % estyminen kontrolleihin verrattuna) oli 6,6-9,0 x 10'8M testattua kasvainsolulinjaa vastaan. Oli selvää, että Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaatti oli solumyrkkyvaikutukseltaan voimakkain konjugaatti (I.D.50 = 35 4,3 x 10'7M) testattuna ITT(1)75NS E3 -solulinjaa vastaan, 98706 24 joka on alkuperäisen solulinjan runsaasti Ly-2 -antigeeniä omaava muutos. Tarkoituksena tutkia konjugaattien vaikutuksen selektiivisyyttä kohdesoluille inkuboitiin Ida-MoAb -konjugaatteja 3 minuutin ajan kohdesolujen kanssa ennen 5 kuin sitoutumaton konjugaatti pestiin pois ja mitattiin solumyrkkyvaikutus. 30 minuutin koetta käytettäessä oli reagoimaan kykenemättömien Ida-MoAb -konjugaattien I.D.50 10-50 kertaa suurempi kuin vapaan Idan, mikä osoitti, että vasta-aineen sitoutuminen oli oleellista IdaMoAb -konju-10 gaatin solumyrkkyvaikutukselle. Huomattakoon, että yhdelläkään tutkimuksessa käytetyistä monoklonaalisista vasta-aineista ei ollut solumyrkkyvaikutusta kohdesoluihin in vitro komplementin puuttuessa. Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 3.

15

Taulukko 3

Idarubisiini- monoklonaaninen vasta-aine -konjugaattien vaikutus

Keskimääräinen I.D.50 kasvainsoluilla1 20 Keskimääräiset I.D.S0-arvot (Ida (M)), jotka on määritetty yhdisteille

Kasvain- Koe Ida Ida-anti- Ida-anti- Ida-anti- solulinja Ly-2.1 L3T4 Thy-1 E3 24 t2 7,8x10-® 4,3xl0-7 N.T. 9,0xl0'7 30 min3 l,8xl0'7 4,3xl0-7 N.T. I,2xl0'6 25 EL4 24 t 6,6x10'® N.T. 6, OxlO'7 N.T.

30 min Ι,βχΙΟ'7 N.T. 6,2xl0'7 N.T.

CEM 24 t 9,0x10’® N.T. N.T. N.T.

30 min 2,2xl0-7 δ,ΟχΙΟ’6 N.T. N.T.

Colo 205 24 t 8,0x10-® N.T. N.T. N.T.

30 30 min l,2xl0~7 N.T._4,0xlQ-6 5,8xl0~6 ^.D.so = [3H]-tymidiinin oton 50 % estyminen kontrolleihin verattuna 2Käyttäen 24 tunnin solumyrkkyvaikutuskoetta 35 3Käyttäen 30 minuutin koetta N.T. = ei testattu 98706 25

Idarubisiini- monoklonaalinen vasta-aine -konju-gaattien tehokkuus in vivo

Ida-MoAb -konjugaattien tehokkuutta immuunivastetta vaimentavina aineina in vivo verrattiin pelkän monoklonaa-5 lisen vasta-aineen tehokkuuteen testaamalla konjugaattien kykyä poistaa selektiivisesti L3T4+- tai Ly-2+ -soluja pernasta. CBA-hiiret saivat neljänä ruiskeena laskimoon an-ti-Ly-2.1- tai anti-L3T4 -konjugaattia (30 pg Idaa/1,5 mg MoAb) päivinä 0, 2, 5 ja 10, ja Ly-2+- tai L3T4+ -solujen 10 lukumäärää pernassa tarkkailtiin rosettienmuodostamisko- keen avulla. Kummankin käsittelyn tapauksessa tutkittiin kahden käsitellyn hiiren pernasolut kunakin päivänä ja laskettiin tulosten keskiarvo (kuvio 15). Tapahtui nopea L3T4+-solujen lukumäärän pieneneminen suurin piirtein mää-15 rästä 30 % kaikista perna soluista normaalilla hiirillä päivänä 0 suurin piirtein määräksi 4 I Ida-anti-L3T4:llä käsitellyillä hiirillä päivänä 20. Nämä L3T4+-solut pysyi-vät vähentyneinä yli 60 päivän ajan ennen kuin havaittiin asteittaista lisääntymistä. Poistuminen, joka seurasi in 20 vivo -käsittelyä pelkällä anti-L3T4:llä, johti myös L3T4+ -solujen lukumäärien jyrkkään pienenemiseen (30 %:sta 5 %:iin).

Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaatti vähensi perna Ly-2+-so-lujen lukumääriä 25 %:sta 5 %:iin päivään 10 mennessä; • 25 Ly-2+ -solujen lukumäärä alkoi kuitenkin kohota päivään 15 mennessä ja palasi normaaliksi päivään 40-50 mennessä. Oli mielenkiintoista, että pelkkä anti-Ly-2.Ι-MoAb -konjugaatti ei kyennyt poistamaan Ly-2 soluja merkittävästi; Ly-2+-ja L3T4+ -solujen lukumäärien vaihtelun käsittelemättömillä 30 kontrollihiirillä otaksuttiin johtuvan luonnollisesta hiirten välisestä vaihtelusta. Siten oli selvää, että sekä Ida-anti-L3T4 että Ida-anti-Ly-2.1 kykenivät poistamaan L3T4+- tai Ly-2+ -soluja, vastaavasti, käsiteltyjen hiirten pernasta paljon tehokkaammin kuin pelkkä monoklonaalinen 35 vasta-aine. Ida-anti-Ly-2.1 -konjugaatin vaikutus on tär- 98706 26 keä, koska anti-Ly-2.1-MoAb on täysin vailla vaikutusta yksin käytettynä, mutta voidaan muuttaa tehokkaaksi immuunivastetta vaimentavaksi aineeksi kytkemällä se Idaan. Lääkeaine-MoAb -konjugaattien aikaansaama poistuminen so-5 pii sen vuoksi Ly-2+- ja L3T4+ -solujen tehtävän tutkimiseen in vivo siirteenhylkimisreaktiossa.

Ida-anti-L3T4:n, Ida-anti-Ly-2.1:n ja Ida-anti-Thy-l:n vaikutus kasvainsiirteen säilymiseen Näissä kokeissa käytettiin Ida-anti-L3T4-, Ida-an-10 ti-Ly-2.1- ja Ida-anti-Thy-1 -konjugaatteja pidentämään P388Dl-kasvainsiirteiden säilymisaikaa CBA-hiirillä, jolloin allograftit oli siirretty H-2 (luokat I ja II) ja ei-H-2-esteiden yli.

a) Yhdistetty konjugoimiskäsittely 15 10-15 CBA-hiiren ryhmille ruiskutettiin ihon alle 8,0 x 106 P388Dl-kasvainsolua ja ne saivat laskimoon päivinä -1, 0 (= kasvaimen istuttamisen päivä), 3, 5 ja 10 yhtä seuraavista: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 ja anti-Ly-2.1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-Ly-2.1 ja (v) Ida-anti-L3T4 20 ja Ida-anti-Ly-2.1. Saatu kokonaismäärää Idaa ja mono-klonaalista vasta-ainetta oli 125 pg ja 5,75 mg, vastaavasti. Sekä PBSrllä että monoklonaalisella vasta-aineella hoidettujen hiirten kasvainsiirteet säilyivät 14-17 päivän ajan, kasvaimen maksimaalisen keskimääräisen koon ollessa . 25 0,31 cm2, mikä osoitti, että kummatkin konjugoimattomat monoklonaaliset vasta-aineet yhdessä olivat kykenemättömiä poistamaan tehokkaasti L3T4*- ja Ly-2+ -soluja siten että kasvainsiirre voisi säilyä (kuvio 16). Lisäksi Ida-anti-Ly-2. 1 tai Ida-anti-L3T4 yksin kykenivät ainoastaan pit-30 kiitämään siirteen säilymistä (päivä 20-28) kasvainten maksimaalisten keskimääräisten kokojen ollessa 0,40 cm2 -0,50 cm2. On todennäköistä, että Ida-anti-Ly-2.1 tai Ida-anti-L3T4 yksin ei poistanut kaikkia T-soluja, ja vahva antigeenihaaste (jollainen esiintyy täydellisten MHC-ero-35 jen yhteydessä) kykeni stimuloimaan jäljellä olevia Ly-2+- 27 98706 ja L3T4 +-soluja lisääntymään ja synnyttämään hylkimisreaktion. Sitä vastoin Ida-anti-L6-2.1- ja Ida-anti-L3T4 -kon-jugaattien yhdistelmä sai 14-15 P388Dl-kasvainsiirteen välttämään hylkimisen ja koon kasvamaan kunnes hiiret ta-5 pettiin (päivä 50-2,00 cm2). Todettiin, että muutamilla näistä konjugaateilla käsitellyistä P388Dl-kasvaimista ilmeni jonkin verran koon takautumista päivinä 8-16. Jatkuva L3T4+- ja Ly-2+ -solujen poistaminen (päivä 10) mahdollisti kuitenkin P388 Dl-kasvainsiirteiden kasvamisen tasaisen 10 kasvun alkuun pääsemisen.

(b) Ida-anti-Thy-1 -konjugaatti 10 CBA-hiiren ryhmille ruiskutettiin ihon alle 101 P388Dl-kasvainsolua ja ne saivat laskimoon yhtä seuraavis-ta päivinä -1, 0, 5 ja 6: (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 ja 15 (iii) Ida-anti-Thy-1. Saatu kokonaismäärä Idaa ja anti-Thyl:tä oli 130 pg ja 5,4 mg, vastaavasti, ja PBS:11a käsiteltyjen hiirten kasvainsiirteet säilyivät 15 päivän ajan. Pelkkä anti-Thy-l-MoAb huolehti kasvainsiirteen säilymisestä 28-32 päivän ajan, kasvaimen maksimaalisen kes-20 kimääräisen koon ollessa 0,58 cm (päivä 6) (kuvio 17). Ida-anti-Thy-1:llä käsitellyillä hiirillä oli 30 % kas-vainsiirteistä torjuttu täydellisesti päivään 40 mennessä, kun sen sijaan jäljellä olevat 70 % jatkoivat kasvamista, saaden lopuksi (päivä 32) ryhmän keskimääräisen kasvain-25 koon suurenemaan. Siten Ida-anti-Thy-1, samoin kuin Ida-anti-Ly-2.1:n ja Ida-anti-L3T4:n yhdistelmä, kykeni poistamaan Ly-2+- ja L3T4+ -soluja niin että suurin osa P388Dl-kasvainsiirteistä säilyi CBA-hiirillä normaalin nopean hylkimisreaktion puuttuessa.

30 Esimerkki 3

Valmistettiin esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaan Idan ja monoklonaalisen vasta-aineen 17.1 (Thompson et ai, Proc. Natl. Cancer Inst. 70, 409-419, 1983; hiiren IgG2a) ja Idan ja monoklonaalisen vasta-aineen 30.6 35 (Thompson et ai, Br. J. Cancer 47, 595-605, 1983; hiiren » 98706 28

IgG2b) välisiä konjugaatteja. Istutettiin ihmisen paksusuolen karsinooman Colo 250 -soluja (30.6+, 17,1’) ihon alle paljaille hiirille 8 x 106 solua/hiiri kuten on kuvattu esimerkissä 2. Hiirille, joille oli suoritettu istutta-5 minen, annettiin sitten sarja hoitoja i.p. Kasvainten koko mitattiin suorakulmamittaimella, mitaten kasvainten kohtisuorien akselien suunnassa. Tulokset ilmoitettiin keskimääräisenä kasvaimen kokona (kahden läpimitan tulo + keskivirhe) . Tulokset on esitetty kuviossa 18.

10 Esimerkki 4

Valmistettiin esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaan Idan ja monoklonaalisen vasta-aineen 17.1, Idan ja monoklonaalisen vasta-aineen JGT-13 (hiiren IgGl, kykenee reagoimaan paksusuolen karsinoomassa olevan karsinoembryo-15 naalisen antigeenin kanssa, mutta ei normaalien kudosten kanssa) ja Idan ja monoklonaalisen vasta-aineen 27.1 (hiiren IgGl, kykenee reagoimaan lukuisissa paksusuolen kasvaimissa olevan ihmisen maitorasvapallosantigeenin kanssa) ja Idan ja monoklonaalisen vastaaineen 30.6 välisiä kon-20 jugaatteja. Istutettiin paljaille hiirille ihon alle LIM2210-ihmisen paksusuolen kasvain -ksenografti (1-5 mg) . Hiirille, joille oli suoritettu istuttaminen, annettiin sitten sarja hoitoa laskimoon. Kasvainten koko mitattiin suorakulmamittarilla, mitaten kasvainten kohtisuorien ak-: 25 selien suunnassa. Tulokset ilmoitettiin keskimäärinä kas vaimen kokona (kahden läpimitan tulo + keskivirhe). Tulokset on esitetty kuviossa 19.

Claims

98706

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen immu-noglobuliinikonjugaatin valmistamiseksi, joka käsittää 5 ihmisen kasvaimelle spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen tai sen palasen, joka sisältää ainakin yhden antigeenin sitoutumiskohdan, ja 14-halogeeni-idarubisiinia, tunnettu siitä, että (a) sekoitetaan mainittu monoklonaalinen vasta-aine 10 tai sen palanen 0-50 kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa 14-halogeeni-idarubisiinia veteen sekoittuvassa liuottimessa, (b) annetaan seoksen reagoida lämpötilassa 18 - 37 °C, 1-8 tunnin ajan, 15 (c) poistetaan mahdollinen saostuma, (d) poistetaan reagoimattomat lähtöaineet geelisuo-datuksen avulla, (e) poistetaan vapaa idarubisiini adsorptiokromato-grafian tai ioninvaihtokromatografian avulla, ja 20 (f) mahdollisesti immunoglobuliinikonjugaatin for muloidaan farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai lai-mentimen kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 14-halogeeni-idarubisiini on 25 14-bromi-idarubisiini.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine tai sen palanen on spesifinen ihmisen transferriinin reseptorille .

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine tai sen palanen on spesifinen rinta-, paksusuoli-, keuhko-, eturauhas- tai munasarjakasvaimelle. 98706