PT86960B

PT86960B - Processo para a preparacao de conjugados de imunoglobulina

Info

Publication number: PT86960B
Application number: PT86960A
Authority: PT
Inventors: Ian Farquhar Campbell Mckenzie; Geoffrey Allan Pietersz; Mark John Smyth
Original assignee: Univ Melbourne; Erba Farmitalia
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1992-06-30
Also published as: CN88101810A; ES2006109A6; PT86960A; US5798097A; CH678815A5; JPS63301832A; JP2736255B2; HUT46547A; DE3808166C2; CN1045621C; MY103231A; NZ223834A; ATA67488A; DE3808166A1; DK131588A; GB2203154B; NO881105L; FR2612074B1; GB2203154A; CZ281193B6

Description

«PROCESSO Para a PREPARAÇÃO D J

A presente invenção está relacionada com conjugados de imunoglobulina, com a sua preparação e utilização.

conceito tes antineoplásticos para nticorpos monoclonais (lioAbs), é um significado te rapêutácoê, usualmente, apreciado. De um modo geral as vi envolvem a produção de conjugados de anticorpos e de agentes não tóxicos, capazes de, selectivamente, localizarem e destruirem células tumorais. Principalmente, a atenção tem sido dirigida para a construção de imunotoxinas a partir das ca deias. A de anticorpos e de toxinas de plantas e bactérias de tal modo que os seus antigénios de ligação e de penetração conduzam à morte da célula, la prática, muitos EoAbs que se julgam ser específicos para tumores, também são reactivos com subpopulações de células normais e, consequentemente, pode ser irreallstico usar essas toxinas potentes devido ao seu perigo potencial sobre os tecidos normais. Uma alternativa segura para toxinas de plantas tem sido ligar anticor

- 2 pos a fármacos convencionais anticancro tais como duxorubicina, vindesina, clorambucil, melfalan e metotrexato. Devido aos efeitos tóxicos não específicos dos agentes antineoplásticos habitualmente utilizados, têm sido feitas tentativas para aumentar o seu index terapêutico mediante a ligação destes a í£oAbs para antigênios tumorais.

As tentativas nara suprimir a rejeição de enxertos de células T derivadas do timo tem sido focado frequentemente na redução da actividade das células T median te utilização de globulina antitimocitos. ?ace, recentemente, ao desenvolvimento de anticorpos monoclonais, tem sido possível definir subconjuntos de células T de acordo com a sua função in vitro e com a presença de antigênios de superfície específicos definidos por moAb, Sste facto tem estimulado a pesquisa de um mecanismo através do qual a rejeição do transplante de controle de células T que se concentre na divisão principal nos subconjuntos auxiliar/indutor e citotóxico/supressor definidos por antigênios murinos L3'24 e Ly-2. Ainda que o anticorpo monoclonal 0KT3 θ o reagente anti-pan células Ϊ, tenham mostrado potência in vivo, num estudo recente descobriu-se que 20 LoAbs para 20 antigênios diferentes de linfócitos murinos não possuem acção in vivo nos murganhos e são, portanto, inadequados para estudos in vivo, É portanto apropriado examinar os meios através dos quais estes anticorpos monoclonais altamente específicos se podem tornar mais potentes e eliminarem completamente as células alvejadas. Uma dessas vias é a utilização de fármacos citotoxicos ligados co... anticorpos monoclonais.

- 3 0 potencial clínico dos conjugados fármaco

-MoAb, abrange a imunoquimioterapia do cancro e a redução de várias perturbações imuno-regul adoras e rejeição dos alotransplantes. Diversos estudos demonstraram a citotoxicidade específica de toxinas e fármacos em células tumorais quando ligados a anticorpos monoclonais provenientes de antigénios associados a tumores. Contudo tem sido dirigida com menos ênfase a utilização in vivo de conjugados de fármacos-MoAb para irradiar células 1’ e para investigar a imuno-regulaçao de células f na rejeição de tecidos transplantados ainda que tenham sido utilizados largamente in vitro, conjugados toxina-anticorpo para irradiar células T antes da transplantação de medula óssea.

Um importante grupo de agentes antineoplãsticos utilizado na quimioterapia do cancro sao as antraciclinas, entre as qiais a doxorubicina e daunorubicina têm demonstrado eficácia sobre os tumores sólidos, A ligação de daunorubicina e doxorubicina com anticorpos, contudo, resulta numa perda substancial da actividade do fármaco quando a ligação é realizada através do grupo amina. Recentemente a daunorubicina foi ligada a anticorpos monoclonais através âo átomo de carbono 14 utilizando-se a bromodaunorubicina» listes conjugados demonstraram actividade in vitro. Contudo nao foram escritos quaisquer estudos in vivo (Gallego et al, Int. J. Câncer, 1934 33 737 - 744). Além disso demonstrou-se que os conjugados de daunorubicina-ãíoAb evidenciam uma toxicidade nao específica nas concentrações superiores s,

Descobriu-se

que a idarubicina (4-deraetoxidaunorubicina, Ida) pode ser ligada a anticorpos monoclonais e que os conjugados possuem uma actividade antitumor selectiva e potente in vitro e in vivo. A toxicidade não específica de conjugados de Ida-aoAb não foi evidenciada in vivo com as concentrações menores que 8,0 mg/kg. Os conjugalos de Ida-LloAb possuem uma eficácia superior in vitro e in vivo do que os conjugados de daunorubicina-monb.

Além disso avaliou-se a capacidade los conjugados de Ida-KoAb para irradiar de uni modo específico populações celulares madiante ligação da Ida a EoAbs conhecidos como reagindo com diferentes subpopulações de linfócitos (L3T4⁺, Ly-2⁺ e Thy-1⁺). Também se descobriu que a depleção das células é um método surpreendentemente eficaz. Por exemplo o anticorpo monoclonal anti-Ly-2.1, cujo efeito não é mensurável in vivo nas células Ly-2.1⁺, pode ser convertido num agente citotôxico efectivo mediante ligação com o agente citotôxico Ida.

Utilizando-se anticorpos monoclonais para os antigénio Ly-2 e L3P4, demonstrou-se presentemonte que a Ida-rMoAb pode eliminar células-alvo in vitro e in vivo. Os conjugados de Ida-koAb podem ser providos de um potencial superior para depletar especificamente sobre conjuntos de células 1’ responsáveis pela rejeição de tecidos transplantados do que as globulinas antilinfóeitos ou reagentes anti-pan-células-T, tais como os anticorpos monoclonais 0KT3·

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se conjugados de imunoglobulina que compreendem um con-

jugado de Ida com um anticorpo monoclonal ou com um seu fragmento que possui pelo menos um dos sítios de ligação antigénica do anticorpo.

A Ida está descrita na patente de invenção norte americana US-A-4077988. De preferência duas a oito, ou mais preferivelmente duas a seis moléculas de Ida ligam-se co-valentemente a cada anticorpo ou moléculas de fragmen to de anticorpo. As moléculas de Ida sao, geralmente, mas não necessariamente, conjugadas na posição 14 do anticorpo monoclonal do seu fragmento. De preferencia estão ligadas directamente ainda que seja possível interpor um veículo inerte ou agente de ligação. Contudo, a Ida pode ser ligada a um anticorpo monoclonal ou a um fragmento do anticorpo através do grupo amina. Pode conseguir-se esta ligação utilizando-se um peptido degradável corno agente de espaço ou um dextrano como veículo e um espaçador sensível ácido ou grupos de ácido poliglutamico que se utilizam para a ligação incluindo os grupos carboxílicos ácidos de ácidos poliamínicos sintéticos tais como o ácido poli-L-glutâmico e o ácido poli-L-aspârtico ou proteínas inertes como a soroalbumina humana ou os dextranos funcionais tais como o carboximetil dextrano que podem actuar como veículos. Bstes veículos podem estar presentes numa escala de dimensão entre 10 a 60 Kilodaltons.

Tipicamente, cada anticorpo ou fragmento de anticorpo é específico para um antigênio na superfície das células, contra o qual é desejável alvejar a Ida. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser especíb -

fico para o tecido-alvo desejado tal como um neoplasma humano. Exemplos de neoplasnias humanos contra os quais podo ser desejável alvejar a Ida, são os cancros da mama, cólon, pulmão, próstata, ovário, timo e outros cancros, sarcomas e leucemias. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser específico de modo alternativo para um neoplasma animal. Pode ser utilizado um anticorpo ou fragmento de um anticorpo específico para o receptor de transferrina humana (TPR) que está presente nas células em divisão, nas células percursoras de eritrócitos e células de una variedade do tumores.

Um anticorpo monoclonal anti-TPR aproprialo pode ser o que se fornia contra o receptor de transferrina nas células LiCR-LOD-HNy-2 (ffiy-2).

Quando os conjugados de ímunoglobulina são destinados para a utilização na depleção de uma população de linfócitos T específica, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é específico para um sntigénio de superfície celular sendo ele próprio específico para esses linfócitos T. 0 anticorpo ou fragmento de anticorpo pode então ser específico para uma população de linfócitos auxiliares, supressores ou linfócitos Ϊ citotóxicos.

De preferencia o anticorpo ou fragmento de anticorpo é da espécie da que o conjugado imunoglobulina vai ser administrado. Portanto, para o ser humano utiliza-se tipicamente um anticorpo monoclonal murino ou humano onde se projectava administrar o conjugado. Também é preferível que o anticorpo ou fragmento de anticorpo seja da cias se de IgG. 0 fragmento do anticorpo pode ser um fragmento

-⁷ - L·^ í

Fab, Fab’ ou F(ab’)o· Também se pode utilizar um monómero £— de IgM que pode ser derivado do anticorpo IgLI mediante digestão enzimática proteolítica.

Os conjugados de imunoglobulina sâo preparados, de acordo com a presente invenção, por um processo que consiste na conjugação de Ida com o anticorpo monoclonal ou com o seu fragmento. De preferencia faz-se reagir uma 14-halogeno-Ida com o anticorpo monoclonal ou o seu fragmento. 0 substituinte na posição 14 pode ser flúor, cloro, bromo ou iodo mas será de preferência bromo. A 14-bromo-Ida está descrita na patente de invenção norte-americana A-4125607* A conjugação pode ser obtida por um processo que consiste:

(a) em se misturar um anticorpo monoclonal a um seu fragmento com um excesso molar de

14-h.al ogeno -I da;

(b) em se fazer reagir esta mistura a uma temperatura compreendida entre 13° e 37°C;

(c) em se remover qualquer precipitado formado ;

(d) em se eliminarem os materiais iniciais que não reagiram, mediante filtração de gel; e (e) em se remover a Ida absorvida mediante cromatografia de adsorção ou cromatografia de permuta iónica.

passo (a), realiza-se, tipicamente, no seio de um dissolvente orgânico miscível coiíi a água como a ΐί,ΙΙ-

i

-dimetilformamida. D© preferencia o ©zcesso molar de 14-halogeno-Ida, utilizado no passo (a), está compreendido entre 0 a 50 vezes, no passo (b), de preferência efectua-se a reacção durante um período entre 1 a 3 horas. Tipicamente a reacção realizasse à temperatura ambiente.

Contudo, podem ser utilizados outros métodos de conjugação.

Quando se necessita de um conjugado que incor pore um veículo inerte ou agente de ligação entreposto entre a Ida e o anticorpo monoclonal ou um fragmento do anticorpo, o veículo ou ligante é, tipicamente, ligado ao átomo de carbomo C-14 de Ida e em seguida ligado ao anticorpo ou ao fragmento do anticorpo. Tal como se referiu antes, também se pode ligar o anticorpo ou o fragmento do anticorpo a Ida através do grupo amina utilizando-se um espaçador peptídico degradável, um veículo de dextrano, um espaçador sensível ao ácido ou um ácido poliglutâmico.

Os conjugados de imunoglobulina desta invenção podem ser utilizados para tratar um ser humano ou um outro mamífero portador de um cancro. Deve ser administrada uma quantidade, terapeuticamente eficaz, do conjugado. 0 cancro pode ser um tumor sólido, um tumor ascítico ou uma leucemia. Os neoplasmas humanos que podem ser tratados estão mencionados anteriormente. Podem ser administrados dois ou mais conjugados em que o anticorpo monoclonal ou o fragmento do anticorpo de cada conjugado possua uma especificidade diferente.

e utilizar-sc

via sa. Este também pode ser administrado localmente ou directainente no tumor.

um doente, dependerá da variedade de factoros .GA· tais como o tumor a ser tratado e o estado do doente. Contudo, tipica mente, pode ser administrada unia dose compreendida entre 10 a 200 mg por m de área corporal do doente. Os conjugados podem ser administrados com outros agentes quisioterapsuticos ou com agentes que reforcem activilade cios conjugados, por exemplo agentes vasoactivos ou factor de necrose de tu mor.

Os conjugados de imunoglobulina também podem ser utilizados para fazerem à depleção específica de um subconjunto de linfócito ο X θ istente numa populaçao de células» Pode ser administrada a um ser humano ou a um animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado, que incorpore um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo dirigido contra o antigsnio de superfície celular presente em linfócitos a serem eliminados. Alternativamente pode ser incubada uma população celular in vitro com esse conjugado.

Pode também utilizar-se uma associação de conjugados dirigidos contra dois ou mais antigénios de supor fície celular. Os linfócitos a eliminar podem consistir em linfócitos auxiliares, supressores ou células S citotóxicas.

Este aspecto da presente invenção pode ser utilizado para impedir a rejeição de tecido transplantado por parte de um receptor da transplantação. Os conjugados

também podem ser utilizados como agentes imuno-supressores. Uma quantidade de conjugado eficaz para impedir a rejeição do transplante é administrada ao receptor de transplantação. De preferencia, nestas condições, são as células ‘1’ citotóxicas que são eliminadas. Um ser humano ou um animal com um cancro pode ser tratado por eliminação das células T supressoras mediante a administração de um conjugado apropriado.

As doenças de auto-imunidade podem sei’ tratadas por administração de um conjugado com a finalidade ds eliminar as células T auxiliares. Uesta circunstância, a via ãe administração e a dose do conjugado são as mencionadas antes.

Os conjugados de imunoglobulina são formulados sob a forma de composições farmacêuticas conjuntamente com um veículo ou dissolvente aceitável em farmácia. rode ser utilizado qualquer dissolvente ou veículo adequado. Sao veículos apropriados e dissolventes as soluções de cloreto de sódio fisiológicas e a solução de dextrose de Ringer.

Os UXSMPLG3 que se seguem ilustram a presente invenção. Os desenhos que a acompanham, Piguras de 1 a 12, descrevem o EXULIELO 1 e as Piguras de 13 a 17 referem-se ao UXEiUPLO 2. Eais particularmente:

A Pigura 1 representa a estrutura dos derivados da antraciclina;

A Pigura 2 representa a ligação de idaru.bicina (Ida) com anti-Ly-2.1 (0,5 mg). Os moles de Ida incorporados por mole de anti-Ly-2.1(w)(ordenada do lado esquerdo) e a proteína recolhidã·)(ordenada do lado direito) estão repre-

sentados em função do número denmoles de Ida na mistura reaç cional (abcissa);

A Figura 3 representa o título de anticorpo medido sob a forma de percentagem de células formadoras de rosette” (ordenada) versus diluição do anticorpo (-1) (abcissa) de conjugados anti-Ly-2.1 nas células-alvo IfT(l) 75 IíS 23. Realizaram-se uma série de diluições sobre uma solução de 0,5 mg/ml de anti-Ly-2.1 (Jk) ou anti-Ly-2.1 com 2(·) ou 8 (o) moles de Ida/mole de anticorpo;

A Figura 4 representa o efeito inibidor de Ida () ou Ida-anti-Ly-2.1, 5 moles de Ida/mole de anticorpo, (·) sobre a incorporação de células .13 (ordenada) colocada versus concentração de Ida (II) (abcissa);

A Figura 5 representa o efeito inibidor de

Ida (), Ida-anti-xiy-2.1, 5 moles de Ida/mole de anticorpo (·) ou Ida-anti-IFR, 5 moles Ida/mole de anticorpo (o) sobre células 23 (Ly-2⁺) durante o ensaio de inibição de 30 minutos en que a percentagem de inibição da incorporação de /¾⁷ timidina (ordenada), é colocada versus concentração de Ida (11) (abcissa);

A Figura b representa o efeito inibidor de Ida-anti-Ly-2.1, 5 moles Ida/mole de anticorpo (o) e conjuga do mais anti-Ly-2.1 (·) sobre células-alvo 33 num ensaio de especificidade durante 30 min. em que a percentagem de inio bição de incorporação de Z” ^JE7 timidina (ordenada) está colocada versus concentração de Ida(II) (abcissa);

A Figura 7 representa o desenvolvimento de timoma 33 em murganhos CBF, injectados por via subcutânea com 2 x 10° células. Administrou-se por via endovenosa os tratamentos assinalados por uma seta; FBS (n), Ida (®), anti -Ly-2.1 (à), Ida-anti-TFR (o) ou Ida-anti-Ly-2.1 (·). A dip _z riensao média do tumor em cm (ordenada) está colocada versus dias após inoculação do tumor (abcissa). As barras de erro representam + o erro-padrão da média;

A Figura 8 representa as curvas de desenvolvi mento de tumor individual de murganhos CBF, injectados por via subcutânea can 2,0 x 10° células tumorais 03 e tratados por via endovenosa nos dias 4 θ 5 com o conjugado Ida-aati-Ly-2.1. A dimensão do tumor em cm (ordenada) está colocada versus dias após a inoculação do tumor (abcissa);

A Figura 9 representa o desenvolvimento de timoma 33 em murganhos OBF, injectados por via subcutânea com 3,0 x 10 células, Grupos de 10 murganhos foram injectados por via endovenosa com os tratamentos indicados pelas setas; PB3 (□); anti-Ly-2.1 (A), Ida (®) ou conjugado Ida-anti-Ly-2.1 (·). A dimensão do tumor média em cm ordenada está colocada versus dias após a inoculação do tumor (abcissa). As barras de erro representam + o erro-padrão da média; e

A Figura 10 representa o desenvolvimento de timoma E3 em murganhos (JBF, injectados por via subcutânea com 3,0 x 10 células. Grupos de 10 murganhos foram administrados com tratamentos por via intratumoral representados

- 13 por uma seta; PBS (O); anti-Ly-2.1 (à), Ida (#) ou conjugado Ida-anti-Ly-2.1 (·). A dimensão média do tumor em cm (ordenada) está colocada versus dias após a inoculação do tumor (abcissa). As barras de erro representara + ⁰ erro-padrão da média;

A Figura 11 representa o desenvolvimento de xenotransplantes de tumores humanos COLO 205 em murganhos nus injectados por via subcutânea com 2 x 10 células. Grupos de 10 murganhos foram administrados com os tratamentos seguintes por via endovenosa indicados por uma seta; PBS (δ); isento de Ida (♦), conjugado de Ida-250-30.6 (·), mistura de Ida e 250-30.6 (O) e 250-30.6 (δ). A dimensão do tumor média em cm (ordenada) está colocada versus dias após inoculação do tumoral (abcissa). As barras de erro representam + o erro-padrão da dimensão do tumor média;

A Figura 12 representa as curvas de desenvolvimento tumoral individual de murganhos nus xenotransplantados tratados por via endovenosa (seta) com o conjugado Ida-250-30.6. A linha a tracejado representa a dimensão do tumor média em murganhos tratados com PBj. A dimensão do tumor em cm (ordenada) está colocada versus dias após a inoculação do tumor (abcissa);

A Figura 13 representa a ligação de idaruoicina com anti-L3T4 (0,5 mg). Os moles de Ida incorporados por mole de anti-L324 (♦) (ordenada pelo lado esquerdo) e a proteína recolhida (·) (ordenada do lado direito) estão representados sob a forma de função do número de nades de

Ida na mistura reaccional (abcissa);

A Figura 14 representa o título de anticorpo medido roseta sob a forma de percentagem de células ãe formação de (ordenada) versus diluição do anticorpo (xlO”¹) (abeissa) de conjugados de anti (1)

753 S E3. As diluições tir conjugado anti

-Thy-1 (♦) com (o), 4 (·) ou 7 (0) miti-Ahy-1;

de o trata mento com Ida-moAb e AoAb no número de células las Ly-2⁺ no passo

L3T4* e ccluOOl-i OL 2L * não tratados (D-d) em que as telas formadoras percentagem (ordenada) estão colocadas versus dias em abcissa;

mento combinado com conjugado que sobreviveram a um enxerto neahaiBS diferenças H-2). Grupos de 10 a 15 murganhos foram in_A Ô z jectados por via subcutânea com 3,0 x 10 células tumorais

P388D1 e receberam uma das seguintes composições por via endovenosa (sota): (i) PB3 (♦), (ii) anti-L324 e anti-Ly-2,1 (v) Ida-anti-L3T4 e Ida-anti-Ly-2.1 (<). A dimensão do tumor f ' 2 z média em cm (ordenada) está colocada versus dias após ino

culação do tumor (abcissa). as barras do erro representam + o erro padrão da média;

A Pigua 17 representa o efeito do conjugado

Ida-anti-Thy-1 em sobreviventes de murganhos CBn com transplante de tumor P388’01. Grupos de 10 murganhos foram injectados por via subcutânea com 1,0 x 10^ células tumorais P388D1 e receberam por via endovenosa (seta) um dos seguintes tratamentos: (i) PBS (n), (ii) anti-Thy-1 (·) e (iii) ,2

Ida-anti-Phy-l (à). A dimensão do tumor média em cm (ordenada) está colocada versus dias após inoculação do tumor (abcissa). As barras de erro representam + o erro-padrão da média;

A Pigura 13 representa o desenvolvimento de xenotransplante COLO 205 (30·δ⁺, 17,1⁺) em murganhos nus injectados cada um com 8 x 10 células. Grupos de 10 murgartos foram tratados por via intraperitonal, (indicado pela seta) com PBS (□); 17,1-Ida (o); 30,ó-Ida (δ) ou uma mistura dej^ó^tee 17,1 -Ida (·). A dimensão do tumor média em cm⁴ (ordenada) está colocada versus dias após inoculação do tumoral (abcissa). As barras de erro representam + o erro-padrão da média. A dose total de Ida foi de 200 pg;

A Pigura 19 representa o desenvolvimento de :enotransplante de tumor de cólon humano LII.I2210 em murganhos nus transplantados com o fragmento de tumor (1-5 mg). 10 murganhos por grupo foram t C íÊLCL os por via endovenosa, indicado pela seta, com PjS (D); 17,1-Ida (♦); JGI-13-Ida

-¹⁶ -ί. ζ (A); 27,1-1da (·), 30,6-1da (ο). A dimensão do tumor média em cin (ordenada) está colocada versus dias após inoculação tumoral (abcissa). 3arras de erro representam + o erro-padrao da média. A dose total de Ida foi de 30 pg.

EXEMPLO 1

Material e Métodos

Células Tumorais

As linhas de células examinadas neste estudo incluem a linha de células (Ly-2 ⁺ ) de timoma rnurina ITT(l) 75- S 33 (33) (Smith et al, J. natl, Câncer Inst. 76 503 -

- 510,1936), a linha de células (Ly-2~, T3A~) de linfoma

3'14 (Horowitz et al, Science 160 , 533 - 535, 1968), a linha de células humana CLM (1W⁺) (j?oley et al, Câncer 18 522 -

- 529.,1965) e a linha de células humana COLO 205 (250-30,6⁺). As células foram mantidas in vitro em meio de Lagle modificado por Dulbecco (DM3) ou em meio RP3I 1640 (Laboratórios ) 31ow de Sydriey, Austrália), suplementado com soro de vitela recém-nascida, inactivado por aquecimento a 10?á (31ow), 2niLZ de glutamina (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Austrália); 10 p.g/ml deestreptomicina (Glaxo, IJelboume, Austrália) e 10 U.I./ml de penicilina (Comonwealth Serum Laboratories) . 0 tumor 33 foi mantido in vivo por uma série de passagens em murganhos (G573L/6 x ΒΑΙ3/ο)?_Ί (murganhos GB3^). As células provenientes de líquido asoítico foram lavadas e centrifugadas (400 x 5minutos) duas vezes em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS), de pH 7,3,

-(

re-suspensas em PBS e injectãdas por via subcutânea na parede abdominal dos murganhos;

estes desenvolveram ali tumores palpáveis antes do tratamento.

Os murganhos foram submetidos a uma série de tratamentos por via endovenosa ou intratumoral e a dimensão subsequente dos tumores foi medida diariamente com um compasso através dos eixos perpendiculares dos tumores. Os dados foram registados em termos da dimensão tumoral média (proveniente de dois diâmetros + o erro-padrão).

Murganhos

Os murganhos C3A e (O57BL/6 x BALB/c) (murganhos CBFp e os murganhos nus (nu/nu) foram produzidos no Departamento de Patologia da Universidade de Lelbourne. Os grupos experimentais de 3-10 murganhos, todos do mesmo sexo e idade, foram utilizados em cada experiência.

Anticorpos Monoclonais

Utilizaram-se moAbs: (i) Anti-Iy-2.1 (IgGl) especificamente reactivos com a especificidade de Ly-2.1 murino (et al Immunology 46 135-144> 1932) e (ii) A306 (anti-TPR) (IgGl) reactivos com o receptor de transferrina humano (TPR) (Panaccio et al Immunology and Oell Biology 65, 461 - 472, 1937); e (iii) um anticorpo designado por 250-30,6 reactivo contra o antigénio presente nas células do carcinoma do cólon humano.

Os anticorpos monoclonais foram isolados do líquido ascítico por precipitação com sulfato de amónio a 40%, dissolução em PB3 e diálise contra o mesmo tampão. 3s· tas preparações impuras foram absorvidas em proteína-Á-sefa· rose (Pharmacia Inc., Piscataway, Aew Jersey), lavadas extensivamente com PB3 de pH 7,3 e eluídas com glicina 0,2 M/IIC1 de pH 2,8 ou passadas através de uma coluna de azul de Affigel (Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sidney). Após a neutralização, os anticorpos monoclonais foram então dialisados contra PBS, divididos em aliquotas e armazenados à temperatura de -70°C. Os anticorpos A3C6 foram obtidos mediante imunização de murganhos C2A por via intraperitonal com intervalos semanais durante três semanas com 2 z 10° células LiCR-L01í-BI_liy-2(BÍy-2) (0K'29^+ve) e remoção dos baços três dias depois da última injecção e fusão com células P3-NSI-AG4-1 (líS-1).

Preparação e quantificação dos conjugados

Aisturou-se anti-Ly-2.1 intacto, anti-lTR MoAb, ou 250-30,6 (1-2 mg/ml em tampão de borato com ρϊι 8,0) com um excesso molar (1-50) de 14-bromo-demetoxidaunorubicina (Br-Ida) dissolvida em (lT,ií-dimetilformamida (DLID) e 10 mg/ml. A reacção foi mantida à temperatura ambiente duran te 4 horas antes de ser submetida a centrifugação a (400 g x 5 minutos) para eliminar qualquer precipitado. .Br-Ida livre e outros materiais iniciais que não reagiram foram retirados por cromatografia de filtração de gel, utilizando-se uma coluna de Sephadex G-25 (PD-10; farmácia) e os conjugados foram em seguida passados através de uma coluna de Porapak ) (milipore) para eliminar qualquer férmaco adsorvido (Piederwieser et al, J. Ohromatog 54 215-223 ; 1971). A quantidade

- 19 -\ de Ida incorporado, nos conjugados fârmaco-AoAb foi determinado por espectrofotometria de absorção a 433 m = 3>4 x 10¾¾^-1) e por avaliação da proteína

Anal. Biochem. 72 248-253 _} 1976)

Actividade de anticoroo

Um. ensaio de formação de rosetas que utilizou anti-imunoglobulina de murganho desenvolvida em carneiro determinar a activ.

ticorpo de conjugado Ida-ZíoÁb comparada com anticorpo monoclonal livre que tinha sido submetido aos mesmos processos utilizando-se um método de ligação (Farish and LcIZenzie,

J. Immunol. Eethods 20 173 - 133 1973).

Actividade do fármaco

Ensaio de inibição de 24 horas: 100 μΐ de células (2-5xl0°/ml) foram adicionadas numa placa Eiicrotitu(a)

1adora de fundo plano e incubados durante 1 hora à temperatura de 37 °0. Idarubiciaa livre (Ida) (dissolvida em PB3) e conjugados diluições com i?B3 estéril; adicionaram-se cavaa amostra; as cavidades ct cou— trol receberam 50 jul de 133 ·'. temperatura da 37°G, (b)

Ensaio de inibição de 30 minutos: recolheram-suspenderam-se no fármaco estéril ou no conjugado e mistu-

raram-se durante minutos â temperatura de 37°C

As células foram em seguida centrifugadas (400 g x 5 minutos), re-suspensas em meio de desenvolvimento e divididas em alíquo-

tas de 100 μΐ que foram semeadas numa placa microtituladora utilizando-se cavidades em duplicado para cada amostra antes de um período de incubação compreendido entre 16 e 24 horas. Após o período de incubação adicionou-se a ambos os ensaios 50 /11 de meio de desenvolvimento que continha 1 p.0i de / ^Jí7-timidina (actividade específica = 5 Oi/minole; Aniersham) e as placas foram incubadas durante 2 a 4 horas. As células foram em seguida recolhidas e secas e as amostras individuais separadas e contadas num contador de cintilação beta, λ incorporação de Γ ij7-timidina foi expressa sob a forma da inibição em percentagem da incorporação dos controles, 0 erro-padrão para qualquer ponto foi obtido por determinações em duplicado e não excedeu 53 em qualquer ponto da experiência.

Toxicidade

Administrou-se uma dose única por via endovenosa a murganhos constituídos em grupos de 10-20 murganhos

CBA com doses diversas de Ida ou Ida-anti-jjy-2.1 e os mur ganhos sobreviventes foram registados relativamente à dose do fármaco libertada em mg/kg. Os orgãos desces murganhos foram retirados e pesados antes de se fixarem com formalina e corados com hematoxilina e eosina.

Resultados

Preparação e caracterização de conjugados

Br-Ida (Pig. 1) foi ligada por oovalência a diversos anticorpos monoclonais; contra TPR humano, contra um antigênio presente nas células de cancro do cólon humano (anticorpo 250-30,6) e contra o aloantigénio Ly-2 murino. As condições de reacção foram estabelecidas para a conjugação mediante excessos molares diversos de Br-Ida adicionados aos anticorpos monoclonais e estabelecendo um compromisso entre a incorporação de Ida mais elevada e recuperações de proteínas menores. Ida-anti-Ly-2.1 (Pig. 2), Ida-anti-TFR e Ida-250-30,6 (dados não representados) incorporaram entre 3 a 5 moléculas de Ida com recuperações proteicas superiores a 50/í. A reacção de Br-Ida com I.IoAbs poderia dar origem a dois tipos de ligações (Pig. 1C e D). Para se estabelecer qual estava presente, expuseram-se os conjugados a pH 4,5 ou plí 9,0 durante 48 horas, o fârmaco livre libertado foi absorvido com Porapak Q e as amostras foram re-quantificadas por espectro fotometria. 15,6 de fârmaco ligado foi libertado por exposição em meio básico (pH 9,0), enquanto que não houve perda aparente a pH 4,5. Bste facto sugeria que pelo menos 50;B do fârmaco fosse ligado por uma ligação éster (Pig. 1D) uma vez que esta é sensível a condições básicas enquanto que a ligação amina é estável.

Actividade de anticorpo

Os títulos de anticorpo antes e após conjuga/

ção foram me lidos pelo método fl f oni >ae

minados como a diluição à gual

50;l das células alvejadas demonstrou rosetas. Conjugados da Ida-anti-Ly-2.1 que continham 2 e 8 moléculas de Ida possuíam títulos de anticorpo contra células J3 de 1:56 000 e 1:33 000 respectivamente, enquanto que o título de anticorpo não conjugado era de 1: :80 000 (Fig. 3). Os conjugados Ida-250-30,6 que continham 2 e 6 moléculas de Ida possuíam títulos de anticorpos anticêlulas COLO 205, de 1:16 000 e 1:11 000 enquanto que o anticorpo não conjugado possuía um titulo de 1:33 000. Portan to existe alguma perda de actividade de anticorpo devido ao processo de conjugação; os conjugados de LloAb com Ida que possuíam menos de 6 moléculas foram utilizados para os estu dos in vitro e in vivo. Verificou-se que a solubilidade e a actividade do anticorpo de conjugados Ida-anti-Ly-2.1 diminuía significativamente para além destas taxas de incorporação de Ida (dados não representados). 0 número máximo de moléculas de Ida que podem ser incorporadas com aproveitamento deverá variar consoante o anticorpo individual.

Actividade in vitro de Idarubicinae conjugadas de

Idarubicina-moAb hediu-se a citotoxiciâade in vitro de Ida e de dois conjugados Ida-LoAb numa linha de células murina ITI(1)75FS E3 (Ly-2⁺TFR“) e numa linha de células C3m huma nas (Ly-2~TPR⁺) através de um ensaio de inibição durante horas e determinaram-se os valores da ΟΙ^θ (50;) da inibição da incorporação da £ ^HZ-timidina nos controles). Os i*esul

- 23 tados estão representados na Figura 4 e no Quadro 1. A ΣΕΕ^θ -7 para Ida está compreendida entre 1,0 a 2,5 x 10 E para ambas as linhas de células ensaiadas (Pig. 4, Quadro 1). A DI^q para Ida-anti-Ly-2.1 em células 33 foi 4 vezes superior (Fig. 4) e para Ida-anti-TFR em células 0311 os valores da DI™ fixam aotce unaaduas vezes suoeriores aos obtidos com a ou

Ida livre (Quadro 1). Portanto, Ida livre é mais citotóxica quer para células 33 quer para células 03LI do que Ida-anti-Ly-2.1 e Ida-anti-2311 respectivamente. Estes conjugados Ida-iloAb, contudo, demonstraram uma cito toxicidade dez vezes menor para as linhas de células não reactivas (Quadro 1), indicando deste modo que a sua acçao citotóxica era específica e resultava da retenção da actividade do anticorpo (Fig. 3).

Quadro 1

Efeito de conjugados de Idarubicina-anticorpos mono, q clonais em células tumorais

Linha de células de tumor	^m50 média de Ida	Valores determinados para
Ida-anti-Ly-2.1	Ida-anti-ϊΡΑ
Ξ3	1.2 x 10'⁷	4.3 x 10^-7	2.3 x 10”⁶
	Í5)²	(3)	(2)
CEE	2.2 x 10⁷	2.0 x 10~^b	3.0 x 10⁷
	(5)	(2)	(3)

Ί ~ .

= inibição de 50m da incorporação da

2Õ ^H^-timidina dos controles.

= número de preparações ensaiadas.

Os conjugados de Ida-250-30,6 foram ligeiramente menos activos do que a Ida livre. A Ida livre tem uma DI^q de 6 x 10T, enquanto que o conjugado possui uma DI^q —7 * de 3,5 x 10 'K na linha de células COLO 205 alvejada.

rara se examinar se os conjugados exibiam de um modo selectível a sua acçao citotóxica para células-alvo a Ida-anti-Ly-2.1 e Ida-snti-Tihl foram incubadas durante min. com células E3 (Ly-2⁺) antes da lavagem de eliminação do conjugado nâo ligado e avaliação de citotoxicilade. 0 conjugado Ida-anti-Ly-2.1 exibiu uma de 6,2 x 10 L

Í-?

comparado com a DI-θ 5.e 5,2 x 10^flI de Ida livre (Dig. 5).

Em contraste 0 conjugado de Ida-anti-2?õ não reactivo apre-6 sentava ur.a ΟΙ^θ de 5,0 x 10 L, isto é, seis veses superior â da Ida livre, o que demonstra que a activiclade de ligação anti-carpo do conjugado Ida-anti-Ly-2.1 resultou na sua citotoxicidade selectiva. De um modo idêntico, 0 conjugado Ida-250-30,6 e o fârraaco livre foram incubados

.33 de células COLO 205 (250-30,6

(250-30,6 -ve) antes da lavagem e execução do doseamento da í-nnaco livre 9,2 x 10^ células COLO 205 e 9,8 x 10 'lí para E3. Contudo,

S.0 .. t.r conjugado

Ida-35O“3O,6 foi quatro vezes mais tóxico para COdO 205 do que para 0 anticorpo não reactivo com a linha de células

Obtiveram-se resultados similares utilizando

111111 (dados não representados). Para se as cito toxicidade de conjugados ida-L.oÁb das era específica e ocorria no sítio po realizaram-se estudos para inibir a citotoxicidade do conjugado utilizando-se iloAb livre. Com uma concentração de Ida de 4,0 x 10~^cL' (2/ig aiiti -Ly-2,1) a citotoxicidade do o que indicou que ε, citotozicidade do conjugado

-Ly-2,1 está directamente relacionada

4--;

de ligação ao anticorpo. Resultados foram obtidos com 2pO-3O,6. Deve notar-se que em todos os ensaios o anti-Ly-2,1 livre e anti-IFR e 250-30,6 se mostra· ram não citotóxieos (dados não representados)

Tratamento in vitro de tirnoma murinoiT2( 1)75118 L3

	Para	se avaliar a inibição	do	de s envo1vimento
de	tumores sólidos,	trataram-se grupos de	10	murganhos CSj?,
por	via subcutânea,	com 2,0 x 10^b células	33	na região abdo-

minai, com unia das injecções (i.v.) seguintes: (i) P33; (ii) anti-Ly-2,1; (iii) Ida; (iv) Ida-anti-TFR; ou Ida-anti-Ly-2,1. Os murganhos receberam 20 jug de Ida e/ou 1200 jug de anti-Ly-2,1 respectivamente nos dias 4 e 5 após a inoculação do tumor (dimensão do tumor = 0,1 cm ).

Durante as 24 horas do primeiro tratamento /

os murganhos tratados com Ida-anti-Ly-2,1 exibiam um tumor com uma dimensão média de 20É da dos murganhos tratados com PBS (isto ê, uma diminuição de 80$ na massa tumoral Fig. 7); foi evidente que anti-Ly-2,1 isoladamente e ligada de modo covalente a anticorpos monoclonais anti-iW não específicos não actuaram no desenvolvimento de tumor 23· Os tumores dos murganhos que receberam Ida isola .lamente estavam reduzidos apenas até 50,5; contudo, três destes murganhos morreram e os outros apresentaram uma redução de 25$ no peso cio corpo. As curvas de desenvolvimento tumoral individual dos murganhos que receberam Ida-anti-Ly-2,1 demonstraram una regressão de 9 em cada 10 tumores durante o decurso do tratamento (Figura 8); de facto 5 de 10 tumores regressaram completamente e náo reapareceram (mais de 200 dias) e aqueles tumores que continuaram a desenvolver-se até se completar o tratamento (5 de 10), cresceram com menor velocidade do que os tu-icres de murganho tratados com E33 e Ida-anti-fFA. Uma outra experiência foi realizada para se avaliar o tratamento endovenoso de tumores maiores utilizando Ida-anti-Ly-2,1. Inocularam-se grupos de murganhos GBP, de 10 murganhos por grupo com 3,0 x 106 células S3 e em seguida os murganhos receberam 15 e 900 yag de Ida e anti-Ly-2,1 respectivamente nos dias 6 (dimensão do tumor = 0,2 .cm ) e apôs 7 dias de inoculação do tumor (Fig. 9)· Os murganhos tratados com Ida-anti-Ly-2,1 apresentavam uma dimensão do tumor média de 50$ da dos murganhos tratados com P33 e 66$ da dos murganhos tratados com Ida nos dias 7, continuando esta tendência até ao final do estudo (dia 18).

As curvas de desenvolvimento tumoral indivi dual dos 10 murganhos CBF^ que receberam Ida-anti-Ly-2,1 demonstraram que houve 4 regressões e uma remoção completei da massa tumoral (> 200 dias; dados nao representados). For tanto, Ida-anti-Ly-2,1 foi eficaz contra tumores maiores e em ambas as experiências a actividade antitumoral de Ida foi consideravelmente melhorada guando se ligou ao anticor po monoclonal anti-Ly-2,1

Tratamento in vivo de célula S (zOJjV 205 de tumor do cólon humano efeito de conjugado Ida-snti-250-30,6 foi avaliado em murganhos nus (nu/nu) que tinham xenoimplantes de COLO 205.

a injecção de 2 x 10^o células por via subcutânea na parede abdominal gerou una massa informe palpável em 4 dias (aproximad.am.ente 0,1 cm ). 3m seguida os grupos de 10 murganhos foram tratados por via endovenosa com uma das injecções i.v. seguintes: (i) P33; (ii) 250-30,6;(iii) Ida mais 250-30,6 (não conjugado); (iv) lia; (v) conjugado Ida-250-30,6. Foi administrado um total de 275 jUg de Ida numa série de 5 injecções intravenosas nos dias 4, 5, 6, 10 e 12 após a inoculação tumoral.

aos grupos de murganhos tratados com BB 3 ou com 250-30,6 não conjugado nao foi visível qualquer efeito terapêutico· De cada 10 murganhos tratados com Ida apenas 2 sobreviveram enquanto que todos os murganhos do grupo que receberam Ida mais 250-30,6 nao conjugados morreram por vol-

£.0 ta dos dias 7, tendo mostrado previamente sintomas de toxicidade tais como ram um conjugado tica da

Em contraste, as curvas de desenvolvimento tumoral para os murganhos individuais (?ig. 12) mostraram que 5 de 10 murganhos tinham tumores que tinham regressado por volta dos dias 7; estes tumores em seguida continuaram a desenvolver-se, ficando 2 dos 10 murganhos sem tumores

Estes murganhos nao mostraram efeitos de toxicidade.

Tratamento intratumoral á terapêutica intratumoral mostrou ser uma técnica útil para a imunoterapia de tumores de animais ou de seres humanos. Estudos consequentes foram realizados pa ra se caracterizar a actividade antitumoral de conjugados

Ida-anti-Ly-2,1 quando administrados directamente em turaores

3,0 res sólidos. Grupos de 10 murganhos GBP, implantados com x 10& células 03 por via subcutânea desenvolveram turno(0,1 a 0,2 cm ) nos 5 dias após a inoculação do tumor.

Os tratamentos consistiram em duas injecçoes nos dias 5 e 6 após a implantação do tumor, recebendo os murganhos um dos cinco tratamentos seguintes

2,1; ou (4) Ida-anti-Ly-2,1 (Ida total - 30 /ig) •Ly-2,1 demonstrou a maior agressividade antitumoral, ida livre e anti-Ly-2,1 apenas não interferiram no desenvolvimento tumoral quando administrados directamente no tumor.

Os murganhos tratados com Ida-anti-Ly-2,1 tinham um

tumor que em média apresentava uma dimensão de 60,5 da dos murganhos tratados com P33 nos dias 8 e 303 da dos murganhos tratados com P33 nos dias 13 (Fig. 10). As curvas de desenvolvimento tumoral individual (dados não representados) de murganhos tratados com Ida-anti-Ly-2,1 indicaram uma regressão completa enquanto que os murganhos restantes demonstravam uma redução retardada no desenvolvimento dos rumores nos dias 3 apôs se completar o tratamento.

I

Toxicidade

Para a toxicidade aguda administraram-se em grupos experimentais de 10 murganhos C3A (Ly2,l⁺), uma única injecção de diversas doses de Ida, Ida-snti-Ly-2,1 ou Ida-anti-TFR. Todos os murganhos injactados com Ida mostraram uma per da de peso inicial até 25.-S do peso original; contudo não se observou perda de peso nos murganhos tratados com o conjugado Ida-LIoAb. Γο quadro 2 representa-se a toxicidade de Ida e conjugados Ida—í.oAb de acordo com os valores reflectidos na DLç- e na Como se representa a de

Ida-anti-Ly-2,1 foi de 10,0 nig/kg de Ida comparado apenas com 0,75 mg/kg de Ida livre. Além disso, o conjugado Ida-anti-TFR tem uma DL-^θ de 8,0 mg/kg. Os conjugados Ida-íToAo não foram ensaiados para a dose de DL^q. demonstraram um índice terapêutico maior

Ida-LíoAb comparados com Ida livro

Efeito aos

Quadro 2 noclonal iOr.o w»j._í

Ida (mg/kg) ^Dho

Ida

0,75

3,00

Ida-anti-Ly-2,1

10,00

15,00 sr « i'« · u. · · lião ensaiado.

Resultados histopatológicos

Efeito agudo: m administração endovenosa do

I da livre (1,0 mg/kg) resultou numa atrofia da polpa branca nos baços 15 dias após o tratamento e alguma hipertrofia das fibras do músculo cardíaco (dados não representados).

Em contraste, uma única dose de lâa-aiiti-L / não provocou qual quer toxicidade de tecido após 15 e 30 dias ainda que tivesse sido não específico observada alguma tumefacção dos hepatócitos nos dias 15.

EXSMPLO 2

Materiais e métodos

Murganho s (jB^/2 x BaLE/c)]?^ e murganhos C3A foram pro- 31

L· f

duzidos no Departamento de Patologia da Universidade de

Idelburne. Os grupos experimentais de 10 a 20 murganhos, utiAI

Células tumorais

As linhas de células examinadas neste es tudo incluíam a (Ly-2⁺) linha .variante^ 03), a (L3T4⁺) linha células (Horowitz et al, Science 160 células CO-bO 205 do carcinoma $ 533 - 535/1968), a linha de do cólon humano (Cemple et al,

Câncer Res. 38 1345 - 1355 _s 1978) e a linha de células (Ly-2“, 1314-) CAL de leucêmia de células 2 humanas (Foley et al, Câncer 18 522 - 529/ 1965). As células foram manti das in vitro como se descreveu no Dxemplo 1. A linha de cê lulas de maorófagos P388D1 foi mantida in vivo por passagem em série em murganhos (dBâ/2 x BALB/c)?^. As células provenientes de liquido ascítico foram lavadas e centrifugadas (400 g x 5 minutos) duas vezes com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato (PBS, pH 7,3), re-suspensas em

PBS e injectadas por via subcutânea na parede abdominal dos murganhos onde se desenvolveram os tumores implantados palpãveis. Os murganhos foram em seguida submetidos a uma rie de tratamentos oor via endovenosa e a dimensão res foi medida diariamente com um compasso no sentido dos

Regi s t ar ain -se os 'tenanho s médios dos tumores (provenientes de dois diâmetros * erropadrão)

Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais para os antigênios de superfície de células murinas L31‘4, Ly-2 e íhy-1 que racterizam subpopulações de linfócitos distintas, foram lizados como um

Utilizaram-se os anticorpos monoclonais:

cauti(1) anti-Ly-2,1 (murino IgG2a) reactivos com a especificidade

Ly-2,1 murino (Horgarth et al,

1982), (ii) H129,19 (anti-1324) (IgG2b de rato)

Immunology 46_f 135 - 144_s reactivo com 13Ή murino especificamente (Pierres et al, gy 132 , 2775 - 2732₅ 1984), e (iii) anti-Phy-1 (IgG2b d rato) reactivas com células 2 murinas (marshak-Rothstein et al. J. Immunology 122 2491 - 2497^ 1979). Os anticorpos foram isolados, purificados e armazenados como se descreveu no Exemplo 1. Foi determinada a actividade dos anticorpos pelo ensaio de formação de rosetas com anti-imunoglobulina de murganho desenvolvida em carneiro (SAÍ..G), como se descreveu no Exemplo 1

Preparação de conjugados Idorubicina-anticorpo monoclonal misturou-se 1 a 2 mg/ml de anticorpo monoclonal com um excesso molar de 5 a 20 daunorubicina (3r-Ida) dissolvida (10 mg/ml) durante 4 horas a um pH de borato) à temperatura ambiente.

Ida incorporada no conjugado resultante de acordo com a descriçao do Exemplo 1.

Actividade do fârmaço nutos) para se avali ctiv no Exemplo 1 utilizando-se células cora uma concentr 1 a 5 x 10⁶/ml.

cão de

Serologia através destas experiências para se determinar z z 4- 4anticorpo e o numero de células L3T4 e Ly-2 ·

Este método envolveu a ligação de

3AL.G que também letecta imunoglobulina de rato (Ig) ligada com glóbulos vermelhos célul as linfóides. Células esplénicas de Ig⁺ tinham a I;

removida por capeamento com a 10 //il); as células foram

3.1.3- (25/11 e 2 ml de células em seguida conservadas em gelo num meio que continha azida de sódio a 0,01% para se impedir a re-síntese da imunoglobulina.

Resultados estudo foi conduzido em fases senaradas:

(a) caracterização in vitro de três conjuga dos diferentes de Ida-MoAb, (b) demonstração subsequente da sua utilização na.depleção activa de subconjuntos de células T antes ou durante a rejeição de ura alotransplante d© células tumo rais

Preparação e caracterização de conjugados

Br-Ida foi ligada de modo covalente a EoAb antigênios murinos L3T4, Ly-2 e Thy-1. As condições reaccionais foram estabelecidas para a conjugação mediante variação do excesso molar de Br-Ida adicionado ao LIoAb e feito um compromisso entre a incorporação de Ida mais elevada e as recuperações menores de proteína. As recuperações de proteínas foram superiores a 5θΒ com 3 a 6 moléculas de Ida incorporadas em Ida-anti-L3T4 (Fig. 13)» Ida-anti-Ly-2,1 e Ida-anti-Thy-1.

Actividade do anticorpo

Os títulos do anticorpo antes e após a conjugação foram medidos pelo método de formação de rosetas e determinados de acordo com a diluição em que 50í-á das células-alvo B3 demonstraram rosetas. Os conjugados Ida-anti-Thy-1 que continham 1, 4 © 7 moléculas de Ida exibiam títulos de anticorpo de 1:425 000, 1:170 000 e 1:13 000 respectivamente enquanto que o título de anticorpo não modificado era de 1:550 000 (Fig. 14). Portanto há alguma perda de actividade de anticorpo após conjugação com Ida; no entanto foram utilizados os conjugados com menos le 4 moléculas de Ida como IdoAb para estudos in vitro e in vivo. De um modo idêntico, a actividade do anticorpo dos conjugados Ida-anti-Ly-2,1 e Ida-anti-L3T4 (lados não referidos) diminuiu significativamente com a incorporação de mais de 6 moléculas de molécula de I.íoAb com Ida.

/

Actividadedo fármaco in vitro a citotoxicidade de conjugados Ida-líoAb foi testada em células-alvo reactivas diferentes utilizando-se um ensaio de 24 horas e comparada com a citotoxicidade de

Ida livre. A actividade da Ida livre foi 4 a 10 vezes superior do que a dos conjugados de

Ida-noAb com uma DI^q (ini/ ^Jh7-timidina dos controlos) de Ila livre que ocorreu a

6,6 - 9,0 x 10-'.

linhas de células tumorais test jugado Ida-anti-Ly-2,1 e o conjugado mais citotôxico (DI_Rn '7 ‘m) quando testado sobre a linha de células

4,3 x 10

ITT( 1)751-3 ,1-L enriquecida para 0 antigénio Ly-2. Para s tividade da acção do conjugado para c élulas-alvo, incubaram-se células

-alvo, gado e de se medir a citotoxicidade. Utilizando-se wa ensaio de 30 minutos, os conjugados ida-AoAb não reactivos tinham uma ΟΙ^θ 10 a 50 vezes superior à ΟΙ de Ida livre demonstrando que a ligação do anticorpo era essencial para a citotoxicidade do conjugado de Ida-hoAb. Deve notar-se que não se utilizou no estudo qualquer anticorpo monoclonal com acção citotóxica sobre as células-alvo in vitro na ausência de complemento.

Os resultados estão resumidos no Quadro 3·

Quadro 3

Efeito da DI media de conjugo·,dos de anticorpo monoclonal-Idarubicina em células tumorais .

Linha de células tumorais	Ensaio	DI^q Valores de DI^q média de Idajlda Ida-anti-Ly- j	média (Ida h.) para	detei -L32-l·	minadce Ida-an- ti-2hy-l
2,1	I da-anti·
Ξ3	24hr²	7.8xl0“^S	4.3xl0^-7		”T Φ	9.0xl0“⁷
30min⁸	l.SxlO”⁷	4·3x10”⁷		TT Φ Xi · X ·	1»2	•Ò ÍxlO
E4	24hr	6.6xlO~°	íi «f ·	6	.OxlO^-7	2'	dl.
30min	1.6xlO”⁷	lí.f ·	6	.2x10”⁷	i.	.2.
CEh	24hr	9.0x10”⁸	h.f.		r φ	E	.3.
30min	2.2xl0“⁷	6.0x10“^b		l:.T.	i.	/•1 • o- ·
COLO 205	24hr	8.0x10”³	Ε.Ϊ.		ΙΪ.Ϊ.		.T.
30min	1.2X10”⁷	L.r.	4	.OxlO”⁶	z* 5.8xl0“^b
DI = ^50	inibição de 50$	na incorporação c-o	/“ -^/-timidina

dos controlos p

utilizando-se um ensaio da citotoxicidade de 24 horas ^J utilizando-se um ensaio de 30 minutos

Ií,T. = não ensaiado

- 37 f

monoclonal

A potência imuno-supressora in vivo de conjugados Ida-iloAb foi comparada com a de LIoAb isolado por ensaio da capacidade dos conjugados para selectivanente eliminarem células L3T4 ou Ly-2⁺ de baço. L.urganhos C3A receberam por via endovenosa 4 injecções de conjugado anti-Ly-2,1 ou conjugado anti-L3T4 (30 ^-g Ida/1,5 mg de EoAb) nos dias 0, 2, 5 e 10 e o número de células Ly-2 ou L3T4 no ba^o foi controlado por um ensaio de formação de rosetas, rara cada tratamento as células de baço de dois murganhos tratados foram examinadas em cada dia e os resultados avaliados (j?ig. 15). Apresentou-se uma queda rápida no número de células L3T4⁺ de aproximadamente 30% das células de baço totais nos murganhos normais no dia 0 até aprozimadanente 4% nos murganhos tratados com Ida-anti-L3T4 cerca do dia 20. Estas células L3T4 permaneceram eliminadas durante mais de 60 dias antes de se verificar um aumento gradual. A depleção após tratamento in vivo com anti-L3T4 isolado também conduziu a uma diminuição acentuada no número de células

L324’ (30% a 5%).

conjugado Ida-anti-Ly-2,1 diminuiu o núme-

dias e voltou ao normal cerca dos dias 40-50. Tem interesse o facto de que o anticorpo monoclonal anti-ny-2,1 isolado

Ly-2⁺ a

em murganhos de controle não trata-los considerou-se ser ser devido a u- a variação natural entre os murganhos. Portanto ficou cia· ro que Ida-anti-L3f4

Ida-anti-Ly-2,1 poderão eliminar células L3T4⁺ ou Ly-2⁺ respectivamente baços de murganhos tratados de um modo mais eficaz do que o anticorpo monocional isolado. 0 efeito do conjugado Ida-anti-Ly-2,1 é importante assim como o anti-Ly-2,1 '.'O.ab ê completamente isento de acção quando utilizado isoladamente, tido num agente

mas pode ser converimuno-supressivo potente quando ligado com

Ida. A depleção mantida por conjugados de fármaco-anticorpo monoclonal foi portanto apropriada para o exame da função de células Ly-2⁺ e células L3I4 in vivo na resposta de rejeição de transplante.

Efeito de Ida-anti-L3I4, Ida-anti-Ly-2,1 e Ida-aati-fhy-l em sobreviventes de transolante de tumor njTnru«iu..iiiii i i ui —111111 11 ii.i—ι-π _l. -..-.γί.γ.-·. — - . ·. -,.- - -¹· — -- 1 —— ——

Nesta experiência utilizaram-se Ida-anti-L3T4, Ida-anti-Ly-2,1 e Ida-anti-dhy-1 para aumentar o tempo de sobrevivência de transplantes de tumor P388D1 em murganhos CBA, sendo os alotransplantes através de H-2 (classe I e II) e de nenhuns limites de H-2.

(a) Tratamento de, conjugado associado

Grupos de murganhos OBA com 10 a 15 murganhos foram injectados por via subcutânea com células tumorais £

P38831 na quantidade de 8,0 x 10° células e receberam por via endovenosa nos dias -1, 0 (= dia de inoculação do tumor), 3, 5 e 10 uma das seguintes injecções: (i) P33, (ii) anti-L3T4 e anti-Ly-2,1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti- 39

-Ly-2,1 e (v) Ida-anti-L3'I4 e Ida-anti-Ly-2,1. A quantidade total de Ida e AoAb recebidos foi de 125 ^ig e 5,75 mg respectivamente. Os transplantes de tumor dos murganhos tratados com PBS e LoAb sobreviveram durante 14 a 17 dias com um máximo de dimensão tumoral média de 0,31 cm¹ demonstrando que ambos os MoAb não conjugados eram incapazes de eliminar efectivamente as células L314⁺ e Ly-2⁺ de tal modo que o transplante de tumor poderia sobreviver (Fig. 16). Além disso Ida-anti-Ly-2,1 ou Ida-anti-L3^£í¹4 isolados foram capazes apenas ie prolongar a sobrevivência do transplante (entre 20 s 28 dias) com dimensões do tumor médias máximas

2 - de 0,40 cm a 0,50 cm . De um modo idêntico Ida-anti-úy-2,1 e Ida-anti-L31’4 isoladamente não eliminou todas as células I e uma inoculação antigénica forte (como ss viu com as diferenças de ml-IC completas) foi capaz de estimular a permanência de células Ly-2⁺ e -L3T4⁺ para proliferarem e provocarem uma resposta de rejeição. Lm contraste a associação de ambos os conjugados Ida-anti-Ly-2,1 e Ida-anti-L31⁵4 permitiram evitar a rejeição de transplantes tumorais P333D1 14/15 e aumentar no tamanho até serem os murganhos sacrificados (dias 50-2,00 cm ). Verificou-se que poucos destes tumores P388D1 tratados com estes conjugados demonstraram alguma regressão nos dias 3 a 16; contudo, a depleçao de células L3I4⁺ e Ly-2⁺ (dia 10) permitiu que os transplantes de tumor P383D1 estabelecessem de um modo consistente o desenvolvimento dos tumores.

(b) Conjugado Ida-anti-Th.y-1

Grupos de 10 murganhos OBA foram injectados f?

por via subcutânea com 10¹ células de tumor 2338Ώ1 e aos dias -1, 0, 5 e 6 receberam uma quantidade de cada um dos seguintes por via endovenosa: (i) P3S, (ii) anti-Thy-l e (iii) Ida-anti-Uhy-1. A quantidade total de Ida e de anti-Thy-1 recebida foi de 130 θ 5,4 mg respectivamente e os transplantes de tumor de murganhos tratados com P.3.3 sobreviveram durante 15 dias.

anti-2hy-l L.oAb isolado manteve a sobrevivência do transplante de tumor durante 28 a 32 dias z z p com um máximo de tamanho meiio do tumor de 0,58 cm^;~ (dia b) (Fig. 17). Dos murganhos tratados com Ida-anti-Thy-l BOíJ dos transplantes de tumor foram rejeitados completamente enquanto que 70;$ continuaram a desenvolver-se, eventualmente (dia 32) permitindo que o tamanho médio do tumor aumen tasse no grupo. Portanto Ida-anti-i'hy-1, tal como a assoei ção de Ida-anti-Ly-2,1 e Ida-anti-u3'24, foi capaz de elimi nar células Ly-2 e L324 -de tal modo que uma maioria de transplantes de tumor 23831)1 sobreviveram nos murganhos CBA na ausência de uma resposta normalmente rápida de rejeição.

EXEMPLO 3

Prepararam-se conjugados de -.-.cordo com 0 processo descrito no clonal 17,1 (Thompson et al Proc. llatl, Oancer Inst.

409 - 419, 1933 ”murine^!’ IGQ-2A) e o anticorpo monoclonal murine IGG2B), Inocularam-se ma de cólon humano (3O,6⁺, 17,1⁺) por via subcutânea em murz Ô z ganhos nús com 8 x 10 células/murganho como descrito no f W

AX.AJ?LO 2. Os murganhos inoculados foram depois submetidos ntos cor via intraperitonal., ή dinensão dos tumores foi medida com um compasso através dos eixos perpendiculares dos tumores. Gs dados foram registados como dimensão tumoral média (produto de dois diâmetros + o erro padrão).

ΞΧΕΡΡΙΟ 4

Prepararam-se conjugados de orocesso descrito no 3X3LPL0 1 entre Ida e anticoroo monoclonal 17,1 Idae anticorpo monoclonal JGÃ-IP, tivos com antigénio carcino-embriónico no carcinoma de có lon mas não com tecidos normais entre Ião e anticorpo mono clonal 27,2 mouse IGGl, reactivos com anti.

.génio de glóbulos de gordura do leite humano num determinado número de turnores de cólon e entre Ida e o anticorpo monoclonal 30,6. Ii.i· plantou-se um xenotransplante de tumor de cólon humano

LIE22210 por via subcutânea em murganhos nús. Os murganhos implantados foram em seguida submetidos a uma série de tratamentos por via endovenosa. A dimensão dos tumores foi avaliada com um compasso medindo-se os eixos perpendiculares dos tumores.

dos tumores erro padrão). Os resultados estão representados na Fig. 19

Claims

Reivindicações

1. - Processo para a preparação de conjugados de imunoglobulina, caracterizado pelo facto de se conjugar idarubicina (Ida) com um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento que comporta pelo menos um dos sítios de ligação do antigénio do anticorpo.

>

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento específico para um tecido alvo determinado.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o tecido alvejado consistir em neoplasma humano.

4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se utilizar um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento específico para o antiçér.io de superfície de linfõcitos T.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento específico para o receptor de transferrina humana.

6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se fazer reagir uma 14-halogeno-Ida com um anticorpo monoclonal ou com um seu fragmento.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a 14-halogeno-Ida ser a 14-bromo-Ida.

)

8. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo facto:

a) de se misturar um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento com um excesso molar de 14-halogeno-Ida;

b) de se fazer reagir esta mistura a uma temperatura compreendida entre 18° e 37°C;

c) de se remover qualquer precipitado formado;

d) de se eliminar os materiais iniciais que não reagiram mediante filtração de gel; e

e) de se retirar a Ida livre mediante cromatografia de adsorçao ou cromatografia de permuta iõnica.

9.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se ligar um veiculo ou ligante ao ãtomo de carbono C-14 da Ida e de, em seguida, se ligar ao anticorpo monoclonal ou a um seu fragmento.

10.- Método para eliminar especificamente um subgrupo de linfócitos T de uma população de células, caracterizado pelo facto de se incubar as células in vitro com um conjugado de imunoglobulina produzido de acordo com o processo descrito na reivindicação 1, e de o anticorpo monoclonal ou um seu fragmento ser específico para um antigênio de superfície celular presente nos referidos linfócitos, >

Lisboa, 11 de Março de 1988

U Asjem.0 viiúiui ua rrupi ieuaue inaustrial

RESUMO

Processo para a preparação de conjugados de imunoglobulina

A presente invenção refere-se a conjugados de imunoglobulina que consistem em uma idarubicina (Ida) conjugada com um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento que incorpora pelo menos um dos sítios de ligação do antigénio.

A presente invenção também se refere a um processo para a preparação dos referidos conjugados de imunoglobulina, que são utilizáveis para o tratamento de seres humanos ou outros animais sofrendo de cancro ou para eliminar um subconjunto de linfõcitos T presentes numa população de células, que é caracterizado pelo facto de se conjugar idarubicina(Ida) com um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento que comporta pelo menos um dos sítios de liga ção do antigénio do anticorpo.