DE3808166A1 - Immunglobulinkonjugate, verfahren zu deren herstellung und anwendung sowie pharmazeutische mittel, die diese enthalten - Google Patents
Immunglobulinkonjugate, verfahren zu deren herstellung und anwendung sowie pharmazeutische mittel, die diese enthaltenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Immunglobulinkonjugate, Verfahren
zu deren Herstellung und Anwendung sowie pharmazeutische
Mittel, die diese enthalten.
Das allgemeine Konzept zum direkten Anpeilen von Tumoren
mit antineoplastischen Agentien unter Verwendung monoklonaler
Antikörper (MoAbs) ist bekannt, und die therapeutische
Bedeutung wird derzeit einer Untersuchung unterzogen.
Im allgemeinen geht man dabei so vor, daß man
Konjugate aus einem Antikörper und einem toxischen Agens,
die in der Lage sind, sich selektiv an den Tumorzellen
zu lokalisieren und diese zu zerstören, herstellt. Ein
besonderes Augenmerk galt der Konstruktion von Immuntoxinen
aus den A-Ketten pflanzlicher und bakterieller Toxine
und Antikörpern, und zwar so, daß es bei der Bindung
des Antigens und bei der Einverleibung desselben zum
Zelltot kommt. In der Praxis hat sich gezeigt, daß viele
MoAbs, von denen man glaubte, daß sie tumor-spezifisch
sind, auch mit Subpopulationen normaler Zellen reagieren,
so daß es folglich unrealistisch ist, derart potente
Toxine einzusetzen, da sie auch normale Gewebe in nennenswerter
Weise schädigen. Eine sichere Alternative
zu Pflanzentoxinen stellt die Kopplung von Antikörpern
an konventionelle Anti-Krebsmittel, wie Doxorubicin,
Vindesin, Chlorambucil, Melphalan und Methotrexat, dar.
Aufgrund der nicht-spezifischen toxischen Wirkung der
derzeit verwendeten antineoplastischen Agenzien hat man
versucht, deren therapeutischen Index zu erhöhen, indem
man sie an MoAbs auf Tumorantigene koppelte.
Versuche zur Unterdrückung der Transplantatabstoßung
durch T-Zellen aus dem Thymus haben sich häufig darauf
fokussiert, die T-Zellenaktivität durch Einsatz von
Antithymocyten-Globulin zu reduzieren. In letzter Zeit
ist es durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper
möglich geworden, T-Zellenuntergruppen entsprechend
ihrer Funktion in vitro und das Vorliegen spezifischer
Oberflächenantigene, wie sie durch MoAb definiert werden,
zu bestimmen. Dies hat die Suche nach einem Mechanismus
stimuliert, mit dem T-Zellen die Transplantatabstoßung
kontrollieren, wobei man sich auf die hauptsächliche
Unterteilung in Helfer/Induktions- und cytotoxische/
Suppressor-Untergruppen, wie sie durch die L3T4 und
Ly-2-Maus-Antigene definiert werden, konzentriert.
Obwohl sich OKT3 MoAb, ein Anti-Pan-T-Zellenreagens,
in vivo als wirksam gezeigt hat, haben wir bei einer
kürzlichen Untersuchung festgestellt, daß 20 MoAbs auf 20
verschiedene Maus-Lymphocytenantigene in vivo in Mäusen
ohne Wirkung waren und daher für in vivo-Studien nicht
von Nutzen sind. Es ist deshalb angezeigt, nach Mitteln
zu suchen, mit deren Hilfe diese hochspezifischen MoAbs
wirksamer gemacht werden können, so daß eine vollständige
Entfernung der target-Zellen erfolgt. Eine Methode
besteht dabei in der Verwendung cytotoxischer Arzneimittel,
die an MoAbs gekoppelt sind.
Das klinische Potential von Arzneimittel-MoAb-Konjugaten
umfaßt die Immunchemotherapie von Krebs sowie die
Erleichterung verschiedener immunregulativer Störungen
und die allo-Transplantatabstoßung. In vielen Untersuchungen
konnte die spezifische Cytotoxizität von Toxinen
und Arzneimitteln auf Tumorzellen gezeigt werden, wenn
diese mit MoAb auf tumor-assoziierte Antigene gekoppelt
werden. Weniger Bedeutung hat man auf die in vivo-Verwendung
von Arzneimittel-MoAb-Konjugaten angewendet, um
T-Zellen zu zerstören und die T-Zellen-Immunregulierung
bei der Transplantatabstoßung zu untersuchen, obwohl
Toxin-Antikörper-Konjugate in vitro in großem Ausmaß
eingesetzt werden, um T-Zellen vor der Knochenmarkstransplantation
zu zerstören.
Anthracycline stellen eine wichtige Gruppe antineoplastische
Agenzien, die in der Krebschemotherapie verwendet
werden, dar, wobei sich Doxorubicin und Daunorubicin
gegen feste Tumore als wirksam erwiesen. Eine Kopplung
von Daunorubicin und Doxorubicin an Antikörper führt
jedoch zu einem wesentlichen Verlust der Wirksamkeit
der Pharmaka, wenn die Kopplung über die Aminogruppe erfolgt.
In letzter Zeit hat man Daunorubicin an MoAbs über
das Kohlenstoffatom 14 unter Verwendung von Bromdaunorubicin
gekoppelt. Diese Konjugate zeigten sich in vitro
als wirksam. Es wurde jedoch von keinen in vivo-Untersuchungen
berichtet (Gallego et al, Int. J. Cancer, 1984
33 737-744). Außerdem konnte gezeigt werden, daß Dauno
rubicin-MoAb-Konjugate eine nicht-spezifische Toxizität
bei Konzentrationen < 10 µg/ml besitzen.
Die Anmelderin hat nun gefunden, daß Idarubicin
(4-Demethoxy-daunorubicin, Ida) an MoAbs gekoppelt werden
kann, und daß die Konjugate eine selektive und potente
in vitro- und in vivo-Anti-Tumoraktivität besitzen. In
vivo zeigten Ida-MoAb-Konjugate bei Dosen von
< 8,0 mg/kg keine nicht-spezifische Toxizität. Die Ida-
MoAb-Konjugate weisen in vitro und in vivo eine größere
Wirksamkeit als Daunorubicin-MoAb-Konjugate auf.
Außerdem wurde die Fähigkeit von Ida-MoAb-Konjugaten
untersucht, spezifisch Zellpopulationen zu zerstören,
indem Ida an MoAbs gekoppelt wurde, von denen bekannt
ist, daß sie mit verschiedenen Subpopulationen von
Lymphocyten (L3T4⁺, Ly-2⁺ und Thy-1⁺) reagieren. Wir
konnten feststellen, daß dies eine überraschend wirksame
Methode zur Verarmung von Zellen darstellt. So kann
z. B. Anti-Ly-2.1-MoAb, das in vivo auf Ly-2.1⁺-Zellen
keinen meßbaren Effekt ausübt, durch Kopplung mit dem
cytotoxischen Agens Ida zu einem wirksamen cytotoxischen
Agens umgewandelt werden.
Unter Verwendung von MoAbs auf Ly-2 und L3T4-Antigene
konnten wir nun zeigen, daß Ida-MoAb target-Zellen in
vitro und vivo eliminieren kann. Es können Ida-MoAb-
Konjugate zur Verfügung gestellt werden, die sich bei der
Verarmung spezifischer T-Zellen-Untergruppen, die für die
Transplantatabstoßung verantwortlich sind, als wirksamer
erweisen als Antilymphocyten-Globuline oder Anti-Pan-T-
Zellen-Reagenzien, wie OKT3 MoAb.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Immunglobulinkonjugate
zur Verfügung, welche Ida, konjugiert mit einem
monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, welches
mindestens eine der Antigenbindungsstellen des Antikörpers
aufweist, umfaßt.
Ida wird in US-A 40 77 988 beschrieben. Vorzugsweise werden
den zwei bis acht Ida-Moleküle kovalent an jeden Antikörper
oder jedes Antikörperfragmentmolekül gebunden,
besonders bevorzugt zwei bis sechs. Die Ida-Moleküle
werden im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise,
in der 14-Stellung an den monoklonalen Antikörper oder
das Antikörperfragment konjugiert. Vorzugsweise sind sie
direkt gebunden, obwohl es auch möglich ist, einen inerten
Träger oder Linker dazwischenzuschieben. Ida kann
jedoch stattdessen an den monoklonalen Antikörper oder
das Antikörperfragment über die Aminogruppe gebunden werden.
Dies wird erreicht durch Verwendung eines abbaubaren
Peptidspacers, einen Dextranträger, einen säureempfindlichen
Spacer oder Polyglutaminsäure. Gruppen. die die
Bindung herstellen, umfassen: Carbonsäuregruppen synthetischer
Polyaminosäuren, wie Poly-L-Glutaminsäure und Poly-L-
Asparaginsäure, oder inerte Proteine, wie human-Serumalbumin
oder funktionalisierte Dextrane, wie Carboxymethyldextran,
können als Träger fungieren. Diese Träger können
eine Größe von 10 bis 60 Kilodalton aufweisen.
Typischerweise ist jeder Antikörper oder jedes Antikörperfragment
spezifisch für ein Antigen auf der Zelloberfläche,
welche als Ziel von Ida angepeilt werden
soll. So kann z. B. der Antikörper oder das Antikörperfragment
spezifisch für ein bestimmtes target-Gewebe,
wie z. B. menschlisches Neoplasma, sein. Beispiele
menschlischer Neoplasmen, die mit Ida angepeilt werden
sollen, sind Brustkrebs, Colonkrebs, Lungenkrebs,
Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Thymuskrebs und andere
Krebsarten, Sarkomata und Leukämien. Alternativ kann der
Antikörper oder das Antikörperfragment spezifisch für
ein tierisches Neoplasma sein. Es kann ein Antikörper
oder Antikörperfragment eingesetzt werden, das spezifisch
für human-Transferrin-Rezeptor (TFR) ist, der auf sich
teilenden Zellen, erythroiden Prekursorzellen und den
Zellen einer Vielzahl von Tumoren, vorliegt. Ein geeigneter
anti-TFR-monoklonaler Antikörper ist z. B. ein
Antikörper auf Transferrin-Rezeptor auf LiCR-LON-HMy-2
(HMy-2)-Zellen.
Wenn die Immunglobulin-Konjugate eingesetzt werden sollen,
um eine spezifische T-Lymphocyten-Population zu
verarmen, so ist der Antikörper oder das Antikörperfragment
spezifisch für ein Zelloberflächenantigen,
welches wiederum spezifisch für diese T-Lymphocyten ist.
Der Antikörper oder das Antikörperfragment können
selbst spezifisch für eine Population von Helfer-,
Supressor- oder cytotoxischen T-Lymphocyten sein.
Vorzugsweise stellt der monoklonale Antikörper oder
das Antikörperfragment die gleiche Spezies dar, gegen die
das Immunglobulinkonjugat verabreicht wird. Ein Human-
oder Maus-monoklonaler Antikörper oder ein entsprechendes
Antikörperfragment werden deshalb typischerweise
dann eingesetzt, wenn eine Verabreichung des Konjugats
am Menschen beabsichtigt ist. Außerdem gehört der Antikörper
oder das Antikörperfragment vorzugsweise der
IgG-Klasse an. Das Antikörperfragment kann das Fab, Fab′
oder F(ab′)₂-Fragment darstellen. Eingesetzt werden kann
auch das IgM-Monomer, das sich durch die abbauende Wirkung
proteolytischer Enzyme aus IgM-Antikörper gewinnen
läßt.
Die Immunglobulinkonjugate werden gemäß der Erfindung
nach einem Verfahren hergestellt, welches die Konjugation
von Ida an den monoklonalen Antikörper oder ein Fragment
davon umfaßt. Vorzugsweise wird ein 14-Halogen-Ida mit
dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon umgesetzt.
Der Substituent in 14-Position kann Fluor, Chlor,
Brom oder Jod darstellen, vorzugsweise Brom. 14-Brom-Ida
wird in US-A 41 25 607 beschrieben. Die Konjugation kann
somit durch ein Verfahren erzielt werden, das folgende
Schritte umfaßt:
- (a) Vermischen des monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments davon mit einem molaren Überschuß von 14-Halogen-Ida,
- (b) Umsetzen des Gemisches bei 18 bis 37°C,
- (c) Entfernen jeglichen Niederschlages,
- (d) Entfernen von nicht-umgesetzten Ausgangsmaterialien durch Gelfiltration, und
- (e) Entfernen von adsorbiertem Arzneimittel (Ida) durch Adsorptionschromatographie oder Ionenaustauschchro matographie.
Schritt (a) wird typischerweise in einem wassermischbaren
organischen Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid,
durchgeführt. Vorzugsweise beträgt der molare Überschuß
von 14-Halo-Ida in Schritt (a) das 0- bis 50-fache.
In Schritt (b) wird die Reaktion vorzugsweise in einem
Zeitraum von 1 bis 8 h durchgeführt. Typischerweise ist
die Reaktionstemperatur die Raumtemperatur.
Es können jedoch auch andere Methoden der Konjugation
angewendet werden. Wenn ein Konjugat gewünscht wird, das
einen inerten Träger oder Linker, eingeschoben zwischen
Ida und dem monoklonalen Antikörper oder dem Antikörperfragment,
aufweist, so wird der Träger oder Linker typischerweise
zunächst an das C-14-Kohlenstoffatom von
Ida angebracht und wird dann an den Antikörper oder das
Antikörperfragment gebunden. Wie vorstehend erwähnt, kann
der Antikörper oder das Antikörperfragment auch an Ida
über die Aminogruppe gebunden werden, wobei man einen
abbaubaren Peptidspacer, einen Dextranträger, einen
säureempfindlichen Spacer oder Polyglutaminsäure verwendet.
Die Immunglobulinkonjugate gemäß der Erfindung können zur
humanen oder veterinären Behandlung von Krebs eingesetzt
werden. Dazu wird eine therapeutisch wirksame Menge des
Konjugats verabreicht. Der Krebs kann einen festen Tumor,
einen Ascitestumor oder eine Leukämie darstellen. Die zu
behandelnden Neoplasmen sind die vorstehend genannten.
Es können zwei oder mehrere Konjugate, in denen der monoklonale
Antikörper oder das Antikörperfragment jeweils
eine unterschiedliche Spezifität aufweisen, verabreicht
werden.
Das Konjugat kann durch Injektion verabreicht werden. Es
kann parenteral, z. B. intravenös, gegeben werden. Es
kann lokal oder direkt in den Tumor verabreicht werden.
Die an einen Patienten zu verabreichende Konjugatmenge
ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, wie z. B. dem
zu behandelnden Tumor und dem Zustand des Patienten.
Typischerweise wird eine Dosis von 10 bis 200 mg Konjugat
pro m² Körperfläche eines Patienten
verabreicht. Die Konjugate kön
nen mit anderen chemotherapeutischen Agenzien oder mit
Agenzien verabreicht werden, die die Aktivität der Konjugate
verstärkt, wie z. B. vasoaktive Agenzien oder
Tumor-Necrose-Faktor.
Die Immunglobulinkonjugate können auch dazu verwendet
werden, spezifisch eine Untergruppe der T-Lymphocyten
aus einer Zellpopulation zu verarmen. Dazu wird eine therapeutisch
wirksame Menge eines Konjugats, welches einen
monoklonalen Antikörper oder ein Antikörperfragment gegen
ein Zelloberflächenantigen, das auf den zu verarmenden
Lymphocyten vorliegt, eingebaut enthält, an Menschen
oder Tiere verabreicht. Alternativ kann eine Zellpopulation
in vitro mit einem solchen Konjugat inkubiert
werden.
Es kann eine Kombination von Konjugaten gegen zwei oder
mehrere Zelloberflächenantigene verwendet werden. Die zu
verarmenden Lymphocyten können Helfer-, Suppressor- oder
cytotoxische T-Zellen darstellen.
Die Erfindung ist somit geeignet, die Abstoßung von
transplantiertem Gewebe in einem Transplantatempfänger
zu verhindern. Die Konjugate können als immunsuppressive
Agenzien dienen. Dazu wird eine wirksame Konjugatmenge
zur Verhinderung der Transplantatabstoßung an den
Transplantatempfänger verabreicht. Vorzugsweise sind es
in diesem Fall cytotoxische T-Zellen, die verarmt werden
sollen. Krebs beim Menschen oder Tier kann durch
Verarmung von Suppressor-T-Zellen mittels Verabreichung
eines geeigneten Konjugats behandelt werden. Autoimmunerkrankungen
können durch Verabreichung eines Konjugats
zum Zwecke der Verarmung von Helfer-T-Zellen behandelt
werden. Die Verabreichungsweise und die Dosis des Konjugats
sind für jeden Fall die vorstehend genannten.
Die Immunglobulinkonjugate werden mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel zu pharmazeutischen
Mitteln formuliert. Dazu kann jeder geeignete
Träger bzw. Verdünnungsmittel verwendet werden.
Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen physiologische
Kochsalzlösung und Ringer′sche-Dextroselösung.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.
In den beiliegenden Zeichnungen betreffen Fig. 1 bis 12
das Beispiel 1 und Fig. 13 bis 17 das Beispiel 2. Insbesondere
stellt
Fig. 1 die Struktur von Anthracyclinderivaten dar;
Fig. 2 stellt die Kopplung von Idarubicin (Ida) an
anti-Ly-2.1 (0,5 mg) dar: Mol Ida inkorporiert
pro Mol anti-Ly-2.1 (∎) (linke Ordinate) und
Proteinanteil (⚫) (rechte Ordinate) sind als
Funktion der Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch
(Abszisse) dargestellt;
Fig. 3 stellt den Antikörpertiter dar, bestimmt als
% rosettenbildende Zellen (Ordinate) gegen die
Antikörperverdünnung (-1) (Abszisse) von anti-
Ly-2.1-Konjugaten auf ITT(1) 75 NS E3 target-Zellen.
Serienmäßige Verdünnungen wurden mit einer
0,5 mg/ml-Lösung von entweder anti-Ly-2.1 (▲)
oder anti-Ly-2.1 mit 2(⚫) oder 8 (○) Mol Ida/Mol
Antikörper durchgeführt.
Fig. 4 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida (∎) oder
Ida-anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper, (⚫)
auf E3-Zellen in einem 24-stündigen Assay, wobei
die prozentuale Inhibierung der [³H] Thymidininkorporierung
(Ordinate) gegen die Konzentration
von Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;
Fig. 5 gibt die inhibierende Wirkung von Ida (∎), Ida-
anti-Ly-2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (⚫) oder
Ida-anti-TFR, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (○) auf
(Ly-2⁺) E3-Zellen in einem 30minütigen Inhibierungsassay
wieder, wobei die prozentuale Inhibierung
der [³H] Thymidininkorporierung (Ordinate)
gegen die Konzentration von Ida(M) (Abszisse)
aufgetragen ist;
Fig. 6 zeigt die inhibierende Wirkung von Ida-anti-Ly-
2.1, 5 Mol Ida/Mol Antikörper (○) und Konjugat
plus anti-Ly-2.1 (⚫) auf E3-target-Zellen in
einem 30minütigen Spezifitätsassay, wobei die
prozentuale Inhibierung der [³H] Thymidininkorporierung
(Ordinate) gegen die Konzentration von
Ida(M) (Abszisse) aufgetragen ist;
Fig. 7 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBF₁-Mäusen,
subkutan injiziert mit 2 × 10⁶ Zellen. Gruppen
von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie
dies durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (),
Ida (∎), anti-Ly-2.1 (▲), Ida-anti-TFR (○) oder
Ida-anti-Ly-2.1 (⚫). Mittlere Tumorgröße (cm²)
(Ordinate) ist gegen Tage nach der Tumorinokulation
(Abszisse) aufgetragen. Die eingetragenen
Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren Standardfehler
dar;
Fig. 8 zeigt einzelne Tumorwachstumskurven von CBF₁-
Mäusen, subkutan injiziert mit 2,0 × 10⁶ E3-
Tumorzellen und intravenös an den Tagen 4 und 5
mit Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat behandelt. Die Tumorgröße
(cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach
der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen;
Fig. 9 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBF₁-Mäusen,
subkutan injiziert mit 3,0 × 10⁶ Zellen. Gruppen
von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt, wie
dies durch einen Pfeil angegeben ist; PBS ();
anti-Ly-2.1 (▲), Ida (∎) oder Ida-anti-Ly-2.1-
Konjugat (⚫). Die mittlere Tumorgröße (cm²)
(Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation
(Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen
stellen den ± mittleren Standardfehler
dar; und
Fig. 10 zeigt das Wachstum von E3-Thymom in CBF₁-Mäusen,
subkutan injiziert mit 3,0 × 10⁶ Zellen. An Gruppen
von 10 Mäusen wurde eine Intratumorbehandlung
durchgeführt, wie dies durch einen Pfeil angezeigt
ist; PBS (); anti-Ly-2.1 (▲), Ida (∎)
oder Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat (⚫). Die mittlere
Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage
nach der Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen.
Die Fehlerabweichungen stellen den ± mittleren
Standardfehler dar;
Fig. 11 zeigt das Wachstum von COLO 205 Human-Tumor-
Xenotransplantat in nackten Mäusen, subkutan injiziert
mit 2 × 10⁶ Zellen. Gruppen von 10 Mäusen
erhielten die folgende intravenöse Behandlung,
die durch einen Pfeil angezeigt ist; PBS (∆),
freies Ida (⬩), Ida-250-30.6-Konjugat (⚫), Gemisch
von Ida und 250-30.6 () und 250-30.6 (▲).
Die mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen
die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse)
aufgetragen. Die Fehlerabweichungen stellen
den ± mittleren Standardfehler der Tumorgröße
dar;
Fig. 12 gibt einzelne Tumorwachstumskurven von nackten
Mäusen mit Fremdtransplantat wieder, wobei die
Mäuse i. v. (Pfeil) mit Ida-250-30.6-Konjugat behandelt
wurden. Die gestrichelte Linie gibt die
mittlere Tumorgröße in PBS-behandelten Mäusen
wieder. Die Tumorgröße (cm²) (Ordinate) ist gegen
die Tage nach der Tumorinokulation (Abszisse)
aufgetragen;
Fig. 13 zeigt die Kopplung von Idarubicin (Ida) an anti-
L3T4 (0,5 mg). Mol Ida, inkorporiert pro Mol
anti-L3T4 (⬩) (linke Ordinate) und Proteinanteil
(⚫) (rechte Ordinate) werden als Funktion der
Anzahl nMol Ida im Reaktionsgemisch (Abszisse)
wiedergegeben;
Fig. 14 zeigt den Antikörpertiter, gemessen als % Roset
ten-bildende Zellen (Ordinate) gegen die Antikörperverdünnung
(x 10-1) (Abszisse) von anti-Thy-1-
Konjugaten auf ITT(1) 75NS E3 target-Zellen. Es
wurden serienmäßige Verdünnungen mit 1.0 mg/ml
Lösung von entweder anti-Thy-1 (⬩) oder Konjugat
mit 1 (○), 4 (⚫) oder 7 () Mol Ida/Mol anti-
Thy-1 durchgeführt;
Fig. 15 zeigt die Wirkung der Ida-MoAb- und MoAb-Behandlung
auf die Anzahl von L3T4⁺ und Ly-2⁺ Zellen
in der Milz in Ida-anti-L3T4-behandelten (⚫-⚫),
anti-L3T4-behandelten (▲-▲), Ida-anti-Ly-2.1-
behandelten (⚫ . . . ⚫), anti-Ly-2.1-behandelten
(▲ . . . ▲) oder unbehandelten ( . . . ) Mäusen, wobei
die % Rosetten-bindenden Zellen (Ordinate) gegen
die Zeit in Tagen (Abszisse) aufgetragen sind;
Fig. 16 zeigt die Wirkung einer kombinierten Ida-MoAb-
Konjugat-Behandlung auf das Überleben eines
P388D1-Tumortransplantats als (across) H-2 und Nicht-
H-2-Unterschiede) in CBA-Mäusen. Gruppen von
10 bis 15 Mäusen wurden subkutan 8,0 × 10⁶ P388D1
Tumorzellen injiziert und erhielten jeweils
intravenös (Pfeil): (i) PBS (⬩), (ii) anti-L3T4
und anti-Ly-2.1 (○), (iii) Ida-anti-L3T4 (∎),
(iv) Ida-anti-Ly-2.1 (⚫) und (v) Ida-anti-L3T4
und Ida-anti-Ly-2.1 (▲). Die mittlere Tumorgröße
(cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation
(Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerabweichungen
geben den ± mittleren Standardfehler
wieder; und
Fig. 17 zeigt die Wirkung von Ida-anti-Thy-1-Konjugat
auf das Überleben eines P388D1-Tumortransplantats
in CBA-Mäusen. Gruppen von 10 Mäusen wurden
subkutan mit 1,0 × 10⁷ P388D1 Tumorzellen
injiziert und erhielten jeweils intravenös
(Pfeil): (i) PBS (), (ii) anti-Thy-1 (⚫) und
(iii) Ida-anti-Thy-1 (▲). Die mittlere Tumorgröße
(cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach der
Tumorinokulation (Abszisse) aufgetragen. Die
Fehlerkreuze stellen den ± mittleren Standardfehler
dar;
Fig. 18 zeigt das Wachstum von COLO 205 (30.6⁺, 17.1⁺)
Xenotransplantat in nackten Mäusen, injiziert
mit 8 × 10⁶ Zellen/Maus. Gruppen von 10
Mäusen wurden intraperitoneal behandelt, wie
durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS (); 17.1-
Ida (○); 30.6-Ida (∆) oder einem Gemisch aus
30.6-Ida und 17.1-Ida (⚫). Die mittlere Tumorgröße
(cm²) (Ordinate) ist gegen die Tage nach
der Tumorinokulation (Abszisse) auftragen. Die
Fehlerkreuze geben den mittleren ± Standardfehler
wieder. Die Gesamtdosis an Ida betrug 200 µg;
Fig. 19 zeigt das Wachstum von LIM 2210 Human-Colon-Tu
mor-Xenotransplantat in nackten Mäusen, die mit
einem Tumorfragment (1-5 mg) implantiert waren.
Gruppen von 10 Mäusen wurden intravenös behandelt,
wie durch einen Pfeil angezeigt, mit PBS
(); 17.1-Ida (⬩); JGT-13-Ida (▲); 27.1-Ida (⚫),
30.6-Ida (○). Mittlere Tumorgröße (cm²) (Ordinate)
ist gegen die Tage nach der Tumorinokulation
(Abszisse) aufgetragen. Die Fehlerkreuze
geben den ± mittleren Standardfehler wieder.
Die Gesamtdosis an Ida betrug 80 µg.
Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfassen
(Ly-2⁺) Mäuse-Thymom ITT(1) 75NS E3 Variante (E3) (Smyth
et al, J. National Cancer Inst. 1986 76 503-510), (Ly-2-,
TFR-) Lyphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-
535), (TFR⁺) Human-Zellinie CEM (Foley et al Cancer 1965
18 522-529) und die (250-30.6⁺) Human-Zellinie COLO 205.
Die Zellen wurden in vitro in Dulbecco′s modifiziertem
Eagle-Medium (DME) oder RPMI 1640-Medium (Flow
Laboratories, Sydney, Australien), ergänzt mit 10%
hitze-inaktiviertem Serum von neugeborenen Kälbern (Flow),
2 mM Glutamin (Commonwealth Serum Laboratories, Sydney,
Australien); 100 µg/ml Streptomycin (Glaxo, Melbourne,
Australien) und 100 I. E./ml Penicillin (Commonwealth
Serum Laboratories), gehalten. Der E3-Tumor wurde in
vivo mittels Serienpassage in (C57BL/6 × BALB/c)F₁-Mäusen
(CBF₁-Mäuse) gehalten. Zellen aus Ascites-Flüssigkeit
wurden zweimal in phosphatgepufferter physiologischer
Kochsalzlösung (PBS), pH 7,3, gewaschen und zentrifugiert
(400 g × 5 min), in PBS resuspendiert und subkutan (s. c.)
in die Abdomenwand von Mäusen injiziert; diese entwickelten
sich vor der Behandlung zu fühlbaren Tumoren. Die
Mäuse wurden einer Reihe von intravenösen (i. v.) oder
intratumor (i. t.)-Behandlungen unterworfen; die Größe
der Tumoren wurde täglich mit einer Schublehre gemessen,
wobei entlang den senkrechten Achsen der Tumore gemessen
wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße
(Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler) regi
striert.
CBA und (C57BL/6 × BALB/c) Mäuse (CBF₁-Mäuse) und nackte
(nu/nu) Mäuse wurden vom Department of Pathology,
Universität von Melbourne, zur Verfügung gestellt. Experimentelle
Gruppen von 8 bis 10 Mäusen, alle vom selben
Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experiment ver
wendet.
Verwendete MoAbs: (i) anti-Ly-2.1 (IgG1), reaktiv
auf Mäuse-Ly-2.1-Spezifität (Hogarth et al, Immunology
1982 46 135-144) und (ii) A3C6 (anti-TFR) (IgG1), reaktiv
auf human-Transferrinrezeptor (TFR) (Panaccio et al,
Immunology and Cell Biology 65, 461-472 (1987)); und
(iii) ein Antikörper, bezeichnet als 250-30.6, reaktiv auf
ein Antigen, welches auf human-Colon-Karzinomzellen vorkommt.
Die MoAbs wurden aus Ascites-Flüssigkeit durch Präzipitation
mit 40%igem Ammoniumsulfat isoliert, aufgelöst in
PBS und dialysiert gegen den gleichen Puffer. Diese rohen
Präparationen wurden entweder an Protein-A-Sepharose
(Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey) absorbiert, eingehend
mit PBS (pH 7,3) gewaschen und mit 0,2 M Glycin/
HCl (pH 2.8) eluiert, oder über eine Affigel-Blau-Säule
(Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Sydney) gegeben. Nach
Neutralisierung wurden die MoAbs gegen PBS dialysiert,
in Teile aufgeteilt und bei -70°C gelagert. A3C6 wurde
durch Immunisierung von CBA-Mäusen, intraperitoneal in
wöchentlichen Intervallen über drei Wochen mit 2 × 10⁶
LiCR-LON-HMy-2(HMy-2) Zellen (OKT9+ve), Entfernen der
Milz drei Tage nach der letzten Injektion und Verschmelzen
mit P3-NSI-AG4-1 (NS-1)-Zellen erhalten.
Intakte anti-Ly-2.1, anti-TFR-MoAb oder 250-30.6 (1-2
mg/ml in Boratpuffer, pH 8,0) wurden mit einem molaren
Überschuß (1-50) 14-Brom-4-demethoxydaunorubicin (Br-
Ida) in (N,N)-Dimethylformamid (DMF) zu 10 mg/ml aufgelöst.
Die Reaktion wurde 4 h lang bei Raumtemperatur
durchgeführt, dann wurde zentrifugiert (400 g × 5 min),
um jeglichen Niederschlag zu entfernen. Freies Br-Ida
und andere nicht-umgesetzte Ausgangsmaterialien wurden
durch Gelfiltrierungschromatographie unter Verwendung
einer Sephadex G-25-Säule (PD-10; Pharmacia) entfernt;
die Konjugate wurden dann über eine Säule von Porapak Q
(Millipore) zur Entfernung von jeglichem adsorbiertem
Arzneimittel gegeben (Niederwieser et al, J. Chromatog.
1971 54 215-223). Die Menge an Ida, die in den Arznei
mittel-MoAb-Konjugaten inkorporiert war, wurde durch
Extinktionsspektrophotometrie bei 483 mm (E₄₉₈=3,4 × 10³M-1cm-1)
und durch Proteinbestimmung (Bradford, Anal.
Biochem. 1976 72 248-253), bestimmt.
Ein Rosettenbildungs-Assay unter Verwendung von Schaf-
anti-Maus-Immunglobulin (SAMG) diente zur Bestimmung der
Antikörperaktivität von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich
zu freiem MoAb, das den gleichen Verfahren, wie sie bei
der Kopplungsmethode angewendet werden, unterzogen worden
war (Parish and Mc Kenzie, J. Immunol. Methods 1978 20
173-183).
(a) 24stündiges Inhibierungsassay: 100 µl Zellen (2-5 × 10⁶/ml)
wurden in eine Mikrotiterplatte mit flachem
Boden gegeben und 1 h bei 37°C inkubiert. Freies Ida-
rubicin (Ida) (aufgelöst in PBS) und Ida-MoAb-Konjugate
wurden aseptisch filtriert und Verdünnungen wurden
in sterilem PBS hergestellt; 50 µl freies Ida oder
Konjugat wurden zu den Zellen gegeben, wobei für jede
Probe zwei Ansätze verwendet wurden; Kontrollansätze
erhielten 50 µl PBS; die Zellen wurden bei 37°C,
7% CO₂, 24 h lang kultiviert.
(b) 30minütiges Inhibierungsassay: 200 µl Zellen (2-5 × 10⁶/ml)
wurden in sterilen Eppendorf-Röhrchen gesammelt,
in sterilem Arzneimittel oder Konjugat resuspendiert
und 30 min bei 37°C vermischt. Die Zellen
wurden dann zentrifugiert (400 g × 5 min), in Wachstumsmedium
resuspendiert; 100 µl aliquote Teile wurden
in eine Mikrotiterplatte unter Verwendung von
doppelten Ansätzen für jede Probe gegeben und dann
16 bis 24 h inkubiert. Nach der Inkubationsperiode
wurden zu beiden Assays 50 µl Wachstumsmedium, welches
1 µCi [³H]-Thymidin enthielt (spezifische
Aktivität=5 Ci/mMol; Amersham) zugegeben und die
Platten 2 bis 4 h inkubiert. Die Zellen wurden dann
geerntet und getrocknet; einzelne Proben wurden getrennt
und auf einem beta-Szintillationszähler gezählt.
Die Inkorporierung von[³H]-Thymidin wurde als
Prozentsatz der Inhibierung der Inkorporierung von
Kontrollproben ausgedrückt. Der Standardfehler für
jeden Punkt wurde durch Doppelbestimmungen ermittelt
und überstieg für jeden gegebenen experimentellen
Punkt nicht 5%.
Gruppen von 10 bis 20 CBA-Mäusen wurde eine einzige i. v.-
Injektion verschiedener Dosen Ida oder Ida-anti-Ly-2.1
verabreicht und das Überleben der Mäuse gegen die Dosis
des verabreichten Arzneimittels in mg/kg aufgetragen.
Die Organe dieser Mäuse wurden entfernt und vor Formalinfixierung
ausgewogen und mit Hämatoxilin und Eosin ange
färbt.
Br-Ida (Fig. 1) wurde kovalent an verschiedene MoAbs gekoppelt:
MoAbs auf human-TFR, auf ein Antigen, welches auf
human-Colonkrebszellen vorkommt (Antikörper 250-30.6) und
auf das Mäuse-Ly-2-Alloantigen. Die Reaktionsbedingungen
für die Konjugation variierten im Hinblick auf den molaren
Überschuß an Br-Ida, der zu den MoAbs zugegeben wurde,
wobei ein Kompromiß zwischen höherer Ida-Inkorporierung
und geringerer Proteinmenge (Proteinanteil) getroffen
wurde. Ida-anti-Ly-2.1 (Fig. 2), Ida-anti-TFR und Ida-
250-30.6 (Daten nicht gezeigt) haben 3 bis 5 Moleküle
Ida bei Proteinanteilen von über 50% inkorporiert. Die
Umsetzung von Br-Ida mit MoAbs könnte zu zwei Bindungstypen
führen (Fig. 1C und D). Um zu bestimmen, welcher
Bindungstyp vorlag, wurden die Konjugate 48 h lang einem
pH von 4,5 oder 9,0 ausgesetzt; das freigesetzte Arzneimittel
wurde an Porapak Q absorbiert und die Proben wurden
erneut durch Spektrophotometrie quantifiziert. 50%
des gebundenen Arzneimittels wurde bei Einwirkung der
Base (pH 9,0) freigesetzt, während sich bei pH 4,5 kein
Verlust zeigte. Dies ist ein Hinweis dafür, daß mindestens
50% des Arzneimittels eine Esterbindung aufweist
(Fig. 1D), da die Esterbindung gegenüber basischen Bedingungen
empfindlich ist, während die Aminbindung stabil
ist.
Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden
nach der Rosettenbildungsmethode gemessen und wurden bestimmt
als die Verdünnung, bei der 50% der Zielzellen
Rosetten zeigten. Ida-anti-Ly-2.1-Konjugate, die 2 und 8
Moleküle Ida enthielten, wiesen Antikörpertiter gegen
E3-Zellen von jeweils 1 : 56 000 und 1 : 33 000 auf, während
der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1 : 80 000
betrug (Fig. 3). Ida-250-30.6-Konjugate, die 2 und 6
Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörpertiter gegen
COLO 205-Zellen von jeweils 1 : 16 000 und 1 : 11 000, während
der Titer von nicht-konjugiertem Antikörper 1 : 33 000
betrug. Somit ergibt sich aufgrund des Konjugationsverfahrens
ein Verlust der Antikörperaktivität; Konjugate
mit weniger als 6 Molekülen Ida pro MoAb wurden für in
vitro und in vivo Untersuchungen eingesetzt. Es wurde
festgestellt, daß die Löslichkeit und Antikörperaktivität
von Ida-anti-Ly-2.1-Konjugaten über diese Niveaus der Ida-
Inkorporierung hinaus deutlich abnahm (Daten nicht wiedergegeben).
Die maximale Anzahl an Ida-Molekülen, die eingebaut
werden kann, variiert in Abhängigkeit von dem
jeweiligen Antikörper.
Die in vitro Cytotoxizität von Ida und zwei Ida-MoAb-Konjugaten
auf Mäuse-ITT(1) 75NS E3-Zellinie (Ly-2⁺TFR-) und
die menschliche CEM-Zellinie (Ly-2-TFR⁺) wurde in einem
24stündigen Inhibierungsassay gemessen und die Werte für
I.D₅₀ (50%ige Inhibierung der [³H]-Thymidin-Inkorporierung
der Kontrollproben) bestimmt. Die Ergebnisse sind
in Fig. 4 und Tabelle 1 wiedergegeben. I.D₅₀ für Ida lag
im Bereich von 1,0 bis 2,5 × 10-7 M für beide der untersuchten
Zellinien (Fig. 4, Tabelle 1). I.D₅₀ für Ida-
anti-Ly-2.1 auf E3 war viermal größer (Fig. 4); für Ida-
anti-TFR auf CEM waren die I.D₅₀-Werte 1-2 mal größer
als die für freies Ida (Tabelle 1). Somit ist freies Ida
toxischer sowohl auf E3 als auch auf CEM als jeweils Ida-
anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR. Diese Ida-MoAb-Konjugate
zeigen jedoch eine zehnfach niedrigere Cytotoxizität als
nicht-reaktive Zellinien (Tabelle 1) und geben damit an,
daß ihre cytotoxische Wirkung spezifisch war und sich aus
der Beibehaltung der Antikörperaktivität ergab (Fig. 3).
Die Ida-250-30.6-Konjugate waren etwas weniger aktiv
als freies Ida. Freies Ida zeigte einen I.D.₅₀-Wert von
6 × 10-8M, während das Konjugat ein I.D.₅₀ von 3,5 × 10-7M
auf die target-Zellinie COLO 205 ergab.
Zur Bestimmung, ob die Konjugate eine Selektivität in
ihrer cytotoxischen Wirkung auf target-Zellen ausüben,
wurden Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-TFR 30 min lang mit
E3 (Ly-2⁺)-Zellen inkubiert und dann das nicht-gebundene
Konjugat weggewaschen und die Cytotoxizität bestimmt.
Das Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat hatte ein I.D.₅₀ von 6,2 × 10-7M
im Vergleich zu einem I.D.₅₀ von 5,2 × 10-7M für
freies Ida (Fig. 5). Im Gegensatz dazu zeigte das nichtreaktive
Ida-anti-TFR-Konjugat ein I.D.₅₀ von 5,0 × 10-6M,
i. e. zehnmal größer als das für freies Ida, wobei
gezeigt wird, daß die Antikörper-bindende Aktivität von
Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat in einer selektiven Cytotoxizität
resultiert. In gleicher Weise wurden Ida-250-30.6-
Konjugat und freies Arzneimittel 30 min mit COLO 205
(250-30 +ve) und E3 (250-30.6 -ve)-Zellinien inkubiert
und dann gewaschen, sowie anschließend ein Cytotoxizitätsassay
durchgeführt. Beide Zellinien zeigten eine
ähnliche Dosisresponse auf freies Arzneimittel, i. e.
9,2 × 10-7M für COLO 205 und 9,8 × 10-7M für E3. Das
Ida-250-30.6-Konjugat war viermal toxischer auf COLO 205
als die Antikörper-nicht-reaktive E3-Zellinie. Ähnliche
Ergebnisse wurden unter Verwendung der CEM-Zellinie und
Ida-anti-Ly-2.1- als eine nicht-reaktive Kontrolle erhalten
(Daten nicht gezeigt). Um im weiteren sicherzustellen,
daß die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten auf
target-Zellen spezifisch war und an der Antikörper-
Bindungsstelle erfolgte, haben wir Untersuchungen zur
Inhibierung der Konjugat-Cytotoxizität unter Verwendung
von freiem MoAb durchgeführt. Bei einer Ida-Konzentration
von 4,0 × 10-6M (2 µg anti-Ly-2.1) war die Cytotoxizität
von anti-Ly-2.1-Konjugat auf E3-Zellen durch Zugabe
von 50 µg (250 µg/ml) anti-Ly-2.1 um 70% reduziert
(Fig. 6), was darauf hinweist, daß die Cytotoxizität des
Ida-anti-Ly-2.1-Konjugats in direktem Zusammenhang zu
dessen Antikörper-Bindungsfähigkeit steht. Ähnliche Kontrollergebnisse
wurden mit 250-30.6 erhalten. Es ist
darauf hinzuweisen, daß in sämtlichen Assays freies anti-
Ly-2.1, anti-TFR und 250-30.6 nicht-cytotoxisch waren
(Daten nicht gezeigt).
Zur Ermittlung der Wachstumsinhibierung von festen Tumoren
wurden Gruppen von CBF₁-Mäusen (10 pro Gruppe), die
mit 2,0 × 10⁶ E3-Zellen im Abdominalbereich inokuliert
waren, mit einer der folgenden i. v. Injektionen behandelt:
(i) PBS; (ii) anti-Ly-2.1; (iii) Ida; (iv) Ida-
anti-TFR; oder (v) Ida-anti-Ly-2.1. Die Mäuse erhielten
jeweils 20 µg Ida und/oder 1200 µg anti-Ly-2.1 an den
Tagen 4 und 5 (Tumorgröße=0,1cm²) nach der Tumorinoku
lation.
Innerhalb 24 h der ersten Behandlung wiesen die mit Ida-
anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse eine mittlere Tumorgröße
von 20% derjenigen Mäuse auf, die mit PBS behandelt
wurden (i. e. eine 80%ige Abnahme der Tumormasse (Fig. 7));
es war offensichtlich, daß anti-Ly-2.1 allein und Ida,
welches kovalent an nicht-spezifischen anti-TFR-MoAb gebunden
war, nicht das E3-Tumorwachstum beeinflußte. Die
Tumoren von Mäusen, die nur Ida erhielten, waren bis zu
50% reduziert; drei von diesen Mäusen starben jedoch
und die anderen zeigten eine 25%ige Verringerung des
Körpergewichts. Die einzelnen Tumorwachstumskurven von
Mäusen, die Ida-anti-Ly-2.1 erhielten, zeigten eine
Regression bei 9 aus 10 Tumoren im Laufe der Behandlung
(Fig. 8); in der Tat gingen 5 von 10 Tumoren vollständig
zurück und traten auch nicht wieder auf (< 200 Tage);
die Tumoren, die nach Abschluß der Behandlung weiterwuchsen
(5 von 10), wuchsen mit langsameren Geschwindigkeiten
als die Tumoren der mit PBS und Ida-anti-TFR behandelten
Mäuse. Es wurde ein weiteres Experiment durchgeführt,
um die i. v. Behandlung von größeren Tumoren
mit Hilfe von Ida-anti-Ly-2.1 zu beurteilen. Gruppen von
CBF₁-Mäusen (10 pro Gruppe) wurden mit 3,0 × 10⁶ E3-
Zellen inokuliert; die Mäuse erhielten dann jeweils 15 µg
und 900 µg Ida und anti-Ly-2.1 an den Tagen 6 (Tumor
größe=0,2 cm²) und 7 nach Tumorinokulation (Fig. 9).
Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse hatten eine
mittlere Tumorgröße von 50% derjenigen der mit PBS behandelten
Mäuse und 66% derjenigen mit Ida behandelten
Mäuse am Tag 7; dieser Trend setzte sich bis zum Abschluß
der Studie fort (Tag 18). Die einzelnen Tumorwachstumskurven
der 10 CBF₁-Mäuse, die Ida-anti-Ly-2.1
erhielten, zeigten, daß vier Regressionen und eine vollständige
Entfernung der Tumormasse (< 200 Tage; Daten
nicht gezeigt) vorlag. Somit war Ida-anti-Ly-2.1 wirksam
gegen große Tumoren; in beiden Experimenten war die
anti-Tumoraktivität von Ida merklich verbessert, wenn
dieses an anti-Ly-2.1-MoAb gekoppelt war.
Die Wirkung von Ida-anti-250-30.6-Konjugat wurde in
nackten (nu/nu) Mäusen mit Xenotransplantaten, unter
sucht.
Die subkutane Injektion von 2 × 10⁶ Zellen in die Abdominalwand
ergab innerhalb von 4 Tagen einen fühlbaren
Klumpen (ca. 0,1 cm²). Gruppen von 10 Mäusen wurden dann
mit einer der folgenden i. v. Injektionen behandelt:
(i) PBS; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 250-30.6 (nichtkonjugiert);
(iv) Ida; (v) Ida-250-30.6-Konjugat. Insgesamt
wurden 275 µg Ida in einer Reihe von 5 intravenösen
Injektionen an den Tagen 4, 5, 6, 10 und 12 nach
Tumorinokulation gegeben.
In den Gruppen von Mäusen, die mit PBS oder mit nichtkonjugierten
250-30.6 behandelt worden waren, zeigte
sich kein therapeutischer Effekt. Mit Ida allein überlebten
2 von 10 Mäusen, während sämtliche Mäuse der
Gruppe, die nicht-konjugiertes Ida plus 250-30.6 erhielten,
am siebten Tage tot waren, wobei sie vorher Toxizitätssymptome
zeigten, wie z. B. Gewichtsverlust. Die
Mäuse, die Ida-250-30.6-Konjugat erhielten, zeigten eine
dramatische Reaktion der Tumorgröße. Diese Ergebnisse
sind in Fig. 11 wiedergegeben. Tumorwachstumskurven für
die einzelnen Mäuse (Fig. 12) zeigten, daß 5 von 7 Mäusen
Tumoren aufwiesen, die am siebten Tag zurückgegangen
waren; diese Tumoren wuchsen weiter fort, wobei 2 von
10 Mäusen ohne Tumoren verblieben. Diese Mäuse zeigten
keine Toxizitätseffekte.
Die Intratumor-Therapie hat sich als eine nützliche
Methode der Immuntherapie von tierischen und menschlichen
Tumoren erwiesen. Im folgenden wurden Untersuchungen
durchgeführt, um die anti-Tumoraktivität von Ida-anti-
Ly-2.1-Konjugaten, wenn diese direkt in den festen E3-
Tumor verabreicht wurden, zu charakterisieren. Gruppen
von 10 CBF₁-Mäusen, denen s. c. 3,0 × 10⁶ E3-Zellen implantiert
worden waren, entwickelten 5 Tage nach der
Tumorinokulation Tumoren (0,1 bis 0,2 cm²). Die Behandlungen
bestanden aus 2 Injektionen an den Tagen 5 und 6
nach der Tumorimplantation, wobei die Mäuse eine der folgenden
Behandlungen erhielten: (1) PBS; (2) Ida; (3)
anti-Ly-2.1; oder (4) Ida-anti-Ly-2.1 (Gesamt-Ida=30
µg). Ida-anti-Ly-2.1 zeigte die größte anti-Tumoraktivität;
freies Ida und anti-Ly-2.1 allein beeinflußten das
Tumorwachstum nicht, wenn sie direkt in den Tumor verabreicht
wurden. Die mit Ida-anti-Ly-2.1 behandelten Mäuse
wiesen eine mittlere Tumorgröße von 60% derjenigen
der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 8 auf, und 30%
derjenigen der mit PBS behandelten Mäuse am Tag 13 (Fig.
10). Die einzelnen Tumorwachstumskurven (Daten nicht gezeigt)
von Ida-anti-Ly-2.1-behandelten Mäusen ergaben
eine vollständige Regression, während sich bei den restlichen
Mäusen eine verzögerte Reduktion des Tumorwachstums
3 Tage nach Abschluß der Behandlung zeigte.
In den Experimenten zur akuten Toxizität wurde Gruppen
von 10 CBA (Ly2.1⁺)-Mäusen eine einzige Injektion ver
schiedener Dosen von entweder Ida, Ida-anti-Ly-2.1 oder
Ida-anti-TFR verabreicht. Alle Mäuse, die mit Ida injiziert
wurden, zeigten anfangs einen Gewichtsverlust von
bis zu 25% des ursprünglichen Gewichtes; bei den mit
Ida-MoAb-Konjugat behandelten Mäusen wurde kein Gewichtsverlust
beobachtet. Tabelle 2 gibt die Toxizität
von Ida und Ida-MoAb-Konjugaten als LD₅₀- und LD₁₀-Werte
wieder. Wie gezeigt, beträgt LD₁₀ von Ida-anti-Ly-2.1
10,0 mg/kg, bezogen auf Ida, im Vergleich zu nur 0,75
mg/kg für freies Ida. Außerdem zeigte das Ida-anti-TFR-
Konjugat ein LD₁₀ von 8,0 mg/kg. Ida-MoAb-Konjugate
wurden nicht im Hinblick auf die LD₅₀-Dosis getestet.
Diese Ergebnisse zeigen den größeren therapeutischen
Index von Ida-MoAb-Konjugaten im Vergleich zu freiem
Ida.
Die intravenöse Verabreichung von freiem
Ida (1,0 mg/kg) führte zu einer Atrophie der weißen Pulpa
der Milz 15 Tage nach Behandlung und einer gewissen
Hypertrophie der Herzmuskelfasern (Daten nicht angegeben).
Im Gegensatz dazu ergab eine einzelne Dosis von Ida-anti-
Ly-2.1 (2,4 mg/kg) keine nicht-spezifische Gewebetoxizität
nach 15 und 30 Tagen, obwohl eine geringe Schwellung
der Hepatocyten am Tag 15 beobachtet wurde.
(DBA/2 × BALB/c)F₁ und CBA-Mäuse wurden vom Department
Pathology, University of Melbourne, zur Verfügung gestellt.
Experimentelle Gruppen von 10 bis 20 Mäusen,
von gleichem Geschlecht und Alter, wurden in jedem Experiment
verwendet.
Die in dieser Studie untersuchten Zellinien umfaßten die
(Ly-2⁺) Mäusethymom ITT(1)75NS E3-Variante (E3), (L3T4⁺)
Lymphom EL4 (Horowitz et al, Science 1968 160 533-535),
menschliches Colon-Karzinom Colo 205 (Semple et al,
Cancer Res. 1978 38 1345-1355) und (Ly-2-, L3T4-)
menschliche T-Zellenleukämie CEM (Foley et al, Cancer
1965 18 522-529). In vitro wurden die Zellen gehalten,
wie dies in Beispiel 1 beschrieben wird. Die P388D1
Makrophagen-Zellinie wurde in vivo durch serienmäßige
Passage in (DBA/2 × BALB/c)F₁-Mäusen erhalten. Zellen
aus der Ascitesflüssigkeit wurden zweimal in phosphatgepufferter
biologischer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,3) ge
waschen und zentrifugiert (400 g × 5 min), in PBS resuspendiert
und s. c. in die Abdominalwand von Mäusen injiziert,
wo diese fühlbare Tumortransplantate entwickelten.
Die Mäuse wurden dann einer Reihe von i. v. Behandlungen
unterworfen, und die Größe der Tumoren wurde täglich mit
einer Schublehre gemessen, wobei entlang der senkrechten
Achse der Tumoren ausgemessen wurde. Die Daten wurden
als mittlere Tumorgröße (Produkt von zwei Durchmessern
± Standardfehler) registriert.
Monoklonale Antikörper auf Mäuse-Zelloberflächenantigene
L3T4, Ly-2 und Thy-1, die bestimmte Subpopulationen von
Lymphocyten charakterisieren, wurden als Modellsystem
verwendet.
Es wurden folgende monoklonale Antikörper (MoAbs) verwendet:
(i) anti-Ly-2.1 (Mäuse-IgG2a), reaktiv mit Mäuse-
Ly-2.1-Spezifität (Horgarth et al, Immunology 1982 46 135-144),
(ii) H129.19 (anti-L3T4) (Ratten-IgG2b) reaktiv
mit Mäuse-L3T4-Spezifität (Pierres et al, J. Immunology
1984 132 2775-2782) und (iii) anti-Thy-1 (Ratten IgG2b)
reaktiv mit Mäuse-T-Zellen (Marshak-Rothstein et al,
J. Immunology 1979 122 2491-2497). Die Antikörper wurden
isoliert, gereinigt und wie im Beispiel 1 beschrieben
gelagert. Die Antikörperaktivität wurde durch ein Rosettenbildungsassay
mit Schaf-anti-Mäuse-Immunoglobulin
(SAMG), wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, bestimmt.
MoAb (1-2 mg/ml) wurde mit einem 5 bis 20 molaren Über
schuß von 14-Brom-4-demethoxydaunorubicin (Br-Ida), aufgelöst
in (N,N)-Dimethylformamid (10 mg/ml), 4 h lang
bei pH 8,0 (0,05 M Boratpuffer) und Raumtemperatur vermischt.
Dabei erfolgte die Umsetzung; es wurde eine Reinigung
durchgeführt, und die Menge an Ida, die in dem
erhaltenen Konjugat eingebaut war, wurde, wie dies im
Beispiel 1 beschrieben ist, bestimmt.
Es wurden zwei Assays (24 h und 30 min) durchgeführt, um
die Arzneimittelaktivität zu bestimmen (die Bestimmung
erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben), wobei Zellen in
einer Konzentration von 1 bis 5 × 10⁶/ml eingesetzt wur
den.
Bei sämtlichen Experimenten wurde eine Rosettenbildungs-
Methode angewendet, um den Antikörpertiter und die Anzahl
an L3T4⁺ und Ly-2⁺-Zellen zu bestimmen. Diese Methode
involvierte die Bindung von SAMG, mit dem auch Ratten-
Immunglobulin (Ig) nachgewiesen werden kann, gekoppelt
an rote Blutzellen von Schaf (SRC), zum Nachweis von Antikörpern
auf der Oberfläche lymphoider Zellen. Bei Ig⁺-
Milzzellen war das Oberflächen-Ig durch Maskieren
(capping) mit SAMG entfernt (75 µl und 2 ml Zellen bei
10⁷/µl); Zellen wurden dann auf Eis in einem Medium gehalten,
das 0,01% Natriumazid enthielt, um die Resynthese
von Immunglobulin zu verhindern.
Die Untersuchung wurde in separaten Phasen durchgeführt:
- (a) in vitro Charakterisierung von drei verschiedenen Ida-MoAb-Konjugaten, und
- (b) Nachweis ihrer Nützlichkeit bei der aktiven Verarmung von T-Zellen-Untergruppen vor oder nach dem Abstoßen eines Tumorzellen-Allotransplantats.
Br-Ida wurde kovalent an monoklonale Antikörper auf
Mäuse-L3T4, Ly-2 und Thy-1-Antigene gekoppelt. Die
Reaktionsbedingungen für die Konjugate variierten im
Hinblick auf molaren Überschuß von Br-Ida, der zu dem
monoklonalen Antikörper (MoAb) zugegeben wurde; dabei
wurde ein Kompromiß zwischen einer höheren Ida-Inkorporierung
und einem niedrigeren Proteinanteil getroffen.
Ida-anti-L3T4 (Fig. 13), Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-
Thy-1 (Daten nicht gezeigt) inkorporierten 3 bis 6
Moleküle Ida, wobei der Proteinanteil über 50% lag.
Die Antikörpertiter vor und nach der Konjugation wurden
mit Hilfe der Rosettenbildungsmethode gemessen und wurden
bestimmt als die Verdünnung, bei der 50% der target-
Zellen Rosetten zeigten: Ida-anti-Thy-1-Konjugate, die
1,4 und 7 Moleküle Ida enthielten, zeigten Antikörpertiter
von jeweils 1 : 425 000, 1 : 170 000 und 1 : 130 000,
während der nicht-modifizierte Antikörpertiter 1 : 550 000
betrug (Fig. 14). Somit führte die Konjugation an Ida zu
einem gewissen Verlust der Antikörperaktivität; es wurden
jedoch Konjugate mit weniger als 4 Molekülen Ida
pro MoAb für die in vitro und in vivo Untersuchungen
eingesetzt. Die Antikörperaktivität für sowohl Ida-
anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4-Konjugate (Daten nicht gezeigt)
nahm in gleicher Weise mit der Inkorporierung von
mehr als 6 Molekülen Ida pro MoAb signifikant ab.
Die Cytotoxizität von Ida-MoAb-Konjugaten wurde an verschieden
reaktiven target-Zellen getestet, wobei ein
24stündiges Assay angewendet wurde und ein Vergleich
mit freiem Ida erfolgte. Die Aktivität von freiem Ida
war 4 bis 10 mal größer als die von Ida-MoAb-Konjugaten,
bei einem I.D.₅₀ (50%ige Inhibierung der [³H]-Thymidin
inkorporierung von Kontrollproben) für freies Ida bei
6,6 bis 9,0 × 10-8M gegen die getesteten Tumorzellinien.
Es ist klar, daß Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat das cytotoxischste
Konjugat darstellte (I.D.₅₀=4,3 × 10-7M) bei einem
Test gegen ITT(1)75NS E3-Zellinie, die eine im Hinblick
auf Ly-2-Antigen angereicherte Variante der nativen Zellinie
darstellt. Um die Selektivität der Konjugatwirkung
auf target-Zellen zu bestimmen, wurden Ida-MoAb-Konjugate
3 min lang mit den target-Zellen inkubiert, bevor
das nicht-gebundene Konjugat ausgewaschen und die Cytotoxizität
bestimmt wurde. Bei Anwendung dieses 30minütigen
Assays zeigten die nicht-reaktiven Ida-MoAb-Konjugate
ein I.D.₅₀, das 10 bis 50 ml größer war als das
von freiem Ida, was wiederum zeigt, daß die Antikörperbindung
für die Ida-MoAb-Konjugat-Cytotoxizität
essentiell ist. Es ist darauf hinzuweisen, daß keiner der
bei dieser Untersuchung verwendeten MoAb auf target-Zellen
in vitro in Abwesenheit von Komplement eine cytotoxische
Wirkung zeigte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
zusammengefaßt.
Die in vivo-immunsuppressive Wirksamkeit von Ida-MoAb-
Konjugaten wurde mit der von MoAb allein verglichen, wobei
die Fähigkeit der Konjugate getestet wurde, selektiv
L3T4⁺ oder Ly-2⁺-Zellen in der Milz zu eliminieren. CBA-
Mäuse erhielten 4 i. v. Injektionen von anti-Ly-2.1- oder
anti-L3T4-Konjugat (30 µg Ida/1,5 mg MoAb) an den Tagen
0, 2, 5 und 10; die Zahl der Ly-2⁺ oder L3T4⁺-Zellen in
der Milz wurde mit Hilfe des Rosettenbildungsassays verfolgt.
Für jede Behandlung wurden täglich die Milzzellen
von zwei behandelten Mäusen untersucht und die Ergebnisse
gemittelt (Fig. 15). Es wurde eine deutliche Abnahme der
Zahl der L3T4⁺-Zellen von ca. 30% der gesamten Milzzellen
in normalen Mäusen am Tag 0 auf ca. 4% bei Ida-
anti-L3T4-behandelten Mäusen am Tag 20 beobachtet. Diese
L3T4⁺-Zellen verblieben mehr als 60 Tage lang in diesem
verarmten Zustand, bevor eine allmähliche Zunahme festgestellt
wurde. Die Verarmung nach in vivo-Behandlung
mit anti-L3T4 allein führte ebenfalls zu einer steilen
Abnahme der Anzahl an L3T4⁺-Zellen (30% auf 5%).
Ida-anti-Ly-2.1-Konjugat führte zu einer Abnahme der Milz-
Ly-2⁺-Zellen von 25% auf 5% bis zum Tag 10; diese Anzahl
der Ly-2⁺-Zellen erholte sich jedoch bis zum Tag 15 und
war dann bis zum Tag 40 bis 50 auf dem normalen Niveau.
Es ist interessant, daß anti-Ly-2.1-MoAb allein nicht in
der Lage ist, Ly-2⁺-Zellen signifikant zu verarmen;
Schwankungen in der Zahl der Ly-2⁺ oder L3T4⁺-Zellen in
nicht behandelten Kontrollmäusen wurden auf die natürliche
Schwankung zwischen Mäusen zurückgeführt. Es war somit
klar, daß sowohl Ida-anti-L3T4 und Ida-anti-Ly-2.1 zu
einer wesentlich wirksameren Verarmung an jeweils L3T4⁺
oder Ly-2⁺-Zellen der Milz von behandelten Mäusen führte
als MoAb allein. Die Wirkung des Ida-anti-Ly-2.1-Konjugats
ist von Bedeutung, da anti-Ly-2.1-MoAb ohne jegliche
Wirkung ist, wenn es allein verwendet wird; es kann jedoch
zu einem wirksamen immunsuppressiven Agens umgewandelt
werden, wenn es an Ida gekoppelt wird. Die durch Arznei
mittel-MoAb-Konjugate herbeigeführte Verarmung war daher
geeignet für eine in vivo-Untersuchung der Rolle von
Ly-2⁺ oder L3T4⁺-Zellen im Hinblick auf die Wirkung der
Transplantatabstoßung.
Bei diesen Experimenten wurden Ida-anti-L3T4, Ida-anti-
Ly-2.1 und Ida-anti-Ty-1-Konjugate verwendet, um die
Überlebenszeit von P388D1-Tumortransplantaten in CBA-
Mäusen zu erhöhen, wobei die Allotransplantate den H-2
(Klasse I und II) und Nicht-H-2-Barrieren entgegengerichtet
waren (being across).
Gruppen von 10 bis 15 CBA-Mäusen wurde s. c. mit 8,0 × 10⁶
P388D1-Tumorzellen injiziert und erhielten i. v. an den
Tagen -1,0 (=Tag der Tumorinokulation), 3, 5 und 10
eine der folgenden: (i) PBS, (ii) anti-L3T4 und anti-Ly-
2.1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-anti-Ly-2.1 und (v)
Ida-anti-L3T4 und Ida-anti-Ly-2.1. Die erhaltene Gesamtmenge
an Ida und MoAb betrug jeweils 125 µg und 575 mg.
Die Tumortransplantate von sowohl PBS- und MoAb-behandelten
Mäusen überlebten 14 bis 17 Tage mit einer maximalen
mittleren Tumorgröße von 0,31 cm², was zeigt, daß
beide nicht-konjugierten MoAb zusammen unfähig waren,
L3T4⁺ und Ly-2⁺-Zellen wirksam zu verarmen, so daß das
Tumortransplantat überleben konnte (Fig. 16). Außerdem
konnten Ida-anti-Ly-2.1 oder Ida-anti-L3T4 allein das
Überleben des Transplantats nur verlängern (Tag 20 bis 28)
mit maximalen mittleren Tumorgrößen von 0,40 cm² bis
0,50 cm². Es ist wahrscheinlich, daß Ida-anti-Ly-2.1 oder
Ida-anti-L3T4 allein nicht alle T-Zellen entfernen und
aufgrund einer starken antigenen Wirkung (wie sich dies
bei MHC-Unterschieden ergibt) die verbleibenden Ly-2⁺ und
L3T4⁺-Zellen zum Wachstum stimuliert wurden und eine Abstoßung
auslösten. Demgegenüber bewirkte eine Kombination
von sowohl Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4-Konjugaten
bei 14/15 P388D1 Tumortransplantaten eine Verhinderung
der Abstoßung und eine Zunahme der Größe, bis die Mäuse
getötet wurden (Tag 50 - 2,00 cm²). Es wurde festgestellt,
daß einige dieser Konjugat-behandelten P388D1-Tumoren in
den Tagen 8 bis 16 eine gewisse Größenregression zeigten;
aufgrund einer kontinuierlichen Verarmung der L3T4⁺
und Ly-2⁺-Zellen (Tag 10) kam es zu einem konsistenten
Tumorwachstum der P388D1-Tumortransplantate.
Gruppen von 10 CBA-Mäusen wurde s. c. mit 10⁷ P388D1-Tumorzellen
injiziert und erhielten an den Tagen -1, 0, 5 und
6 eine der folgenden i. v.-Behandlungen: (i) PBS, (ii)
anti-Thy-1 und (iii) Ida-anti-Thy-1. Die Gesamtmenge an
Ida und anti-Thy-1 betrug jeweils 130 µg und 5,4 mg;
die Tumortransplantate von PBS-behandelten Mäusen überlebten
15 Tage. anti-Thy-1-MoAb allein führte zu einem
28 bis 32tägigem Überleben des Tumortransplantats bei
einer maximalen mittleren Tumorgröße von 0,58 cm² (Tag 6)
(Fig. 17). Bei den Ida-anti-Thy-1-behandelten Mäusen wurden
30% der Tumortransplantate bis zum Tag 40 vollständig
abgestoßen, während die restlichen 70% weiterwuchsen,
wodurch schließlich (Tag 32) die mittlere Tumorgröße der
Gruppe zunahm. Somit führten Ida-anti-Thy-1, sowie die
Kombination von Ida-anti-Ly-2.1 und Ida-anti-L3T4 zu
einer Verarmung an Ly-2⁺ und L3T4⁺-Zellen, so daß die
Mehrheit der P388D1-Tumortransplantate in CBA-Mäusen in
Abwesenheit einer normal schnellen Abstoßungswirkung
überlebten.
Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen
Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem
Antikörper 17.1 (Thomson et al, Proc. Natl. Cancer Inst.
70, 409-419 (1983)) Mäuse-IgG2a und aus Ida und monoklonalem
Antikörper 30.6 (Thomson, et al, Br. J. Cancer 47,
595-605 (1983)) Mäuse-IgG2a. Menschliche Colonkarzinom
Colo 205-Zellen (30.6⁺, 17,1⁺) wurden s. c. in nackte Mäuse
mit 8 × 10⁶ Zellen/Maus inokuliert, wie dies im Beispiel 2
beschrieben ist. Die inokulierten Mäuse wurden dann einer
Reihe von i. p.-Behandlungen unterzogen. Die Größe der Tumoren
wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei entlang
der senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen wurde. Die
Daten wurden als mittlere Tumorgröße registriert (Produkt
von zwei Durchmessern ± Standardfehler). Die Ergebnisse
sind in Fig. 18 wiedergegeben.
Es wurden Konjugate nach dem im Beispiel 1 beschriebenen
Verfahren hergestellt, und zwar aus Ida und monoklonalem
Antikörper 17.1, aus Ida und monoklonalem Antikörper
JGT-13 (Maus-IgG1, reaktiv mit carcino-embryonischem
Antigen auf Coloncarcinom, jedoch nicht mit Gewebe),
aus Ida und monoklonalem Antikörper 27.1 (Maus-IgG1,
reaktiv mit menschlichem Milchfettglobulantigen auf
einer Reihe von Colontumoren) und aus Ida und monoklonalem
Antikörper 30.6. Ein LIM2210 menschliches Colon
tumor-Xenotransplantat (1-5 mg) wurde in nackte Mäuse
s. c. implantiert. Die implantierten Mäuse wurden dann
einer Reihe von i. v.-Behandlungen unterzogen. Die Größe
der Tumoren wurde mit einer Schublehre gemessen, wobei
entlang den senkrechten Achsen der Tumoren ausgemessen
wurde. Die Daten wurden als mittlere Tumorgröße registriert
(Produkt von zwei Durchmessern ± Standardfehler).
Die Ergebnisse sind in Fig. 19 wiedergegeben.
Claims (10)
1. Immunglobulinkonjugat, gekennzeichnet durch
Idarubicin (Ida), welches mit einem monoklonalen
Antikörper oder einem Fragment davon, welches mindestens
eine der Antigenbindungsstellen des Antikörpers
umfaßt, konjugiert ist.
2. Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale
Antikörper oder das Fragment davon spezifisch für ein
bestimmtes target-Gewebe (Zielgewebe) ist.
3. Konjugat nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das target-
Gewebe menschlisches Neoplasma darstellt.
4. Konjugat nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale
Antikörper oder das Fragment davon spezifisch
für ein T-Lymphocyten-Zelloberflächen-Antigen ist.
5. Konjugat nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
2 bis 8 Ida-Moleküle kovalent an jedes Antikörpermolekül
gebunden sind.
6. Konjugat nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder dem Antikörperfragment
in C-14-Stellung von Ida konjugiert ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulinkonjugates
nach einem oder mehreren der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
man Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder einem
Fragment davon zu einem Konjugat verbindet.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß 14-Halogen-
Ida mit dem monoklonalen Antikörper oder einem
Fragment davon umgesetzt wird.
9. Pharmazeutisches Mittel,
gekennzeichnet durch einen pharmazeutisch
annehmbaren Träger oder ein entsprechendes Verdünnungsmittel
und, als Wirkstoff, ein Immunglobulinkonjugat
nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis
6 oder wie es im Verfahren nach einem der Ansprüche
7 oder 8 hergestellt wird.
10. Verfahren zur spezifischen Verarmung oder einer Untergruppe
von T-Lymphocyten einer Zellpopulation,
gekennzeichnet durch Inkubieren der Zellen
in vitro mit einem Immunglobulinkonjugat nach Anspruch
1, wobei der monoklonale Antikörper oder das
Fragment davon spezifisch für ein Zelloberflächenantigen
ist, welches auf den zu verarmenden Lymphocyten
vorliegt.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: PHARMACIA & UPJOHN S.P.A., MAILAND/MILANO, IT THE |
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| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition |