DE2507901C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft Antitumormittel, bei denen ein niedermolekulares Antikrebsmittel an für die betreffenden Tumorantigene selektive Antikrebskörper gebunden ist, und ein Verfahren zur Herstellung der Antitumormittel.
Niedermolekulare Antikrebsmittel sind bekannt, so insbesondere die mit Freinamen (INN) bezeichneten bzw. unter Trivialnamen bekannten Mittel: Daunorubicin (INN; auch als Daunomycin bekannt; ein Anthracyclin- Antibiotikum), Doxorubicin (INN; auch als Adriamycin bekannt; ein dem Daunorubicin sehr nahestehendes cytostatisch wirksames Antibiotikum), Methotrexat (INN; ein als Folsäure-Antagonist gegen Leukämie wirksames Cytostatikum), Mithramycin (INN; ein zu den Aureolsäuren gezähltes, cytostatisch wirksames Glykosid-Antibiotikum), Cytarabin (INN; auch als Cytosinarabinosid bekannt; ein synthetisch zugängliches unter anderem als Cytostatikum wirkendes Arabinonucleosid), 6-Azauridin (ein Cytostatikum zur Leukämiebehandlung).
Diese genannten, wie auch weitere Antikrebsmittel weisen jedoch den Nachteil auf, verhältnismäßig hoch toxisch zu wirken, so daß es in manchen Anwendungsfällen nur schwer vertretbar bis unmöglich ist, die für die Behandlung an sich gewünschte hohe Medikationsdosis zu verabreichen.
Andererseits sind Versuche unternommen worden, spezifische Tumorantikörper herzustellen. Jedoch konnte bisher der gewünschte Antikrebseffekt nicht erreicht werden.
In diesem Zusammenhang sei auch auf die DE-OS 23 24 544 hingewiesen, nach der das Ziel verfolgt wird, synthetische Antigene herzustellen, mittels derer die Bildung von spezifischen Antikörpern hervorgerufen werden kann, welche ihrerseits als Reaktionssubstanzen zur Analyse von immunochemisch bestimmbaren Substanzen dienen sollen. Ob und inwieweit die nach dieser Publikation in etwa 45 unterschiedlichen Reaktantenkombinationen erhaltbaren vorgeschlagenen synthetischen Antigene als Antikrebsmittel geeignet wären, ist der Publikation nicht zu entnehmen.
Ferner wurden Versuche unternommen, Antitumormittel als Syntheseprodukt aus einem niedermolekularen Antikrebsmittel und einem selektiven Antikörper zu erzeugen. Soweit bekannt, handelt es sich dabei bisher um komplexartig und nicht kovalent gebundene Konjugate mit noch nicht befriedigender Antikrebswirkung.
Ein derartiges Antitumormittel ist nach T. Ghose et al., British Medical Journal 1972, 495-499 ("Immunochemotherapy of Cancer with Chlorambucil- carrying Antibody"), bekannt. Es handelt sich um Konjugate zwischen Chlorambucil (INN; ein alkylierend wirkendes synthetisches Leukämietherapeutikum) und einem der beiden Antikörperspezies: Anti-EL4- Kaninchenimmunglobulin und ein Anti-Humanmelanomglobulin. Wie der Publikation als Gegenteil nicht zu entnehmen ist, beruht die Reaktion zwischen dem Chlorambucil und dem Antikörper auf der Ausbildung einer komplexartigen, jedenfalls nicht kovalenten, Bindung. Die genannte Publikation erteilt die Lehre, daß Konjugate aus einem Antikrebsmittel (Cytostatikum) und einem Antikrebskörper eine je verabreichter Dosis höhere Antikrebswirksamkeit aufweisen kann als sie bei Einzelanwendung der Komponenten zu verzeichnen ist.
Dieser Effekt läßt sich nach den Überlegungen der Patentinhaberin damit erklären, daß Antikrebskörper zwar eine schwächere Antikrebswirkung besitzen als sie Cytostatika aufweisen können, sich andererseits aber durch eine hohe Tendenz auszeichnen, selektiv zum entsprechenden Krebsgewebe zu wandern, wohingegen die Cytostatika keine Tendenz zeigen, sich im Körper im Bereich der Krebszellen zu konzentrieren. Kombiniert man aber das nicht selektive Cytostatikum mit dem selektiven Antikrebskörper, wirkt der Antikörper sozusagen als Vehikel, das das Cytostatikum gezielt zum Krebsgewebe transportiert. Bei diesem Mechanismus läßt sich für eine ausreichende Medikation mit dem Cytostatikum vermeiden, dieses in hohen und damit meist erheblich bis unzuträglich toxischen Mengen isoliert einsetzen zu müssen.
Zu Abrundung sei erwähnt, daß nach der DE-OS 17 92 298 kovalent gebundene Syntheseprodukte aus einem Antikrebskörper und einem chemotherapeutischen Antikrebsmittel zu immunochromatographischen Zwecken vorgeschlagen werden, die als Antikrebskörper-Komponente entweder Methotrexat oder "Uracilsenf" aufweisen.
Die Herstellung erfolgt über Azokupplungsreaktionen, wobei zunächst Benzidin zweifach diazotiert, das Tetrazoniumsalz dann mit dem Antikrebsmittel zu Tetrazo-biphenyl-methotrexat bzw. Tetrazo-biphenyl- uracilsenf gekuppelt und das azotierte Antikrebsmittel schließlich mit dem Antikrebskörper (ein γ-Globulin) weitergekuppelt wird. Im Ergebnis erhält man eine Verbindung A-N=N-Φ-Φ-N=N-G, in der A das spezielle Cytostatikum, G ein γ-Globulin und N₂-Φ-Φ-N₂ das Tetrazobiphenyl- Verbrückungsglied symbolisieren.
In der genannten Publikation finden sich keine Angaben über die oder eine cytotoxische Wirksamkeit der Syntheseprodukte.
Faßt man den referierten Stand der Technik zusammen, liefern lediglich die Veröffentlichungen von T. Ghose et al. und die DE-OS 17 92 298 Angaben zu Methoden bzw. potentiellen Methoden, Antitumormittel in Form von Reaktionsprodukten aus einem Antikrebsmittel oder Cytostatikum und einem Antikrebskörper zu synthetisieren, wobei diese genannten Publikationen nur sehr ausgewählte Spezialitäten offenbaren, von denen lediglich alleine bei den oben bezeichneten Chlorambucil-Konjugaten eine Antikrebswirksamkeit nachgewiesen ist. Nach T. Ghose et al. ist völlig offen, ob und in welcher Weise statt des synthetischen Chlorambucilmoleküls weitere, insbesondere natürliche Cytostatika mit einem Antikrebskörper kombinierbar wären, was im Sinne der geforderten Antikrebswirksamkeit des Syntheseproduktes zugleich voraussetzt, daß die Antikrebswirkung des Cytostatikums durch die Verbindungsreaktion mit dem Antikrebskörper nicht verloren geht. Andererseits ergibt sich zur DE-OS 17 92 298 die Frage, inwieweit die zu immunochromatographischen Zwecken vorgeschlagenen tetrazo-biphenyl- verbrückten Antikrebskörper-Methotrexat- bzw. Antikrebskörper- Uracilsenf-Reaktionsprodukte überhaupt eine Antikrebswirksamkeit besitzen könnten, und ob, falls dies gegeben wäre, diese Verbindungen wegen der diazotierten Biphenylgruppe nicht ihrerseits zu unerwünschten Immunantworten und zu allergischen Reaktionen führten.
Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, nicht nur weitere Antitumormittel als Syntheseprodukt aus einem spezifischen Antikrebskörper und einem chemotherapeutischen Antikrebsmittel oder Cytostatikum zur Verfügung zu stellen, sondern darüberhinaus naturstoffliche Cytostatika einzusetzen und diese Moleküle in stabiler kovalenter Bindung zu verbinden. Die Verbindung des Antikrebsmittels mit dem Antikörper soll dabei über funktionelle Gruppen der Komponenten erfolgen, die keine oder nicht die entscheidende Bedeutung für die cytotoxische Wirkung der diskreten Komponenten besitzen.
Diese Aufgabe wird, wie durch das weiter unten angegebene Ausführungsbeispiel und durch die die vorliegende Beschreibung abschließende Erläuterung belegt, gemäß der kennzeichnenden Merkmale der Patentansprüche 1 und 2 bzw. des Patentanspruchs 4 dadurch gelöst, daß man als Antikrebsmittel-Reaktanten ein solches Molekül einsetzt, das einen durch Periodat spaltbaren Zuckerteil aufweist, der nach seiner oxidativen Spaltung mit dem Antikrebskörper unmittelbar umgesetzt wird. Gemäß der Patentansprüche ist als das Antikrebsmittel Daunorubicin bzw. Doxorubicin zu verwenden. Als Antikrebskörper kommen insbesondere die in Patentanspruch 3 bezeichneten in Frage.
Die Antikörper werden nach ihrer spezifischen cytotoxischen Wirkung ausgewählt. Während die erfindungsgemäß mit den Antikrebskörpern kovalent zu verbindenden Antikrebsmittel Verbindungen mit verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht sind, so haben Daunorubicin und Doxorubicin die Zusammensetzung C₂₇H₂₉NO₁₀ bzw. C₂₇H₂₉NO₁₁, entsprechend Molmassen von 527,53 und 543,53, weisen die Antikörper wesentlich höhere Molmassen, meist in der Größenordnung um 150 000, auf.
Die Wirksamkeit der aus einem niedermolekularen Antikrebsmittel und einem hochmolekularen, durch kovalente Verbindung der Komponenten gebildeten Antitumormittel wird nach allgemeiner Erfahrung in weitem Maße oder entscheidend von dem jeweiligen Reaktionsort der Komponenten, gegebenenfalls auch von der Art der chemischen Bindung, abhängen. Jedenfalls sollten für die Ausbildung der Verbindung mit dem Reaktionspartner eine, womöglich auch mehrere, solche funktionelle Gruppen der Komponenten gewählt werden, die für die biologische bzw. cytotoxische Aktivität der Komponenten keine oder nicht die entscheidende Bedeutung ausübt. Allgemein läßt sich voraussetzen, daß die kovalente Bindung eines Antikrebsmittels an einen Krebsantikörper je nach den zur Verfügung stehenden reaktionsfähigen Gruppen des umzusetzenden Moleküls entweder direkt oder über eine wenigstens bivalente dritte Komponente als Verbrückungsglied erfolgen kann.
Wenngleich im Rahmen des vorliegenden Patents nicht beansprucht, werden als derartige Drittkomponente bivalente Verbindungen, z. B. von der Art des Glutaraldehyds, welcher leicht mit Polyhydroxyverbindungen reagiert, vorgeschlagen; bei Verwendung von Methotrexat als Antikrebsmittel wird vorgeschlagen, die Reaktion mit dem Antikörper zu einem Antitumormittel in Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid- hydrochlorid auszuführen.
Eine direkte Bindung kann durch verschiedene chemische Reaktionen bewirkt werden, z. B. durch die Öffnung einer Bindung innerhalb des kleinen Moleküls (im allgemeinen des Antikrebsmittels) und anschließende Bindung an den Antikörper. Die Methoden zur chemischen Bindung von gewünschten Verbindungen an Antikörper sind aus der Literatur bekannt; vgl. dazu auch die oben genannte DE-OS 17 92 298. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antitumormittel muß die Methode der chemischen Bindung sorgfältig ausgewählt werden, da sich bei den einzelnen Verfahren große Unterschiede ergeben können. Es wurde gefunden, daß die Spezifität der Antikörper gegenüber den Tumorantigenen im Antitumormittel aufrechterhalten werden kann. Die Spezifität der Antikörper führt zu einer beträchtlichen Konzentration der neuen Präparate im Tumor bzw. in seiner unmittelbaren Nachbarschaft, wodurch die Wirksamkeit erhöht wird und die für den cytotoxischen Effekt erforderliche Gesamtdosierung wesentlich herabgesetzt werden kann. So können jetzt Fälle behandelt werden, bei denen es bisher nicht möglich war, eine adäquate Dosis des Antikrebsmittels anzuwenden.
Für die Bindung von Daunorubicin und Doxorubicin an spezifische Immunoglobuline ist die Methode der Wahl die Perjodatoxidation des Antikrebsmittels, gefolgt von der Bindung des oxidierten Antikrebsmittels an das Immunoglobulin. Darauf wird die Bindung stabilisiert durch Reduktion des Produkts mit einem angemessenen Reduktionsmittel, wie Natriumborhydrid.
Die Antitumormittel gemäß der Erfindung können gegen eine Vielzahl von Tumoren angewendet werden, jedenfalls gegen alle Tumoren, bei denen bisher die in den konventionellen Präparaten enthaltenen Antikrebsmittel angewendet wurden. Darüberhinaus können sie auch gegen andere Tumoren angewendet werden, gegen die die genannten Antikrebsmittel nicht verwendbar waren, da wegen deren Toxizität nicht die erforderlichen Dosen anwendbar waren. Unter den Arten von Tumoren, die mit den neuen Präparaten behandelt werden können, sind folgende zu nennen: akute lymphatische Leukämie, akute myelocytische Leukämie, Lymphom, Brustcarcinom, Blasencarcinom, Hodencarcinom, osteogenes Sarcom, Weichgewebesarcom und ähnliche bösartige Geschwulste.
Die kovalente Bindung von Dauorubicin und Doxorubicin an aus spezifischen Antitumorsera isolierten Immunoglobulin unter Anwendung der Perjodatoxidation erfolgt vermutlich durch Öffnung der Bindung zwischen C₃ und C₄ des Aminozuckerteils des Moleküls. Dies führt zur Bildung von Carbonylgruppen, die mit den freien Aminogruppen des Proteins reagieren können. Die entstehende Schiff'sche Basen-Bindung wird mit Natriumborhydrid reduziert.
Die in den Patentansprüchen bezeichneten Antitumormittel ließen sich wie folgt herstellen. Es wurden etwa 40 mg/ml des Antikrebsmittels in 1 ml PBS (phosphatgepufferte Salzlösung; siehe auch weiter unten) mit 0,1 m Natriumperjodat in leichtem molarem Überschuß gemischt und während etwa 1 Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Vernichtung des überschüssigen Perjodats wurde 1 m Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 0,05 m zugegeben. Die Lösung des oxidierten Materials wurde mit 1 ml tumorspezifischem Immunoglobulin und 20 bis 25 mg/ml 0,15 m Kaliumcarbonat-Puffer (pH 9,5) vermischt und während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde Natriumborhydrid bis zu einer Endkonzentration von 0,3 mg/ml zugegeben. Die Reaktion vollzog sich während 2 Stunden bei 37°C. Freies und gebundenes Antikrebsmittel wurden durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Bio-gel P-100 oder Sepharose 6 B getrennt. Kleine Mengen an freiem Antikrebsmittel wurden aus den Proteinfraktionen durch Adsorptionschromatographie an Poropak Q entfernt. Die proteingebundenen Antikrebsmittel gingen unverzögert durch die Säule. Pro Mol Antikörper waren etwa 2 bis 5 Mol Antikrebsmittel kovalent gebunden.
Die Antitumormittel (nachfolgend auch als Kombinationspräparate bezeichnet) wurden mit verschiedenen Immunoglobulinen, die für verschiedene Tumoren spezifisch waren, hergestellt. Unter diesen waren drei Mäuselymphoidtumoren. Die Präparate wurde auf ihre toxische Wirkung auf verschiedene Tumor-Targetzellen geprüft. Gemessen wurde die Inhibierung der RNA-Synthese oder die Verminderung des Wachstums der Tumorzellen nach der Transplantation. Die Präparate gemäß der Erfindung greifen vorzugsweise die Targetzellen an, erkennbar durch den Antikörperbestandteil des Präparates.
Tumore
Für diese Versuche wurden verschiedene Murinlymphoidtumoren verwendet. Diese umfassen eine darcinogeninduzierte B-Zellen-Leukämie bei SJL/J-Mäusen (Nature 241 [1973] 396), ein Maloney-Virusinduziertes Lymphom (YAC) bei A/J-Mäusen (J. Nat. Canc. Inst. 32 [1964] 547) und ein mineralölinduziertes Plasmacytom (PC 5) bei BALB/c-Mäusen (J. Nat. Canc. Inst. 25 [1960] 847). Ferner wurde ein Lymphom verwendet, das bei Lewis-Ratten durch intrathymische Injektion von Murinstrahlenleukämievirus induziert war. Dieses Rattenlymphom zeigt virale Zelloberflächenantigene, wie das PC 5-Plasmacytom, was bei den anderen hier verwendeten Mäusetumoren nicht der Fall ist. Alle Tumoren wurden erhalten im Durchgang ihrer natürlichen animalischen Stämme.
Antisera
Ein Antiserum zum Rinderserumalbumin (Anti-BSA) wurde in Kaninchen hergestellt durch schwache subkutane Injektion von 2 mg BSA, das in Freund's Adjuvans emulgiert war.
Kaninchenantisera zu B-Leukämiezellen und zu PC 5-Zellen wurden durch 4 bis 5 intravenöse Injektionen von 10⁸ Tumorzellen in fünftägigen Intervallen hergestellt.
Die Antikörperaktivität wurde mittels der komplementabhängigen Cytotoxizität gemessen. Für diese erhielt man Titer von ¹/₁₀₀ bis ½₀₀ gegenüber ihren Immunisierungszellen. Die Anti-B- Leukämieantisera zeigten ähnliche Cytotoxizität gegenüber YAC- Tumorzellen. Die Anti-PC 5-Antisera wurden nach Absorption für normale BALB/o-Thymus- und -Milzzellen verwendet. In der absorbierten Form waren sie cytotoxisch gegenüber beiden Immunisierungs- PC 5-Zellen und den Rattenlymphomzellen, nicht jedoch gegenüber den YAC-Zellen.
Die Immunoglobulinfraktionen dieser Antisera wurden durch Fällung mit Ammoniumsulfat bei 33%iger Sättigung hergestellt. Sie wurden für die Herstellung der erfindungsgemäßen Kombinationspräparate verwendet.
Aktivität des Antikrebsmittels
Die pharmakologische Aktivität von Daunorubicin und Doxorubicin wurde vorweg durch ihre Inhibition der zellularen RNA-Synthese gemessen. Die Versuche wurden mit Mikrotiterschalen (Cook, V-Bodenschalen) in Eagle's Minimalessentialmedium, enthaltend Penicillin und Streptomycin, ausgeführt. Die Zellen wurden mit einer Konzentration von 2×10⁷ Zellen pro ml im Medium suspendiert und in den Schalenvertiefungen in Teilmengen von 50 µl verteilt. Die Wirkstoffe wurden in PBS gelöst (0,15 m NaCl, 0,01 m PO₄, pH 7,2) und dann den Zellen in Mengen von 50 µl zugegeben. Dann wurde - soweit nicht anders angegeben - 2 Stunden bei 37°C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ in der Luft inkubiert.
Zu dieser Zeit wurden 10 µl, enthaltend 1 µCi 5-[-3H]-Uridin in jede Vertiefung zugegeben und weitere 1 bis 2 Stunden inkubiert. Dann wurden 25 µl 25%ige Trichloressigsäure (TCA) zugegeben und die Schalen über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die TCA-Niederschläge wurden gewaschen, in NaOH gelöst und in Ampullen gebracht, um sie - wie in "Transplantation" 13 (1972) 541-545 beschrieben - auszuzählen. Das Scintillationsgemisch bestand aus einer Scintillationslösung auf Basis von Toluol mit Triton X-100 und 0,1 n HCl im Verhältnis von 6 : 3 : 1. HCl war beigegeben, um der Chemilumineszenz entgegenzuwirken. Die Versuche wurden dreifach ausgeführt, wobei die Abweichungen allgemein kleiner als 10% waren. Die Versuche zeigten, daß die Aktivität des Antikrebsmittels auch nach dessen Bindung an das Antikörpermolekül erhalten blieb, wie es aus Tabelle 1 zu ersehen ist.
Tabelle 1
Cytotoxische Aktivität des Kombinationspräparats (Antitumormittels), verglichen mit dem freien Wirkstoff (Antikrebsmittel)
10⁷ B-Leukämie-Zellen wurden bei 37°C in Gegenwart von 4 µg/ml Daunorubicin, einerseits frei, andererseits proteingebunden, inkubiert. Die Inkorporation in das durch TCA fällbare Zellmaterial wurde gemessen und ausgedrückt als prozentuale Inhibition (100% der Kontrollkultur ohne den Wirkstoff [Antikrebsmittel]).
Pharmakologische Wirkung des Kombinationspräparates (Antitumormittels)
Die spezifische Cytotoxizität der Wirkstoff-Immunoglobulin-Kombination wurde geprüft, nachdem dieses Präparat Gelegenheit hatte, sich während einer kurzen Inkubationszeit in vitro an Targetzellen zu binden, worauf zur Entfernung nichtspezifischer Proteine und deren Wirkstoffkonjugat gewaschen wurde. Dann wurden die Zellen auf die verbleibenden Wirkstoffeffekte geprüft.
Die Tumorzellen wurden gewaschen und in Eagle's Medium mit einer Konzentration von 2×10⁷ Zellen pro ml suspendiert und dann in Mengen von 50 µl in den Vertiefungen von Mikrotiterschalen (Cook, V-Bodenschalen) verteilt. In verschiedenen Konzentrationen wurden freier Wirkstoff, Immunoglobulin und Wirkstoff-Immunoglobulin- Kombination in Mengen von 50 ml zugegeben. Nach Schütteln (Cook AM 69 Mikroshaker) wurde während 5 Minuten bei 37°C inkubiert. 100 ml des Mediums wurden dann in jede Vertiefung gegeben, und die Schalen wurden bei 4°C und 1800 UpM 10 Minuten zentrifugiert (International PR-J-Zentrifuge, ausgerüstet mit Cook-Schalenträger). Das Überstehende wurde durch ein einfaches Abschütteln aus der umgedrehten Schale entfernt, und die Vertiefungen wurden wieder mit 200 µl frischem Medium gefüllt. Dieser Waschvorgang wurde nochmals wiederholt. Schließlich wurden die Zellen wieder in Eagle's Medium suspendiert (100 µl pro Vertiefung) und während 2 Stunden bei 37°C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ in der Luft inkubiert. 10 µl, enthaltend 10 µCi [³H]-Uridin, wurden dann in jede Vertiefung gegeben, und nach einer weiteren einstündigen Inkubation wurden 25 µl 25%ige TCA zugesetzt. Die TCA-Niederschläge wurden gewaschen, in NaOH gelöst und - wie bei Rosenberg et al. (Transplantation 13 (1972) 541-545) beschrieben - radioaktiv gezählt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Prozentinhibition der [³H]-Uridin-Inkorporation, verglichen mit dem Kontrollmaterial, das entweder salzartige oder freie Antikörper in äuqivalenter Konzentration zu der Antikörperkonzentration des entsprechenden Präparats enthielt. Die Abweichungen bei den dreifach durchgeführten Versuchen waren allgemein kleiner als 10%.
Zusätzlich zu dem [³H]-Uridin-Inkorporationsversuch wurden die Target-Tumorzellen auf ihre Wachstumsfähigkeit nach der Transplantation untersucht. Nachdem die Zellen in vitro dem Kombinationspräparat ausgesetzt und gewaschen waren, wurden sie in ihre jeweiligen syngenetischen Stämme transplantiert, und es wurde das Überleben der Empfänger verfolgt.
Spezifische Cytotoxizität von Daunorubicin-anti-B-leukämie-Kombinationspräparaten
Daunorubicin wurde an Anti-B-Leukämie- und Anti-BSA-Immunoglobuline gebunden und auf die Cytotoxizität gegenüber B-Leukämiezellen sowie mehreren anderen Tumoren in vitro geprüft. Diese Kombinationspräparate behielten etwa 50% der Aktivität des freien Wirkstoffs. Die verschiedenen, hier verwendeten Tumoren hatten gleiche Empfindlichkeit gegenüber dem Wirkstoff-Immunoglobulin-Kombinationspräparat. Für die Versuche wurde eine Konzentration an Daunorubicin-Immunoglobulin angewendet, die 40 bis 60% Inhibition der [³H]-Uridin-Inkorporation in den Testzellen ergab, wenn es im Kontakt mit den Targetzellen während der gesamten Inkubationszeit blieb. Um die Spezifität der Präparate festzustellen, wurden die Testzellen diesen nur für 5 Minuten ausgesetzt, um das Anhaften des spezifischen Antikörpers zu erlauben. Dann wurde zur Entfernung des nichtspezifischen Immunoglobulins gewaschen und die Toxizität des mit den Zellen in Kontakt bleibenden Daunorubicins wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2.
Tabelle 2
Spezifische Cytotoxizität von an Anti-B-Leukämie-Immunglobuline gebundenem Daunorubicin
Nach den in Tabelle 2 wiedergegebenen Ergebnissen zeigt das Daunorubicin-anti-B-Leukämie-Kombinationspräparat eine signifikante bleibende Inhibition der [³H]-Uridin-Inkorporation in den B- Leukämiezellen nach diesem kurzen Ausgesetztsein und der Waschung.
Bei den verschiedenen, in diesen Versuchen getesteten Targetzellen wurde gefunden, daß deren Empfindlichkeit gegenüber dem spezifischen Daunorubicin-anti-B-Leukämie-Kombinationspräparat der Spezifität des Antikörpers folgt. Dies bedeutet, daß das Präparat gegenüber den im Kreuzversuch reagierenden (cross-reacting) YAC-Zellen toxisch ist, jedoch gegenüber den im Nichtkreuzversuch reagierenden (non-cross-reacting) PC 5- oder Rattenlymphomzellen (Zeile 1) nicht toxisch ist, selbst wenn die Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber dem freien Wirkstoff größer als die der B-Leukämie-Zellen (Zeile 4) ist. Der hier festgestellte spezifische Effekt ist von der Aktivität des Antikörpers abhängig, denn mit dem Daunorubicin-anti-BSA-Präparat zeigte sich kein Effekt (Zeile 2). Im Falle der B-Leukämie-Testzellen war die Wirkung des Daunorubicin-Antikörper-Kombinationspräparats größer als die des freien Wirkstoffs (Zeile 4, 1. Zahlenspalte). Freier Antikörper macht die Zellen nicht empfindlicher gegenüber der Wirkung des freien Wirkstoffs, aber er erhöht leicht die Wirkung des nichtspezifischen Daunorubicin-anti-BSA-Präparats gegenüber diesen 1en (Zeile 3, 1. Zahlenspalte). Die durch den Antikörper verursachte schwere Agglutination der Zellen dürfte sich ergeben durch das Einfangen von Daunorubicin-anti-BSA, wodurch die Entfernung durch Waschen schwieriger wird. YAC-Zellen, die durch Anti-B- Leukämie-Antikörper nicht stark agglutiniert sind, werden durch die Mischung von Anti-B-Leukämie- und Daunorubicin-anti-BSA nicht angegriffen (Zeile 3, 2. Zahlenspalte).
Zusätzlich zur Wirkung bezüglich der RNA-Synthese wurden die Kombinationspräparate auch auf ihre Wirkung auf das Tumorzellenwachstum geprüft. Die Zellen wurden in vitro kurze Zeit dem Kombinationspräparat, dem freien Antikörper oder dem freien Wirkstoff ausgesetzt. Dann wurden sie gewaschen und transplantiert in syngenetisches SJL/J-Wirtsmaterial (Tabelle 2, letzte Spalte).
Die mittlere Überlebenszeit der Tiere, die unbehandelte Zellen erhielten, betrug 11 Tage. Bei allen Kontrollgruppen, die mit freiem Wirkstoff, freiem Antikörper oder mit einem Gemisch von Anti-B-Leukämie-Antikörper und Daunorubicin behandelte Zellen erhielten, war die Überlebenszeit ebenso wie bei denen, die unbehandelte Zellen erhielten. Allein die Gruppe, welche die mit dem spezifischen Daunorubicin-anti-B-Leukämie-Kombinationspräparat behandelten Zellen erhalten hatte, zeigte eine längere Überlebenszeit. Ihre Überlebenszeit war gleich der von Tieren, die nur 10³ unbehandelte Zellen erhalten hatten.
Spezifische cytotoxische Wirkungen von Daunorubicin-anti-PC 5-Kombinationspräparaten
Für diese Versuche wurden an Anti-PC 5-Immunoglobuline gebundenes Daunorubicin verwendet. Aus Tabelle 3 ist zu ersehen, daß die spezifischen Kombinationspräparate gegenüber den homologen PC 5- Targetzellen und den im Kreuzversuch reagierenden (cross-reacting) Rattenlymphomzellen Toxizität aufweisen, während sie gegenüber den nicht im Kreuzversuch reagierenden (non-cross-reacting) YAC- Zellen viel weniger toxisch sind. In diesen Serien von Versuchen diente das Daunorubicin-anti-B-Leukämie-Kombinationspräparat als spezifische Kontrollsubstanz, die das umgekehrte Muster der toxischen Wirkung zeigt. Wiederum war das homologe System Daunorubicin- anti-PC 5 gegenüber den PC 5-Testzellen überlegen bezüglich der Wirkung des freien Wirkstoffs (Antikrebsmittels) auf die gleichen Zellen.
Bei der Prüfung des Wachstums von behandelten PC 5-Zellen in syngenetischen BALB/c-Tieren wurde eine schwache Wirkung sowohl des freien Wirkstoffs als auch des freien Antikörpers gefunden. Hingegen führte das spezifische Daunorubicin-anti-PC 5-Kombinationspräparat zu bedeutend höherer Wirkung, wobei bei mehr als 50% der Tiere der Tumorbefall ausblieb (letzte Spalte der Tabelle 3). Die Überlebenszeit dieser Gruppe von Tieren war gleich der von Tieren, die nur 10² unbehandelte Tumorzellen erhalten hatten. Die Langzeitüberlebenden waren resistent gegen einen nachfolgenden Test mit 10³ Tumorzellen.
Tabelle 3
Spezifische Toxizität von Daunorubicin, gebunden an Anti-PC 5-Immunoglobuline
In weiteren Versuchsserien wurden die Zellen wie oben kurze Zeit in vitro behandelt, jedoch ohne Waschung transplantiert. Hierdurch gelangen Wirkstoff und nicht spezifische Wirkstoffkombination in das Tier. Die Ergebnisse waren gleichartig. Bei einer Kontrollgruppe, bei der die Zellen einem Gemisch von freiem Wirkstoff und Anti-PC 5-Antikörper ausgesetzt waren, zeigte sich keine Wirkung, die über die des freien Wirkstoffs allein oder des freien Antikörpers allein hinausgeht.
Die Versuchsserien ergaben, daß Daunorubicin, kovalent gebunden an Antikörper, die gegen einen individuellen Tumor gerichtet sind, eine bevorzugende Cytotoxizität gegenüber diesen spezifischen Tumorzellen aufweist. Wenn der Wirkstoff an Anti-B-Leukämie- Antikörper gebunden ist, dann ist das Kombinationspräparat toxisch gegen homologe B-Leukämie-Zellen ebenso wie gegen im Kreuzversuch reagierenden YAC-Zellen (Tabelle 2). Hingegen zeigt sich gegenüber nicht im Kreuzversuch reagierenden PC 5- oder Rattenlymphomzellen keine bezeichnende Toxizität (Tabellen 2 und 3).
Die vorstehend angegebenen Versuche sind wegen des erheblichen Aufwands detailliert nur hinsichtlich Daunorubicin ausgeführt worden. Doch sind übereinstimmende Wirksamkeitsergebnisse für Kombinationspräparate oder Antitumormittel unter Verwendung von Doxorubicin als dem Antikrebsmittel ebenso festgestellt worden.
Mit Hinblick auf die chemisch engste Verwandschaft zwischen Daunorubicin und Doxorubicin - beide sind Naphthacenderivate, die am C₁₀-Atom einen Hexapyranosyl-oxy-Rest ("Zuckerteil") tragen und sich ausschließlich durch den C₈-Substituenten unterscheiden: Acetylrest bei Daunorubicin, Hydroxyacetylrest bei Doxorubicin - und dem Umstand, daß der Zuckerteil des Daunorubicins und ebenso des Doxorubicins den Reaktionsort zur direkten Verbindung des Antikrebsmittels mit dem Krebsantikörper darstellt, ist ohne weiteres einsichtig, daß sich die unter Verwendung von Doxorubicin hergestellten Kombinationspräparate in gleicher Weise wie die unter Verwendung von Daunorubicin hergestellten Kombinationspräparate als Antitumormittel im Sinne der Lehre gemäß Patentanspruch 1 verhalten.

Claims (5)

1. Antitumormittel, bei dem ein niedermolekulares Antikrebsmittel an für die betreffenden Tumorantigene selektive Antikörper gebunden ist, gekennzeichnet durch Daunorubicin, einem Naturstoff aus der Gruppe der Antibiotika mit einem durch Priodat spaltbaren Zuckerteil als niedermolekulares Antikrebsmittel, wobei das Daunorubicin über seinen Zuckerteil nach dessen Periodatspaltung unmittelbar mit dem Krebs- Antikörper umgesetzt ist.
2. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle des Antibiotikums Daunorubicin das das Antibiotikum Doxorubicin verwendet ist.
3. Antitumormittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Krebsantikörper ein spezifischer oder selektiver Antikörper gegenüber Antigenen bei akuter lymphatischer bzw. akuter myelocytischer Leukämie, bei Lymphomen, Brust-, Blasen-, Hodenkarzinomen, osteogenen bzw. Weichskrebssarkomen oder bei ähnlichen bösartigen Geschwulsten ist.
4. Verfahren zur Herstellung eines Antitumormittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Daunorubicin bzw. Doxorubicin mit Periodat oxidiert, das Reaktionsprodukt mit dem Krebsantikörper umsetzt, die hierbei erhaltene Schiff'sche Base reduziert und das Rohprodukt reinigt.
5. Antitumormittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Umsetzung von 2 bis 10 Molekülen des Antikrebsmittels je Molekül des Krebsantikörpers.
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