DE3853028T2

DE3853028T2 - Antikörper-Enzym-Konjugate in Verbindung mit Wirkstoff-Vorläufern zur Freisetzung von cytotoxischen Mitteln in den Tumorzellen.

Info

Publication number: DE3853028T2
Application number: DE3853028T
Authority: DE
Inventors: Joseph P. Seattle Wa 98109 Brown; David E. Seattle Wa 98199 Kerr; Mark G. Middletown Ct 06457 Saulnier; Peter D. Seattle Wa 98102 Senter
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1987-08-04
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1995-12-14
Anticipated expiration: 2008-08-04
Also published as: PT101702A; NO178138B; EP0302473B1; DE3856112T2; PT101702B; ATE118354T1; IE68309B1; ES2068191T3; HUT47437A; NO883414D0; AU614532B2; FI883597A; NO883414L; FI98197B; IL87319A; EG18751A; EP0302473A2; DE3853028D1; NO178138C; IE950981L

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Abgabe zytotoxischer Agenzien an Tumorzellen durch die kombinierte Verwendung von Antikörper-Enzymkonjugaten und Prodrugs. Insbesondere betrifft die Erfindung die Abgabe zytotoxischer Medikamente an den Ort eines Tumors durch Verabreichung eines tumorspezifischen Antikörper-Enzymkonjugates, das an die Tumorzellen bindet und die weitere Verabreichung einer Prodrug, die am Ort des Tumors in Gegenwart des Antikörper-gebundenen Enzyms in ein aktives, zytotoxisches Medikament konvertiert wird. Die beanspruchten Antikörper-Enzymkonjugate, deren beanspruchte Verwendung und die Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung überwinden mehrere Nachteile von Antikörper-vermittelten Arzneimittelabgabe-Systemen, die gegenwärtig bei der Behandlung von Krebs und anderen Tumoren eingesetzt werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Verwendung von Immunokonjugaten für die selektive Abgabe von zytotoxischen Medikamenten an Zellen bei der Behandlung von Krebs ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die Abgabe von zytotoxischen Agenzien an den Ort der Tumorzellen ist besonders wünschenswert, da die systemische Verabreichung dieser Agenzien häufig zur Abtötung normaler Zellen innerhalb des Körpers sowie der zu eliminieren beabsichtigten Zellen führt. Bei derzeit gebräuchlichen Abgabesystemen für Antitumor- Medikamente wird ein zytotoxisches Agens an einen Tumorspezifischen Antikörper konjugiert, um ein Immunokonjugat zu bilden, das an Tumorzellen bindet und dadurch das zytotoxische Medikament an den Ort des Tumors "abgibt". Die bei diesen Targeting-Systemen verwendeten Immunokonjugate umfassen Antikörper-Medikament-Konjugate [vgl. z.B. R. W. Baldwin et al., "Monoclonal Antibodies For Cancer Treatment, " Lancet, S. 603-05 (15. März 1986)] sowie Antikörper-Toxin-Konjugate [vgl. z.B. P. E. Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (Hrsg), S. 475-506 (1985)].
Sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper wurden in diesen Immunokonjugaten verwendet [vgl. z.B. K. Ohkawa et al., "Selective In Vitro And In Vivo Growth Inhibition Against Human Yolk Sac Tumor Cell Lines By Purified Antibody Against Human α-Fetoprotein Conjugated With Mitomycin C Via Human Serum Albumin, " Cancer Immunol. Immunother., 23, S. 81-86 (1986) und G. F. Rowland et al., "Drug Localisation And Growth Inhibition Studies Of Vindesine- Monoclonal Anti-CEA Conjugates In A Human Tumour Xenograft, " Cancer Immunol. Immunother., 21, S. 183-87 (1986)]. Medikamente, die in diesen Immunokonjugaten verwendet wurden, umfassen Daunomycin [vgl. z.B. J. Gallego et al., "Preparation Of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tmour Activity," Int. J. Cancer, 33, S. 737-44 (1984) und R. Arnon et al., "In Vitro And In Viva Efficacy Of Conjugates Of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies," Immunological Rev., 62, S. 5-27 (1982)], Methotrexat [N. Endo et al., "In Vitro Cytotoxicity Of A Human Serum Albumin-Mediated Conjugate Of Methotrexate With Anti-MM46 Monoclonal Antibody," Cancer Research, 47, S. 1076-80 (1987)], Mitomycin C [K. Ohkawa et al., oben] und Vindesin [G. F. Rowland et al., oben]. Die in den Antikörper-Toxin-Konjugaten verwendeten Taxine umfassen bakterielle Toxine, wie das Diphtherie-Toxin, und pflanzliche Toxine, wie Ricin [vgl. z.B. F. L. Moolten et al., "Antibodies Conjugated To Potent Cytotoxins As Specific Antitumor Agents," Immunol. Rev., 62, S. 47-73 (1982)].
Trotz des Farschungsaufwandes, der auf die Verwendung von Immunokonjugaten für therapeutische Zwecke gerichtet war, wurden mehrere Einschränkungen deutlich, die mit diesen Abgabe- Versuchen verbunden sind [vgl. z.B. M. J. Embleton, "Targeting Of Anti-Cancer Therapeutic Agents By Monoclonal Antibodies," Biochemical Society Transactions, 14, S. 393-395 (615th Meeting, Belfast 1986)]. Erstens, die große Menge an Medikament, die an die Zieltumorzelle abzugeben ist, um ein Abtöten der Zelle zu bewirken, ist häufig nicht erreichbar aufgrund von Beschränkungen durch die Anzahl der Tumorassoziierten Antigene auf der Oberfläche der Zellen und der Anzahl der Medikament-Moleküle, die an ein bestimmtes Antikörpermolekül angelagert werden können. Die Beschränkung führte zur Verwendung von wirksameren zytotoxischen Agenzien, wie Pflanzentoxinen, bei diesen Konjugaten und zur Entwicklung von Polymer-gebundenen Antikörper-Medikament-Konjugaten, die sehr hohe Medikament-Multiplizitäts-Verhältnisse aufwiesen [vgl. z.B. P. E. Thorpe, oben, S. 475-506 und R. W. Baldwin et al., "Design And Therapeutic Evaluation Of Monoclonal Antibody 791T/36 - Methotrexate Conjugates," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, S. 215-31 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]. Viele Immunokonjugate besitzen jedoch sogar dann sub-optimale zytotoxische Aktivität, wenn sie mit einem hohen Medikamentanteil beladen sind oder bei Verwendung von starken Toxinen, und können keine vollständige Abtötung bei Dosen bewirken, bei denen sämtliche verfügbare Antigen-Positionen gesättigt sind.
Zweitens wurde erkannt, daß die zytotoxische Aktivität eines Immunokonjugates häufig von dessen Aufnahme in die Tumorzelle abhängig ist, die durch die Antikörperkomponente des Konjugates vermittelt wird [vgl. z.B. J. M. Lambert et al., "Purified Immunotoxins That Are Reactive With Human Lymphoid Cells," J. Biol. Chem., 260 (Nr. 22), S. 12035-12041 (1985)]. Diese Internalisierung ist von besonderer Bedeutung, wenn ein Antikörper-Medikament-Konjugat verwendet wird, dessen Medikament einen intrazellulären Wirkort besitzt oder wenn Antikörper-Toxin-Konjugate verwendet werden Die große Mehrzahl von Tumor-assoziierten Antigenen und somit die Antikörper- Medikament- oder Antikörper-Toxin-Konjugate, die an diese Antigene gebunden sind, werden jedoch nicht internalisiert. Diejenigen Konjugate, die internalisiert werden, werden häufig zu den Lysosomen der Zelle transportiert, wo der Wirkstoff oder das Toxin abgebaut wird [vgl. z.B. E.S. Vitetta et al., Science, 238, S. 1098-1104 (1987)]. Obwohl ein Antikörper- Medikament- oder Antikörper-Toxin-Konjugat ausgezeichnete Tumorbindungseigenschaften aufweisen kann, kann das Konjugat dennoch eine begrenzte zytotoxische Wirksamkeit aufgrund seiner Unfähigkeit, den Wirkort innerhalb der Zelle zu erreichen, besitzen.
Außerdem ist allgemein bekannt, daß Tumorzellpopulationen in bezug auf Antigenexpression häufig heterogen sind [vgl. z.B. A. P. Albino et al., "Heterogeneity In Surface Antigen And Glycoprotein Expression Of Cell Lines Derived From Different Melanoma Metastases Of The Same Patient," J. Exp. Med., 154, S. 1764-78 (1981)]. Außerdem wurde gezeigt, daß Antigen-positive Tumorzellen zu Antigen-negativen Nachkommen führen können [vgl. z.B. M. Yeh et al., "Clonal Variation For Expression of A Human Melanoma Antigen Defined By A Monoclonal Antibody," J. Immunol., 126 (Nr. 4), S. 1312-17 (1981)]. In jeder Tumorzellpopulation wird daher eine bestimmte Anzahl von Zellen vorliegen, die nicht das Antigen besitzen, für welches das jeweilige Immunokonjugat spezifisch ist. Das Immunokonjugat wird daher nicht in der Lage sein, an diese Zellen zu binden und deren Abtötung zu bewirken.
Aufgrund dieser Nachteile waren die derzeit verwendeten Antitumor-Medikament- oder-Toxin-Abgabesysteme nur eingeschränkt erfolgreich, insbesondere bei deren Verwendung zur in vivo-Behandlung.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Immunokonjugaten, wurden in vitro Antikörper-Enzymkonjugate in Kombination mit einem zweiten, ungelenkten Enzym für die Umwandlung van Jodid oder Arsphenamin in deren toxische Formen untersucht, um die Antikörper-vermittelte Zytotoxizität zu verstärken [vgl. z.B. C. W. Parker et al., "Enzymatic Activation And Trapping Of Luminol-Substituted Peptides And Proteins. A Possible Means Of Amplifying The Cytotoxicity Of Anti-Tumor Antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 (Nr. 1), S. 338-42 (1975) und G. W. Philpott et al., "Affinity Cytotoxicity Of Tumor Cells With Antibody-Glucose Oxidase Conjugates, Peroxidase, And Arsphenamine," Cancer Research, 34, S. 2159-64 (1974)].
Bei diesen in vitro-Untersuchungen wurde das Enzym Glucose Oxidase an einen Antikörper gebunden und in Kombination mit einem ungelenkten Peroxidase-Enzym verwendet, um Jodid oder Arsphenamin in zytotoxisches Jod bzw. eine zytotoxische Arsenverbindung umzusetzen. Für diesen Ansatz ist deshalb nicht nur die Lenkung von Glucose Oxidase zu den Tumorzellen mit Hilfe eines Antikörpers erforderlich, sondern auch die Präsenz von zwei weiteren ungelenkten Agenzien am Ort des Tumors. Die Wahrscheinlichkeit, daß alle drei Agenzien in vivo am Ort des Tumors gleichzeitig präsent sind ist gering und deshalb ist es unwahrscheinlich, daß dieser Ansatz therapeutische Bedeutung besitzt.
Das Kanadische Patent 1 216 791, erteilt für F. Jansen et al., am 20. Januar 1987, offenbart die Konjugation eines Enzyms, das zur Freisetzung von Ammoniumionen aus Substraten befähigt ist, mit einem Antikörper. Die Ammoniumionen sollen dann die zytotoxische Wirkung bestimmter Immunotoxine potenzieren, welche an den Ort des Tumors gelenkt wurden.
Schließlich offenbart die EP-A-142 905 ein Verfahren zur Behandlung einer krankhaften Zellpopulation, wie zum Beispiel eines Tumors, wobei ein Antikörper verwendet wird, um ein nicht-metabolisierbares Antigen zu den Tumorzellen zu lenken. Das Antigen wird zumindest innerhalb eines prozentualen Anteils der Tumorzellen angehäuft, welche dann lysiert werden um das Antigen in eine ubiquitäre Fibronektin-Einfang-Matrix freizusetzen, welche am Tumorort gebildet wurde. Dann wird gemäß dem Verfahren dieser Erfindung ein Jod-haltiger Ligand verabreicht, der für das an der Matrix fixierte Antigen spezifisch ist und daran bindet. Das zytotoxische Jod bewirkt dann die Abtötung der Tumorzellen an dieser Stelle. Viele alternativen Ausführungsformen sind in dieser Anmeldung offenbart. Eine davon schlägt die Verwendung eines Antikörper- Enzymkonjugates vor, um das Enzym an eine Tumorstelle zu lenken, sowie die Zugabe eines nicht-lethalen Substrates, das das Enzym in ein zytotoxisches Material umsetzen kann [vgl. Seiten 34-35 der Europäischen Patentanmeldung]. Diese Anmeldung offenbart jedoch an keiner Stelle, wie diese Ausführungsform durchzuführen ist. In gleicher Weise wird von Hellstrom et al., in "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2. Aufl.), Robinson and Lee (Hrsg.) S. 639 (1987) vorgeschlagen, daß "Medikamente, die bis zur "Aktivierung" durch ein Agens (z.B. ein Enzym) nicht toxisch sind am Tumor lokalisiert werden, als weiterer Ansatz betrachtet werden können...".
Sullivan et al. offenbaren in Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 1973, 709 - 717 Antikörper-Enzymkonjugate, um spezifisch den Parasiten Dirophilaria immitis abzutöten. Das Heterokonjugat besteht aus Antikörpern mit Spezifität für D. immitis-Antigenen, kovalent gebunden an Glucose Oxidase. In Gegenwart von Meerrettichperoxidase und einem oxidierbaren Substrat ist das Konjugat befähigt, den Parasiten abzutöten.
Die WO 87/03205 offenbart Enzym-gekoppelte Antikörper, wobei das Enzym durch seine Fähigkeit zur Katalyse von Reaktionen befähigt ist, die zur Abtötung von Zellen führen, welche Antigene tragen, an die der Antikörper binden kann. Beispiele für geeignete Enzyme sind Lipasen, Phospholipasen, Proteasen, Glykasen und Glukose Oxidase.
Die CA 1 216 791 offenbart Immunoenzym-Konjugate, die einen Antikörper oder ein Antikörperfragment enthalten, das kovalent an ein Enzym gebunden ist, welches zur Produktion von Ammoniumionen aus natürlichen, vom Organismus höherer Lebewesen tolerierten Substraten befähigt ist.
Bisher wurde jedoch von niemandem weder offenbart oder vorgeschlagen, wie der erfindungsgemäße Ansatz durchgeführt werden kann nach hat irgendjemand tatsächlich versucht, diesen Ansatz zum Targeting van Medikamenten durchzuführen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit den oben erwähnten Problemen und stellt einen neuartigen Ansatz für die Übertragung zytotoxischer Agenzien auf Tumorzellen durch die kombinierte Verwendung von Antikörper-Enzymkonjugaten und Prodrugs bereit. Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Enzym, das zur Konvertierung einer wenig oder nicht-toxischen Prodrug in ein aktives, zytotoxisches Medikament befähigt ist, mit einem Tumor-spezifischen Antikörper konjugiert. Dieses Antikörper-Enzymkonjugat wird dem Tumor-tragenden Säuger verabreicht und bindet aufgrund der Antikörperspezifität an die Oberfläche solcher Tumorzellen, welche das Tumorantigen aufweisen, für das der Antikörper spezifisch ist. Die Prodrug wird dann dem Wirt verabreicht und wird am Ort des Tumors über die Wirkung des Antikörper-gebundenen Enzyms in das aktivere zytotoxische Arzneimittel konvertiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Abgabe zytotoxischer Medikamente an Tumorzellen, wobei eine Reihe von Prodrugs durch ein einziges Antikörper-gebundenes Enzym aktiviert wird. Zusätzlich kann eine Reihe unterschiedlicher Immunokonjugate, d.h. Tumor-spezifischer Antikörper, die unterschiedliche Enzyme tragen, erfindungsgemäß verwendet werden, um eine Reihe verschiedener Prodrugs in deren jeweilige zytotoxischere Form zur Behandlung von Tumoren umzuwandeln. Erfindungsgemäß kann aber auch eine Serie unterschiedlicher Immunokonjugate, wobei die Spezifität der Antikörperkomponente des Konjugates variiert, d.h. jedes Immunokonjugat enthält einen Antikörper gegen ein anderes Antigen auf der Tumorzelle, verwendet werden, um die Prodrug oder eine Reihe von Prodrugs in die aktiverere zytotoxische Form zu konvertieren.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden Antikörper-Enzymkonjugate, die das Enzym Alkalische Phosphatase ("AP") enthalten, in Kombination mit der neuen Prodrug Etoposid-4'-phosphat oder 7-(2'-Aminoethylphosphat)mitomycin oder mit einer Kombination davon verwendet, um die Abtötung von Tumorzellen zu bewirken. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde ein Antikörper- Enzymkonjugat, enthaltend das Enzym Penicillin V Amidase ("PVA"), in Kombination mit einer neuen Prodrug, N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin, zur Abtötung von Tumorzellen verwendet. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines Antikörper-Enzymkonjugates, enthaltend das Enzym Cytosin Deaminase ("CD"), in Kombination mit der Prodrug 5-Fluorcytosin, zur Abtötung van Tumorzellen.
Die Immunokonjugate und Prodrugs gemäß vorliegender Erfindung können in Antitumor-Mitteln verwendet werden, wie zum Beispiel solchen, die eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Immunokonjugats oder einer Prodrug gemäß folgender Erfindung und eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers enthalten. Zusätzlich können die Immunokonjugate und Prodrugs in Kombinationen und Verfahren zur Behandlung von Tumoren in Säugetieren verwendet werden, wobei man das Säugetier mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung behandelt.
Vorteilhafterweise ermöglichen die Verwendung, die Immunokonjugate, die Prodrugs, die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Kombinationen gemäß vorliegender Erfindung eine relativ einfache und direkte Prozedur zur Abgabe zytotoxischer Medikamente auf Tumorzellen, und bewirken somit eine selektive Zytotoxizität und vermeiden gleichzeitig die Probleme aufgrund von heterogener Antigenexpression, Antigen/Antikörper-Internalisierung und unzureichender Wirksamkeit des Medikaments, welche mit herkömmlichen Antikörper-gebundenen Immunotherapie-Techniken verbunden sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 veranschaulicht die verwendete Strategie zur Aktivierung von Prodrugs im Bereich von Tumorzellen, welche Antikörper-Enzymkonjugate binden.
Figur 2 zeigt eine SDS-Polyacrylamidgel-Analyse (5- 12,5%iges Gradientengel, nicht-reduzierend) von: (A) dem 96.5-AP-Immunokonjugat; (B) dem L6-AP-Immunokonjugat; (C) AP; (D) dem monoklonalen Antikörper 96.5; und (E) dem monoklonalen Antikörper L6.
Figur 3 zeigt die Herstellung der erfindungsgemäßen Prodrugs von Etoposidphosphat und Etoposidthiophosphat.
Figur 4 zeigt die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) (aufgezeichnet bei 254 nm) von: (A) Etopasid-4'- phosphat alleine, d.h. in Abwesenheit von AP oder L6-AP- Konjugat; (B) Etoposid alleine; (C) dem Produkt, produziert 5 Minuten nach Reaktion von Etoposid-4'-phosphat-Prodrug mit AP; und (D) dem Produkt, produziert 5 Minuten nach der Umsetzung der Etoposid-4'-phosphat-Prodrug mit dem L6-AP- Konjugat gemäß vorliegender Erfindung.
Figur 5 ist eine vergleichende graphische Darstellung der prozentualen, zeitabhängigen Etoposidfreisetzung bei Behandlung von Etoposid-4'-phosphat oder Etoposid-4'-thiophosphat mit alkalischer Phosphatase.
Figur 6 zeigt im Vergleich die Bindung der monoklonalen Antikörper L6 und 96.5 sowie des erfindungsgemäßen Konjugats L6-AP und des Konjugats 96.5-AP an die Tumorzellen H3347.
Figur 7 zeigt einen Vergleich der Bindung der monoklonalen Antikörper L6 und 1F5 sowie der erfindungsgemäßen Konjugate L6- AP und 1F5-AP an die Tumorzellen H3347.
Figur 8 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung des prozentualen Anteils abgetöteter Tumorzellen in Abhängigkeit von der molaren Konzentration von Etoposid oder Etoposidphosphat-Prodrug. Die Darstellung zeigt die erhöhte prozentuale Abtötung, die daraus resultiert, daß die relativ unzytotoxische Prodrug entweder mit dem erfindungsgemäßen L6- AP-Konjugat oder mit dem Konjugat 96.5-AP reagiert.
Figur 9 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der prozentualen Inhibition der ³H-Thymidin-Aufnahme in die DNA von H3347-Tumorzellen, behandelt mit : Etoposid, : EP, : L6-AP+EP oder : 1F5-AP+EP. Die Darstellung veranschaulicht die Zunahme der zytotoxischen Aktivität, die man beobachtet, wenn man die Tumorzellen mit L6-AP und EP behandelt, im Vergleich zur Aktivität bei Behandlung mit EP alleine.
Figur 10 zeigt Analysen der Phosphataseaktivität in Tumoren, unbehandelt oder behandelt mit erfindungsgemäßen Konjugaten. Figur 10A zeigt die Gesamtphosphatase-Aktivität von H3347-Tumoren in Abhängigkeit von der Zeit in unbehandelten Mäusen, bzw. in Mäusen, welche 24 Stunden vorher mit dem erfindungsgemäßen L6-AP-Konjugat behandelt wurden. Figur 10B zeigt Tumor-Schnitte von unbehandelten Mäusen oder Mäusen nach Vorbehandlung mit L6-AP oder 1F5-AP, und Färbung mit Hämatoxylin und Eosin oder mit einem AP-Substrat. Dunkle Bereiche weisen auf hohe Phosphataseaktivität hin.
Figur 11 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung des Tumorvolumens in Abhängigkeit von der Zeit in Mäusen : unbehandelt oder behandelt mit : Etoposid, : EP, : 1F5- AP+EP oder : L6-AP+EP. Pfeile zeigen den Beginn der Arzneimittelbehandlung und falls möglich, wurden die Konjugate 18-24 Stunden früher verabreicht. Der Graph zeigt den bei Behandlung mit L6-AP und EP beobachteten, ausgeprägten Antitumoreffekt
Figur 12 zeigt die chemischen Strukturen der erfindungsgemäß verwendeten Mitomycinderivate, einschließlich der neuen Prodrug 7-(2'-Aminoethylphosphat)mitomycin ("MOP").
Figur 13 zeigt die Reaktion von MOP mit dem Enzym Alkalische Phosphatase in Abhängigkeit von der Zeit. Der Reaktionsverlauf wurde durch HPLC für die Freisetzung von MOH, dem Mitomycin-Alkoholderivat von MOP, aufgezeichnet.
Figur 14 zeigt im Vergleich die Bindung der monoklonalen Antikörper L6 und 1F5 und der erfindungsgemäßen Konjugate L6-AP und 1F5-AP an die Tumorzellen H2981.
Figur 15 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der prozentualen Inhibition der ³H-Thymidininkorporation in die DNA von H2981-Tumorzellen, behandelt mit : Etoposid, : EP, : AP+EP, : L6-AP+EP oder : 1F5-AP+EP. Der Graph zeigt die Zunahme der zytotoxischen Aktivität über den Wert von EP hinaus, wenn die Tumorzellen mit dem erfindungsgemäßen L6-AP- Konjugat vorbehandelt wurden.
Figur 16 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation der prozentualen Inhibition der ³H-Thymidin-Inkorporation in die DNA von H2981-Tumorzellen, behandelt mit : Mitomycin C (MMC), : MOH, : MOP, Δ: MOP+AP, : L6-AP+MOP oder : 1F5-AP+MOP. Der Graph zeigt die Zunahme der zytotoxischen Aktivität, die man beobachtet, wenn man die Tumorzellen mit erfindungsgemäßem L6-AP-Konjugat vorbehandelt und anschließend mit MOP behandelt, im Vergleich zu der Aktivität bei Behandlung mit MOP alleine.
Figur 17 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der prozentualen Inhibition der ³H-Thymidininkorporation in die DNA von CEM-Zellen, behandelt mit : MMC, : MOH, : MOP, : L6-AP+MOP oder : 1F5-AP+MOP. Dieser Graph veranschaulicht die Spezifität der verstärkten Zytotoxizität gemäß obiger Figur 16, da eine signifikante Verstärkung bei CEM-Zellen, denen das L6-Antigen fehlt, nicht beobachtet werden konnte.
Figur 18 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation des Tumorvolumens in Abhängigkeit von der Zeit in Mäusen : unbehandelt (Kontrolle) oder behandelt mit : MOH, : MOP, : 1F5-AP+MOP oder : L6-AP+MOP. Die Pfeile geben die in Abständen vorgenommenen Arzneimittelbehandlungen an und falls anwendbar wurden die Konjugate 18-24 Stunden vor der Medikamentbehandlung verabreicht. Der Graph veranschaulicht den ausgeprägten Antitumoreffekt, den man bei Tumorbehandlung mit L6-AP+MOP beobachtet.
Figur 19 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung des Tumorvolumens in Abhängigkeit von der Zeit in Mäusen : unbehandelt (Kontrolle) oder behandelt mit : MOP/EP, : 1F5- AP+MOP/EP oder : L6-AP+MOP/EP. Pfeile geben die in Abständen vorgenommenen Arzneimittelbehandlungen an, und falls möglich, wurden die Konjugate 18-24 Stunden vor der jeweiligen Arzneimittelbehandlung verabreicht. Der Graph veranschaulicht den ausgeprägten Antitumoreffekt, den man bei Tumorbehandlung mit L6-AP-Konjugat gemäß vorliegender Erfindung und einer Kombination der Prodrugs MOP und EP beobachtet.
Figur 20 zeigt die chemische Struktur einer erfindungsgemäßen Adriamycin-Prodrug ("APO") und deren Herstellung aus Adriamycin.
Figur 21 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation des Prozentsatzes an freigesetztem Adriamycin in Abhängigkeit von der Zeit bei Reaktion von APO mit Δ: freiem Penicillin V Amidase-Enzym oder und : dem L6-PVA-Konjugat gemäß vorliegender Erfindung bei einer Gesamtproteinmenge von 10 bzw. 100 ug/ml. Der Verlauf der Reaktion wurde durch HPLC aufgezeichnet.
Figur 22 zeigt im Vergleich die Bindung des monoklonalen Antikörpers L6 und der erfindungsgemäßen Konjugate L6-PVA und 1F5-PVA an H2981-Tumorzellen.
Figur 23 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation der prozentualen Inhibition der ³H-Thymidin-Inkorporation in die DNA van H2981-Tumorzellen, behandelt mit : Adriamycin (ADM), : APO, Δ: L6-PVA+APO oder : 1F5-PVA+APO. Der Graph veranschaulicht die Zunahme der zytotoxischen Aktivität, die man beobachtete, wenn Tumorzellen mit L6-PVA-Konjugat vorbehandelt wurden und anschließend mit APO behandelt wurden, im Vergleich zur Aktivität, die man bei Behandlung mit APO alleine beobachtet.
Figur 24 zeigt im Vergleich die Bindung der monoklonalen Antikörper L6 und 1F5 und der erfindungsgemäßen Konjugate L6- PVA und 1F5-PVA an Daudi-Lymphomazellen.
Figur 25 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation der prozentualen Inhibition der ³H-Thymidininkorporation in die DNA von Daudi-Lymphomazellen, behandelt mit : ADM, : APO, : L6-PVA+APO oder : 1F5-PVA+APO. Der Graph veranschaulicht die Zunahme der zytotoxischen Aktivität, die man beobachtete, wenn man die Tumorzellen mit 1F5-PVA-Konjugat vorbehandelte und mit APO behandelte, im Vergleich zum zytotoxischen Effekt, den man bei Behandlung der Zellen mit APO alleine beobachtete.
Figur 26 zeigt die chemischen Strukturen von 5- Fluorcytosin ("-FC") und 5-Fluoruracil ("5-FU"). 5-FC ist eine Prodrug, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in 5-FU umgewandelt wird.
Figur 27 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation der Produktmenge, die in Abhängigkeit von der Zeit gebildet bei Reaktion von Cytosin (Cyto) mit : CD, : L6-CD oder : 1F5-CD oder bei Reaktion von 5FC mit : CD, : L6-CD oder Δ: 1F5-CD. Das bei Verwendung von Cytosin als Substrat gebildete Produkt war Uracil und das bei Verwendung von 5-FC als Substrat gebildete Produkt war 5-FU. Der Reaktionsverlauf wurde spektrophotometrisch aufgezeichnet.
Figur 28 zeigt im Vergleich die Bindung des monoklonalen Antikörpers L6 und der erfindungsgemäßen Konjugate L6-CD und 1F5-CD an die Tumorzellen H2981.
Figur 29 zeigt eine vergleichende graphische Präsentation der prozentualen Inhibition der ³H-Leucin-Inkorporation in das Protein von H2981-Tumorzellen, behandelt mit : 5-FU, : 5- FC, : L6-CD+5-FC oder 1F5-CD+5-FC. Der Graph veranschaulicht die Zunahme der zytotoxischen Aktivität, die man beobachtete, wenn man die Tumorzellen mit L6-CD Konjugat vorbehandelte und anschließend mit 5-FC behandelte, im Vergleich zur Aktivität, die man bei Behandlung mit 5-FC alleine beobachtete.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Ansatz für die Abgabe zytotoxischer Agenzien an Tumorzellen und ermöglicht die Abtötung von Tumorzellen mit erhöhter Selektivität bei der Behandlung von Krebs, wie zum Beispiel Karzinomen und Melanomen, sowie anderen Tumoren.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung wenigstens einer Prodrug, die im Vergleich zum entsprechenden Ausgangs-Arzneimittel (Parent Drug) gegenüber Tumorzellen schwach zytotoxisch ist, und wenigstens eines Antikörper-Enzymkonjugates, das einen Antikörper mit Reaktivität gegenüber einem Antigen auf der Oberfläche von Tumorzellen, konjugiert an ein Enzym, das zur Umwandlung der Prodrug in das zytotoxischere Ausgangs-Arzneimittel befähigt ist, umfaßt, ausgewählt unter L6-β-Lactamase, 1F5-β-Lactamase, L6-AP, 1F5-AP, L6-PVA, 1F5- PVA, L6-CD, oder 1F5-CD, zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, bestehend aus zwei getrennten Komponenten zur Behandlung von Tumoren.
Ein erfindungsgemäßes Antikörper-Enzymkonjugat kann einem Tumor-tragenden Säuger verabreicht werden. Dieses Antikörper- Enzymkonjugat besteht vorzugsweise aus einem Tumor-spezifischen Antikörper, der mit einem Enzym verknüpft ist, das zur Umwandlung der Prodrug, die im Vergleich zum Ausgangs- Arzneimittel gegenüber Tumorzellen weniger zytotoxisch ist, in das aktivere Ausgangs-Arzneimittel. Bei Einführung in den Wirt lenkt die Antikörper-komponente des Konjugates, die mit einem Antigen auf den Tumorzellen reagiert, das Konjugat an den Tumorort und bindet an die Tumorzellen. Der Antikörper liefert somit das Enzym an den Tumorort. Eine Prodrug, die ein Substrat für das Enzym darstellt, wird dann in den Wirt eingeführt und am Ort des Tumors durch das Enzym in ein aktives, zytotoxisches Medikament umgewandelt. Das Medikament wird somit extrazellulär aktiviert und kann in alle Tumorzellen an dieser Stelle, das heißt, diejenigen Zellen, welche das jeweilige Tumorantigen tragen, für welches der Antikörper des Konjugates spezifisch ist und an welches der Antikörper gebunden wurde, sowie in diejenigen Zellen, die in bezug auf dieses Antigen negativ sind, aber dennoch am Ort des Tumors vorliegen (vgl. Figur 1), diffundieren. Das erfindungsgemäße Verfahren überwindet deshalb die gegenwärtigen Probleme in bezug auf Tumorantigen- Heterogenität und das Erfordernis der Antigen/Kanjugat- Internalisierung im Zusammenhang mit den herkömmlichen Immunokonjugat-Arzneimittel-Abgabesystemen.
Da es gemäß vorliegender Erfindung nicht erforderlich ist, das Medikament direkt an den Antikörper zu binden und damit die Medikamentmenge, die übertragen werden kann zu beschränken, tritt darüber hinaus das allgemeine Problem der Wirksamkeit des Medikaments am Tumorort nicht auf. Das vorliegende Verfahren erhöht in der Tat die Anzahl der am Ort des Tumors vorliegenden Moleküle des Medikaments, da das Antikörper-gebundene Enzym des Konjugates zahlreiche Substratumwandlungen vornehmen kann, wobei wiederholt Prodrug in aktives Medikament umgesetzt wird. Darüber hinaus ist das vorliegende Verfahren in der Lage, das aktive Medikament spezifisch am Ort des Tumors und nicht in anderem Gewebe freizusetzen. Dies wird dadurch bedingt, daß die Konzentration des Enzyms am Ort des Tumors höher ist als die Konzentration in anderem Gewebe, da die Tumorzellen mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat behaftet sind.
Die Antikörperkomponente des erfindungsgemäßen Immunokonjugates umfaßt einen Antikörper, der spezifisch an ein Tumor-assoziiertes Antigen bindet. Antikörper, die auf der Zelloberfläche über einen längeren Zeitraum gebunden bleiben, oder solche, die sehr langsam internalisiert werden, sind bevorzugt. Diese Antikörper können monoklonale Antikörper sein, können in Form von intakten Antikörpermolekülen oder als Fragmente vorliegen, welche die aktive Bindungsregion des Antikörpers enthalten, wie z.B. Fab oder F(ab')&sub2;, und können mit Hilfe allgemein bekannter Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt werden [vgl. z.B. R.A. DeWeger et al., "Eradication Of Murine Lymphoma And Melanoma Cells By Chlorambucil-Antibody Complexes, Immunological Rev., 62, S. 29-45 (1982) (Herstellung spezifischer polyklonaler Antikörper und deren Verwendung in Konjugaten); M. Yeh et al., "Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Manoclonal Antibodies," Prac. Natl. Acad. Sci., 76, S. 2927 (1979); J.P. Brown et al. "Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies," J. Immunol., 127 (Nr.2), S. 539-546 (1981) (Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper); und J.P. Mach et al., "Improvement Of Colon Carcinoma Imaging: From Polyclonal Anti-CEA Antibodies And Static Photoscanning To Monoclonal Fab Fragments And ECT", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, R.W. Baldwin et al. (Hrsg.), S. 53-64 (Academic Press 1985) (Herstellung von Antikörperfragmenten und Verwendung zur Lokalisierung an Tumorzellen)]. Zusätzlich können die verwendeten monoklonalen Antikörper von der Maus oder dem Menschen abgeleitet sein oder chimäre Antikörper sein [vgl. z.B. V.T. Oi, "Chimeric Antibodies," BioTechniques, 4 (Nr. 3), S. 214-221 (1986)].
Die Enzymkomponente des erfindungsgemäßen Immunokonjugates umfaßt ein Enzym, das auf eine Prodrug in der Weise einwirken kann, daß diese in deren aktivere, zytotoxische Form überführt wird. Der hierin verwendete Ausdruck "Prodrug" bezeichnet einen Präkursor oder ein Derivat einer pharmazeutisch aktiven Substanz, die im Vergleich zum Ausgangsmedikament gegenüber Tumorzellen weniger zytotoxisch ist und enzymatisch aktiviert oder in die aktivere Ausgangsform umgewandelt werden kann [vgl. z.B. D.E.V. Wilman, "Prodrugs In Cancer Chemotherapy," Biochemical Society Transactions, 14, S. 375-382 (615th Meeting, Belfast 1986) und V. J. Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach To Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, R. Borchardt et al. (Hrsg.), S. 247-267 (Humana Press 1985)].
Enzyme, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens brauchbar sind, umfassen Alkalische Phosphatase zur Umwandlung Phosphat-haltiger Prodrugs in die freien Medikamente, Cytosin Deaminase zur Umwandlung von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin in das Antikrebs-Medikament 5-Fluoruracil, β-Lactamase zur Umwandlung von Medikamenten, die mit β-Lactamen derivatisiert wurden, in die freien Medikamente, und Penicillin-V-Amidase, zur Umwandlung von Medikamenten, die an ihren Amin- Stickstoffatomen mit Phenoxyacetyl derivatisiert wurden, in die freien Medikamente. Antikörper-Abzym-Konjugate können wie hierin beschrieben hergestellt werden, um das Abzym auf die Tumorzell-Population zu übertragen.
Dementsprechend umfassen die erfindungsgemäßen Prodrugs, ohne darauf beschränkt zu sein, die oben erwähnten Prodrugs, wie z.B. Phosphat-haltige Prodrugs, Thiophosphat-haltige Prodrugs, β-Lactam-haltige Prodrugs, gegebenenfalls substituierte Phenoxyacetamid-haltige Prodrugs oder 5- Fluorocytosin und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs, die durch das Enzym des Konjugates in das aktivere, zytotoxische freie Medikament überführt werden können. Beispiele für zytotoxische Medikamente, die zu einer Prodrug für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung derivatisiert werden können, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Etoposid, Teniposid, Adriamycin, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, cis-Platin und cis-Platin-Analoga, Bleomycine, Experamicine [vgl. US Patent 4 675 187], 5-Fluoruracil, Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Lostverbindungen.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können an die erfindungsgemäßen Antikörper mit Hilfe wohlbekannter Techniken kovalent gebunden werden, wie zum Beispiel mit Hilfe der heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien SPDP (N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) oder SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat [vgl. z.B. P. E. Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunological Rev., 62, S. 119-58 (1982); J.M. Lambert et al., oben, S. 12038; G. F. Rowland et al., oben, S. 183-84 und J. Gallego et al., oben, S. 737-38]. Fusionsproteine, welche wenigstens die Antigenbindende Region eines erfindungsgemäßen Antikörpers, verknüpft mit wenigstens einem funktionell aktiven Teil eines erfindungsgemäßen Enzyms umfassen, können als Alternative unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, die aus dem Stand der Technik wohlbekannt sind, hergestellt werden (vgl. z.B.: M.S. Neuberger et al., Nature, 312, S. 604-608 (1984)]. Diese Fusionsproteine wirken im wesentlichen in gleicher Weise wie die hierin beschriebenen Antikörper-Enzymkonjugate.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein Antikörper mit Spezifität für ein menschliches Krebsantigen mit dem Enzym Alkalische Phosphatase konjugiert und in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Umwandlung eines 4'-Phosphat-Derivates der Epipodophyllotoxin- Glucoside in ein aktives Antikrebs-Medikament verwendet. Diese Derivate umfassen Etoposid-4'-phosphat, Etoposid-4'- thiophosphat und Teniposid-4'-phosphat (vgl. Figur 3 für die Strukturen dieser Derivate; das Teniposid-Derivat weist eine 2- Thienylgruppe anstelle der Methyl-Gruppe auf dem Zuckerrest der abgebildeten Strukturen auf). Andere Ausführungsformen dieser Erfindung umfassen Phosphat-Derivate dieser Glucoside, wobei der Phosphatrest an anderen Hydroxylgruppen des Glucosids angeordnet ist. Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden jedoch als erfindungsgemäße Prodrugs die Phosphatderivate Etoposid-4'-phosphat oder Etoposid-4'-thiophosphat verwendet.
Erfindungsgemäß wurde Alkalische Phosphatase, AP, kovalent an den monoklonalen Antikörper L6, einem IgG2a-Antikörper, der an ein Glykoprotein-Antigen auf menschlichen Lungenkarzinomzellen bindet [I. Hellström et al., "Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas," Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 83, S. 7059-63 (1986)] gebunden. Das resultierende Immunokonjugat zeigte keinen Verlust in bezug auf enzymatische Aktivität im Vergleich zu unkonjugiertem Enzym. Zusätzlich blieb der größte Teil der Bindungsaktivität des Antikörpers L6 im Immunokonjugat erhalten.
Unter Verwendung von in vitro-Zytotoxizitäts-Assays konnte gezeigt werden, daß die Behandlung von Zellen einer menschlichen Karzinomzellinie mit dem Immunokonjugat L6-AP, gefolgt van einer Exposition der Zellen mit der Prodrug Etoposidphosphat zu einer Zytotoxizität führte, die mit der bei alleiniger Anwendung von Etoposid auf diese Krebszellen beobachteten Zytotoxizität vergleichbar war. Demgegenüber zeigte Etoposidphosphat alleine nur eine geringe Zytotoxizität.
In den erfindungsgemäß durchgeführten in vivo- Untersuchungen in nackten Mäusen wurde gezeigt, daß das L6-AP- Immunokonjugat an L6-positiven Tumor-Xenotransplantaten lokalisiert wird. Eine histologische Untersuchung dieser Tumoren ergab, daß das herangeführte AP-Enzym über die Tumormasse verteilt war.
Außerdem zeigte das L6-AP-Immunokonjugat eine starke in vivo Antitumoraktivität in Therapieexperimenten, wobei das Konjugat nackten Mäusen verabreicht wurde, welche subkutane, L6-positive Tumoren trugen und wobei anschließend mit einer Etoposid-Phosphat-Prodrug behandelt wurde. Der Antitumoreffekt dieser Behandlung beinhaltete die vollständige Regression einiger Tumoren und war dem Effekt überlegen, den man bei der Behandlung mit der Prodrug oder dem Ausgangs-Medikament alleine beobachtete.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde das Immunokonjugat L6-AP verwendet, um eine neuartige Mitomycinphosphat-Prodrug in das aktive Medikament Mitomycin umzuwandeln. Wie im Falle der Etoposidphosphat- Prodrug entfernt das Enzym AP des Konjugates die Phosphatgruppe der Prodrug und setzt dabei ein aktives Antitumoragens frei. Die Mitomycinphosphat-Prodrug gemäß dieser Ausführungsform kann ein N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8;-Alkylphosphat-Derivat von Mitomycin C oder Porfiromycin oder einem der pharmazeutisch verträglichen Salze davon sein. N&sup7; bezeichnet das Stickstoffatom, das sich in der 7-Position des Mitosan-Kerns des Ausgangs-Medikaments befindet. Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird als Derivat 7-(2'-Aminoethylphosphat)mitomycin ("MOP") (vgl. die in Figur 12 angegebenen Strukturen für Mitomycin C und MOP in Form des Dinatriumsalzes; das Porfiromycin-Derivat, welches MOP entspricht, weist eine Methylgruppe am Aziridin-Stickstoff von Mitomycin C auf). Die Verbindung MOP kann aber auch bezeichnet werden als 9a-Methoxy-7-[[(phosphonooxy)ethyl]amino]mitosan- Dinatriumsalz. Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Verwendung von N&sup7;-Alkylmitomycinphosphorothioaten als Prodrugs.
In vitro Untersuchungen ergaben, daß die Behandlung von Zellen einer menschlichen Lungentumorzellinie mit dem Immunokonjugat L6-AP, gefolgt von einer Exposition der Zellen mit MOP, zu einer Zytotoxizität führte, die vergleichbar war mit derjenigen, die man bei alleiniger Anwendung des anerkannten Antitumormedikaments Mitomycin auf die Tumorzellen beobachtete. Die alleinige Anwendung der Mitamycinphosphat- Prodrug auf die Tumorzellen führte zu einer geringen Zytotoxizität. In ähnlicher Weise zeigte das L6-AP- Immunokonjugat einen ausgeprägten Antitumoreffekt bei in vivo- Therapie-Experimenten, wobei das Konjugat nackten Mäusen verabreicht wurde, die menschliche Lungentumoren trugen, und wobei man anschließend mit der Mitomycinphosphat-Prodrug behandelte. Dieser Antitumoreffekt war stärker ausgeprägt, als bei alleiniger Verwendung von Prodrug, Ausgangsmedikament oder Verabreichung der Prodrug zusammen mit einem nicht-bindenden Antikörper-AP-Konjugat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde ein Penicillin Amidase-Enzym kovalent an den monoklonalen Antikörper L6 gebunden und das resultierende Immunokonjugat wurde dazu verwendet, um eine neuartige Adriamycin-Prodrug in den aktiven Antitumorwirkstoff Adriamycin umzuwandeln. Als Amidase wurde eine Penicillin V Amidase ("PVA"), isoliert aus Fusarium oxysporum verwendet, die Phenoxyacetylamidbindungen hydrolysiert. Als Prodrug wurde N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin ("APO") verwendet, das durch die Amidase unter Freisetzung des starken Antitumormittels Adriamycin hydrolysiert wurde. Das L6-PVA Immunokonjugat zeigte keinen Verlust der enzymatischen Aktivität im Vergleich zum unkonjugierten Enzym und der größte Teil der Bindungsaktivität des Antikörpers L6 bleibt im Konjugat erhalten.
In den erfindungsgemäßen in vitro Studien führte die Behandlung menschlicher Lungentumorzellen mit dem L6-PVA Konjugat, gefolgt von einer Exposition der Zellen mit der APO- Prodrug zu einer Zytotoxizität, die vergleichbar war mit derjenigen, die man bei der Behandlung der Zellen mit Adriamycin alleine beobachtete. Entscheidenderweise zeigte die APO-Prodrug alleine eine sehr viel geringere Zytotoxizität gegenüber den Tumorzellen.
Vergleichbare in vitro-Studien wurden ebenfalls unter Verwendung eines 1F5-PVA Konjugates durchgeführt, in dem das PVA-Enzym mit 1F5 konjugiert war, einem monoklonalen Antikörper, der mit einem Antigen auf Lymphomzellen reagiert. Die Behandlung von Daudi-Lymphomzellen mit dem 1F5-PVA- Konjugat, gefolgt von einer Exposition der Zellen mit APO führte zu einer Zytotoxizität, die vergleichbar war mit derjenigen, die man bei alleiniger Behandlung mit Adriamycin beobachtete, während eine Behandlung der Zellen mit APO alleine zu einer sehr geringen Zytotoxizität führte.
Obwohl die Verwendung der neuartigen Adriamycin-Prodrug N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl) adriamycin hierin beschrieben wird, umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung anderer verwandter Adriamycin-Prodrugs, welche in im wesentlichen gleicher Weise derivatisiert werden können. Beispielsweise liegt die Verwendung der Prodrug N-(Phenoxyacetyl)adriamycin ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, da die Prodrug unter Anwendung des hierin beschriebenen Protokolls synthetisiert werden kann, wobei man den Reaktanden P- Hydroxyphenoxyessigsäure (vgl. folgendes Beispiel 4), ersetzt durch Phenoxyessigsäure. Zusätzlich umfassen die erfindungsgemäßen Adriamycin-Prodrugs andere N-Hydroxyphenoxyacetylderivate von Adriamycin, wie z.B. solche, die in verschiedenen Positionen des Phenylrings substituiert sind, sowie N-Phenoxyacetylderivate, die andere Substituenten am Phenylring aufweisen, als die hierin beschriebene Hydroxylgruppe.
Erfindungsgemäß werden auch solche Prodrugs erfaßt, die abgeleitet wurden durch Umsetzung der Amin-Gruppe des Ausgangswirkstoffs mit der Carboxylgruppe von Phenoxyessigsäure oder anderen verwandten Säuren. Somit fallen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung auch von Adriamycin verschiedene Anthrazyklin-Prodrugs, die derivatisiert werden können und im wesentlichen in gleicher Weise wie die hierin beschriebenen Adriamycin-Prodrugs wirken. Beispiele für andere Prodrugs, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt und verwendet werden können, sind Hydroxyphenoxyacetylamid-Derivate und Phenoxyacetylamid-Derivate von Anthrazyklinen, wie Daunamycin und Carminomycin. Andere Aminhaltige Medikamente wie Melphalan, Mitomycin, Aminopterin, Bleomycin und Dactinomycin können ebenfalls wie hierin beschrieben modifiziert werden um erfindungsgemäße Prodrugs zu erhalten.
Die folgende Erfindung umfaßt somit die Verwendung von Verbindungen der Formel I:
worin:
R¹ für H steht und R³ für OH oder OCH&sub3; steht; oder
R¹ für OH und R³ für OCH&sub3; steht; und
R² für H oder OH steht.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Konjugation des Enzyms Cytosin Deaminase ("CD") an den monoklonalen Antikörper L6. Das Deaminase-Enzym katalysiert die Umwandlung von 5-Fluorcytosin ("5-FC"), einer Verbindung, der die antineoplastische Aktivität fehlt, in das starke Antitumor-Medikament 5-Fluoruracil ("5-FU") (vgl. Figur 26). Das erfindungsgemäße L6-CD- Immonokonjugat wurde somit zur Umwandlung der Prodrug 5-FC zu 5-FU verwendet, was zu einem signifikanten zytotoxischen Effekt auf Tumorzellen in vitro führte.
Ebenfalls wie die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Immunokonjugate zeigte das L6-CD-Konjugat keinen signifikanten Verlust an enzymatischer oder Bindungs-Aktivität als Folge der Konjugation. Darüber hinaus zeigten die durchgeführten in vitro-Untersuchungen, daß die Behandlung menschlicher Lungentumorzellen mit L6-CD-Konjugat, gefolgt von einer Exposition der Zellen mit der Prodrug 5-FC einen zytotoxischen Effekt bewirkte, der gleich dem Effekt war, den man bei Behandlung der Zellen mit dem starken Antitumor-Medikament 5-FU alleine beobachtete. Die Behandlung dieser Tumorzellen mit der Prodrug alleine bewirkte einen insignfikanten zytotoxischen Effekt.
Aus den umfangreichen, hierin beschriebenen Daten ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Immunokonjugat/Prodrug- Kombination einen selektiven Mechanismus zur Abtötung von Tumorzellen bereitstellt, wobei eine Prodrug verabreicht wird, die einen verminderten zytotoxischen Effekt aufweist, wobei die Prodrug in einen hochzytotoxischen Zustand am Ort der Tumorzellen überführt wird, und zwar aufgrund der Präsenz des Antikörper-gelenkten Enzyms. Darüber hinaus ist die mit Hilfe dieser Methode erreichte Zytotoxizität größer als bei herkömmlichen Antikörper-Lenkungstechniken, da das am Ort des Tumors freigesetzte aktive Medikament nicht durch die physikalischen Einschränkungen behindert wird, die mit den oben erwähnten Antikörper-Arzneimittel-Konjugat-Abgabesystemen verbunden sind. Es ist daher klar, daß die vorliegende Erfindung einen Weg bereitstellt, auf dem die selektive Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen bei der Behandlung von Krebs und anderen Tumoren verstärkt werden kann.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung stellt eine Kombinations-Chemotherapie bereit, bei welcher mehrere Prodrugs und nur ein einzelnes Antikörper-Enzym-Konjugat verwendet werden. Gemäß dieser Ausführungsform wird eine Reihe von Prodrugs verwendet, welche alle Substrate für das gleiche Enzym in einem Immunokonjugat darstellen. Somit konvertiert ein spezielles Antikörper-Enzymkonjugat eine Reihe von Prodrugs in ihre zytotoxischen Formen, woraus eine erhöhte Antitumoraktivität am Ort des Tumors resultiert. Beispielsweise wurde ein verstärkter Antitumoreffekt in in vivo-Studien erzielt, bei welchen das erfindungsgemäße Immunokonjugat L6-AP nackten Mäusen verabreicht wurde, die menschliche Lungen- Tumoren trugen und wobei anschließend eine Therapie mit einer Kombination von neuartigen Prodrugs, d.h. einer Etoposidphosphat-Prodrug und einer damit verabreichten Mitomycinphosphat-Prodrug, erfolgte. In gleicher Weise führte die Verabreichung von Etoposidphosphat, Adriamycinphosphat [vgl. US Patent 4 185 111] und 5-Fluoruridin-monophosphat [vgl. z.B. C. Heidelberger et al., "Fluorinated Pyrimidines And Their Nucleosides", in Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 54, S. 57-119 (1983)] nach Behandlung mit einem Antitumorantikörper- AP-Konjugat zur Bildung einer Kombination von wirksamen Antitumor-Medikamenten am Ort des Tumors, d.h. Etoposid, Adriamycin und 5-Fluoruridin.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform verwendet man eine Reihe verschiedener Immunokonjugate, wobei die Enzymkomponente des Konjugates variiert. Jedes Immunokonjugat kann dazu verwendet werden, um die entsprechende Prodrug oder Prodrugs am Ort des Tumors in die zytotoxische Form zu überführen. Beispielsweise kann ein Antitumorantikörper mit AP verknüpft werden, um das eine Konjugat zu bilden, und kann mit Cytosin Deaminase verknüpft werden, um ein anderes Konjugat zu bilden. Beide Immunokonjugate werden dann dem Tumor-tragenden Wirt verabreicht und binden an das Tumorantigen am Ort des Tumors aufgrund der Antikörperspezifität. Die Verabreichung der Prodrugs Etoposidphosphat und 5-Fluorcytosin führte zur Bildung von Etoposid und 5-Fluoruracil, beide starke Antitumormittel, am Ort des Tumors.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt die Verwendung einer Reihe von Immunokonjugaten, wobei die Spezifität der Antikörperkomponente des Konjugates variiert, d.h. es wird eine Reihe von Immunokonjugaten verwendet, wobei jede Komponente einen Antikörper aufweist, der spezifisch an ein anderes Antigen auf dem interessierenden Tumor bindet. Die Enzymkomponente dieser Immunokonjugate kann gleich oder verschieden sein. Diese Ausführungsform kann von besonderem Nutzen sein in Situationen, wo die Menge der verschiedenen Antigene auf der Tumoroberfläche unbekannt ist und wobei man sicherstellen will, daß Enzym in ausreichender Menge an den Tumorort gelenkt wird. Die Verwendung einer Reihe von Konjugaten, die verschiedene Antigenspezifitäten für den Tumor aufweisen, erhöht die Wahrscheinlichkeit der Bereitstellung von Enzymen in ausreichender Menge am Ort des Tumors für die Umwandlung einer Prodrug oder einer Serie von Prodrugs. Zusätzlich ist diese Ausführungsform von Bedeutung für das Erreichen einer hohen Tumorspezifität, da die Wahrscheinlichkeit, daß normales Gewebe all die gleichen Tumor-assoziierten Antigene aufweist, gering ist [vgl. I. Hellstrom et al., "Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity", J. Immunol., 127 (Nr. 1), S. 157-169 (1981)].
Die bevorzugten Antikörper-Enzymkonjugate gemäß vorliegender Erfindung sind L6-β-Lactamase, 1F5-β-Lactamase, L6-AP, 1F5-AP, L6-PVA, 1F5-PVA, L6-CD und 1 F5-CD.
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem pharmazeutische Mittel und Kombinationen zur Behandlung von Krebs und anderen Tumoren. Insbesondere umfaßt die Erfindung Kombinationen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper-Enzymkonjugate und die entsprechende(n) Prodrug(s) zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren umfassen, wobei ein Säuger als Wirt in pharmazeutisch akzeptabler Weise mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines oder mehrerer Antikörper-Enzymkonjugate und einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer oder mehrerer Prodrugs behandelt wird. Die erfindungsgemäße Kombination eignet sich zur Behandlung beliebiger Säuger, umfassend Menschen, Hunde, Katzen und Pferde.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung zur Behandlung von Tumoren, bestehend aus zwei getrennten Komponenten, wobei eine Komponente eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Antikörper-Enzymkonjugates gemäß obiger Definition umfaßt und die andere Komponente wenigstens eine Prodrug gemäß obiger Definition umfaßt. Vorzugsweise ist das Antikörper-Enzymkonjugat ausgewählt unter L6-AP, L6-PVA und L6-CD und die Prodrug wird ausgewählt unter Etoposidphosphaten, Etoposidthiophosphaten, Teniposidphosphaten, Teniposidthiophosphaten, Adriamycinphosphaten, N-Phenoxyacetylderivativen von Adriamycin, Mitomycinphosphaten, 5-Fluoruridinmonophosphaten und 5-Fluorcytosin.
Besonders bevorzugt ist eine Zusammensetzung, worin als Antikörper-Enzymkonjugat L6-AP und als Prodrug Etoposid-4'- phosphat, N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyl-mitomycinphosphat oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon verwendet werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen, wobei man das Antikörper-Enzymkonjugat und die Prodrug kombiniert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Antikörper-Enzymkonjugat verabreicht, bevor man die Prodrug in den Wirt einführt. Es sollte eine ausreichende Zeitspanne zwischen Verabreichung des Konjugates und der Prodrug liegen, um dem Antikörper des Konjugates die Lenkung und Lokalisierung des Enzyms am Tumorort zu ermöglichen. In Abhänigkeit vom verwendeten Konjugat kann eine solche ausreichende Zeitspanne im Bereich von 12 Stunden oder einer Woche liegen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate und Prodrugs können unter Anwendung herkömmlicher Verabreichungsarten verabreicht werden, umfassend, ohne darauf beschränkt zu sein, eine intravenöse, intraperitoneale, orale, intralymphatische Verabreichung oder Verabreichung direkt in den Tumor. Eine intravenöse Verabreichung ist bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen - umfassend Immunokonjugate oder Prodrugs - können in unterschiedlichen Dosierungsformen vorliegen, umfassend, ohne darauf beschränkt zu sein, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Pulver, Suppositorien, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Liposome und Injektions- oder Infusionslösungen. Die jeweils bevorzugte Form ist abhängig von der Art der Verabreichung und der therapeutischen Anwendung. Beispielsweise kann eine orale Verabreichung des Antikörper-Enzym-Konjugates nicht bevorzugt sein, da die Proteine des Konjugates bei oraler Einnahme, wie zum Beispiel in Tablettenform, im Magen abgebaut werden können.
Die Konjugat- oder Prodrug-Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise außerdem herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger und Adjuvanzien, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel Humanserumalbumin, Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Lecithin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat und Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat.
Die effektivste Form der Verabreichung und des Dosierungsplanes für Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung ist abhängig von Schwere und Verlauf der Erkrankung, dem Gesundheitszustand des Patienten und dem Ansprechen auf die Behandlung sowie von der Einschätzung des behandelnden Arztes. Folglich sollten die Dosierungen für Immunokonjugate und Prodrugs auf den jeweiligen Patienten eingestellt werden.
Nichtsdestoweniger kann die wirksame Dosis für ein erfindungsgemäßes Antikörper-Enzymkonjugat im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 100 mg/m² liegen. Eine wirksame Dosis für die erfindungsgemäße Prodrug ist abhängig von der jeweils verwendeten Prodrug und dem Ausgangswirkstoff, von dem sie abgeleitet ist. Da die Prodrug weniger zytotoxisch ist als der Ausgangswirkstoff können Dosierungen verwendet werden, die höher liegen als diejenigen, die im Stand der Technik für den jeweiligen Ausgangswirkstoff beschrieben sind. Beispielsweise kann eine wirksame Dosis für die Etoposid-Prodrugs im Bereich von etwa 75-500 mg/m² liegen. Eine wirksame Dosis für die Mitomycinphosphat-Prodrugs kann im Bereich von etwa 50-1000 mg/m² liegen. Eine wirksame Dosis für die Adriamycin-Prodrugs kann im Bereich von etwa 15-150 mg/m² liegen. Eine wirksame Dosis für 5-Fluorcytosin und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs kann im Bereich von etwa 600-2000 mg/m² liegen.
Zum besseren Verständnis der hierin beschriebenen Erfindung seien die folgenden Beispiele aufgeführt: Diese Beispiele dienen lediglich dem Zweck der Veranschaulichung und beschränken in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung.

BEISPIEL 1

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung von Immunokonjugaten und Methoden der vorliegenden Erfindung für die Konversion einer Etoposidphosphat-Prodrug zu Etoposid durch Antikörper-gebundene Alkalische Phosphatase und die daraus resultierende in vitro-Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen. Die in vivo-Antitumoreffekte bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren werden veranschaulicht.

Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugates

In diesem Beispiel werden drei Immunokonjugate hergestellt und untersucht, welche einen der monoklonalen Antikörper L6, 96.5 (nicht Teil dieser Erfindung) oder 1F5, konjugiert an das Enzym Alkalische Phosphatase (AP) umfassen. L6 ist ein monoklonaler Antikörper der Unterklasse IgG2a, der spezifisch an ein Glykoproteinantigen auf menschlichen Lungenkarzinomzellen bindet [vgl. I. Hellstrom et al., (1986), oben]. 96.5 ist ein monoklonaler IgG2a-Antikörper mit Spezifität für p97, einem Melanom-assoziierten Antigen [vgl. J. P. Brown et al., "Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies," J. Immunol., 127 (Nr. 2), S. 539-46 (1981)]. 1F5 ist ein monoklonaler IgG2a- Antikörper, mit Spezifität für das CD-20-Antigen auf normalen und neoplastischen B-Zellen [vgl. E.A. Clark et al., "Role Of The Bp35 Cell Surface Polypeptide in Human B-Cell Activation," Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82, S. 1766-70 (1985)]. Das L6- Hybridom, das den monoklonalen Antikörper L6 produziert, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer HB8677 im Zusammenhang mit der Einreichung der Europäischen Patentanmeldung 207963, veröffentlicht am 14. Januar 1987, hinterlegt. Das Hybridom 1F5, das den monoklonalen Antikörper 1F5 produziert, wurde am 12. Februar 1988 bei der ATCC unter der ATCC Nr. HB9645 hinterlegt.
Die Antikörper-Enzymkonjugate wurden durch kovalente Bindung von AP an die monoklonalen Antikörper L6, 96.5 oder 1F5 über eine Thioether-Brücke unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das in ähnlicher Weise beschrieben wurde von J. M. Lambert et al., in "Purified Immunotoxins That Are Reactive With Human Lymphoid Cells," J. Biol. Chem., 260 (Nr. 22), S. 12035-12041 (1985). Gemäß einem Versuchspratokoll wurden die Konjugate L6-AP und 96.5-AP wie folgt hergestellt: 2-Iminothiolan (50 mM in 0.5M Triethanolamin-Hydrochlorid mit 10 mM EDTA, pH 8,0) wurde zu einer 8,0 mg/ml-Lösung des Antikörpers L6 oder 96.5 (in 50 mM Triethanolamin-Hydrochlorid und 1 mM EDTA, pH 8,0) gegeben, so daß die Endkonzentration von 2-Iminothiolan 1,3 mM betrug. Nach 90 Minuten bei 0ºC wurde die Reaktion durch Gelfiltration über Sephadex G-25 unter Verwendung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,2 als Elutionsmittel gestoppt. Die Reaktion der Antikörper mit 2-Iminothiolan bewirkte die Einführung von Sulfhydryl- Gruppen, deren Anzahl 1,9-3,5, bestimmt mit Ellman's Reagens [vgl. P. W. Riddles et al., "Ellman's Reagent: 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic Acid)-A Reexamination," Analytical Biochemistry, 94, S. 75-81 (1979)] betrug.
Alkalische Phosphatase (Kalbsintestinum, Boehringer Mannheim 10 mg/ml) in 100 mM Phosphatpuffer bei pH 7,0 wurde mit Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1carboxylat (Sulfo-SMCC) (Pierce Chemical Co., 20 mM in Dimethylformamid (DMF)) behandelt, wobei die Endkonzentration von Sulfo-SMCC 2,4 mM betrug. Nach 30 Minuten bei 30ºC wurde das modifizierte Enzym durch Gelfiltration über Sephadex G-25 und Elution mit PBS gereinigt.
Die modifizierte AP wurde anschließend in einem molaren Verhältnis von 2:1 zum thiolierten Antikörper gegeben. Die Reaktion von AP mit Sulfo-SMCC bewirkte die Einführung von Maleimido-Gruppen in das Enzym, das bei Reaktion der Sulfhydryl-Gruppen mit einem modifizierten Antikörper zur Bildung einer Thioether-Verknüpfung zwischen Antikörper und AP führte. Jodacetamid (Endkonzentration 1 mM) wurde zur Proteinlösung nach 1-stündiger Reaktionszeit zugesetzt, um verbleibende unumgesetzte Thiole zu blockieren. Die Konjugate wurden dann unter Verwendung von PBS als Elutionsmittel über eine Sephacryl S-300-Säule gereinigt. Die Fraktionen wurden bei 280 nm aufgezeichnet und die AP-Aktivität jeder Fraktion (64 000-fache Verdünnung) wurde bei pH 9,5 unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat getestet [P. Tijssen, Laboratory Techniques In Biochemistrv And Molecular Biology, S. 366-67, (Elsevier Press 1985)]. Diejenigen Fraktionen, die Konjugate mit geeigneten Werten für das AP-Antikörper- Verhältnis aufwiesen, wurden durch SDS-PAGE auf einem 5-12,5%igen Gradientengel (vgl. Figur 2) bestimmt und anschließend vereinigt. Die Proteinkonzentration wurde bei 280 nm bestimmt, wobei eine 0,1%ige Lösung von Antikörpern oder AP einen OD-Wert von 1,4 bzw. 0,76 aufwies. Die Analyse der Konjugate auf dem Gel ergab, daß sie überwiegend ein 1:1- Verhältnis von Antikörper zu Enzym aufwiesen. Unter den für das Gel verwendeten denaturierenden Bedingungen wanderte AP, das in der Natur als Homodimer mit einem Molekulargewicht von 140 kd existiert, als Einzelbande bei 70kd. Dieses 70kd-Protein wurde auf dem Gel auf denjenigen Bahnen beobachtet, die außerdem die Konjugatbande mit höherem Molekulargewicht aufwiesen, da eine der Untereinheiten des Enzyms von dem kovalent verknüpften Antikörper-Enzym-Konjugat abdissoziierte (vgl. Figur 2, Bahnen A und B). Gelfiltration auf einer S-300 Sephacryl -Säule zeigte, daß kein freies Enzym in dem Konjugat-Präparat vorlag.
Es wurde auch ein zweites, ähnliches Vesuchsprotokoll zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate L6-AP und 1F5-AP verwendet, wobei der Antikörper mit Iminothiolan (0,5 mM) modifiziert wurde, um eine einzelne freie Thiolgruppe einzuführen und wobei AP mit 4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexan- 1-carboxylat (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) modifiziert wurde, wobei die Endkonzentration von SMCC 1,0 mM betrug. Die modifizierten Proteine wurden anschließend miteinander verbunden und die resultierenden Konjugate wurden durch Gelfiltration über S-300 Sephacryl gereinigt. Eine anschließende SDS-PAGE zeigte, daß diese Konjugat-Präparationen frei von unkonjugiertem Protein und Aggregaten waren. Wie oben beschrieben, wurden die Protein-Konzentrationen der Präparationen über die Extinktion bei 280 nm bestimmt, wobei eine 1 mg/ml-Lösung des Antikörpers (Molekulargewicht 160 kd) und von AP (Molekulargewicht 140 kd) einen OD-Wert von 1,4 bzw. 0,76 Einheiten aufwiesen.

Herstellung der Prodrugs, Etoposidphosphat und Etoposidthiophosphat

In Übereinstimmung mit dem nächsten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde jedes Antikörper- Enzymkonjugat mit einer neuen Etoposidphosphat- oder Etoposidthiophosphat-Prodrug umgesetzt. Insbesondere wurden als Prodrugs 4'-Dinatriumphosphatester von Etoposid und 4'- Dinatriumthiophosphatester von Etoposid mit den in Figur 3 angegebenen Formeln verwendet.
Etoposidphosphat und Etoposidthiophosphat wurden synthetisiert durch Umsetzung von Etoposid mit Phosphoroxychlorid bzw. Thiophosphorylchlorid, wobei die Dichlorphosphat- bzw. Dichlorthiophosphat-Zwischenprodukte produziert wurden. Die Phosphorylierungsreaktion wird in einem geeigneten wasserfreien, organischen Lösungsmittel, wie z.B. Acetonitril, und vorzugsweise in Gegenwart einer tertiären Aminbase, wie z.B. N,N-Diisopropylethylamin, durchgeführt. Der Reaktionsverlauf wird durch Dünnschichtchromatographie (TLC) verfolgt, womit die optimale Reaktionszeit für das Auftreten des Produktes und/oder das Verschwinden des Ausgangsmaterials ermittelt werden kann. Erfahrungsgemäß kann die Reaktionszeit etwa 4 Stunden bis etwa 72 Stunden betragen, abhängig von der Qualität der verwendeten Phosphor-Reagenzien. Die Hydrolyse des Dichlorphosphat- oder Dichlorthiophosphat-Zwischenprodukts zur Dinatriumphosphat- oder -thiophosphat-Prodrug wurde durchgeführt unter Zugabe einer Lösung von Natriumbicarbonat (20-50-facher Überschuß) in Wasser. Die Zugabe erfolgte direkt zum Reaktionsgemisch und das Gemisch wurde 1,5 bzw. 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Eine Partitionierung mit Ethylacetat und Wasser, gefolgt von einer Umkehrphasen- Chromatographie der wäßrigen Schicht unter Verwendung von Wasser-Methanol ergab die gewünschten Prodrugs nach Lyophilisierung oder Verdampfung des wäßrigen Mediums im Vakuum.
Eine detailliertere Beschreibung der Herstellung des 4'- Dinatriumphosphat-Derivats von Etoposid, das als eine Prodrug im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wurde, wird nunmehr gegeben:
Eine magnetisch gerührte Suspension von Etoposid (Bristol- Myers Co., 2,30 g, 3,91 mmol) in trockenem Acetonitril (210 ml) wurde bis zur fast vollständigen Lösung erwärmt und auf Zimmertemperatur abgekühlt und anschließend mit N,N- Diisopropylethylamin (2,36 ml, 13,5 mmol) behandelt. Das Gemisch wurde anschließend auf 0ºC abgekühlt und über eine Spritze 30 Sekunden mit Phosphorylchlorid, POCl&sub3; (666 mg, 4,34 mmol), behandelt. Das Gemisch ließ man langsam über einen Zeitraum von 2 bis 3 Stunden Zimmertemperatur erreichen und rührte 63 Stunden bei Zimmertemperatur. Am Ende dieser Phase wurde das Reaktionsgemisch mit einer Lösung aus Natriumbicarbonat (6,0 g, 71,4 mmol) in entionisiertem Wasser (110 ml) behandelt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 80 Minuten gerührt und anschließend mit wäßrigem, gesättigtem Natriumbicarbonat (20 ml), entionisiertem Wasser (125 ml) und Ethylacetat (350 ml) partitioniert. Die organische Phase wurde nochmals mit entionisiertem H&sub2;O (1 x 50 ml) extrahiert und die vereinigten wäßrigen Phasen wurden mit Ethylacetat (250 ml) gewaschen und anschließend einem 0,5 mm Vakuum bei Zimmertemperatur über einen Zeitraum von 1 Stunde unterzogen, um gelöstes Lösungsmittel zu entfernen. Der wäßrige Teil wurde auf eine Säule mit 4 cm Durchmesser aufgetragen, die 15 cm octadecylsilan (C-18), gebunden an Silikagel, enthielt und die in Methanol gepackt und mit H&sub2;O äquilibriert wurde. Danach wurde die wäßrige Phase aufgetragen, die Säule wurde mit H&sub2;O (175 ml) eluiert, um anorganische Salze zu entfernen. Anschließend wurde das Produkt mit 20 % Methanol in Wasser eluiert. Aufkonzentrieren des Lösungsmittels bei 66,66 Pa (0,5 Torr) ergab 744 mg (36 %) der reinen Etoposidphosphat- Verbindung in Form eines farblosen Feststoffes. Alternativ kann mit Hilfe der Lyophilisierung die reine Verbindung als sehr flockiger Feststoff geringer Dichte hergestellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wurde die erfindungsgemäße Etoposidphosphat-Prodrug wie folgt hergestellt:
Eine magnetisch gerührte Suspension von Etoposid (10,50 g, 17,84 mmol, getrocknet über P&sub2;O&sub5; bei 80ºC/66,66 Pa(0,5 torr) in trockenem Acetonitril (450 ml) wurde mit Diisopropylethylamin (4,20 ml, 24,1 mmol) behandelt. Diphenylchlorphosphat (2,00 ml, 9,65 mmol) wurde anschließend mit einer Spritze zugegeben. Das Gemisch wurde unter N&sub2; 2 Stunden bei 50ºC gerührt, wobei sämtliches Etoposid gelöst wurde. Zusätzliches Diphenylchlorphosphat (1,80 ml, 8,68 mmol) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 72 Stunden bei 45ºC gehalten. Nach weiterer Zugabe von Aminbase (0,75 ml) und Diphenylchlorphosphat (0,80 ml, 3,86 mmol) wurde das Gemisch 27 Stunden bei 40-45ºC gerührt, mit weiterem Diphenylchlorphosphat (0,40 ml) behandelt und 22 Stunden bei 40-45ºC gehalten. Isopropanol (20 ml) wurde anschließend zugesetzt, das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampt und der feste Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (500 ml) gelöst und mit H&sub2;O (400 ml) partitioniert. Die wäßrige Phase wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) weiter extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (250 ml) gewaschen und getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;/MgSO&sub4;). Eindampfen im Rotationsverdampfer und anschließende Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von 2-3 % CH&sub3;OH in CH&sub2;Cl&sub2; ergaben 12,50 g (85 %) Etoposid-4'-diphenylphosphat als farblosen Feststoff.
Als nächstes wurde Platinoxid (0,198 g, 0,87 mmol) aus einer frisch geöffneten Flasche (Aldrich Chemical Co.) zur Lösung von Etoposid-4'-diphenylphosphat (0,79 g, 0,962 mmol) in 95 ml absolutem Ethanol zugesetzt. Die Lösung wurde in einer Parr-Apparatur bei 310,3 - 344,8 kPa (45 - 50 PSI) 4 Stunden bei Zimmertemperatur hydrogeniert. Das Reaktionsgemisch wurde über ein Celit-Bett unter Verwendung von Ethanol als Elutionsmittel filtriert. Aufkonzentrieren im Vakuum und Trocknen über P&sub2;O&sub5; über einen Zeitraum von 14 Stunden im Vakuum führte zu Etoposid-4'-phosphat in Form eines weißen Feststoffes (0,627 g, 94 %):
FAB MS m/e 669 (M+H)&spplus;
IR (KBr) 3440, 2930, 1778, 1604, 1498 cm&supmin;¹.
¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 6,93 (s,1H), 6,46 (s,1H), 6,12 (s,2H), 5,94 (m,2H), 5,17 (bs,1H), 4,86 (d,J=3,93Hz,1H), 4,64 (q,J=7,5, 5,8Hz,1H), 4,51-4,42 (m,2H), 4,20 (d,J=10,7Hz,1H), 4,01 (dd,J=12,1, 5,3Hz,1H), 3,51 (s,6H), 3,51-2,75 (m,7H), 2,83 (m,1H), 1,16 (d,J=5,1Hz,3H).
¹³C NMR (DMSO-d&sub6;) δ 174,5, 151,2, 151,1, 147,7, 146,2, 126,1, 132,3, 128,8, 109,8, 109,7, 107,9, 101,5, 101,2, 98,5, 80,0, 74,3, 72,7, 71,7, 67,6, 67,2, 65,7, 55,8, 43,0, 37,1, 20,2, 18,5.
Analyse für C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub3;O&sub1;&sub6;P 0,85 % H&sub2;O:
C H
Berechnet: 50,95 5,11
Gefunden: 51,42 4,97.
Etoposid-4'-phosphat wurde anschließend in das entsprechende Dinatriumsalz umgesetzt, indem man entionisiertes H&sub2;O (50 ml) und festes Natriumbicarbonat (3,00 g, 35,7 mmol) zu 2,90 g (4,34 mmol) Etoposid-4'-phosphat-Produkt gab. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Während dieser Zeit klang die CO&sub2;-Bildung ab. Das Reaktionsgemisch wurde dann direkt auf eine C-18-Säule, wie in der vorhergehenden Ausführungsform beschrieben, aufgetragen. Die Säule wurde zunächst mit 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Salz zu entfernen und anschließend erfolgte eine Elution mit 4:1 H&sub2;O/CH&sub3;OH, wobei man 1,90 g (61 %) des reinen Etoposid-4'phosphat-Dinatriumsalzes nach Lyophilisieren in Form eines flockigen, weißen Feststoffs erhielt.
Das 4'-Dinatriumphosphat oder -thiophosphat-Derivat von Etoposid stellt eine stark wasserlösliche Prodrug von Etoposid mit verringerter zytotoxischer Aktivität dar. Durch die Reaktion dieser Verbindungen mit alkalischer Phosphatase wird jedoch der Phosphat- oder der Thiophosphat-Rest entfernt, und das wirksame Antikrebs-Medikament Etoposid (vgl. Figur 3) wird freigesetzt.
Ein Experiment, bei dem Etoposid-4'-phosphat und Etoposid- 4'-thiophosphat mit alkalischer Phosphatase umgesetzt wurden, zeigte, daß beide Prodrugs Substrate für das Enzym darstellen. Wie Figur 5 veranschaulicht, wird Etoposidphosphat durch das Enzym schneller hydrolysiert als die Etoposidthiophosphat- Prodrug. Jedoch kann Etoposidthiophosphat unter bestimmten Bedingungen aufgrund seiner erhöhten Hydrolysestabilität besonders brauchbar sein.

Umsetzung des Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugates mit einer Etoposidphosphat-Prodrug

Die erfindungsgemäßen Konjugate zeigten keinen merklichen Verlust an enzymatischer Aktivität, bedingt durch die Anlagerung des Enzyms an den Antikörper. Dies ergab sich aus der Tatsache, daß die Konjugate und das freie Enzym gleiche Aktivität in bezug auf die Substrate p-Nitrophenylphosphat [vgl. P. Tijssen, oben] oder Etoposidphosphat zeigten.
Beispielsweise wurde entweder AP alleine oder das gemäß obiger Beschreibung hergestellte Antikörper-Enzymkonjugat L6-AP (AP-Endkonzentration 5 ug/ml) einer Lösung von Etoposid-4'- phosphat (0,1 mM) in Trispuffer (100 mM), enthaltend MgCl&sub2; (1 mM) und ZnCl&sub2; (0,1 mM) bei pH 7,0, zugesetzt. Die Reaktion wurde mit Hilfe der HPLC unter Verwendung einer IBM C-18-Säule (3 u, 4,5 x 100 mm) und von 50%igem wäßrigem Methanol als Elutionsmittel (0,5 ml/min, aufgezeichnet bei 254 nm) überwacht. Es wurde festgestellt, daß innerhalb von 5 Minuten nach dem Start der Reaktion AP entweder in freier Form, oder als Teil des L6-Antikörper-Enzymkonjugates, eine wenigstens 85%ige Hydrolyse von Etoposid-4'-phosphat zu Etoposid bewirkte (vgl. Figuren 4C und 4D). Wie diese Figuren zeigen, erfolgt kein Verlust an AP-Enzymaktivität aufgrund der Bindung an den Antikörper im Konjugat. In Abwesenheit von Enzym war keine Phosphathydrolyse zu beobachten (vgl. Figur 4A). Wäßrige Lösungen von Etoposidphosphat und Etoposidthiophosphat waren wenigstens 8 Stunden bei Zimmertemperatur und mehrere Tage bei 4ºC stabil.

Bindung von Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugaten an H3347-Tumorzellen

Figur 6 zeigt die Ergebnisse eines Konjugat-Bindungstests, der durchgeführt wurde, um die Fähigkeit der Konjugate L6-AP und 96,5-AP sowie der freien Antikörper L6 und 96,5 zur Bindung an Tumorzellen aus der metastatischen menschlichen Colonkarzinomzellinie H3347 (bereitgestellt von Judy Anderson, Oncogen) zu bestimmen.
Der Bindungstest wurde wie folgt durchgeführt: Die Immunokonjugate oder die freien Antikörper wurden in inkompletten modifizierten Dulbecco-Medium (IMDM, Gibco) seriell verdünnt und 100 ul-Proben wurden bei 4ºC 30 Minuten mit 10&sup6; Zellen inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit 50 ul FITC-Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Tago, verdünnt 1:12,5) weitere 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und auf einem Coulter Epics-C-Fluoreszenz- Zellanalysator getestet. Tote Zellen wurden abgezogen und die mittlere logarithmische Intensität der grünen Fluoreszenz einer jeden Probe wurde ermittelt. Dieser Wert wurde auf einen linearen Maßstab übertragen und Verhältnisse zwischen negativer Kontrolle (Zellen + FITC-Ziege-Anti-Maus-Antikörper) und allen Testproben wurde berechnet.
Figur 6 zeigt, daß der größte Teil der Bindungsfähigkeit der Antikörper in den Konjugaten erhalten blieb, d.h., daß die Konjugation die Bindungsfähigkeit der Antikörper nicht beeinflußte. Darüber hinaus zeigt die Figur die Spezifität der Bindung von Antikörpern, d.h. daß sowohl der freie Antikörper 96.5 als auch das Konjugat 96.5-AP viel schwächer an die Tumorzellen banden, als die Antikörper L6 und das Konjugat L6- AP. Dieses Ergebnis kann erwartet werden, wenn man berücksichtigt, daß die Tumorzellen H3347 von einem Humankarzinom stammen und daß der Antikörper L6 spezifisch für ein Karzinomantigen ist, während der Antikörper 96.5 Spezifität für ein Melanomantigen besitzt.
Ähnliche Bindungsexperimente unter Verwendung von L6, L6- AP, 1F5 und 1F5-AP zeigten ebenfalls, daß L6 und L6-AP an die H3347-Karzinomzellinie (Sättigung bei 10 ug/ml Antikörper) banden, während nur eine geringe oder eine nicht nachweisbare Bindung für 1F5 oder 1F5-AP beobachtet wurde (vgl. Figur 7). Dieses Ergebnis veranschaulicht erneut die Bindungsspezifität der Konjugate, wobei das L6-AP-Konjugat an die L6-positive Tumorzellinie band, während das Konjugat 1F5-AP mit Spezifität für B-Lymphomzellen keine Bindung zeigte.

In Vitro-Zytotoxizität einer Konjugat/Prodrug-Kombination gemäß vorliegender Erfindung

Als nächstes wurde der zytotoxische Effekt der erfindungsgemäßen Konjugat/Prodrug-Kombinationen in vitro unter Verwendung eines klonogenen Zytotoxizitätstest oder eines ³H- Thymidin-Aufnahmetests gezeigt.
Als klonogener Zytotoxizitätstest wurde der von I. Hellstrom et al., "Colony Inhibition And Cytotoxicity Assays," in In Vitro Methods In Cell-Mediated Immunity, Bloom and Glade (ed.s), S. 409-14 (1971)) beschriebene Kolonie-Inhibitionstest verwendet. Die zum Nachweis der Zytotoxizität verwendeten Zellen waren die oben beschriebenen H3347 Tumorzellen. Die Konjugate L6-AP und 96.5-AP wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Prodrug in das freie Medikament zu überführen.
Die H3347 Zellen (10&sup6;/ml) wurden in IMDM-Wachstumsmedium (enthaltend 10 ug/ml jedes Immunokonjugates, basierend auf der Antikörperkonzentration) suspendiert und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, resuspendiert in IMDM und dann wurde das Medikament oder die Prodrug in Medium zugesetzt. Die Inkubation wurde 15 Minuten bei 37ºC fortgesetzt. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen ausplattiert und die Zahl der Kolonien (> 8 Zellen/Kolonie) wurde 7-10 Tage später bestimmt.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Figur 8 dargestellt (die prozentuale Inhibition stellt den Mittelwert von sechs Proben dar). Wie die Figur zeigt, besitzt Etoposid (IC&sub5;&sub0; = 0,20 uM) eine sehr viel größere Zytotoxizität als Etoposid-4'- phosphat (EP) (IC&sub5;&sub0; = 5,8 uM). Die Prodrug alleine zeigte nur eine sehr geringe zytotoxische Aktivität. Die Behandlung von H3347-Zellen mit dem L6-AP-Konjugat, gefolgt von einer Exposition mit Etoposidphosphat, führte zu einer sehr großen Zunahme der zytotoxischen Aktivität im Vergleich zu Prodrug alleine. Die erhöhte zytotoxische Aktivität war vergleichbar mit der zytotoxischen Aktivität, die man mit Etoposid alleine beobachtete. Die Behandlung von Zellen mit dem 96.5-AP-Konjugat und Etoposid-Phosphat zeigte eine sehr viel geringere Zunahme der zytotoxischen Aktivität im Vergleich zur Prodrug alleine. Dieses Ergebnis ist der geringen Menge an 96.5-AP-Konjugat zuzuschreiben, die an die H3347-Zellen, wie oben diskutiert, bindet (vgl. Figur 6). Die Konjugate selbst sind nicht zytotoxisch, da eine Behandlung der Zellen mit dem Konjugat alleine zu keinem Zelltod führt.
Der zytotoxische Effekt der erfindungsgemäßen Konjugate wurde außerdem unter Verwendung eines ³H-Thymidin-Aufnahmetests untersucht. Bei diesem Test wird eine Suspension von 10&sup6; H3347- Tumorzellen in 0,1 ml IMDM mit 10 % fötalem Kälberserum 1 Stunde bei 4ºC in Gegenwart von 5 ug/ml Konjugat inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit dem Medium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, gewaschen, resuspendiert (in 1 ml) und auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (10 000 Zellen/Vertiefung) ausplattiert. Wirkstoff oder Prodrug in IMDM wurden anschließend zugesetzt und die Inkubation wurde weitere 6 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und die Inkubation wurde weitere 12 Stunden fortgesetzt, und anschließend erfolgte ein 6 Stunden-Puls mit ³H-Thymidin (1,0 uCi/Vertiefung). Die Platten wurden bei -20ºC eingefroren, um die Zellen abzulösen. Die Zellen wurden auf Glasfaserscheiben geerntet. Die Filter wurden mit einem Beckman 3801 Szintillationszähler gezählt.
Unter Verwendung dieses Tests wurde die Inhibition der ³H- Thymidin-Inkorporation in die DNA der Tumorzellen und somit der zytotoxische Effekt von Etoposid oder von der Prodrug EP auf die Zellen in Gegenwart der Abwesenheit von L6-AP oder 1F5-AP- Konjugat gemessen. Wie in Figur 9 gezeigt, war Etoposid (IC&sub5;&sub0; = 1 uM) mehr als 100-fach stärker zytotoxisch als EP (35%ige Inhibition bei 100 ul). Eine Vorbehandlung der Zellen mit 1 F5- AP vor der EP-Exposition führte zu keiner Steigerung der Zytotoxizität. Es war jedoch eine dramatische Zunahme der zytotoxischen Aktivität zu beobachten, wenn die Zellen zunächst mit L6-AP und dann mit EP behandelt wurden. In beiden verwendeten Tests zur Bestimmung der in vitro-Zytotoxizität war der zytotoxische Effekt der erfindungsgemäßen Konjugat/Prodrug- Kombination vergleichbar mit derjenigen von Etoposid alleine. Dieser Effekt war Antigen-spezifisch, was durch die Tatsache belegt wird, daß die EP-Zytotoxizität nicht in gleichem Maße verstärkt wurde durch die Behandlung der H3347-Zellen mit den Kontroll-Konjugaten 96.5-AP bzw. 1F5-AP.

Lokalisation der Konjugate in Tumor-Xenotransplataten in Mäusen

In vivo-Lokalisierungsuntersuchungen wurden als nächstes vorgenommen, um herauszufinden, wie schnell und in welchem Umfang die Konjugate gemäß vorliegender Erfindung in einem Tumor akkumuliert werden. Diese Information würde für die Bestimmung eines geeigneten Zeitintervalls zwischen der Verabreichung des Antikörper-Enzymkonjugates und der Prodrug in den Tumortherapie-Studien nützlich sein.
Zunächst wurden weibliche Balb/C nu/nu-Mäuse (4-6 Wochen alt) (bezogen von Life Sciences, St. Petersburg, Florida) 10&sup7;- H3347-Tumorzellen subkutan (s.c.) in die linke und rechte Hinterflanke injiziert. Die Tumorzellen erhielt man aus in vitro-Kulturen, die durch 2-minütige Behandlung mit Trypsin (0,5 g/l) und EDTA (0,2 g/l) suspendiert worden waren. Die Zellen wurden zweimal mit IMDM gewaschen und 1 Stunde bei 37ºC in IMDM mit 10 % fötalem Kälberserum inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, suspendiert in PBS und vor der Injektion bei 4ºC aufbewahrt. Sowohl die Lokalisierungs- als auch die Therapie-Studien, die im folgenden beschrieben werden, wurden begonnen, sobald die Tumoren eine durchschnittliche Größe von 225 mm³ erreicht hatten.
Für die vorliegenden Lokalisierungsstudien wurden L6 und L6-AP mit ¹²&sup5;I und 1F5 und 1F5-AP mit ¹³¹I unter Verwendung der Jodogen-Methode [vgl. P.J. Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80, S. 849-857 (1978)] markiert. Zwei Tage vor den Lokalisierungsexperimenten wurden die Tiere auf 0,5 %ige (v/v) Lugol-Jodlösung eingestellt. Jeder Maus wurde i.p. 100 ug (basierend auf jedem monoklonalen Antikörper) eine der folgenden Lösungen injiziert: L6-AP (5 uCi) und 1F5-AP (2,5 uCi) in 0,2 ml PBS bei pH 7,2 oder eine Kombination von L6 (5 uCi) und 1F5 (2,5 uCi) in 0,2 ml PBS. In periodischen Intervallen wurden die Mäuse anästhetisiert, über den Plexus orbitalis ausgeblutet und anschließend getötet. Gewebe wurde gewogen und anschließend in einem Gammazähler ausgezählt. Die Lokalisierung wurde bestimmt durch Vergleich der Lokalisierung von ¹²&sup5;I-L6 mit der von ¹³¹I-1F5, d.h. über die Bestimmung des Verhältnisses von spezifischer (¹²&sup5;I) zu nicht-spezifischer (¹³¹I) Aufnahme von Counts durch die verschiedenen Gewebe. Die Ergebnisse für Tumor- und Leber-Aufnahme sind in folgender Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 PROZENT DER INJIZIERTEN DOSIS DES VERABREICHTEN PROTEINS PRO GRAMM GEWEBEGEWICHT Tumor Leber Stunden
Die Zahlen in Klammern stellen das Verhältnis von L6/1F5 oder L5-AP/1F5-AP dar.
Wie die Tabelle zeigt, wird unkonjugierter L6 in wirksamer Weise innerhalb von 24 Stunden am Tumor lokalisiert und verbleibt dort wenigstens 48 Stunden. Während dieses Zeitraums reicht das Verhältnis von L6 zu 1F5 im Tumor von 8-12, während das Verhältnis in der Leber ziemlich niedrig (1,3-1,4) ist. Der maximale Grad für die spezifische Aufnahme im Tumor ist für L6- AP etwa nach 24 Stunden zu beobachten, wobei das Verhältnis L6- AP zu 1F5-AP 10,0 betrug. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das L6-AP-Konjugat im Tumor weitaus besser lokalisiert wird als 1F5-AP, jedoch nicht so gut wie nicht modifizierter L6.
Als nächstes wurde die Menge an natürlicher Phosphatase- Aktivität im Tumor bestimmt, sowie der Grad, bis zu welchem diese Aktivität durch Lenkung von AP zum Tumor unter Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate erhöht werden konnte. Die Tumoren wurden Mäusen entnommen, die 24 Stunden mit 100 ug (basierend auf L6) L6-AP behandelt wurden. Die Gesamtphosphatase-Aktivität wurde unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat wie folgt bestimmt: Der herausgeschnittene Tumor wurde gewaschen und vorsichtig bei 23ºC in p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml) in Tris (100 mM, pH 9,5), enthaltend NaCl (100 mM) und MgCl&sub2; (5 mM), geschüttelt. Der Reaktionsverlauf wurde aufgezeichnet durch Messung der p-Nitrophenolfreisetzung bei 410 nm und die Ergebnisse wurden auf das Tumorgewicht abgeglichen. Es wurde festgestellt, daß Tumoren aus Mäusen, die L6-AP-Konjugat erhalten hatten, einen 10-fach höheren Phosphatase-Aktivitätswert zeigten als Tumoren von unbehandelten Mäusen (vgl. Figur 10A).
Eine detailliertere histologische Analyse der Phosphataseaktivität in den Tumoren wurde auf Tumorschnitten vorgenommen, welche man aus Mäusen erhielt, die unbehandelt waren oder 24 Stunden vorher mit 300 ug (basierend auf Antikörper) L6-AP oder 1F5-AP vorbehandelt wurden. Die Phosphataseaktivität wurde immunohistologisch abgeschätzt, indem man ein Phosphatasesubstrat verwendete, das einen dunklen Niederschlag am Ort der Enzymaktivität abschied: Hierzu wurden herausgeschnittene Tumoren schnell bei -28ºC eingefroren und sequentielle 8 um Schnitte wurden unter Verwendung eines Reichert-Jung-Mikrotoms angefertigt. Die Phosphataseaktivität wurde mit einem AP-Substrat-Kit von Vektor Laboratories (Burlingame, CA) gemessen und die Ergebnisse wurden mit Schnitten verglichen, die mit Hämatoxylin und Eosin (H. und E., vgl. Figur 10B) gefärbt wurden.
Wie Figur 10B zeigt, konnte nur wenig Aktivität in Tumoren aus Mäusen entdeckt werden, die unbehandelt waren oder mit 1F5- AP behandelt worden waren. Mäuse, die jedoch L6-AP erhielten, zeigten eine stark erhöhte und über den Tumor verteilte Phosphataseaktivität. Eine mikroskopische Bewertung ergab, daß die meisten Tumorzellen in L6-AP-behandelten Mäusen eine stark positive Färbung durch Phosphataseaktivität zeigten.

In Vivo-Antitumoreffekt einer Konjugat/Etoposidphosphat- Prodrugkombination gemäß vorliegender Erfindung

Therapieexperimente wurden mit nackten Mäusen durchgeführt, die s.c. Tumoren mit einem Volumen von etwa 225 mm³ aufwiesen. Die Konjugate L6-AP und 1F5-AP wurden 18-24 Stunden vor der Behandlung mit EP verabreicht (i.p.). Das Tumorwachstum wurde verglichen mit dem in unbehandelten Mäusen und in Mäusen, welche behandelt wurden mit der maximal tolerierten Dosis von Etoposid oder EP alleine.
Insbesondere wurde eine Gruppe von 8 nackten Mäusen mit bilateralen H3347-Tumoren entweder mit Etoposid (0,2 ml, enthaltend 1,2 mg Etoposid in 2:3 DMSO:H&sub2;O) oder EP (0,2 ml, enthaltend 2 mg EP in H&sub2;O) behandelt oder mit L6-AP (0,1 ml, enthaltend 300 ug Antikörper in PBS) oder 1F5-AP (0,1 ml, enthaltend 300 ug Antikörper in PBS), gefolgt von einer EP- Behandlung. Jedes Experiment umfaßte eine Kontrollgruppe von unbehandelten Mausen. Die Tumorvolumina wurden an verschiedenen Tagen nach Tumorimplantation mit Hilfe folgender Formel abgeschätzt:
[(senkrechte Breite 2/2)) x größte Länge
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Figur 11 gezeigt. Etoposid zeigte einen sehr geringen Effekt auf das Tumorwachstum bei der verwendeten Dosis und höhere Dosen wurden nicht gut vertragen. Die Prodrug EP war weniger toxisch für die Tiere und die höhere Dosis, die deshalb verabreicht werden konnte, führte zu einem größeren Antitumoreffekt im Vergleich zu Etoposid selbst. Ein ähnlicher Grad an Antitumoraktivität konnte in Mäusen beobachtet werden, die das Kontrollkonjugat 1F5-AP vor der Behandlung mit EP erhielten. Jedoch konnte bei Behandlung der Mäuse mit L6-AP, gefolgt von EP, ein sehr viel stärker ausgeprägter Antitumoreffekt beobachtet werden. L6-AP zeigte keinen Einfluß auf das Tumorwachstum (Daten nicht gezeigt).
Eine Zusammenfassung dieser Reaktionen jedes einzelnen Tumors auf die Therapie wird in folgender Tabelle 2 gezeigt. Von 16 Tumoren in 8 Mäusen, die mit L6-AP und EP behandelt wurden, zeigten 6 Tumoren eine vollständige Regression und 2 weitere waren kleiner als bei Beginn der Behandlung. Keine vollständige oder eine teilweise Reaktion konnte bei den anderen Behandlungsprotokollen beobachtet werden. Tabelle 2 EINFLUSS VERSCHIEDENER BEHANDLUNGEN AUF DAS TUMORWACHSTUM REAKTION * Agens Progression Stabil Partiell Vollständig Keines Etoposid
Die Daten zeigen die Reaktion von 16 Tumoren in jeder Gruppe 23 Tage nach Tumorimplantation.
*Reaktion: Progression - fortgesetztes Tumorwachstum; Stabil - kein zusätzliches Tumorwachstum; Partiell - Abnahme der Größe; Vollständig - Regression, die zu keinem apparenten Tumor führt.
Das vorliegende Beispiel veranschaulicht eindeutig die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Abgabe eines zytotoxischen Antitumor-Medikaments an Tumorzellen unter Verwendung von Tumor-spezifischen Antikörper-Enzymkonjugaten und einer Prodrug, die durch das Enzym von einer relativ wenig zytotoxischen in eine stark zytotoxische Form umgewandelt werden kann.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von Immunokonjugaten und Verfahren gemäß vorliegender Erf indung zur Umwandlung einer relativ unzytotoxischen Mitomycinphosphat- Prodrug in ein aktives Mitomycin-Medikament, das zu in vitro- Zytotoxizität gegen Tumorzellen führt. Wie bereits in obigem Beispiel 1 gezeigt wurde, veranschaulicht das folgende Beispiel die Anwendbarkeit von Immunokonjugaten, Prodrugs und Methoden gemäß vorliegender Erfindung für die in vivo Abgabe eines zytotoxischen Antitumor-Medikaments an Tumorzellen.
Bei diesem Beispiel werden die in obigen Beispiel 1 hergestellten und beschriebenen Immunokonjugate L6-AP und 1F5- 5AP verwendet. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird jedes dieser Antikörper-Enzymkonjugate mit einer neuen Mitomycinphosphat-Prodrug umgesetzt. Insbesondere wird als Prodrug das Dinatriumsalz eines N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8; Alkyl-Phosphats von Mitomycin C verwendet. Das infolge dieser Reaktion freigesetzte Antitumor-Agens ist ein Mitomycinalkohol-Derivat. Die L6- AP/Mitomycinphosphat-Prodrugkombination gemäß folgender Erfindung führte zu einer Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen in vitro und zu einem ausgeprägten in vivo-Antitumoreffekt in Mäusen.

Herstellung einer neuen Mitomycinphosphat-Prodrug

Die neue Mitomycinphosphat-Prodrug 7-(2'- Aminoethylphosphat)mitomycin (im folgenden bezeichnet als "MOP") ist das 2-Aminoethylphosphatderivat von Mitomycin C ("MMC") und wurde wie folgt hergestellt:
Eine Lösung von 2-Aminoethyldihydrogenphosphat (56 mg, 0,4 mmol) in Wasser (0,35 ml) und Triethylamin (0,3 ml, 2mmol) wurde zu Mitomycin A (im folgenden bezeichnet als "MMA") (140 mg, 0,4 mmol) in Methanol (6 ml) gegeben und die Reaktion ließ man über Nacht bei Zimmertemperatur fortschreiten. 1,4 ml gesättigtes wäßriges Natriumbicarbonat wurden anschließend zugesetzt und die Lösung wurde zwischen Wasser und Methylenchlorid partitioniert. Die wäßrige Phase wurde zur Trockene aufkonzentriert und mehrere Portionen Methanol wurden zugesetzt und eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen, filtriert und auf eine 2 x 10 cm C-18 (Reversed Phase) Kieselgelsäule aufgetragen. Das Produkt wurde mit Wasser eluiert und das gesamte flüchtige Material wurde abgedampft. Methanol wurde zugesetzt und wie oben abgedampft und der Rückstand wurde 24 Stunden im Hochvakuum in einem Exsikkator mit Phosphorpentoxid getrocknet. Das Mitomycinphosphat-Derivat MOP erhielt man in Form eines feinen blauen Pulvers (190 mg, 97 %).
360 MHz ¹H-NMR (D&sub2;O) δ 1,94 (s, 3H, CH&sub3;), 2,9-3,1 (m, 4H), 3,20 (s, OCH&sub3;), 3,28 (s, 1H), 3,36 (s, 1H), 3,5-3,65 (m, 4H), 4,1-4,25 (m, 2H), 4,50-4,57 (dd, 1H, 10-H).
MOP wurde somit dadurch hergestellt, daß man die 7- Methoxy-Gruppe von MMA durch 2-Aminoethylphosphorsäure ersetzte (vgl. Figur 12). Das Produkt wurde durch Behandlung mit Natriumbicarbonat in das wasserlösliche Dinatriumsalz umgewandelt.
Das entsprechende bekannte Mitomycinalkohol-Derivat 7-[(2- Hydroxyethyl)amino]-9a-methoxymitosan (im folgenden bezeichnet als "MOH") wurde hergestellt durch Umsetzung von MMA (100 mg, 0,286 mmol) mit Ethanolamin (26 mg, 0,429 mmol) unter Anwendung des Verfahrens von B.S. Iyengar et al., "Mitomycin C and Porfiromycin Analogues With Substituted Ethylamines At Position 7", J. Med. Chem., 26, S. 16-20 (1983). Das Produkt wurde in Form eines feinen blauen Pulvers erhalten (58 mg, 54 %).

Reaktivität und Stabilität der Mitomycinphosphat-Prodrug

Die MOP-Prodrug wurde anschließend auf ihre Reaktivität mit AP getestet. Zu einer Lösung von MOP (1 mM) in 100 mM Trispuffer, pH 7,2, wurde bei Zimmertemperatur entweder Kalbsintestinum- oder Humanplacenta-AP (Endkonzentration 1 ug/ml) gegeben. Der Reaktionsverlauf wurde durch HPLC unter Verwendung einer C-18 Säule (4,6 x 150 mm) bei folgenden Bedingungen überwacht: Detektion bei 280 nm; 30-95 % Methanol in Acetatpuffer (100 mM, pH 5,2) über 8 Minuten, Reäquilibrierung nach 15 Minuten; 0,8 ml/min Flußgeschwindikeit. Unter diesen Bedingungen eluierte MMC nach 7,0 Minuten, MOH eluierte nach 8,5 Minuten und MOP eluierte nach 4,0 Minuten. Wie in Figur 13 gezeigt, wurde die Phosphatgruppe auf der MOP-Prodrug mit AP schnell gespaltet. Die HPLC diente zur Bestätigung, daß der entsprechende Alkohol MOH gebildet wurde. Unter den verwendeten Reaktionsbedingungen betrug die Halbwertszeit für die Hydrolyse von MOP etwa 10 Minuten und die Reaktion war innerhalb von 40 Minuten beendet.
Die Stabilität von MOP und EP in Humanserum wurde unter Verwendung der HPLC durch Messung der Geschwindigkeit für das Verschwinden der Prodrug und der Geschwindigkeit für die Bildung von MOH und Etoposid bestimmt. Beispielsweise wurde eine Lösung von MOP (1 mM in 100 mM Tris, pH 7,2) zu frischem Humanserum gegeben, so daß die Endkonzentration des Medikaments 0,1 mM betrug. Teile (0,25 ml) davon wurden mit Methanol (0,25 ml) und EDTA (50 ul, 100 mM) verdünnt, um Serumproteine auszufällen und um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden zentrifugiert und wie oben beschrieben durch HPLC analysiert. Es wurde festgestellt, daß eine 50%ige Hydrolyse von EP nach einer Stunde erfolgte und daß nur 25 % MOP nach 4 Stunden hydrolysiert war. Eine vollständige Hydrolyse konnte durch Zugabe von AP zum Serum schnell erreicht werden.

Bindung des Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugates an H2981-Tumorzellen

Die Befähigung der erfindungsgemäßen Antikörper- Enzymkonjugate L6-AP und 1F5-AP zur Bindung an H2981- Tumorzellen wurde anschließend bestimmt. Die Zellinie H2981 wurde etabliert aus einem primären menschlichen Lungenadenokarzinom (vgl. 1. Hellstrom et al., "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinomas", Cancer Res., 46 (Nr. 8), S. 3917-23 (1986)). Es ist bekannt, daß der Antikörper L6 stark an H2981-Zellen bindet (Sättigung bei 10 ug/ml), während 1F5 nur eine sehr geringe Bindung an diese Zellen zeigt.
Der Bindungstest wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Eine FACS-Analyse zeigte, daß L6 und L6-AP stark an die Zellen banden, während eine sehr viel schwächere Bindung für 1F5 und 1F5-AP gezeigt werden konnte (vgl. Figur 14).

In Vitro-Zytotoxizität der erfindungsgemäßen Konjugat/Prodrugkombination gegenüber H2981 Tumorzellen

Der zytotoxische Effekt der erfindungsgemäßen Konjugat/Prodrug-Kombinationen wurde in vitro über den ³H- Thymidin-Aufnahmetest, der in Beispiel 1 beschrieben wurde, gezeigt. In diesem Fall wurden H2981 Tumorzellen zur Bestimmung der in vitro-Zytotoxizität und als Kontrollen CEM-Zellen verwendet. Die T-Zellen-ALL-Zellinie CEM wurde von der ATCC bezogen und bindet nicht an die monoklonalen Antikörper L6 und 1F5. Der zytotoxische Effekt der Prodrugs EP und MOP auf die Tumorzellen in Abwesenheit oder Anwesenheit der Immunokonjugate L6-AP oder 1F5-AP wurde analysiert. Der zytotoxische Effekt dieser Kombinationen wurde außerdem mit dem zytotoxischen Effekt jedes Ausgangswirkstoffs allein verglichen. Eine Suspension von 10&sup6; H2981- oder CEM-Zellen in 0,1 ml IMDM, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, wurde 1 Stunde bei 4ºC in Gegenwart von 10 ug/ml Konjugat inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit dem Medium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, gewaschen, resuspendiert in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, ph 7,2 (PBS) und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (10 000 Zellen/Vertiefung) ausplattiert. Die Prodrug in PBS wurde anschließend zugegeben und es wurde anschließend bei 37ºC eine Stunde (für MOP) oder 5 Stunden (für EP) inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal gewaschen und die Inkubation wurde insgesamt 24 Stunden (einschließlich einer 6-stündigen Pulsphase mit ³H-Thymidin, 1,0 uCi/Vertiefung) fortgesetzt. Die Platten wurden dann bei -70ºC eingefroren, um die Zellen abzulösen und nach dem Auftauen wurden die Zellen auf Glasfaserscheiben geerntet. Die Filter wurden in einem Beckman 3801-Szintillationszähler gezählt und der zytotoxische Effekt der Konjugat/Prodrug- Kombinationen wurde mit der Zytotoxizität verglichen, die man bei Behandlung der Zellen mit der Prodrug oder dem Ausgangswirkstoff alleine beobachtete. Die Ergebnisse sind in den Figuren 15-17 dargestellt.
Wie Figur 15 zeigt, besaß Etoposid (IC&sub5;&sub0; = 2 uM) eine signifikant höhere Toxizität für H2981 Zellen als EP (20 % Abtötung bei 30 uM). Eine Vorbehandlung der Zellen mit 1F5-AP vor der Prodrug-Exposition führte zu einer sehr signifikanten Zunahme der Zytotoxizität. Eine dramatische Zunahme der zytotoxischen Aktivität wurde jedoch beobachtet, wenn die Zellen zunächst mit L6-AP und anschließend mit EP exponiert wurden. Der zytotoxische Effekt war vergleichbar mit dem von Etoposid alleine.
Ein ähnliches Ergebnis wurde beobachtet bei Verwendung der Mitomycin-Derivate. Wie in Figur 16 veranschaulicht, besaßen MMC und MOH gleiche Zytotoxizität gegenüber H2981 Zellen und IC&sub5;&sub0; Werte von etwa 1 uM auf. Die Phosphat-Prodrug MOP war sehr viel weniger zytotoxisch (5 % Zelltod bei 10 uM), möglicherweise aufgrund der Unfähigkeit in die Zelle zu penetrieren. Die Aktivität von MOP war jedoch vergleichbar mit MOH und MMC, wenn die Tumorzellen mit dem erf indungsgemäßen Konjugat L6-AP präexponiert wurden. Diese Steigerung war antigenspezifisch, da das nicht-bindende Konjugat 1F5-AP die zytotoxische Aktivität der Prodrug nicht signifikant beeinflußte. Weder L6-AP noch 1F5-AP führte zu einer drastischen Erhöhung des zytotoxischen Effekts von MOP auf CEM- Zellen. Dies ist konsistent mit der Tatsache, daß das Konjugat nicht an diese Zellinie bindet (vgl. Figur 17). Diese Ergebnisse zeigen somit, daß die Phosphat-Gruppe einer jeden getesteten Prodrug das Medikament inaktiviert und daß bei Hydrolyse der Phosphatgruppe durch ein Antikörper-Enzymkonjugat, das an die Zelloberf läche gebunden ist, jede der Prodrugs EP und MOP das aktive, zytotoxische Medikament ergibt.

In Vivo-Antitumoreffekt der erfindungsgemäßen Konjugat/Mitomycin-Prodrug-Kombination

Vor der Untersuchung des in vivo-Antitumoreffekts von MOP in Kombination mit dem L6-AP-Konjugat gemäß vorliegender Erfindung wurden die relativen Zytotoxizitätswerte der Prodrug und des freigesetzten aktiven Derivates davon, nämlich MOH, in Balb C nu/nu-Mäusen bestimmt. Wurden die Medikamente in zwei gleichen Dosen im Abstand von 4 Tagen verabreicht (i.p.), so betrugen die LD&sub5;&sub0;-Werte für MOH und MOP 45 bzw. 90 mg Medikament/kg Körpergewicht. Es wurde außerdem festgestellt, daß wesentlich mehr Medikament verabreicht werden konnte, wenn kleinere Dosen über einen längeren Zeitraum verwendet wurden. Gesamtmengen von bis zu 40 mg/kg MOH und 100 mg/kg MOP wurden gut vertragen bei Verabreichung in 4 gleichen Dosen über einen Zeitraum von 25 Tagen. Diese Untersuchungen wiesen darauf hin, daß signifikant mehr Mitomycin-Prodrug aufgrund der reduzierten Zytotoxizität vertragen wurde.
Therapiestudien wurden anschließend mit weiblichen Balb C nu/nu Mäusen (6 Mäuse je Behandlungsgruppe) (4-6 Wochen alt), bezogen von Life Sciences (St. Petersburg, Fla.), durchgeführt, denen ein H2981-Tumor aus einer in vivo-Quelle implantiert worden war (s.c., rechte Hinterflanke). Die Experimente wurden durchgeführt, nachdem die Tumoren ein Volumen von etwa 100 mm³ erreicht hatten. Die Konjugate L6-AP und 1F5-AP (0,1 ml, enthaltend 250 ug Antikörper in PBS) wurden jeweils 18-24 Stunden vor der Behandlung mit MOP (0,2 ml, enthaltend 0,6 mg MOP in H&sub2;O) verabreicht (i.e.). Das Tumorwachstum wurde verglichen mit dem in unbehandelten Mäusen und in Mäusen, die mit der tolerierten Maximaldosis von MOP (0,2 ml, enthaltend 0,6 mg MOP in H&sub2;O) oder MOH (0,2 ml, enthaltend 0,2 mg MOH in H&sub2;O) alleine behandelt wurden.
Wie in Figur 18 gezeigt, wiesen MOH und MOP eine in vivo- Antitumoraktivität auf. Die zur Erreichung eines mittleren Tumorvolumens von 750 mm³ erforderliche Zeit betrug 45 Tage in Mäusen, die mit MOH behandelt wurden, 63 Tage in Mäusen, die mit der MOP-Prodrug behandelt wurden und 27 Tage in der Kontrollgruppe. Wie oben diskutiert, war die MOP-Prodrug weniger zytotoxisch für die Tiere und deshalb führte die höhere Dosierung, die verabreicht werden konnte, zu einem größeren Antitumoreffekt im Vergleich zum MOH-Derivat. Obwohl das nichtbindende Konjugat 1F5-AP die Aktivität von MOP etwas erhöhte, war ein sehr viel stärker ausgeprägter Effekt in der Gruppe zu beobachten, die L6-AP vor der MOP-Behandlung erhielt. Wie die Figur zeigt, wiesen Tumoren, die mit L6-AP-Konjugat behandelt wurden (gefolgt von einer MOP-Behandlung) am Tag 70 etwa ein Drittel der Größe von Tumoren auf, die mit 1F5-AP-Konjugat vorbehandelt wurden. Wie außerdem folgende Tabelle 3 zeigt, war am Tag 63 nach Implantation eine vollständige Regression bei 3 von 6 Tumoren in den L6-AP + MOP-behandelten Mäusen zu beobachten und die verbleibenden 3 Tumoren zeigten keine Größenzunahme seit Beginn der Behandlung. Demgegenüber zeigten 3 von 5 Tumoren in der 1F5-AP + MOP-behandelten Gruppe eine Größenzunahme, 2 von 5 der Tumoren waren stabil und keine partielle oder vollständige Regression war zu beobachten. Tabelle 3 TUMORREAKTION (AM TAG 63) AUF DIE BEHANDLUNG MIT ANTIKÖRPER-AP-KONJUGATEN UND MITOMYCINDERIVATEN TUMORREAKTIONEN GRUPPE PROGRESSION STABIL TEILWEISE REGRESSION VOLLSTÄNDIGE REGRESSION Kontrolle
Diese Experimente veranschaulichen deutlich die Spezifität und den erhöhten Antitumoreffekt der gelenkten Enzym/MOP- Kombination gemäß vorliegender Erfindung in vivo.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Immunokonjugate, Prodrugs und Methoden zur Übertragung einer Reihe verschiedener Medikamente auf Tumorzellen. Unter Verwendung des Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugates L6-AP in Kombination mit den Prodrugs EP und MOP wurde eine verstärkte Antitumoraktivität in vivo gezeigt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit die Verwendung eines einzelnen Antikörper-gelenkten Enzyms mit einem Satz Prodrugs zur Kombinationstherapie von Tumoren.
Die Prodrugs EP und MOP wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben hergestellt. Die Herstellung der Immunokonjugate L6-AP und 1F5-AP erfolgte gemäß Beispiel 1. Die in vivo-Studien an nackten Mäusen wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben durchgeführt. Nackte Mäuse, denen ein H2981-Tumor implantiert worden war, wurden mit L6-AP- oder 1F5-AP-Konjugat 18-24 Stunden vor der Behandlung mit einer Kombination von MOP/EP (0,2 ml, enthaltend 1 mg EP und 0,3 mg MOP in H&sub2;O) präexponiert. Das Tumorwachstum wurde verglichen mit dem in unbehandelten Mäusen und in Mäusen, die nur mit der MOP/EP- Kombination behandelt wurden.
Wie in Figur 19 gezeigt, war die Antitumoraktivität der MOP/EP-Kombination alleine und der MOP/EP-Kombination plus 1F5- AP-Behandlung annähernd gleich stark. Wie folgende Tabelle 4 zeigt, war bei allen Tumoren dieser beiden Gruppen wie bei den Tumoren der unbehandelten Kontrollmäuse eine Größenzunahme zu beobachten. Die Vorbehandlung der tumortragenden Mäuse mit dem Konjugat L6-AP gefolgt von einer MOP/EP-Rombination führte jedoch zu einer ausgeprägten Antitumor-Antwort. Wie Figur 19 zeigt, besaßen am Tag 70 Tumoren, die mit L6-AP vorbehandelt wurden (gefolgt von einer kombinierten MOP/EP-Behandlung) etwa ein Drittel der Größe von Tumoren, die mit dem Konjugat 1F5-AP behandelt wurden. Darüber hinaus zeigt Tabelle 4, daß sich am Tag 63 nach Implantation einer von sechs Tumoren in der mit L6- AP vorbehandelten Gruppe von Mäusen vollständig zurückgebildet hatte, daß drei von sechs Tumoren das Wachstum eingestellt hatten und daß nur zwei von sechs Tumoren im Wachstum fortschritten Tabelle 4 REAKTION VON TUMOREN (AM Tag 63) AUF DIE BEHANDLUNG MIT ANTIKÖRPER-AP-KONJUGATEN UND DER MITOMYCIN/ETOPOSID-KOMBINATION GRUPPE PROGRESSION STABIL TEILWEISE REGRESSION VOLLSTÄNDIGE REGRESSION Kontrolle
Diese in vivo-Untersuchungen zeigen somit die Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Konjugate, Prodrugs und Methoden für die Kombinationstherapie von Tumoren.
Die erfindungsgemäßen Konjugate, wie L6-AP, können auch mit anderen Kombinationen von Prodrugs, wie EP, Adriamycin-14phosphat und 5-Fluoruridinmonophosphat angewendet werden, um eine Reihe verschiedener zytotoxischer Medikamente auf Tumorzellen zu übertragen.
Die Herstellung des Antikörperenzymkonjugates L6-AP und der Prodrug Etoposid-4'-phosphat sind in Beispiel 1 beschrieben. Adriamycin-14-phosphat wird hergestellt wie beschrieben im US-Patent 4 185 111, erteilt für J.B. Ducep am 22. Januar 1980. 5-Fluoruridinmonophosphat wird hergestellt wie beschrieben in M. J. Robins et al., Can. J. Chem., 53. S. 1302- 1306 (1975).
Die Reaktion von L6-AP mit den drei oben erwähnten Prodrugs wird wie folgt durchgeführt: entweder AP alleine oder das Konjugat L6-AP (AP-Endkonzentration 5 ug/ml) wird zugegeben zu Lösungen von Etoposid-4'-phosphat oder Adriamycin-14- phosphat (0,1 mM) in Tris-Puffer (100 mM), enthaltend MgCl&sub2; (1 mM) und ZnCl&sub2; (0,1 mM) bei pH 7,0. Die 5-Fluoruridin-Prodrug erfordert als Reaktionsbedingung eine Lösung von 5-Fluoruridin (3 uM) in Phosphatpuffer (100 mM) bei pH 8,0. Die Reaktion von L6-AP mit der Etoposidphosphat- oder der 5-Fluoruridin-Prodrug wird wie in Beispiel 1 beschrieben überwacht. Die Reaktion von L6-AP mit Adriamycin-14-phosphat wird durch HPLC überwacht unter Verwendung einer IBM C-18 Säule (3 u, 4,5 x 100 mm) und 65 % Methanol in Wasser, enthaltend 3 % Ammoniumacetat als Elutionsmittel (0,5 ml/min, Aufzeichnung bei 495 nm).
Die Reaktion des Antikörper-AP-Konjugats mit jeder Prodrug führt zur hydrolytischen Entfernung der Phosphatreste und zur Freisetzung des freien Medikaments [vgl. z.B. RF. B. McComb et al., Alkaline Phosphatase, Plenum Press (New York 1979)].
Die Zytotoxizität auf Tumorzellen für jede der drei Prodrugs in Gegenwart des L6-AP-Konjugats gemäß vorliegender Erfindung kann unter Verwendung des in obigem Beispiel 1 beschriebenen Kolonie-Inhibitionstests gezeigt werden. Nach Entfernung des Phosphatrestes von jeder der Prodrug mit Hilfe des Konjugates werden Etoposid, Adriamycin und 5-Fluoruridin freigesetzt. Jedes dieser Medikamente ist ein wirksames Antitumormittel [vgl. z.B. P.J. O'Dwyer et al., "Etoposide: Current Status Of An Active Anticancer Drug", New England Journal Of Medicine, 312, S. 692-700 (1985); M.J. Embleton et al., "Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, R.W. Baldwin und V. S. Byers (Hrsg), S. 321-22 (Academic Press 1985); United States Patent 4 185 111, oben; S.T. Crooke und S.D. Reich (Hrsg), Anthracyclines: Current Status And New Developments, Academic Press (New York 1980); und C. Heidelberger et al., "Fluorinated Pyrimidines And Their Nucleosides" in Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 54, S. 57-119 (1983)].
Die Prodrugs von Etoposid, Adriamycin und 5-Fluoruridin können deshalb zusammen oder der Reihe nach für die Abgabe des entsprechenden bekannten Antitumor-Medikaments am Ort des Tumors mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugate verwendet werden. Es wurde beispielsweise gezeigt, daß Antitumormittel, die in Kombination verabreicht wurden, synergistisch wirken können [vgl. z.B. S. Monfardini et al., Manual of Cancer Chemotherapy, UICC Technical Report Series, 56 (1981)]. Diese Ausführungsform der Erfindung stellt somit ein Verfahren für die Kombinationschemotherapie von Tumoren bereit.

BEISPIEL 4

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung weiterer Immunokonjugate und Prodrugs gemäß vorliegender Erfindung für die Umwandlung einer relativ untoxischen Prodrug in ein aktives Antitumor-Agens, das in vitro-Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen aufweist. Bei diesem Beispiel wird ein L6-Penicillin V Amidase (im folgenden bezeichnet als "PVA")- Immonokonjugat dazu verwendet, um das N-Phenoxyacetylderivat von Adriamycin in das bekannte Antitumormittel Adriamycin umzuwandeln.

Herstellung von erfindungsgemäßem Antikörper-Penicillin V Amidase-Konjugat

In diesem Beispiel wird ein L6-PVA-Immunokonjugat und ein 1F5-PVA-Konjugat hergestellt. Die Antikörper L6 und 1F5 und deren Quellen wurden bereits früher beschrieben. Als Amidase- Enzym wurde Penicillin V Amidase, isoliert aus einer Pilzkultur von Fusarium oxvsnorum entsprechend den Methoden beschrieben von D.A. Lowe et al., "Enzymatic Hydrolysis Of Penicillin V to 6-Aminopenicillanic Acid By Fusarium oxysporum", Biotechnology Letters, 8 (3), S. 151-56 (1986) verwendet. Fusarium oxysporum- Stämme, aus denen das Enzym isoliert werden kann, sind bei der ATCC hinterlegt. PVA ist somit ein leicht verfügbares Enzym, das Penicillin-V in Penicillansäure überführt. Insbesondere hydrolysiert PVA die Phenoxyacetylbindung von Penicillin-V unter Bildung von Penicillansäure. Das Enzym, das mit Phenoxyacetamiden reagiert, kann deshalb zur Spaltung von Prodrugs bekannter zytotoxischer Mittel verwendet werden, die mit Phenoxyessigsäure oder p-Hydroxyphenoxyessigsäure derivatisiert wurden.
Die Antikörper-PVA-Konjugate gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wurden im wesentlichen in gleicher Weise hergestellt wie die AP-Konjugate gemäß Beispiel 1. Die Antikörper L6 und 1F5 wurden wie beschrieben mit Iminothiolan umgesetzt und die Anzahl der eingeführten Sulfhydryl-Gruppen auf jedem der Antikörper wurde zwischen 1-2 liegend bestimmt.
Das Enzym PVA wurde anschließend in PBS gelöst (9 ug/ml) und behandelt mit SMCC (Pierce Chemical Co., 100 mM in DMF), so daß die Endkonzentration 5 mM betrug. Durch die Behandlung mit SMCC wurden Maleimido-Gruppen in das Enzym eingeführt. Nach 30 Minuten bei 30ºC wurde das modifizierte Enzym durch Gelfiltration über G-25 PD-10 Sephadex (Pharmacia, Upsalla, Schweden) durch Elution mit PBS gereinigt. Die modifizierte PVA wurde anschließend zu einer Lösung eines jeden thiolierten Antikörpers in einem molaren Verhältnis von 3:1 zugesetzt. Jedes Reaktionsgemisch wurde mit Stickstoff gesättigt und 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde bei 4ºC weitere 18 Stunden inkubiert. Dann wurde 2-Aminoethanthiol (1 mM Endkonzentration) zu jeder Lösung zugesetzt, um weitere unumgesetzte Maleimide zu blockieren.
Jedes Reaktionsgemisch wurde anschließend über eine Gelfiltrationssäule (G-25) gegeben, wobei 20 mM Tris, pH 7,2, mit 50 mM NaCl als Eluent verwendet wurde. Die resultierenden Gemische wurden auf DEAE Sephadex Säulen (2,5 x 10 cm) gereinigt. Die Fraktionen wurden bei 280 nm aufgezeichnet. Nicht umgesetzter Antikörper eines jeden Gemisches bindet nicht an die Säule und Konjugat und nicht umgesetzte PVA wurden mit 20 mM Tris, pH 7,2 mit 0,5 M NaCl eluiert. Die Fraktionen, welche PVA und Konjugat enthielten, wurden anschließend unter Verwendung eines Amicon YM-30-Ultrafiltrationsfilters aufkonzentriert und auf einer Sephacryl S-300-Säule (2,5 x 95 cm) unter Verwendung von PBS als Elutionsmittel gereinigt. Die Fraktionen wurden bei 280 nm aufgezeichnet, und diejenigen, die reines Konjugat enthielten, was durch SDS-PAGE (4-12 %iges Gradientengel) bestimmt wurde, wurden vereinigt.

Herstellung einer neuen Adriamycin-Prodrug

Jedes der oben hergestellten Antikörper-PVA-Konjugate wurde anschließend mit einer neuen Adriamycin-Prodrug umgesetzt. Insbesondere wurde als Prodrug N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin (im folgenden bezeichnet als "APO") verwendet, worin Adriamycin an der Aminozucker-Position, wie in Figur 20 gezeigt, mit p-Hydroxy-phenoxyessigsäure acyliert ist.
Diese Adriamycin-Prodrug wurde wie folgt hergestellt:
In 10 ml Tetrahydrofuran wurden 84 mg (0,5 mmol) p- Hydroxyphenoxyessigsäure, 57 mg (0,5 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 100 mg (0,49 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid vorgelegt. Dieses Gemisch wurde 2 Stunden gerührt, dann wurde die Lösung abfiltriert und das Filtrat wurde zu 200 mg (0,35 mmol) Adriamycinhydrochlorid gegeben. 0,1 ml Triethylamin wurden zur Reaktionsmischung hinzugegeben und das Rühren wurde 4 Stunden fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Glaswolle filtriert und im Hochvakuum unter Bildung eines Rückstands eingedampft. Das resultierende Gemisch wurde auf einer Silikagel-60-Säule (2,5 x 20 cm) gereinigt. Die Elution erfolgte mit 95:5 Dichlormethan:Methan. Die vereinigten Fraktionen wurden auf der gleichen Säule erneut gereinigt, wobei man 70 mg (0,1 mmol, Ausbeute 30 %) reines N-(p- Hydroxyphenoxyacetyl) adriamycin erhielt.
FAB MS m/e 694.2125 (M+H)&spplus;. Berechnet für C&sub3;&sub5;H&sub3;&sub6;NO&sub1;&sub4;, 694.2136. 360 MHz ¹H NMR (CDCl&sub3;): δ 1,06 (d, 3H, Zucker CH&sub3;), 1,5-2,2 (m, 6H, Zucker H), 3,0 (q, 2H) 4,0 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,35 (s, 2H, COCH&sub2;O), 4,8-5,0 (m, 3H), 5,2 und 5,4 (s, 1H), 6,6-6,8 (dd, 4H, Phenoxy ArH), 7,4-7,9 (m, 3H, 2,3,4-H), 9,0 (s, 1H, Ar'OH), 11,61 und 12,39 (s, 1H, ArOH).
Selbstverständlich können auch andere Phenoxyacetylamid- Derivate von Adriamycin hergestellt werden, indem man im wesentlichen das gleiche, oben beschriebene Verfahren anwendet. Beispielsweise kann N-(Phenoxyacetyl)adriamycin gemäß diesem Abschnitt hergestellt werden, wobei die p-Hydroxyphenoxyessigsäure ersetzt wird durch 0,5 mmol (76 mg) Phenoxyessigsäure. In ähnlicher Weise können N- (p-Hydroxyphenoxyacetyl) melphalan- oder -Daunomycin-Prodrugs oder N-(Phenoxyacetyl)melphalan- oder -Daunomycin-Prodrugs anhand dieses Syntheseprotokolls hergestellt werden, wenn 100 mg Mephalan oder 200 mg Daunomycin (0,35 mmol) verwendet werden.

Umsetzung eines Antikörper-Penicillin V Amidase-Konjugates mit einer Adriamycin Prodrug

Die Fähigkeit des Antikörper-PVA-Konjugates L6-PVA, die neue Prodrug APO in Adriamycin umzuwandeln, wurde wie folgt gemessen: es wurde entweder a) PVA alleine (Endkonzentration: 50 ug/ml), b) 100 ug/ml L6-PVA-Konjugat (PVA-Endkonzentration: 25 ug/ml) oder c) 10 ug/ml L6-PVA (PVA Endkonzentration: 2,5 ug/ml) zu einer Lösung von APO (0,1 mM) in PBS zugegeben. Jede Reaktion wurde durch HPLC unter Verwendung einer Phenominex C- 18-Säule (3 um, 4,5 x 100 mm) und einer Gradientenelution von 20-60 % Tetrahydrofuran in Wasser mit 0,1 % H&sub3;PO&sub4; (1,0 ml/min, Aufzeichnung bei 495 nm) überwacht. Unter diesen Bedingungen wurde Adriamycin nach 8,9 Minuten und APO nach 12,2 Minuten eluiert. Die Resultate sind in Figur 21 gezeigt.
Wie die Figur zeigt, wurde die Amidgruppe von APO durch PVA tatsächlich hydrolysiert, was durch die Bildung von Adriamycin belegt wird. Unter den angewendeten Bedingungen beträgt die Halbwertszeit für die Hydrolyse von APO durch PVA etwa 20 Minuten. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß innerhalb von 40 Minuten nach dem Beginn der Reaktion entweder das Enzym alleine oder das Antikörper-PVA-Konjugat die Hydrolyse von wenigstens 80 % APO zu Adriamycin bewirken konnten. 10 ug/ml Konjugat (2,5 ug/ml PVA) erreichten diesen Hydrolysegrad nach 120 Minuten. Schließlich ergibt sich aus diesen Untersuchungen, daß das Antikörper-PVA-Konjugat gemäß vorliegender Erfindung keinen offensichtlichen Verlust an enzymatischer Aktivität aufgrund der Anlagerung dieses Enzyms an den Antikörper zeigt. Dies wird belegt durch die Tatsache, daß das Konjugat und das freie Enzym ähnliche Fähigkeiten zur Hydrolyse von APO zu Adriamycin zeigten.

Serumstabilität der neuen erfindungsgemäßen Adriamycin-Prodrug

Die Stabilität von APO in Humanserum wurde bestimmt unter Anwendung der HPLC und Messung der Geschwindigkeit für die Abnahme von APO und der Geschwindigkeit für die Bildung von Adriamycin. Eine Lösung von APO (10 mM in Dimethylformamid) wurde hierzu zu frischem Humanserum gegeben, so daß die Endkonzentration 0,1 mM betrug. Proben (50 ul) wurden verdünnt mit Methanol (50 ul), um Serumproteine auszufällen. Diese Proben wurden anschließend zentrifugiert und durch HPLC wie oben beschrieben analysiert. Innerhalb von zwei Stunden konnte keine Hydrolyse von APO zu Adriamycin festgestellt werden.

Bindung von Antikörper-PVA-Konjugaten an H2981-Tumorzellen

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Konjugate L6-PVA und 1F5-PVA zur Bindung an H2981-Tumorzellen wurde wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse des Bindungstests sind in Figur 22 dargestellt.
Die FACS-Analyse ergab, daß sowohl L6 als auch das L6-PVA- Konjugat stark an die Tumorzellen banden, während das Konjugat 1F5-PVA keine signifikante Bindung zeigte. Diese Bindungsstudie weist erstens darauf hin, daß die Konjugation an das Enzym die Bindungsfähigkeit der Antikörperkomponente des erfindungsgemäßen Immunokonjugates nicht wesentlich beeinflußt. Zweitens veranschaulicht dieser Test erneut die Spezifität der Bindung dieser Konjugate; das L6-PVA-Konjugat bindet an die L6- positiven H2981-Tumorzellen und das 1F5-PVA-Konjugat zeigt im wesentlichen keine Bindung aufgrund der fehlenden Spezifität des Antikörpers 1F5 für die Tumorzellen.

In Vitro-Zytotoxizität der erfindungsgemäßen Antikörper-PVA- Konjugat/Adriamycin-Prodrugkombination auf H2981-Tumorzellen

Der zytotoxische in vitro-Effekt der erfindungsgemäßen Antikörper-PVA/Adriamycin-Prodrug-Kombination gegenüber H2981- Tumorzellen wurde unter Anwendung des ³H-Thymidin-Aufnahmetests, der in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurde gemessen. Die H2981-Tumorzellen wurden auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in IMDM (10 000 Zellen/Vertiefung) ausplattiert. Man ließ sie 18 Stunden bei 37ºC anwachsen. Die Antikörper-PVA-Konjugate L6-PVA oder 1F5-PVA wurden anschließend in Konzentrationen von 10 ug/ml Antikörper zugesetzt und die Platten wurden 30 Minuten bei 4ºC inkubiert.
Die Vertiefungen wurden anschließend viermal mit IMDM gewaschen und APO wurde in verschiedenen Konzentrationen in IMDM zugesetzt. Nach zwei Stunden wurden die Vertiefungen erneut gewaschen, IMDM wurde zugesetzt und die Zellen wurden 18 Stunden bei 37ºC aufbewahrt. Dann wurde ³H-Thymidin zugegeben (1 uCi pro Vertiefung) und nach 6 Stunden wurden die Platten bei -70ºC eingefroren, um die Zellen abzulösen. Nach dem Auftauen wurden die Zellen auf Glasfaser-Filtern geerntet. Der Einbau von ³H-Thymidin wurde in einen Beckman 3801- Szintillationszähler gemessen und verglichen mit Zellen, die mit APO oder Adriamycin (ADM) alleine behandelt wurden.
Mit Hilfe dieses Tests konnte die Inhibition der ³H- Thymidin-Inkorporation in die DNA der Tumorzellen und somit der zytotoxische Effekt der Prodrug APO auf die Zellen mit oder ohne Vorbehandlung der Zellen mit L6-PVA oder 1F5-PVA Konjugat gemessen werden. Die zytotoxischen Effekte dieser Kombinationen wurden mit der beobachteten Zytotoxizität nach ausschließlicher Behandlung der Zellen mit dem Ausgangs-Medikament Adriamycin verglichen. Wie in Figur 23 gezeigt wird, war Adriamycin mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 38 nM signifikant stärker toxisch als APO mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 2 uM gegenüber Tumorzellen, die nicht mit Konjugat behandelt wurden. Dies war aufgrund von früheren Berichten zu erwarten, da gezeigt werden konnte, daß Adriamycin-Amide weniger toxisch waren als Adriamycin [vgl. z.B. Y. Levin und B. A. Sela, FEBS Letters, 98, s. 119 (1979) und R. Baurain et al., J. Med. Chem., 23, S. 1171 (1980)]. Eine Vorbehandlung der Zellen mit L6-PVA führte zu einer Verstärkung der APO-Zytotoxizität um das 20-fache auf einen Wert, der vergleichbar war mit dem von Adriamycin alleine. Eine Vorbehandlung der Zellen mit 1F5-PVA beeinflußte die Toxizität von APO nicht. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Konjugat L6-PVA zur Hydrolyse der relativ unzytotoxischen Prodrug APO befähigt ist, Tumorzellen in einem Umfang abzutöten, der vergleichbar ist mit der alleinigen Verwendung von Adriamycin und daß diese Zytotoxizität Antigen-spezifisch ist, was durch die Tatsache veranschaulicht wird, daß das 1F5-PVA-Konjugat, das keine signifikante Bindung an diese spezielle Tumorzellinie zeigt, keine derartige Zytotoxizität zeigt.

Bindung der Antikörper-PVA-Konjugate an Daudi-Lymphomzellen

Die Fähigkeit der Konjugate L6-PVA und 1F5-PVA gemäß vorliegender Erfindung zur Bindung an die bekannte Daudi- Zellinie wurde ebenfalls untersucht. Diese Zellinie ist eine Burkitt-Lymphomzellinie, die bei der ATCC (ATCC # CCL 213) hinterlegt ist und das CD-20-Antigen exprimiert, an das die Antikörper 1F5 binden. Der Bindungstest wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme davon, daß die verwendeten Zellen Daudizellen waren. Die Ergebnisse sind in Figur 24 dargestellt.
In diesem Fall banden der monoklonale Antikörper 1F5 und das Konjugat 1F5-PVA stark an die Lymphomzellen. Diese Untersuchung veranschaulicht erneut, daß die Bindungsfähigkeit des Konjugates von der Konjugations-Prozedur nicht signifikant beeinflußt wurde.
Wie die Figur zeigt, konnte bei dem Antikörper L6 und dem Konjugat L6-PVA keine nennenswerte Bindung an Daudi-Zellen beobachtet werden. Dies war zu erwarten, da Daudi Tumorzellen das Antigen, mit dem der Antikörper L6 reagiert, nicht aufweisen. Diese Untersuchung demonstriert eindeutig in Kombination mit den hierin bereits früher beschriebenen Bindungsstudien die Bindungsspezifität der erfindungsgemäßen Konjugate, das heißt der L6-haltigen Konjugate, die spezifisch an L6-positive Tumorzellen binden, und der 1F5-haltigen Konjugate, die spezifisch an CD-20-positive Tumorzellen binden.

In Vitro Zytotoxizität der Antikörper-PVA-Konjugat/Adriamycin- Prodrug-Kombination gemäß vorliegender Erfindung gegenüber Daudi-Zellen

Anschließend wurde der zytotoxische in vitro-Effekt der Konjugate L6-PVA oder 1F5-PVA in Kombination mit der Prodrug APO auf Daudi-Zellen getestet.
Der ³H-Thymidin-Test wurde im wesentlichen wie in obigen Beispielen beschrieben durchgeführt, wobei jedoch geringe Modifikationen aufgrund der Tatsache vorgenommen werden mußten, daß Daudi-Zellen nicht-adhärent sind. Etwa 250 000 Daudi-Zellen in IMDM wurden hierzu in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ausplattiert und Antikörper-Enzymkonjugat wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Nicht-gebundenes Antikörper-Enzymkonjugat wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 x g und Entfernung des Überstandes abgetrennt. Die Zellen wurden in IMDM resuspendiert und die Waschprozedur wurde dreimal wiederholt, um sämtliches ungebundes Konjugat zu entfernen. APO in IMDM wurde anschließend 2 Stunden zugesetzt. Dann wurde wie oben beschrieben einmal gewaschen. Der restliche Test wurde wie in obigen Beispielen beschrieben durchgeführt.
Mit Hilfe dieses Tests wurde die lnhibition der ³H- Thymidin-Inkorporation in die DNA von Daudizellen und somit der zytotoxische Effekt der APO-Prodrug auf die Zellen mit oder ohne Vorbehandlung der Zellen mit dem Konjugat L6-PVA oder 1F5- PVA gemessen. Die zytotoxischen Effekte dieser Kombinationen wurden mit der Zytotoxizität verglichen, die man bei alleiniger Behandlung der Zellen mit Adriamycin beobachtete. Wie in Figur 25 gezeigt, war Adriamycin gegenüber Daudizellen, die mit keinem Konjugat behandelt wurden, signifikant stärker toxisch als APO. Eine Vorbehandlung der Zellen mit dem Konjugat 1F5-PVA erhöhte die Zytotoxizität der APO-Prodrug in signifikanter Weise auf einen Wert, der vergleichbar war mit dem von Adriamycin alleine, wobei die Vorbehandlung mit L6-PVA-Konjugat keine derartige Erhöhung bewirkte.
Es ist anzumerken, daß die aus diesen Bindungs- und Zytotoxizitäts-Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse gegensätzlich zu den Ergebnissen ausgefallen sind, die man mit diesen Konjugaten in den früher beschriebenen Untersuchungen im Rahmen dieses Beispiels unter Verwendung der Tumorzellen H2981 erhielt, worin die L6-PVA + APO-Kombination erhöhte zytotoxische Effekte und die 1F5-PVA + APO-Kombination keine Effekte zeigte. Dis war aufgrund der gegebenen unterschiedlichen Spezifitäten der Antikörper L6 und 1F5 der Konjugate zu erwarten. Es zeigt deutlich die Spezifität des mit den erfindungsgemäßen Konjugat/Prodrug-Kombinationen gemäß vorliegender Erfindung erzielten zytotoxischen Effekte.
Darüber hinaus veranschaulicht diese Untersuchung die Brauchbarkeit des Konjugates 1F5-PVA in Kombination mit APO für die Erzeugung eines zytotoxischen Effekts gegenüber Tumorzellen in vitro. Die in vitro-Zytotoxizitätsuntersuchungen dieses Beispiels veranschaulichen somit die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung auf ein beliebiges Konjugat, das einen Antikörper enthält, der mit einem Tumor-assoziierten Antigen reagiert, für die Behandlung von Tumoren, mit denen der Antikörper reagiert.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel betrifft die Verwendung von Immunokonjugaten und Methoden der vorliegenden Erfindung zur Umwandlung der Prodrug 5-Fluorcytosin (im folgenden bezeichnet als "5-FC") in das Antitwnormedikament 5-Fluoruracil (im folgenden bezeichnet als "5-FU") durch ein Antikörpergebundenes Cytosin Deaminase (CD) Enzym (vgl. Figur 26). Die Antikörper-CD-Konjugat/5-FC-Prodrugkombination gemäß dieser Ausführungsform zeigte einen signifikanten zytotoxischen Effekt gegenüber Tumorzellen in vitro.

Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper-Cytosin Deaminase- Konjugate

Die Immunokonjugate L6-CD und 1F5-CD wurden unter Verwendung der in früheren Beispielen erwähnten monoklonalen Antikörper L6 und 1F5 sowie des Enzyms Cytosin Deaminase hergestellt. Obwohl CD-Enzyme in verschiedenen Mikroorganismen nachgewiesen und daraus isoliert wurden (vgl. z.B. West et al., Biochem. Biophys. Acta., 719, S. 251-58 (1982)) wurde die in diesem Beispiel verwendete spezielle CD aus komprimierter Bäckerhefe in ähnlicher Weise wie von P. L. Ipata et al. in "Baker's Yeast Cytosine Deaminase. Some Enzymatic Properties And Allosteric Inhibition By Nucleosides And Nucleotides," Biochemistry, 10, S. 4270-76 (1971) beschrieben, isoliert.
Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) (2,0 kg) wurden mit Ethylacetat plasmolysiert und eine Ammoniumsulfatfällung (50-73 %) wurde zweimal durchgeführt, um ein Rohenzympräparat zu erhalten. Das Ammoniumsulfat-Pellet wurde gegen 10 mM Tris- Cl Puffer, ph 8,0, dialysiert, auf eine Q-Sepharose - Anionenaustauschersäule (Pharmacia) aufgetragen und mit einem KCL-Gradienten (0-0,3 M) eluiert.
Die Fraktionen wurden in Übereinstimmung mit dem Verfahren von T. Nishiyama et al., "Antineoplastic Effects In Rats Of 5- Fluorocytosine In Combination With Cytosine Deaminase Capsules," Cancer Research, 451 S. 1753-61 (1985)] auf CD- Aktivität unter Verwendung von 3 mM Cytosin (oder 5-FC) als Substrat in PBS bei 27ºC getestet. Bei diesem Verfahren wurde eine kleine Menge des Enzympräparates zu Substrat, das heißt Cytosin (oder 5-FC), zugesetzt und der Reaktionsverlauf wurde durch UV-Spektrophotometrie über die Bildung von Uracil (oder 5-FU) in Proben bestimmt, die mit 0,1 N HCl gequencht wurden. Die Verhältnisse von 250/280 (für Cytosin) und 255/290 (für 5- FC) wurden verwendet, um die Menge an gebildetem Uracil oder 5- FU zu messen. Dieses Verfahren zur Bestimmung der CD-Aktivität wurde für jede Reinigungsstufe des CD-Enzyms sowie während der Reinigung der im folgenden beschriebenen erf indungsgemäßen CD- Konjugate verwendet.
Die aktiven Fraktionen aus dem KCl-Gradienten wurden vereinigt, konzentriert und auf einer G-75 Sephadex -Säule gereinigt. Ein SDS-PAGE (14 %, nicht-reduzierend) in diesem Stadium zeigte, daß die CD-Aktivität enthaltenen Fraktionen ein Hauptprotein mit MW 18 kd und geringe Mengen von Proteinen bei 20 und 30 kd enthielten. Die CD-Aktivität dieser Fraktion betrug 10 U/mg Protein (unter Verwendung von Cytosin als Substrat). Andere Präparationen ergaben Material mit Aktivität im Bereich von 17 U/mg Protein. Sämtliche Proteintests wurden durchgeführt unter Anwendung der BCA-Protein-Assay-Reagenzien, die von Pierce (Rockford, IL) zu beziehen sind.
Die gereinigte CD wurde anschließend mit den monoklonalen Antikörpern L6 oder 1F5 im wesentlichen wie für die AP- Konjugate in Beispiel 1 beschrieben konjugiert. Die Rohkonjugate (nichtbehandelt mit Jodacetamid) wurden durch Gelfiltration über S-200 Sepharose unter Verwendung von PBS als Elutionsmittel gereinigt. Die Fraktionen wurden bei 280 nm aufgezeichnet und die CD-Aktivität für jede Fraktion wurde wie oben beschrieben bestimmt. Fraktionen, die Konjugate mit geeigneten Werten für das CD-Antikörperverhältnis enthielten, wurden vereinigt und durch SDS-PAGE auf einem 4-12%igen, nichtreduzierenden Gradientengel analysiert, um gereinigte L6-CD- und 1F5-CD-Konjugatpräparationen zu erhalten.

Reaktion der Antikörper-Cytosin Deaminase-Konjugate mit der Prodrug 5-Fluorcytosin

Die Fähigkeit der Konjugate L6-CD und 1F5-CD zur Konvertierung der Prodrug 5-FC zu 5-FU oder des Substrates Cytosin zu Uracil wurde wie folgt gemessen: entweder freie CD (Endkonzentration: 5 ug/ml), das L6-CD-Konjugat (CD Endkonzentration: 5 ug/ml) oder das Konjugat (1F5-CD (CD Endkonzentration: 5 ug/ml) wurde zu einer 3 mM Lösung von a) Cytosin oder b) 5-FC in PBS bei 27ºC gegeben und die Menge an gebildetem Produkt wurde in Abhängigkeit von der Zeit spektrophotometrisch wie in obigem Abschnitt beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 27 zusammengefaßt. Wie die Figur zeigt, wurde 5-FU aus der Prodrug 5-FC sowohl durch das freie Enzym CD als auch durch die erf indungsgemäßen Antikörper-CD-Konjugate gebildet. Die Figur zeigt außerdem, daß kein signifikanter Verlust an CD- Enzymaktivität aufgrund der Anlagerung des Enzyms an den Antikörper eines jeden Konjugates bewirkt wurde. Dies wird veranschaulicht durch die Tatsache, daß die Konjugate gleiche Aktivitäten wie CD alleine zeigten. Die spezifische Aktivität von freien Enzym und Konjugaten betrug etwa 4 U/mg Enzym.
Zu Vergleichszwecken wurde die Reaktivität der Konjugate unter Verwendung von Cytosin anstelle von 5-FC als Substrat getestet. Wie der Figur zu entnehmen ist, zeigten die Konjugate mit Cytosin als Substrat CD-Aktivitäten, die im wesentlichen vergleichbar waren mit der Aktivität des freien CD-Enzyms alleine. Die spezifische Aktivität des Konjugates - 10 U/mg gebundenes Enzym - weist außerdem darauf hin, daß die ursprüngliche Enzymaktivität von CD im Konjugat erhalten blieb. Dieser Aktivitätswert wurde mehrere Wochen beibehalten, wenn die Konjugate in PBS bei 4ºC gelagert wurden.

Bindung der Antikörper-CD-Konjugate an H2981 Tumorzellen

Die Befähigung der Konjugate L6-CD und 1F5-CD gemäß vorliegender Erfindung zur Bindung an H2981 Tumorzellen wurde wie in den Beispielen 1 und 2 gemessen. Die Ergebnisse dieses Bindungstests sind in Figur 28 dargestellt.
Die FACS-Analyse ergab, daß L6 und L6-CD stark an die Tumorzellen banden, während das 1F5-CD-Konjugat keine Bindung an diese Zellen zeigte. Wie bei den vorausgegangenen, hierin beschriebenen Bindungsstudien, weist dieser Test auf eine Konservierung der Bindungsaktivität dieser Konjugate trotz Konjugation des Antikörpers mit dem Enzym sowie auf die Bindungsspezifität dieser Konjugate hin.

In Vitro Zytotoxizität der erfindungsaemäßen Antikörper-CD Konjugat/5-FC-Prodrugkombination gegenüber H2981-Tumorzellen

Die in vitro Zytotoxizität der Antikörper-CD/5-FC Prodrug- Kombination gemäß vorliegender Erfindung gegenüber H2981- Tumorzellen wurde unter Verwendung eines ³H-Leucin-Aufnahmetests, ähnlich dem ³H-Thymidin-Aufnahmetest gemäß Beispiel 1 und 2, gemessen.
Bei diesem Test wird eine Suspension von 10&sup4; H2981 Zellen in 0,1 ml IMDM mit 10 % (Vol/Vol) fötalem Kälberserum auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Adhäsion erfolgt über Nacht bei 37ºC. Die Platten wurden anschließend gewaschen und die Konjugate L6-CD oder 1F5-CD (10 ug Gesamtprotein/ml, enthaltend 10 U/mg gebundene CD-Enzym- Aktivität unter Verwendung von Cytosinsubstrat) in 0,1 ml IMDM wurde zugesetzt. Nach 30 Minuten bei 4ºC wurden die Platten viermal gewaschen und 0,15 ml Leucin-freies RPMI-Medium, enthaltend unterschiedliche Konzentrationen der Wirkstoffe 5-FC oder 5-FU, wurden zu den Vertiefungen zugegeben. Die Zellen wurden 18 Stunden bei 37ºC inkubiert und 6 Stunden mit ³H-Leucin (1 uCi/Vertiefung) in 0,05 ml Leucin-freiem RPMI gepulst. Die Platten wurden wie in den Beispielen 1 und 2 für den ³H- Thymidinaufnahmetest beschrieben weiterverarbeitet.
Mit Hilfe dieses Tests konnte die Inhibition der ³H- Leucinaufnahme in das Protein der Tumorzellen und somit der zytotoxische Effekt der Prodrug 5-FC auf die Zellen mit oder ohne Vorbehandlung der Zellen mit L6-CD oder 1F5-CD-Konjugat gemessen werden. Die zytotoxischen Effekte dieser Kombinationen wurden mit der Zytotoxizität verglichen, die man bei Behandlung der Zellen mit dem Ausgangswirkstoff 5-FU alleine beobachtete. Wie in Figur 29 gezeigt wird, zeigte 5-FC gegenüber Tumorzellen, die mit keinem Konjugat behandelt wurden, nur eine sehr geringe zytotoxische Aktivität, während 5-FU das Zellwachstum mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 20 uM inhibierte. Eine Vorbehandlung der Zellen mit L6-CD-Konjugat erhöhte jedoch die Zytotoxizität von 5-FC auf den gleichen Wert wie 5-FU alleine. Dieses Ergebnis stimmt überein mit der Tatsache, daß Antigen-gebundenes L6-CD zur Umwandlung der nicht-toxischen Prodrug 5-FC in 5-FU befähigt ist. Das nicht-bindende Konjugat IF5-CD zeigte keine derartige Steigerung, was auf die Antigen-spezifische Natur dieser erhöhten Zytotoxizität hinweist.

Claims

1. Verwendung wenigstens eines Wirkstoff-Vorläufers, der im Vergleich zu seinem entsprechenden Wirkstoff wenig zytotoxisch ist, und wenigstens eines Antikörper- Enzymkonjugates, umfassend einen Antikörper, der mit einem Antigen auf der Oberfläche von Tumorzellen reagiert und mit einem Enzym konjugiert ist, das zur Umwandlung des Wirkstoff-Vorläufers in den cytotoxischen Wirkstoff befähigt ist, wobei das Antikörper-Enzymkonjugat ausgewählt ist unter L6-β-Lactamase, 1F5-β-Lactamase, L6- Alkalische Phosphatase (AP), 1F5-AP, L6-Penicillin V Amidase (PVA), 1F5-PVA, L6-Cytosin-Deaminase (CD), oder 1F5-CD, zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, bestehend aus zwei getrennten Komponenten zur Behandlung von Tumoren.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist unter Etoposid, Teniposid, Adriamycin, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycinen, cis- Platin und cis-Platin-Analoga, Bleomycinen, Esperamicinen, 5-Fluoruracil, Melphalan und anderen Stickstoff-Lost- Verbindungen.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff Etoposid, Nitomycin, Adriamycin oder 5-Fluoruracil ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff-Vorläufer ausgewählt ist unter phosphathaltigen Wirkstoff- Vorläufern, β-Lactam-haltigen Wirkstoff-Vorläufern und gegebenenfalls substituierten Phenoxyacetamid-haltigen Wirkstoff-Vorläufern.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff-Vorläufer ausgewählt ist unter Etoposidphosphaten, Etoposidthiophosphaten, Teniposidphosphaten, Teniposidthiophosphaten, Adriamycinphosphaten, und N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8;- Alkylmitomycinphosphaten.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff-Vorläufer Etoposid-4'-phosphat oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, oder 7-(2'-Aminoethyiphosphat)mitomycin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff-Vorläufer ausgewählt ist unter N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin, N-(Phenoxyacetyl)adriamycin, 5- Fluoruridinmonophosphat und 5-Fluorcytosin.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antikörper- Enzymkonjugat L6-AP ist und der Wirkstoff-Vorläufer Etoposid-4'-phosphat, N&sup7;-C&sub1;.&sub8;-Alkylmitomycinphosphat oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.

9. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antikörper- Enzymkonjugat L6-PVA ist und der Wirkstoff-Vorläufer ausgewählt ist unter N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin und N-(Phenoxyacetyl)adriamycin.

10. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antikörper- Enzymkonjugat L6-CD und der Wirkstoff-Vorläufer 5-Fluorcytosin ist.

11. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Tumorzellen abgeleitet sind von Karzinomen, Melanomen, Lymphomen, Knochen- und Bindegewebe-Sarkomen und anderen Tumoren.

12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mehr als ein Wirkstoff-Vorläufer verwendet wird, wobei jeder davon im Vergleich zum entsprechenden Wirkstoff schwach zytotoxisch auf Tumorzellen wirkt.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin das Enzym Alkalische Phosphatase ist.

14. Verwendung nach Anspruch 12, worin die Wirkstoff-Vorläufer ausgewählt sind unter Etoposidphosphaten, Etoposidthiophosphaten, Teniposidphosphaten, Teniposidthiophosphaten, Adriamycinphosphaten, N- Phenoxyacetylderivativen von Adriamycin und N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8;- Alkylmitomycinphosphaten -

15. Verwendung nach Anspruch 12, worin einer der Wirkstoff- Vorläufer 5-Fluorcytosin oder 5-Fluoruridinmonophosphat ist.

16. Verwendung nach Anspruch 12, worin die Wirkstoff-Vorläufer Etoposid-4'-phosphat, N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8;-Alkylmitomycinphosphat oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon sind.

17. Verwendung nach Anspruch 12, worin das Antikörper- Enzymkonjugat L6-AP ist und die Wirkstoff-Vorläufer Etoposid-4'-phosphat und N&sup7;-C&sub1;&submin;&sub8;-Alkylmitomycinphosphat oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon sind.

18. Verwendung nach Anspruch 1, worin mehr als ein Antikörper- Enzymkonjugat verwendet wird, wobei der Antikörper eines jeden Konjugates mit dem gleichen oder einem anderen Antigen auf der Oberfläche der Tumorzellen reagiert und die Enzyme der Konjugate gleich oder verschieden sind und befähigt sind, zur Umwandlung wenigstens eines Wirkstoff- Vorläufers, der im Vergleich zum entsprechenden Wirkstoff auf Tumorzellen schwach zytotoxisch wirkt, in den zytotoxischeren Wirkstoff.

19. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Wirkstoff-Vorläufer eine Verbindung der Formel ist:

worin

R¹ für H steht und R³ für OH oder OCH&sub3; steht; oder

R¹ für OH und R³ für OCH&sub3; steht; und

R² für H oder OH steht.

20. Verwendung nach Anspruch 20, worin der Wirkstoff-Vorläufer N-(p-Hydroxyphenoxyacetyl)adriamycin oder N- (Phenoxyacetyl)adriamycin ist.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin das Antikörper-Enzymkonjugat ein Fusionsprotein ist, welches wenigstens die Antigen-bindende Region eines Antikörpers umfaßt, der mit einem Tumor-assoziierten Antigen reagiert und verbunden ist mit einem wenigstens funktionell aktiven Teil eines Enzyms, das zur Umwandlung wenigstens eines schwach zytotoxischen Wirkstoff-Vorläufers in den zytotoxischeren Wirkstoff befähigt ist.

22. Die Antikörper-Enzymkonjugate L6-β-Lactamase, 1F5-β- Lactamase, L6-AP, 1F5-AP, L6-PVA, 1F5-PVA, L6-CD, oder 1F5-CD.

23. Pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung, zur Behandlung von Tumoren, bestehend aus zwei getrennten Komponenten, wobei eine Komponente eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Antikörper-Enzymkonjugates gemäß Anspruch 1 und die andere Komponente wenigstens einen Wirkstoff-Vorläufer gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, 14 bis 16, 19 und 20 umfaßt.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin das Antikörper- Enzymkonjugat ausgewählt ist unter L6-AP, L6-PVA und L6-CD.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin der Wirkstoff- Vorläufer ausgewählt ist unter Etoposidphosphaten, Etoposidthiophosphaten, Teniposidphosphaten, Teniposidthiophosphaten, Adriamycinphosphaten, N-Phenoxyacetyl-Derivativen von Adriamycin, Mitomycinphosphaten, 5-Fluoruridinmonophosphaten und 5- Fluorcytosin.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin das Antikörper- Enzymkonjugat L6-AP ist und der Wirkstoff-Vorläufer ausgewählt ist unter Etoposid-4'-phosphat, N&sup7;-C&sub1;&sub8;- Alkylmitomycinphosphat oder pharmazeutisch akzeptablen Salzen davon.

27. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 23 bis 26, wobei man das Antikörper-Enzymkonjugat und den Wirkstoff-Vorläufer miteinander kombiniert.