DE69131435T2 - Bifunktionale Kupplungsverbindungen, Konjugate und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Bifunktionale Kupplungsverbindungen, Konjugate und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue bifunktionelle Verbindungen, Konjugate, welche die Verbindungen enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung N-substituierte Hydrazinverbindungen, die mit Molekülen verknüpft werden können, welche gezielt an Zellpopulationen binden.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bifunktionelle Verbindungen, mit denen sich zwei oder mehrere Moleküle verknüpfen lassen, sind beschrieben worden. Beispielsweise sind bifunktionelle Verbindungen zur Verknüpfung von cytotoxischen Reagenzien mit Molekülen zur gezielten Bindung an Zellpopulationen bekannt. Die bifunktionellen Verbindungen müssen in der Lage sein, diese Typen von cytotoxischen Reagenzien in vivo zu tragen und freizusetzen, um z. B. ausreichende, d. h. therapeutische Niveaus der Reagenzien in vivo zur Verfügung zu stellen, ohne die Aktivität der gezielt bindenden Moleküle zu beeinträchtigen. Für gewisse Anwendungen ist die Bildung eines Konjugats wünschenswert, welches eine pH-empfindliche Verknüpfung zwischen den Reagens- und den gezielt bindenden Molekülen des Konjugats enthält, die für eine Freisetzung des cytotoxischen Reagenzes in bestimmten pH-Bereichen sorgt.
  • Besonders nützliche Reagenzien zur Behandlung von Krebs sind die Anthracycline. Anthracycline sind antibiotische Verbindungen, die eine cytotoxische Aktivität zeigen. Untersuchungen haben gezeigt, dass Anthracycline beim Abtöten von Zellen über eine Reihe verschiedener Mechanismen wirken. Hierzu gehören: 1) die Interkalation der Wirkstoffmoleküle in die DNA einer Zelle, wodurch die DNA-abhängige Nukleinsäu resynthese gehemmt wird; 2) die Produktion von freien Radikalen durch den Wirkstoff, welche dann mit zellulären Makromolekülen reagieren, wodurch eine Schädigung der Zellen bewirkt wird, oder 3) Wechselwirkungen der Wirkstoffmoleküle mit der Zellmembran (Peterson et al., "Transport And Storage Of Anthracyclines In Experimental Systems And Human Leukemia", in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy, Muggia et al. (Herausg.), S. 132 (Martinus Nijhoff Publishers (1982); und Bachur, "Free Radical Damage", id. auf den Seiten 97-102)). Aufgrund ihres cytotoxischen Potentials wurden Anthracycline bei der Behandlung von zahlreichen Krebsarten wie z. B. Leukämie, Brustkarzinom, Lungenkarzinom, Eierstockadenokarzinom und Sarkomen verwendet (Wiernik, "Current Status Of Adriamycin And Daunomycin In Cancer Treatment", in Anthracyclines: Current Status And New Developments, Crooke et al. (Herausg.), Seiten 273-94 (Academic Press 1980)). Zu häufig verwendeten Anthracyclinen zählen Adriamycin (ADM, ebenfalls bekannt als Doxorubicin).
  • und Daunomycin (DAU, ebenfalls bekannt als Daunorubicin) Obwohl diese Verbindungen bei der Behandlung von Neoplasmen und anderen Krankheitszuständen, bei denen eine Targetzellpopulation reduziert oder eliminiert werden soll, nützlich sein können, wird ihre therapeutische Wirksamkeit oft durch die dosisabhängige Toxizität begrenzt, die mit ihrer Verabreichung verbunden ist. Zu typischen nachteiligen Nebenwirkungen dieser Verbindungen bei der Behandlung von Tumoren gehören beispielsweise Knochenmarksdepressionen und eine Kardiotoxizitäten (Crooke, "Goals For Anthracycline Analog Development At Bristol Laboratories", Anthracyclines: Current Status And New Developments, oben, auf S. 11). Daher wurden bei der Behandlung von Tumoren Versuche unternommen, die therapeutischen Wirkungen dieser Verbindungen dadurch zu verbessern, daß Anthracyclin und gegen tumorassoziierte Antigene gerichtete Antikörper miteinander verknüpft werden, um Immunkonjugate zur selektiven Abgabe der Wirkstoffe an die Tumorzellen zu bilden. (Hermentin und Seiler, "Investigations with monoclonal antibody drug (anthracycline) conjugates", Behring Insti. Mitl. 82: 197-215 (1988)). Auf diese Weise kann der Wirkstoff an den Ort des Tumors abgegeben oder gezielt dorthin gebracht ("targeted") werden, und dessen toxische Nebenwirkungen auf normale Zellen in dem Körper können verringert werden. Immunkonjugate, die aus den Anthracyclinen ADM oder DAU, verknüpft mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen tumorassoziierte Antigene, zusammensetzt sind, sind im Stand der Technik bekannt (z. B. Gallego et al., "Preparation Of Four Daunomucin-Monoclonal Antibody 791T/36-Conjugates With Anti-Tumor Activity", Int. J. Cancer 33: 737-44 (1984); und Arnon et al., "In Vitro And In Vitro Efficacy Of Conjugates Of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies", Immunological Rev. 62: 5-27 (1982)).
  • Die am häufigsten verwendeten Ansätze zur Anbindung eines Anthracyclins an einen Antikörper haben eine Verknüpfung an der Aminozuckereinheit des Anthracyclins benutzt. Beispielsweise wurde der Aminozucker durch eine Natriumperiodat- Behandlung oxidiert und direkt an Lysinreste auf dem Antikörper über die Bildung einer Schiffbase angebunden (Hurwitz et al., "The Covalent Binding Of Daunomycin And Adriamycin To Antibodies, With Retention of Both Drug And Antibody Activities", Cancer Res. 35: 1175-1181 (1975)). Alternativ wurden Anthracycline mit Antikörpern durch eine Carbodiimid-vermittelte Verknüpfung der Aminogruppe des Anthracyclins mit Carboxylgruppen auf dem Antikörper verknüpft (Hurwitz et al., oben) oder einer Aminoalkylgruppe (Hurwitz et al., "The Effect in vivo of Chemotherapeutic drug-antibody conjugates in two murine experimental tumor systems", Int. J. Cancer 21: 747-755 (1978)). Diese Verknüpfungen werden nicht leicht hydrolysiert und machen es schwer, die Freisetzung des Anthracyclins zu steuern. Anthracycline wurden ebenfalls mit Antikörpern durch ein Quervernetzen des Aminozuckers des Wirkstoffs und von Aminogruppen auf dem Antikörper mit Glut araldehyd verknüpft (Belles-Isles et al., "In Vitro Activity of Daunomycin-Anti-AlphaFetoprotein Conjugate On Mouse Hepatoma Cells", Br. J. Cancer 41, Seiten 841-42 (1980)). Jedoch haben Untersuchungen mit Immunkonjugaten, bei welchen die Aminozuckereinheit des Anthracyclinmoleküls durch eine Verknüpfung mit dem Antikörper modifiziert wurde, einen Verlust der cytotoxischen Aktivität des konjugierten Wirkstoffs gezeigt (Arnon et al., oben, auf den Seiten 7-8). Zusätzlich zeigen Untersuchungen von Anthracyclinanalogen, dass Modifikationen der Anthracycline an ihren Aminozuckern zu einer Abnahme der cytotoxischen Aktivität des Wirkstoffanalogen in Bezug auf den GrundWirkstoff führen (Yamamoto et al., "Antitumor Activity of Some Derivatives of Daunomycin At The Amino And Methyl Ketone Functions", J. Med. Chem. 15: 872-75 (1972)).
  • Noch andere Immunkonjugate wurden hergestellt, bei denen das Anthracyclin DAU an der Kohlenstoff-14(C-14)-Position des Wirkstoffs direkt mit einem Antikörper verknüpft wurde. Jedoch war die selektive cytotoxische Aktivität dieser Immunkonjugate gegenüber Tumorzellen nicht problemlos reproduzierbar und fiel nur bei einer Konzentration von 20 ug/ml gleichmäßig aus (Gallego et al., oben).
  • Die japanische Patentanmeldung 274658 offenbart die Konjugation eines Anthracyclins mit einem Antikörper über eine C-13- Acylhydrazon-Verknüpfung. Diese Konjugation wurde unter Verwendung von Verfahren erreicht, welche eine Derivatisierung des Antikörpers und eine anschließende Reaktion dieses Derivats mit Anthracyclin umfassten. Diese Verfahren sind ungünstig, da eine Derivatisierung des Antikörpers unerwünschte unspezifische Reaktionen mitsichbringt und sehr niedrige Anthracyclin: Antikörper-Verhältnisse ergibt. Gemäß dem ersten Verfahren wurde der Antikörper in Gegenwart von Hydrazin mit Carbodiimid behandelt, um ein Hydrazid- Antikörper-Derivat zu ergeben, welches dann mit dem Anthracyclin derart umgesetzt wurde, dass das Anthracyclin direkt mit der Antikörperstruktur verknüpft war. Die resultierenden Immunkonjugate sind jedoch anfällig für eine Aggregation der Antikörpermoleküle. Weiterhin weisen diese Immunkonjugate, da dieses Verfahren Carboxylgruppe benötigt, welche zahlenmäßig begrenzt sein können, niedrige Anthracyclin. Antikörper-Verhältnisse auf (ungefähr 1,1- 1,3). Das zweite Verfahren beinhaltet ein Umsetzen des Antikörpers mit Succinsäureanhydrid, um ein Hemisuccinat- Derivat des Antikörpers zu ergeben. Dieses Derivat wurde als nächstes mit Hydrazin umgesetzt, um ein Antikörper-Hydrazid- Derivat zu ergeben, welches dann mit dem Anthracyclin, Daunomycin, umgesetzt wurde. Dieser zweite Ansatz leidet daran, dass die Reaktion des Antikörperderivats mit Hydrazin unspezifisch ist, was zu der Produktion einer Mischung von verschiedenen Antikörperderivaten neben dem gewünschten Hydrazidderivat führt. Somit war, wie in der Anmeldung 274658 angegeben ist, das Molverhältnis des Anthracyclins zu dem Antikörper sehr niedrig (ungefähr 1, siehe japanische Anmeldung, Seite 264, Spalte 1). Siehe ebenfalls europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnr. 294294, welche die Konjugation eines C-13-Hydrazonderivats eines Anthracyclins mit der Kohlenhydrateinheit eines Antikörpers offenbart.
  • Andere Anthracyclinhydrazone sind in Tong et al., J. Med. Chem, 21: 732-37 (1978); Smith et al., J. Med. Chem., 21: 280-83 (1978); und Brownlee et al., J. Chem. Soc., Seiten 659-61 (1986) offenbart. Siehe ebenfalls U. S. -Patent 4,112,217, welches Bishydrazone von DAU und ADM offenbart.
  • Bei anderen Untersuchungen wurden Anthracycline mit hochmolekularen Trägern wie z. B. Dextran oder Polyglutaminsäure verknüpft, um die cytotoxische Aktivität zu verstärken und die Toxizität des Wirkstoffs zu verringern (Arnon et al., oben, auf S. 5 und Hurwitz et al., "Soluble Macromolecules As Carriers For Daunorubicin", J. Appl. Biochem. 2, Seiten 25-35 (1980)). Diese trägerverknüpften Anthracycline wurden eben falls kovalent an Antikörper gebunden, die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet waren, um Immunkonjugate zur gezielten Bindung des cytotoxischen Wirkstoffs spezifisch an Tumorzellen zu bilden. Beispielsweise wurde ADM mit einem solchen "anti-Tumor"-Antikörper über eine Carboxyl-Methyl- Dextranhydrazid-Brücke verknüpft, wobei das ADM-Molekül mit einem Hydrazinderivat von Carboxymethyldextran an dem C-13- Carbonyl des ADM verknüpft wurde, um ein Hydrazon zu bilden. Der Antikörper wurde dann mit dem Dextranhydrazidderivat mit Glutaraldehyd verknüpft, um ein Adriamycin-dex-Antikörper- Konjugat zu bilden (Arnon et al., "Monoclonal Antibodies As Carriers For Immunotargeting Of Drugs", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Herausg.), Seiten 365-83 (1985) und Hurwitz et al., "A Conjugate Of Adriamycin And Monoclonal Antibodies To Thy-1 Antigen Inhibits A Human Neuroblastoma Cells In Vitro", Ann. N. Y. Acad. Sci. 417, Seiten 125-36 (1983)).
  • Jedoch bringt die Verwendung von Trägern gewisse Nachteile mit sich. Beispielsweise sind Träger enthaltende Immunkonjugate recht groß und werden in vivo schnell durch das retikuloendotheliale System entfernt (Dillmann et al., "Preclinical Trials With Combinations And Conjugates Of T101 Monoclonal Antibody And Doxorubicin", Cancer Res. 46: 4886-91 (1986)). Dieses schnelle Entfernen der Träger enthaltenden Immunkonjugate kann für die Therapie nachteilhaft sein, da der konjugierte Wirkstoff seine beabsichtigte Wirkungsstelle, d. h. die Zielgruppe der Zellen, welche abgetötet werden sollen, möglicherweise nie erreicht. Zusätzlich kann die Gegenwart des hochmolekularen Trägers die Stabilität des Immunkonjugats negativ beeinflussen, und es wurde gezeigt, dass dieses die Bindungsaktivität des Konjugatantikörpers verringert (Embleton et al., "Antibody Targeting Of Anti- Cancer Agents", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Herausg.), Seiten 323-24 (1985)). Weiterhin gibt es bei Untersuchungen mit Tumorzellen keinen Beweis dafür, dass hochmolekulare Träger enthaltende Immunkonjugate in der Lage sind, die Tumorzellen in vivo zu lokalisieren. (Vergleiche Ford et al., "Localization And Toxicity Study Of A Vindesine-Anti-CEA Conjugate In Patients With Advanced Cancer", Br. J. Cancer 47: 35-42 (1983), welches die Lokalisierung von direkt konjugierten Wirkstoff- Antikörper-Konjugaten an Tumorzellen in vivo zeigt).
  • Somit wurde die Konjugation von Anthracyclinen mit Antikörpern durch die Verwendung spezifischer Verknüpfungen und Träger offenbart. Wie oben ausgeführt wurde, bringt die Verwendung dieser Immunkonjugate verschiedene Nachteile mit sich, die von der verwendeten spezifischen Verknüpfung oder Träger abhängen.
  • Gewisse Liganden-Toxin-Konjugate wurden ebenfalls offenbart. Das U. S. -Patent 4,545,985, welches an Pastan erteilt wurde, offenbart ein Exotoxin-Konjugat, bei welchem Pseudomonas-Exotoxin (PE) mit EGF in einem Verhältnis von 1 : 2 verknüpft ist, um gegen Zellen mit einer großen Anzahl an EGF-Rezeptoren eingesetzt zu werden. EGF-Ricin A- und EGF-Diphtherietoxin- Konjugate wurden ebenfalls erzeugt; Cawley et al., "Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates:" EGF-Ricin A Is A Potent Toxin While EGF-Diphtheria Fragment A Is Nontoxic", Cell 22: 563-70 (1980) und Shimizu et al., "A Cytotoxic Epidermal Growth Factor Cross-Linked To Diphtheria Toxin A-Fragment", FEBS Letters 118 (Nr. 2): 274-78 (1980)). Weiterhin wurden Pseudomonas-Exotoxin-Fusionsproteine hergestellt, wobei Proteine, Polypeptide und Wachstumsfaktoren wie z. B. TGF-α, IL-2, IL-6 und CD4 verwendet wurden (Pastan et al., "Novel Cytotoxic Agents Created By The Fusion Of Growth Factors And Toxin Genes", Fourth Internatl. Conference On Monoclonal Antibody Immunoconiugates For Cancer, S. 36 (30. März - 1. April 1989); Lorberboum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1922-26 (1988); Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4538-42 (1987); Siegall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9738-42 (1988); und Chaudhary et al., Nature, 335: 369-72 (1988)). Ein Fusionsprotein aus Diphtherietoxin und α-melanozytenstimulierendem Hormon wurde erzeugt (Murphy et al., "Genetic Construction, Expression And Melanoma-Selective Cytotoxicity Of A Diphteria Toxin-Related α-Melanocyte-Stimulating Hormone Fusion Protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8258-62 (1986), und U. S. -Patent 4,675,382, erteilt an Murphy). Ligandenkonjugate, die Proteintoxine umfassen, können sich jedoch in xenogenetischen Wirten als immunogen erweisen.
  • Zusätzlich wurden Anthracycline wie z. B. ADM oder DAU chemisch mit gewissen Protein- oder Polypeptidliganden wie z. B. Transferrin (Vereinigtes Königreich, Patentanmeldung, GB 2116979 A) und Melanotropin (Varga et al., "Melanotropin-Daunomycin Conjugate Shows Receptor-Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Melanoma Cells", Nature 267: 56-58 (1977)) verknüpft. Die PCT-Patentanmeldung WO 88/00837 beschreibt EGF, verknüpft über einen polymeren Träger mit einer cytotoxischen Substanz wie z. B. DAU, und die U. S. -Patente 4,522,750 und 4,590,001 beschreiben Transferrin, verknüpft mit einem Vinca-Alkaloid bzw. Platin.
  • Der cytotoxische Wirkstoff, welches in dem Immunkonjugat verwendet werden soll, sollte über einen konditionalen Freisetzungsmechanismus freigesetzt werden, d. h. der cytotoxische Wirkstoff sollte an einer spezifischen Stelle und nicht durch eine allmähliche Hydrolyse an unspezifischer Stelle freigesetzt werden. Es wurde vorgeschlagen, dass bestimmte Immunkonjugate zu Lysosomen transloziert werden (deDuve, "Lysosomes Revisited", Eur. J. Biochem. 137: 391-397 (1983)), welche leicht sauer sind (pH 5,0 bis 5,5) (Poznansky und Juliano, "Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs: A Critical Review", Pharmacol. Rev. 36: 277-336 (1984)). Die Verwendung von sauren Bedingungen zur Freisetunzg konjugierter Wirkstoff, wurde bei der Entwicklung von cis-Aconityl-Linkern an ADM (Shen und Reiser, "Cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin and Macromolecular Carriers: A Model of pH-sensitive Linkage Releasing Drug From a Lysosomotrophic Conjugate", Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048-1054 (1981) und Yang und Reisfeld, "Doxorubicin Conjugates With a Monoclonal Antibody Directed to a Human Melanoma- Associated Proteoglycan Suppresses the Growth of Established Tumor Xenografts in Nude Mice", Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 1189-1193 (1988)) und von Ketal-Linkern an Diphterietoxin (Srinivasachar und Neville, "New Protein Cross-Linking Reagents That Are Cleaved by Mild Acid", Biochemistry 28: 2501- 2509 (1989)) berichtet.
  • Greenfield et al. haben vor kurzem die Bildung von säureempfindlichen Immunkonjugaten, welche die Acylhydrazinverbindung 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid konjugiert über eine Acylhydrazonbindung an die 13-Keto-Position des Anthracyclinmoleküls enthielt, und die Konjugation dieses Anthracyclinderivats mit einem Antikörper- oder Ligandenmolekül beschrieben (Greenfield et al., europäische Patentanmeldung Nr. 328,147, veröffentlicht am 16. August 1989).
  • Die EP-A-0 326 863 beschreibt Verknüpfungsmittel mit der Formel
  • in welcher
  • R¹ für ein Element steht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH&sub2;- und NH&sub2;-NH;
  • R² für ein Element steht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -NH-C(O)-, -C(O)-NH- und -C(O)-;
  • R³ beispielsweise für C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylen steht und
  • R&sup4; ausgewählt ist aus verschiedenen Mercaptogruppen.
  • Die EP-A-0 240 200 beschreibt Quervernetzungsmittel mit der allgemeinen Formel
  • L-S-(CH&sub2;)n-CONH-SPACER-NH-X
  • in welcher
  • L für eine Abgangsgruppe steht, die ausgewählt ist aus -H und -S-Ar, n = 2-4; SPACER ausgewählt ist aus verschiedenen Oxaalkylengruppen, und X ausgewählt ist aus verschiedenen Hydrazid-, Hydrazin-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazid- Resten.
  • Es wäre nützlich, zusätzliche bifunktionelle Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die so strukturiert sind, dass sie eine säureempfindliche Verknüpfung zwischen Molekülen, gezielt bindende und Reagens-Moleküle für eine therapeutische Verwendung in vivo eingeschlossen, zur Verfügung stellen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neue bifunktionelle Verbindungen, welche leicht mit nützlichen Molekülen konjugiert werden können, sowie Verfahren zur Herstellung der bifunktionellen Verbindungen zur Verfügung. Die bifunktionellen Verbindungen enthalten eine reaktive Pyridinyldithio- oder ortho-Nitrophenyldithio-Gruppe. Die Erfindung stellt ebenfalls neue Konjugate, welche cytotoxische Moleküle verknüpft mit den bifunktionellen Verbindungen enthalten, so daß Derivate der cytotoxischen Moleküle gebildet werden, und weitere Konjugate zur Verfügung, welche die cytotoxischen Derivate verknüpft mit einem Molekül enthalten, das in der Lage ist, mit einer Targetzellpopulation, welche abgetötet werden soll, zu reagieren. Dieses gezielt bindende Molekül kann ein Protein wie z. B. ein Antikörper oder ein Ligand wie z. B. Bombesin oder EGF sein.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine neue bifunktionelle Verbindung, 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]- ethyll amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid (Verbindung 11a), synthetisiert und verwendet, um ein Carbazonderivat von ADM zu bilden, das eine Carbazonbindung an der C-13-Position des ADM enthält, welche als die Anbindungsstelle des ADM an die Verbindung 11a dient.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine neue bifunktionelle Verbindung, N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2- butenyl]hydrazincarbothioamid (Verbindung 12), synthetisiert und verwendet, um ein Thiosemicarbazonderivat von ADM zu bilden, welches eine Thiosemicarbazonbindung an der C-13- Position des ADM enthält, welche als die Anbindungsstelle des ADM an die Verbindung 12 dient.
  • Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird eine Anzahl von Molekülen der obigen neuen Anthracyclinderivate mit einem Molekül verknüpft, das gegenüber einer ausgewählten Targetzellpopulation reaktiv ist. Vorzugsweise ist das zellreaktive Molekül ein Antikörper, ein monoklonaler Antikörper. Jedes Anthracyclinderivatmolekül wird mit dem Antikörper über die bifunktionelle Verbindung, welche über eine Carbazon- oder Thiosemicarbazonbindung an der C-13- Position des Anthracyclinmoleküls an das Anthracyclin gebunden ist, verknüpft, um die neuen Immunkonjugate der Erfindung zu bilden. Beispielsweise umfasst eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Synthese eines neuen Adriamycinderivatmoleküls, welches mit einem thiolierten Antikörper kondensiert ist, was zu der Anbindung des Anthracyclins an den Antikörper über die bifunktionelle Verbindung führt. Die Hydrazonbindung, welche an der C-13- Position des ADM gebildet wird, dient als Anbindungsstelle an das ADM. In dieser Ausführungsform ist eine Disulfidbindung innerhalb der bifunktionellen Verbindung vorgesehen, durch welche diese an den Antikörper angebunden wird. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Adriamycinderivatmolekül (ADM gebunden an die bifunktionelle Verbindung) reduziert, um eine Sulfhydrylgruppe zu erzeugen, und das resultierende Derivat wird mit einem mit Maleinimid derivatisierten Antikörper kondensiert. Dieses führt zu der Bildung eines Immunkonjugats mit einer N-substituierten Hydrazonbindung als der Anbindungstelle der bifunktionellen Verbindung an die C-13-Position des ADM und einer Thioetherbindung innerhalb der bifunktionellen Verbindung, durch welche diese an den Antikörper angebunden wird.
  • Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die neuen Anthracyclinderivate kovalent mit Liganden wie z. B. Bombesin, Transferrin oder EGF verknüpft werden, was zu der Anbindung des Anthracyclins an den Liganden über eine bifunktionelle Verbindung führt. Wie bei den anderen oben beschriebenen Ausführungsformen wird das Anthracyclin an die bifunktionelle Verbindung über eine Hydrazonbindung angebunden, welche an der C-13-Position des Anthracyclins gebildet wird. Der Ligand wird vorzugsweise vor der Verknüpfung mit dem Anthracyclinderivat thioliert, dieses kann aber auch direkt an Liganden angebunden werden, welche eine endogene freie Tiolgruppe aufweisen.
  • Wie anhand dieser Ausführungsformen ersichtlich ist, stellt die vorliegende Erfindung neue bifunktionelle Verbindungen und Derivate von Anthracyclinen zur Verfügung, welche bei der Herstellung der Konjugate dieser Erfindung nützlich sind.
  • Die Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung weisen ein Anthracyclin: Antikörper-Molverhältnis von wenigstens 1 : 1 bis 10 : 1, und vorzugsweise von ungefähr 4 : 1 bis 10 : 1 auf und behalten sowohl die Antikörper- als auch die cytotoxische Wirkstoffaktivität für die Abtötung ausgewählter Targetzellen bei. Die Anthracyclin-Liganden-Konjugate, welche hierin beschrieben werden, weisen vorzugsweise ein Anthracyclin- Liganden-Verhältnis von wenigstens 1 : 1 und bis hoch zu 10 : 1, und vorzugsweise von ungefähr 4 : 1 bis 10 : 1 auf. Die säureempfindliche Bindung, welche an der Anbindungsstelle des Anthracyclins an die bifunktionelle Verbindung dieser Konjugate vorgesehen ist, ist ideal geeignet für die Freisetzung von aktivem Wirkstoff unter sauren Bedingungen wie beispielsweise jenen, die typischerweise innerhalb einer Zelle, z. B. in lysosomalen Vesikeln, angetroffen werden.
  • Die Freisetzung von Adriamycin durch eine Hydrolyse jedes der oben genannten Derivate als eine Funktion des pH zeigte, dass die neuen Derivate weitreichende Freisetzungsraten unter sauren, die lysosomale Umgebung nachahmenden Bedingungen. Als Immunkonjugate mit dem monoklonalen anti-Transferrinrezeptor- Antikörper 5E9 erwiesen sich diese Derivate ebenfalls als cytotoxisch.
  • Die bifunktionellen N-substituierten Hydrazinverbindungen enthalten eine Hydrazineinheit und eine reaktive Pyridinyldithio- oder ortho-Nitrophenyldithioeinheit. Diese neuen bifunktionellen Verbindungen können verwendet werden, um eine Vielzahl von Molekülen zur Bildung nützlicher Konjugate zu verknüpfen. Das Molekül, welches mit der Hydrazineinheit der bifunktionellen Verbindung verknüpft werden soll, enthält eine freie Carbonylgruppe oder eine Gruppe, die derivatisiert ist, so dass sie eine Carbonylgruppe enthält, wie z. B. ein cytotoxisches Reagensmolekül. Wenn das Molekül, welches die Carbonylgruppe enthält, mit der Hydrazineinheit der bifunktionellen Verbindung verknüpft wird, wird eine Hydrazonbindung gebildet, welche eine Carbazon- oder eine Thiosemicarbazonbindung ist, was davon abhängt, welche bifunktionelle Verbindung der Erfindung verwendet wird, um das Konjugat zu bilden. Das Molekül, welches mit demjenigen Ende der bifunktionellen Verbindung verknüpft werden soll, das die Pyridinyldithio- oder ortho-Nitrophenyldithioeinheit enthält, besitzt eine freie Sulfhydrylgruppe oder eine Gruppe, die derart derivatisiert werden kann, dass sie eine Sulfhydrylgruppe besitzt, wie z. B. ein Antikörpermolekül oder ein Ligand, welcher vorzugsweise mit Antigenen oder Rezeptoren auf den abzutötenden Targetzellen reaktiv ist. Die Pyridinyldithioeinheit geht während der Reaktion des Antikörpers mit der bifunktionellen Verbindung ab. Das Molekül, welches eine freie Carbonylgruppe enthält, ist vorzugsweise ein cytotoxisches Reagensmolekül wie z. B. ein Anthracyclin, das in der Lage ist, ausgewählte Zellen abzutöten. In einer bevorzugten Ausführungsform erlaubt die Hydrazonbindung, welche das cytotoxische Reagensmolekül mit der bifunktionellen Verbindung verknüpft, eine pH-empfindliche Freisetzung des cytotoxischen Reagenzes.
  • Die Konjugate dieser Erfindung, welche durch ein Verknüpfen der Moleküle mit den bifunktionellen Verbindungen der Erfindung gebildet wurden, können in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden wie beispielsweise jenen, die eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Immunkonjugats der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung der neuen Hydrazinverbindungen für die selektive Abgabe der cytotoxischen Reagenzien an eine ausgewählte Population von Targetzellen, welche man zu eliminieren wünscht, wie auch die Verwendung der neuen Hydrazinverbindungen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines Säugers auf eine pharmazeutisch verträgliche Weise mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der Zusammensetzungen der Erfindung.
  • In vorteilhafter Weise stellen die Verbindungen, Konjugate, pharmazeutischen Zusammensetzungen und Verfahren, welche hierin offenbart sind, einen nützlichen Ansatz zur Verfügung für das gezielte Binden von cytotoxischen Reagenzien an eine ausgewählte Population von Zellen zum bevorzugten Abtöten jener Targetzellen bei der Behandlung von Krankheiten wie z. B. Krebs und anderen Tumoren, nichtcytociden viralen oder anderen pathogenen Infektionen sowie Autoimmunstörungen.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 stellt die Strukturen von Adriamycinderivaten dar, welche durch ein Umsetzen von bifunktionellen Verbindungen mit Adriamycin gebildet wurden, wie in den Beispielen 1-5, unten, beschrieben wird.
  • Fig. 2 stellt in schematischer Form die Synthese der bifunktionellen Verbindung N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxamid dar, welche verwendet wurde, um das Semicarbazonderivat von Adriamycin wie in Beispiel 1, unten, beschrieben herzustellen.
  • Fig. 3 stellt in schematischer Form die Synthese der bifunktionellen Verbindung der Erfindung 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid dar, welche verwendet wurde, um das Carbazonderivat von Adriamycin wie in Beispiel 2, unten, beschrieben herzustellen.
  • Fig. 4 stellt in schematischer Form die Synthese der bifunktionellen Verbindung der Erfindung N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid dar, welche verwendet wurde, um das Thiosemicarbazonderivat von Adriamycin wie in Beispiel 3, unten, beschrieben herzustellen.
  • Fig. 5 stellt in schematischer Form die Synthese der bifunktionellen Verbindung 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethylhydrazincarboxylat dar, welche verwendet wurde, um das Carboxylathydrazonderivat von Adriamycin wie in Beispiel 4, unten, beschrieben herzustellen.
  • Fig. 6 stellt in schematischer Form die Synthese der bifunktionellen Verbindung N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-4- hydrazinobenzamid dar, welche verwendet wurde, um das Arylhydrazonderivat von Adriamycin wie in Beispiel 5, unten, beschrieben herzustellen.
  • Fig. 7 stellt in schematischer Form die Herstellung von Immunkonjugaten unter Verwendung eines Antikörpers dar, der mit SPDP thioliert und mit den bifunktionellen Verbindungen der Erfindung wie in Beispiel 7, unten, beschrieben umgesetzt wurde.
  • Fig. 8 stellt in schematischer Form die Herstellung von Immunkonjugaten unter Verwendung eines Antikörpers dar, der mit 2-IT thioliert und mit den bifunktionellen Verbindungen der Erfindung umgesetzt wurde.
  • Fig. 9 stellt in schematischer Form die Herstellung von Immunkonjugaten dar, welche eine Thioetherverknüpfung zwischen dem Antikörper und der reduzierten bifunktionellen Verbindung aufweisen, wobei ein Antikörper verwendet wurde, der mit SMPB umgesetzt wurde, um Maleinimidgruppen zu addieren.
  • Fig. 10 ist eine graphische Darstellung der Freisetzung von Adriamycin als eine Funktion der Zeit nach der Inkubation der Adriamycinderivate in einem Puffer bei pH 4,5, wie in Beispiel 6, unten, beschrieben wird.
  • Fig. 11 ist eine graphische Darstellung der Freisetzung von Adriamycin als eine Funktion der Zeit nach der Inkubation der Adriamycinderivate in einem Puffer bei pH 5,0, wie in Beispiel 6, unten, beschrieben wird.
  • Fig. 12 ist eine graphische Darstellung der Freisetzung von Adriamycin als eine Funktion der Zeit nach der Inkubation der Adriamycinderivate in einem Puffer bei pH 7,4, wie in Beispiel 6, unten, beschrieben wird.
  • Fig. 13 ist eine graphische Darstellung der Freisetzung von Adriamycin aus dem Carbazonderivat von Adriamycin und aus einem 5E9-Immunkonjugat dieses Derivats als eine Funktion der Zeit nach der Inkubation in einem Puffer bei pH 4,5, wie in Beispiel 7, unten, beschrieben wird.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Damit die hierin offenbarte Erfindung umfassender verstanden werden kann, wird die folgende detaillierte Beschreibung gegeben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue bifunktionelle N-substituierte Hydrazinverbindungen: 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid (Verbindung 11a) und N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid (Verbindung 12). Diese Verbindungen und andere Verbindungen, welche keinen Teil der Erfindung bilden (Verbindungen 10, 13 und 15), werden verwendet, um N-substituierte Hydrazonderivate von cytotoxischen Reagenzien wie z. B. Anthracyclinen zu bilden und, wenn diese mit einem Antikörper verbunden sind, um Immunkonjugate zu bilden. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verfahren zur Herstellung der bifunktionellen Verbindungen, cytotoxische Derivate und Immunkonjugate, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Abgabe von cytotoxischen Reagenzien an Targetzellen, um Krankheiten wie z. B. Krebs und andere Tumoren, nicht-cytocide virale oder andere pathogene Infektionen und Autoimmunstörungen zu behandeln.
  • Die Konjugate umfassen wenigstens ein cytotoxisches Derivatmolekül, welches durch eine der bifunktionellen Verbindungen mit wenigstens einem Molekül verbunden ist, das gegenüber der Targetzellpopulation reaktiv ist. Dieses Molekül kann ein Protein wie z. B. ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, oder ein Ligand wie z. B. Bombesin oder EGF sein.
  • Somit wurde die Verbindung N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl] - hydrazincarboxamid, Verbindung 10, synthetisiert und verwendet, um das Semicarbazonderivat von ADM, welches eine Semicarbazonbindung an der C-13-Position des ADM enthält, zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde die neue Ver bindung 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl] - kohlensäuredihydrazid, Verbindung 11a, synthetisiert und verwendet, um das Carbazonderivat von ADM, welches eine Carbazonbindung an der C-13-Position des ADM aufweist, zu bilden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurde die neue Verbindung N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid, Verbindung 12, synthetisiert und verwendet, um das Thiosemicarbazonderivat von ADM, welches eine Thiosemicarbazonbindung an der C-13-Position von ADM aufweist, zu bilden. Darüber hinaus wurde die Verbindung 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxylat, Verbindung 13, synthetisiert und verwendet, um das Hydrazonderivat von ADM, welches eine Carboxylathydrazonbindung an der C-13-Position des ADM aufweist, zu bilden; und die Verbindung N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-4-hydrazinobenzamid, Verbindung 15, wurde verwendet, um das Arylhydrazonderivat von ADM, welches eine Arylhydrazonbindung an der C-13-Position von ADM aufweist, zu bilden.
  • In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Konjugate, welche wenigstens ein Molekül, das gegenüber einer Targetzellpopulation reaktiv ist, wie z. B. einen Antikörper oder einen Liganden, und wenigstens ein cytotoxisches Molekül, welches Zellen abtötet, durch die neuen bifunktionellen Verbindungen der Erfindung verknüpft enthalten. Somit betrifft die Erfindung gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform Immunkonjugate, welche einen Antikörper enthalten, der gegen eine Targetzellpopulation, z. B. eine Tumorzellpopulation, gerichtet ist, wobei der Antikörper eine Anzahl von Anthracyclinderivatmolekülen aufweist, die mit seiner Struktur verknüpft sind. Die Anthracyclinderivatmoleküle sind kovalent an einen mit Thiolgruppen versehenen Antikörper angebunden, so dass eine Disulfidbindung zwischen jedem Wirkstoffmolekül und einem Antikörper gebildet wird, wobei die bifunktionelle Verbindung an das Anthracyclinderivat durch eine Hydrazonbindung an der C-13-Position des Anthracyclins angebunden ist. Mehr als ein Wirkstoffmolekül kann an jedes Antikörpermolekül angebunden werden, wobei eine bifunktionelle Verbindung der Erfindung pro Wirkstoffmolekül verwendet wird. Ein Molverhältnis von 4 : 1 zeigt an, dass 4 Wirkstoff- (d. h. Anthracyclinderivat)-Moleküle an einen einzelnen Antikörper angebunden sind.
  • Bei einer alternativen Ausführungsform wird das Anthracyclinderivat reduziert, um eine Sulfhydrylgruppe zu schaffen, und dieses ADM-Derivat wird mit einem mit Maleinimid modifizierten Antikörper kondensiert, wobei eine Thioetherverbindung zwischen dem Antikörper und dem Anthracyclin gebildet wird.
  • Diese Konjugate erlauben die pH-empfindliche Freisetzung des nichtmodifizierten AnthracyclinWirkstoffs, so dass strukturelle Modifikationen des Wirkstoffs verhindert werden können, welche zu einer Verringerung der Cytotoxizität führen könnten.
  • Bei noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung Anthracyclin-Liganden-Konjugate, die aus einem Liganden, wie z. B. einem Polypeptid- oder Peptidliganden zusammengesetzt sind, welcher mit einem oder mehreren Rezeptoren reagiert, die mit der Zelloberfläche einer Targetzellpopulation assoziiert sind, wobei der Ligand wenigstens ein Anthracyclinderivatmolekül aufweist, das mit seiner Struktur verknüpft ist. Das Anthracyclin ist kovalent über eine bifunktionelle Verbindung an das Peptid gebunden, welche an das Anthracyclin an der C-13-Position des Anthracyclins über eine Hydrazonbindung angebunden ist. Bei einer alternativen Ausführungsform wird das Anthracyclinderivat reduziert, um eine Sulfhydrylgruppe zu schaffen, und dieses Derivat wird dann mit einem mit Maleinimid modifizierten Liganden kondensiert.
  • Die Konjugate dieser Erfindung können schrittweise hergestellt werden, indem zuerst eine neue N-substituierte Hydrazinverbindung gebildet wird, welche verwendet wird, um ein Hydrazonderivat des cytotoxischen Reagenzes zu bilden, welches dann mit einem Protein oder einem Liganden der geeigneten Spezifität umgesetzt wird (siehe Hardy, "Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry", in Handbook Of Experimental Immunology, Band 1: Immunochemistry, D. M. Weir et al. (Herausg.), Seiten 31.4-31.12 (4. Ausg. 1986) für eine Diskussion der herkömmlichen Antikörper- Kopplungstechniken und Varga et al., oben, für die Herstellung von Ligandenkonjugaten).
  • Die Länge der bifunktionellen Verbindung, welche das cytotoxische Reagens mit dem zellreaktiven Bestandteil des Konjugats verbindet, kann variieren, solange die bifunktionelle Verbindung über eine der vorher erwähnten Hydrazonbindungen an die Carbonylgruppe des cytotoxischen Reagensmoleküls oder der -moleküle angebunden ist.
  • Die cytotoxischen Reagenzien, welche die Konjugate dieser Erfindung umfassen, können beleibige Moleküle sein, die eine Carbonylgruppe enthalten. Solche Reagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Anthracycline: Adriamycin, Daunomycin, Detorubicin, Carminomycin, Idarubicin, Epirubicin, Esorubicin, 4'-THP-Adriamycin, AD-32 und 3'- Deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)doxorubicin (Casazza, "Experimental Studies On New Anthracyclines", in Adriamycin: Its Expanding Role In Cancer Treatment, M. Ogawa et al. (Herausg.), Seiten 439-52 (Excerpta Medica, 1984)).
  • Die Erfindung ist so zu verstehen, dass das zellreaktive Molekül, mit welchem das cytotoxische Reagens in dem Konjugat über die bifunktionelle Verbindung verknüpft ist, ein beliebiges Molekül sein kann, das die Zellpopulation, welche eliminiert werden soll, bindet oder mit dieser reagiert und welches eine Sulfhydrylgruppe besitzt oder so modifiziert werden kann, dass es eine Sulfhydryl- oder Maleinimidgruppe enthält. Solche Moleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Proteine mit großem Molekulargewicht (im allgemeinen größer als 10.000 Dalton) wie z. B. Antikörper, Proteine mit kleinerem Molekulargewicht (im allgemeinen weniger als 10.000 Dalton), Polypeptid- oder Peptidliganden und peptidylfreie Liganden.
  • Von den Immunkonjugaten dieser Erfindung umfasst sind beliebige Antikörper, welche gegenüber einer wunschgemäß zu eliminierenden oder abzutötenden spezifischen Targetzellpopulation reaktiv sind. Beispiele solcher Antikörper umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper, welche an tumorassoziierte Antigene binden, wie z. B. Antigene, die auf Karzinomen, Melanomen, Lymphomen, Knochen- oder Weichgewebesarkomen, wie auch anderen Tumoren gefunden werden, Antikörper, welche an virus- oder andere pathogenassoziierte Antigene binden, und Antikörper, welche an ungewöhnliche Zelloberflächenantigene binden. Diese Antikörper können polyklonal oder, vorzugsweise, monoklonal sein und können hergestellt werden, indem Techniken verwendet werden, die im Stand der Technik wohl etabliert sind (Deweger et al., "Eradication of Murine Lymphoma And Melanoma Cells By Chlorambucil-Antibody Complexes", Immunological Rev. 62: 29-45 (1982) (tumorspezifische polyklonale Antikörper, welche hergestellt und in Konjugaten verwendet wurden); Yeh et al., "Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 2927-31 (1979) und Brown et al., "Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies", J. Immunol. 127 (Nr. 2): 539-46 (1981) (tumorspezifische monoklonale Antikörper wurden hergestellt)). Beispielsweise können der monoklonale Antikörper L6, der für menschliche Lungenkarzinomzellen spezifisch ist, oder der monoklonale Antikörper 791T/36, der für Knochensarkomzellen spezifisch ist, verwendet werden. Weiterhin können nicht-internalisierende oder, vorzugsweise, internalisierende Antikörper verwendet werden. Der Begriff "Antikörper", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, umfasst intakte Antikörpermoleküle oder Fragmente, welche den aktiven Bindungsbereich des Antikörpermoleküls enthalten, z. B. Fab oder F(ab')&sub2;. Wenn monoklonale Antikörper verwendet werden, können die Antikörper aus Mäusen stammen oder menschlichen Ursprungs sein oder chimäre Antikörper sei; sie sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Weiterhin ist die Erfindung so zu verstehen, dass der Begriff "Ligand", wie er hierin verwendet wird, beliebige Moleküle umfasst, welches spezifisch an einen Rezeptor binden, der mit der Zelloberfläche einer Targetzellpopulation assoziiert ist. Bevorzugte Liganden, die verwendet werden können, um die Anthracyclin-Liganden-Konjugate dieser Erfindung zu bilden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Protein-, Polypeptid- oder Peptidliganden wie z. B. Transferrin, den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Bombesin, Gastrin, gastrinausschüttendes Peptid, den aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor, IL-2, IL-6, die Tumorwachstumsfaktoren (TGF)-α und TGF-β, Vaccinia-Wachstumsfaktor (VGF), Insulin und die insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II. Andere peptidylfreie Liganden umfassen Steroide, Kohlenhydrate und Lectine.
  • Somit wirkt das zellreaktive gezielt bindende ("Targeting") Molekül, z. B. der Antikörper oder Ligand des Konjugats dieser Erfindung, unter Abgabe der cytotoxischen Reagensmoleküle an die bestimmte Targetzellpopulation, gegenüber welcher der Antikörper oder Ligand reaktiv ist. Beispielsweise wird ein Antikörper, der gegen ein Antigen gerichtet ist, das auf der Oberfläche von Tumorzellen gefunden wird, an jene Tumorzellen binden und gibt die cytotoxischen Reagenzien an diese ab, oder ein Antikörper, der gegen ein Protein des humanen Immundefizienzvirus (HIV) gerichtet ist, welches AIDS verursacht, wird seine cytotoxischen Reagenzien an HIV-infizierte Zellen abgeben. Da Tumorzellen wie z. B. Karzinome vorzugsweise bestimmte Rezeptoren wie z. B. den EGF-Rezeptor mit hoher Dichte exprimieren, wird ein Ligand wie z. B. EGF in ähnlicher Weise an Karzinomzellen binden und das cytotoxische Reagens an diese abgeben.
  • Eine Freisetzung des cytotoxischen Reagenzes innerhalb oder an dem Ort der bestimmten Zellpopulation, mit welcher der Antikörper oder Ligand reagiert, führt zu der bevorzugten Abtötung jener bestimmten Zellen. Somit ist es ersichtlich, dass die Konjugate dieser Erfindung bei der Behandlung jeglicher Krankheit nützlich sind, bei der eine spezifische Zellpopulation eliminiert werden soll, wobei die Zellpopulation ein Zelloberflächenantigen oder einen Rezeptor aufweist, welche eine Bindung des Konjugats erlauben. Krankheiten, für welche die vorliegenden Konjugate nützlich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Krebs und andere Tumoren, nicht-cytocide virale oder andere pathogene Infektionen wie z. B. AIDS, Herpes, CMV (Cytomegalovirus), EBV (Epstein-Barr- Virus) und SSPE (subakute sklerosierende Panenzephalitis) und rheumatoide Arthritis.
  • Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass die Antikörper- oder Liganden-verknüpften cytotoxischen Reagensmoleküle, d. h. in der Form der Konjugate der Erfindung, über die Antikörper- oder Ligandenspezifität an die Targetzellen, die abgetötet werden sollen, abgegelben werden und dann über denselben Endozytoseweg in die Zelle eintreten können, der zu der Internalisierung von membrangebundenen nicht-konjugierten Antikörpern und Liganden führt (Pastan et al.,, "Pathways Of Endocytosis", in Endocytosis, I. Pastan et al. (Herausg.), Seiten 1-44 (Plenum Press, 1985)). Wenn sie sich innerhalb der Zelle befinden, verschmelzen die Endozytosevesikel, welche das Konjugat enthalten, mit den primären Lysosomen unter Bildung von sekundären Lysosomen (Embleton et al., oben, auf S. 334). Da die cytotoxischen Moleküle über säureempfindliche Hydrazonbindungen an den Antikörper- oder Ligandenbestandteil des Konjugats gebunden sind, führt ein Aussetzen des Konjugats an die saure Umgebung der Endozytosevesikel und Lysosomen zu der Freisetzung des cytotoxischen Reagenzes aus dem Konjugat. Weiterhin wird angenommen, dass das freigesetzte Reagens in der Form eines relativ unmodifizierten Reagenzes vorliegt, das zu einer vollen cytotoxischen Aktivität fähig ist. Somit ist die säureempfindliche Bindung des Konjugats in hohem Maße vorteilhaft für die Freisetzung des cytotoxischen Reagenzes innerhalb der Targetzellen, wobei die Cytotoxizität des Konjugats gegenüber jenen Zellen verstärkt wird. Alternativ kann die Hydrazonbindung unter sauren und reduzierenden Bedingungen in der unmittelbaren. Umgebung außerhalb von oder in der Umgebung der Targetzellen, z. B. an dem Ort eines Tumors, gespalten werden, und der freigesetzte Wirkstoff kann von den Tumorzellen aufgenommen werden.
  • Die neuen bifunktionellen Verbindungen, Derivate der cytotoxischen Reagenzien und Konjugate der Erfindung sowie die Verfahren zu deren Herstellung werden beispielhaft durch bevorzugte Ausführungsformen angegeben, bei welchen das Anthracyclin Adriamycin verwendet wurde. Im allgemeinen wurden Carbonylderivate von Adriamycin hergestellt, indem Adriamycinhydrochlorid mit einer der fünf bifunktionellen Verbindungen der Erfindung in Methanol bei Raumtemperatur behandelt wurde. Es wurde gefunden, dass die Zugabe von katalytischen Mengen an Trifluoressigsäure (TFA) die Kondensationsreaktionen beschleunigte, so dass die Reaktion nach einem Rühren über Nacht abgeschlossen war. Nur wenige Nebenprodukte wurden bei diesen Reaktionen erzeugt, und der Reinigungsvorgang machte lediglich eine Fällung mit Acetonitril notwendig. Diese vereinfachten Verfahren stellen deshalb eine Verbesserung gegenüber jenen dar, die früher von Greenfield et al., oben, berichtet wurden, weil diese leichter durchzuführen, ökonomischer und schneller sind und zusätzliche, neue bifunktionelle Verbindungen zum Konjugieren einer Vielzahl von Molekülen zur Verfügung stellen.
  • Eine bifunktionelle Verbindung wurde hergestellt, indem zuerst Methoxycarbonylsulfenylchlorid mit 2-Aminoethanthiolhydrochlorid, dann mit 2-Mercaptopyridin umgesetzt wurde, um 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethanaminhydrochlorid zu bilden (siehe Fig. 2). Diese Verbindung wurde dann in Gegenwart von Triethylamin (TEA) mit Phosgen, dann mit t-Butylcarbazat umgesetzt, um N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl-2-(tert-butoxycarbonyl)hydrazincarboxamid zu bilden. Das Hydrazincarboxamid wurde als nächstes in TFA gelöst, um N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxamid, Verbindung 10, ein Semicarbazid, zu bilden, welches dann mit Adriamycinhydrochlorid umgesetzt wurde, um das Semicarbazonderivat von ADM zu bilden, welches eine reaktive Pyridinyldithioeinheit enthielt, Verbindung 1, Fig. 1.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde eine neue bifunktionelle Carbazidverbindung hergestellt (Fig. 3). Die Verbindung t-Butylcarbazat wurde mit Triphosgen in Gegenwart von TEA umgesetzt. 2-(2-Pyridinyldithio)ethanaminhydrochlorid wurde dann zugegeben, um 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]-2,2'-bis(tert-butoxycarbonyl)kohlensäuredihydrazid zu bilden. Dieses Zwischenprodukt wurde zu TFA zugegeben, um 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino] - carbonyl]kohlensäuredihydrazid, Verbindung 11a, zu bilden, welche dann zu Adriamycinhydrochlorid zugegeben wurde, um das Carbazonderivat von ADM (Verbindung 2, Fig. 1) zu bilden, welches eine reaktive Pyridinyldithioeinheit enthielt.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurde eine neue bifunktionelle Thiosemicarbazidverbindung gebildet (Fig. 4). In dieser Ausführungsform wurde Kaliumphthalimid mit 1,4-Dibrom-2-buten umgesetzt, um 1-Brom- 4-(N-phthalimido)-2-buten zu bilden. Diese Verbindung wurde mit Kaliumthioacetat umgesetzt, um 1-(Acetylthio)-4-(Nphthalimido)-2-buten zu bilden, welches dann mit Hydrazin umgesetzt wurde und mit Methoxycarbonylsulfenylchlorid gefolgt von 2-Mercaptopyridin behandelt wurde, um 1-Amino-4- [(2-pyridinyl)dithio]-2-butenhydrochlorid zu bilden. Diese Verbindung wurde mit TEA, gefolgt von Di-2-pyridylthionocarbonat vereinigt, dann wurde t-Butylcarbazat zugegeben, um das t-BOC-Derivat von N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]- hydrazincarbothioamid, Verbindung 12, zu bilden. Diese Verbindung wurde in TFA gelöst, um eine Verbindung in Form eines Gummis zu bilden, welche dann mit Adriamycinhydrochlorid und TFA umgesetzt wurde, um das Thiosemicarbazonderivat von ADM zu bilden, welches eine Thiosemicarbazonbindung an der C-13- Position des ADM (Verbindung 3, Fig. 1) und eine reaktive Pyridinyldithioeinheit aufwies.
  • Die Bildung noch einer anderen bifunktionellen Verbindung ist in Fig. 5 gezeigt. Chlorcarbonylsulfenylchlorid wurde mit 2- Mercaptoethanol und 2-Mercaptopyridin umgesetzt. Eine Ammoniumcarbonatlösung wurde zugegeben, um 2-(2-Pyridinyl)dithio)- ethanol als ein farbloses Öl zu bilden. Carbonyldiimidazol wurde zugegeben, und die Mischung wurde mit Hydrazin umgesetzt, um 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethylhydrazincarboxylat, Verbindung 13, zu bilden. Diese Verbindung wurde mit Adriamycinhydrochlorid und TFA und dann mit Acetonitril umgesetzt, um das Carboxylathydrazonderivat von ADM (Verbindung 4, Fig. 1) zu bilden, welches eine Carboxylathydrazonbindung an der C-13-Position des ADM aufwies und eine reaktive Pyridinyldithioeinheit aufwies.
  • Die Synthese einer weiteren bifunktionellen Verbindung ist in Fig. 6 gezeigt. Diese Verbindung wurde hergestellt, indem p- Hydrazinobenzoesäure mit Di-tbutylpyrocarbonat umgesetzt wurde, um 4-(N-BOC-Hydrazino)benzoesäure zu bilden. Diese Verbindung wurde mit N-Hydroxysuccinimid und DCC umgesetzt, um den N-Hydroxysuccinimidester von 4-N-BOC-(Hydrazino)benzoesäure zu ergeben. Dieses Material wurde mit 2-(2-Pyridinyl)dithio)ethanaminhydrochlorid und TEA umgesetzt, um N-[2- (2-Pyridinyl)dithio]ethyl-4-N-BOC-(hydrazino)benzamid zu bilden. Diese Verbindung wurde dann mit TFA behandelt, um N-[2- [(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-4-hydrazinobenzamid, Verbindung 15, zu bilden, welche dann mit Adriamycinhydrochlorid umgesetzt wurde, um das Arylhydrazonderivat von ADM (Verbindung 5, Fig. 1) zu bilden, welches eine Arylhydrazonbindung an der C-13-Position von ADM aufwies und eine reaktive Pyridinyldithioeinheit aufwies.
  • Die neuen oben beschriebenen N-substituierten Hydrazonderivate von ADM wurden verwendet, um die Konjugate der Erfindung zu bilden. Jedes Derivat wurde mit einem monoklonalen Antikörper umgesetzt, welcher vorher mit SPDP oder 2-IT (2-Iminothiolan) thioliert wurde, wie in den Fig. 7 bzw. 8 gezeigt ist. Die resultierenden Immunkonjugate waren aus ADM-Molekülen zusammensetzt, die mit dem monoklonalen Antikörper mittels der bifunktionellen Verbindung, welche an der C-13-Position jedes ADM-Moleküls über eine Hydrazonbindung angebunden war, konjugiert waren. Die bifunktionellen Verbindungen enthielten ebenfalls eine Disulfidbindung, durch welche jede an den Antikörper angebunden war.
  • Die bifunktionelle Verbindung, welche das ADM und den Antikörper verbindet, kann aus einer Reihe von Bestandteilen und Verknüpfungen zusammengesetzt sein, solange wie diese Verknüpfungen eine säureempfindliche Hydrazonbindung an der C- 13-Position des Anthracyclins einschließen. Der Antikörper der bevorzugten Ausführungsformen war der monoklonale Antikörper 5E9.
  • Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die neuen bifunktionellen Verbindungen mit Adriamycin kombiniert, um ein Derivat zu bilden, welches dann weiter mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) oder Tributylphosphin behandelt wird, um ein Adriamycinderivat zu erzeugen, welches eine Sulfhydryl (-SH)-Gruppe an dem Ende der bifunktionellen Verbindung enthält. Dieses Derivat wird dann mit einem monoklonalen Antikörper oder Liganden umgesetzt, an welchem, beispielsweise durch eine Reaktion des Antikörpers mit Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat (SMPB), Maleinimidgruppen angebunden wurden. Ein Immunkonjugat wird gebildet, welches eine bifunktionelle Verbindung angebunden durch eine Hydrazonbindung an die C-13-Position von jedem ADN aufweist und welches eine Thioetherverknüpfung als Teil der Anbindung an den Antikörper aufweist (siehe Fig. 9).
  • Somit ist ersichtlich, dass die bifunktionelle Verbindung, welche das ADM und den Antikörper oder Liganden verbindet, aus einer Reihe von Bestandteilen und Verknüpfungen zusammengesetzt sein kann, solange wie diese Verknüpfungen eine Hydrazonbindung an der 13-Keto-Position des ADM und eine reaktive Pyridinyldithio- oder ortho-Nitrophenyldithiogruppe zum Verbinden mit dem Antikörper einschließen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die neuen ADM- Derivate der Erfindung mit einem Liganden wie z. B. Bombesin, EGF oder Transferrin umgesetzt, wobei der Ligand zuerst derivatisiert worden ist, so dass er Thiolgruppen oder Maleinimidgruppen besitzt. In dem Fall von Bombesin wird ein Cysteinrest an dem Aminoterminus des Peptids eingeführt, um eine reaktive Sulfhydrylgruppe zur Konjugation mit dem ADM-Derivat zur Verfügung zu stellen. In dem Fall von Mäuse-EGl wird das Polypeptid mit SPDP umgesetzt, um eine reaktive Sulfhydrylgruppe zur Konjugation an dem Aminoterminus des Moleküls einzuführen. In dem Fall von Transferrin wird das Protein zuerst mit 2-IT umgesetzt, um reaktive Thiolgruppen auf der Proteinstruktur einzuführen. In jedem Fall wird der mit Thiolgruppen versehene Ligand dann mit dem ADM-Derivat umgesetzt, um ein Anthracyclin-Liganden-Konjugat der Erfindung zu bilden, welches eine bifunktionelle Verbindung zwischen dem Liganden und dem ADM aufweist, wobei die bifunktionelle Verbindung an die C-13-Position jedes Anthracyclinmoleküls über eine Hydrazonbindung angebunden ist.
  • Es ist ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung neue Hydrazonderivate von Anthracyclinen mit der folgenden allgemeinen Formel I:
  • worin:
  • R&sub1; für NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
  • NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
  • NCONHNHCONH(CH&sub2;)nS-H; oder
  • NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nS-H steht;
  • worin R&sub8; für
  • oder
  • steht;
  • X für H, NO&sub2; oder Halogen steht;
  • Ar für
  • steht; und
  • m, n ganze Zahlen von 1 bis 10 sind, welche gleich oder verschieden sein können;
  • R&sub2; für CH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;OCO(CH&sub2;)&sub3;CH&sub3; oder CH&sub2;OCOCH(OC&sub2;H&sub5;)&sub2; steht;
  • R&sub3; für OCH&sub3;, OH oder Wasserstoff steht;
  • R&sub4; für NH&sub2;, NHCOCF&sub3;, 4-Morpholinyl, 3-Cyano-4-morpholinyl, 1- Piperidinyl, 4-Methoxy-1-piperidinyl, Benzylamin, Dibenzylamin, Cyanomethylamin oder 1-Cyano-2-methoxyethylamin steht;
  • R&sub5; für OH, O-THP oder Wasserstoff steht; und
  • R&sub6; für OH oder Wasserstoff steht, mit der Maßgabe, dass R&sub6; nicht für OH steht, wenn R&sub5; für OH oder O-THP steht;
  • und Formel II zur Verfügung stellt:
  • worin:
  • R&sub1; für NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
  • NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
  • NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nS-H; oder
  • NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nS-H steht;
  • worin R&sub8; für
  • oder
  • steht;
  • X für H, NO&sub2; oder Halogen steht;
  • Ar für
  • steht; und
  • m, n ganze Zahlen von 1 bis 10 sind, welche gleich oder verschieden sein können;
  • R&sub2; für CH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;OCO(CH&sub2;)&sub3;CH&sub3; oder CH&sub2;OCOCH(OC&sub2;H&sub5;)&sub2;, steht;
  • R&sub3; für OCH&sub3;, OH oder Wasserstoff steht;
  • R&sub4; und R&sub7; unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, substituiertes Cycloalkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl oder substituiertes Aralkyl stehen; oder R&sub4;, R&sub7; und N zusammen einen 4 bis 7-gliedrigen Ring bilden, wobei der Ring gegebenenfalls substituiert sein kann;
  • R&sub5; für OH, O-THP oder Wasserstoff steht; und
  • R&sub6; für OH oder Wasserstoff steht, mit der Maßgabe, dass R&sub6; nicht für OH steht, wenn R&sub5; für OH oder O-THP steht.
  • Die oben offenbarten bifunktionellen Verbindungen und die Nsubstituierten Hydrazonderivate von Anthracyclin sind neue Verbindungen. Die Hydrazonderivate von Anthracyclin können als neue cytotoxische Reagenzien verwendet werden und stellen ebenfalls Zwischenprodukte bei der Herstellung der neuen Konjugate der Erfindung dar. Die Hydrazonderivate von Anthracyclin werden beispielhaft durch Adriamycincarbazon bzw. Adriamycinthiosemicarbazon veranschaulicht, wie in den hierin diskutierten bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird.
  • Wie man aus den obigen Formeln sehen kann, umfassen die Nsubstituierten Hydrazon-ADM-Derivate der Erfindung N-substituierte Hydrazone von beliebigen einer Reihe bekannter Anthracycline wie z. B. Adriamycin, Daunomycin und Carminomycin. Zusätzlich umfassen die Derivate N-substituierte Hydrazone, die an bestimmten Stellen der Anthracyclinstruktur derivatisiert sind (z. B. 4'-THP-Adriamycinhydrazon und 3'-Deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)adriamycinhydrazon). Diese letzteren Derivate können synthetisiert wer den, indem zuerst das Anthracyclin derivatisiert wird, um ein gewünschtes Analoges zu bilden, und dann dieses Analoge verwendet wird, um die N-substituierten Hydrazonderivate der Erfindung herzustellen. Bekannte Anthracyclinanaloge umfassen jene, die in den U. S. -Patenten Nr. 4,464,529 und 4,301,277 (3'-Deamino-3'-(4-morpholinyl)- oder 3'-Deamino-3'-(3-cyano- 4-morpholinyl)-Anthracyclinanaloge), U. S. -Patenten Nr. 4,202,967 und 4,314,054 (3'-Deamino-3'-(1-piperidinyl)- oder 3'-Deamino-3'-(4-methoxy-1-piperidinyl)-Anthracyclinanaloge), U. S. -Patent Nr. 4,250,303 (N-Benzyl- oder N,N-Dibenzyl- Anthracyclinanaloge), U. S. -Patent Nr. 4,591,637 (N-Methoxymethyl- oder N-Cyanomethyl-Anthracyclinanaloge) und U. S. -Patent Nr. 4,303,785 (Acetalanaloge von Anthracyclinen) beschrieben werden. Somit können diese bekannten Anthracyclinanalogen wie vorstehend beschrieben umgesetzt werden, um neue Hydrazonderivate von ADM herzustellen, welche dann mit einem zellreaktiven Molekül wie z. B. einem Antikörper oder Liganden mit einer gewünschten Spezifität, wie oben beschrieben wurde, konjugiert werden können.
  • Alternativ kann ein nicht derivatisiertes N-substituiertes Hydrazonderivat dieser Erfindung zuerst wie hierin beschrieben aus dem nicht derivatisierten Anthracyclin wie z. B. Adriamycin, Daunomycin oder Carminomycin hergestellt werden, und dieses neue Derivat kann dann derivatisiert werden, um ein neues N-substituiertes Hydrazon herzustellen, das wie gewünscht substituiert ist. Beispielsweise kann das Semicarbazon-ADM-Derivat an seiner Aminozuckereinheit durch eine reduktive Aminierung mit 2,2'-Oxydiacetaldehyd derivatisiert werden, wobei das Verfahren verwendet wird, das in dem U. S. - Patent 4,464,529 beschrieben wird, um das Semicarbazen von 3'-Deamino-3'-(4-morpholino)anthracyclin herzustellen. Zusätzlich können die N-substituierten Hydrazonderivate an der R&sub5;-Position der Formeln I und II derivatisiert werden, wie in dem U. S. -Patent 4,303,785 beschrieben wird, um Acetalderivate des Hydrazons wie z. B. 4'-THP-ADM-N-substituiertes Hydrazon herzustellen.
  • Die Erfindung ist so zu verstehen, dass diese Verfahren zum Derivatisieren der Hydrazone der Erfindung als Ausgangsmaterialien N-substituierte Hydrazone anderer Reagenzien, einschließlich verschiedener chemotherapeutischer Mittel, verwenden können. Daneben können Anthracycline außer ADM wie z. B. Daunomycin oder Carminomycin verwendet werden, um neue Verbindungen wie z. B. ein N-Benzyl-Daunomycin-Nsubstituiertes -ydrazon oder ein 3'-Deamino-3'-(4- morpholinyl)-Carminomycin-N-substituiertes Hydrazon und andere Verbindungen herzustellen, wobei die anderen Derivate verwendet werden, welche ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung liegen.
  • Die Anthracyclinderivate der vorliegenden Erfindung wurden auf die Freisetzungsraten des Wirkstoffs Adriamycin hin bei pH-Werten von 4,5, 5,0 und 7,4 ausgewertet und zeigten einen weiten Bereich an Freisetzungsraten. Zusätzlich wurden die Immunkonjugate, welche die Derivate konjugiert mit einem monoklonalen Antikörper umfassten, auf die Freisetzung von Adriamycin bei einem pH von 4,5 hin ausgewertet. Die Immunkonjugate wurden auf die Cytotoxizität hin getestet, wobei Daudi-Zellen in dem Koloniebildungs-Inhibitions-Test verwendet wurden und eine Korrelation zwischen der Stabilität der Hydrazonderivate aufgezeigt wurde. Die Immunkonjugate zeigten ebenfalls einen weiten Bereich von Freisetzungsraten und zeigten eine durch den Antikörper dirigierte Zellabtötung (Cytotoxizität) von Tumorzellen in dem Koloniebildungstest.
  • Die N-substituierten Hydrazinverbindungen der Erfindung stellen nützliche bifunktionelle Verbindungen zur Verknüpfung von Molekülen wie z. B. gezielt bindenden und cytotoxischen Reagenzien zur Verfügung. Wenn sie verwendet werden, um cytotoxische Moleküle zu verknüpfen, welche eine Carbonylgruppe enthalten, stellen die bifunktionellen Verbindungen eine säureempfindliche Verknüpfung zur Verfügung, die innerhalb eines pH-Bereichs gespalten wird, in dem das cytotoxische Reagens freigesetzt wird. Die Anthracyclin-Immunkonjugate dieser Erfindung scheinen eine Verbesserung gegenüber den Immunkonjugaten zu sein, von denen früher berichtet wurde, bei welchen die Anthracycline direkt mit den Antikörpern über die Aminozuckereinheit des Anthracyclins verknüpft waren, da diese Aminozucker-verknüpften Konjugate oft niedrigere Molverhältnisse von Anthracyclin zu Antikörper enthalten, weniger wirksam sind als freies ADM und verringerte Antikörper- Bindungseigenschaften zeigen (Arnon et al., Immunological Rev. 62, oben; Hurwitz et al., Cancer Res. 35, oben, und Yamamoto et al., oben). Weiterhin haben Stabilitätsuntersuchungen, die an den Immunkonjugaten dieser Erfindung durchgeführt wurden, gezeigt, dass das Anthracyclin unter sauren Bedingungen aus den Immunkonjugaten freigesetzt wurde, welche denen ähnlich waren, die in einer zellulären Umgebung gefunden wurden. Somit können die Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung relativ unmodifizierter Wirkstoff zur Abgabe an die Targetzellen freisetzen. Die hierin beschriebenen Konjugate sorgen für die Freisetzung des Wirkstoffs in einem weiten Bereich von pH-Werten, was für die Wirkstoffabgabe vorteilhaft sein kann.
  • Die bifunktionellen Verbindungen, Immunkonjugate der Erfindung und Verfahren zu deren Herstellung werden beispielhaft durch bevorzugte Ausführungsformen dargestellt, bei welchen Derivate des Anthracyclins Adriamycin mit dem monoklonalen anti-Transferrinrezeptor-Antikörper 5E9 konjugiert wurden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, Kombinationen und Verfahren zur Behandlung von Krankheiten wie z. B. Krebs und anderen Tumoren, nichtcytociden viralen oder anderen pathogenen Infektionen, und Autoimmunkrankheiten. Insbesondere umfasst die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Krankheiten bei Säugetieren, wobei eine pharmazeutisch wirksame Menge von wenigstens einem Anthracyclin-haltigen Konjugat auf eine pharmazeutisch verträgliche Weise an den Wirtssäuger verabreicht wird.
  • Alternative Ausführungsformen der Verfahren dieser Erfindung umfassen die Verabreichung, entweder gleichzeitig oder nacheinander, einer Reihe verschiedener Konjugate, d. h. welche unterschiedliche cytotoxische Reagenzien oder unterschiedliche Antikörper oder Liganden aufweisen, zur Verwendung in Verfahren der Kombinationschemotherapie. Beispielsweise kann eine Ausführungsform dieser Erfindung die Verwendung einer Reihe von Anthracyclin-Immunkonjugaten beinhalten, wobei die Spezifität des Antikörperbestandteils des Konjugats variiert, d. h. eine Reihe von Immunkonjugaten verwendet wird, wobei jedes einen Antikörper aufweist, der spezifisch an ein anderes Antigen oder an unterschiedliche Stellen oder Epitope auf demselben Antigen bindet, das auf der interessierenden Zellpopulation vorhanden ist. Der Anthracyclinbestandteil dieser Immunkonjugate kann derselbe sein oder kann variieren. Beispielsweise kann diese Ausführungsform bei der Behandlung von gewissen Tumoren besonders nützlich sein, wo die Mengen der verschiedenen Antigene auf der Oberfläche eines Tumors unbekannt sind oder die Tumorzellpopulation in Bezug auf die Antigenexpression heterogen ist und man sicher sein möchte, dass eine ausreichende Menge des Wirkstoffs gezielt zu allen Tumorzellen am Ort des Tumors gebracht wird. Die Verwendung einer Reihe von Konjugaten, welche unterschiedliche Antigen- oder Epitop-Spezifitäten für den Tumor aufweisen, erhöht die Wahrscheinlichkeit, ausreichend Wirkstoff am Ort des Tumors zu erhalten. Zusätzlich ist diese Ausführungsform wichtig, um ein hohes Ausmaß an Spezifität für den Tumor zu erreichen, da die Wahrscheinlichkeit, dass normales Gewebe all dieselben tumorassoziierten Antigene besitzt, klein ist (cf. Hellstrom et al., "Monoclonal Antibodies to Two Determinants of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement- Dependent Cytotoxicity", J. Immunol., 127 (Nr. 1), Seiten 157-160 (1981)).
  • Alternativ kann eine Reihe unterschiedlicher Immunkonjugate verwendet werden, wobei nur der Anthracyclinbestandteil des Konjugats variiert. Beispielsweise kann ein bestimmter Antikörper mit Adriamycin verknüpft werden, um ein Immunkonjugat zu bilden, und kann mit Daunomycin verknüpft werden, um ein zweites Immunkonjugat zu bilden. Beide Konjugate können dann einem Wirt, welcher behandelt werden soll, verabreicht werden, und diese werden sich aufgrund der Spezifität des Antikörpers am Ort der ausgewählten Zellpopulation, welche eliminiert werden soll, konzentrieren. Beide Wirkstoffe werden dann an diesem Ort freigesetzt. Diese Ausführungsform kann wichtig sein, wenn es eine gewisse Unsicherheit im Hinblick auf die Wirkstoffresistenz einer bestimmten Zellpopulation wie z. B. eines Tumors gibt, da dieses Verfahren die Freisetzung einer Reihe unterschiedlicher Wirkstoffe an dem Ort oder innerhalb der Targetzellen erlaubt. Eine weitere Ausführungsform umfasst die Konjugation von mehr als einem Typ von Anthracyclin mit einem bestimmten Antikörper, um ein Immunkonjugat zu bilden, das eine Vielzahl von verschiedenen Anthracyclinmolekülen entlang seiner Oberfläche aufweist, welche alle mit dem Antikörper über eine 13-Keto- Hydrazonbindung verknüpft sind. Die Verabreichung des Immunkonjugats dieser Ausführungsform führt zu der Freisetzung einer Reihe unterschiedlicher Wirkstoffe an dem Ort oder innerhalb der Targetzellen. Weiterhin kann eine Kombination von Anthracyclin-Liganden-Konjugaten verwendet werden, wobei der Wirkstoff gezielt an eine Zellpopulation abgegeben werden kann, welche ein spezifisches Antigen wie auch einen Rezeptor für einen spezifischen Liganden auf ihrer Oberfläche trägt. Wieder kann ein Typ von Anthracyclin oder eine Reihe verschiedener Wirkstoffe bei dieser Kombinationstherapie verwendet werden.
  • Die Konjugate der Erfindung können in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, wobei herkömmliche Verabreichungsarten verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine intravenöse, intraperitoneale, orale, intralymphatische oder direkte Verabreichung an den Ort einer ausgewählten Zellpopulation wie z. B. einen Tumor.
  • Die intravenöse Verabreichung ist bevorzugt. Im Fall der Immunkonjugate, kann es für eine Behandlung in vivo nützlich sein, Konjugate zu verwenden, welche Antikörperfragmente wie z. B. Fab oder F(ab')&sub2; oder chimäre Antikörper umfassen.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, welche die Konjugate umfassen, können in einer Vielzahl von Dosierungsformen vorliegen, welche einschließen, aber nicht beschränkt sind auf feste, halbfeste und flüssige Dosierungsformen wie z. B. Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Zäpfchen, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Liposomen und injizierbare oder infundierbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der Art der Verabreichung und der therapeutischen Anwendung ab.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls herkömmliche pharmazeutisch verträgliche Träger, welche im Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. Serumproteine wie beispielsweise Humanserumalbumin, Puffersubstanzen wie beispielsweise Phosphate, Wasser oder Salze oder Elektrolyte einschließen.
  • Die wirksamste Art der Verabreichung und der Dosierungsweise für die Konjugatzusammensetzungen dieser Erfindung hängt von der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, der Gesundheit des Patienten und seinem Ansprechen auf die Behandlung und von der Einschätzung des behandelnden Arztes ab. Demgemäß sollten die Dosierungen der Konjugate und jeglicher begleitenden Verbindungen auf den einzelnen Patienten eingestellt werden. Nichtsdestotrotz kann eine wirksame Dosis des Anthracyclin- Immunkonjugats dieser Erfindung in dem Bereich von ca. 1 bis ca. 100 mg/m² Anthracyclin oder von ca. 500-5000 mg/m² Antikörper liegen. Eine wirksame Dosis des Anthracyclin-Liganden- Konjugats kann in dem Bereich von ca. 1 bis ca. 100 mg/m² Anthracyclin oder von ca. 1 bis ca. 100 mg/m² Ligand liegen.
  • Damit die hierin beschriebene Erfindung umfassender verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele gegeben. Verständlicherweise dienen diese Beispiele nur zu Zwecken der Veranschaulichung und sollen nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang dieser Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
    • BEISPIELE Herstellung der Bifunktionellen Verbindungen und Derivate von Adriamycin (ADM)
  • Die Schmelzpunkte (MP) wurden auf einem Fisher-Johns-Schmelzpunktgerät (Medford, MA) bestimmt und sind unkorrigiert. Die Kernmagnetresonanz- (NMR)-Spektren wurden auf einem Brucker AM 300-Instrument erhalten. Die Infrarot- (IR)-Spektren wurden als KBr-Preßlinge oder CHCl&sub3;-Lösungen auf einem P-E-FTIR- (Fourrier-Transformations-Infrarot)-Instrument (Norwalk, CT), Modell 1800, aufgenommen. Das MS (Massenspektrum) und HRMS (hochaufgelöstes Massenspektrum) wurden mit Kratos MS25RFA- bzw. MS50TC-Instrumenten (Manchester, England) erhalten. Die Flashchromatographie wurde durchgeführt, indem ein Silicagel (Silica 32-63) von Woelm (Atlanta, GA) verwendet wurde. Die Dünnschichtchromatographie (DSC) wurde auf Silicagel-GHLF- Platten oder RPS-F-Umkehrphasenplatten von Analtec (Newark, DE), beide mit 250 Mikron, durchgeführt. Für eine routinemäßige Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wurden eine P-E-Pumpe, Serie 4 LC, ein HP 1046A-Fluoreszenzdetektor und eine IB-Sil-5C18-Säule (150 · 4,6 mm) von Phenomenex (Torrance, CA) verwendet. Die mobile Phase war ein 70 : 30 Methanol-Phosphat-Puffer (50 mmol Ammoniumphosphat, pH 4,4) bei einer Flußgeschwindigkeit von 1,5 ml/min. Für Messungen der Freisetzungsrate umfasste das HPLC-System zwei Waters- Pumpen, Modell 510, einen Autosampler, Modell 712, und ein Gradienten-Steuergerät, Modell 680. Die Chromatographie wurde auf einer Waters-C-18-Säule durchgeführt, und die mobile Phase war eine 68 : 32-Mischung von Triethylammoniumformiat- Puffer (0,05 M, pH 2,8) bzw. Acetonitril. Die Fluoreszenz des eluierten Adriamycins wurde nachgewiesen, indem ein ABI- Fluoreszenzdetektor, Modell 980 (Anregung 254 nm; Emission 550 nm), der von Applied Biosystems, Ramsey, NJ, erhalten wurde, verwendet wurde. Acetatpuffer wurde für pH 4,5 und 5,0 verwendet; Phosphatsalzlösungspuffer wurde für pH 7,4 verwendet. Adriamycin-HCl wurde von der Sanraku Inc. (Japan) erhalten. Alle anderen Chemikalien wurden im Handel erhalten. Die Elementaranalysen wurden in der analytischen Abteilung der Bristol-Myers Squibb Company, Wallingford, CT und bei Oneida Research Services durchgeführt.
    • BEISPIEL 1 Herstellung der Bifunktionellen Verbindung 10 und des Semicarbazonderivats von ADM
  • Das folgende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer bifunktionellen Verbindung und eines Semicarbazonderivats von ADM, welches eine Semicarbazonbindung an der C- 13-Position von ADM aufweist. In diesem Beispiel wird N-[2- [(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxamid, Verbindung 10, durch die Reaktionsfolge hergestellt, welche in. Fig. 1 gezeigt ist. Ein Umsetzen von Cysteaminhydrochlorid mit Methoxycarbonylsulfenylchlorid gefolgt von 2-Mercaptopyridin ergab 2-(2-Pyridinyl)dithioethanaminhydrochlorid (Verbindung 9 in Fig. 1). Dieses wurde wiederum mit Phosgen und t- Butylcarbazat gefolgt von Trifluoressigsäure (TFA) umgesetzt, um das gewünschte Produkt (Verbindung 10) zu ergeben.
    • Herstellung von 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethanaminhydrochlorid
  • Eine Lösung von Methoxycarbonylsulfenylchlorid (Zumach et al., Angew Chem. International Edit. 9: 54-63 (1970), (6,33 g, 50 mmol) in Methanol vom HPLC-Grad (100 ml) wurde unter N&sub2; gerührt und in Eis abgeschreckt. Zu diesem wurde eine Lösung von 2-Aminoethanthiolhydrochlorid (5,7 g, 50 mmol) in Metha nol (50 ml) tropfenweise zugegeben. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde die Lösung für 2 'h bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann verdampft und das restliche Öl aus Aceton (100 ml) kristallisiert, um einen Feststoff (6,9 g) zu ergeben. Dieser Feststoff wurde in Methanol (100 ml) gelöst. Die Lösung wurde in Eis abgeschreckt, unter 1% gerührt und tropfenweise mit einer Lösung von 2-Mercaptopyridin (3,82 g, 34 mmol) in Methanol (50 ml) behandelt. Die Lösung wurde für 1 h bei RT gerührt, auf ein kleines Volumen konzentriert und langsam mit Aceton verdünnt, bis eine Kristallisation auftrat. Nach 1 h im Kühlschrank wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und getrocknet, um die Verbindung 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethanaminhydrochlorid (Verbindung 9) zu ergeben. Diese Verbindung wurde von Field et al., J. Org, Chem. 29: 1632-1635 (1964) und Connor und Schroit, Biochem. 27: 848-851 (1988) beschrieben. Die Verbindung wurde wie folgt charakterisiert: Smp. 123-5º (5,8 g, 52%). IR (KBr) 2952, 2913, 1610, 1575, 1559, 1451, 1115, 767 cm&supmin;¹. NMR (D&sub2;O) δ 8,46, 7,83, 7,34 (d, m, m 4H, Py), 3,37 (t, 2H, CH&sub2; CH&sub2; NH&sub2;), 3,12 (t, 2H, SCH&sub2; CH&sub2;). MS (m/e): 187 (entspricht [M+H]&spplus;) 170, 152, 142, 112, 104, 76.
  • Analyse: berechnet für C&sub7;H&sub1;&sub1;ClN&sub2;S&sub2;·1/4 H&sub2;O: C, 37,00, H, 5,06, N, 12,33. Gefunden: C, 36,82, H, 4,99, N, 12,37.
    • Herstellung von N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-2-(tert-butoxycarbonyl)hydrazincarboxamid
  • 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethanaminhydrochlorid (2,22 g, 10 mmol) wurde in trockenem Methylenchlorid (100 ml) suspendiert und mit Triethylamin (TEA) (5,8 ml) behandelt. Diese Lösung wurde tropfenweise zu einer eiskalten gerührten Lösung von Phosgen (10 ml einer 1,93 M Toluollösung) in Methylenchlorid (200 ml) zugegeben. Die Reaktion wurde durch DSC überwacht und, wenn kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden war, wurde N&sub2; für eine Weile durch die Mischung geleitet. Dann wurde t- Butylcarbazat (1,32 g, 10 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht rühren gelassen. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde über Silica chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methylenchlorid. Methanol (100 : 2) verwendet wurde. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt, um 1,74 g N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-2-(tert-butoxycarbonyl)- hydrazincarboxamid (Verbindung 9a) als einen Schaum zu ergeben, welcher wie folgt charakterisiert wurde: IR (KBr) 3281, 2979, 2932, 1723, 1672, 1577, 1560, 1545, 1448, 19 : 19, 1253, 1161, 762 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;) δ 8,50, 7,56, 7,51, 7,12 (4H, Py), 3,51 (2H, CH&sub2;), 2,89 (2H, CH&sub2;S), 6,84, 6,37, 6,17 (3H, NH), 1,44 (9H), (CH&sub3;)&sub3;C). MS (m/e) 345 (entspricht [M+H]&spplus;), 317, 289, 245, 213, 178, 134, 112.
    • Herstellung von N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxamid
  • N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-2-(tert-butoxycarbonyl)- hydrazincarboxamid (570 mg, 1,66 mmol) wurde in eiskalter TFA (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde für 10 min in Eis und für weitere 10 min ohne Kühlen gerührt. Der Überschuß an TFA wurde unter vermindertem Druck soweit wie möglich verdampft, und der Rückstand wurde über Silica chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methylenchlorid : Methanol : konzentriertem Ammoniumhydroxid (100 : 5 : 0,5) verwendet wurde. Die passenden Fraktionen wurden gemäß der DSC vereinigt und das Lösungsmittel verdampft, wobei ein kristalliner Rückstand (0,42 g, quantitativ) zurückgelassen wurde. Eine Analyseprobe wurde hergestellt, indem aus IPA kristallisiert wurde, Smp. 105-7º. N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxamid (Verbindung 10) wurde wie folgt charakterisiert: IR (KBr) 3336, 3220, 3064, 2949, 2934, 1670, 1623, 1575, 1562, 11-33, 1452, 1369, 1172, 1046, 770 cm&supmin;¹. NMR (CD&sub3;OD) δ 8,41, 7,78, 7,21 (4H, Py), 3,43 (2H, NCH&sub2;), 2,91 (2H SCH&sub2;). MS (m/e) 245 (entspricht [M+H]&spplus;0, 221, 213, 162, 134, 112.
  • Analyse: Berechnet für C&sub8;H&sub1;&sub2;N&sub4;OS&sub2;: C, 39,32, H, 4,95; N, 22,93; S, 26,24. Gefunden, C 39,19; H, 4,86; N, 22,48; S, 25,02.
    • Herstellung des Semicarbazonderivats von Adriamycinhydrochlorid und N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]hydrazincarboxamid
  • Verbindung 10 (0,37 g, 1,5 mmol) in Methanol (25 ml) wurde zu einer gerührten Suspension von Adriamycinhydrochlorid (0,66 g, 1,14 mmol) in Methanol (50 ml) zugegeben. TFA (5 Tropfen) wurde zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht rühren gelassen. Die klare Lösung wurde konzentriert und über eine C-18-Säule chromatographiert, wobei als Lösungsmittelsystem Methanol : Wasser (60 : 40), das 0,3% Ammoniumacetat enthielt, verwendet wurde. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt und das Methanol soweit wie möglich verdampft. Die wässrige Phase wurde gefriergetrocknet, und der Rückstand wurde in Methanol gelöst und zu Acetonitril zugegeben. Der rote Feststoff wurde durch Zentrifugation gesammelt und gearocknet. (0,65 g, 68%). Das Semicarbazonderivat von ADM wurde wie folgt charakterisiert: IR (KBr) 3399, 2976, 2936, 1671, 1618, 1578, 1538, 1417, 1286, 1210, 1117, 1015, 989, 764 cm&supmin;¹. NMR (CD&sub3;OD) δ 8,25, 7,76, 7,62, 7,48, 7,07 (py, ph, H), 4,95 (anomeres H), 4,63 (CH&sub2;OH), 4,24 (CH&sub3;CH), 3,97 (OCH&sub3;), 3,5 - 2,9 (Clusterabsorption von SSCH&sub2;, -CH&sub2;-, CH&sub2;-NH), 1,29 (HC- CH&sub3;). MS (m/e) 770 (entspricht [M+H]&spplus;), 641, 437, 346. HRMS: Berechnet C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub0;N&sub5;O&sub1;&sub1;S&sub2;: 770,2166; Gefunden: 770,2157.
    • BEISPIEL 2 Herstellung der Bifunktionellen Verbindung 11a und des Carbazonderivats von ADM
  • Das folgende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer bifunktionellen Carbazidverbindung und des Carbazonderivats von ADM, das eine Carbazonbindung an der C-13- Position von ADM aufweist. In diesem Beispiel wurde die Reaktion zwischen 2-[(2-(Pyridinyl)dithio]ethanaminhydrochlorid und t-Butylcarbazat, welche in Fig. 2 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist, mit t-Butylcarbazat und Triphosgen gestartet, wie in Fig. 3 gezeigt ist, um eine bifunktionelle Verbindung (Verbindung 11a), ein Carbazid, zu ergeben. In diesem Fall wurde überschüssiges t-Butylcarbazat mit Phosgen umgesetzt, um das Kohlensäuredihydrazid zu ergeben.
    • Herstellung von 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]-2,2'-bis(tert-butoxycarbonyl)kohlensäuredihydrazid
  • t-Butylcarbazat (0,396 g, 3 mmol) wurde in trockenem Chloroform (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde unter N&sub2; bei RT gerührt und TEA wurde zugegeben (0,6 g, 6 mmol). Darauf folgte die Zugabe von Triphosgen (0,296 g, 1 mmol), alles auf einmal. Eine kräftige Reaktion folgte und, als diese nachließ, wurde 2-(2-Pyridinyldithio)ethanaminhydrochlorid (0,667 g, 3 mmol) in Chloroform, das TEA (0,3 g, 3 mmol) enthielt, zugegeben. Die Mischung wurde für 1 1/2 h bei RT gerührt, dann mit Wasser (3 · 20 ml) gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft, wobei ein Schaum (0,91 g) zurückgelassen wurde. Dieses Material wurde über Silica chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methylenchlorid : Methanol (100 : 2) verwendet wurde. Die Fraktionen wurden durch DSC überwacht und entsprechend vereinigt, um die Verbindung 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]- 2,2'-bis(tert-butoxycarbonyl)kohlensäuredihydrazid (Verbindung 11) als einen Schaum (0,54 g, 52%) zu ergeben. Verbindung 11 wurde wie folgt charakterisiert: IR (KBr) 3302, 2980, 2933, 1726, 1683, 1498, 1252, 1160, 1047, 1018, 763 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;) δ 8,50, 7,57, 7,49, 7,10, (d, q, d, t, 4H, Py), 3,52 (t, 2H, SSCH&sub2;), 2,90 (t, 2H CONd&sub2;), 1,46 [C(CH&sub3;)&sub3;], 8,30, 6,50, 6,29 (b, s, s, NH). MS (m/e) 503 (entspricht [M+H]&spplus;), 447, 431, 419, 403, 347, 303, 213, 179, 112.
    • Herstellung von 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid
  • Verbindung 11 (0, 34 g, 0, 68 mmol) wurde für 10 min. mit eiskalter TFA (5 ml) und weitere 10 min ohne Kühlen gerührt. Das TFA wurde soweit wie möglich verdampft, und der Rückstand wurde über Silica chromatographiert, wobei ein Lösungsmittel- System aus Methylenchlorid : Methanol : konzentriertem NH&sub4;OH (100 : 5 : 0,5) verwendet wurde. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt, und nach Verdampfen wurde Verbindung 11a als ein hygroskopischer Schaum erhalten (0,2 g, quantitative Ausbeute). Verbindung 11a wurde wie folgt charakterisiert: IR (Film) 3330, 2964, 2929, 1698, 1660, 1576, 1486, 1231, 1045, 759 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;) δ 8,50, 7,56, 7,10 (d, m, m, 4H, Py), 3,52 (q, 2H, CH&sub2;N), 2,91 (t, 2H, CH&sub2;SS), 8,87, 8,85, 4,19, 3,78 (D&sub2;O-austauschbare Protonen, NH). MS (m/e) 303 (entspricht [M+H]&spplus;), 213, 112.
    • Herstellung des Carbazonderivats von Adriamycinhydrochlorid und 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid
  • Adriamycinhydrochlorid (356 mg, 0,6 mmol) und Verbindung 11a (0,2 g, 0,68 mmol) wurden über Nacht in Methanol (50 ml), welches 2-3 Tropfen TFA enthielt, rühren gelassen. Eine klare Lösung wurde erhalten, und eine HPLC (Methanol. 0,01 M Ammoniumphosphat-Lösung, pH 4,5, 70 : 30-Lösungsmittelsystem) zeigte, dass über 90% des Adriamycins in das Semicarbazon umgewandelt worden waren. Das Lösungsmittel wurde daher verdampft und der Rückstand über eine C-18-Säule chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methanol : Wasser (60 : 40), welches 0,3% Ammoniumacetat enthielt, verwendet wurde. Die Fraktionen wurden über Umkehrphasen-DSC (dasselbe Lösungsmittelsystem, aber 3% Ammoniumacetat) und/oder HPLC überwacht, und die Fraktionen, welche frei von Adriamycin waren, wurden vereinigt. Das meiste des Methanols wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet, und der rote Rückstand wurde in einem kleinen Volumen Methanol gelöst. Die Lösung wurde filtriert und zu gerührtem Acetonitril (1 L) zugegeben. Die klare Lösung wurde auf ungefähr ein Drittel ihres Volumens konzentriert, und der feste Rückstand wurde durch Zentrifugation gesammelt und getrocknet, um das Carbazon von ADM (Verbindung 4) (160 mg) zu ergeben. Eine zweite Ausbeute (85 mg) wurde erhalten, indem die Lösung auf 100 ml konzentriert wurde, mit Ether verdünnt wurde und der Feststoff durch Zentrifugation gesammelt wurde (Gesamtausbeute 49%). Dieses Carbazonderivat wurde wie folgt charakterisiert: IR (KBr): 3346, 2975, 2936, 1711, 1668, 1618, 1578, 1286, 1210, 1083, 1015, 765 cm&supmin;¹. NMR (CD&sub3;OD) δ 8,43, 7,89, 7,77, 7,52, 7,21, (Py, Phenyl H), 5,15 (anomeres H) 4,57 (CH&sub2;OH), 4,25 (CH&sub3;CH), 3,99 (OCH&sub3;), 3,53 (SSCH&sub2;), 3,17 (-CH&sub2;-, Ring), 3,05 (CH&sub2;NN=), 2,38 (-CH&sub2;-, Ring), 1,29 (CHCH&sub3;). MS (m/e) 828 (entspricht [M+H]&spplus;), 699, 572, 537, 377, 346, 289, 213.
    • BEISPIEL 3 Herstellung der Bifunktionelllen Verbindung 12 und des Thiosemicarbazonderivats von ADM
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer hifunktionellen Verbindung, Verbindung 12, und des Thiosemicarbazonderivats von ADM, welches eine Thiosemicarbazonbindung an der C-13-Position von ADM aufweist. In diesem Beispiel wurde das Thioanaloge des Semicarbazids, das oben in Beispiel 1 beschrieben wurde (Verbindung 10), hergestellt, wie schematisch in Fig. 4 gezeigt ist. Wenn das 2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethanamin verwendet wurde, wurde eine Eliminierung von 2-Mercaptopyridin beobachtet, welche der erhöhten Nukleophilie der Thiosemicarbazideinheit in dem vorletzten Produktstadium zugeschrieben werden konnte. Dieses Problem wurde umgangen, indem die trans-2-Butengruppe eingesetzt wurde, wie in Fig. 4 gezeigt ist.
  • Herstellung von 1-Brom-4-(N-phthalimido)-2-buten Zu einer Lösung von 1,4-Dibrom-2-buten (8,4 g, 40 mmol) in DMF (200 ml) wurde portionsweise während 1 h Kaliumphthalimid (4,62 g, 24 mmol) zugegeben. Nach einem Rühren über Nacht wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand zwischen Wasser und Methylenchlorid partitioniert. Die organische Schicht wurde mehrere Male mit Wasser gewaschen, getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde aus 2- Propanol kristallisiert, was das gewünschte Produkt 1-Brom-4- (N-phthalimido-2-buten) (3,95 g, 59%) ergab; welches wie folgt charakterisiert wurde: Smp. 101-2º. IR (KBr) 1775, 1711, 1466, 1436, 1393, 723 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;) δ 7,81, 7,73 (m,m 4H, Phenyl), 5,88, 5,81 (m,m 2H, 2 =CH-), 4,30 (d, 2H CH&sub2;-N), 3, 90 (d, 2H CH&sub2;Br). MS (m/e) 280 (entspricht [M+H]&spplus;), 200.
  • Analyse: Berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub0;BrNO&sub2;: C, 51,45; H, 3,60; N, 5,00.
  • Gefunden: C, 52,35; H, 3,47; N, 4,80.
    • Herstellung von 1-(Acetylthio)-4-(N-phthalimido)-2-buten
  • Eine Mischung von 1-Brom-4-(N-phthalimido)-2-buten (3,95 g; 14 mmol) und Kaliumthioacetat (1,77 g, 15,5 mmol)in absolutem Ethanol (50 ml) wurde für 1/2 h unter Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand mit Methylenchlorid extrahiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei sich ein kristalliner Rückstand ergab (3,85 g, 99%), welcher als solcher für den nächsten Schritt verwendet wurde. Eine Analyseprobe wurde durch Kristallisation aus 2- Propanol hergestellt, Smp. 69-71º. Diese Verbindung wurde wie folgt charakterisiert: IR (KBr) 1769, 1713, 1688, 1427, 1391, 1114, 958 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;) δ 7,80, 7,73 (m, m 4H Ph), 5,70 (m, 2H, 2 =CH-), 4,24 (d, 2H, CH N), 3,48 (t, 2H CH&sub2;S), 2,29 (s, 3H, C-CH&sub3;). MS (m/e) 276 (entspricht [M+H]&spplus;), 234, 200.
  • Analyse: Berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub3;NO&sub3;S: C, 61,07; H, 4,76; N, 5,09. Gefunden: C, 61,29; H, 4,82; N, 5,21.
    • Herstellung von 1-Amino-4-[(2-pyridinyl)dithiol-2-butenhydrochlorid
  • Eine Lösung von 1-Acetylthio-4-(N-phthalimido)-2-buten (6,5 g, 23,6 mmol) in absolutem Ethanol (150 ml) und Hydrazin (1,74 g, 54 mmol) wurde unter Rückfluß erwärmt. Der Reaktion folgte eine DSC und, wenn kein Ausgangsmaterial vorhanden war, wurde die Lösung in Eis abgeschreckt und mit 6 N HCl (10 ml) behandelt. Ein voluminöser Niederschlag bildete sich und wurde als Phthalhydrazid (NMR, MS) identifiziert, und er wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde auf 10 ml konzentriert und mit Wasser verdünnt. Der Feststoff wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit Ether (2X) und Methylenchlorid (1X) gewaschen, durch Cellt filtriert und gefriergetrocknet. Der Feststoff wurde in einer kleinen Menge Methanol gelöst, und die Lösung wurde durch Cellt filtriert, das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand über Nacht evakuiert. Ein wachsartiges, hygroskopisches Material wurde erhalten, welches die folgenden Charakteristika aufwies: NMR (DMSO-D&sub2;O) δ 5,83, 5,60 (m,m 2H, 2 =CH-), 3,40 (d, 2H CH&sub2;NH&sub2;), 3,16 (d 2H, CH&sub2;SH). MS (m/e) 104 (entspricht [M+H]&spplus;), 87, 70. Dieses wachsartige Material wurde in Methanol vom HPLC-Grad (75 ml) gelöst. Die Lösung wurde gerührt und mit Methoxycarbonylsulfenylchlorid (3 g, 23,7 mmol) behandelt. Nach 1/2 h wurde kein Ausgangsmaterial durch DSC nachgewiesen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde erneut in Methanol (75 ml) gelöst. Die Lösung wurde gerührt und mit 2-Mercaptopyridin (2,7 g, 24 mmol) behandelt. Nach 2 h wurde das Lösungsmittel verdampft, und der Rückstand wurde unter Hochvakuum evakuiert. Der Rückstand wurde dann in einer Mischung aus 0,01 N HCl und Methanol (90 : 10, 130 ml) gelöst. Die trübe Lösung wurde mit Methylenchlorid gewaschen, durch Cellt filtriert und gefriergetrocknet, um 1-Amino-4-[(2-pyridinyl)dithio]-2-butenhydrochlorid als ein stark hygroskopisches flockiges Material (4 g, 68%) zu ergeben, welches die folgenden Charakteristika aufwies: IR (KBr) 3433, 2959, 2884, 1607, 1576, 1447, 1418, 1118, 767 cm&supmin;¹. NMR (D&sub2;O) δ 8,51, 8,13, 8,02, 7,54 (m 4H, Py), 5,87, 5,72 (m, m 2H, 2 =CH-), 3,54 (d 2H, CH&sub2;, NH&sub2;), 3,43 (d 2H, CH&sub2; S). MS (m/e) 213 (entspricht [M+H]&spplus;), 196, 112.
    • Herstellung von N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid
  • 1-Amino-4-[(2-pyridinyl)dithio]-2-butenhydrochlorid (1,5 g, 6 mmol) wurde in gerührtem Methylenchlorid (30 ml) suspendiert. TEA wurde zugegeben (1,46 g, 14,6 mmol), gefolgt von Di-2- pyridylthionocarbonat (Kim und Yi, Tetrahedron Lett. 26: 1661-1664 (1985)), (1,4 g, 6 mmol). Eine klare Lösung wurde erhalten, und eine DSC zeigte das Fehlen des Ausgangsmaterials an. t-Butylcarbazat (0,8 g, 6 mmol) wurde zugegeben, und die Lösung wurde für 1 h gerührt. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde über Silica chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methylenchlorid: Methanol (100 : 2) verwendet wurde, und rechromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Hexan. Ethylacetat (75 : 25) verwendet wurde, um einen Schaum zu ergeben, welcher das t-BOC-Derivat von N-[4-[(2- Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid ist (1,4 g, 58%), das wie folgt charakterisiert wurde: IR (KBr) 3238, 2971, 2930, 1718, 1544, 1418, 1156, 762 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;/D&sub2;O) δ 8,43, 7,65, 7,08 (m, m, m 4H, py), 5,57 (m 2H, 2 =CH), 4,12 (d 2H, CH&sub2; N), 3,45 (d 2H CH&sub2;S), 1,46 (s 9H, 3 CH&sub3;). MS (m/e) 387 (entspricht [M+H]&spplus;) 355, 287, 276, 112.
  • Das geschützte Carbothioamid (0,86 g, 2,2 mmol) wurde in eiskalter TFA gelöst. Die Lösung wurde für 10 min auf Eis (unter Stickstoff) und für weitere 10 min ohne Kühlung gehalten. Die überschüssige Säure wurde unter Hochvakuum soweit wie möglich verdampft, und der Rückstand wurde über Silica chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methylenchlorid : Methanol : konzentriertem NH&sub4;OH (100 : 5 : 0,5) verwendet wurde. Die passenden Fraktionen wurden vereinigt, wobei sich die Verbindung 12 in Form eines Gummis (0,39 g, 63%) ergab, welche die folgenden Charakteristika aufwies: IR (Film) 3322, 3198, 2974, 1626, 1574, 1560, 1538, 1448, 1418, 1224, 760 cm&supmin;¹. NMR (CDCl&sub3;/D&sub2;O) δ 8,41, 7,63, 7,11 (m m m 4H, Py), 5,64 (m 2H, 2 =CH), 4,20 (d 2H, CH&sub2;N), 3,41 (d 2H, CH&sub2;S). MS (m/e) 287 (entspricht [M+H]&spplus;), 225, 221, 144, 112.
    • Herstellung des Thiosemicarbazonderivats von Adriamycinhydrochlorid und N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid
  • Zu einer gerührten Suspension von Adriamycinhydrochlorid (350 mg, 0,6 mmol) in Methanol vom HPLC-Grad (50 ml) wurde eine Lösung der Verbindung 12 (350 mg, 1,2 mmol) in Methanol vom HPLC-Grad (25 ml) zugegeben. TFA (3-4 Tropfen) wurde zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht rühren gelassen. Eine klare Lösung wurde erhalten, und durch HPLC oder DSC wurde kein freies Adriamycin nachgewiesen. Die Lösung wurde auf ein kleines Volumen (5 ml) konzentriert, welches zu Acetonitril (600 ml) zugegeben wurde. Es bildete sich ein Niederschlag, und nach Kühlen im Kühlschrank wurde dieser durch Zentrifugation gesammelt und unter Hochvakuum getrocknet (275 mg, 54%). Das Thiosemicarbazonderivat wurde wie folgt charakterisiert: IR (KBr) 3418, 2934, 1616, 1578, 1534, 1414, 1284, 1208, 1012, 986 cm&supmin;¹. NMR (CD&sub3;OD) δ 8,30, 7,80, 7,74, 7,52, (Py, Phenyl 7H), 5,60 (2 =CH), 5,40 (anomeres H), 4,67 (CH&sub2;OH), 4,22 (CH&sub3;CH), 4,09 (CH&sub2;N), 4,02 (OCH&sub3;), 3,5-1,88 Clusterabsorption einschließlich -CH&sub2;-SS, -CH&sub2;-CH), 1,30 (CH&sub3;-CH). MS (m/e) 812 (entspricht [M+H]&spplus;), 701, 683, 669, 572, 554, 540, 536, 522, 504. HRMS, berechnet für C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub2;N&sub5;O&sub1;&sub0;S&sub3;: 812,2094; Gefunden 812,2087.
    • BEISPIEL 4 Herstellung der Bifunktionellen Verbindung 13 und des Carboxylathydrazonderivats von ADM (kein Teil der Erfindung)
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung der neuen bifunktionellen Verbindung 13 und des Carboxylathydrazonderivats von ADM. Die bifunktionelle Carboxylathydrazin-Verbindung wird ausgehend von Mercaptoethanol hergestellt, welches zu Pyridinyldithioethanol derivatisiert wurde, wie in Fig. 5 gezeigt ist. Diese Verbindung wurde dann zu einem aktivierten Carbonylderivat umgewandelt, das mit Hydrazin kondensiert wurde.
    • Herstellung von 2[(2-(Pyridinyl)dithioethylhydrazincarboxylat
  • Zu einer gekühlten (0ºC) Lösung von Chlorcarbonylsulfenylchlorid (1,24 g, 9,45 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde tropfenweise 2-Mercaptoethanol (737 mg, 9,45 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde für 30 min bei 0º-15ºC gerührt, auf 0ºC abgekühlt und mit einer Lösung von 2-Mercaptopyridin (1,05 g, 9,45 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (15 ml) behandelt. Die Mischung wurde für 1 h bei 0ºC und dann für 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe einer Ammoniumcarbonatlösung (1,0 g in 20 ml H&sub2;O) wurden die Schichten getrennt, und die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und in vacuo konzentriert, wobei sich rohes 2-(2-Pyridinyldithio)ethanol (1,75 g) als ein farbloses Öl ergab. Carbonyldiimidazol (648 mg, 4 mmol) wurde zu einer Lösung von 2- (2-Pyridinyldithio) ethanol (714 mg, 3, 8 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) zugegeben. Die Mischung wurde für 20 h gerührt und dann auf -20ºC abgekühlt und mit Hydrazin (122 mg, 3,8 mmol) behandelt. Die Mischung wurde für 16 h bei -5ºC stehen gelassen und dann in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde auf Silicagel chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Methylenchlorid : Methanol (100 : 1-3) verwendet wurde, um die Verbindung 13, 2-[(2-Pyridinyldithio)ethylhydrazincarboxylat (340 mg, 37%), als ein farbloses Öl zu ergeben, welches die folgenden Charakteristika aufwies: NMR (CDCl&sub3;) δ 8,46 (1H), 7,62 (2H), 7,08 (1H), 5,92 (1H), 4,35 (t, 2H), 3,70 (s, ZH), 3,01 (t, 2H), 1,56 (s, 2H). MS (m/e) 246 (entspricht [M+H]&spplus;), 142, 103.
    • Herstellung des Hydrazonderivats von Adriamycinhydrochlorid und 2[(2-Pyridinyl)dithio]ethylhydrazincarboxylat
  • Zu einer Suspension von Adriamycinhydrochlorid (290 mg, 0,5 mmol) in wasserfreiem Methanol (4 ml) wurden eine Lösung der Verbindung 13 (170 mg, 6,9 mmol) in Methanol (4 ml) und CF&sub3;CO&sub2;H (6 mg) in Methanol (1 ml) zugegeben. Nach einem Rühren für 24 h wurde die Mischung auf ca. 4 ml konzentriert, und Acetonitril (50 ml) wurde zu dieser Lösung zugegeben. Das Produkt wurde durch Zentrifugation isoliert. Der Feststoff wurde in Wasser-Methanol gelöst und dann lyophilisiert, wobei sich das Hydrazonderivat von Adriamycin (354 mg, 88%) als ein dunkelroter Feststoff ergab, welcher die folgenden Charakteristika aufwies: NMR (CD&sub3;OD) δ 8,34 (1H), 7,93 (d, 1H), 7,81 (m, 3H), 7,54 (d, 1H), 7,17 (m, 1H), 5,49 (m, 1H), 5,19 (s, 1H), 4,59 (m, 2H), 4,37 (m, 2H), 4,25 (m, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,63 (m, 1H), 3,54 (m, 1H), 3,10 (t, 3H), 2,37 (m, 2H), 2,03 (m, 1H), 1,89 (m, 1H), 1,29 (d, 3H). MS (m/e): 771 (entspricht [M+H]&spplus;), 642.
    • BEISPIEL 5 Herstellung der Bifunktionellen Verbindung 15 und des Arylhydrazonderivats von ADM (kein Teil der Erfindung)
  • Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren zur Herstellung einer neuen bifunktionellen Verbindung, Verbindung 15, und des Arylhydrazonderivats von ADM, welches eine Arylhydrazonbindung an der C-13-Position von ADM aufweist. Verbindung 15 wird hergestellt, indem 4-N-BOC-Hydrazinobenzoesäure verwen det wird und die 2-(2-Pyridinyldithio)ethanamingruppe wie in Fig. 6 gezeigt eingebaut wird.
    • 4-(N-BOC-Hydrazino)benzoesäure
  • p-Hydrazinobenzoesäure (760 mg, 5 mmol) wurde in Dioxan (10 ml), Wasser (5 ml) und 1 N NaOH-Lösung (5 ml) gelöst. Di-tbutylpyrocarbonat (1,31 g, 6 mmol) wurde bei 0ºC zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde für 1 h bei 0ºC und für 30 min bei RT gerührt. Nach diesem Zeitraum wurde das Volumen der Lösung auf die Hälfte verringert, und die Lösung wurde mit 0,5%iger HCl-Lösung angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Lösung wurde mit Kochsalzlösung gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Ein Entfernen des Lösungsmittels ergab einen schwach braunen Feststoff, welcher aus EtOAc und Hexan umkristallisiert wurde (950 mg, 75%) und welcher wie folgt charakterisiert wurde: NMR (CD&sub3;OD) δ 7,84 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,75 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 1.48 (s, 9H); IR (KBr) 3316, 1688, 1607, 1298 cm&supmin;¹.
    • Herstellung von N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl-4-(N-BOChydrazino)benzamidsäure
  • 4-(N-BOC-Hydrazino)benzoesäure (252 mg, 1 mmol), N-Hydroxysuccinimid (115 mg, 1 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (247 mg, 1,2 mmol) in N,N-Dimethylformamid (DMF) (5 ml) wurden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dicyclohexylharnstoff (DCU) wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde verdampft. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Et&sub2;O kristallisiert, wobei sich der N-Hydroxysuccinimidester von 4-(N-BOC- Hydrazino)benzoesäure (300 mg) ergab. Dieses Material (250 mg, 0,72 mmol) und 2-(2-Pyridinyl)dithio)ethylaminhydrochlorid (167 mg, 0,75 mmol) wurden in DMF (4 ml) gelöst. Nach Zugabe von TEA (0,125 ml, 0,9 mmol) wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. DMF wurde entfernt, und der Rückstand wurde auf SiO&sub2; chromatograhiert (2% MeOH-CH&sub2;Cl&sub2;), wobei sich ein Schaum ergab (217 mg, 52%), welcher die fol genden Charakteristika aufwies: NMR (CDCl&sub3;) δ 8,37 (d, 1H, J = 5,1 Hz), 8,01 (bt, 1H), 7,78 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,57 (m, 1H), 7,46 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 7,09 (m, 1H), 6,84 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,40 (bs, 1H), 5,92 (bs, 1H), 3,70 (m, 2H), 2,98 (t, 2H, J = 5,8 Hz), 1,45 (s, 9H); IR (KBr) 3303, 1714, 1610, 1505 cm&supmin;¹; MS m/e 421 (M+H), 365, 321, 112, HRMS berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub5;N&sub4;O&sub3;S&sub2; 421,1368, gefunden 421,1358.
    • Herstellung von N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]-4-hydrazinobenzamid
  • Die vorhergehende Verbindung (200 mg, 0,48 mmol) wurde für 1 h bei 0ºC mit TFA (1,5 ml) behandelt. Nach diesem Zeitraum wurde TFA verdampft, und der Rückstand wurde mit Et&sub2;O verrieben, wobei sich ungefähr 200 mg N-[2-[(2-Pyridinyl)dithio]- ethyl]-4-hydrazinobenzamid (Verbindung 15) in der Form eines Öls ergaben, welches die folgenden Charakteristika aufwies: NMR (CD&sub3;OD) δ 8,38 (d, 1H, J = 4,5 Hz), 7,81 (m, 4H), 7,22 (t, 1H, J = 5,8 Hz), 6,97 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 3,67 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 3,06 (t, 2H, J = 6,6 Hz); IR (Film) 3278, 1674, 1613 cm&supmin;¹; MS m/e 321 (M+H).
    • Herstellung des Arylhydrazonderivats von Adriamycin und N-[2- [(2-Pyridinyldithio)ethyl]-4-hydrazinobenzamid
  • Verbindung 15 und Adriamycinhydrochlorid (250 mg, 0,43 mmol) wurden in MeOH (15 ml) gelöst und in der Dunkelheit 2 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde auf einer C-18-Umkehrphasen-SiO&sub2; chromatographiert. Eine Elution mit MeOH : H&sub2;O - 2 : 1, welches 0,3% NH&sub4;OAc enthielt, ergab die Hydrazonverbindung 7 als ein oranges Pulver (30 mg, 8%), welches die folgenden Charakteristika aufwies: NMR (CD&sub3;OD) δ 8,33 (d, 1H, J = 4,8 Hz), 7,85 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 7,74 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 7,66 (m, 4H), 7,41 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,14 (m, 1H), 7,02 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 5,46 (bs, 1H), 5,16 (m, 1H), 4,60 (s, 2H), 4,23 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,62 (m, 4H), 3,02 (m, 4H), 2,61 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 1,97 (m, 2H), 1,32 (d, 3H, J = 6,5 Hz); IR (KBr) 3206, 1708, 1607, 1578 cm&supmin;¹; MS m/e 846 (M+H), 737, 717, HRMS berechnet für C&sub4;&sub1;H&sub4;&sub4;N&sub5;O&sub1;&sub1;S&sub2;, 846,2479, beobachtet 846,2380.
  • Eine Elution mit MeOH : H&sub2;O = 3 : 1, welches 0,3% NH&sub4;OAc enthielt, ergab das Anhydroderivat als einen blauen Feststoff (120 mg, 34%). NMR (CD&sub3;OD) δ 8,40 (d, 1H, J = 4,1 Hz), 7,77 (m, 5H), 7,42 (m, 1H), 7,22 (m, 1H), 7,16 (m, 2H), 5,35 (bs, 1H), 5,26 (m, 1H), 4,65 (s, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,67 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 3,44 (m, 1H), 3,08 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 2,49 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,63 (m, 1H), 1,19 (d, 3H, J = 6,5 Hz);
  • MS m/e 828 (M+H) 699, 681, 495; HRMS berechnet für C&sub4;&sub1;H&sub4;&sub1;N&sub5;O&sub1;&sub0;S&sub2; 828,2372, beobachtet 828,2300.
    • BEISPIEL 6 Charakterisierung der ADM-Derivate
  • Die Freisetzung von ADM aus den ADM-Derivaten, welche wie in den Beispielen 1-5 oben beschrieben hergestellt wurden, wurde bei verschiedenen pH's, die von 4,5 bis 7,4 reichten, unter Verwendung einer HPLC-Analyse untersucht. Stammlösungen (1 mg/ml) der ADM-Derivate wurden in Methanol hergestellt, und Aliquots wurden in einer wässrigen Pufferlösung bei pH 4,5, 5,0 und 7,4 verdünnt, um Endkonzentrationen von ungefähr 1,6 nmol/ml zu erreichen. Die Inkubationen in jedem Puffer wurden bei 37ºC für bis zu 24 h durchgeführt, und die Aliquots wurden durch Auftragen auf eine HPLC-Säule analysiert, um die Menge an unkonjugiertem ADM zu bestimmen. Das freigesetzte Material wurde über seine Retentionszeit auf der Säule und durch ein UV-Profil des eluiert en Materials als intaktes ADM identifiziert. Die Freisetzungsraten wurden als Prozentsatz der maximalen Menge an ADM ausgedrückt und sind in den Fig. 10-12 gezeigt.
  • Wie in den Figuren dargestellt ist, zeigten die ADM-Derivate der Erfindung Freisetzungsraten in einem weiten Bereich. Die Menge an Material, das aus den ADM-Derivaten freigesetzt wurde, erhöhte sich, wenn der pH von 7 auf 4 erniedrigt wurde. Die ADM-Derivate weisen eine säureempfindliche Verknüpfungsgruppe auf, was zu der Freisetzung von ADN aus dem Antikörperprotein führt. Diese Ergebnisse sind mit dem Vorliegen einer Semicarbazon-, Carbazon-, Thiosemicarbazon-, Carboxylathydrazon- oder Arylhydrazonbindung konsistent, welche das ADM mit der bifunktionellen Verbindung verbindet.
    • BEISPIEL 7 Herstellung der Anthracyclin-Immunkoniugate
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Anthracyclin- Immunkonjugaten, wobei die oben beschriebenen ADM-Derivate (Beispiele 1-5) mit einem monoklonalen Antikörper konjugiert wurden.
    • Herstellung von Immunkonlugaten mit einer Disulfidbindung innerhalb der bifunktionellen Verbindung
  • Der verwendete monoklonale Antikörper war 5E9, welcher von dem Hybridom ATCC Nr. HB21 produziert wurde, welches bei der American Type Culture Collection "ATCC" in Rockville, MD, erhältlich ist. Der monoklonale Antikörper 5E9 ist ein IgG&sub1;- Antikörper, welcher gegenüber dem Transferrinrezeptor auf allen sich teilenden menschlichen Zellen reaktiv ist und welcher gegenüber verschiedenen histologischen Typen von Krebszellen kreuzreaktiv ist. 5E9 wurde aus der Aszites-Flüssigkeit, die von BALB/c-Mäusen produziert wurde, gemäß dem Verfahren von Bruck et al., "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic Fluid by DEAE-Affigel Blue Chromatography", J. Immunol. Methods 5b: 313-319 (1982)) gereinigt.
  • Bevor das ADM-Derivat mit dem ausgewählten monoklonalen Antikörper umgesetzt wurde, wurde der Antikörper mit Thiolgruppen versehen, d. h. reaktive Sulfhydrylgruppen wurden auf dem Antikörpermolekül eingeführt. Eine Einführung von Thiolgruppen auf dem monoklonalen Antikörper (MAb) 5E9 wurde durchgeführt, indem SPDP im wesentlichen wie bei Greenfield et al., oben, beschrieben verwendet wurde. Kurz gesagt, wurde SPDP (Pierce Chemical Co., IL) (50 mM), gelöst in Ethanol, zu dem 5E9-MAb (5-10 mg/ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, zugegeben, um eine Endkonzentration zwischen 5-10 mM zu ergeben. Die Reaktionsmischung wurde für 30 min bei 30ºC inkubiert. Nicht umgesetztes SPDP wurde von dem mit SPDP derivatisierten Antikörper durch eine Gelfiltrationschromatographie abgetrennt, wobei eine PD-10-Säule (Pharmacia) verwendet wurde. Die reaktiven Pyridinyldithioeinheiten wurden durch Reduktion mit einem Überschuß an DTT entfernt. Die reduzierten Antikörper wurden durch eine PD-10-Säule geleitet, und die freies Thiol enthaltenden Antikörper wurden zur Kondensation mit den ADM-Derivaten verwendet.
  • Reaktive Thiolgruppen wurden ebenfalls unter Verwendung von 2-IT auf dem Antikörperprotein eingeführt. Der Antikörper (5- 10 mg/ml in 50 mM TEA, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA bei pH 8,0) wurde mit 2-IT (Pierce Chemical Co., 1L) bei einer Endkonzentration von 5-10 mM gemischt. Die Reaktion wurde für 90 min bei 4ºC fortschreiten gelassen, und mit Thiolgruppen versehene Antikörper wurden auf einer PD-10-Säule, welche mit 2 M NaCl/PBS äquilibriert war, abgetrennt.
  • Die Anzahl der reaktiven Thiolgruppen, welche auf dem Antikörper eingebaut wurden, wurde unter Verwendung von DTNB (5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (E&sub4;&sub1;&sub2; = 14150) gemäß dem Verfahren, welches von Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959) beschrieben wird) bestimmt.
  • Jedes ADM-Derivat wurde in DMF gelöst und zu dem reduzierten, durch SPDP mit Thiolgruppen versehenen MAb 5E9 in PBS zugege ben. Die Menge des ADM-Derivats entsprach der Anzahl von Thiolgruppen auf dem Antikörper. Die Konjugationsreaktion wurde über Nacht bei 4ºC inkubieren gelassen. Nach diesem Zeitraum wurde die Antikörperlösung gegen PBS dialysiert, um nichtkonjugiertes Adriamycinderivat zu entfernen. Die Antikörperlösung wurde dann über Nacht mit SM-2 Bioßeads (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) behandelt. Die Menge an konjugiertem Anthracyclin, das an den MAb gebunden war, wurde durch die Extinktion bei 495 nm (E&sub4;&sub9;&sub5; = 8030) bestimmt. Die Menge an Antikörperprotein wurde durch die Extinktion bei 280 nm (1 mg/ml = 1,4 O. D.-Einheiten) bestimmt. Um die Überlappung der ADM-Extinktion bei 280 nm zu korrigieren, wurde die folgende Formel verwendet:
  • Antikörper (mg/ml) = A&sub2;&sub8;&sub0; - (0,72 · A&sub4;&sub9;&sub5;)/1,4
  • Die Immunkonjugate wurde unter Verwendung einer HPhC-Analyse auf das Vorliegen von unkonjugiertem ADM oder ADM-Derivaten hin untersucht. Die HPLC wurde durchgeführt, indem eine Phenomenex-Säule, die mit 5 Mikrometer-IB-SIL-C18-Kügelchen gepackt war, verwendet wurde. Unkonjugierter Wirkstoff, ADM- Derivate (d. h. ADM konjugiert mit jeder der bifunktionellen Verbindungen der Erfindung, die wie in den Beispielen 1-5 oben beschrieben hergestellt wurden) (0,1 umol), oder Immunkonjugate, die 0,5-5 umol Wirkstoffäquivalente enthielten, wurden auf die Säure aufgetragen und mit Methanol und 10 mM Ammoniumphosphat, pH 4,5 (70 : 30) bei 1,5 ml/min eluiert. Die erzeugten Immunkonjugate enthielten keine signifikante Menge (weniger als 1%) des unkonjugierten Wirkstoffs, wie durch HPLC-Analyse festgestellt wurde.
    • BEISPIEL 8 Charakterisierung der Immunkonjugate
  • Die Immunkonjugate, welche wie oben in Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurden, waren aus ADM-Molekülen zusammengesetzt, die an der 13-Keto-Position mit einer bifunktionellen Verbindung konjugiert waren, die eine Verknüpfung zwischen dem ADM und dem MAb 5E9 bildete. Weiterhin führte die Zugabe des MAb mit freien Thiolgruppen zu dem ADM-Derivat, welches eine reaktive Pyridinyldithioeinheit enthielt, zu der Bildung einer Disulfidbindung in der bifunktionellen Verbindung, welche ADM mit dem MAb verband. Immunkonjugate, die gemäß dieser Ausführungsform gebildet wurden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 5E9-ADM-Semicarbazon-[3,42]; 5E9-ADM-Carbazon- [4,37]; 5E9-ADM-Thiosemicarbazon-[2,51]; 5E9-ADM-Carboxylathydrazon-[2,35]; und 5E9-ADM-Arylhydrazon-[2,52], wobei der erste Teil der Bezeichnung für den monoklonalen Antikörper steht, der verwendet wurde, um das Konjugat zu bilden, der zweite Teil für das Anthracyclin steht, das mit dem Antikörper verknüpft wurde, und die Ziffer in der Bezeichnung für das Molverhältnis von ADM/Antikörper in dem speziellen Konjugat steht.
  • Die Bindungsaktivität der Immunkonjugate wurde in einem Fluoreszenzbindungstest bestimmt, wie er von Greenfield et al., in "In Vitro Evaluation of Immunoconjugates Prepared by Linking Mitomycin C to Monoclonal Antibodies via Polyglutamic Acid Carriers" in Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, Bd. 2, S. 201 (1989) beschrieben wird. Kurz gesagt, wurden die Immunkonjugate in Serie in 100 ul Testmedium (RPMI 1640 ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum und Penicillin/Streptomycin, Gibco, Grand Island, N. Y.) verdünnt. CEM-Tumorzellen (ATCC Nr. CCL 119) (1 · 10&sup6; Zellen), die in demselben Medium kultiviert wurden, wurden geerntet und durch Zentrifugation gewaschen und dann in dem Medium suspendiert (1 · 10&sup6; Zellen), welches die verdünnten Immunkonjugate ent hielt. Nach einer Stunde Inkubation bei 4ºC wurden die Zellen gewaschen und für eine weitere Stunde bei 4ºC in 100 ul Medium suspendiert, welches 1 : 40-verdünnte Ziegen-anti-Maus- IgG-FITC (Cappel, Durham, NC) enthielt. Die Zellen wurden gewaschen und analysiert, indem ein Coulter Epics V Fluorenszenzzellanalysator verwendet wurde. Für jedes Experiment wurde ein ähnlich verdünnter MAb als eine nicht-konjugierte positive Bindungskontrolle verwendet. Der Prozentsatz der Proteinausbeute (separat erhalten), die Molverhältnisse (Mole an ADM/MAb) und die Bindung, ausgedrückt als der Prozentsatz der ursprünglichen Bindung, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, behielten die 5E9-Immunkonjugate (außer für das Thiosemicarbazon) über 90% der ursprünglichen Bindungsaktivität des unkonjugierten 5E9 bei. Dieses zeigt, dass die Konjugation der ADM-Derivate mit dem 5E9-MAb zu dem Verlust eines relativ kleinen Anteils der Antikörperbindungsaktivität führte. Die Proteinausbeuten zeigen, dass große Mengen an Protein über den Konjugationsvorgang hinweg beibehalten wurden.
    • Freisetzung von ADM aus dem Carbazon-Immunkonjugat
  • Die Freisetzungsraten von ADM aus dem Carbazon-Immunkonjugat der Erfindung bei pH 4,5, 5,0 und 7,4 wurden ebenfalls durch eine HPLC-Analyse untersucht, wie oben in Beispiel 6 für die ADM-Derivate der Erfindung beschrieben wird. Wie in Fig. 13 gezeigt ist, ist die Freisetzungsrate von ADM aus dem Immunkonjugat im wesentlichen dieselbe wie die, welche für das Carbazonderivat von ADM in Beispiel 6 gezeigt wurde. Die Menge des Materials, das aus dem ADM-Immunkonjugat freigesetzt wurde, stieg an, wenn der pH von 7 auf 4 erniedrigt wurde. Dieses ADM-Immunkonjugat weist eine säureempfindliche Verknüpfungsgruppe auf, was zu der Freisetzung von ADM aus dem Antikörperprotein führt. Diese Ergebnisse sind mit dem Vorliegen einer Hydrazonbindung konsistent, welche das ADM mit der bifuktionellen Verbindung verbindet.
  • Die experimentellen Daten, welche hierin beschrieben wurden, zeigen, dass eine ADM-Einheit aus den Immunkonjugaten dieser Erfindung unter "physiologischen" Bedingungen, d. h. sauren Bedingungen, welche für die lysosomale Umgebung typisch sind, freigesetzt wird.
    • Cytotoxische Aktivität der Immunkonjugate
  • Die Cytotoxizität der Immunkonjugate wurde durch ein Testen in vitro bestimmt, wobei der Koloniebildungstest in Weichagar unter Verwendung von Daudi- (Burkitt's Lymphom)-Zellen (Phänotyp: 5E9&spplus;, ATCC Nr. HB21) verwendet wurde, wie von Greenfield et al., europäische Patentanmeldung Nr. 328,147, oben, beschrieben wird. Die Daudi-Zellen wurden in Vollmedium (RPMI 1640-Medium plus 10% fötales Kalbsserum (FCS)) kultiviert. 1 · 10&sup5; Zellen in 1 ml Medium wurden für 1,5 Stunden in Serie verdünnten 5E9-ADM-Immunkonjugaten oder unkonjugiertem ADM ausgesetzt. Für jede Verdünnung wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Kontrollen bestanden aus ähnlich behandelten Zellen, die nicht dem Wirkstoff ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden dann gewaschen und in RPMI 1640-Medium suspendiert, welches 15% FBS und 0,3% Agarose enthielt (Marine Colloid, Rockland, ME). Ein ml der Zellsuspension (1 · 10³ Zellen) wurden dann in 6 Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Costar, Cambridge, MA) über eine 0,4%ige Agaroseschicht geschichtet. Die Proben wurden für 7- 10 Tage bei 37ºC inkubiert, und die resultierenden Kolonien wurden für 48 Stunden mit 0,5 ml 1 mg/ml p-Iodnitrotetrazoliumviolett (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) angefärbt. Die Kolonien wurden gezählt, wobei ein Optimax 40-10-Bildanalysator verwendet wurde, und die Hemmung der Koloniebildung wurde bestimmt, indem mit Wirkstoff behandelte oder mit Immunkonjugat behandelte Zellen mit der unbehandelten Kontrolle verglichen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2, unten, als IC&sub5;&sub0; (die Konzentration, welche nötig ist, um die Koloniebildung um 50% zu hemmen) angegeben.
    • Tabelle 2 5E9-Immunkoniugat IC&sub5;&sub0; (M)a
  • Semicarbazon > 5,1 · 10&supmin;&sup7;
  • Carbazon 4,0 · 10&supmin;&sup7;
  • Thiosemicarbazon 3,0 · 10&supmin;&sup7;
  • Carboxylathydrazon 5,9 · 10&supmin;&sup7;
  • Arylhydrazon > 6,4 · 10&supmin;&sup7;
  • aM = molare Konzentration des Immunkonjugats, die nötig war, um die Koloniebildung um 50% zu hemmen, gemessen nach 24 h.
  • Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, besitzen alle pH-empfindlichen Immunkonjugate zusätzlich dazu, dass sie ADM freisetzen, eine signifikante cytotoxische Aktivität in vitro.
    • BEISPIEL 9 Herstellung eines Anthracyclin-Immunkoniugats, das eine Thioetherverknüpfung enthält
  • Dieses Beispiel beschreibt eine alternative Ausführungsform zur Herstellung eines Anthracyclin-Immunkonjugats, worin ADM mit einem monoklonalen Antikörper über eines der ADM-Derivate der Erfindung konjugiert ist, welche wie oben in den Beispielen 1-5 beschrieben hergestellt wurden und welche irgendeine der fünf Bindungen: Semicarbazon, Carbazon, Thiosemicarbazon, Carboxylathydrazon und Arylhydrazon als deren Anbindungsstelle an dem ADM-Molekül aufwiesen. Zusätzlich weist das Immunkonjugat eine Thioetherverknüpfung als Teil seiner Anbindung an den Antikörper auf.
  • Der MAb 5E9 (2,5 mg in 2,5 ml PBS) wird bei 30ºC für 30 min mit SMPB (Succinimidyl-4-(p-maleinimidophenyl)butyrat, 59,5 ug, in 100 ul Tetrahydrofuran) umgesetzt. Der pH wird mit Natriumcitratpuffer auf 6,0 eingestellt. Die Mischung wird durch eine PD-10-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) geleitet, um den Maleinimid-haltigen Antikörper von den nicht umgesetzten Materialien abzutrennen. Die ADM-Derivate (1 mg), welche wie oben beschrieben hergestellt wurden, werden dann in 1 ml MeOH/H&sub2;O (9 : 1) gelöst, und 0,5 umol von jedem der ADM-Derivate werden mit 0,5 umol Tri-n-butylphosphin in 4 : 1 Aceton : H&sub2;O umgesetzt, um die reduzierte Form des ADM-Derivats herzustellen. Nach 10 min wird 0,1 M Schwefel in Toluol zugegeben, um verbliebenes Phosphin zu zerstören. Die reduzierten ADM- Derivate werden dann mit dem Maleinimid-haltigen 5E9-MAb gemischt. Immunkonjugate, die so hergestellt wurden, werden durch eine Passage über eine PD-10-Gelfiltrationssäule gereinigt. In Fällen, wo die Entfernung des Toluol-Lösungsmittels nicht vollständig ist und sich eine organische Lösungsmittelschicht abtrennt, welche einiges Protein aus der Reaktionsmischung zum Aufschwimmen bringt, wird ein leichter Luftstrom verwendet, um das Lösungsmittel zu entfernen, und das denaturierte Protein wird durch Zentrifugieren der Mischung für 2 min bei 16.000 · g entfernt. Der klare Überstand enthält die Immunkonjugate und wird in PBS bei pH 7,4 gelfiltriert und analysiert. Das ADM/Antikörper-Molverhältnis wird spektrophotometrisch unter Verwendung von OD&sub2;&sub8;&sub0; und OD&sub4;&sub9;&sub5; wie oben beschrieben bestimmt. Eine typische Reaktion ergibt Immunkonjugate mit Molverhältnissen zwischen 3 und 4.
  • Die Bindungs- und die cytotoxische Aktivität der Immunkonjugate, welche wie in diesem Beispiel beschrieben hergestellt wurden, werden wie oben beschrieben getestet.
  • Die obigen Beispiele demonstrieren die Herstellung von neuen N-substituierten bifunktionellen Hydrazinverbindungen, neuen N-substituierten Hydrazonderivaten von ADM, welche mit diesen bifunktionellen Verbindungen erzeugt wurden, und neuen Immunkonjugaten, bei welchen ADM mit einem Antikörper über eine neue säureempfindliche Verknüpfung konjugiert wurde. Die bifunktionellen Verbindungen wurden leicht mit einem cytotoxischen Reagens, ADM, und einem gezielt an Zellen bindenden Molekül, einem monoklonalen Antikärper, konjugiert. Die Konjugate behielten sowohl die Antikörperbindungsaktivität (d. h. die Targetzellspezifität) als auch die cytotoxische Wirkstoffaktivität bei und setzten freies, unmodifiziertes ADM unter sauren Bedingungen frei, welche für die zelluläre Umgebung der Targetzellen typisch sind.
  • Somit zeigen die neuen bifunktionellen Verbindungen der Erfindung, Immunkonjugate der Erfindung Ansätze für ein Konjugieren von nützlichen Molekülen, insbesondere zur Abgabe von cytotoxischen Wirkstoffen an eine Targetzellpopulation, zur bevorzugten Abtötung jener Zellen bei der Behandlung von Krankheiten wie z. B. Krebs und anderen Tumoren, nichtcytociden viralen und anderen pathogenen Infektionen und Autoimmunstörungen.
  • Während wir vorstehend eine Reihe von Ausführungsformen dieser Erfindung angegeben haben, ist es klar, dass unsere Grundkonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen zur Verfügung zu stellen, welche die bifunktionellen Verbindungen, Derivate der cytotoxischen Reagenzien, Konjugate und Verfahren dieser Erfindung benutzen. Daher wird man anerkennen, dass der Umfang dieser Erfindung durch die hieran angefügten Ansprüche definiert werden soll und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, welche vorstehend in Form eines Beispiels angegeben wurden.

Claims (57)

1. Bifunktionelle Verbindung in Form eines N-substituierten Hydrazins der Formel
H&sub2;NNHCONHNHCONH(CH&sub2;)nSSR&sup8;
in der n für eine ganze Zahl von 1 bis 10 und R&sup8; für
oder
steht,
worin X für H, NO&sub2; oder Halogen steht.
2. 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid.
3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 2, bei dem man
a) t-Butylcarbazat, Triethylamin, Triphosgen und 2-(2-Pyri- 5 dinyldithio)ethanaminhydrochlorid unter Bildusng von 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]-2,2'-bis(tert-butoxylcarbonyl)kohlensäuredihydrazid umsetzt und
b) das N-Butoxycarbonylkohlensäuredihydrazid mit Trifluoressigsäure unter Bildung von 2-[[[2-[(2-Pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazid umsetzt.
4. Bifunktionelle Verbindung in Form eines N-substituierten Hydrazins der Formel
R&sub2;NNHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nSSR&sup8;
in der m, n für ganze Zahlen von 1 bis 10, die gleich oder verschieden sind, stehen; und
R&sup8; für
oder
steht,
worin X für H, NO&sub2; oder Halogen steht.
5. N-4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid.
6. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 5, bei dem man
a) 1,4-Dibrom-2-buten mit Kaliumphthalimid unter Bildung von 1-Brom-4-(N-phthalimido)-2-buten umsetzt;
b) das Brombuten mit Kaliumthioacetat unter Bildung von 1-(Acetylthio)-4-(N-phthalimido)-2-buten umsetzt;
c) das Acetylthiobuten mit Hydrazin unter Bildung von 1-Amino-4-mercapto-2-butenhydrochlorid umsetzt;
d) das Aminomercaptobuten mit Methoxycarbonylsulfenylchlorid und 2-Mercaptopyridin unter Bildung von 1-Amino-4-[(2-pyridinyl)dithio]-2-butenhydrochlorid umsetzt;
e) das Aminobutenhydrochlorid mit TEA und Di-2-pyridinylthioncarbonat und t-Butylcarbazat unter Bildung des als t-BOC-Derivat geschützten Carbothioamids von N-[4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]-hydrazincarbothioannid umsetzt; und
f) das t-BOC-Derivat mit Trifluoressigsäure unter Bildung von N-4-[(2-Pyridinyl)dithio]-2-butenyl]hydrazincarbothioamid umsetzt.
7. Bifunktionelle Verbindung, umfassend die Verbindung nach Anspruch 1 oder 4, wobei die Verbindung mit einem Reduktionsmittel unter Bildung einer freien Sulfhydrylgruppe reduziert ist.
8. Bifunktionelle Verbindung nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Reduktionsmittel um Dithiothreitol oder Tributylphosphin handelt.
9. Konjugat, gebildet durch Vereinigen der Verbindung nach Anspruch 1 oder 4 mit mindestens einem eine freie Carbonylgruppe enthaltenden Molekül und mindestens einem eine Sulfhydrylgruppe enthaltenden Molekül.
10. Konjugat nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem eine Carbonylgruppe enthaltenden Molekül um ein cytotoxisches Reagens handelt.
11. Konjugat nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem cytotoxischen Reagens um ein Anthracyclin handelt.
12. Konjugat nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem eine Sulfhydrylgruppe enthaltenden Molekül um ein gegenüber einer Targetzellpopulation reaktives Molekül handelt.
13, Konjugat nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Molekül um einen monoklonalen Antikörper handelt.
14. Konjugat, gebildet durch Vereinigen der Verbindung nach Anspruch 7 mit mindestens einem eine freie Carbonylgruppe enthaltenden Molekül und mindestens einem Molekül mit argebundenen Maleinimidgruppen.
15. Konjugat nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem eine freie Carbonylgruppe enthaltenden Molekül um ein Anthracyclin und bei dem Molekül mit angebundenen Maleinimidgruppen um einen Antikörper handelt.
16. Anthracyclinderivat, hergestellt durch Umsetzen der Verbindung nach Anspruch 1 oder 4 mit einem Anthracyclin.
17. Anthracyclinderivat nach Anspruch 16, wobei das Anthracyclin aus der aus Adriamycin, Daunomycin, Detorubicin, Carminomycin, Idarubicin, Epirubicin, Esorubicin, 4'-THP-Adriamycin,
AD-32 und 3'-Deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)-doxorubicin besthenden Gruppe ausgewählt ist.
18. Konjugat, hergestellt durch Umsetzen des Anthracyclinderivats nach Anspruch 16 mit einem gegenüber einer Targetzellpopulation reaktiven Molekül.
19. Konjugat nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Molekül um einen gegenüber Tumorzellen reaktiven Antikörper handelt.
20. Ronjugat nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt, der aus der aus 5E9, L6, 3A1 und G28.5 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
1521. Konjugat nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Anthracyclin um Adriamycin und bei dem Antikörper um 5E9 handelt.
22. Konjugat nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Molekül um einen Liganden handelt.
23. Ronjugat nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem Liganden um ein Protein, Polypeptid oder Peptidmolekül handelt.
24. Konjugat nach Anspruch 23, wobei der Ligand aus der aus Bombesin, EGF, Transferrin, Gastrin, gastrinausschüttendem Peptid, Wachstumsfaktor aus Blutplättchen, IL-2, IL-6, TGF-α, TGF-β, VGF, Insulin und insulinartigem Wachstumsfaktor I und 11 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
25. Ronjugat nach Anspruch 22, wobei es sich bei dem Liganden um einen peptidylfreien, aus der aus Kohlehydraten, Steroiden und Lectinen bestehenden Gruppe ausgewählten Liganden handelt.
26. Adriamycin-13-2-[[[2-[(2-pyridinyl)dithio]ethyl]amino]carbonyl]kohlensäuredihydrazidcarbazon-hydrochlorid.
27. Adriamycin-13-N-4-[(2-pyridinyl)dithio]-2-butenyl-hydrazincarbothioamidthiosemicarbazon-hydrochlorid.
28. Anthracyclinderivat der Formel
worin R&sub1; für NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nSSR&sub8;; NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nS-H; oder
NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nS-H; Steht,
wobei m, n für ganze Zahlen von 1 bis 10, die gleich oder verschieden sind, stehen;
R&sup8; für
oder
steht,
worin X für H, NO&sub2; oder Halogen und Ar für
steht,
R&sub2; für CH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;OCO(CH&sub2;)&sub3;CH&sub3; oder CH&sub2;OCOCH(OC&sub2;H&sub5;)&sub2;;
R&sub3; für OCH&sub3;, OH oder Wasserstoff;
R&sub4; für NH&sub2;, NHCOCF&sub3;, 4-Morpholinyl, 3-Cyano-4-morpholinyl, 1-Piperidinyl, 4-Methoxy-1-piperidinyl, Benzylamin, Dibenzylamin, Cyanomethylamin oder 1-Cyano-2-methoxyethylamin;
R&sub5; für OH, O-THP oder Wasserstoff, und
R&sub6; für OH oder Wasserstoff steht, mit der Maßgabe, dass R&sub6; nicht für OH steht, wenn R&sup5; für OH oder O-THP steht.
29. Anthracyclinderivat der Formel
worin R&sub1; für NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nSSR&sub8;;
NHCONHNHCONH(CH&sub2;)nS-H; oder
NHCSNH(CH&sub2;)mCH=CH(CH&sub2;)nS-H; steht,
wobei m, n für ganze Zahlen von 1 bis 10, die gleich oder verschieden sind, stehen,
R&sup8; für
oder
steht,
worin X für H, NO&sub2; oder Halogen und Ar für
steht,
R&sub2; für CH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;OCO(CH&sub2;)&sub3;CH&sub3; oder CH&sub2;OCOCH(OC&sub2;H&sub5;)&sub2;;
R&sub3; für OCH&sub3;, OH oder Wasserstoff;
R&sub4; und R&sub7; unabhängig voneinander für Wasserstoff, Alkyl, substituiertes Alkyl, Cycloalkyl, substituiertes Cycloalkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl oder substituiertes Aralkyl stehen; oder R&sup4;, R&sup7; und N gemeinsam einen 4- bis 7-gliedrigen Ring bilden, wobei dieser Ring gegebenenfalls substituiert sein kann;
R&sub5; für OH, O-THP oder Wasserstoff und
R&sub6; für OH oder Wasserstoff steht, mit der Maßgabe, dass R&sub6; nicht für OH steht, wenn R&sub5; für OH oder O-THP steht.
30. Konjugat, umfassend das Anthracyclinderivat nach Anspruch 28 oder 29, konjugiert mit wenigstens einem gegenüber einer Targetzellpopulation reaktiven Molekül.
31. Konjugat nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem Molekül um einen Antikörper handelt.
32. Konjugat nach Anspruch 31, wobei der Antikörper gegenüber Tumorzellen reaktiv ist.
33. Konjugat nach Anspruch 32, wobei es sich bei dem Antikörper um einen aus der aus 5E9, L6, 3A1 und G28.5 bestehenden Gruppe ausgewählten monoklonalen Antikörper handelt.
34. Verfahren zur Herstellung des Konjugats nach Anspruch 31, bei dem der Antikörper mit einem Thiolgruppen-übertragenden Mittel umgesetzt wird, bevor der Antikörper mit dem Anthracyclinderivat konjugiert wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Thiolgruppen-übertragenden Mittel um SPDP oder 2-IT handelt.
36. Verfahren zur Herstellung des Konjugats nach Anspruch 31, bei dem das Anthracyclinderivat vor der Konjugation mit dem Antikörper reduziert worden ist, und wobei vor der Umsetzung des Antikörpers mit dem Derivat Maleinimidgruppen an den Antikörper angebunden werden.
37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Maleinimidgruppen durch Umsetzung des Antikörpers mit Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat angebunden werden.
38. Konjugat nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem gegenüber einem Targetzellmolekül reaktiven Molekül um einen gegenüber einer Targetzellpopulation reaktiven Liganden handelt.
39. Konjugat nach Anspruch 38, wobei der Ligand aus der aus einem Protein, Polypeptid und Peptidmolekülen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
40. Konjugat nach Anspruch 39, wobei der Ligand aus der aus Bombesin, EGF, Transferrin, Gastrin, gastrinausschüttendem Peptid, Wachstumsfaktor aus Blutplättchen, IL-2, IL-6, TGF-α, TGF-β, VGF, Insulin und insulinartigem Wachstumsfaktor I und II bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
41. Konjugat, umfassend wenigstens ein Molekül mit einer freien Carbonylgruppe, das über eine bifunktionelle Verbindung mit einer reaktiven Pyridinyldithio- oder ortho-Nitrophenyldithioeinheit an wenigstens ein Molekül mit einer freien Sulfhydrylgruppe gebunden ist, wobei die bifunktionelle Verbindung über eine Bindung an das Molekül mit einer freien Sulfhydrylgruppe gebunden ist, die aus der aus Carbazon- oder Thiosemicarbazonbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
42. Konjugat nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem Molekül mit einer freien Carbonylgruppe um ein Molekül eines cytotoxischen Reagenzes handelt.
43. Konjugat nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem Molekül eines cytotoxischen Reagenzes um ein Molekül eines chemotherapeutischen Reagenzes handelt.
44. Konjugat nach Anspruch 43, wobei es sich bei dem chemotherapeutischen Reagenz um ein Anthracyclin handelt und die bifunktionelle Verbindung an die Ketogruppe an der C&sub1;&sub3;-Position des Anthracyclinmoleküls gebunden ist.
45. Konjugat nach Anspruch 44, wobei das Anthracyclin aus der aus Adriamycin, Daunomycin, Detorubicin, Carminomycin, Idarubicin, Epirubicin, Esorubicin, 4'-THP-Adriamycin, AD-32 und 3'-Deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)-doxorubicin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
46. Konjugat nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem zellreaktiven Molekül um einen Antikörper oder einen Liganden handelt.
47. Konjugat nach Anspruch 46, wobei es sich bei dem Molekül um einen gegenüber Tumorzellen reaktiven Antikörper handelt.
48. Konjugat nach Anspruch 47, wobei der Antikörper gegenüber einem mit Karzinomen, Melanomen, Lymphomen, Knochen- oder Weichgewebesarkomen assoziierten Antigen reaktiv ist.
49. Konjugat nach Anspruch 48, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
50. Konjugat nach Anspruch 49, wobei der Antikörper aus der aus 5E9, L6, 3A1 und G28.5 bestehenden Gruppe ausgewählt ist und es sich bei dem Anthracyclin um Adriamycin handelt.
51. Konjugat nach Anspruch 46, wobei es sich bei dem Molekül um einen Liganden handelt.
52. Konjugat nach Anspruch 51, wobei der Ligand aus der aus einem Protein, Polypeptid und Peptidmolekülen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
53. Konjugat nach Anspruch 52, wobei der Ligand aus der aus Bombesin, EGF, Transferrin, Gastrin, gastrinausschüttendem Peptid, Wachstumsfaktor aus Blutplättchen, IL-2, IL-6, TGF-α, TGF-β, VGF, Insulin und insulinartigem Wachstumsfaktor I und 11 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
54. Konjugat nach Anspruch 51, wobei es sich bei dem Liganden um einen peptidylfreien Liganden handelt.
55. Konjugat nach Anspruch 54, wobei der Ligand aus der aus Kohlenhydraten, Steroiden und Lectinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
56. Pharmazeutisch verträgliche, zur Behandlung von Erkrankungen geeignete Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Konjugats nach einem der Ansprüche 9 bis 15, 18 bis 25, 30 bis 33, und 38 bis 55 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
57. Verwendung wenigstens eines Konjugats nach einem der Ansprüche 9 bis 15, 18 bis 25, 30 bis 33, und 38 bis 55 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Abgabe von Anthracyclinen an eine Targetzellpopulation.
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