JP3010319B2 - 新規二官性連結化化合物及びその製法 - Google Patents

新規二官性連結化化合物及びその製法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規二官性（又は二官能
性）化合物、その化合物を含むコンジュゲート、および
その製造、使用方法に関する。特に、本発明は細胞集団
ターゲッティングのための分子と連結できるＮ−置換ヒ
ドラジン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】二またはそれ以上の分子が連結できる二
官性化合物はすでに知られている。例えば、細胞毒性試
薬を、細胞集団ターゲッティングのための分子に連結す
る二官性化合物は知られている。二官性化合物は、生体
内でこのタイプの細胞毒性試薬の運搬と放出が可能でな
ければならず、例えば、ターデッティング分子の活性を
損なうことなく、生体内で治療上十分なレベルの試薬を
供給しなければならない。確実な適用のためには、試薬
とターゲッティング分子間にｐＨに敏感な連結を含むコ
ンジュゲートが形成され、ｐＨの一定の範囲で細胞毒性
試薬が放出されることが望まれる。
【０００３】がんの治療に特に有用な試薬は、アントラ
サイクリンである。アントラサイクリンは、細胞毒活性
を示す抗生物質化合物である。アントラサイクリンは、
以下のいくつかの異なるメカニズムによって、細胞を殺
す作用をするであろうことが研究されている。１）薬剤
分子の、細胞のＤＮＡへのインターカレーション、それ
によるＤＮＡ依存性核酸合成の阻害。２）細胞巨大分子
と反応して、細胞に損傷を引き起こすフリーラジカル
の、薬剤による生成。３）薬剤分子と細胞膜との相互作
用（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｒａｎｓ
ｐｏｒｔ ＡｎｄＳｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ａｎｔｈｒａ
ｃｙｃｌｉｎｅｓ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉ
ａ”，ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．
Ｍｕｇｇｉａ ｅｔ ａｌ（Ｅｄｓ．），ｐ．１３２
（Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ （１９８２）およびＢａｃｈｕｒ，“Ｆｒｅｅ
Ｒａｄｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ”， ｉｄ． ｐｐ．
９７−１０２）。その細胞毒性の高さ故に、アントラサ
イクリンは、白血病、乳がん、肺がん、卵巣腺がん、肉
腫のような多くのがんの治療に用いられてきた（Ｗｉｅ
ｒｎｉｋ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ｏｆ Ａ
ｄｒｉａｍｙｃｉｎ Ａｎｄ Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ
Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，ｉｎ Ａ
ｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａ
ｔｕｓＡｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，
Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ，），ｐｐ．２７
３−９４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８
０））。通常用いられるアントラサイクリンは、アドリ
アマイシン（ＡＤＭドキソルビシンとしても知られる）
とダウノマイシン（ＤＡＵダウノルビシンとしても知ら
れる）を含む。
【０００４】これら化合物は、新生物や、標的細胞集団
が弱められるか除去されるかが求められるような他の疾
患の状態の治療で有用であるかもしれないが、その治療
効果は、その投与に関係する服量依存性の毒性によっ
て、しばしば制限される。例えば、腫瘍の治療で、これ
ら化合物の典型的逆副作用は、骨髄障害と心臓毒性であ
る（Ｃｒｏｏｋｅ，“Ｇｏａｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｈｒ
ａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ Ａｔ Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ”，Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ： Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＳｔａｔｕｓＡｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ，前述、ｐ１１）。それ故腫瘍の治療でこれら化合
物の治療効果を改善するために、アントラサイクリン
を、腫瘍関連の抗原に向かう抗体に連結して、腫瘍細胞
へ薬剤を選択的に運搬するためのイムノコンジュゲート
形成の試みがされた。（Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ
Ｓｅｉｌｅｒ，“Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｗｉ
ｔｈ ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕ
ｇ（Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ”，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉ． Ｍｉｔｌ．８
２：１９７−２１５（１９８８））。この方法で薬剤は
腫瘍の場所へ運搬または“ターゲッティング”でき、全
身の正常な細胞への有毒な副作用が減せるかもしれな
い。腫瘍関連の抗原に対するポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体に連結した、アントラサイクリンＡＤＭ
またはＤＡＵを含むイムノコンジュゲートはすでに知ら
れている（例えばＧａｌｌｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｄａｕｎｏｍ
ｕｃｉｎ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
７９１Ｔ／３６ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ａ
ｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３３：７３７−４４（１９８４）、
及びＡｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
Ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｏｆ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ＯｆＤａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ｗ
ｉｔｈ Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ． ６２：
５−２７（１９８２））。
【０００５】アントラサイクリンの抗体への付着への、
最もしばしば用いられるアプローチは、アントラサイク
リンのアミノ糖部分での連結が利用されてきた。例えば
アミノ糖は、過酸化ナトリウムで酸化され、Ｓｃｈｉｆ
ｆ塩基形成を介して、抗体のリジン残基に直接付着させ
た（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｃｏｖ
ａｌｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｏｆ Ｄａｕｎｏｍｙｃ
ｉｎ Ａｎｄ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ Ｔｏ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｔｈ ＲｅｔｅｎｔｉｏｎＯｆ Ｂ
ｏｔｈ Ｄｕｒｇ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｃｔ
ｉｖｉｔｉｅｓ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：１１
７５−１１８１（１９７５））。一方アントラサイクリ
ンのアミノ基と抗体のカルボキシル基との、カルボジイ
ミドを介する連結を通じて、アントラサイクリンは抗体
に連結された（Ｈｕｒｗｉｔｚｅｔ ａｌ．，前述）ま
たはアミノアルキル基（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．，“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｏｆ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ−Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｉｎ Ｔｗｏ
Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｕｍｏｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２１：
７４７−７５５（１９７８））。これらと連結は容易に
加水分解されず、アントラサイクリンの放出管理を難し
くしている。又、薬剤のアミノ糖と抗体のアミノ基と
の、グルタルアルデヒドによるクロス連結によって、ア
ントラサイクリンは抗体に連結された（Ｂｅｌｌｅｓ−
Ｉｓｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙＯｆ Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ−Ａｎｔｉ−
ＡｌｐｈａＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ Ｏｎ Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌ
ｓ”，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４１，ｐｐ．８４１−４
２（１９８０））。しかしアントラサイクリン分子のア
ミノ糖部分が、抗体との連結によって変形されたイムノ
コンジュゲートの研究で、コンジュゲートした薬剤の細
胞毒活性の損失が示された（Ａｒｎｏｎｅｔ ａｌ．，
前述，ｐ７−８）。更にアントラサイクリン類似体の研
究で、アントラサイクリンのアミノ糖を変形すると、薬
剤類似体の細胞毒活性が、親の薬剤に比し減少する結果
となる（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉ
ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｓｏｍｅ Ｄｅ
ｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｏｆ Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ａ
ｔ Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ ＡｎｄＭｅｔｈｙｌＫｅｔｏ
ｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
１５：８７２−７５（１９７２））。
【０００６】アントラサイクリンＤＡＵが、薬剤のＣ−
１４位置で抗体に直接連結したイムノコンジュゲートが
製造された。しかし腫瘍細胞へ向うこれらイムノコンジ
ュゲートの選択的細胞毒活性が容易に再生できず、２０
μｇ／ｍｌの濃度でだけ一貫して表われた（Ｇａｌｌｅ
ｇｏ ｅｔ ａｌ．，前述）。
【０００７】日本特許出願２７４６５８は、Ｃ−１３ア
シルヒドラゾン連結を介する、アントラサイクリンと抗
体とのコンジュゲート化を示している。このコンジュゲ
ート化は、抗体の誘導化と、その誘導体とアントラサイ
クリンとのその後の反応を含む方法で達成された。抗体
の誘導体化が望ましくない非特異的反応を含み、アント
ラサイクリン：抗体の比が非常に低いために、この方法
は不都合である。第一の方法によると、抗体をヒドラジ
ンの存在下カルボジイミドで処理して、ヒドラジド抗体
誘導体とし、次にアントラサイクリンと反応させて、ア
ントラサイクリンを抗体構造に直接連結した。しかし、
その結果生じたイムノコンジュゲートは、抗体分子の集
合体の傾向がある。更にこの方法は、数が限られるだろ
うカルボキシル基が求められるために、このコンジュゲ
ートは、アントラサイクリン：抗体の比が、約１．１〜
１．３と低い。第二の方法は、抗体を無水コハク酸と反
応させて、抗体のヘミ−コハク酸誘導体とする反応を含
む。この誘導体を次にヒドラジンと反応させて、抗体ヒ
ドラジド誘導体とし、更にアントラサイクリン、ダウノ
マイシンと反応させる。抗体誘導体とヒドラジンとの反
応が非特異的であり、望むヒドラジド誘導体に加えて、
種々の抗体誘導体の混合物を生成することにより、この
第二のアプローチは無効である。こうして、２７４６５
８出願に示されている通り、アントラサイクリンの抗体
に対するモル比が非常に低い（約１、日本出願２６４頁
１段を見よ）。又欧州特許出願、公開Ｎｏ．２９４２９
４には、アントラサイクリンのＣ−１３ヒドラゾン誘導
体と、抗体の炭化水素部分とのコンジュゲートが示され
ている。
【０００８】他にもアントラサイクリンヒドラゾンが示
されている（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．，２１：７３２−３７（１９７８）、Ｓｍｉｔ
ｈｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１：２８
０−８３（１９７８）、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｐｐ．６５９−６１
（１９８６））。米国特許４，１１２，２１７に、ＤＡ
ＵとＡＤＭのビス−ヒドラジンが示されている。
【０００９】他方、アントラサイクリンは、デキストラ
ンまたはポリグルタミン酸のような高分子量担体と連結
して、薬剤の紬胞毒活性を高め、毒性を減している（Ａ
ｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，前述ｐ５およびＨｕｒｗｉｔ
ｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｍａｃｒｏｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｓ Ａｓ ＣａｒｒｉｅｒｓＦｏｒＤａｕ
ｎｏｒｕｂｉｃｉｎ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２，ｐｐ２５−３５（１９８０））。これら担体連
結のアントラサイクリンは、腫瘍細胞へ特異的に細胞毒
性試薬をターゲッティングするために、腫瘍関連の抗原
に向かう抗体と共有結合して、イムノコンジュゲートを
形成する。例えば、カルボキシ−メチル−デキストラン
ヒドラジドブリッジを介して、ＡＤＭはそのような“抗
腫瘍”抗体と連結し、そのヒドラジドブリッジでは、Ａ
ＤＭ分子はＣ−１３カルボニルでカルボキシメチルデキ
ストランのヒドラジド誘導体と連結して、ヒドラゾンを
形成している。その後抗体が、グルタルアルデヒドによ
りデキストランヒドラジド誘導体と連結して、アドリア
マイシン−デックス−抗体コンジュゲートを形成する
（Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｆ
ｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕ
ｇｏ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｈｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３６５−８３（１９８５）お
よびＨｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ Ｏｆ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ Ａｎｄ Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴｏ Ｔｈｙ
−１ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａ Ｈｕｍ
ａｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
４１７，ｐｐ．１２５−３６（１９８３））。
【００１０】しかし、担体の利用には確実に不利な点が
ある。例えば、担体を含むイムノコンジュゲートは大変
かさが大きく、生体内で細網内皮系により急速に移動す
る（Ｄｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎｓ Ａｎｄ ＣｏｎｊｕｇａｔｅｓＯｆ Ｔ１０
１ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎｄ
Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
４６：４８８６−９２（１９８６））。担体を含むイム
ノコンジュゲートの速い動きは、コンジュゲートした薬
剤が作用の予定された場所へ、すなわち殺されるべき細
胞の標的群へ着かないかもしれないため、治療上不利か
もしれない。更に高分子量担体の存在は、イムノコンジ
ュゲートの安定性に悪い影響をあたえ、コンジュゲート
の抗体の結合活性を減すことが示された（Ｅｍｂｌｅｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ＡｎｔｉｂｏｄｙＴａｒｇｅｔ
ｉｎｇ Ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔ
ｓ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａ
ｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．
（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３２３−２４（１９８５））。更
に腫瘍細胞を研究すると、高分子量担体を含むイムノコ
ンジュゲートが、生体内で腫瘍細胞に局在する証拠はな
い。（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａｌｉｚａｔ
ｉｏｎ Ａｎｄ ＴｏｘｉｃｉｔｙＳｔｕｄｙ Ｏｆ
Ａ Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ−Ａｎｔｉ−ＣＥＡＣｏｎｊｕ
ｇａｔｅ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｄｖ
ａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒ”，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
４７：３５−４２（１９８３）は直接コンジュゲートし
た薬剤−抗体コンジュゲートの、生体内腫瘍細胞への局
在を説明しているで、比較せよ）。
【００１１】こうして、特定の連結や担体の利用によ
る、アントラサイクリンと抗体とのコンジュゲート化は
示されている。上に概略を述べたように、これらイムノ
コンジュゲートの使用は、用いた特定の連結または担体
によっては明確に不利である。
【００１２】リガンド−毒素のコンジュゲートも示され
ている。Ｐａｓｔａｎによる米国特許４，５４５，９８
５は、プソイドモナル（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒
素（ＰＥ）が、多数のＥＧＦ受容体をもつ細胞に対して
用いるために、１：２の比でＥＧＦと連結した外毒素コ
ンジュゲートを示している。ＥＧＦ−リチンＡおよびＥ
ＧＦ−ジフテリア毒素コンジュゲートも作られた（Ｃａ
ｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｔｏｘｉｎ Ａ Ｃｈａｉｎ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： ＥＧＦ−Ｒｉｃｉｎ Ａ
Ｉｓ Ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｔｏｘｉｎ Ｗｈｉｌｅ Ｅ
ＧＦ−Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａ
Ｉｓ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ”，Ｃｅｌｌ２２：５６３−７
０（１９８０）およびＳｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，
“Ａ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｃｒｏｓｏ−Ｌｉｎｋｅｄ
Ｔｏ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｉｎ Ａ−Ｆｒａ
ｇｅｍｅｎｔ”，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ １１８（Ｎ
ｏ．２）：２７４−７８（１９８０））。更にプソイド
モナス外毒素融合タンパク質は、タンパク質、ポリペプ
チドおよびＴＧＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＣＤ４の
ような増殖因子を用いて製造された（Ｐａｓｔａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇ
ｅｎｔｓＣｒｅａｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｆｕｓｉｏｎ
Ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎｄ Ｔｏｘ
ｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，ＦｏｕｒｔｈＩｎｔｅｒｎａｔ
ｌ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ， Ｐ３６（３月３０日−
４月１日 １９８９）、Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ ｅｔａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８５：１９２２−２
６（１９８８）、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８
４：４５３８−４２（１９８７），Ｓｉｅｇａｌｌ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８５： ９７３８−４２（１９８８），Ｃｈａ
ｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：
３６９−７２（１９８８））。ジフテリア毒素−α−メ
ラニン細胞刺激ホルモン融合タンパク質が作られた（Ｍ
ｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，“ＧｅｎｅｔｉｃＣｏｎｓ
ｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ
Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏ
ｘｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−
Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｆｕｓｉｏ
ｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：８２５８−６２（１９８
６）。およびＭｕｒｐｈｙによる米国特許４，６７５，
３８２）。しかしタンパク毒素を含むリガンドコンジュ
ゲートは、異種の宿主に免疫原であるかもしれない。
【００１３】更に、ＡＤＭまたはＤＡＵのようなアント
ラサイクリンは、トランスフェリンのような一定のタン
パク質またはポリペプチドリガンドに化学的に連結した
（英国特許出願ＧＢ２１１６９７９Ａ）、またメラノト
ロピンに連結した（Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅ
ｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ−Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ Ｓｈｏｗｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄ
ｉａｔｅｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｆｏｒ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌ
ｌｓ”， Ｎａｔｕｒｅ ２６７：５６−５８（１９７
７））。ＰＣＴ特許出願Ｗ０ ８８／００８３７は、Ｅ
ＧＦが高分子担体を介してＤＡＵのような細胞毒性物質
と連結したことを示し、米国特許４，５２２，７５０と
４，５９０，００１は、トランスフェリンがビンカアル
カロイドやプラチナにそれぞれ連結したことを示してい
る。
【００１４】イムノコンジュゲートに用いられた細胞毒
性試薬は、条件付放出メカニズムを介して放出されるべ
きであって、すなわち、漸次の、非特異的な場所の加水
分解でなく、特定の場所で放出されるべきである。特定
のイムノコンジュゲートがリソソームへ輸送されると提
案された（ｄｅＤｕｖｅ，“Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ Ｒｅ
ｒｉｓｉｔｅｄ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３
７：３９１−３９７（１９８３））、リソソームはわず
かに酸性（ｐＨ５．０〜５．５）である。（Ｐｏｚｎａ
ｎｓｋｙ ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎｏ，“Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ
： Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ，Ｒｅｖ．３６：２７７−３３６（１９８
４）。コンジュゲートした薬剤放出のための酸性条件の
利用は、ＡＤＭへのシスアコニッチル連結の開発で報じ
られている（Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｒｅｉｓｅｒ，“Ｃｉ
ｓ−Ａｃｏｎｉｔｙｌ Ｓｐａｃｅｒ Ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ： Ａ Ｍｏｄｅｌ
Ｏｆ ＰＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｒ
ｅｌｅａｓｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ｆｒｏｍ ＡＬｙｓｏｓ
ｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．１
０２：１０４８−１０５４（１９８１）およびＹａｎｇ
ａｎｄ Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，“Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉ
ｎＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ａ Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｏ
Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ
ｅｓ Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｏｆ Ｅｓｔａｂｌｉｓ
ｈｅｄ Ｔｕｍｏｒ ＸｅｎｏｇｒａｆｔｓＩｎ Ｎｕ
ｄｅ Ｍｉｃｅ”，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８５：１１８９−１１９３（１９８８））またジ
フテリア毒素へのケタール連結で報じられている（Ｓｒ
ｉｎｉｖａｓａｃｈａｒ ａｎｄ Ｎｅｖｉｌｌｅ，
“Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｏｓｏ−Ｌｉｎｋｉｎ
ｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｔｈａｔ Ａｒｅ Ｃｌｅａｖ
ｅｄ Ｂｙ Ｍｉｌｄ Ａｃｉｄ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ２８：２５０１−２５０９（１９８９））。
【００１５】Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ他は、アシルヒドラ
ジン化合物を含む酸に敏感なイムノコンジュゲートの形
成を最近述べていて、アントラサイクリン分子の１３−
ケト位置にアシルヒドラゾン結合を介してコンジュゲー
トした３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオニルヒド
ラジドと、このアントラサイクリン誘導体の、抗体また
はリガンド分子へのコンジュゲート化について述べてい
る（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出
願Ｎｏ．３２８，１４７ １９８９年４月１６日公開）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】ターゲッティングを含
む分子と、生体内で治療に用いられる試薬分子の間に、
酸に敏感な連結を提供するような構造の二官性化合物を
提供するのは有意義である。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は有用な分子と容
易にコンジュゲートする新規二官性化合物及びその製造
方法を提供する。その二官性化合物は、反応性ピリジニ
ルジチオ基またはオルト−ニトロフェニルジチオ基を含
む。本発明は又、その二官性化合物に連結して、細胞毒
性分子の誘導体を形成する細胞毒性分子を含む新規コン
ジュゲートで、さらに殺されるべき標的細胞集団と反応
できる分子に連結した細胞毒性誘導体を含むコンジュゲ
ートを提供する。このターゲッティング分子は抗体のよ
うなタンパク質またはボンベシン、ＥＧＦのようなリガ
ンドであってよい。
【００１８】具体例によれば、新規二官性化合物、Ｎ−
〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジ
ンカルボキサミド（化合物１０）が合成され、化合物１
０にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭのＣ−１３
位置にセミカルバゾン結合を含む、ＡＤＭのセミカルバ
ゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００１９】もう一つの具体例によれば、新規二官性化
合物、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド
（化合物１１ａ）が合成され、化合物１１ａにＡＤＭが
付着する場所として働くＡＤＭのＣ−１３位置にカルバ
ゾン結合を含む、ＡＤＭのカルバゾン誘導体を形成する
のに用いられる。
【００２０】もう一つの具体例では、新規二官性化合
物、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブ
テニル〕ヒドラジンカルボチオアミド（化合物１２）が
合成され、化合物１２にＡＤＭが付着する場所として働
くＡＤＭのＧ１３位置にチオセミカルバゾン結合を含
む、ＡＤＭのチオセミカルバゾン誘導体を形成するのに
用いられる。
【００２１】もう一つの具体例によれば、新規二官性化
合物、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラ
ジンカルボキシレート（化合物１３）が合成され、化合
物１３にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭのＣ−
１３位置にカルボキシレートヒドラゾン結合を含む、Ａ
ＤＭのヒドラゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００２２】もう一つの具体例では、新規二官性化合
物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕
−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）が合成さ
れ、化合物１５にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤ
ＭのＣ−１３位置にアリルヒドラゾン結合を含む、ＡＤ
Ｍのアリルヒドラゾン誘導体を形成するのに用いられ
る。
【００２３】本発明のその他の具体例によれば、上記新
規アントラサイクリン誘導体のいくつもの分子が、選ば
れた標的細胞集団と反応する分子に連結する。好ましく
は、細胞反応性分子は抗体であり、モノクローナル抗体
である。各アントラサイクリン誘導体分子は、アントラ
サイクリン分子のＣ−１３位置の、セミカルバゾン、カ
ルバゾン、チオセミカルバゾン、カルボキシレートヒド
ラゾン、アリルヒドラゾン結合を介してアントラサイク
リンに結合している二官性化合物を介して、抗体と連結
し、本発明の新規イムノコンジュゲートを形成する。例
えば、本発明の好例は、新規アドリアマイシン誘導体分
子の合成を含み、この誘導体分子がチオール化した抗体
と縮合して、二官性化合物を介して抗体にアントラサイ
クリンが付着する結果となる。ＡＤＭのＣ−１３位置に
形成されたヒドラゾン結合は、ＡＤＭに付着する場所と
して働く。この例で、それを介して抗体に付着している
二官性化合物の中に、ジスルフィド基が存在する。もう
一つの好例によれば、アドリアマイシン誘導体分子（二
官性化合物に結合したＡＤＭ）は還元されてスルフヒド
リル基を生じ、その結果できた誘導体が、マレイミド誘
導化抗体と縮合する。この結果、ＡＤＭのＣ−１３位置
に二官性化合物付着の場所としてＮ−置換ヒドラゾン結
合をもち、それを通して抗体に付着する二官性化合物内
にチオエーテル結合をもつイムノコンジュゲートを形成
することになる。
【００２４】本発明のその他の具体例によれば、新規ア
ントラサイクリン誘導体が、ボンベシン、トランスフェ
リン、ＥＧＦのようなリガンドと共有結合して、二官性
化合物を介してリガンドにアントラサイクリンが付着す
る結果となる。上で述べた他の例のように、アントラサ
イクリンのＣ−１３位置に形成したヒドラゾン結合を介
して、アントラサイクリンは二官性化合物に付着する。
リガンドは先にチオール化されてアントラサイクリン誘
導体に連結するのが好ましいが、内在する遊離のチオー
ル基を持つリガンドに直接付着してもよい。
【００２５】これらの具体例から明らかなように、本発
明は、この発明のコンジュゲート製造に有用な、新規二
官性化合物とアントラサイクリン誘導体を提供する。
【００２６】本発明のイムノコンジュゲートは、アント
ラサイクリン：抗体モル比が少なくとも１：１から１
０：１で、好ましくは約４：１〜１０：１であり、選択
した標的細胞を殺すための、抗体と細胞毒性薬剤の両方
の活性が残る。この中で述べたアントラサイクリン−リ
ガンドコンジュゲートは、アントラサイクリン：リガン
ド比が少なくとも１：１から１０：１で、好ましくは約
４：１〜１０：１である。これらコンジュゲートの二官
性化合物にアントラサイクリンが付着する場所に存在す
る酸に敏感な結合は、例えばリソソーム小胞内のよう
な、細胞内で特徴的に出あうような酸性条件下で、活性
な薬剤を放出するのに理想的である。
【００２７】上に名をあげた誘導体の加水分解によるア
ドリアマイシンの放出が、ｐＨの関数として示され、そ
の新規誘導体は、リソソーム環境をまねた酸性条件下
で、大きなレンジの放出率をもった。これら誘導体は、
抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体５Ｅ９と
のイムノコンジュゲートとしての、細胞毒性も示され
た。
【００２８】Ｎ−置換ヒドラジン二官性化合物は、ヒド
ラジン部分と、反応性ピリジニルジチオまたはオルト−
ニトロフェニルジチオ部分を含む。これら新規二官性化
合物は、いろいろな分子と連結して有用なコンジュゲー
トを形成するのに用いられる。二官性化合物のヒドラジ
ン部分に連結する分子は、遊離のカルボニル基または、
カルボニル基を含むように誘導化される基を含み、細胞
毒性試薬分子などである。カルボニル基を含む分子が二
官性化合物のヒドラジン部に連結する時、ヒドラゾン結
合が形成され、コンジュゲート形成に用いられる本発明
の二官性化合物によって、そのヒドラゾン結合は、セミ
カルバゾン、カルバゾン、チオセミカルバゾン、カルボ
キシレートヒドラゾン、アリルヒドラゾン結合である。
ピリジニルジチオまたはオルト−ニトロフェニルジチオ
部分を含む二官性化合物の末端に連結する分子は、遊離
のスルフヒドリル基またはスルフヒドリル基を含むよう
に誘導化できる基を含み、殺すべき標的細胞の抗原また
は受容体と反応する、抗体分子またはリガンドなどであ
る。抗体と二官性化合物との反応を通じ、ピリジニルジ
チオ部分はなくなる。遊離のカルボニル基を含む分子
は、選択した細胞を殺すことができるアントラサイクリ
ンのような細胞毒性分子が好ましい。好例では、細胞毒
性試薬分子を二官性化合物に連結するヒドラゾン結合
は、ｐＨに敏感に細胞毒性試薬を放出させる。
【００２９】本発明の二官性化合物との連結によって形
成された本発明のコンジュゲートは、本発明のイムノコ
ンジュゲートの少なくとも一つの製薬上有効な量と、製
薬上許容しうる担体を含むような、薬剤組成物中で利用
できるだろう。本発明は又、除去したい標的細胞の選ば
れた集団へ、細胞毒性試薬を選択的に運ぶための方法と
同様に、本発明の組成物の製薬上有効な量で、製薬上許
容しうる手法により、哺乳動物を治療するための方法も
含む。
【００３０】好都合に、この中で示された化合物、コン
ジュゲート、薬剤組成物、および方法は、がんやその他
の腫瘍、非細胞致死性のウィルス性または他の病原性の
感染、自己免疫不全症のような疾患の治療で、その標的
細胞を選択的に殺すための、選ばれた細胞集団への細胞
毒性試薬のターゲッティングに有用なアプローチを提供
する。
【００３１】本発明が更によく理解されるように、詳細
な説明をする。
【００３２】本発明は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二官性
化合物に関する：Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド（化合物１
０）、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド
（化合物１１ａ）、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジ
チオ〕−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミド
（化合物１２）、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チルヒドラジンカルボキシレート（化合物１３）、およ
びＮ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−
４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）。これらの
化合物を用いて、アントラサイクリンのような細胞毒性
試薬の新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体を形成し、抗体に
連結すると、イムノコンジュゲートを形成する。本発明
は又、二官性化合物、細胞毒性誘導体およびイムノコン
ジュゲートの製造方法、がんや他の腫瘍、非細胞致死性
のウィルス性または他の病原性の感染、自己免疫不全の
ような疾患を治療するため、標的細胞へ細胞毒性試薬を
運ぶための、薬剤組成物および方法に関する。
【００３３】コンジュゲートは、二官性化合物の一つに
よって、標的細胞集団と反応する分子少なくとも一つと
つながった、細胞毒性誘導体分子少なくとも一つから成
る。この分子は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体
のようなタンパク質またはボンベシン、ＥＧＦのような
リガンドであってよい。
【００３４】具体例をあげると、新規化合物、Ｎ−〔２
−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカ
ルボキサミド（化合物１０）が合成され、さらにＡＤＭ
のＣ−１３位置にセミカルバゾン結合を含み、ＡＤＭの
セミカルバゾン誘導体が形成される。又、新規化合物、
２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕
アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド（化合
物１１ａ）が合成され、さらにＡＤＭのＣ−１３位置に
カルバゾン結合をもつ、ＡＤＭのカルバゾン誘導体が形
成される。又、新規化合物、Ｎ−〔４−〔２−ピリジニ
ル）ジチオ〕−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオア
ミド（化合物１２）が合成され、さらにＡＤＭのＣ−１
３位置にチオセミカルバゾン結合をもつ、ＡＤＭのチオ
セミカルバゾン誘導体が形成される。又、新規化合物、
２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジンカ
ルボキシレート（化合物１３）が合成され、さらにＡＤ
ＭのＣ−１３位置にカルボキシレートヒドラゾン結合を
もつ、ＡＤＭのヒドラゾン誘導体が形成される。又、新
規化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）が
合成され、さらにＡＤＭのＣ−１３位置にアリルヒドラ
ゾン結合をもつ、ＡＤＭのアリルヒドラゾン誘導体を形
成する。
【００３５】他の具体例で、本発明は、抗体またはリガ
ンドのような、標的細胞集団と反応する分子少なくとも
一つと、細胞を殺す細胞毒性分子少なくとも一つを含
み、本発明の新規二官性化合物により連結されるコンジ
ュゲートに関する。又本発明は、と標的細胞集団、例え
ば腫瘍細胞集団に向かう抗体を含むイムノコンジュゲー
トに関し、その抗体は、その構造に連結したいくつもの
アントラサイクリン誘導体分子を持つ。アントラサイク
リン誘導体分子は、チオール化した抗体に共有結合で付
着し、各薬剤分子と抗体の間にジスルフィド結合が形成
され、二官性化合物は、アントラサイクリンのＣ−１３
位置のヒドラゾン結合により、アントラサイクリン誘導
体に付着している。薬剤分子毎に、本発明の二官性化合
物一つを使い、一以上の薬剤分子が各抗体分子に付着す
るかもしれない。モル比４：１は、４薬剤（すなわちア
ントラサイクリン誘導体）分子が１抗体に付着すること
を示す。
【００３６】他の具体例で、アントラサイクリン誘導体
は還元されてスルフヒドリル基を生じ、このＡＤＭ誘導
体が、マレイミド化した抗体と縮合して、抗体とアント
ラサイクリン間にチオエーテル結合をつくる。
【００３７】これらのコンジュゲートは、未修飾アント
ラサイクリン薬剤をｐＨに敏感に放出させ、結果的に細
胞毒性の減少となる薬剤の構造的修飾をしない。
【００３８】別の具体例で、本発明は、ポリペプチドま
たはペプチドリガンドのようなリガンドを含む、アント
ラサイクリン−リガンドコンジュゲートを包含し、その
リガンドは、標的細胞集団の細胞表面に関連する受容体
一以上と反応し、その構造に連結したアントラサイクリ
ン誘導体分子少なくとも一つをもつ。アントラサイクリ
ンは、アントラサイクリンのＣ−１３位置のヒドラゾン
結合を介してアントラサイクリンに付着している二官性
化合物によって、ペプチドに共有的に結合している。他
の具体例で、アントラサイクリン誘導体は還元されてス
ルフヒドリル基を生じ、この誘導体が、マレイミド化し
たリガンドと縮合する。
【００３９】本発明のコンジュゲートは、一段ずつ製造
でき、まず新規Ｎ−置換ヒドラジン化合物をつくり、そ
れを用いて細胞毒性試薬のヒドラゾン誘導体をつくり、
更に適当な特異性をもつタンパク質またはリガンドと反
応させる（伝統的な抗体カップリング技術については、
Ｈａｒｄｙ，“ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｎｄＣｏｕ
ｐｌｉｎｇ Ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ＦｏｒＵｓｅ Ｉｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍ
ｅｔｒｙ”，ｉｎ ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆ Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ
１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉ
ｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３１．４−３
１．１２（４ｔｈ Ｅｄ．１９８６）、リガンドコンジ
ュゲートの製造については、Ｖａｒｇａ ｅｔ ａ
ｌ．，前述を参照）
【００４０】細胞毒性試薬を、コンジュゲートの細胞反
応性成分につなぐ二官性化合物の長さは、二官性化合物
が先に述べたヒドラゾン結合を介して、一またはそれ以
上の細胞毒性試薬分子のカルボニル基に付着する限り
は、変えられる。
【００４１】本発明のコンジュゲートを構成する細胞毒
性試薬は、カルボニル基を含む、いかなる分子であって
もよい。そのような試薬は、限定するものではないが、
アントラサイクリン：アドリアマイシン、ダウノマイシ
ン、デトルビシン、カルミノマイシン、イダルビシン、
エピルビシン、エソルビシン、４′−ＴＨＰ−アドリア
マイシン、ＡＤ−３２，および３′−デアミノ−３′−
（３−シアノ−４−モルホリニル）ドキソルビシンを含
む（Ｃａｓａｚｚａ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｎｔａｌ
Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｎ Ｎｅｗ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌ
ｉｎｅｓ”，ｉｎ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎｅ ： Ｉｔ
ｓ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ Ｉｎ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｍ．Ｏｇａｗａ ｅｔａｌ．
（Ｅｄｓ），ｐｐ．４３９−５２（Ｅｘｃｅｒｐｔａ
Ｍｅｄｉｃａ，１９８４））。
【００４２】細胞毒性試薬が二官性化合物を介してコン
ジュゲート内で連結する細胞反応性分子は、除去したい
細胞集団に結合するか反応し、スルフヒドリル基をもつ
かスルフヒドリルまたはマレイミド基を含むように修飾
できる、いかなる分子であってもよいと理解されるべき
である。そのような分子は、限定するものではないが、
抗体のような高分子量タンパク質（一般に１０，０００
ダルトン以上）、低分子量タンパク質（一般に１０，０
００ダルトン以下）、ポリペプチドまたはペプチドリガ
ンド、および非ペプチドリガンドを含む。
【００４３】本発明のイムノコンジュゲートを構成する
抗体は、除去または殺したい特定の標的細胞集団と反応
する、いかなる抗体であってもよい。そのような抗体の
例は、限定するものではないが、がん、黒色腫、リンパ
腫、骨または軟部組織肉腫、その他の腫瘍で見られる抗
原のような腫瘍関連の抗原に結合する抗体、ウィルス性
または他の病原性関連の抗原に結合する抗体、異常細胞
表面抗原に結合する抗体を含む。これら抗体はポリクロ
ーナルまたは好ましくはモノクローナル抗体であり、従
来十分に確立された技術を用いて製造できる（Ｗｅｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ
Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ａｎｄ Ｍｅｌａｎ
ｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ
−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖ．６２：２９−４５（１９８
２）（腫瘍に特異なポリクローナル抗体が製造され、コ
ンジュゲートに用いられた）、Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，
“ＣｅｌｌＳｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｏｆ Ｈ
ｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
Ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：２９２７
−３１（１９７９）、Ｂｒｏｗｎ ｅｔａｌ．，“Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ＯｆＨｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｐ９７ Ｗｉｔｈ Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１２７（Ｎｏ．２）：５３９−４６（１９８
１）（腫瘍に特異なモノクローナル抗体の製造）。例え
ば、ヒト肺がん細胞に特異なモノクローナル抗体Ｌ６、
または、骨肉腫細胞に特異なモノククローナル抗体７９
１Ｔ／３６が使用できる。更に非インターナリジングま
たは好ましくは、インターナリジングな抗体が用いられ
る。この出願では、“抗体”という用語は、そのままの
抗体または抗体分子の活性結合部分を含むフラグメン
ト、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２を包含する。モ
ノクローナル抗体を用いるならば、抗体は、と限定する
ものではないが、マウスまたはヒト起源、またはキメラ
抗体であってよい。
【００４４】“リガンド”という用語は、標的細胞集団
の細胞表面に関連する受容体に特異的に結合する、いか
なると分子も含むと理解されるべきである。本発明のア
ントラサイクリン−リガンドコンジュゲート形成に用い
られる好ましいリガンドは、限定するものではないが、
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドリガンドを含
み、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ボン
ベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、血小板
由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、 腫瘍増殖因子
（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、ワクシニア増殖因子（Ｖ
ＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびＩ
Ｉなどである。非ペプチドリガンドは、ステロイド、炭
化水素、レクチンを含む。
【００４５】本発明のコンジュゲートの細胞反応性“タ
ーゲッティング”分子、例えば抗体またはリガンドは、
抗体またはリガンドが反応する特定の標的細胞集団へ細
胞毒性試薬分子を運ぶはたらきをする。例えば、腫瘍細
胞表面で見られる抗原に向かう抗体が、その腫瘍細胞
へ、細胞毒性試薬を運搬するだろうし、ＡＩＤＳをひき
おこすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のタンパク質に
向かう抗体が、その細胞毒性試薬をＨＩＶ感染細胞へ運
搬するだろう。同様にがんのような腫瘍細胞は、ＥＧＦ
受容体のような特定の受容体を高濃度で特異的に発現す
るので、ＥＧＦのようなリガンドが細胞毒性試薬をがん
細胞へ運搬するだろう。
【００４６】抗体またはリガンドが反応する特定の細胞
集団内またはその場所で、細胞毒性試薬が放出する結
果、その特定の細胞を選択的に殺すことになる。従っ
て、コンジュゲートが結合できる細胞表面抗原または受
容体をもつ特定の細胞集団の除去が望まれる疾患の治療
で、本発明のコンジュゲートが有用であることは明白で
ある。本発明のコンジュゲートが有用である疾患は、限
定するものではないが、がんやその他の腫瘍、エイズ、
ヘルペス、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）、ＥＢＶ
（エプスタインバーウィルス）、ＳＳＰＥ（亜急性硬化
性全脳炎）のような非細胞致死性のウィルスまたは他の
病原性感染、リュウマチ性関節炎を含む。
【００４７】理論にしばられずに、抗体−またはリガン
ド−連結細胞毒性試薬分子は、すなわち本発明のコンジ
ュゲートの形で、抗体またはリガンドの特異性を介し
て、殺すべき標的細胞へ運ばれて、細胞膜に結合したコ
ンジュゲートしてない抗体やリガンドのインターナリゼ
ーションに通じるのと同じエンドサイトな道を介して細
胞に入るものと信じる（Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，
“Ｐａｔｈｗａｙ ＯｆＥｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ”，ｉ
ｎ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，Ｉ，Ｐａｓｔａｎ ｅｔ
ａｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．１−４４（Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ，１９８５）。いったん細胞内に入ると、
コンジュゲートを含むエンドサイトな小胞は第一のリソ
ソームと融合し、第二のリソソームをつくる（Ｅｍｂｌ
ｅｔｏｎｅｔ ａｌ．，前述，ｐ．３３４）。細胞毒性
分子は、、コンジュゲートの抗体またはリガンド成分
と、酸に敏感なヒドラゾン結合を介して結合しているの
で、エンドサイトな小胞やリソソームの酸性環境にコン
ジュゲートを曝すと、コンジュゲートから細胞毒性試薬
を放出することになる。更に放出された試薬は、十分な
細胞毒活性が可能な比較的未修飾の試薬の形であると信
じられる。従って、コンジュゲートの酸に敏感な結合
は、標的細胞内での細胞毒性試薬の放出に大変有利で、
その細胞に対するコンジュゲートの細胞毒性を高めてい
る。一方、標的細胞の外部またはとり囲む直接の環境、
例えば腫瘍の場所での、酸性還元条件でヒドラゾン結合
は開裂し、放出された薬剤は腫瘍細胞にとりあげられる
だろう。
【００４８】本発明の新規二官性化合物、細胞毒性試薬
の誘導体およびコンジュゲート、およびその製造方法
は、アントラサイクリン、アドリアマイシンが用いられ
る例で示される。一般に、アドリアマイシンのカルボニ
ル誘導体は、アドリアマイシン塩酸塩を本発明の五つの
二官性化合物の一つで、メタノール中室温で処理して製
造される。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を触媒量加える
と、縮合反応を加速することがわかり、反応は一夜かく
はん後完了した。この反応では副生成物がほとんどな
く、精製処理はアセトニトリルによる沈澱化だけでよ
い。この簡素化された処理方法は、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌ
ｄらによってかつて報告されたものより優れていて、よ
り行ないやすく、より経済的で、より早く、種々の分子
とコンジュゲートするための追加の新規アドリアマイシ
ン誘導体を提供する。
【化１３】
【００４９】新規二官性化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピ
リジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド
の合成は以下の図式で示され、アドリアマイシンのセミ
カルバゾン誘導体製造に用いられる。
【化１４】 まずメトキシカルボニルスルフェニルクロリドを２−ア
ミノエタンチオール塩酸塩と、次いで２−メルカプトピ
リジンと反応させて、２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エタンアミン塩酸塩とする。この化合物をトリエチ
ルアミン（ＴＥＡ）の存在下ホスゲンと、次いでｔ−ブ
チルカルバザートと反応させて、Ｎ−〔２−〔（２−ピ
リジニル）ジチオ〕エチル〕−２−（ｔ−ブトキシーカ
ルボニル）ヒドラジンカルボキサミドとする。ヒドラジ
ンカルボキサミドを次にＴＦＡに溶かして、Ｎ−〔２−
〔２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボ
キサミド（化合物１０）、セミカルバジドとし、次にア
ドリアマイシン塩酸塩と反応させて、反応性ピリジニル
ジチオ部分をもつＡＤＭのセミカルバゾン誘導体（化１
３の化合物１）とする。
【００５０】新規カルバジド二官性化合物、２−
〔〔〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カ
ルボニル〕カルボニックジヒドラジドの合成は以下の図
式で示され、アドリアマイシンのカルバゾン誘導体製造
に用いられる。
【化１５】 ｔ−ブチルカルバザートをＴＥＡの存在下ホスゲンと反
応させる。次いで２−（２−ピリジニルジチオ）エタン
アミン塩酸塩を加えて、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジ
ニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，
２′−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニックジ
ヒドラジドとする。この中間体をＴＦＡに加えて、２−
〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミ
ノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド（化合物１
１ａ）とし、次にアドリアマイシン塩酸塩に加えて、反
応性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭのカルバゾン誘
導体（化１３の化合物２）とする。
【００５１】新規チオセミカルバジド二官性化合物、Ｎ
−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニ
ル〕ヒドラジンカルボチオアミドの合成は以下の図式で
示され、アドリアマイシンのチオセミカルバゾン誘導体
製造に用いられる。
【化１６】 フタールイミドカリウムを１，４−ジブロモ−２−ブテ
ンと反応させて、１−ブロモ−４−（Ｎ−フタールイミ
ド）−２−ブテンとする。この化合物をチオ酢酸カリウ
ムと反応させて、１−（アセチルチオ）−４−（Ｎ−フ
タールイミド）−２−ブテンとし、次にヒドラジンと反
応させ、メトキシカルボニルスルフェニルクロリド、続
いて２−メルカプトピリジンと反応させて、１−アミノ
−４−〔（２−ピリジニル（ジチオ〕−２−ブテン塩酸
塩とする。この化合物をＴＥＡと合わせ、ジ−２−ピリ
ジルチオノカーボネート、次いでｔ−ブチルカルバザー
トを加えて、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）−ジチ
オ〕−２−ブテニル〕−ヒドラジンカルボチオアミド
（化合物１２）のｔ−Ｂｏｃ誘導体とする。この化合物
をＴＦＡに溶かして、ゴム状の化合物とし、次にアドリ
アマイシン塩酸塩、ＴＦＡと反応させて、反応性ピリジ
ニルジチオ部分をもつＡＤＭのチオセミカルバゾン誘導
体（化１３の化合物３）とする。
【００５２】新規二官性化合物、２〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕エチルヒドラジンカルボキシレートの合成
は以下の図式で示され、アドリアマイシンのカルボキシ
レートヒドラゾン誘導体製造に用いられる。
【化１７】 クロロカルボニルスルフェニルクロリドを２−メルカプ
トエタノール、２−メルカプトピリジンと反応させる。
炭酸アンモニウム溶液を加えて、２−（２−ピリジニ
ル）ジチオ）エタノールを無色オイルで得る。カルボニ
ルジイミダゾールを加え、更にヒドラジンと反応させ
て、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジ
ンカルボキシレート（化合物１３）とする。この化合物
をアドリアマイシン塩酸塩、ＴＦＡ次いでアセトニトリ
ルと反応させて、反応性ピリジニルジチオ部分をもつＡ
ＤＭのカルボキシレートヒドラゾン誘導体（化１３の化
合物４）とする。
【００５３】新規化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミドの
合成は以下の図式で示され、アドリアマイシンのアリル
ヒドラゾン誘導体製造に用いられる。
【化１８】 ｐ−ヒドラジノ安息香酸をジ−ｔ−ブチルピロカーボネ
ートと反応させて、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安
息香酸とする。この化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ＤＣＣと反応させて、４−Ｎ−Ｂｏｃ−（ヒドラ
ジノ）安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルとする。これを２−（２−ピリジニル）ジチオ）エタ
ンアミン塩酸塩、ＴＥＡと反応させて、Ｎ−〔２−（２
−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−Ｎ−Ｂｏｃ−（ヒ
ドラジノ）ベンズアミドとする。この化合物をＴＦＡで
処理して、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）と
し、更にアドリアマイシン塩酸塩と反応させて、反応性
ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭのアリルヒドラゾン
誘導体（化１３の化合物５）とする。
【００５４】上述のＡＤＭのＮ−置換ヒドラゾン誘導体
は、本発明のコンジュゲートをつくるのに用いられる。
各誘導体は、ＳＰＤＰまたは２−ＩＴ（２−イミノチオ
ラン）で先にチオール化されたモノクローナル抗体と反
応させ、以下に示す通りである。
【化１９】
【化２０】 二官性化合物がＡＤＭのＣ−１３位置にヒドラゾン結合
を通して付着する方法により、イムノコンジュゲート
は、モノクローナル抗体にコンジュゲートしたＡＤＭ分
子から成る。二官性化合物もジスルフィド結合を含み、
それを通して抗体に付着している。
【００５５】アントラサイクリンのＣ−１３位置に酸に
敏感なヒドラゾン結合を含む限り、ＡＤＭと抗体をつな
ぐ二官性化合物は、いくつもの要素や結合を含んでよ
い。好例の抗体はモノクローナル抗体５Ｅ９である。
【００５６】又、新規二官性化合物はアドリアマイシン
と化合して誘導体となり、更に還元剤ジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）またはトリブチルホスフィンと反応して、
二官性化合物の末端にスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含
むアドリアマイシン誘導体となる。例えば抗体をスクシ
ンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラー
ト（ＳＭＰＢ）と反応により、マレイミド基がすでに付
着しているモノクローナル抗体またはリガンドとこの誘
導体を反応させる。各ＡＤＭのＣ−１３位置のヒドラゾ
ン結合により付着した二官性化合物をもち、抗体の付着
部にチオエーナル結合をもつイムノコンジュゲートが形
成される。
【化２１】
【００５７】従って、ＡＤＭの１３−ケト位置のヒドラ
ゾン結合と、抗体と結びつくための反応性ピリジニルジ
チオまたはオルト−ニトロフェニルジチオ基を含む限
り、ＡＤＭと抗体またはリガンドとをつなぐ二官性化合
物は、いくつもの要素や結合を含んでよいのは明白であ
る。
【００５８】又、本発明の新規ＡＤＭ誘導体を、ボンベ
シン、ＥＧＦ、トランスフェリンのようなリガンドと反
応させる。リガンドは最初にチオール基またはマレイミ
ド基をもつよう誘導化される。ボンベシンの場合、シス
テイン残基がペプチドのアミノ末端に導入されて、ＡＤ
Ｍ誘導体とのコンジュゲーションのための反応性スルフ
ヒドリル基となる。ネズミＥＧＦの場合、ポリペプチド
がＳＰＤＰと反応して、分子のアミノ末端に反応性スル
フヒドリル基を導入する。トランスフェリンの場合、タ
ンパク質がまず２−ＩＴと反応して、タンパク構造に反
応性チオール基を導入する。各々の場合、チオール化し
たリガンドは次にＡＤＭ誘導体と反応して、本発明のア
ントラサイクリン−リガンドコンジュゲートとなり、そ
のコンジュゲートはリガンドとＡＤＭ間に二官性化合物
をもち、その二官性化合物はヒドラゾン結合を介して各
アントラサイクリン分子のＣ−１３位置に付着してい
る。
【００５９】本発明が、次の一般式Ｉ
【化２２】 （ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じであるか異な
るものであり）、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ
ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
２Ｈ５）２でありＲ３はＯＣＨ３、ＯＨまたは水素であ
り、Ｒ４はＮＨ２ 、ＮＨＣＯＣＦ３、４−モルホリニ
ル、３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニ
ル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミ
ン、ジベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−
シアノ−２−メトキシエチルアミンでありＲ５はＯＨ、
Ｏ−ＴＨＰまたは水素であり、Ｒ６はＯＨまたは水素で
あって、Ｒ５がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ６
はＯＨでない〕および一般式ＩＩ
【化２３】 （ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じであるか異な
るものであり）、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ
ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
２Ｈ５）２であり、Ｒ３はＯＣＨ３、ＯＨまたは水素で
あり、Ｒ４およびＲ７は各々、水素アルキル、置換アル
キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリル、
置換アリル、アラルキルまたは置換アラルキルであるか
またはＲ４、Ｒ７およびＮと共に、置換されていてもよ
い４〜７員環を形成し、Ｒ５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは
水素であり、Ｒ６はＯＨまたは水素であって、Ｒ５がＯ
ＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ６はＯＨでない〕を
有するアントラサイクリンの新規ヒドラジン誘導体を提
供するのは明白である。
【００６０】上述の二官性化合物およびアントラサイク
リンのＮ−置換ヒドラゾン誘導体は新規化合物である。
アントラサイクリンのヒドラゾン誘導体は新規細胞毒性
試薬として用いられ、また本発明の新規コンジュゲート
製造の中間体でもある。アントラサイクリンのヒドラゾ
ン誘導体は、アドリアマイシンセミカルバゾン、アドリ
アマイシンカルバゾン、アドリアマイシンチオセミカル
バゾン、アドリアマイシンカルボキシレートヒドラゾ
ン、アドリアマイシンアリルヒドラゾンによって例示さ
れ、各々具体例で示される。
【００６１】上の式からわかるように、本発明のＮ−置
換ヒドラゾンＡＤＭ誘導体は、アドリアマイシン、ダウ
ノマイシン、カルミノマイシンのような多くの既知のア
ントラサイクリンのうちのいずれのＮ−置換ヒドラゾン
も含む、更に、アントラサイクリン構造上特異的な場所
で誘導化されたＮ−置換ヒドラゾンも含む（例えば、
４′−ＴＨＰ−アドリアマイシンヒドラゾン、３′−デ
アミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）アド
リアマイシンヒドラゾン）。後者の誘導体は、まずアン
トラサイクリンを誘導化して、望む類似体とし、その類
似体を用いて本発明のＮ−置換ヒドラゾン誘導体とし、
合成できる。既知のアントラサイクリン類似体は、Ｕ．
Ｓ．特許Ｎｏ．４，４６４，５２９、４，３０１，２７
７（３′−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）また
は３′−デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリ
ニル）アントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎ
ｏ．４，２０２，９６７、４，３１４，０５４（３′−
デアミノ−３′−（１−ピペリジニル）または３′−デ
アミノ−３′−（４−メトキシ−１−ピペリジニル）ア
ントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，２
５０，３０３（Ｎ−ベンジルまたはＮ，Ｎ−ジベンジル
アントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，
５９１，６３７（Ｎ−メトキシメチルまたはＮ−シアノ
メチルアントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎ
ｏ．４，３０３，７８５（アントラサイクリンのアセタ
ール類似体）記載のものを含む。これら既知のアントラ
サイクリン類似体は、上で述べたように反応して、ＡＤ
Ｍの新規ヒドラゾン誘導体となり、望む特異性をもつ抗
体またはリガンドのような細胞反応性分子と上で述べた
ようにコンジュゲートできる。
【００６２】一方、本発明の誘導化しないＮ−置換ヒド
ラゾン誘導体がまず、上で述べたように誘導化しないア
ントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ダウノマ
イシン、カルミノマイシンから製造され、この新規誘導
体が次に誘導化されて、望むように置換した新規Ｎ−置
換ヒドラゾンとなる。例えば、セミカルバゾンＡＤＭ誘
導体が、Ｕ．Ｓ．特許４，４６４，５２９記載の方法に
よる、２，２′−オキシジアセトアルデヒドによる還元
的アミノ化により、アミノ糖部分で誘導化され、３′−
デアミノ−３′−（４−モルホリノ）アントラサイクリ
ンのセミカルバゾンとなる。更に、Ｎ−置換ヒドラゾン
誘導体は、式ＩおよびＩＩののＲ５の位置で、Ｕ．Ｓ．
特許４，３０３，７８５記載のように誘導化され、４′
−ＴＨＰ−ＡＤＭ Ｎ−置換ヒドラゾンのようなヒドラ
ゾンのアセタール誘導体となる。
【００６３】本発明のヒドラゾンを誘導化する方法は、
種々の化学療法剤を含め、他の試薬のＮ−置換ヒドラゾ
ンを出発物資として用いられると理解すべきである。ダ
ウノマイシン、カルミノマイシンのようなＡＤＭ以外の
アントラサイクリンが用いられ、Ｎ−べンジルダウノマ
イシンＮ−置換ヒドラゾン、３′−デアミノ−３′−
（４−モルホリニル）カルミノマイシンＮ−置換ヒドラ
ゾンのような新規化合物が製造され、これも本発明の範
囲内である。
【００６４】本発明のアントラサイクリン誘導体は、ｐ
Ｈ４．５、５．０、７．４での薬剤アドリアマイシンの
放出率で評価され、大きなレンジの放出率を示した。更
に、モノクローナル抗体にコンジュゲートした誘導体か
ら成るイムノコンジュゲートは、ｐＨ４．５でのアドリ
アマイシンの放出率で評価された。イムノコンジュゲー
トはコロニー形成阻害検定でＤａｕｄｉ細胞を用いて細
胞毒性をテストされ、ヒドラゾン誘導体の安定性との相
関性が表された。イムノコンジュゲートも大きなレンジ
の放出率を示し、コロニー形成検定で腫瘍細胞に対し、
抗体に導かれた細胞殺傷力（細胞毒性）を示した。
【００６５】本発明のＮ−置換ヒドラジン化合物は、タ
ーゲッティングする分子と細胞毒性試薬を連結するのに
有用な二官性化合物である。カルボニル基を含む細胞毒
性分子を連結するのに用いると、ｐＨのある範囲内で開
裂して細胞毒性試薬を放出する。酸に敏感な結合を提供
する。本発明のアントラサイクリンイムノコンジュゲー
トは、過去に報じられたイムノコンジュゲートよりも重
要であることは明らかで、過去に報じられたものは、ア
ントラサイクリンが抗体にアントラサイクリンのアミノ
糖部分を通して直接連結していて、これらアミノ糖連結
コンジュゲートはしばしば、抗体に対するアントラサイ
クリンのモル比がより低く、フリーのＡＤＭより弱く、
抗体結合特性の減少を示すからである（Ａｒｎｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．６
２，前述、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．３５，前述、ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａ
ｌ．，前述）。更に本発明のイムノコンジュゲートの安
定性が研究され、アントラサイクリンがイムノコンジュ
ゲートから、細胞環境で見られるのと同様の酸性条件で
放出されることを示した。従って、本発明のイムノコン
ジュゲートは、標的細胞へ運搬して比較的未修飾の薬剤
を放出するだろう。上述のコンジュゲートは薬剤輸送に
有利な、ｐＨのある範囲での薬剤の放出を提供するだろ
う。
【００６６】本発明の二官性化合物、イムノコンジュゲ
ート、その製造方法は、アントラサイクリン、アドリア
マイシンの誘導体が、抗−トランスフェリン受容体モノ
クローナル抗体、５Ｅ９とコンジュゲートしている例で
示される。
【００６７】本発明は又、がんやその他の腫瘍、非細胞
致死性のウィルス性または他の病原性の感染、自己免疫
不全のような疾患の治療のための、薬剤組成物、組み合
わせ、方法を含む。特に、アントラサイクリンを含むコ
ンジュゲート少なくとも１つの製薬上の有効量が製薬上
許容しうる手法で宿主哺乳動物に投与される、哺乳動物
の疾患治療のための方法を含む。
【００６８】本発明方法の一つの例は、組み合わせ化学
療法の方法で用いるために、同時にまたは続いて、いく
つかの異なるコンジュゲート、すなわち異なる細胞毒性
試薬をもつか異なる抗体またはリガンドをもつコンジュ
ゲートの投与を含む。例えば、コンジュゲートの抗体成
分の特異性が異なるアントラサイクリン イムノコンジ
ュゲートのいくつもの使用は本発明の具体例に含まれ、
すなわちいくつものイムノコンジュゲートが用いられ、
関心のある細胞集団に存在する、異なった抗原または同
じ抗原の異なった場所またはエピトープに特異的に結合
する抗体を各々もっている。これらイムノコンジュゲー
トのアントラサイクリン成分は同じであっても違ってい
てもよい。例えば、この例は、腫瘍表面の種々の多数の
抗原が既知であるか、腫瘍細胞集団が抗原の表れ方で異
種であって、十分な量の薬剤を腫瘍の場所で腫瘍細胞す
べてにターゲッティングすると確信したい、特定の腫瘍
の治療で特に有用であろう。腫瘍に対し異なる抗原特異
性または異なるエピトープ特異性をもつ、いくつものコ
ンジュゲートの使用は、腫瘍の場所で十分な薬剤を得る
可能性を増す。更に、正常な組織が、腫瘍に関連した抗
原と同じものすべてをもっている可能性は小さいから、
腫瘍に対して高度の特異性を達成するために重要である
（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｗｏ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｎ
ｔｉｇｅｎ ｐ９７ Ａｃｔ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ
ａｌｌｙ Ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１２７（Ｎｏ．１）ｐｐ．１５７−１６０（１
９８１）参照）
【００６９】一方、コンジュゲートのアントラサイクリ
ン成分だけが変わる、いくつもの異なるイムノコンジュ
ゲートが用いられる。例えば、特定の抗体がアドリアマ
イシンと連結して一つのイムノコンジュゲートをつく
り、ダウノマイシンと連結して第二のイムノコンジユゲ
ートをつくる。両方のコンジュゲートが宿主に投与さ
れ、除去したい選ばれた細胞集団の場所に、抗体の特異
性によって偏圧する。両方の薬剤がその場所で放出され
る。この方法は、標的細胞内または場所で、いくつもの
異なる薬剤が放出されるから、腫瘍のような特定の細胞
集団の薬剤耐性に関して不確かな時、この例は重要であ
ろう。もう一つの例は、アントラサイクリンの１以上の
型と、一つの特定の抗体とのコンジュゲーションを含
み、できたイムノコンジュゲートは、表面に沿って種々
の異なるアントラサイクリン分子をもち、すべて１３−
ケトヒドラゾン結合を介して抗体に連結している。この
例のイムノコンジュゲートの投与は、標的細胞内または
場所で、いくつもの異なる薬剤が放出することになる。
更にアントラサイクリン−リガンドコンジュゲートの組
み合わせを使用すると、薬剤は細胞表面に特定の抗体同
様受容体をもつ細胞集団へターゲッティングされる。一
種のアントラサイクリンまたはいくつもの異なる薬剤が
この組み合わせ療法で用いられる。
【００７０】本発明のコンジュゲートは、薬剤組成物の
形で、伝統的な投与方法を用いて投与され、限定するも
のではないが、静脈内、腹膜内、経口、リンパ内、また
は腫瘍のような選ばれた細胞集団の場所への直接投与を
含む。静脈内投与が好ましい。イムノコンジュゲートの
場合、生体内治療用に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２のよう
な抗体フラグメントまたはキメラ抗体を含むコンジュゲ
ートの使用が有用であろう。
【００７１】コンジュゲートを含む、本発明の薬剤組成
物は種々の投与形であってよく、限定するものではない
が、固体、半固体、液体の投薬形を含み、錠剤、丸薬粉
剤、溶体溶液または懸濁液、座薬、重合したマイクロカ
プセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、注入でき
るまたは溶解しない溶液などである。好ましい形は、投
与方法や治療適用による。
【００７２】薬剤組成物は、伝統的な製薬上許容しうる
担体を含み、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク
質、リン酸塩のような緩衝液物質、水、生理食塩水、電
解液などである。
【００７３】本発明のコンジュゲート成分に対する、投
与、投薬管理の最も効果的な方法は、疾患の厳しさや道
すじ、患者の治ゆ力や治療の反応、治療する医師の判断
による。更にコンジュゲートと何か添付する化合物の投
与形は、個々の患者によるべきだ。しかしながら、本発
明のアントラサイクリン イムノコンジュゲートの有効
投薬量は、アントラサイクリン約１〜１００ｍｇ／ｍ２
または抗体約５００〜５０００ｍｇ／ｍ２の範囲であろ
う。アントラサイクリン−リガンドコンジュゲートの有
効投薬量は、アントラサイクリン約１〜１００ｍｇ／ｍ
２またはリガンド約１〜１００ｍｇ／ｍ２の範囲であろ
う。
【００７４】上に述べた発明をさらに良く理解されるよ
うに、実施例を置く。これら実施例は説明の目的のため
だけであって、この発明の範囲を限定するものでないこ
とを理解すべきである。
【００７５】
【実施例】二官性化合物およびアドリアマイシン（ＡＤＭ）の誘導
体の製造 融点（ＭＰ）はＦｉｓｈｅｒ−Ｊｏｈｎｓ（Ｍｅｄｆｏ
ｒｄ，ＭＡ）融点測定装置で測定し、未修正である。核
磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｃｋｅｒＡＭ
３００機器で得た。赤外（ＩＲ）スペクトルはＫＢｒ小
球またはＣｈＣｌ３溶液でＰ−Ｅ ＦＴＩＲ（フーリエ
変換赤外）機器（Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＴ）、型１８００
でとった。ＭＳ（質量分析）とＨＲＭＳ（高分解能質量
分析）はＫｒａｔｏｓ ＭＳ２５ＲＦＡとＭＳ５０ＴＣ
機器（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）でそれぞれ得た。
フラシュ クロマトグラフィーはＷｏｅｌｍ（Ａｔｌａ
ｎｔａ，ＧＡ）シリカゲルゲル（シリカ３２−６３）を
用いて行った。薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はＡ
ｎａｌｔｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）シリカゲルＧＨＬ
ＦプレートまたはＲＰＳ−Ｆ逆相プレート、共に２５０
ミクロンで行った。ルーチン高圧液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）用に、Ｐ−Ｅポンプ、シリーズ４ＬＣ、
ＨＰ １０４６Ａ蛍光検出器、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ
（Ｊｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）ＩＢ Ｓｉｌ−５Ｃ１８
（１５０×４．６ｍｍ）カラムが用いられた。移動相は
７０：３０メタノール−リン酸塩緩衝液（５０ｍｍｏｌ
リン酸アンモニウム、ｐＨ４．４）であり、流速１．５
ｍｌ／分で行った。放出率測定のため、ＨＰＬＣシステ
ムは、二台のＷａｔｅｒｓポンプ型５１０、オートサン
プラー型７１２、傾斜コントローラー型６８０を含ん
だ。クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ Ｃ−１８カラ
ムで行い、移動相はギ酸トリエチル−アンモニウム緩衝
液（０．０５Ｍ ｐＨ２．８）とアセトニトリルが各々
６８：３２の混合液である。溶離したアドリアマイシン
の蛍光は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ
ａｍｓｅｙ，ＮＪから得たＡＢＩ蛍光検出器型９８０
（励起、２５４ｎｍ；蛍光、５５０ｎｍ）を用いて検出
された。酢酸塩緩衝液はｐＨ４．５と５．０で用いら
れ、リン酸緩衝溶液はｐＨ７．４で用いられた。アドリ
アマイシン塩酸塩はサンラク（日本）から得た。その他
のすべての化学薬品は市販源から得た。元素分析はＢｒ
ｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＴの分析部門とＯｎｅ
ｉｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓで行っ
た。
【００７６】実施例１ 二官性化合物１０およびＡＤＭのセミカルバゾン誘導体
の製造 この実施例は二官性化合物と、ＡＤＭのＣ−１３位置に
セミカルバゾン結合をもつＡＤＭのセミカルバゾン誘導
体を製造する方法を述べる。Ｎ−〔２−〔（２−ピリジ
ニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド（化
合物１０）は化１４に示した反応で製造される。システ
アミン塩酸塩をメトキシカルボニルスルフェニル クロ
リド次いで２−メルカプトピリジンと反応させて２−
（２−ピリジニル）ジチオエタンアミン塩酸塩（化１４
の化合物９）とする。これを次にホスゲンとｔ−ブチル
カルバザート、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と
反応させて、望む生成物（化合物１０）を得る。
【００７７】２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタン
アミン塩酸塩の製造 メトキシカルボニルスルフェニル クロリド（Ｚｕｍａ
ｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｎｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔ．９：５４−６３（１９
７０），（６．３３ｇ，５０ｍｍｏｌ）のＨＰＬＣのグ
リードのメタノール（１００ｍｌ）溶液をＮ２下かくは
んし、氷で冷やす。これに、２−アミノエタン−チオー
ル塩酸塩（５．７ｇ、５０ｍｍｏｌ）のメタノール（５
０ｍｌ）溶液を滴下する。加え終って、室温（ＲＴ）で
２時間かくはんする。溶媒を蒸発させ、残オイルをアセ
トン（１００ｍｌ）から結晶化させ、固体（６．９ｇ）
が得られる。この固体をメタノール（１００ｍｌ）に溶
かす。氷で冷やし、Ｎ２下かくはんし、２−メルカプト
ピリジン（３．８２ｇ、３４ｍｍｏｌ）のメタノール
（５０ｍｌ）溶液を滴下する。１時間ＲＴでかくはん
し、少量に濃縮し、結晶化するまでアセトンで除々に希
釈する。冷蔵庫に１時間置いた後、固体を濾過して集
め、乾燥して、化合物２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エタンアミン塩酸塩（化合物９）を得る。この化合
物はＦｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ，２９：１６３２−１６３５（１９６４）およびＣｏ
ｎｎｏｒ ａｎｄＳｃｈｒｏｉｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
７：８４８−８５１（１９８８）にかかれている。化合
物の特性は次の通りである。 ｍｐ １２３−５゜（５．８ｇ，５２％）．ＩＲ（ＫＢ
ｒ）２９５２，２９１３，１６１０，１５７５，１５５
９，１４５１，１１１５，７６７ｃｍ−１．ＮＭＲ（Ｄ
２Ｏ）．δ ８．４６，７．８３，７．３４（ｄ，ｍ，
ｍ ４Ｈ，Ｐｙ），３．３７（ｔ，２Ｈ ＣＨ ２ ＣＨ
２ ＮＨ２），３．１２（ｔ，２Ｈ，ＳＣＨ２ Ｃ
Ｈ２）． ＭＳ（ｍ／ｅ）：１８７（［Ｍ＋Ｈ］＋に相
当）１７０，１５２，１４２，１１２，１０４，７６． 元素分析：計算値Ｃ７Ｈ１１ＣＬＮ２Ｓ２．１／４ Ｈ
２Ｏ： Ｃ，３７．００，Ｈ，５．０６，Ｎ，１２．３
３． 実測値Ｃ，３６．８２： Ｈ，４．９９，Ｎ，１
２．３７．
【００７８】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン
カルボキサミド） ２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタンアミン塩酸塩
（２．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン（１
００ｍｌ）に懸濁させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）
（５．８ｍｌ）で処理する。この溶液を、氷で冷やしな
がらかくはんするホスゲン（１．９３Ｍトルエン溶液１
０ｍｌ）の塩化メチレン（２００ｍｌ）溶液に滴下す
る。反応をＴＬＣでモニターし、出発物質がなくなった
ら、しばらくの間混合液にＮ２を通す。その後ｔ−ブチ
ル カルバザート（１．３２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加
え、一夜かくはんする。溶液を水で洗い、溶媒を蒸発さ
せる。残渣を、塩化メチレン：メタノール（１００：
２）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフィーする。適
当なフラクションを集め、１．７４ｇのＮ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−２−（ｔ−ブ
トキシカルボニル）ヒドラジンカルボキサミド（化合物
９ａ）を泡状で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３２８１，２９７９，２９３２，１７２
３，１６７２，１５７７，１５６０，１５４５，１４４
８，１４１９，１２５３，１１６１，７６２ｃｍ−１．
ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）δ ８．５０，７．５６，７．
５１，７．１２（４Ｈ，Ｐｙ），３．５１（２Ｈ，ＣＨ
２），２．８９（２Ｈ，ＣＨ ２Ｓ），６．８４，６．３
７，６．１７（３Ｈ，ＮＨ），１．４４（９Ｈ），（Ｃ
Ｈ３）３Ｃ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）３４５（［Ｍ＋Ｈ］＋
に相当），３１７，２８９，２４５，２１３，１７８，
１３４，１１２
【００７９】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕ヒドラジンカルボキサミド Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−２
−（ｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジンカルボキサミ
ド（５７０ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を氷で冷やしたＴ
ＦＡ（１０ｍｌ）に溶かす。氷中で１０分間かくはん
し、続いて冷やさずに１０分間かくはんする。ＴＦＡを
減圧でできるだけ蒸発させ、残渣を塩化メチレン：メタ
ノール：農水酸化アンモニウム（１００：５：０．５）
溶媒系を用いシリカでクロマトグラフィーする。適当な
フラクションをＴＬＣによって集め、溶媒を蒸発させて
結晶性残渣（０．４２ｇ、定量的）を残す。分析用サン
プルはＩＰＡから結晶化し、ｍｐ１０５−７°、Ｎ−
〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジ
ンカルボキサミド（化合物１０）は次のような特性であ
る。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３３６，３２２０，３０６４，２９４
９，２６３４，１６７０，１６２３，１５７５，１５６
２，１１−３３，１４５２，１３６９，１１７２，１０
４６，７７０ｃｍ−１． ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ
８．４１，７．７８，７．２１（４Ｈ，Ｐｙ），３．４
３（２Ｈ，ＮＣＨ２ ），２．９１（２Ｈ，ＳＣＨ２ ）．
ＭＳ（ｍ／ｅ）２４５（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当，２２
１，２１３，１６２，１３４，１１２． 元素分析：計算値Ｃ８Ｈ１２Ｎ４ＯＳ２： Ｃ，３９．
３２，Ｈ，４．９５；Ｎ，２２．９３； Ｓ，２６．２
４．実測値Ｃ，３９．１９； Ｈ，４８６；Ｎ，２２．
４８； Ｓ，２５．０２．
【００８０】アドリアマイシン塩酸塩およびＮ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕 ヒドラジンカルボキサミドのセミカルバゾン誘導体の製
造 化合物１０（０．３７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）のメタノー
ル（２５ｍｌ）溶液をアドリアマイシン塩酸塩（０．６
６ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍｌ）懸
濁液にかくはんしながら加える。ＴＦＡ（５滴）を加
え、一夜かくはんする。澄んだ溶液を濃縮し、０．３％
酢酸アンモニウムを含むメタノール：水（６０：４０）
を溶媒系として用いＣ−１８カラムでクロマトグラフィ
ーする。適当なフラクションを集め、メタノールをでき
るだけ蒸発させる。水相を凍結乾燥し、残渣をメタノー
ルに溶かし、アセトニトリルに加える。濾過により赤色
の固体を集め、乾燥する（０．６５ｇ、６８％）。ＡＤ
Ｍのセミカルバゾン誘導体は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３９９，２９７６，２９３６，１６７
１．１６１８，１５７８，１５３８，１４１７，１２８
６，１２１０，１１１７，１０１５，９８９，７６４ｃ
ｍ−１．ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ８．２５，７．７
６，７．６２，７．４８，７．０７（ｐｙ，ｐｈ，
Ｈ），４．９５（アノマーＨ），４．６３（ＣＨ２Ｏ
Ｈ），４．２４（ＣＨ ３ＣＨ），３．９７（ＯＣ
Ｈ３），３．５−２．９（クラスター吸収ＳＳＣＨ２ ，
−ＣＨ２−，ＣＨ２−ＮＨ），１．２９（ＨＣ−Ｃ
Ｈ ３）．ＭＳ（ｍ／ｅ）７７０（［Ｍ＋Ｈ］＋に相
当），６４１，４３７，３４６． ＨＲＭＳ： 計算値
Ｃ３５Ｈ４０Ｎ５Ｏ１１Ｓ２： ７７０．２１６６；実
測値：７７０．２１５７．
【００８１】実施例２ 二官性化合物１１ａおよびＡＤＭのカルバゾン誘導体の
製造 この実施例は、カルバジド二官性化合物とＡＤＭのＣ−
１３位置にカルバゾン結合をもつＡＤＭのカルバゾン誘
導体を製造する方法を述べる。２−〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕−エタンアミン塩酸塩をｔ−ブチルカルバ
ザート、トリホスゲンと反応させて、化１５に示すよう
に、二官性化合物（化合物１１ａ）、カルバジドを得
る。過剰のｔ−ブチルカルバザートはホスゲンと反応し
てカルボニックジヒドラジドとなる。
【００８２】２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，２′−ビス
（ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニック ジヒドラジ
ド ｔ−ブチル カルバザート（０．３９６ｇ，３ｍｍｏ
ｌ）を乾燥クロロホルム（１０ｍｌ）に溶かす。その溶
液をＮ２下、ＲＴでかくはんし、ＴＥＡ（０．６ｇ、６
ｍｍｏｌ）を加える。これにトリホスゲン（０．２９６
ｇ、１ｍｍｏｌ）を一気に加える。活発な反応が起こ
り、静まってから、２−（２−ピリジニルジチオ）エタ
ンアミン塩酸塩（０．６６７ｇ、３ｍｍｏｌ）のＴＥＡ
（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を含むクロロホルム溶液を加
える。ＲＴで１．５時間かくはんし、水（３×２０ｍ
ｌ）で洗い乾燥して、減圧で溶媒を蒸発させると、泡
（０．９１ｇ）が残る。これを塩化メチレン：メタノー
ル（１００：２）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフ
ィーする。フラクションをＴＬＣでモニターし集める
と、化合物２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，２′−ビス
（ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニック ジヒドラシ
ド（化合物１１）を泡状で得る（０．５４ｇ、５２
％）。化合物１１は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３０２，２９８０，２９３３，１７２
６，１６８３，１４９８，１２５２，１１６０，１０４
７，１０１８，７６３ｃｍ−１． ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ３）δ ８．５０，７．５７，７．４９，７．１０，
（ｄ，ｑ，ｄ，ｔ，４Ｈ，Ｐｙ），３．５２（ｔ，２
Ｈ，ＳＳＣＨ２ ）２．９０（ｔ，２Ｈ ＣＯＮＣ
Ｈ ２），１．４６［Ｃ（ＣＨ３）３］，８．３０，６．
５０，６．２９（ｂ，ｓ，ｓ，ＮＨ）． ＭＳ（ｍ／
ｅ）５０３（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），４４７，４３１，
４１９，４０３，３４７，３０３，２１３，１７９，１
１２．
【００８３】２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニック ジヒ
ドラジド 化合物１１（０．３４ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に氷で冷
やしたＴＦＡ（５ｍｌ）を加えて１０分間かくはんし、
続いて冷やさずに１０分間かくはんする。ＴＦＡをでき
るだけ蒸発させ、残渣を、塩化メチレン：メタノール：
濃ＮＨ４ＯＨ（１００：５：０．５）溶媒系を用いシリ
カでクロマトグラフィーする。適当なフラクションを集
め、蒸発後化合物１１ａを吸湿性泡で得る（０．２ｇ、
定量的収率）。化合物１１ａは次のような特性である。 ＩＲ（フィルム）３３３０，２９６４，２９２９，１６
９８，１６６０，１５７６，１４８６，１２３１，１０
４５，７５９ｃｍ−１． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ
８．５０，７．５６，７．１０（ｄ，ｍ，ｍ，４Ｈ，Ｐ
ｙ），３．５２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ ２Ｎ），２．９１
（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ ＳＳ），８．８７，８．８５，４．
１９，３．７８（Ｄ２Ｏ可交換プロトン，ＮＨ）． Ｍ
Ｓ（ｍ／ｅ）３０３（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），２１３，
１１２．
【００８４】アドリアマイシン塩酸塩および２−
〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミ
ノ〕カルボニル〕カルボニック ジヒドラシドのカルバ
ゾン誘導体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（３５６ｍｇ、０．６ｍｍｏ
ｌ）と化合物１１ａ（０．２ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）
を、２〜３滴のＴＦＡを含むメタノール（５０ｍｌ）中
で一夜かくはんする。澄んだ溶液が得られ、ＨＰＬＣ
（メタノール：０．０１Ｍリン酸アンモニウム溶液、ｐ
Ｈ４．５、７０：３０溶媒系）は、９０％以上のアドリ
アマイシンがセミカルバゾンに変わったことを示す。溶
媒を蒸発させ、残渣を、０．３％酢酸アンモニウムを含
むメタノール：水（６０：４０）溶媒系を用いＣ−１８
カラムでクロマトグラフィーする。逆相ＴＬＣ（０．３
％酢酸アンモニウムを除き同じ溶媒系）および／または
ＨＰＬＣでフラクションをモニターし、アドリアマイシ
ンのないフラクションを集める。メタノールの大部分を
減圧で蒸発させる。水溶液を凍結乾燥し、赤色の残渣を
少量のメタノールに溶かす。溶液を濾過し、アセトニト
リル（１１）にかきまぜながら加える。澄んだ溶液を約
１／３まで濃縮し、得られた固体を遠心分離により集
め、乾燥して、ＡＤＭのカルバゾン（化合物４）（１６
０ｍｇ）を得る。溶液を１００ｍｌにまで濃縮し、エー
テルで希釈し、遠心分離により固体を集めて、更に８５
ｍｇ得る（合計収率４９％）。このカルバゾン誘導体は
次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３３４６，２９７５，２９３６，１７
１１，１６６８，１６１８，１５７８，１２８６，１２
１０，１０８３，１０１５，７６５ｃｍ−１．ＮＭＲ
（ＣＤ３ＯＤ）δ ８．４３，７．８９，７．７７，
７．５２，７．２１．（Ｐｙ，Ｈ），５．１５（アノマ
ーＨ）４．５７（ＣＨ２ ＯＨ），４．２５（ＣＨ３ Ｃ
Ｈ），３．９９（ＯＣＨ ３），３．５３（ＳＳＣ
Ｈ ２），３．１７（−ＣＨ２−，ｒｉｎｇ），３．０５
（ＣＨ ２ＮＨ＝），２．３８（−ＣＨ２，環）１．２９
（ＣＨＣＨ ３）． ＭＳ（ｍ／ｅ）８２８（［Ｍ＋Ｈ］
＋に相当），６９９，５７２，５３７，３７７，３４
６，２８９，２１３．
【００８５】実施例３ 二官性化合物１２およびＡＤＭのチオセミカルバゾン誘
導体の製造 この実施例は、二官性化合物（化合物１２）とＡＤＭの
Ｃ−１３位置にチオセミカルバゾン結合をもつＡＤＭの
チオセミカルバゾン誘導体を製造する方法を述べる。こ
の実施例では、実施例１で述べたセミカルバジド（化合
物１０）のチオ類似体を化１６に図示するように製造す
る。２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタンアミンを
用いると、最後から二番目の工程で、チオセミカルバジ
ド部分の求核性が強いために２−メルカプトピリジンの
脱離が見られた。この問題は化１６に示すようにトラン
ス−２−ブテン基を用いてきりぬけた。
【００８６】１−ブロモ−４−（Ｎ−フタルイミド）−
２−ブテンの製造 １，４−ジブロモ−２−ブテン（８．４ｇ、４０ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ（２００ｍｌ）溶液にフタール酸イミドカ
リウム（４．６２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を１時間かけて少
量ずつ加える。一夜かきまぜた後、溶媒を蒸発させ、残
渣を水と塩化メチレンに分配する。有機相を数回水で洗
い、乾燥し、溶媒を蒸発させる。残渣を２−プロパノー
ルから結晶化させて、望む生成物１−ブロモ−４−（Ｎ
−フタルイミド）−２−ブテン（３．９５ｇ、５９％）
を得、次のような特性である。 ｍｐ １０１−２゜． ＩＲ（ＫＢｒ）１７７５，１７
１１，１４６６，１４３６，１３９３，７２３ｃ
ｍ−１． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．８１，７．７
３（ｍ，ｍ ４Ｈ，ｐｈ），５．８８，５．８１（ｍ，
ｍ ２Ｈ，２＝ＣＨ −１）４．３０（ｄ，２ＨＣＨ ２−
Ｎ），３．９０（ｄ，２Ｈ ＣＨ ２Ｂｒ）．ＭＳ（ｍ／
ｅ）２８０（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），２００． 元素分析：計算値 Ｃ１２Ｈ１０ＢｒＮＯ２： Ｃ，５
１．４５；Ｈ，３．６０； Ｎ，５．００． 実測値：
Ｃ，５２．３５； Ｈ，３．４７，Ｎ，４．８０．
【００８７】１−（アセチルチオ）−４−（Ｎ−フタル
イミド）−２−ブテンの製造 無水エタノール（５０ｍｌ）中の、１−ブロモ−４−
（Ｎ−フタルイミド）−２−ブテン（３．９５ｇ、１４
ｍｍｏｌ）とチオ酢酸カリウム（１．７７ｇ、１５．５
ｍｍｏｌ）の混合物を１／２時間還流する。溶媒を蒸発
させ、残渣を蒸発させ、残渣を塩化メチレンで抽出す
る。溶媒を蒸発させて、結晶性残渣（３．８５ｇ、９９
％）を得、そのまま次の工程で用いる。分析用サンプル
は２−プロパノールから結晶化し、ｍｐ６９−７１°で
ある。この化合物は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）１７６９，１７１３，１６８８，１４２
７，１３９１，１１１４，９５８ｃｍ−１． ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ３）δ ７．８０，７．７３（ｍ，ｍ４Ｈ
Ｐｈ），５．７０（ｍ，２Ｈ，２ ＝ＣＨ−），４．２
４（ｄ，２Ｈ，ＣＨ ２ Ｎ），３．４８（ｔ，２Ｈ Ｃ
Ｈ ２Ｓ），２．２９（ｓ，３Ｈ，Ｃ−ＣＨ ３）． ＭＳ
（ｍ／ｅ）２７６（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），２３４，２
００． 元素分析：計算値Ｃ１４Ｈ１３ＮＯ３Ｓ： Ｃ，６１．
０７； Ｈ，４．７６；Ｎ，５．０９． 実測値：
Ｃ，６１．２９；Ｈ，４．８２，Ｎ，５．２１
【００８８】１−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジ
チオ〕−２−ブテン塩酸塩の製造 １−アセチルチオ−４−（Ｎ−フタルイミド）−２−ブ
テン（６．５ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）の無水エタノール
（１５０ｍｌ）溶液とヒドラジン（１．７４ｇ、５４ｍ
ｍｏｌ）を還流する。反応をＴＬＣで追い、出発物質が
なくなってから、溶液を氷で冷やし、６ＮＨＣｌ（１０
ｍｌ）で処理する。生じたかさ高の沈澱物はフタルヒド
ラジドと固定され（ＮＭＲ，ＭＳ）濾過する。濾液を１
０ｍｌまで濃縮し、水で希釈する。固体を濾過して除
き、濾液をエーテル（２Ｘ）と塩化メチレン（１Ｘ）で
洗い、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、凍結乾燥する。固体を少
量のメタノールに溶かし、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、溶媒
を蒸発させ、一夜排気する。ろう状の吸湿性物質を得、
次の特性をもつ。 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ２Ｏ）δ ５．８３，５．６０
（ｍ，ｍ ２Ｈ，２ ＝ＣＨ−）３．４０（ｄ，２Ｈ
ＣＨ２ ＮＨ２），３．１６（ｄ ２Ｈ，ＣＨ ２ＳＨ）Ｍ
Ｓ（ｍ／ｅ）１０４（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），８７，７
０． このろう状物質をＨＰＬＣグレードのメタノール（７５
ｍｌ）に溶かす。溶液をかくはんし、メトキシカルボニ
ルスルフェニル クロリド（３ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）
で処理する。１／２時間後、ＴＬＣで出発物質は見つか
らない。溶媒を蒸発させ、メタノール（７５ｍｌ）に溶
かす。溶液をかくはんし、２−メルカプトピリジン
（２．７ｇ、２４ｍｍｏｌ）で処理する。２時間後溶媒
を蒸発させ、高真空で排気する。残渣を、０．０１Ｎ
ＨＣｌとメタノール混合液（９０：１０、１３０ｍｌ）
に溶かす。濁った溶液を塩化メチレンで洗い、Ｃｅｌｉ
ｔｅで濾過し、凍結乾燥して、１−アミノ−４−〔（２
−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテン塩酸塩を吸湿性の
高い綿毛状物質（４ｇ、６８％）として得、次のような
特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４３３，２９５９，２８８４，１６０
７，１５７６，１４４７，１４１８，１１１８，７６７
ｃｍ−１． ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ ８．５１，８．１
３，８．０２，７．５４（ｍ ４Ｈ，Ｐｙ）５．８７，
５７２（ｍ，ｍ２Ｈ，２ ＝ＣＨ−）３．５４（ｄ ２
Ｈ，ＣＨ ２ ＮＨ２）３．４３（ｄ ２Ｈ，ＣＨ２
Ｓ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）２１３（［Ｍ＋Ｈ］＋に相
当），１９６，１１２．
【００８９】Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミドの製造 １−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−
ブテン塩酸塩（１．５ｇ、６ｍｍｏｌ）をかきまぜなが
ら塩化メチレン（３０ｍｌ）に懸濁させる。ＴＥＡ
（１．４６ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を加え、続いてジ−
２−ピリジル チオノカーボネート（Ｋｉｍ ａｎｄ
Ｙｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：１６
６１−１６６４（１９８５）），（１．４ｇ、６ｍｍｏ
ｌ）を加える。澄んだ溶液が得られ、ＴＬＣが出発物質
のないことを示す。ｔ−ブチル カルバザート（０．８
ｇ、６ｍｍｏｌ）を加え、１時間かくはんする。溶液を
水で洗い、溶媒を蒸発させる。残渣を塩化メチレン：メ
タノール（１００：２）溶媒系を用いシリカでクロマト
グラフィーし、ヘキサン：酢酸エチル（７５：２５）溶
媒系を用いて再クロマトグラフィーして、Ｎ−〔４−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル〕ヒドラ
ジンカルボチオアミドのｔ−Ｂｏｃ誘導体（１．４ｇ、
５８％）を泡状で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３２３８，２９７１，２９３０，１７１
８，１５４４，１４１８，１１５６，７６２ｃｍ−１．
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／Ｄ２Ｏ）δ ８．４３，７．６
５，７．０８（ｍ，ｍ，ｍ ４Ｈ，ｐｙ）５．５７（ｍ
２Ｈ，２＝ＣＨ），４．１２（ｄ ２Ｈ，ＣＨ ２
Ｎ）３．４５（ｄ ２Ｈ ＣＨ ２Ｓ），１．４６（Ｓ
９Ｈ，３ ＣＨ３ ）．ＭＳ（ｍ／ｅ）３８７（［Ｍ＋
Ｈ］＋に相当），３５５，２８７，２７６，１１２．
【００９０】保護カルボチオアミド（０．８６ｇ、２．
２ｍｍｏｌ）を氷で冷やしたＴＦＡに溶かす。氷で１０
分間冷やし（Ｎ２下）、続いて１０分間冷やさずに置
く。過剰の酸をできるだけ高真空で蒸発させ、残渣を塩
化メチレン：メタノール：濃ＮＨ４ＯＨ（１００：５：
０．５）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフィーす
る。適当なクラクションを集めて、化合物１２をゴム状
（０．３９ｇ、６３％）で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（フィルム）３３２２，３１９８，２９７４，１６
２６，１５７４，１５６０，１５３８，１４４８，１４
１８，１２２４，７６０ｃｍ−１． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ
３／Ｄ２Ｏ）δ ８．４１，７．６３，７．１１（ｍ
ｍｍ ４Ｈ，Ｐｙ）５．６４（ｍ ２Ｈ，２＝ＣＨ），
４．２０（ｄ ２Ｈ，ＣＨ ２Ｎ）３．４１（ｄ ２Ｈ，
ＣＨ ２Ｓ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）２８７（［Ｍ＋Ｈ］＋に
相当），２２５，２２１，１４４，１１２．
【００９１】アドリアマイシン塩酸塩およびＮ−〔４−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル〕 ヒドラジンカルボチオアミドのチオセミカルバゾン誘導
体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（３５０ｍｇ、０．６ｍｍｏ
ｌ）のＨＰＬＣグレードのメタノール（５０ｍｌ）懸濁
液にかきまぜながら、化合物１２（３５０ｍｇ、１．２
ｍｍｏｌ）のＨＰＬＣグレードのメタノール（２５ｍ
ｌ）溶液を加える。ＴＦＡ（３〜４滴）を加え、一夜か
くはんする。澄んだ溶液が得られ、フリーのアドリアマ
イシンが残っていないことがＨＰＬＣまたはＴＬＣで示
される。溶液を少量（５ｍｌ）に濃縮し、アセトニトリ
ル（６００ｍｌ）に加える。沈澱を生じ、冷蔵庫で冷や
して、遠心分離で集め、高真空で乾燥させる（２７５ｍ
ｇ、５４％）。チオセミカルバゾン誘導体は、次のよう
な特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４１８，２９３４，１６１６，１５７
８，１５３４，１４１４，１２８４，１２０８，１０１
２，９８６ｃｍ−１． ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ８．
３０，７．８０，７．７４，７．５２，（Ｐｙ，ｐｈ
７Ｈ），５．６０（２＝ＣＨ）５．４０（アノマーＨ）
４．６７（ＣＨ ２ＯＨ），４．２２（ＣＨ ３ＣＨ）４．
０９（ＣＨ２Ｎ）４．０２（ＯＣＨ３）３．５−１．８
８（クラスター吸収−ＣＨ ２−ＳＳ，−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ），１．３０（ＣＨ ３−ＣＨ）．ＭＳ（ｍ／ｅ）８１
２（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），７０１，６８３，６６９，
５７２，５５４，５４０，５３６，５２２，５０４．
ＨＲＭＳ計算値 Ｃ３７Ｈ４２Ｎ５Ｏ１０Ｓ３： ８１
２．２０９４； 実測値８１２．２０８７．
【００９２】実施例４ 二官性化合物１３およびＡＤＭのカルボキシレートヒド
ラゾン誘導体の製造 この実施例は、新規二官性化合物１３およびＡＤＭのカ
ルボキシレートヒドラゾン誘導体の製造を述べている。
カルボキシレートヒドラゾン二官性化合物は、化１７に
示すように、メルカプトエタノールを誘導化してピリジ
ニルジチオエタノールとし、この化合物を活性化カルボ
ニル誘導体に変えてヒドラジンと縮合させて製造する。
【００９３】２−〔（２−（ピリジニル）ジチオ〕エチ
ル ヒドラジンカルボキシレートの製造 クロロカルボニルスルフェニル クロリド（１．２４
ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）冷
溶液（０℃）に、２−メルカプトエタノール（７３７ｍ
ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）を滴下する。３０分間０°〜１
５℃でかくはんし、０℃に冷やして、２−メルカプトピ
リジン（１．０５ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ
２（１５ｍｌ）溶液で処理する。０℃で１時間かくはん
し、次に室温で１６時間かくはんする。炭酸アンモニウ
ム溶液（水２０ｍｌ中に１．０ｇ）を加えて、相を分
け、有機相を水で洗い、乾燥し、減圧濃縮して粗２−
（２−ピリジニルジチオ）エタノール（１．７５ｇ）を
無色オイルで得る。カルボニルジ−イミダゾール（６４
８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を２−（２−ピリジニルジチオ）
エタノール（７１４ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃ
ｌ２（１０ｍｌ）溶液に加える。混合物を２０分間かく
はんし、−２０℃に冷やし、ヒドラジン（１２２ｍｇ、
３．８ｍｍｏｌ）で処理する。−５℃に１６時間置き、
減圧濃縮する。残渣を塩化メチレン：メタノール（１０
０：１〜３）溶媒系をシリカゲルでクロマトグラフィー
して、化合物１３．２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル ヒドラジンカルボキシレート（３４０ｍｇ、３
７％）を無色のオイルで得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．４６（１Ｈ），７．６２
（２Ｈ），７．０８（１Ｈ），５．９２（１Ｈ），４．
３５（ｔ，２Ｈ），３．７０（ｓ，ＺＨ），３．０１
（ｔ，２Ｈ），１．５６（ｓ，２Ｈ）． ＭＳ（ｍ／
ｅ）２４６（［Ｍ＋Ｈ］＋相当），１４２，１０３．
【００９４】アドリアマイシン塩酸塩および２〔（２−
ピリジニル）ジチオ〕エチル ヒドラジンカルボキシレ
ートのヒドラゾン誘導体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（２９０ｍｇ、０．５ｍｍｏ
ｌ）の無水メタノール（４ｍｌ）懸濁液に、化合物１３
（１７０ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍ
ｌ）溶液を、ＣＦ３ＣＯ２Ｈ（６ｍｇ）のメタノール
（１ｍｌ）溶液を加える。２４時間かくはんし、約４ｍ
ｌまで濃縮し、この溶液にアセトニトリル（５０ｍｌ）
を加える。生成物を遠心分離で分ける。固体を水−メタ
ノールに溶かし、凍結乾燥し、アドリアマイシンのヒド
ラゾン誘導体（３５４ｍｇ、８８％）を暗赤色の固体で
得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ８．３４（１Ｈ），７．９３
（ｄ，１Ｈ），７．８１（ｍ，３Ｈ），７．５４（ｄ，
１Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｍ，１
Ｈ），５．１９（ｓ，１Ｈ），４．５９（ｍ，２Ｈ），
４．３７（ｍ，２Ｈ），４．２５（ｍ，１Ｈ），４．０
１（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｍ １Ｈ），３．５４
（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｔ，３Ｈ），２．３７（ｍ，
２Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．８９（ｍ，１
Ｈ），１．２９（ｄ，３Ｈ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）：７７
１（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），６４２．
【００９５】実施例５ 二官性化合物１５およびＡＤＭのアリルヒドラゾン誘導
体の製造 この実施例は、新規二官性化合物（化合物１５）および
ＡＤＭのＣ−１３位置にアリルヒドラゾン結合をもつＡ
ＤＭのアリルヒドラゾン誘導体の製造方法を述べてい
る。化合物１５は、４−Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ安息香
酸を用い、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン
基を結合させて、化１８に示すように製造される。
【００９６】４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸
の製造 ｐ−ヒドラジノ安息香酸（７６０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）
を、ジオキサン（１０ｍｌ）、水（５ｍｌ）、１ＮＮａ
ＯＨ溶液（５ｍｌ）に溶かす。ジ−ｔ−ブチルピロカー
ボネート（１．３１ｇ、６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、０
℃で１時間、ＲＴで３０分かくはんする。その後溶液の
かさを半分にし、０．５％ＨＣｌ溶液で酸性にし、Ｅｔ
ＯＡｃで抽出する。集めたＥｔＯＡｃ溶液をブラインで
洗い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。溶媒を除くとわずかに
褐色の固体が得られ、ＥｔＯＡｃとヘキサンから再結晶
する（９５０ｍｇ、７５％）。次のような特性である。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ７．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝
８．５ Ｈｚ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５ Ｈ
ｚ），１．４８（ｓ，９Ｈ）； ＩＲ（ＫＢｒ）３３１
６，１６８８，１６０７，１２９８ｃｍ−１．
【００９７】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチルー４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）ベンズアミド
の製造 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ）中
の、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸（２５２
ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（１１５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシル−カル
ボジイミド（ＤＣＣ）（２４７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）
を一夜室温でかくはんする。ジシクロヘキシルウレア
（ＤＣＵ）を濾過して除き、濾液を蒸発させる。残渣に
Ｅｔ２Ｏを加えて結晶化させて、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒ
ドラジノ）安息香酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル（３００ｍｇ）を得る。この物質（２５０ｍ
ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）と２−（２−ピリジニルジチ
オ）エチルアミン塩酸塩（１６７ｍｇ、０．７５ｍｍｏ
ｌ）をＤＭＦ（４ｍｌ）に溶かす。ＴＦＡ（０．１２５
ｍｌ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、一夜室温でかくはんす
る。ＤＭＦを除き、ＳｉＯ２でクロマトグラフィー（２
％ ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）して、泡状物（２１７ｍ
ｇ、５２％）を得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
５．１ ＨＺ），８．０１（ｂｔ，１Ｈ），７．７８
（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ），７．５７（ｍ，１
Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１ Ｈｚ），７．
０９（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７
Ｈｚ），７．４０（ｂｓ，１Ｈ），５．９２（ｂｓ，１
Ｈ），３．７０（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ
＝５．８ Ｈｚ），１．４５（ｓ，９Ｈ）； ＩＲ（Ｋ
Ｂｒ）３３０３，１７１４，１６１０，１５０５ｃｍ
−１； ｍｓ ｍ／ｅ ４２１（Ｍ＋Ｈ），３６５，３
２１，１１２，ＨＲＭＳ計算値Ｃ１９Ｈ２５Ｎ４Ｏ３Ｓ
２ ４２１．１３６８，実測値４２１．１３５８．
【００９８】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミドの製造 先の化合物（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をＴＦＡ
（１．５ｍｌ）で０℃で１時間処理する。その後ＴＦＡ
を蒸発させ、残渣をＥｔ２Ｏで粉砕して、約２００ｍｇ
のＮ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−
４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）をオイル状
で得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．５ Ｈｚ），７．８１（ｍ，４Ｈ），７．２２
（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８ Ｈｚ），６．９７（ｄ，２
Ｈ），Ｊ＝８．８ Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ−
６．６ Ｈｚ），３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈ
ｚ）；ＩＲ（フィルム）３２７８，１６７４，１６１３
ｃｍ−１； ＭＳ ｍ／ｅ ３２１（Ｍ＋Ｈ）．
【００９９】アドリアマイシンおよびＮ−〔２−〔（２
−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノべン
ズアミドのアリルヒドラゾン誘導体の製造 化合物１５とアドリアマイシン塩酸塩（２５０ｍｇ、
０．４３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍｌ）に溶かし、
暗室で２日間かくはんする。溶媒を除去し、Ｃ−１８逆
相ＳｉＯ２でクロマトグラフィーする。０．３％ＮＨ４
ＯＡｃを含むＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝２：１で溶出して、ヒ
ドラゾン化合物５（３０ｍｇ、８％）を橙色粉末で得、
次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．８ Ｈｚ），７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９ Ｈ
ｚ），７．７４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ），７．
６６（ｍ，４Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５
Ｈｚ），７．１４（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｄ，２Ｈ，
Ｊ＝８．８ Ｈｚ），５．４６（ｂｓ，１Ｈ），５．１
６（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），４．２３
（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｍ，
４Ｈ），３．０２（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｍ，１
Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），１．９７（ｍ，２Ｈ），
１．３２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５ Ｈｚ）； ＩＲ（Ｋ
Ｂｒ）３２０６，１７０８，１６０７，１５７８ｃｍ
−１； ＭＳ ｍ／ｅ ８４６（Ｍ＋Ｈ），７３７，７
１７，ＨＲＭＳ計算値Ｃ４１Ｈ４４Ｎ５Ｏ１１Ｓ２，８
４６．２４７９，実測値８４６．２３８０．
【０１００】０．３％ ＮＨ４ＯＡｃを含むＭＣＯＨ：
Ｈ２Ｏ＝３：１で溶出して無水の誘導体（１２０ｍｇ、
３４％）を青色固体で得る。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＤ）δ ８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．１ Ｈｚ），７．７７（ｍ，５Ｈ），７．４２
（ｍ，１Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），７．１６（ｍ，
２Ｈ），５．３５（ｂｓ，１Ｈ），５．２６（ｍ，１
Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），
３．９３（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．
５ Ｈｚ），３．４４（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｔ，２
Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．４９（ｍ，１Ｈ），１．８
８（ｍ，１Ｈ），１．６３（ｍ，１Ｈ），１．１９
（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５ Ｈｚ）； ＭＳ ｍ／ｅ ８
２８（Ｍ＋Ｈ）６９９，６８１，４９５； ＨＲＭＳ計
算値Ｃ４１Ｈ４１Ｎ５Ｏ１０Ｓ２ ８２８．２３７２，
実測値８２８．２３００．
【０１０１】実施例６ ＡＤＭ誘導体の特性 実施例１〜５で述べたように製造された、本発明のＡＤ
Ｍ誘導体からのＡＤＭの放出は、ｐＨ４．５〜７．４
で、ＨＰＬＣ分析を用いて研究された。ＡＤＭ誘導体の
保存溶液（１ｍｇ／ｍｌ）はメタノールでつくられ、ア
リコートは水性緩衝溶液ｐＨ４．５、５．０、７．４に
希釈され、約１．６ｎｍｏｌ／ｍｌまで達した。各緩衝
液でのインキュベーションは３７℃で２４時間まで行わ
れ、アリコートは、ＨＰＬＣカラムに入れて分析され、
コンジュゲートしていないＡＤＭ量を測定した。放出物
質は、カラムでの保持時間から、また溶出物質のＵＶプ
ロフィールからそのままのＡＤＭと同定された。放出率
は、ＡＤＭの最大量の百分率で表され、図１〜３に示
す。
【０１０２】図に示されるように、本発明のＡＤＭ誘導
体は大きなレンジの放出率を示した。ＡＤＭ誘導体から
の放出物質の量は、ｐＨが７か４に下がるに従って、増
した。ＡＤＭ誘導体が酸に敏感な結合をもっている結
果、抗体タンパク質からＡＤＭが放出することになる。
これらの結果は、ＡＤＭを二官性化合物につないでいる
セミカルバゾン、カルバゾン、チオセミカルバゾン、カ
ルボキシレートヒドラゾン、アリルヒドラゾン結合の存
在で一貫している。
【０１０３】実施例７ アントラサイクリン イムノコンジュゲートの製造 この実施例は、本発明によるアントラサイクリン イム
ノコンジュゲートの製造を述べ、実施例１〜５で述べた
ＡＤＭ誘導体がモノクローナル抗体とコンジュゲートさ
れる。
【０１０４】二官性化合物内にジスルフィド結合をもつ
イムノコンジュゲートの製造 用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡＴ
ＣＣＮｏ．ＨＢ２１から産する５Ｅ９であり、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ“ＡＴＣＣ”（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から
入手できる。モノクローナル抗体５Ｅ９は、すべての分
裂するヒト細胞上のトランスフェリン受容体と反応し、
腫瘍細胞の種々の組織学上の型とクロス反応する、Ｉｇ
Ｇ抗体である。５Ｅ９は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに産する
腹水から精製された（Ｂｒｕｃｋｅｔ ａｌ．，“Ｏｎ
ｅ−Ｓｅｔｐ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏ
ｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｒｏｍ ＡｓｃｉｔｉｃＦｌｕｉｄ ｂｙ ＤＥＡ
Ｅ−Ａｆｆｉｉｇｅｌ Ｂｌｕｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ” Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
５ｂ：３１３−３１９（１９８２））。
【０１０５】ＡＤＭ誘導体を選ばれたモノクローナル抗
体と反応させる前に、抗体をチオール化する。すなわち
抗体分子に反応性スルフヒドリル基を導入する。５Ｅ９
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のチオール化は、ＳＰＤ
Ｐを用いて本質的にはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａ
ｌ．，前述に述べられるように行われる。簡単に述べる
と、ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，ＩＬ）（５０ｍＭ）をエタノールに溶かし、リン
酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中の５Ｅ９ＭＡｂ
（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）に加えて、最終濃度が５〜１０
ｍＭ間となる。反応混合物を３０分３０℃でインキュベ
ートする。未反応のＳＰＤＰをＳＰＤＰ誘導化抗体か
ら、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いゲ
ル濾過クロマトグラフィーにより分離する。反応性ピリ
ジニルジチオ部分は、過剰のＤＴＴで還元して除去す
る。還元した抗体をＰＤ−１０カラムに通し、遊離のチ
オールを含む抗体がＡＤＭ誘導体との縮合に用いられ
る。
【０１０６】反応性チオール基は、２−ＩＴを用いても
抗体タンパク質に導入される。抗体（５０ｍＭ ＴＥ
Ａ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
０に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）を２−ＩＴと（Ｐｉｅｒｃｅ
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＩＬ）最終濃度５〜１０ｍ
Ｍで混合する。反応は９０分間４℃で進み、チオール化
された抗体は、２Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳで平衡化された
ＰＤ−１０カラムで分離される。
【０１０７】抗体についた反応性チオール基の数は、Ｄ
ＴＮＢ（５，５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸）
（Ｅ４１２＝１１４１５０）を用い、Ｅｌｌｍａｎ，Ａ
ｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２：７０
−７７（１９５９）記載の方法により測定される。
【０１０８】各ＡＤＭ誘導体をＤＭＦに溶かし、還元さ
れたＳＰＤＰ−チオール化ＭＡｂ５Ｅ９のＰＢＳ溶液に
加える。ＡＤＭ誘導体の量は、抗体上のチオール基の数
と当量である。コンジュゲート化反応は一夜４℃でイン
キュベートして行われる。その後、抗体溶液をＰＢＳで
透析し、コンジュゲートしていないアドリアマイシン誘
導体を除く。次に抗体溶液をＳＭ−２ ＢｉｏＢｅａｄ
ｓ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃ
ｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で一夜処理する。ＭＡｂに結合しコ
ンジュゲートしたアントラサイクリンの量は、４９５ｎ
ｍ（Ｅ４９５＝８０３０）での吸光度により測定され
る。抗体タンパク質の量は、２８０ｎｍで吸光度で測定
される（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４ ０．Ｄ．単位）。２８
０ｎｍでのＡＤＭ吸光度の重なりを補正するために次の
式を用いる。
【数１】
【０１０９】イムノコンジュゲートは、コンジュゲート
していないＡＤＭやＡＤＭ誘導体の存在に対して、ＨＰ
ＬＣ分析を用いて分析された。ＨＰＬＣは５ミクロンＩ
Ｂ−ＳＩＬＣ１８ビーズで充填したＰｈｅｎｏｍｅｎｅ
ｘカラムを用い行った。コンジュゲートしていない薬
剤、ＡＤＭ誘導体（すなわち、実施例１〜５で述べたよ
うに製造された、本発明の二官性化合物の各々にコンジ
ュゲートしたＡＤＭ）（０．１μｍｏｌ）、０．５〜５
μｍｏｌ薬剤当量を含むイムノコンジュゲートをカラム
に入れ、メタノールと１０ｍＭリン酸アンモニウム、ｐ
Ｈ４．５（７０：３０）、１．５ｍｌ／分で溶出した。
生成したイムノコンジュゲートは、ＨＰＬＣ分析で測定
したように、コンジュゲートしていない薬剤を意味ある
程には含まなかった（１％以下）。
【０１１０】実施例８ イムノコンジュゲートの特性 実施例７で述べたように製造したイムノコンジュゲート
は、１３−ケト位置で二官性化合物にコンジュゲートし
たＡＤＭ分子から成り、その二官性化合物がＡＤＭとＭ
Ａｂ５Ｅ９間に連結を形成している。更にＭＡｂを遊離
のチオール基によって、反応性ピリジニルジチオ部分を
含むＡＤＭ誘導体に加えると、ＡＤＭとＭＡｂをつなぐ
二官性化合物中にジスルフィド結合が形成されることに
なる。この実施例によってつくられたイムノコンジュゲ
ートは、限定するものではないが、５Ｅ９−ＡＤＭ−セ
ミカルバゾン−〔３．４２〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−カルバ
ゾン−〔４．３７〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−チオセミカルバ
ゾン−〔２．５１〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−カルボキシレー
トヒドラゾン−〔２．３５〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−アリル
ヒドラゾン−〔２．５２〕を含み、名称の最初の部分は
コンジュゲートをつくるのに用いたモノクローナル抗体
を表し、第二の部分は抗体に連結したアントラサイクリ
ンを表し、数字はコンジュゲート中のＡＤＭ／抗体のモ
ル比を表す。
【０１１１】本発明のイムノコンジュゲートの結合活性
は蛍光結合検定で測定された（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ
ｅｔ．ａｌ．，“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖａｌｕａｔｉ
ｏｎｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｐｒｅ
ｐａｒｅｄ ｂｙ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｍｉｔｏｍｙｃｉ
ｎ Ｃ ｔｏ ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｖｉａ Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ”ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｖｏｌ．２，ｐ２０１（１
９８９））． 簡単に述べると、イムノコンジュゲート
を連続的に１００μｌ検定培地に希釈する（ＲＰＭＩ１
６４０に１０％胎児ウシ血清とペニシリン／ストレプト
マイシンを補う、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎ
ｄ，Ｎ．Ｙ．）。同じ培地で育てたＣＥＭ腫瘍細胞（Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ１１９）（１×１０６セル）を取
り出し、遠心分離により洗い、希釈したイムノコンジュ
ゲートを含む培地に懸濁させる（１×１０６）。４℃で
１時間インキュベートした後、細胞を洗い、１：４０希
釈ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄ
ｕｒｈａｍ．ＮＣ）を含む培地１００μｌに懸濁させ、
更に４℃で１時間置く。細胞を洗い、Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｅｐｉｃｓ Ｖ蛍光細胞分析器を用い分析する。各実験
に対して、同様に希釈したＭＡｂがコンジュゲートして
いない正の結合対照として用いられる。タンパク質収率
の百分率（分離して得た）、モル比（ＡＤＭ／ＭＡｂの
モル数）、元の結合活性の百分率で表した結合活性は表
１に示される。
【表１】
【０１１２】表１に示されるように、５Ｅ９イムノコン
ジュゲートは、コンジュゲートしていない５Ｅ９の元の
結合活性の９０％以上（チオセミカルバゾンを除く）を
保有した。このことは、ＡＤＭ誘導体の５Ｅ９とのコン
ジュゲートの結果、抗体の結合活性が比較的小さい程度
のロスですむことを示している。タンパク質収率は、タ
ンパク質の大部分がコンジュゲート化処理を通して維持
されたことを示す。
【０１１３】カルバゾンイムノコンジュゲートからのＡ
ＤＭの放出 本発明のカルバゾンイムノコンジュゲートからのＡＤＭ
の放出率は、ｐＨ４．５、５．０、７．４で、ＨＰＬＣ
分析により、実施例６でＡＤＭ誘導体に対して述べたよ
うに研究された。図４に示されるように、イムノコンジ
ュゲートからのＡＤＭの放出率は、実施例６でＡＤＭの
カルバゾン誘導体に対して示されたものと、本質的に同
じである。ＡＤＭ−イムノコンジュゲートから放出され
る物質量は、ｐＨが７から４に下がるにつれて増した。
このＡＤＭ−イムノコンジュゲートが酸に敏感な結合基
をもっている結果、抗体タンパク質からＡＤＭの放出と
なる。この結果はＡＤＭを二官性化合物につなぐヒドラ
ゾン結合の存在で一貫している。
【０１１４】ここで述べる実験データは、ＡＤＭ部分が
本発明のイムノコンジュゲートから、“生理学的”条
件、すなわちリソソーム環境で特徴的な酸性条件で放出
されることを示している。
【０１１５】イムノコンジュゲートの細胞毒活性 本発明のイムノコンジュゲートの細胞毒活性は、Ｇｒｅ
ｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔａｌ．，欧州特許出願Ｎｏ．３２
８，１４７記載のように、Ｄａｕｄｉ（バーキットリン
パ腫）細胞（表現型：５Ｅ９＋、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ２
１）を用い軟アガルでのＣｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、インビトロ試験により測定
された。Ｄａｕｄｉ細胞は、完全培地（１０％胎児ウシ
血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭ１１６４０培地）で成長
させた。培地１ｍｌ中１×１０５セルを、１．５時間、
連続的に希釈した５Ｅ９−ＡＤＭイムノコンジュゲート
またはコンジュゲートしていないＡＤＭにさらした。各
希釈に対し３回測定した。対照は、薬剤にさらさず同様
に処理した細胞から成る。その後細胞を洗い、１５％Ｆ
ＢＳと０．３％アガロース（Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｏ
ｉｄ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を含むＲＰＭＩ１６４
０培地に懸濁させた。懸濁液の１ｍｌ（１×１０３セ
ル）を、６つのウェルマイクロチタープレート（Ｃａｓ
ｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の０．４％アガロ
ース層に置いた。試料を３７℃で７〜１０日間インキュ
ベートし、その結果のコロニーをｐ−ヨードニトロテト
ラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１ｍｇ／ｍｌ
の０．５ｍｌで、４８時間着色した。コロニーはＯｐｔ
ｉｍａｘ ４０−１０ イメージアナライザーを用いて
数えられ、コロニー形成の阻害が、薬剤処理またはイム
ノコンジュゲート処理細胞を非処理対照に比較して測定
された。その結果が表２にＩＣ５０（コロニー形成を５
０％阻害するのに要する濃度）として表わされる。
【表２】
【０１１６】表２に示されるように、ＡＤＭ放出の他
に、酸に敏感なイムノコンジュゲートのすべてが意味深
いインビトロ細胞毒活性をもつ。
【０１１７】実施例９チオエーテル結合を含むアントラサイクリンイムノコン
ジュゲートの製造 この実施例は、本発明によるアントラサイクリンイムノ
コンジュゲートを製造するもう一つの具体例を述べてい
て、実施例１〜５で述べたように製造され、ＡＤＭ分子
に付着する場所として、セミカルバゾン、カルバゾン、
チオセミカルバゾン、カルボキシレートヒドラゾン、ア
リルヒドラゾンの５つの結合のいずれかをもつ、二官性
化合物の一つを介して、ＡＤＭはモノクローナル抗体に
コンジュゲートしている。更にイムノコンジュゲート
は、抗体に付着する場所として、チオエーテル結合をも
つ。
【０１１８】ＭＡｂ ５Ｅ９（ＰＢＳ２．５ｍｌ中２．
５ｍｇ）をＳＭＰＢ（１００μｌテトラヒドロフラン中
スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チラート５９．５μｇ）で、３０℃で３０分間処理す
る。ｐＨをクエン酸ナトリウム緩衝液で６．０に調整す
る。ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を通して、未反応物質からマレイミドを含む抗体を分離
する。先のように製造したＡＤＭ誘導体（１ｍｇ）を１
ｍｌ ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（９：１）に溶かし、各々のＡ
ＤＭ誘導体の０．５μｍｏｌを、４：１アセトン：Ｈ２
Ｏ中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン０．５μｍｏｌと反
応させて、ＡＤＭ誘導体の還元形にする。１０分後、
０．１Ｍ硫黄のトリエン溶液を加え、残っているホスフ
ィンをこわす。還元したＡＤＭ誘導体を５Ｅ９マイレミ
ドを含むＭＡｂと混ぜる。そうして生成したイムノコン
ジュゲートをＰＤ−１０ゲル濾過カラムを通して精製す
る。トルエン溶媒の除去が十分でない、橙色溶媒層が反
応混合物と浮遊する何かタンパク質に分離する場合に
は、溶媒を除くために空気の弱流を用い、変性したタン
パク質は、反応混合物を２分間１６０００×ｇで回転さ
せて除く。澄んだ上清がイムノコンジュゲートを含み、
ゲル濾過して、ｐＨ７．４ＰＢＳ中で分析する。ＡＤＭ
／抗体モル比は、上で述べたようにＯＤ２８０とＯＤ
４９５を用いて分光測光的に測定される。典型的な反応
で、モル比３〜４のイムノコンジュゲートがつくられ
る。
【０１１９】この実施例でこうして製造されたイムノコ
ンジュゲートの結合活性、細胞毒活性が先に述べたよう
にテストされる。
【０１２０】上の実施例は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二
官性化合物、これら二官性化合物でつくれらたＡＤＭの
新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体、ＡＤＭが抗体に新規酸
に敏感な連結を介してコンジュゲートしている新規イム
ノコンジュゲートの製造を示している。二官性化合物は
細胞毒性試薬、ＡＤＭおよび細胞にターゲッテングする
分子、モノクローナル抗体と容易にコンジュゲートし
た。コンジュゲートは、抗体結合活性（すなわち標的細
胞特異性）と細胞毒性薬剤活性の両方を維持し、標的細
胞の細胞環境で特徴的な酸性条件でフリーの変形されな
いＡＤＭを放出した。
【０１２１】従って、本発明の新規二官性化合物、イム
ノコンジュゲートは、有用な分子のコンジュゲート化を
約束し、特にがんやその他の腫瘍、非細胞致死性のウィ
ルス性または他の病原性感染、自己免疫不全のような疾
患の治療で、その細胞を特異的に殺すために、標的細胞
集団に細胞毒性試薬を運ぶためにコンジュゲートする。
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【０１２２】上にこの発明のいくつもの具体例をあげた
が、基本的構成は、この発明の二官性化合物、細胞毒性
試薬の誘導体、コンジュゲート、方法を利用する他の具
体例の提示にかえられるのは明白である。それ故、本発
明の範囲は、ここに添えるクレームに限定されるべき
で、実施例の方法であげた特定の具体例に限定されるべ
きでないことは正しく評価されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ４．５の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図２】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ５．０の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図３】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ７．４の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図４】実施例７に記載したように、ｐＨ４．５の緩衝
液でインキュベートした時間の関数として、本発明のア
ドリアマイシンのカルバゾン誘導体から、および５Ｅ９
イムノコンジュゲートからのアドリアマイシンの放出を
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ Ｌ Ｃ０７Ｄ 213/71 Ｃ０７Ｄ 213/71 309/30 309/30 Ｃ０７Ｈ 15/252 Ｃ０７Ｈ 15/252 (72)発明者 デビッド ウィルナー アメリカ合衆国コネチカット州 06514 ハムデンリーリング ロード ９ (72)発明者 アイボ モンコビック アメリカ合衆国コネチカット州 06422 ダーハムモーロ ドライブ 44 (72)発明者 ロバート エス グリーンフィールド アメリカ合衆国コネチカット州 06492 ウォリングフォード シーター ヒル ロード 10 (72)発明者 ゲリー アール ブラスロースキイ アメリカ合衆国コネチカット州 06033 グラストンベリー ヘリテージ ドラ イブ 124 (56)参考文献 特開 平２−1464（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 〔式中、ｎは１〜１０の整数であり、そしてＲ8 は 【化１】 （式中、ＸはＮＯ 2 またはハロゲンである）または 【化２】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ 2 またはハロゲンである）であ
    る〕を有する二官性Ｎ−置換ヒドラジン化合物。
  2. 【請求項２】 ａ）メトキシカルボニルスルフェニルク
    ロリドを２−アミノエタンチオール塩酸塩および２−メ
    ルカプトピリジンと反応させて、２−〔（２−ピリジニ
    ル）−ジチオ〕エタンミアン塩酸塩とし、 ｂ）上記塩酸塩をトリエチルアミン、ホスゲンおよびｔ
    −ブチルカルバザートと反応させて、Ｎ−〔２−〔（２
    −ピリジニル）−ジチオ〕エチル〕−２−（ｔｅｒｔ−
    ブトキシカルボニル）ヒドラジンカルボキサミドとし、
    そして ｃ）上記ヒドラジンカルボキサミドをトリフルオロ酢酸
    と反応させて、Ｎ−〔２〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
    エチル〕ヒドラジンカルボキサミドとすることを特徴と
    する請求項１記載の化合物を製造する方法。
  3. 【請求項３】 式 Ｈ 2 ＮＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ 2 ） n ＳＳＲ 8 〔式中、ｎは１〜１０の整数であり、そしてＲ 8 は 【化３】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ 2 またはハロゲンである）であ
    る〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  4. 【請求項４】 ａ）ｔ−ブチルカルバザート、トリエチ
    ルアミン、トリホスゲンおよび２−（２−ピリジニルジ
    チオ）エタンアミン塩酸塩を反応させて、２−〔〔〔２
    −（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボ
    ニル〕−２，２′−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニ
    ル）カルボニックジヒドラジドとし、そして ｂ）上記Ｎ−ブトキシカルボニルカルボニックジヒドラ
    ジドをトリフルオロ酢酸と反応させて、２−〔〔〔２−
    〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボ
    ニル〕カルボニックジヒドラジドとすることを特徴とす
    る請求項３記載の化合物を製造する方法。
  5. 【請求項５】 ２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジ
    チオ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒ
    ドラジド。
  6. 【請求項６】 式 Ｈ 2 ＮＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ 2 ） m ＣＨ＝（ＣＨ 2 ） n ＳＳＲ 8 〔式中、ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じである
    か異なるものであり、そしてＲ 8 は 【化４】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ 2 またはハロゲンである）であ
    る〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  7. 【請求項７】 ａ）１，４−ジブロモ−２−ブテンをフ
    タル酸イミドカリウムと反応させて、１−ブロモ−４−
    （Ｎ−フタルイミド）−２−ブテンとし、 ｂ）上記ブロモブテンをチオ酢酸カリウムと反応させ
    て、１−（アセチルチオ）−４−（Ｎ−フタルイミド）
    −２−ブテンとし、 ｃ）上記アセチルチオブテンをヒドラジンと反応させ
    て、１−アミノ−４−メルカプト−２−ブテン塩酸塩と
    し、 ｄ）上記アミノメルカプトブテンをメトキシカルボニル
    スルフェニルクロリドおよび２−メルカプトピリジンと
    反応させて、１−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジ
    チオ〕−２−ブテン塩酸塩とし、 ｅ）上記アミノブテン塩酸塩をＴＥＡおよびジ−２−ピ
    リジニルチオノカーボネートおよびｔ−ブチルカルバザ
    ートと反応させて、Ｎ−〔４〔（２−ピリジニル）ジチ
    オ〕−２−ブテニル〕−ヒドラジンカルボチオアミドの
    カルボチオアミドを保護するｔ−Ｂｏｃ誘導体とし、そ
    して ｆ）上記ｔ−Ｂｏｃ誘導体をトリフルオロ酢酸と反応さ
    せて、Ｎ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブ
    テニル〕ヒドラジンカルボチオアミドとすることを特徴
    とする請求項６記載の化合物を製造する方法。
  8. 【請求項８】 Ｎ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ−
    ２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミド。
  9. 【請求項９】 式 Ｈ 2 ＮＮＨＣＯＯ（ＣＨ 2 ） n ＳＳＲ 8 〔式中、ｎは１〜１０の整数であり、そしてＲ 8 は 【化５】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ 2 またはハロゲンである）であ
    る〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  10. 【請求項１０】 ａ）クロロカルボニルスルフェニルク
    ロリドを２−メルカ プトエタノールおよび２−メルカプ
    トピリジン、次いで炭酸アンモニウムと反応させて、粗
    ２−（２−ピリジニルジチオ）エタノールとし、そして ｂ）上記２−（２−ピリジニルジチオ）エタノールをカ
    ルボニルジイミダゾールおよびヒドラジンと反応させ
    て、２〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジン
    カルボキシレートとすることを特徴とする請求項９記載
    の化合物を製造する方法。
  11. 【請求項１１】 ２〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチ
    ルヒドラジンカルボキシレート。
  12. 【請求項１２】 式 Ｈ 2 ＮＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ 2 ） n ＳＳＲ 8 〔式中、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ 8 は 【化６】 （式中、ＸはＮＯ 2 またはハロゲンである）または 【化７】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ 2 またはハロゲンである）であ
    り、そしてＡｒは 【化８】 である〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  13. 【請求項１３】 ａ）Ｐ−ヒドラジノ安息香酸をジ−ｔ
    −ブチルピロカーボ ネートと反応させて、４−（Ｎ−Ｂ
    ｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸とし、 ｂ）上記４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸をＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドおよびＤＣＣと反応させ
    て、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸のＮ−ヒ
    ドロキシスクシンイミドエステルとし、 ｃ）上記エステルを２−（２−ピリジニルジチオ）エチ
    ルアミン塩酸塩およびトリエチルアミンと反応させて、
    Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−
    （Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）ベンズアミドとし、そして ｄ）上記Ｎ−〔２−（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル
    −４−（Ｎ−ＢＯＣ−ヒドラジノ）ベンズアミドをトリ
    フルオロ酢酸と反応させて、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジ
    ニル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミド
    とすることを特徴とする請求項１２記載の化合物を製造
    する方法。
  14. 【請求項１４】 化合物が還元剤により還元されて遊離
    のスルフヒドリル基を形成する、請求項１、３、６、９
    または１２記載の化合物から成る二官性化合物。
  15. 【請求項１５】 還元剤がジチオトレイトールまたはト
    リブチルホスフィンである、請求項１４記載の二官性化
    合物。
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