FI100718B - Bifunktionaalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä, menetelmiä n iiden valmistamiseksi ja konjugaattien valmistusmenetelmä, jossa niitä käytetään - Google Patents

Bifunktionaalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä, menetelmiä n iiden valmistamiseksi ja konjugaattien valmistusmenetelmä, jossa niitä käytetään Download PDF

Info

Publication number
FI100718B
FI100718B FI912285A FI912285A FI100718B FI 100718 B FI100718 B FI 100718B FI 912285 A FI912285 A FI 912285A FI 912285 A FI912285 A FI 912285A FI 100718 B FI100718 B FI 100718B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dithio
pyridyl
reacting
compound
adm
Prior art date
Application number
FI912285A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI912285A0 (fi
FI912285A (fi
Inventor
Takushi Kaneko
Ivo Monkovic
David Willner
Gary R Braslawsky
Robert S Greenfield
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Squibb Bristol Myers Co filed Critical Squibb Bristol Myers Co
Publication of FI912285A0 publication Critical patent/FI912285A0/fi
Publication of FI912285A publication Critical patent/FI912285A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI100718B publication Critical patent/FI100718B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/23—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/39—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton at least one of the nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C323/43—Y being a hetero atom
    • C07C323/44—X or Y being nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Static Random-Access Memory (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Measurement Of Radiation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

1 -100718
Bifunktionaalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä, menetelmiä niiden valmistamiseksi ja konjugaattien valmistusmenetelmä, jossa niitä käytetään 5 Tämä keksintö koskee uusia bifunktionaalisia yhdis teitä ja menetelmiä niiden valmistamiseksi ja käyttämiseksi. Erityisemmin keksintö koskee N-substituoituja hydrat-siiniyhdisteitä, jotka voidaan liittää molekyyleihin solu-populaatioihin kohdistettaviksi.
10 On kuvattu bifunktionaalisia yhdisteitä, jotka sal livat kahden tai useamman molekyylin liittämisen. Tunnetaan esimerkiksi bifunktionaalisia yhdisteitä sytotoksis-ten reagenssien liittämiseksi molekyyleihin solupopulaatioihin kohdistettavaksi. Bifunktionaalisten yhdisteiden on 15 pystyttävä kuljettamaan ja vapauttamaan tämäntyyppisiä sytotoksisia aineita in vivo, aikaansaamaan esimerkiksi aineiden riittäviä, ts. terapeuttisia tasoja in vivo koh-distamismolekyylien aktiivisuutta vahingoittamatta. Määrättyihin sovellutuksiin on toivottavaa muodostaa konju-20 gaatti, joka sisältää pH-herkän sidoksen reagenssin ja kohdistamismolekyylien välillä, jolloin sidos aikaansaa sytotoksisen reagenssin vapautumisen määrätyillä pH-alueilla.
Erityisen käyttökelpoisia reagensseja syöpälajien 25 hoitamiseen ovat antrasykliinit. Antrasykliinit ovat an- tibioottiyhdisteitä, joilla on sytotoksista aktiivisuutta. Tutkimukset ovat paljastaneet, että antrasykliinit voivat toimia tappamalla soluja joukolla erilaisia mekanismeja, mukaan lukien: 1) lääkemolekyylien sovittaminen solun 30 DNA:n väliin, jolloin DNA:sta riippuva nukleiinihapposyn- teesi inhiboituu; 2) vapaiden radikaalien tuottaminen lääkkeellä, jolloin radikaalit sitten reagoivat solun makromolekyylien kanssa aiheuttaen soluvauriota, tai 3) lääkemolekyylien vuorovaikutus solumembraanin kanssa [Peter-35 son et ai., "Transport and Storage Of Anthracyclines In
Experimental Systems and Human Leukemia", teoksessa Anth- - 100718 2 racycline Antibiotics In Cancer Therapy, Muggia et al. (toimittajat), s. 132 (Martinus Nijhoff Publishers (1982); ja Bachur, "Free Radical Damage", sama julkaisu, s. 97 -102)]. Sytotoksisesta potentiaalistaan johtuen antrasyk-5 liinejä on käytetty hoitamaan lukuisia syöpälajeja, kuten leukemiaa, rintasyöpää, keuhkosyöpää, munasarjojen rauhas-kudossyöpää ja sarkoomalajeja [Wiernik, "Current Status Of Adriamycin and Daunomycin In Cancer Treatment", teoksessa Anthracyclines: Current Status and New Developments, 10 Crooke et ai. (toimittajat), s. 273 - 94 (Academic Press 1980)]. Tavallisesti käytettyjä antrasykliinejä ovat mm. adriamysiini (ADM, tunnetaan myös doksorubisiinina) ja daunomysiini (DAU, tunnetaan myös daunorubisiinina).
Vaikka nämä yhdisteet voivat olla käyttökelpoisia 15 kasvainten ja muiden tautitilojen hoidossa, joissa yrite tään vähentää tai poistaa kohdesolupopulaatiota, niiden terapeuttista tehokkuutta rajoittaa usein niiden antoon liittyvä annoksesta riippuva toksisuus. Esimerkiksi kasvainten hoidossa näiden yhdisteiden tyypillisiä haitalli-20 siä sivuvaikutuksia ovat mm. luuytimen toiminnan estäminen ja kardiotoksisuus (Crooke, "Goals For Anthracycline Analog Development At Bristol Laboratories", Anthracyclines: Current Status and New Developments, edellä, s. 11). Sen vuoksi kasvainten hoidossa on pyritty parantamaan näiden 25 yhdisteiden terapeuttisia vaikutuksia liittämällä antra- sykliini kasvaimiin liittyviä antigeenejä vastaan suunnattuihin vasta-aineisiin muodostamaan immunokonjugaatteja lääkkeiden selektiivistä soluihin vapauttamista varten. [Hermentin ja Seiler, "Investigations with monoclonal an-30 tibody drug (anthracycline) conjugates", Behring Insti.
/ Mitl. 82 (1988) 197 - 215]. Tällä tavalla lääke voidaan a vapauttaa tai "kohdistaa" kasvainkohtaan, ja sen toksisia sivuvaikutuksia kehon normaaleja soluja kohtaan voidaan vähentää. Tekniikan tasolla tunnetaan immunokonjugaatit, 35 jotka koostuvat antrasykliineistä ADM tai DAU, jotka on liitetty kasvaimeen liittyvien antigeenien polyklonaali- 100718 3 siin tai monoklonaalisiin vasta-aineisiin [esimerkiksi Gallego et. ai., "Preparation Of Four Daunomucin-Monoclo-nal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Aktivity", Int. J. Cancer 33 (1984) 737-44; ja Arnon et ai., "In Vit-5 ro and In Vitro Efficacy Of Conjugates Of Daunomycin With
Anti-Tumor Antibodies", Immunological Rev. 62 (1982) 5 -27].
Useimmin käytetyissä lähestymistavoissa antrasyk-liinin kiinnittämiseksi vasta-aineeseen on käytetty sidos-10 ta antrasykliinin aminosokeriryhmässä. Aminosokeri on esi merkiksi hapetettu natriumperjodaattikäsittelyllä ja kiinnitetty suoraan vasta-aineen lysiinitähteisiin Schiffin emäksen muodostuksella [Hurwitz et ai., "The Covalent Binding Of Daunomycin and Adriamycin To Antibodies, With 15 Retention of Both Drug and Antibody Activities", Cancer
Res. 35 (1975) 1175 - 1181]. Vaihtoehtoisesti antrasyk-liinit on liitetty vasta-aineisiin antrasykliinin aminoryhmän karbodi-imidi-välitteisellä liittämisellä vasta-aineen karboksyyliryhmiin [Hurwitz et ai., edellä) tai 20 aminoalkyyliryhmään (Hurwitz et ai., "The Effect in vivo of Chemotherapeutic drug-antibody conjugates in two murine experimental tumor systems", Int. J. Cancer 21 (1978) 747 - 755]. Nämä sidokset eivät hydrolysoidu helposti ja tekevät antrasykliinin vapautumisen kontrolloinnin vaikeaksi. 25 Antrasykliinejä on liitetty vasta-aineisiin myös risti- liittämällä lääkkeen aminosokeri ja vasta-aineen aminoryh-miä glutaraldehydillä [Belles-lsles et ai., "In Vitro Activity of Daunomycin-Anti-AlphaFetoprotein Conjugate On Mouse Hepatoma Cells", Br. J. Cancer 41 (1980) 841 - 42]. 30 Tutkimuksista immunokonjugaateilla, joissa antrasyk- liinimolekyylin aminosokeriosa oli modifioitu sidoksella vasta-aineeseen, käy kuitenkin ilmi konjugoidun lääkkeen sytotoksisen aktiivisuuden menetys (Arnon et ai., edellä, s. 7 - 8). Lisäksi tutkimuksista antrasykliinianalogeilla 35 ilmenee, että antrasykliinien aminosokerien modifikaati oista seuraa lääkeanalogin sytotoksisen aktiivisuuden vä- •1C0718 4 heneminen suhteessa emolääkkeen aktiivisuuteen [Yamamoto et ai., "Antitumor Activity of Some Derivatives of Dauno-mycin At The Amino and Methyl Ketone Functions", J. Med. Chem. 15 (1972) 872 - 75].
5 Edelleen on valmistettu muita immunokonj ugaattej a, joissa antrasykliini DAU on liitetty suoraan vasta-aineeseen lääkkeen hiili-14 (C-14)-asemassa. Näiden immunokon-jugaattien selektiivinen sytotoksinen aktiivisuus kasvain-soluja kohtaan ei kuitenkaan ollut helposti toistettavissa 10 ja ilmeni johdonmukaisesti vain konsentraatiolla 20 pg/ml (Gallego et ai., edellä).
JP-patenttihakemuksessa 274 658 esitetään antrasyk-liinin liittäminen vasta-aineeseen C-13-asyylihydratsoni-sidoksella. Tämä liittäminen suoritettiin käyttämällä me-15 netelmiä, joihin liittyy vasta-aineen derivatisointi ja tämän johdannaisen seuraava reaktio antrasykliinin kanssa. Nämä menetelmät eivät ole suotuisia, koska vasta-aineen derivatisointiin liittyy ei-toivottu ja epäspesifisiä reaktioita ja menetelmät tuottavat hyvin alhaisia antrasyklii-20 ni:vasta-aine-suhteita. Ensimmäisen menetelmän mukaan vas ta-aine käsiteltiin karbodi-imidillä hydratsiinin läsnä ollessa, jolloin saatiin hydratsidivasta-ainejohdannainen, joka sitten saatettiin reagoimaan antrasykliinin kanssa niin, että antrasykliini liittyi suoraan vasta-aineraken-25 teeseen. Tulokseksi saadut immunokonjugaatit ovat kuiten kin taipuvaisia vasta-ainemolekyyleihin aggregoitumiseen. Koska tämä menetelmä lisäksi vaatii karboksyyliryhmiä, joiden lukumäärä voi olla rajallinen, näillä immunokonju-gaateilla on alhaiset antrasykliini:vasta-aine-suhteet 30 (suunnilleen 1,1 - 1,3). Toiseen menetelmään liittyy vas- ta-aineen saattaminen reagoimaan meripihkahappoanhydridin kanssa, jolloin saadaan vasta-aineen hemi-sukkinaattijohdannainen. Seuraavaksi tämä johdannainen saatetaan reagoimaan hydratsiinin kanssa, jolloin saadaan vasta-ainehyd-35 ratsidijohdannainen, joka sitten saatetaan reagoimaan ant rasykliinin, daunomysiinin, kanssa. Tällä toisella lähes- 5 100718 tymistavalla on vikana, että vasta-ainejohdannaisen reaktio hydratsiinin kanssa on epäspesifinen, mikä johtaa erilaisten vasta-ainejohdannaisten seoksen muodostumiseen toivotun hydratsidijohdannaisen muodostumisen lisäksi.
5 Siten antrasykliini:vasta-aine-moolisuhde oli JP-patentti- hakemuksen 274 658 ilmoituksen mukaan hyvin alhainen (suunnilleen 1, katso JP-patenttihakemuksen s. 264, palsta 1). Katso myös EP-patenttihakemus 294 294, jossa kuvataan antrasykliinin C-13-hydratsonijohdannaisen liittäminen 10 vasta-aineen hiilihydraattiosaan.
Muita antrasykliinihydratsoneja kuvaavat Tong et ai., J. Med. Chem. 21 (1978) 732 - 37, Smith et ai., J. Med. Chem. 21 (1978) 280 - 83, ja Brownlee et ai., J. Chem. Soc. (1986) s. 659 - 61. Katso myös US-patenttijul-15 kaisua 4 112 217, jossa kuvataan DAU:n ja ADM:n bishydrat- sonit.
Muissa tutkimuksissa antrasykliinejä on liitetty suurimolekyylipainoisiin kantajiin, kuten dekstraaniin tai polyglutamiinihappoon sytotoksisen aktiivisuuden vahvista-20 miseksi ja lääkkeen toksisuuden vähentämiseksi [Arnon et ai., edellä, s. 5; ja Hurwitz et ai., "Soluble Macro-molecules As Carriers For Daunorubicin", J. Appi. Biochem.
2 (1980) 25 - 35]. Näitä kantajaan sidottuja antrasykliinejä on myös sidottu kovalenttisesti kasvaimeen 25 liittyvien antigeenien vastaisiin vasta-aineisiin muodos tamaan immunokonjugaatteja sytotoksisen lääkkeen kohdistamiseksi spesifisesti kasvainsoluihin. ADM on esimerkiksi liitetty tällaiseen "anti-kasvain"-vasta-aineeseen karbok-simetyylidekstraanihydratsidisillalla, jolloin ADM-mole-30 kyyli on liitetty karboksimetyylidekstraanin hydratsiini- johdannaiseen ADM:n C-13-karbonyylillä hydratsonin muodos-tamiseksi. Sitten vasta-aine on liitetty dekstraanihydrat-sidijohdannaiseen glutaraldehydillä adriamysiini-dex-vas-ta-ainekonjugaatin muodostamiseksi [Arnon et ai., 35 "Monoclonal Antibodies As Carriers For Immunotargeting Of
Drugs", teoksessa Monoclonal Antibodies For Cancer Detec- 100718 6 tion and Therapy, Baldwin et ai. (toimittajat), s. 365 -83 (1985); ja Hurwitz et al., "A Conjugate Of Adriamycin and Monoclonal Antibodies To Thy-1 Antigen Inhibits A Human Neuroblastoma Cells In Vitro”, Ann. N.V. Acad. Sci.
5 417 (1983) 125 -36].
Kantajien käyttöön liittyy kuitenkin määrättyjä haittoja. Kantajia sisältävät immunokonjugaatit ovat esimerkiksi melko suuria kooltaan, ja retikuloendoteelijärjestelmä poistaa ne nopeasti in vivo [Dillman et ai., 10 "Preclinical Trials With Combinations and Conjugates Of T101 Monoclonal Antibody and Doxorubicin", Cancer Res. 46 (1986) 4886 - 91]. Tämä kantajaa sisältävien immunokonju-gaattien nopea poistuminen ei voi olla eduksi hoidon kannalta, koska konjugoitu lääke ei ehkä koskaan saavuta 15 aiottua vaikutuskohtaansa, ts. tapettavien solujen kohde ryhmää. Lisäksi suurimolekyylipainoisen kantajan läsnäolo voi vaikuttaa haitallisesti immunokonjugaatin stabiilisuu-teen, ja sen on osoitettu alentavan konjugaatin vasta-aineen sitoutumisaktiivisuutta [Embleton et ai., "Antibody 20 Targeting Of Anti-Cancer Agents", teoksessa Monoclonal
Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et ai. (toimittajat), s. 323 - 24 (1985)]. Lisäksi kasvainso-luilla suoritetuissa tutkimuksissa ei ole saatu todisteita siitä, että suurimolekyylipainoisia kantajia sisältävät 25 immunokonjugaatit voisivat paikallistua kasvainsoluihin in vivo, [vertaa Ford et ai., "Localization and Toxicity Study Of A Vindesine-Anti-CEA Conjugate In Patients With Advanced Cancer", Br. J. Cancer 47 (1983) 35 - 42, jossa osoitetaan suoraan konjugoitujen lääke/vasta-aine-konju-30 gaattien paikallistuminen kasvainsoluihin in vivo].
Siten antrasykliinien konjugoiminen vasta-aineisiin spesifisiä sidoksia ja kantajia käyttäen on kuvattu. Kuten edellä esitettiin, näiden immunokonjugaattien käytöllä on erityisestä käytetystä sidoksesta tai kantajasta riippuen 35 selviä haittoja.
.100718 7
On myös kuvattu määrätyt ligandi/toksiini-konjugaa- tit. US-patenttijulkaisussa 4 545 985, Pastan, kuvataan eksotoksiinikonjugaatti, jossa Pseudomonas-eksotoksiini (PE) on liitetty EGF:ään suhteessa 1:2 käytettäväksi solu-5 ja vastaan, joissa on suuri joukko EGF-reseptoreita. On myös valmistettu EGF/risiini A- ja EGF/difteriatoksiini-konjugaatit [Cawley et ai., "Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates:" EGF-Ricin A Is A Potent Toxin While EGF-Diphtheria Fragment A Is Nontoxic", Cell 22 (1980) 563 10 - 70; ja Shimizu et al., "A Cytotoxic Epidermal Growth
Factor Cross-Linked To Diphtheria Toxin A-Fragment"f FEBS Letters 118 (no. 2) (1980) 274 - 278]. Lisäksi on valmistettu Pseudomonas-eksotoksiinifuusioproteiineja käyttämällä proteiineja, polypeptidejä ja kasvutekijöitä, kuten 15 TGF-«:aa, IL-2:ta, IL-6:tta ja CD4:ää [Pastan et ai., "No vel Cytotoxic Agents Created By The Fusion Of Growth Factor and Toxin Genes", Fourth Internatl. Conference On Monoclonal Antibody Immunoconjugates For Cancer, s. 36 (30. maaliskuuta - 1. huhtikuuta 1989); Lorberboum et ai., 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 1922 - 1926; Chaudha- ry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 4538 4542; Siegall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 9738 - 9742; ja Chaudhary et al., Nature 335 (1988) 369 372] . On valmistettu difteriatoksiini/cc-melanosyyttiä sti-25 muloiva hormoni-fuusioproteiini [Murphy et al., "Genetic
Construction, Expression and Melanoma-Selective Cytotoxicity Of A Diphtheria Toxin-Related «-Melanocyte-Stimulating Hormone Fusion Protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 8258 - 8262; ja US-patenttijulkaisu 4 675 382, 30 Murphy]. Ligandikonjugaatit, jotka sisältävät prote iini toksiineja, voivat kuitenkin osoittautua ksenogeeni-sissä isännissä immunogeenisiksi.
Lisäksi antrasykliinejä, kuten ADM tai DAU, on liitetty kemiallisesti määrättyihin proteiini- tai polypep-35 tidiligandeihin, kuten transferriiniin (GB-patenttihakemus 2 116 979 A) ja melanotropiini [Varga et al., "Melanotro- - 100718 8 pin-Daunomycin Conjugate Shows Receptor-Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Melanoma Cells", Nature 267 (1977) 56 - 58]. PCT-patenttihakemuksessa WO 88/00837 kuvataan EGF, joka on liitetty polymeerisen kantajan kautta 5 sytotoksiseen aineeseen, kuten DAU, ja US-patenttijul kaisuissa 4 522 750 ja 4 590 001 kuvataan transferriini, joka on liitetty vinka-alkaloidiin ja platinaan, vastaavasti .
Sytotoksisen lääkkeen, jota on määrä käyttää immu-10 nokonjugaatissa, pitäisi vapautua ehdollisella vapautus- mekanismilla, ts. sytotoksisen lääkkeen pitäisi vapautua paremminkin spesifiseen kohtaan kuin vähittäisellä, ei-spesifisessä kohdassa tapahtuvalla hydrolyysillä. On ehdotettu, että erityiset immunokonjugaatit siirtyvät pai-15 koilleen lysosomeihin [deDuve, "Lysosomes Revisited", Eur.
J. Biochem. 137 (1983) 391 - 397], jotka ovat hieman happamia (pH 5,0 - 5,5) [Poznansky ja Juliano; "Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs: A Critical Review", Pharmacol. Rev. 36 (1984) 277 - 336]. Happamien 20 olosuhteiden käyttö konjugoidun lääkkeen vapauttamiseksi on kuvattu ADM:n cis-akonityylilinkkereiden kehityksessä [Shen ja Reiser, "Cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin and Macromolecular Carriers: A Model of pH-sensitive
Linkage Releasing Drug From a Lysosomotrophic Conjugate", 25 Biochem. Biophys. Res. Commun. 102 (1981) 1048 - 1054; ja
Yang ja Reisfeld, "Doxorubicin Conjugates With a
Monoclonal Antibody Directed to a Human Melanoma-Associated Proteoglycan Suppresses the Growth of Established Tumor Xenografts in Nude Mice", Proc. Natl.
30 Acad. Sci. 85 (1988) 1189 - 1193), ja ketaalilinkkerit ‘ difteriatoksiinille [Srinivasachar ja Neville; "New Pro tein Cross-Linking Reagents That Are Cleaved by Mild Acid", Biochemistry 28 (1989) 2501 - 2509].
Greenfield et ai. on viime aikoina kuvannut happo-35 herkkien immunokonjugaattien muodostamisen, jotka sisältä vät asyylihydratsiiniyhdisteen, 3-(2-pyridyyliditio)pro- 100718 9 pionyylihydratsidin, joka on konjugoitu asyylihydratsoni-sidoksella antrasykliinimolekyylin 13-keto-asemaan, ja tämän antrasykliinijohdannaisen konjugoinnin vasta-aine-tai ligandimolekyyliin (Greenfield et ai., EP-patenttiha-5 kemus 328 147, julkaistu 16. elokuuta 1989).
Olisi käyttökelpoista aikaansaada lisää bifunktionaalisia yhdisteitä, jotka on muodostettu aikaansaamaan happoherkän sidoksen molekyylien välille, mukaan lukien kohdistamis- ja reagenssimolekyylit käytettäväksi tera-10 piassa in vivo.
Tämä keksintö koskee uusia bifunktionaalisia yhdisteitä, jotka könjugoituvat helposti käyttökelpoisten molekyylien kanssa, ja menetelmiä bifunktionaalisten yhdisteiden valmistamiseksi. Bifunktionaaliset yhdisteet sisältä-15 vät reaktiivisen pyridinyyliditioryhmän. Keksintö koskee myös menetelmää uusien konjugaattien valmistamiseksi, jossa sytotoksinen molekyyli liitetään keksinnön mukaisiin bifunktionaalisiin yhdisteisiin sytotoksisen molekyylin johdannaisen muodostamiseksi, ja edelleen molekyyliin, 20 joka voi reagoida tapettavan kohdesolupopulaation kanssa.
Tämä kohdistamismolekyyli on sulfhydryyliryhmän sisältävä monoklonaalinen vasta-aine.
Tarkemmin sanottuna keksinnölle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa on esitetty.
25 Yhden suoritusmuodon mukaan syntetisoidaan uusi bifunktionaalinen yhdiste, N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]-etyyli]hydratsiinikarboksamidi (yhdiste 10) ja käytetään ADM:n semikarbatsonijohdannaisen muodostamiseen, joka johdannainen sisältää ADM:n C-13-asemassa semikarbatsonisi-30 doksen, joka toimii ADM:n kiinnityskohtana yhdisteeseen 10.
Toisen edullisen suoritusmuodon mukaan syntetisoidaan uusi bifunktionaalinen yhdiste, 2-[[[2-[(2-pyridinyyli )ditio]etyyli)amino]karbonyyli]karbonidihydratsidi (yh-35 diste 11a) ja käytetään muodostamaan ADM:n karbatsonijoh dannaisen, joka sisältää ADM:n C-13-asemassa karbatsonisi- • 100718 10 doksen, joka toimii ADM:n kiinnityskohtana yhdisteeseen 11a.
Toisessa edullisessa suoritusmuodossa syntetisoidaan uusi bifunktionaalinen yhdiste, N-[4-[(2-pyridinyy-5 li)ditio]-2-butenyyli]hydratsiinikarbotioamidi (yhdiste 12) ja käytetään muodostamaan ADM:n tiosemikarbatsonijohdannaisen, joka sisältää ADM:n C-13-asemassa tiosemikarbatsoni sidoksen, joka toimii ADM:n kiinnityskohtana yhdisteeseen 12.
10 Toisen edullisen suoritusmuodon mukaan syntetisoi daan uusi bifunktionaalinen yhdiste, 2[(2-pyridinyyli)di-tiojetyylihydratsiinikarboksylaatti (yhdiste 13) ja käytetään muodostamaan ADM:n hydratsonijohdannaisen, joka sisältää ADM:n C-13-asemassa karboksylaattihydratsonisidok-15 sen, joka toimii ADM:n kiinnityskohtana yhdisteeseen 13.
Edelleen eräässä edullisessa suoritusmuodossa syntetisoidaan uusi bifunktionaalinen yhdiste, N-[2-[(2-pyridinyyli )ditio]etyyli]hydratsinobentsamidi (yhdiste 15) ja käytetään muodostamaan ADM:n fenyylihydratsonijohdannai-20 sen, joka sisältää ADMtn C-13-asemassa aryylihydrat- sonisidoksen, joka toimii ADM:n kiinnityskohtana yhdisteeseen 15.
Sitten joukko edellä olevien uusien antrasyk-liinijohdannaisten molekyylejä liitetään molekyyliin, joka 25 on reaktiivinen valitun kohdesolupopulaation kanssa, ts.
sulfhydryyliryhmän sisältävän monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Jokainen antrasykliinijohdannaismolekyyli liitetään vasta-aineeseen bifunktionaalisen yhdisteen kautta, joka on sidottu antrasykliiniin antrasykliinimolekyylin 30 C-13-asemassa olevan semikarbatsoni-, karbatsoni-, tiose mikarbatsoni-, karboksylaattihydratsoni- tai fenyylihyd-ratsonisidoksen kautta uusien immunokonjugaattien muodostamiseksi. Esimerkiksi keksinnön edulliseen suoritusmuotoon liittyy uuden adriamysiinijohdannaismolekyylin syn-35 teesi, joka molekyyli kondensoidaan tioloidun vasta-aineen kanssa, josta seuraa antrasykliinin kiinnittyminen vasta- -100718 11 aineeseen bifunktionaalisen yhdisteen kautta. ADM:n C-13-asemaan muodostunut hydratsonisidos toimii kiinnittymis-kohtana ADM:ään. Tässä suoritusmuodossa bifunktionaalises-sa yhdisteessä on läsnä disulfidisidos, joka on kiinnitty-5 nyt vasta-aineeseen. Toisen edullisen suoritusmuodon mu kaan adriamysiinijohdannaismolekyyli (bifunktionaaliseen yhdisteeseen kiinnittynyt ADM) pelkistetään sulfhydryyli-ryhmän muodostamiseksi, ja tuloksena syntyvä johdannainen kondensoidaan maleimidilla derivatisoidun vasta-aineen 10 kanssa. Tämä johtaa immunokonjugaatin muodostumiseen, jos sa on N-substituoitu hydratsonisidos bifunktionaalisen yhdisteen kiinnittymiskohtana ADM:n C-13-asemaan, ja bi-funktionaalisessa yhdisteessä tioeetterisidos, jonka kautta se on kiinnittynyt vasta-aineeseen.
15 Keksinnön mukaisilla immunokonjugaateilla on antra- sykliini:vasta-aine-moolisuhde ainakin 1:1 ja jopa 10:1, ja edullisesti suunnilleen 4:1 - 10:1, ja niillä säilyy sekä vasta-aine- että sytotoksisen lääkkeen aktiivisuus valittujen kohdesolujen tappamisessa. Happoherkkä sidos, 20 joka on läsnä antrasykliinin kiinnityskohdassa näiden kon- jugaattien bifunktionaaliseen yhdisteeseen, on ihanteellisen sopiva aktiivisen lääkkeen vapauttamiseen happamissa olosuhteissa, kuten solun sisällä tyypillisesti vallitsevissa, esimerkiksi lysosomirakkuloissa.
'25 Adriamysiinin vapautuminen hydrolyysillä kustakin edellä nimetyistä johdannaisista pH-arvon funktiona osoitti, että uusilla johdannaisilla oli laaja-alaiset vapautu-misnopeudet lysosomiympäristöä jäljittelevissä happamissa olosuhteissa. Näillä johdannaisilla osoitettiin myös syto-30 toksisuutta immunokonjugaatteina transferriinireseptorin • · vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen 5E9 kanssa.
N-substituoidut bifunktionaalinen hydratsiiniyhdis-teet sisältävät hydratsiiniosan ja reaktiivisen pyridinyy-liditio-osan. Näitä uusia bifunktionaalisia yhdisteitä 35 voidaan käyttää liittämään laaja joukko molekyylejä käyt tökelpoisten konjugaattien muodostamiseksi. Bifunktionaa- • 100718 12 lisen yhdisteen hydratsiiniosaan liitettävä molekyyli sisältää vapaan karbonyyliryhmän tai ryhmän, joka on deriva-tisoitu sisältämään karbonyyliryhmän, kuten sytotoksinen reagenssimolekyyli. Kun karbonyyliryhmän sisältävä mole-5 kyyli liitetään bifunktionaalisen yhdisteen hydrat siiniosaan, muodostuu hydratsonisidos, joka on semikarbat-soni-, karbatsoni-, tiosemikarbatsoni-, karboksylaattihyd-ratsoni- tai fenyylihydratsonisidos, riippuen siitä, mitä keksinnön mukaista bifunktionaalista yhdistettä konjugaa-10 tin muodostamiseen käytetään. Molekyyli, joka on liitettä vä bifunktionaalisen yhdisteen päähän, joka sisältää pyri-dinyyliditioryhmän, sisältää vapaan sulfhydryyliryhmän tai ryhmän, joka voidaan derivatisoida sisältämään sulfhydryyliryhmän, kuten vasta-ainemolekyyli. Pyridinyyliditio-osa 15 irtoaa vasta-aineen ja bifunktionaalisen yhdisteen välisen reaktion aikana. Vapaan karbonyyliryhmän sisältävä molekyyli on edullisesti sytotoksinen reagenssimolekyyli, kuten antrasykliini, joka voi tappaa valittuja soluja. Edullisessa suoritusmuodossa hydratsonisidos, joka liittää 20 sytotoksisen reagenssimolekyylin bifunktionaaliseen yhdis teeseen, sallii sytotoksisen reagenssin pH-herkän vapautumisen.
Konjugaatteja, jotka on muodostettu liittämällä molekyylejä keksinnön mukaisten bifunktionaalisten yhdis-. 25 teiden kanssa, voidaan käyttää farmaseuttisissa koostumuk sissa, kuten sellaisissa, jotka sisältävät farmaseuttissti tehokkaan määrän ainakin yhtä immunokonjugaattia ja farmaseuttisesti hyväksyttävää väliainetta.
Tässä kuvatut yhdisteet, konjugaatit, farmaseutti-30 set koostumukset ja menetelmät aikaansaavat edullisella tavalla käyttökelpoisen lähestymistavan sytotoksisten rea-genssien kohdistamiseksi solujen valittuihin populaatioihin näiden kohdesolujen ensijäiseen tappamiseen sairauksien hoidossa, kuten syöpälajien ja muiden kasvainten, ei-35 soluja tappavissa virus- tai muissa patogeeni-infektioissa ja autoimmuunihäiriöissä.
100718 13
Kuviossa 1 kuvataan adriamysiinijohdannaisten rakenteet, jotka johdanniaset on valmistettu saattamalla keksinnön mukaiset bifunktionaaliset yhdisteet reagoimaan adriamysiinin kanssa alla esimerkeissä 1-5 kuvatulla 5 tavalla.
Kuvio 2 on kaavamainen esitys bifunktionaalisen N-[2-[ (2-pyridinyyli )ditio] etyyli ]hydrat siinikarboksamidi-yhdisteen synteesistä, jota yhdistettä käytetään valmistettaessa adriamysiinin semikarbatsonijohdannaista alla 10 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
Kuvio 3 on kaavamainen esitys bifunktionaalisen 2—[[[2—[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]amino]karbonyyli]-karbonihappodihydratsidiyhdisteen synteesistä, jota yhdistettä käytetään valmistettaessa adriamysiinin karbatsoni- 15 johdannaista alla esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Kuvio 4 on kaavamainen esitys bifunktionaalisen N-[4-[(2-pyridinyyli)ditio]-2-butenyyli]hydratsiinikarbo-tioamidiyhdisteen synteesistä, jota yhdistettä käytetään valmistettaessa adriamysiinin tiosemikarbatsonijohdannais-20 ta alla esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Kuvio 5 on kaavamainen esitys bifunktionaalisen 2-[ (2-pyridinyyli )ditio]etyylihydratsiinikarboksylaattiyh-disteen synteesistä, joka yhdistettä käytetään valmistettaessa adriamysiinin karboksylaattihydratsonijohdannaista 25 alla esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 6 on kaavamainen esitys bifunktionaalisen N- [2- [ (2-pyridinyyli )ditio] etyyli] -4-hydratsinobentsamidi-yhdisteen synteesistä, jota yhdistettä käytetään valmistettaessa adriamysiinin aryylihydratsonijohdannaista alla 30 esimerkissä 5 kuvatulla tavalla.
Kuvio 7 on kaavamainen esitys immunokonjugaattien keksinnön mukaisesta valmistuksesta käyttämällä SPDP:llä tioloitua vasta-ainetta, joka saatetaan reagoimaan keksinnön mukaisten bifunktionaalisten yhdisteiden kanssa alla 35 esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.
14 1C0718
Kuvio 8 on kaavamainen esitys immunokonjugaattien keksinnön mukaisesta valmistuksesta käyttämällä 2-IT:llä tioloitua vasta-ainetta, joka saatetaan reagoimaan keksinnön mukaisten bifunktionaalisten yhdisteiden kanssa.
5 Kuvio 9 on kaavamainen esitys immunokonjugaattien keksinnön mukaisesta valmistuksesta, joissa konjugaateissa on vasta-aineen ja pelkistetyn bifunktionaalisen yhdisteen välissä tioeetterisidos, käyttämällä vasta-ainetta, joka on saatettu reagoimaan SMPB:n kanssa maleimidiryhmien li-10 säämiseksi.
Kuvio 10 on kaavio adriamysiinin vapautumisesta ajan funktiona adriamysiinijohdannaisten inkuboinnin jälkeen puskurissa pH-arvossa 4,5, kuten kuvataan alla esimerkissä 6.
15 Kuvio 11 on kaavio adriamysiinin vapautumisesta ajan funktiona adriamysiinijohdannaisten inkuboinnin jälkeen puskurissa pH-arvossa 5,0, kuten kuvataan alla esimerkissä 6.
Kuvio 12 on kaavio adriamysiinin vapautumisesta 20 ajan funktiona adriamysiinijohdannaisten inkuboinnin jäl keen puskurissa pH-arvossa 7,4, kuten kuvataan alla esimerkissä 6.
Kuvio 13 kaavio adriamysiinin vapautumisesta adriamysiinin karbatsonijohdannaisesta ja tämän johdannaisen ·. 25 5E9-immunokonjugaatista ajan funktiona inkuboinnin jälkeen puskurissa pH-arvossa 4,5, kuten kuvataan alla esimerkissä 7.
Seuraava yksityiskohtainen kuvaus esitetään, jotta tässä kuvattu keksintö ymmärrettäisiin täydellisemmin.
30 Tämä keksintö koskee erityisesti uusia bifunktio- naalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä: N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]hydratsiinikarboksamidi (yhdiste 10) ; 2-[[[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]amino]karbonyy- 11) karbonidihydratsidi (yhdiste 11a); N-[4-[(2-pyridinyy- 35 li)ditio]-2-butenyyli]hydratsiinikarbotioamidi (yhdiste 12) ; 2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyylihydratsiinikarboksy- 100718 15 laatti (yhdiste 13); ja N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyy-li]-4-hydratsinobentsamidi (yhdiste 15). Näitä yhdisteitä käytetään muodostamaan sytotoksisten reagenssien, kuten antrasykliinien, uusia N-substituoituja hydratsonijohdan-5 naisia, ja vasta-aineeseen liitettäessä immunokonjugaat- tien muodostamiseen. Keksintö koskee myös menetelmiä bi-funktionaalisten yhdisteiden valmistamiseksi ja immunokon-jugaattien valmistusmenetelmää. Immunokonjugaatit ovat käyttökelpoisia farmaseuttisissa koostumuksissa sytotok-10 sisten reagenssien vapauttamiseksi kohdesoluihin hoitamaan sairauksia, kuten syöpälajeja ja muita kasvaimia, ei soluja tappavia virus- tai muita patogeeni-infektioita ja au-toimmuunihäiriöitä.
Konjugaatit sisältävät ainakin yhtä sytotoksista 15 johdannaismolekyyliä, joka on yhdistetty yhdellä bifunk- tionaalisista yhdisteistä ainakin yhteen molekyyliin, joka on reaktiivinen kohdesolupopulaation kanssa, ts. sulf-hydryyliryhmän sisältävän monoklonaalisen vasta-aineen kanssa.
20 Siten yhden edullisen suoritusmuodon mukaan synte tisoitiin uusi yhdiste, N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli ] hydratsiinikarboksamidi, yhdiste 10, ja sitä käytettiin muodostamaan ADM:n semikarbatsonijohdannainen, joka sisältää ADMrn C-13-asemassa semikarbatsonisidoksen. Toisessa 25 edullisessa suoritusmuodossa syntetisoitiin uusi yhdiste 2—[[[2—[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]amino]karbonyyli]kar-bonidihydratsidi, yhdiste 11a, ja sitä käytettiin muodostamaan ADM:n karbatsonijohdannainen, jossa on ADM:n C-13-asemassa karbatsonisidos. Keksinnön edelleen erään edulli-30 sen suoritusmuodon mukaan syntetisoitiin uusi yhdiste N- [4-[ (2-pyridinyyli )ditio] -2-butenyyli)hydratsiinikarbotio-amidi, yhdiste 12, ja sitä käytettiin muodostamaan ADM:n tiosemikarbatsonijohdannainen, jossa on ADMrn C-13-asemas-sa tiosemikarbatsonisidos. Edelleen eräässä edullisessa 35 suoritusmuodossa syntetisoitiin uusi yhdiste 2[(2-pyri dinyyli )ditio]etyylihydratsiinikarboksylaatti, yhdiste 13, 100718 16 ja sitä käytettiin muodostamaan ADM:n hydratsonijohdannainen, jossa on ADM:n C-13-asemassa karboksylaattihydrat-sonisidos. Edelleen edullisessa suoritusmuodossa käytettiin uutta yhdistettä, N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]-5 4-hydratsinobentsamidia, yhdiste 15, muodostamaan ADM:n aryylihydratsonijohdannainen, jossa oli ADM:n C-13-asemas-sa fenyylihydratsonisidos.
Muissa suoritusmuodoissa keksintö koskee menetelmää konjugaattien valmistamiseksi, jotka sisältävät ainakin 10 yhden molekyylin, joka on reaktiivinen kohdesolupopulaati- on kanssa, ts. sulfhydryyliryhmän sisältävän monoklonaali-sen vasta-aineen kanssa, ja ainakin yhden soluja tappavan sytotoksisen molekyylin, joka on liitetty keksinnön mukaisilla uusilla bifunktionaalisilla yhdisteillä. Siten kek-15 sintö koskee menetelmää immunokonjugaattien valmistamisek si, jotka sisältävät sylfhydryyliryhmän sisältävää mono-klonaalista vasta-ainetta, joka on suunnattu kohdesolupo-pulaatiota, esimerkiksi kasvainsolupopulaatiota vastaan, jonka vasta-aineen rakenteeseen on liitetty joukko antra-20 sykliinijohdannaismolekyylejä. Antrasykliinijohdannaismo- lekyylit ovat kiinnittyneet tioloituun vasta-aineeseen kovalenttisesti niin, että jokaisen lääkemolekyylin ja vasta-aineen välille muodostuu disulfidisidos, jolloin bifunktionaalinen yhdiste on kiinnittynyt antrasyk-25 liinijohdannaiseen hydratsonisidoksella antrasykliinin C-13-asemassa. Kuhunkin vasta-ainemolekyyliin voidaan kiinnittää useampia, kuin yksi lääkemolekyyli käyttämällä yhtä keksinnön mukaista bifunktionaalista yhdistettä/lää-kemolekyyli. Moolisuhde 4:1 ilmaisee, että neljä lääke-, 30 (ts. antrasykliinijohdannais)molekyyliä kiinnittyy yhteen ainoaan vasta-aineeseen.
Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa antrasykliinijohdannainen pelkistetään sulfhydryyliryhmän muodostamiseksi, ja tämä ADM-johdannainen kondensoidaan maleimidilla modi-35 fioidun vasta-aineen kanssa muodostaen vasta-aineen ja antrasykliinin välille tioeetterisidoksen.
17 100718 Nämä konjugaatit sallivat modifioimattoman antra-sykliinilääkkeen pH-herkän vapautumisen estäen lääkkeen rakennemuutokset, jotka voisivat aiheuttaa sytotoksisuuden alenemisen.
5 Konjugaatit valmistetaan vaiheittain muodostamalla ensin uusi N-substituoitu hydratsiiniyhdiste, jota käytetään sytotoksisen reagenssin hydratsonijohdannaisen muodostamiseen, joka sitten saatetaan reagoimaan proteiinin kanssa, jolla on sopiva spesifisyys [katso: Hardy, "Puri-10 fication and Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In
Flow Cytometry", käsikirjassa Handbook Of Experimental Immunology, voi. 1: Immunochemistry, D.M. Weir et al.
(toimittajat), s. 31.4 - 31.12 (4. painos 1986) koskien esitystä tavanomaisista vasta-aineenkytkentätekniikoista; 15 ja Varga et ai., edellä, ligandikonjugaattien valmistuksen suhteen].
Pituus bifunktionaalisella yhdisteellä, joka yhdistää sytotoksisen reagenssin konjugaattien solureaktiivisen komponentin kanssa, voi vaihdella mikäli vain bifunktio-20 naalinen yhdiste on kiinnittynyt sytotoksisen reagenssimo- lekyylin tai molekyylien karbonyyliryhmään jollain edellä mainituista hydratsonisidoksista.
Sytotoksisia reagensseja ovat antrasykliinit: ad-riamysiini, daunomysiini, detorubisiini, karminomysiini, ·, 25 ldarubisiini, epirubisiini, esorubisiini, 4'-THP-ad- riamysiini, AD-32 ja 3'-deamino-3'-3-syaani-4-morfolinyy-li)doksorubisiini [Casazza, "Experimental Studies On New Anthracyclines", teoksessa Adriamycin: Its Expanding Role In Cancer Treatment, M. Ogawa et ai. (toimittajat), s.
30 439 - 52 (Excerpta Medica, 1984)].
Solureaktiiviset molekyylit, johon sytotoksinen reagenssi liitetään konjugaatissa bifunktionaalisen yhdisteen kautta, voivat olla mitä hyvänsä sulfhydryyliryhmän sisältäviä vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia erityi-35 sen kohdesolupopulaation kanssa, joka halutaan eliminoida tai tappaa. Esimerkkejä tällaisista vasta-aineista ovat ι8 100718 mm. vasta-aineet, jotka sitoutuvat kasvaimiin liittyviin antigeeneihin, kuten antigeeneihin, joita esiintyy kar-sinoomissa, melanoomissa, imukudoskasvaimissa, luu- tai pehmeän kudoksen sarkoomissa, samoin kuin muissa kasvai-5 missä; vasta-aineet, jotka sitoutuvat virus- tai muihin patogeeneihin liittyviin antigeeneihin; ja vasta-aineet, jotka sitoutuvat epänormaaleihin solupinta-antigeeneihin. Nämä vasta-aineet voidaan valmistaa tekniikan tasolla vakiintuneita tekniikkoja käyttäen [Yeh et ai., "Cell Surfa-10 ce Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal
Antibody," Proc. Natl. Acad. Sei. 76 (1979) 2927 - 31, ja Brown et ai., "Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies," J. Immunol. 127 (no. 2) (1981) 539 - 46 (tuotetut kas-15 vainspesifiset monoklonaaliset vasta-aineet)]. Voidaan käyttää esimerkiksi monoklonaalista vasta-ainetta L6, joka on spesifinen ihmisen keuhkosyöpäsoluille, tai monoklonaalista vasta-ainetta 791T/36, joka on spesifinen luuperäi-sille syöpäsoluille.
20 Keksinnön mukaisesti valmistettujen konjugaattien solureaktiivinen "kohdistamismolekyyli", vasta-aine toimii vapauttaen sytotoksiset reagenssimolekyylit erityiseen kohdesolupopulaatioon, jonka kanssa vasta-aine on reaktiivinen. Esimerkiksi vasta-aine, joka on suunnattu kasvain-25 solujen pinnalla esiintyvää antigeeniä vastaan, sitoutuu ja vapauttaa sytotoksiset reagenssit näille kasvainsoluil-le, tai vasta-aine, joka on suunnattu AIDSia aiheuttavan HI-viruksen (Human Immunodeficiency Virus) proteiinia vastaan, vapauttaa sytotoksisen reagenssinsa HI-viruksella 30 infektoituneille soluille.
*: Sytotoksisen reagenssin vapauttamisesta erityisen solupopulaation sisälle tai erityisen solupopulaation sijaintipaikkaan, jonka populaation kanssa vasta-aine reagoi, seuraa näiden erityisten solujen ensisijainen tappa-35 minen. Siten on selvää, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetut konjugaatit ovat käyttökelpoisia hoitamaan 19 100718 mitä hyvänsä sairautta, jossa yritetään eliminoida erityistä solupopulaatiota, jolla on solupinta-antigeeni tai -reseptori, joka sallii konjugaatin sitoutumisen. Sairauksia, joihin konjugaatit ovat käyttökelpoisia, ovat mm., 5 muttei rajoittuen, syöpälajit ja muut kasvaimet, ei-soluja tappavat virus- tai muut patogeeni-infektiot, kuten AIDS, herpes, CMV (sytomegalovirus), EBV (Epstein-Barr virus), SSPE (subacute schlerosis panencephalitis; hitaasti etenevä, aivoja rappeuttava sairaus) ja nivelreuma.
10 Teoriaan sitoutumatta uskotaan, että vasta-ainee seen liittyneet sytotoksiset reagenssimolekyylit, ts. konjugaatit vapautuvat tapettaviin kohdesoluihin vasta-aine-spesifisyyden kautta ja voivat siis mennä solun sisälle saman endosyyttisen reitin kautta, joka johtaa membraaniin 15 sitoutuneiden, konjugoitumattomien vasta-aineiden interna- lisoitumiseen [Pastan et ai.; "Pathway Of Endocytosis", teoksessa Endocytosis, I. Pastan et ai. (toimittajat), s.
1-44 (Plenum Press, 1985)]. Kun konjugaatin sisältävät endosyyttiset rakkulat kerran ovat solun sisäpuolella, ne 20 sulautuvat yhteen primääristen lysosomien kanssa muodosta en sekundäärisiä lysosomeja [Embleton et ai., yllä, s. 334). Koska sytotoksiset molekyylit ovat kiinnittyneet konjugaatin vasta-ainekomponenttiin happoherkillä hydrat-sonisidoksilla, konjugaatin altistamisesta endosyyttisten 25 rakkuloiden ja lysosomien happamalle ympäristölle seuraa sytotoksisen reagenssin vapautuminen konjugaatista. Edelleen vapautuvan reagenssin uskotaan olevan suhteellisen mofifioimattoman reagenssin muodossa, jolla on täysi syto-toksinen aktiivisuus. Siten konjugaatin happoherkkä sidos 30 on erittäin edullinen sytotoksisen reagenssin vapauttami- seen kohdesolujen sisälle, lisäten konjugaatin sytotoksi-suutta näitä soluja kohtaan. Vaihtoehtoisesti hydrat-sonisidos voi lohjeta happamissa ja pelkistävissä olosuhteissa välittömässä ympäristössä, joka on kohdesolujen 35 ulkopuolella tai ympäröi niitä, esimerkiksi, kasvaimen 20 1C0718 sijaintipaikassa, ja kasvainsolut voivat ottaa vapautuneen lääkkeen vastaan.
Keksintöä kuvataan edullisilla suoritusmuodoilla, joissa käytettiin antrasykliini adriamysiiniä. Yleensä 5 adriamysiinin karbonyylijohdannaiset valmistettiin käsit telemällä adriamysiinihydrokloridi yhdellä keksinnön mukaisesta viidestä bifunktionaalisesta yhdisteestä metano-lissa huoneenlämpötilassa. Havaittiin, että trifluorietik-kahapon (TFA) katalyyttisen määrän lisääminen nopeutti 10 kondensointireaktioita niin, että reaktio eteni loppuun yön yli sekoittamisen jälkeen. Näissä reaktioissa muodostui harvoja sivutuotteita, ja puhdistusmenetelmä vaati vain asetonitriilillä saostamista. Nämä yksinkertaistuneet menetelmät edustavat parannusta verrattuna aikaisempiin, 15 jotka on kuvannut Greenfield et ai., yllä., siinä mieles sä, että ne ovat helpompia suorittaa, taloudellisempia ja nopeampia, ja aikaansaavat lisää uusia bifunktionaalisia yhdisteitä erilaisten molekyylien joukon kanssa konjugoi-tavaksi.
20 Ensimmäisessä suoritusmuodossa valmistettiin uusi bifunktionaalinen yhdiste saattamalla ensin metoksikarbo-nyylisulfenyylikloridi reagoimaan 2-aminoetaanitiolihydro-kloridin kanssa, sitten 2-merkaptopyridiinin kanssa muodostamaan 2-[(2-pyridinyyli)ditio]etaaniamiinihydroklori-25 din (katso kuvio 2). Sitten tämä yhdiste saatettiin rea goimaan fosgeenin kanssa trietyyliamiinin (TEA) läsnä ollessa, sitten t-butyylikarbatsaatin kanssa muodostamaan N- [ 2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]-2-(tert-butoksi-kar-bonyyli)hydratsiinikarboksamidin. Seuraavaksi hydratsiini-30 karboksamidi liuotettiin TFA:hän muodostamaan N-[2-[(2- " pyridinyyli)ditio]etyyli]hydratsiinikarboksamidin, yhdis teen 10, semikarbatsidin, joka sitten saatettiin reagoimaan adriamysiinihydrokloridin kanssa muodostamaan ADM:n semikarbatsonijohdannaisen, joka sisälsi reaktiivisen py-35 ridinyyliditioryhmän, yhdiste 1, kuvio 1.
100718 21
Toisessa edullisessa suoritusmuodossa valmistettiin uusi bifunktionaalinen karbatsidiyhdiste (kuvio 3). Yhdiste t-butyylikarbatsaatti saatettiin reagoimaan trifos-geenin kanssa TEA:n läsnä ollessa. Sitten lisättiin 2-(2-5 pyridinyyliditio)etaaniamiinihydrokloridia 2—[[[2—[(2-py- ridinyyli)ditio]etyyli]amino]karbonyyli]-2,2'-bis(tert-butoksikarbonyyli)karbonidihydratsidin muodostamiseksi. Tämä välituote lisättiin TFA:han muodostamaan 2-[[[2-[(2-pyridinyyli )ditio] etyyli] amino] karbonyyli]karbonidihydrat-10 sidin, yhdisteen 11a, joka sitten lisättiin adriamysiini- hydrokloridiin muodostamaan ADM:n karbatsonijohdannaisen (yhdiste 2, kuvio 1), joka sisälsi reaktiivisen pyri-dinyyliditioryhmän.
Edelleen edullisessa suoritusmuodossa valmistettiin 15 uusi bifunktionaalinen tiosemikarbatsidiyhdiste (kuvio 4).
Tässä suoritusmuodossa kaliumftalimidi saatettiin reagoimaan 1,4-dibromi-2-buteenin kanssa l-bromi-4-(N-ftalimi-do)-2-buteenin muodostamiseksi. Tämä yhdiste saatettiin reagoimaan kaliumtioasetaatin kanssa muodostamaan l-(ase-20 tyylitio)-4-(N-ftalimido)-2-buteenin, joka sitten saatet tiin reagoimaan hydratsiinin kanssa ja käsiteltiin metok-sikarbonyylisulfenyylikloridilla, ja sen jälkeen 2-merkap-topyridiinilläl-amino-4-[(2-pyridinyyli)ditio]-2-buteeni-hydrokloridin muodostamiseksi. Tämä yhdiste yhdistettiin 25 TEA:n kanssa, ja sen kanssa di-2-pyridyylitionokarbonaatin kanssa, sitten lisättiin t-butyylikarbatsaattia N-[4-[(2-pyridinyyli )ditio] -2-butenyyli] hydratsiinikarbotioamidin t-boc-johdannaisen, yhdisteen 12 muodostamiseksi. Tämä yhdiste liuotettiin TFA:aan muodostamaan kumimaisen yhdis-30 teen, joka sitten saatettiin reagoimaan adriamysiinihydro- kloridin ja TFA:n kanssa muodostamaan ADM:n tiosemikarbat-sonijohdannaisen, jossa oli tiosemikarbatsonisidos ADM:n C-13-asemassa (yhdiste 3, kuvio 1), ja jossa oli reaktiivinen pyridinyyliditioryhmä.
35 Toiseen edulliseen suoritusmuotoon liittyy edelleen erään uuden bifunktionaalisen yhdisteen muodostaminen 100718 22 (kuvio 5). Kloorikarbonyylisulfenyylikloridi saatettiin reagoimaan 2-merkaptoetanolin ja 2-merkaptopyridiinin kanssa. Lisättiin ammoniumkarbonaattiliuosta muodostamaan 2-(2-pyridinyyli)ditio)etanolia värittömänä öljynä. Lisät-5 tiin karbonyylidi-imidatsolia, ja seos saatettiin reagoi maan hydratsiinin kanssa 2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli-hydratsiinikarboksylaatin, yhdisteen 13 muodostamiseksi. Tämä yhdiste saatettiin reagoimaan adriamysiinihydroklori-din ja TFA:n, ja sitten asetonitriilin kanssa muodostamaan 10 ADM:n karboksylaattihydratsonijohdannaisen (yhdiste 4, kuvio 1), jossa on ADM:n C-13-asemassa karboksylaattihyd-ratsonisidos, ja jossa on reaktiivinen pyridinyyliditio-ryhmä.
Edelleen eräässä edullisessa suoritusmuodossa syn-15 tetisoitiin uusi bifunktionaalinen yhdiste (kuvio 6). Tämä yhdiste valmistettiin saattamalla p-hydratsinobentsoehappo reagoimaan di-t-butyylipyrokarbonaatin kanssa 4-(N-boc-hydratsino)bentsoehapon muodostamiseksi. Tämä yhdiste saatettiin reagoimaan N-hydroksisukkinimidin ja DCC:n kanssa, 20 jolloin saatiin 4-N-boc-(hydratsino)bentsoehapon N-hydrok- sisukkinimidiesteri. Tämä materiaali saatettiin reagoimaan 2-(2-pyridinyyli)ditio)etaaniamiinihydrokloridin ja TEA:n kanssa, jolloin saatiin N-[2-(2-pyridinyyli)ditio]etyyli-4-N-boc-(hydratsino)bentsamidi. Sitten tämä yhdiste käsi-25 teltiin TFAzlla muodostamaan N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]- etyyli]-4-hydratsinobentsamidin, yhdisteen 15, joka sitten saatettiin reagoimaan adriamysiinihydrokloridin kanssa muodostamaan ADM:n fenyylihydratsonijohdannaisen (yhdiste 5, kuvio 1), jossa on ADM:n C-13-asemassa aryylihydrat-30 sonisidos, ja jossa on reaktiivinen pyridinyyliditioryhmä.
Edellä kuvattuja ADM:n uusia N-substituoituja hyd-ratsonijohdannaisia käytettiin konjugaattien keksinnön mukaisessa valmistuksessa. Jokainen johdannainen saatettiin reagoimaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka 35 oli aikaisemmin tioloitu SPDP:llä tai 2-IT:llä (2- iminotiolaani) vastaavasti, kuten kuvissa 7 ja 8 esite- 100718 23 tään. Tulokseksi saadut immunokonjugaatit koostuivat ADM-molekyyleistä, jotka oli konjugoitu monoklonaaliseen vasta-aineeseen bifunktionaalisen yhdisteen avulla, joka oli kiinnittynyt kunkin ADM-molekyylin C-13-asemaan hydrat-5 sonisidoksella. Bifunktionaaliset yhdisteet sisälsivät myös disulfidisidoksen, jonka kautta kukin oli kiinnitetty vasta-aineeseen.
Bifunktionaalinen yhdiste, joka yhdistää ADM:n ja vasta-aineen, voi koostua joukosta ainesosia ja sidoksia 10 mikäli vain näihin sidoksiin kuuluu antrasykliinin C-13- asemassa happoherkkä hydratsonisidos. Edullisten suoritusmuotojen vasta-aine oli monoklonaalinen vasta-aine 5E9.
Keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa uudet bifunktionaaliset yhdisteet yhdistetään adriamysii-15 nin kanssa muodostamaan johdannaisen, joka sitten käsitel lään edelleen pelkistysaine ditiotreitolilla (DTT) tai tributyylifosfiinilla tuottamaan adriamysiinijohdannaisen, joka sisältää sulfhydryyli (-SH)-ryhmän bifunktionaalisen yhdisteen päässä. Sitten tämä johdannainen saatetaan rea-20 goimaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, johon malei- midiryhmät on kiinnitetty, esimerkiksi vasta-aineen reaktiolla sukkinimidyyli-4-(p-maleimidofenyyli)butyraatin (SMPB) kanssa. Muodostuu immunokonjugaatti, jossa on bifunktionaalinen yhdiste kiinnittyneenä hydratsonisidoksel-25 la jokaisen ADM:n C-13-asemassa, ja jossa on tioeette- risidos osana vasta-aineeseen kiinnittymistä (katso kuvio 9).
Siten on selvää, että ADM:n ja vasta-aineen yhdistävä bifunktionaalinen yhdiste voi koostua joukosta ai-30 nesosia ja sidoksia mikäli näihin sidoksiin kuuluu ADM:n '[ 13-ketoasemassa hydratsonisidos ja reaktiivinen pyri- dinyyliditioryhmä vasta-aineeseen yhdistämistä varten.
On selvää, että tämä keksintö aikaansaa seuraavan yleisen kaavan I mukaisia antrasykliinien uusia hydratso-35 nijohdannaisia: 100718 24 O OH N-R, H Il Ί J"oh 2
Rj O OH Ö CHj7---0-7 f1» "r/T7 10 R5 jossa:
Ri on NHCONH(CH2)nSSR8; NHCONHNHCONH (CH2 )„SSR8; 15 NHCSNH(CH2)BCH-CH(CH2)nSSR8; NHCOO(CH2)nSSR8; tai NHArCONH (CH2) nSSR8; <r^ joissa R8 on | ; 20
Ar on I ; 25 m on kokonaisluku 1-10, ja n on kokonaisluku 1-4; R2 on CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 tai CH2OCOCH (OC2H5) 2; R3 on OCH3, OH tai vety; R4 on NH2, NHCOCF3, 4-morfolinyyli, 3-syaani-4-morfolinyyli, 1-piperidinyyli, 4-metoksi-l-piperidinyyli, bentsyyliamii-30 ni, dibentsyyliamiini, syaanimetyyliamiini tai l-syaani-2- • metoksietyyliamiini; R5 on OH, O-THP tai vety; ja R6 on OH tai vety, sillä ehdolla, että R6 ei ole OH kun Rs on OH tai O-THP, 35 ja kaavan II mukaisia antrasykliinien uusia hydratsonijoh dannaisia: 100718 25 O OH M-R, 5 R3 O oh o
CHj-r~—o-J UD
ίο R® I nr4r7 r5 jossa:
Rx on NHCONH(CH2)nSSR8; NHCONHNHCONH (CH2) nSSRe ; 15 NHCSNH( CH2 )bCH«CH( CH2 )nSSRe; NHCOO(CH2)nSSRe; tai NH-Ar-CONH (CH2 )nSSRe; 2Q joissa R8 on ί j
Ar on ; , 25 m on kokonaisluku 1 - 10, ja n on kokonaisluku 1-4; R2 on CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 tai CH2OCOCH( OC2H5 )2; R3 on OCH3, OH tai vety; R4 ja R, ovat toisistaan riippumatta vety, alkyyli, substi-tuoitu alkyyli, sykloalkyyli, substituoitu sykloalkyyli, 30 aryyli, substituoitu aryyli, aralkyyli tai substituoitu aralkyyli; tai R4, R7 ja N muodostavat yhdessä 4 - 7-jäsenisen renkaan, jolloin mainittu rengas voi mahdollisesti olla substituoitu; R5 on OH, O-THP tai vety; ja 35 r6 on OH tai vety, sillä ehdolla, että R6 ei ole OH kun R5 on OH tai O-THP.
100718 26
Edellä kuvatut bifunktionaaliset yhdisteet ja ant-rasykliinin N-substituoidut hydratsonijohdannaiset ovat uusia yhdisteitä. Antrasykliinin hydratsonijohdannaisia voidaan käyttää uusina sytotoksisina reagensseina, ja ja 5 ne edustavat myös välituotteita uusien konjugaattien kek sinnön mukaisessa valmistuksessa. Antrasykliinin hydratsoni johdannaisista esitetään esimerkkeinä adriamysii-nisemikarbatsoni; adriamysiinikarbatsoni; adriamysiini-tiosemikarbatsoni; adriamysiinikarboksylaattihydratsoni; 10 ja adriamysiiniaryylihydratsoni, vastaavasti, jotka kuva taan tässä esitetyissä edullisissa suoritusmuodoissa.
Kuten yllä olevista kaavoista voidaan nähdä, N-substituoituihin hydratsoni-ADM-johdannaisiin luetaan mukaan N-substituoituja hydratsoneja mistä hyvänsä tunne-15 tuista antrasykliineistä, kuten adriamysiini, daunomysiini ja karminomysiini. Lisäksi johdannaisia ovat mm. N-substituoidut hydratsonit, jotka on derivatisoitu erityisiin kohtiin antrasykliinirakenteessa (esimerkiksi 4'-THP-ad-riamysiinihydratsoni ja 3'-deamino-3'-(3-syaani-4-morfo-20 linyyli )adriamysiinihydratsoni). Viimeksi mainitut johdan naiset voidaan syntetisoida derivatisoimalla antrasykliini ensin halutun analogin muodostamiseksi ja käyttämällä tätä analogia N-substituoitujen hydratsoni johdannaisten valmistukseen. Tunnettuja antrasykliinianalogeja ovat mm. sel-25 laiset, jotka on kuvattu US-patenttijulkaisuissa 4 464 529 ja 4 301 277 (3'-deamino-3'-(4-morfolinyyli)- tai 3'-de-amino-3'(3-syaani-4-morfolinyyli)antrasykliinianalogit), 4 202 967 ja 4 314 054 (3'-deamino-3'-(1-piperidinyyli)-tai 3'-deamino-3'-(4-metoksi-l-piperidinyyli)antrasyk-30 liinianalogit), 4 250 303 (N-bentsyyli- tai N,N-dibentsyy- • · ; liantrasykliinianalogit), 4 591 637 (N-metoksimetyyli- tai N-syaanimetyyliantrasykliinianalogit) ja 4 303 785 (antra-sykliinien asetaalianalogit). Siten nämä tunnetut antra-sykliinianalogit voidaan saattaa reagoimaan tässä edellä 35 kuvatulla tavalla ADM:n uusien hydratsonijohdannaisten tuottamiseksi, jotka sitten voidaan konjugoida solureak- 100718 27 tiiviseen molekyyliin, kuten vasta-aineeseen, jolla on haluttu spesifisyys, kuten edellä kuvataan.
Vaihtoehtoisesti, voidaan ensin valmistaa tässä kuvatulla tavalla derivatisoimaton N-substituoitu hydrat-5 sonijohdannainen derivatisoimattomasta antrasykliinistä, kuten adriamysiinistä, daunomysiinistä tai kar-minomysiinistä, ja sitten tämä uusi johdannainen voidaan derivatisoida halutulla tavalla substituoidun uuden N-substituoidun hydratsonin valmistamiseksi. Esimerkiksi 10 semikarbatsoni-ADM-johdannainen voidaan derivatisoida aminosokeriryhmästään pelkistävällä aminoinnilla 2,2'-oksidiasetaldehydillä käyttämällä US-patenttijulkaisussa 4 464 529 kuvattua menetelmää 3'-deamino-3'-(4-morfoli-no)antrasykliinin semikarbatseenin valmistamiseksi. Lisäk-15 si N-substituoidut hydratsonijohdannaiset voidaan deriva tisoida kaavojen I ja II R5-asemaan US-patenttijulkaisussa 4 303 785 kuvatulla menetelmällä hydratsonin asetaalijoh-dannaisten, kuten 4'-THP-ADM:n N-substituoidun hydratsonin, valmistamiseksi.
20 Olisi ymmärrettävä, että näissä menetelmissä hyd- ratsonien derivatisoimiseksi voidaan käyttää lähtöaineina muiden reagenssien N-substituoituja hydratsoneja, mukaan lukien erilaisten kemoterapeuttisten aineiden N-substituoidut hydratsonit. Ja muita antrasykliinejä kuin ADM:ää, ·. 25 kuten daunomysiiniä tai karminomysiiniä, voidaan käyttää tuottamaan uusia yhdisteitä, kuten N-bentsyylidaunomysii-nin N-substituoitu hydratsoni tai 3'-deamino-3'-(4-morfo-linyyli)karminomysiinin N-substituoitu hydratsoni ja muita yhdisteitä käyttämällä muita johdannaisia, jotka muut yh-30 disteet myös kuuluvat keksinnön suoja-alaan.
. · Antrasykliini johdannaisten vapauttamisnopeudet lää ke adriamysiinille arvioitiin pH-arvoilla 4,5, 5,0 ja 7,4 ja niillä oli laaja vapauttamisnopeuksien alue. Lisäksi immunokonjugaateilla, jotka sisälsivät johdannaisia, jotka 35 oli konjugoitu monoklonaaliseen vasta-aineeseen, arvioi tiin adriamysiinin vapautuminen pH-arvolla 4,5. Immunokon- 100718 28 jugaattien sytotoksisuus testattiin käyttämällä Daudi-so-luja pesäkkeenmuodostusinhibointimäärityksessä, ja hydrat-sonijohdannaisten stabiilisuuden välillä ilmeni korrelaatiota. Immunokonjugaateilla nähtiin myös laaja vapautumis-5 nopeuksien alue, ja niillä ilmeni pesäkkeenmuodostusmää- rityksessä kasvainsoluilla vasta-aine-suunnattua soluntap-pamista (sytotoksisuutta).
Keksinnön mukaiset N-substituoidut hydratsiiniyh-disteet antavat käyttöön käyttökelpoisia bifunktionaalisia 10 yhdisteitä molekyylien, kuten kohdistamis- ja sytotoksis- ten reagenssien, liittämiseen. Käytettäessä liittämään sy-totoksisia molekyylejä, jotka sisältävät karbonyyliryhmän, bifunktionaaliset yhdisteet aikaansaavat happoherkän sidoksen, joka lohkeaa pH-alueen sisällä sytotoksisen rea-15 genssin vapauttamiseksi. Keksinnön mukaisesti valmistetut antrasykliini-immunokonjugaatit vaikuttavat parannukselta verrattuna aikaisemmin kuvattuihin immunokonjugaatteihin, joissa antrasykliinit oli suoraan liitetty vasta-aineisiin antrasykliinin aminosokeriryhmän kautta, koska nämä 20 aminosokerilla liitetyt konjugaatit sisältävät usein al haisempia antrasykliini:vasta-aine-moolisuhteita, ovat heikompitehoisia kuin vapaa ADM, ja niillä on huonontuneet vasta-aineensitomisominaisuudet [Arnon et ai., Immunological Rev. 62, yllä; Hurwitz et ai., Cancer Res. 35, yllä; . 25 ja Yamamoto et ai., yllä]. Lisäksi keksinnön mukaisesti valmistetuilla immunokonjugaateilla suoritetut stabiili-suustutkimukset osoittivat, että antrasykliini vapautui immunokonjugaateista happamissa olosuhteissa, jotka ovat samanlaiset, kuin soluympäristössä esiintyvät. Siten nämä 30 immunokonjugaatit voivat vapauttaa suhteellisen modifioi- matonta lääkettä kohdesoluihin vapautettavaksi. Tässä kuvatut konjugaatit aikaansaavat lääkkeen vapautumisen laajalla pH-arvojen alueella, mikä voi olla eduksi lääkkeen vapauttamiselle.
35 Keksinnön mukaisista bifunktionaalisista yhdisteis tä ja niitä käyttäen valmistetuista immunokonjugaateista 100718 29 ja menetelmistä niiden valmistamiseksi esitetään esimerkkeinä edulliset suoritusmuodot, joissa antrasykliini ad-riamysiinin johdannaisia konjugoitiin transferriiniresep-torin vastaisen monoklonaaliseen vasta-aineeseen 5E9.
5 Tämän keksinnön menetelmien vaihtoehtoisissa suori tusmuodoissa annetaan käyttöön mm. joko samanaikaisesti tai perättäin joukko erilaisia konjugaatteja, ts., sellaisia, joissa on erilaisia sytotoksisia reagensseja ja erilaisia vasta-aineita yhdistelmäkemoterapiamenetelmissä 10 käytettäviksi. Voidaan esimerkiksi valmistaa antrasyklii ni -immunokonjugaattej a, joissa konjugaatin vasta-ainekom-ponentin spesifisyys vaihtelee, ts., käytetään joukkoa immunokonjugaattej a, joista jokaisessa on vasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti eri antigeeniin tai kiinnostuksen 15 kohteena olevassa solupopulaatiossa olevan saman antigee nin eri kohtiin tai epitooppeihin. Näiden immunokonjugaat-tien antrasykliinikomponentti voi olla sama tai se voi vaihdella. Tällainen suoritusmuoto voi olla erityisen käyttökelpoinen esimerkiksi käsiteltäessä määrättyjä kas-20 vaimia, joissa kasvaimen pinnan eri antigeenien määrät ovat tuntemattomia tai kasvainsolupopulaation anti-geeniekspressio on heterogeenistä ja halutaan olla varmoja, että riittävä määrä lääkettä kohdistuu kasvainkohdan kaikkiin kasvainsoluihin. Käyttämällä joukkoa konjugaatte-• 25 ja, joilla on kasvainta varten erilaisia antigeeni- tai epitooppispesifisyyksiä lisää todennäköisyyttä, että kasvaimen sijaintipaikkaan saadaan riittävästi lääkettä. Lisäksi tällainen suoritusmuoto on tärkeä suuren spesi-fisyysasteen saavuttamisessa kasvainta varten, koska to-30 dennäköisyys, että normaali kudos omaa kaikki kasvaimeen ; liittyvistä antigeeneistä, on pieni [katso Hellström et ai., "Monoclonal Antibodies to Two Determinants of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity", J. Immunol. 127 (no. 1) (1981) 157 35 - 160], 100718 30
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää joukkoa erilaisia immunokonjugaatteja, joissa vain konjugaatin antrasyklii-nikomponentti vaihtelee. Erityinen vasta-aine voidaan esimerkiksi liittää adriamysiiniin yhden immunokonjugaatin 5 muodostamiseksi, ja se voidaan liittää daunomysiiniin toi sen immunokonjugaatin muodostamiseksi. Sitten molempia konjugaatteja voidaan antaa hoidettavalle isännälle, ja konjugaatit paikallistuvat vasta-ainespesifisyydestä johtuen valitun solupopulaation sijaintipaikassa, jota popu-10 laatiota yritetään eliminoida. Sitten molemmat lääkkeet vapautuvat tässä kohdassa. Tämä suoritusmuoto voi olla tärkeä silloin, kun erityisen solupopulaation, kuten kasvaimen, lääkeresistenssin suhteen on epävarmuutta, koska näin joukko erilaisia lääkkeitä vapautuu kohdesolujen koh-15 dalla tai niiden sisällä. Useampi kuin yksi antrasyk- liinityyppi voidaan siis konjugoida erityiseen vasta-aineeseen muodostamaan immunokonjugaatin, jossa on pitkin sen pintaa joukko erilaisia antrasykliinimolekyylejä, jotka on kaikki liitetty vasta-aineeseen 13-ketohydrat-20 sonisidoksen kautta. Tällaisen immunokonjugaatin antami sesta seuraa erilaisten lääkkeiden joukon vapautuminen kohdesolujen sijaintipaikassa tai kohdesolujen sisälle.
Keksinnön mukaisesti valmistetut konjugaatit voidaan antaa farmaseuttisten koostumusten muodossa käyttä-25 mällä tavanomaisia antotapoja, mukaan lukien, muttei ra joittuen, laskimonsisäisesti, vatsaontelonsisäisesti, oraalisesti, imusuonensisäisesti tai antamalla suoraan valitun solupopulaation, kuten kasvaimen sijaintikohtaan. Laskimonsisäinen anto on edullista.
30 Farmaseuttiset koostumukset, jotka sisältävät kon jugaatteja, voivat olla joukossa erilaisia annosmuotoja, mukaan lukien, muttei mainittuihin rajoittuen, kiinteät, puolikiinteät ja nestemäiset annostelumuodot, kuten tabletit, pillerit, jauheet, nesteliuokset tai -suspensiot, 35 peräpuikot, polymeeriset mikrokapselit tai mikrorakkulat, liposomit ja injisoitavat tai infusoitavat liuokset. Edul- 100718 31 linen muoto riippuu antotavasta ja terapeuttisesta sovellutuksesta.
Farmaseuttiset koostumukset voivat myös sisältää tekniikan tasolla tunnettuja, tavanomaisia farmaseuttises-5 ti hyväksyttäviä väliaineita, kuten seerumiproteiineja, kuten ihmisen seerumin albumiinia, puskuriaineita, kuten fosfaatteja, vettä tai suoloja tai elektrolyyttejä.
Konjugaattikoostumusten tehokkain antotapa ja an-nostelujärjestys riippuu sairauden vakavuudesta ja kehi-10 tyksestä, potilaan terveydentilasta ja vasteesta käsitte lyyn ja hoitavan lääkärin harkinnasta. Niinpä konjugaat-tien ja kaikkien ohessa seuraavien yhdisteiden annokset olisi titrattava yksittäiselle potilaalle. Antrasykliini-immunokonjugaatin tehokas annos voi joka tapauksessa olla 15 alueella noin 1 - 100 mg/m2 antrasykliiniä tai noin 500 - 5000 mg/m2 vasta-ainetta.
Seuraavat esimerkit esitetään jotta keksintö ymmärrettäisiin täydellisemmin. Olisi ymmärrettävä, että nämä esimerkit ovat vain kuvaustarkoituksiin, eikä niitä ole 20 katsottava millään tavalla keksinnön suoja-alaa rajoitta viksi.
Esimerkit
Bifunktionaalisten yhdisteiden ja adriamysiinin (ADM) johdannaisten valmistus 25 Sulamispisteet määritettiin yhtiön Fisher-Johns (Medford, MA) sulamispistelaitteella, ja ne ovat korjaamattomia. NMR-spektrit saatiin Brucker AM 300-laitteella. Infrapuna (IR)-spektrit ajettiin KBr-pelletteinä tai CHC13-liuoksina P-E FTIR (Fourier Transformation Infrared)-lait-30 teella (Norwalk, CT), malli 1800. MS (massaspektri) ja HRMS (high resolution mass spectrum) saatiin Kratos MS25RFA- ja MS50TC-laitteilla (Manchester, England), vastaavasti . Flash-kromatografia suoritettiin käyttämällä Woelm (Atlanta, GA) silikageeliä (silica 32-63). Ohutlevy-35 kromatografia (TLC) suoritettiin yhtiön Analtec (Newark, DE) GHLF-silikageelilevyillä tai RPS-F-käänteisfaasile- 100718 32 vyillä, molemmat 250 pm. Rutiininomaiseen HPLC:hen (High Pressure Liquid Chromatography) käytettiin P-E-pumppua, sarja 4 LC, HP 1046A-fluoresenssidetektoria ja yhtiön Phe-nomenex (Torrance, CA) IB Sil-5C18-kolonnia (150 x 5 4,6 mm). Liikkuva faasi oli 70:30 metanoli/fosfaattipusku- ri (50 mmol ammoniumfosfaattia, pH 4,4) virtausnopeudella 1,5 ml/min. HPLC-järjestelmä käsitti vapautumisnopeusmit-tauksia varten 2 Waters-pumppua malli 510, automaattisen näytteenottimen malli 712 ja gradienttikontrollerin malli 10 680. Kromatografia suoritettiin Waters C-18-kolonnilla, ja liikkuva faasi oli 68:32-seosta trietyyliammoniumformiaat-tipuskurista (0,05 M, pH 2,8) ja asetonitriilistä, vastaavasti. Eluoidun adriamysiinin fluoresenssi havaittiin käyttämällä ABI-fluoresenssidetektoria malli 980 (virit-15 täminen, 254 nm; emissio, 550 nm), joka saatiin yhtiöstä
Applied Biosystems, Ramsey, NJ. pH-arvoilla 4,5 ja 5,0 käytettiin asetaattipuskuria; pH-arvolla 7,4 käytettiin fosfaatti/suolaliuos-puskuria. Adriamysiini *HC1 saatiin yhtiöstä Sanraku Inc. (Japan). Kaikki muut kemikaalit saa-20 tiin kaupallisista lähteistä. Alkuaineanalyysit suoritet tiin analyyttisellä osastolla yhtiössä Bristol-Myers Squibb Company, Wallingford, CT, ja yhtiössä Oneida Research Services.
Esimerkki 1 ·, 25 Bifunktionaalisen yhdisteen 10 ja ADM:n semikarbat- sonijohdannaisen valmistus
Seuraava esimerkki kuvaa tapaa valmistaa bifunktio-naalinen yhdiste ja ADM:n semikarbatsonijohdannainen, jossa on ADM:n C-13-asemassa semikarbatsonisidos. Tässä esi-30 merkissä valmistetaan N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio)etyyli]- • hydratsiinikarboksamidi, yhdiste 10, kuviossa 1 esitetyllä reaktiojaksolla. Kysteiiniamiinihydrokloridi saatettiin reagoimaan metoksikarbonyylisulfenyylikloridin ja sitten 2-merkaptopyridiinin kanssa, jolloin saatiin 2-(2-pyridi-35 nyyli)ditioetaaniamiinihydrokloridi (yhdiste 9 kuviossa 1). Tämä saatettiin puolestaan reagoimaan fosgeenin ja 100718 33 t-butyylikarbatsaatin ja sitten trifluorietikkahapon (TFA) kanssa, jolloin saatiin haluttu tuote (yhdiste 10).
2- [ (2-pyridinyyli )ditioletaaniamiinihydrokloridin valmistus 5 Metoksikarbonyylisulfenyylikloridin (Zumach et ai.,
Angew. Chem. International Edit. 9 (1970) 54-63, 6,33 g, 50 mmol) liuosta HPLC-laatuisessa metanolissa (100 ml) sekoitettiin N2:n alla ja jäähdytettiin jäässä. Tähän lisättiin tipoittain 2-aminoetaanitiolihydrokloridin (5,7 g, 10 50 mmol) liuosta metanolissa (50 ml). Kun lisäys oli suo ritettu loppuun, liuosta sekoitettiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten liuotin haihdutettiin, ja jäännösöljy kiteytettiin asetonista (100 ml), jolloin saatiin kiinteä aine (6,9 g). Tämä kiinteä aine liuotettiin metanoliin 15 (100 ml). Liuos jäähdytettiin jäässä, sekoitettiin N2:n alla ja käsiteltiin tipoittain 2-merkaptopyridiinin (3,82 g, 34 mmol) liuoksella metanolissa (50 ml). Liuosta sekoitettiin 1 tunti huoneenlämpötilassa, konsentroitiin pieneen tilavuuteen ja laimennettiin hitaasti asetonilla, 20 kunnes tapahtui kiteytymistä. 1 tunnin kuluttua jääkaapis sa kiinteä aine kerättiin suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin yhdiste 2-[(2-pyridinyyli)ditio]etaani-amiinihydrokloridi (yhdiste 9). Tämän yhdisteen ovat kuvanneet: Field et ai., J. Org. Chem. 29 (1964) 1632-1635; .25 ja Connor ja Schroit, Biochem. 27 (1988) 848-851). Yhdiste karakterisoitiin seuraavasti: sp. 123 - 125 eC (5,8 g, 52 %). IR (KBr) 2952, 2913, 1610, 1575, 1559, 1451, 1115, 767 cm"1. NMR (D20) δ 8,46, 7,83, 7,34 (d, m, m 4H, Py), 3,37 (t, 2H, CH2CH2NH2), 3,12 (t, 2H, ££H2CH2). MS(m/e): 30 187 (vastaa [M+H]*:aa), 170, 152, 142, 112, 104, 76.
- Alkuaineanalyysi C7H11CLN2S2 *1/4H20:lie:
Laskettu: C, 37,00; H, 5,06; N, 12,33.
Saatu: C, 36,82; H, 4,99; N, 12,37.
100718 34 N- [2- [ (2-pyridinyyli )ditioletyyli] -2- (tert-butok-sikarbonyyli )hydratsiinikarboksamidin valmistus 2- [ (2-pyridinyyli )ditio]etaaniamiinihydrokloridia (2,22 g, 10 mmol) suspendoitiin kuivaan metyleenikloridiin 5 (100 ml) ja käsiteltiin trietyyliamiinilla (TEA) (5,8 ml).
Tämä liuos lisättiin tipoittain jääkylmään sekoitettuun liuokseen, jossa oli fosgeenia (10 ml 1,93 M tolueeni-liuosta) metyleenikloridissa (200 ml). Reaktiota seurattiin TLC:llä, ja kun lähtöainetta ei enää ollut läsnä, 10 seoksen läpi ajettiin jonkin aikaa N2:ta. Sitten lisättiin t-butyylikarbatsaattia (1,32 g, 10 mmol), ja seosta sekoitettiin yön yli. Liuos pestiin vedellä, ja liuotin haihdutettiin. Jäännös kromatografoitiin silikageelillä käyttämällä metyleenikloridi:metanoli-liuotinjärjestelmää 15 (100:2). Sopivat jakeet yhdistettiin, jolloin saatiin 1,74 g N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]-2-(tert-butok-sikarbonyyli)hydratsiinikarboksamidia (yhdiste 9a) vaahtona, jota karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3281, 2979, 2932, 1723, 1672, 1577, 1560, 1545, 1448, 1419, 20 1253, 1161, 762 cm'1. NMR (CDC13) Ö 8,50, 7,56, 7,51, 7,12 (4H, Py), 3,51 (2H, CH2), 2,89 (2H, £H2S), 6,84, 6,37, 6,17 (3H, NH), 1,44 (9H), (CH3)3C). MS (m/e) 345 (vastaa [M+H]*:aa), 317, 289, 245, 213, 178, 134, 112.
N- [2- [ (2-pyridinyyli )ditio)etyyli]hydratsiinikar-. 25 boksamidin valmistus N- [2- [ (2-pyridinyyli )ditio] etyyli] -2-( tert-butok-sikarbonyyli)hydratsiinikarboksamidia (570 mg, 1,66 mmol) liuotettiin jääkylmään TFA:han (10 ml). Liuosta sekoitettiin jäässä 10 min ajan ja lisäksi 10 min ajan ilman jääh-30 dytystä. Ylimääräistä TFA:ta haihdutettiin alennetussa paineessa mahdollisimman paljon, ja jäännös kromatografoitiin silikageelillä käyttämällä metyleenikloridi:metano-li:konsentroitu ammoniumhydroksidi-liuotinjärjestelmää (100:5:0,5). Sopivat jakeet yhdistettiin TLC:n mukaan, ja 35 liuotin haihdutettiin, jolloin jäljelle jäi kiteinen jään nös (0,42 g, kvantitatiivinen). Valmistettiin analyyttinen 100718 35 näyte kiteyttämällä IPA:sta, sp. 105 - 107 °C. N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]hydratsiinikarboksamidi (yhdiste 10) karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3336, 3220, 3064, 2949, 2934, 1670, 1623, 1575, 1562, 11-33, 1452, 5 1369, 1172, 1046, 770 cm*1. NMR (CD30D) δ 8,41, 7,78, 7,21 (4H, Py), 3,43 (2H, NCH.. 2,91 (2H ££H2). MS (m/e) 245 (vastaa [M+H]":aa), 221, 213, 162, 134, 112.
Alkuaineanalyysi C8H12N4OS2:lie:
Laskettu: C, 39,32; H, 4,95; N, 22,93; S, 26,24.
10 Saatu: C, 39,19; H, 4,86; N, 22,48; S, 25,02.
Adriamysiinihydrokloridin semikarbatsonijohdannaisen ja N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]hydratsii-nikarboksamidin valmistus
Yhdistettä 10 (0,37 g, 1,5 mmol) metanolissa 15 (25 ml) lisättiin sekoitettuun suspensioon, jossa oli ad- riamysiinihydrokloridia (0,66 g, 1,14 mmol) metanolissa (50 ml). Lisättiin TFA:ta (5 tippaa), ja seosta sekoitettiin yön yli. Kirkas liuos konsentroitiin ja kromatogra-foitiin C-18-kolonnilla käyttämällä liuotinjärjestelmänä 20 metanoli:vettä (60:40), joka sisälsi 0,3 % ammonium- asetaattia. Sopivat jakeet yhdistettiin ja mahdollisimman paljon metanolia haihdutettiin. Vesifaasi pakastekuivat-tiin, ja jäännös liuotettiin metanoliin ja lisättiin ase-tonitriiliin. Punainen kiinteä aine (0,65 g, 68 %) kerät-. 25 tiin sentrifugoimalla ja kuivattiin. ADM:n semikarbatsoni- johdannaista karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3399, 2976, 2936, 1671, 1618, 1578, 1538, 1417, 1286, 1210, 1117, 1015, 989, 764 cm"1. NMR (CD30D) 5 8,25, 7,76, 7,62, 7,48, 7,07 (py, ph, H), 4,95 (anomeerinen H), 4,63 (CH20H), 30 4,24 (CH3CH), 3,97 (0CH3), 3,5 - 2,9 (SSCH2:n, -CH2-:n, CH2- • NH:n ryhmäabsorptio), 1,29 (HC-CH3). MS (m/e) 770 (vastaa [M+H] + :aa), 641, 437, 346. HRMS: laskettu C35H40N5OnS2:lie: 770,2166; Saatu: 770,2157.
36 100718
Esimerkki 2
Bifunktionaalisen yhdisteen 11a ja ADM:n karbatso-nijohdannaisen valmistus
Seuraava esimerkki kuvaa tapaa valmistaa bifunktio-5 naalinen karbatsidiyhdiste ja ADM:n karbatsonijohdannai nen, jossa on ADM:n C-13-asemassa karbatsonisidos. Tässä esimerkissä kuviossa 2 esitetty ja esimerkissä 1 kuvattu reaktio2-[(2-(pyridinyyli)ditio]etaaniamiinihydrokloridin ja t-butyylikarbatsaatin välillä aloitettiin kuviossa 3 10 esitetyllä tavalla t-butyylikarbatsaatilla ja trifosgee- nilla, jolloin saatiin bifunktionaalinen yhdiste, (yhdiste 11a), karbatsidi. Tässä tapauksessa t-butyylikarbatsaat-tiylimäärä saatettiin reagoimaan fosgeenin kanssa, jolloin saatiin karbonidihydratsidi.
15 2-[[[2-[( 2-pyridinyyli )ditio] etyyli] amino] karbonyy- li] -2,2' -bis( tert-butoksikarbonyyli )karbonidihyd-ratsidin valmistus t-butyylikarbatsaattia (0,396 g, 3 mmol) liuotettiin kuivaan kloroformiin (10 ml). Liuosta sekoitettiin 20 huoneenlämpötilassa N2:n alla, ja lisättiin TEA:ta (0,6 g, 6 mmol). Tämän jälkeen lisättiin yhdessä erässä trifosgee-nia (0,296 g, 1 mmol). Seurasi kiivas reaktio, ja kun tämä tyyntyi, lisättiin 2-(2-pyridinyyliditio)etaaniamiinihyd-rokloridia (0,667 g, 3 mmol) kloroformissa, joka sisälsi 25 TEAtta (0,3 g, 3 mmol). Seosta sekoitettiin 1 1/2 tuntia huoneenlämpötilassa, ja pestiin sitten vedellä (3 x 20 ml), kuivattiin ja liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin jäljelle jäi vaahtoa (0,91 g). Tämä materiaali kromatografoitiin silikageelillä käyttämällä mety-30 leenikloridi:metanoli-liuotinjärjestelmää (100:2). Jakelta ' seurattiin TLC:llä ja yhdistettiin sen mukaisesti, jolloin saatiin yhdiste 2-[[[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli] amino] karbonyyli]-2,2'-bis(tert-butoksikarbonyyli)kar-bonidihydratsidi (yhdiste 11) vaahtona (0,54 g, 52 %).
35 Yhdiste 11 karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3302, 2980, 2933, 1726, 1683, 1498, 1252, 1160, 1047, 1018, 100718 37 763cm'1. NMR (CDC13) ft 8,50, 7,57, 7,49, 7,10, (d,q,d,t, 4H,
Py), 3,52 (t, 2H, SSCH2), 2,90 (t, 2H CONCH2), 1,46 [C(CH3)3], 8,30, 6,50, 6,29 (b,s,s, NH). MS (m/e) 503 (vastaa [M+H] + :aa), 447, 431, 419, 403, 347, 303, 213, 179, 5 112.
2- [ [ [2- [ (2-pyridinyyli)ditlo]etyyli]amino]karbonyy-li]karbonidihydratsidin valmistus
Yhdistettä 11 (0,34 g, 0,68 mmol) sekoitettiin 10 min ajan jääkylmän TFA:n (5 ml) kanssa ja lisäksi 10 10 min ajan ilman jäähdytystä. TFA:ta haihdutettiin mah dollisimman paljon, ja jäännös kromatografoitiin silika-geelillä käyttämällä metyleenikloridi:metanoli:konsentroitu NH4OH-liuotinjärjestelmää (100:5:0,5). Sopivat jakeet yhdistettiin, ja yhdiste 11a saatiin haihdutuksen jälkeen 15 hygroskooppisena vaahtona (0,2 g, kvantitatiivinen saanto). Yhdiste 11a karakterisoitiin seuraavasti: IR (kalvo) 3330, 2964, 2929, 1698, 1660, 1576, 1486, 1231, 1045, 759 cm'1. NMR (CDC13) ft 8,50, 7,56, 7,10 (d,m,m,4H, Py), 3,52 (q, 2H, CH2N), 2,91 (t, 2H, £H2SS), 8,87, 8,85, 4,19, 3,78 20 (D20:lla vaihtuvia protoneja, NH). MS (m/e) 303 (vastaa [M+H]*:aa), 213, 112.
Adriamysiinihydrokloridin karbatsonijohdannaisen ja 2-[[[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]amino]karbo-nyyli]karbonidihydratsidin valmistus 25 Adriamysiinihydrokloridia (356 mg, 0,6 mmol) ja yhdistettä 11a (0,2 g, 0,68 mmol) sekoitettiin yön yli metanolissa (50 ml), joka sisälsi 2-3 tippaa TFA:ta.
Saatiin kirkas liuos, ja HPLC (metanoli:0,01 M ammonium-fosfaattiliuos-liuotinjärjestelmä, 70:30, pH 4,5) ilmaisi, 30 että yli 90 % adriamysiinistä oli muuttunut semikarbatso- niksi. Siksi liuotin haihdutettiin, ja jäännös kromatogra foitiin C-18-kolonnilla käyttämällä metanoli: vesi-liuotin-järjestelmää (60:40), joka sisälsi 0,3 % ammoniumasetaat-tia. jakeita tarkkailtiin käänteisfaasi-TLC:llä (sama 35 liuotinjärjestelmä, mutta 3 % ammoniumasetaattia) ja/tai HPLC:llä ja yhdistettiin jakeet, joissa ei ollut adriamy- 38 100718 siiniä. Suurin osa metanolista haihdutettiin alennetussa paineessa. Vesiliuos pakastekuivattiin, ja punainen jäännös liuotettiin pieneen metanolitilavuuteen. Liuos suodatettiin ja lisättiin sekoitettuun asetonitriiliin (1 1).
5 Kirkas liuos konsentroitiin noin kolmasosaan tilavuudes taan, ja saatu kiinteä aine kerättiin sentrifugoimalla ja kuivattiin, jolloin saatiin ADM:n karbatsoni (yhdiste 4) (160 mg). Toinen sato (85 mg) saatiin konsentroimalla liuos 100 ml:ksi, laimentamalla eetterillä ja keräämällä 10 kiinteä aine sentrifugoimalla (kokonaissaanto 49 %). Tämä karbatsonijohdannainen karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr): 3346, 2975, 2936, 1711, 1668, 1618, 1578, 1286, 1210, 1083, 1015, 765 cm-1. NMR (CD30D) 6 8,43, 7,89, 7,77, 7,52, 7,21, (py, fenyyli-H), 5,15 (anomeerinen H), 4,57 15 (CH20H), 4,25 (CH3CIi), 3,99 (0CH3), 3,53 (SSCH2), 3,17 (- CH2-, rengas), 3,05 (CH2NN=), 2,38 (-CH2-, rengas), 1,29 (0¾¾). MS (m/e) 828 (vastaa [M+H]*:aa), 699, 572, 537, 377, 346, 289, 213.
Esimerkki 3 20 Bifunktionaalisen yhdisteen 12 ja ADM:n tiosemikar- batsonijohdannaisen valmistus Tämä esimerkki kuvaa bifunktionaalisen yhdisteen 12, ja ADM:n tiosemikarbatsonijohdannaisen valmistusta, jossa johdannaisessa on ADM:n C-13-asemassa tiosemikarbat-25 sonisidos. Tässä esimerkissä valmistettiin edellä esimer kissä 1 kuvatun semikarbatsidin (yhdiste 10) tioanalogi tavalla, joka esitetään kaavamaisesti kuviossa 4. 2-[(2-pyridinyyli)ditio]etaaniamiinia käytettäessä voitiin havaita 2-merkaptopyridiinin eliminoitumista, joka voitiin 30 katsoa seuraavan tiosemikarbatsidiryhmän lisääntyneestä nukleofiilisyydestä viimeistä edellisessä tuotevaiheessa.
Tämä ongelma voitiin välttää käyttämällä trans-2-buteeni-ryhmää kuviossa 4 esitetyllä tavalla.
l-bromi-4-(N-ftalimido)-2-buteenin valmistus 35 Liuokseen, jossa oli 1,4-dibromi-2-buteenia (8,4 g, 40 mmol) DMF:ssä (200 ml), lisättiin kaliumftalimidiä 100718 39 (4,62 g, 24 mmol) erissä 1 tunnin aikana. Yön yli sekoittamisen jälkeen liuotin haihdutettiin, ja jäännös jaettiin veden ja metyleenikloridin välillä. Orgaaninen kerros pestiin vedellä useita kertoja, kuivattiin ja liuotin haih-5 dutettiin. Jäännös kiteytettiin 2-propanolista, jolloin
saatiin haluttu tuote, l-bromi-4-(N-ftalimido-2-buteeni) (3,95 g, 59 %), jota karakterisoitiin seuraavasti: sp. 101-102 eC. IR (KBr) 1775, 1711, 1466, 1436, 1393, 723 cm'1. NMR (CDClj) δ 7,81, 7,73 (m,m 4H, fenyyli), 5,88, 5,81 10 (m,m 2H, 2 =CH-), 4,30 (d,2H CH2-N), 3,90 (d, 2H CH2Br). MS
(m/e) 280 (vastaa [M+H]*:aa), 200.
Alkuaineanalyysi Cl2H10BrNO2: lie:
Laskettu: C, 51,45? H, 3,60; N, 5,00.
Saatu: C, 52,35; H, 3,47; N, 4,80.
15 l-(asetyylitio)-4-(N-ftalimido)-2-buteenin valmis tus
Seosta, jossa oli l-bromi-4-(N-ftalimido)-2-butee-nia (3,95 g; 14 mmol) ja kaliumtioasetaattia (1,77 g, 15,5 mmol) absoluuttisessa etanolissa (50 ml), kuumennet-20 tiin refluksoiden 1/2 tunnin ajan. Liuotin haihdutettiin ja jäännös uutettiin metyleenikloridilla. Liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin kiteinen jäännös (3,85 g, 99 %), jota käytettiin sellaisenaan seuraavassa vaiheessa. Analyyttinen näyte valmistettiin kiteyttämällä 2-propano-25 lista, sp. 69 - 71 °C. Tämä yhdiste karakterisoitiin seu raavasti: IR (KBr) 1769, 1713, 1688, 1427, 1391, 1114, 958 cm'1. NMR (CDC13) fi 7,80, 7,73 (m,m 4H Ph), 5,70 (m, 2H, 2 =CH-), 4,24 (d, 2H, £H2-N), 3,48 (t, 2H CH2S), 2,29 (s, 3H, C-CH3). MS (m/e) 276 (vastaa [M+H]*:aa), 234, 200.
30 Alkuaineanalyysi C14H13N03S: lie: ·. Laskettu: C, 61,07; H, 4,76; N, 5,09.
Saatu: C, 61,29; H, 4,82; N, 5,21.
l-amino-4-[(2-pyridinyyli)ditio]-2-buteenihydro-kloridin valmistus 35 Liuos, jossa oli l-asetyylitio-4-(N-ftalimido)-2- buteenia (6,5 g, 23,6 mmol) absoluuttisessa etanolissa 40 100718 (150 ml) ja hydratsiinia (1,74 g, 54 mmol) kuumennettiin refluksoitumaan. Reaktiota seurattiin TLC:llä, ja kun lähtöainetta ei ollut läsnä, liuos jäähdytettiin jäässä ja käsiteltiin 6N HCltllä (10 ml). Muodostui runsaasti sak-5 kaa, ja se tunnistettiin ftalhydratsidiksi (NMR, MS) ja suodatettiin pois. Suodos konsentroitiin 10 ml:ksi ja laimennettiin vedellä. Kiinteä aine suodatettiin pois, ja suodos pestiin eetterillä (2X) ja metyleenikloridilla (IX), suodatettiin seliitin läpi ja pakastekuivattiin.
10 Kiinteä aine liuotettiin pieneen metanolimäärään, ja liuos suodatettiin seliitin läpi, liuotin haihdutettiin ja jäännöstä pidettiin tyhjössä yön yli. Saatiin vahamainen, hygroskooppinen materiaali, joka karakterisoitiin seuraavasti: NMR (DMS0/D20) 6 5,83, 5,60 (m,m 2H, 2 =CH-), 3,40 15 (d, 2H CH2NH2), 3,16 (d 2H, CH2SH) MS (m/e) 104 (vastaa [M+H]*:aa), 87, 70. Tämä vahamainen materiaali liuotettiin HPLC-laatuiseen metanoli (75 ml). Liuosta sekoitettiin ja käsiteltiin metoksikarbonyylisulfenyylikloridilla (3 g, 23,7 mmol). 1/2 tunnin kuluttua TLCillä ei havaittu lähtö-20 ainetta. Liuotin haihdutettiin ja jäännös liuotettiin uudelleen metanoliin (75 ml). Liuosta sekoitettiin ja käsiteltiin 2-merkaptopyridiinillä (2,7 g, 24 mmol). 2 tunnin kuluttua liuotin haihdutettiin, ja jäännös haihdutettiin suurtyhjössä. Sitten jäännös liuotettiin seokseen, 25 jossa oli 0,01 N HCl:ää ja metanolia (90:10, 130 ml). Sa mea liuos pestiin metyleenikloridilla, suodatettiin seliitin läpi ja pakastekuivattiin, jolloin saatiin l-amino-4-[ (2-pyridinyyli )ditio] -2-buteenihydrokloridi erittäin hygroskooppisena höytymäisenä materiaalina (4 g, 68 %), joka 30 karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3433, 2959, 2884, .: 1607, 1576, 1447, 1418, 1118, 767 cm"1. NMR (D20) 5 8,51, 8,13, 8,02, 7,54 (m 4H, Py) 5,87, 5,72 (m,m 2H, 2 =CH-), 3,54 (d 2H, CH2-NH2), 3,43 (d 2H, CH2-S). MS (m/e) 213 (vastaa [M+H]*:aa), 196, 112.
35 100718 41 N-[4-[(2-pyridinyyli)ditio]-2-butenyyli]hydratsii- nikarbotioamidin valmistus l-amino-4- [ (2-pyridinyyli )ditio] -2-buteenihydrok-loridi (1,5 g, 6 mmol) suspendoitiin sekoitettuun metylee-5 nikloridiin (30 ml). Lisättiin TEA:ta (1,46 g, 14,6 mmol) ja sitten di-2-pyridyylitionokarbonaattia (Kim ja Yi, Tetrahedron Lett. 26 (1985) 1661-1664), (1,4 g, 6 mmol). Saatiin kirkas liuos ja TLC osoitti, ettei lähtöainetta ollut läsnä. Lisättiin t-butyylikarbatsaattia (0,8 g, 6 mmol), 10 ja liuosta sekoitettiin 1 tunnin ajan. Liuos pestiin ve dellä, ja liuotin haihdutettiin. Jäännös kromatografoitiin silikageelillä käyttämällä metyleenikloridi:metanoli-liuo-tinjärjestelmää (100:2), ja kromatografoitiin uudelleen käyttämällä heksaani:etyyliasetaatti-liuotinjärjestelmää 15 (75:25), jolloin saatiin vaahtoa, joka oli N-[4-[(2-pyri- dinyyli)ditio]-2-butenyyli]hydratsiinikarbotioamidin t-boc-johdannaista (1,4 g, 58 %), joka karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3238, 2971, 2930, 1718, 1544, 1418,
1156, 762 cm'1. NMR (CDC13/D20) 8 8,43, 7,65, 7,08 (m, m, m 20 4H, py) 5,57 (m 2H, 2=CH), 4,12 (d 2H, £H2-N), 3,45 (d 2H
CH2S), 1,46 (s 9H, 3 CHj). MS (m/e) 387 (vastaa [M+H]*:aa) 355, 287, 276, 112.
Suojattua karbotioamidia (0,86 g, 2,2 mmol) liuotettiin jääkylmään TFA:han. Liuosta pidettiin jäässä -.25 10 min ajan (typen alla) ja lisäksi 10 min ilman jäähdy tystä. Ylimääräistä happoa haihdutettiin mahdollisimman paljon suurtyhjössä, ja jäännös kromatografoitiin silikageelillä käyttämällä metyleenikloridi:metanolikonsentroitu NH4OH-liuotinjärjestelmää (100:5:0,5). Sopivat jakeet 30 yhdistettiin, jolloin saatiin yhdiste 12 kumimaisena (0,39 g, 63 %), ja joka karakterisoitiin seuraavasti: IR (kalvo) 3322, 3198, 2974, 1626, 1574, 1560, 1538, 1448, 1418, 1224, 760 cm"1. NMR (CDC13/D20) 8 8,41, 7,63, 7,11 (mmm 4H, Py) 5,64 (m 2H, 2=CH), 4,20 (d 2H, CH2N), 3,41 35 (d 2H, CH2S). MS (m/e) 287 (vastaa [M+H]":aa), 225, 221, 144, 112.
42 100718
Adriamysiinihydrokloridin tiosemikarbatsonijohdannaisen ja N-[4-[(2-pyridinyyli)ditio]-2-butenyyli]-hydratsiinikarbotioamidin valmistus Sekoitettuun suspensioon, jossa oli adriamysiini-5 hydrokloridia (350 mg, 0,6 mmol) HPLC-laatuisessa metano- lissa (50 ml), lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä 12 (350 mg, 1,2 mmol) HPLC-laatuisessa metanolissa (25 ml). Lisättiin TFA:ta (3-4 tippaa), ja seosta sekoitettiin yön yli. Saatiin kirkas liuos, eikä HPLC:llä tai TLC:llä 10 havaittu vapaata adriamysiiniä. Liuos konsentroitiin pie neen tilavuuteen (5 ml), joka lisättiin asetonitriiliin (600 ml). Muodostui sakka, joka kerättiin jääkaapissa jäähdyttämisen jälkeen sentrifugoimalla ja kuivattiin suurtyhjössä (275 mg, 54 %). Tiosemikarbatsonijohdannainen 15 karakterisoitiin seuraavasti: IR (KBr) 3418, 2934, 1616, 1578, 1534, 1414, 1284, 1208, 1012, 986 cm'1. NMR (CD30D) Ö 8,30, 7,80, 7,74, 7,52, (Py, fenyyli 7H), 5,60 (2=CH), 5,40 (anomeerinen H) 4,67 (£H20H), 4,22 (CH3CH), 4,09 (CH2N), 4,02 (0£H3), 3,5-1,88 (ryhmäabsorptio, johon kuu-20 luvat CH2-SS, -CH2-CH), 1,30 (£H3-£H). MS (m/e) 812 (vastaa [M+H]*:aa), 701, 683, 669, 572, 554, 540, 536, 522, 504. HRMS laskettu C37H42N5O10S3: lie: 812,2094; Saatu 812,2087.
Esimerkki 4 ·. 25 Bifunktionaalisen yhdisteen 13 ja ADM:n karboksy- laattihydratsonijohdannaisen valmistus Tässä esimerkissä kuvataan uuden bifunktionaalisen yhdiste 13:ta ja ADM:n karboksylaattihydratsonijohdannaisen valmistus. Bifunktionaalinen karboksylaattihydratsii-30 niyhdiste valmistetaan lähtien merkaptoetanolista, joka • derivatisoitiin kuviossa 5 esitetyllä tavalla pyridinyyli- ditioetanoliksi. Tämä yhdiste muutettiin sitten aktivoiduksi karbonyylijohdannaiseksi, joka kondensoitiin hydrat-siinin kanssa.
35 100718 43 2 [ (2-pyridinyyli )ditioetyylihydratsiinikarboksylaa-tin valmistus Jäähdytettyyn (O °C) liuokseen, jossa oli kloori-karbonyylisulfenyylikloridia (1,24 g, 9,45 mmol) CH2Cl2:ssa 5 (10 ml), lisättiin tipoittain 2-merkaptoetanolia, (737 mg, 9,45 mmol). Seosta sekoitettiin 30 min ajan 0-15 °C:ssa, jäähdytettiin 0 °C:een ja käsiteltiin liuoksella, jossa oli 2-merkaptopyridiiniä (1,05 g, 9,45 mmol) CH2Cl2:ssa (15 ml). Seosta sekoitettiin 1 tunti 0 °C:ssa, ja sitten 16 10 tuntia huoneenlämpötilassa. Kun oli lisätty ammoniumkar- bonaattiliuosta (1,0 g 20 ml:ssa H20:ta), kerrokset erotettiin ja orgaaninen kerros pestiin vedellä, kuivattiin ja konsentratoitiin tyhjössä, jolloin saatiin raakatuote 2-(2-pyridinyyliditio)etanoli (1,75 g) värittömänä öljynä.
15 Lisättiin karbonyylidi-imidatsolia (648 mg, 4 mmol) liuok seen, jossa oli 2-(2-pyridinyyliditio)etanolia (714 mg, 3,8 mmol) CH2C12: ssa (10 ml). Seosta sekoitettiin 20 tuntia ja jäähdytettiin sitten -20 eC:een ja käsiteltiin hydrat-siinilla (122 mg, 3,8 mmol). Seos sai eistä 16 tuntia 20 -5 °C:ssa, ja konsentroitiin sitten tyhjössä. Jäännös kro- matografoitiin silikageelillä käyttämällä metyleeniklori-di:metanoli-liuotinjärjestelmää (100:1-3), jolloin saatiin yhdiste 13, 2-[(2-pyridinyyliditio)etyylihydratsiinikar-boksylaatti (340 mg, 37 %), värittömänä öljynä, joka ka-·. 25 rakterisoitiin seuraavasti: NMR (CDC13) 8 8,46 (1H), 7,62 (2H), 7,08 (1H), 5,92 (1H), 4,35 (t, 2H), 3,70 (s, 2H), 3,01 (t, 2H), 1,56 (s, 2H). MS (m/e) 246 (vastaa [M+H]*:aa), 142, 103.
Adriamysiinihydrokloridin hydratsonijohdannaisen ja 30 2 [ (2-pyridinyyli )ditio] etyylihydratsiinikarboksy- laatin valmistus
Suspensioon, jossa oli adriamysiinihydrokloridia (290 mg, 0,5 mmol) vedettömässä metanolissa (4 ml), lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä 13 (170 mg, 6,9 mmol) 35 metanolissa (4 ml) ja CF3C02H:ta (6 mg) metanolissa (1 ml).
Kun oli sekoitettu 24 tuntia, seos konsentroitiin noin 100718 44 4 ml:ksi, ja tähän liuokseen lisättiin asetonitriiliä (50 ml). Tuote eristettiin sentrifugoimalla. Kiinteä aine liuos tettiin vesi/metanoliin ja lyofilisoitiin sitten, jolloin saatiin adriamysiinin hydratsonijohdannainen 5 (354 mg, 88 %) tummanpunaisena kiinteänä aineena, joka karakterisoitiin seuraavasti: NMR (CD30D) Ö 8,34 (1H), 7,93 (d, 1H), 7,81 (m, 3H), 7,54 (d, 1H), 7,17 (m, 1H), 5,49 (m, 1H), 5,19 (s, 1H), 4,59 (m, 2H), 4,37 (m, 2H), 4,25 (m, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,63 (m, 1H), 3,54 (m, 1H), 3,10 10 (t, 3H), 2,37 (m, 2H), 2,03 (m, 1H), 1,89 (m, 1H), 1,29 (d, 3H). MS (m/e): 771 (vastaa [M+H]*:aa), 642.
Esimerkki 5
Bifunktionaalisen yhdisteen 15 ja ADM:n aryylihyd- ratsonijohdannaisen valmistus 15 Tässä esimerkissä kuvataan tapaa valmistaa uusi bifunktionaalinen yhdiste, yhdiste 15, ja ADM:n aryylihyd-ratsonijohdannainen, jossa on ADM:n C-13-asemassa aryyli-hydratsonisidos. Yhdiste 15 valmistetaan käyttämällä 4-N-Boc-hydratsinobentsoehappoa, ja liittämällä 2-(2-pyridi-20 nyyliditio)etaaniamiiniryhmän kuviossa 6 esitetyllä taval la.
4-(N-boc-hydratsino)bentsoehappo p-hydratsinobentsoehappoa (760 mg, 5 mmol) liuotettiin dioksaaniin (10 ml), veteen (5 ml), ja 1 N NaOH-25 liuokseen (5 ml). Lisättiin di-t-butyylipyrokarbonaattia (1,31 g, 6 mmol) 0 °C:ssa, ja reaktioseosta sekoitettiin 1 tunti 0 °C:ssa ja 30 min huoneenlämpötilassa. Tämän ajanjakson kuluttua liuoksen tilavuus bvähennettiin puoleen, ja liuos säädettiin 0,5-% HCl-liuoksella happamaan 30 pH-arvoon ja uutettiin EtOAc:lla. Yhdistetty EtOAc-liuos pestiin suolavedellä ja kuivattiin Na2S04:llä. Liuotin poistettiin, jolloin saatiin hieman ruskea kiinteä aine, joka uudelleenkiteytettiin EtOAc:sta ja heksaanista (950 mg, 75 %), ja karakterisoitiin seuraavasti: 35 NMR (CD30D) δ 7,84 (d, 2H, J=8,5 Hz), 6,75 (d, 2H, J=8,5
Hz), 1,48 (s, 9H); IR (KBr) 3316, 1688, 1607, 1298 cm'1.
100718 45 N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli-4-(N-boc-hydrat-sinoJbentsamidihapon valmistus 4-(N-boc-hydratsino)bentsoehappoa (252 mg, 1 mmol), N-hydroksisukkinimidiä (115 mg, 1 mmol) ja disykloheksyy-5 li-karbodi-imidiä (DCC) (247 mg, 1,2 mmol) N,N-dimetyyli- formamidissa (DMF) (5 ml) sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa. Disykloheksyyliurea (DCU) suodaterttiin pois ja suodos haihdutettiin. Jäännös kiteytettiin lisäämällä Et20:ta, jolloin saatiin 4-(N-boc-hydratsinoJbentsoehapon 10 N-hydroksisukkinimidiesteri (300 mg). Tätä materiaalia (250 mg, 0,72 mmol) ja 2-(2-pyridinyyli)ditioJetyyliamii-nihydrokloridia (167 mg, 0,75 mmol) liuotettiin DMF:ään (4 ml). Kun oli lisätty TEA:ta (0,125 ml, 0,9 mmol), seosta sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa. DMF poistet-15 tiin ja jäännös kromatografoitiin Si02:lla (2 %
MeOH/CH2Cl2), jolloin saatiin vaahtoa (217 mg, 52 %), joka karakterisoitiin seuraavasti: NMR (CDC13) ft 8,37 (d, 1H, J-5,lHz), 8,01 (bt, 1H), 7,78 (d, 2H, J=8,7Hz), 7,57 (m, 1H), 7,46 (d, 1H, J=8,1Hz), 7,09 (m, 1H), 6,84 (d, 2H, 20 J=8,7Hz), 7,40 (bs, 1H), 5,92 (bs, 1H), 3,70 (m, 2H), 2,98 (t, 2H, J=5,8 Hz), 1,45 (s, 9H); IR (KBr) 3303, 1714, 1610, 1505 cm"1; ms m/e (M+H), 365, 321, 421 112, HRMS laskettu C19H25N403S2: lie 421,1368, saatu 421,1358.
N-[2-[(2-pyridinyyli)ditio]etyyli]-4-hydratsino-25 bentsamidin valmistus
Edellä valmistettua yhdistettä (200 mg, 0,48 mmol) käsiteltiin 1 tunnin ajan TFA:lla (1,5 ml) 0 eC:ssa. Tämän ajanjakson jälkeen TFA haihdutettiin ja jäännös trituroi-tiin Et20:lla, jolloin saatiin noin 200 mg N-[2-[(2-pyri-30 dinyyli)ditio]-etyyli]-4-hydratsinobentsamidia (yhdiste 15) öljymäisenä, ja joka karakterisoitiin seuraavasti: NMR (CD30D) ft 8,38 (d, 1H, J=4,5Hz), 7,81 (m, 4H), 7,22 (t, 1H, J=5,8Hz), 6,97 (d, 2H, J=8,8Hz), 3,67 (t, 2H, J=6,6Hz), 3,06 (t, 2H, J=6,6Hz); IR (kalvo) 3278, 1674, 35 1613 cm"1; MS m/e 321 (M+H).
100718 46
Adriamysiinin aryylihydratsonijohdannaisen ja N-(2-[(2-pyridinyyliditio)etyyli]-4-hydratsinobentsami-din valmistus
Yhdiste 15 ja adriamysiinihydrokloridia (250 mg, 5 0,43 mmol) liuotettiin MeOH:hon (15 ml) ja sekoitettiin 2 päivää pimeässä. Liuotin poistettiin ja jäännös kromato-grafoitiin C-18-käänteisfaasi-Si02:11a. Eluoitiin MeOH:-H20:lla (2:1), joka sisälsi 0,3 % NH4OAc:tä, jolloin saatiin hydratsoniyhdiste 7 oranssinvärisenä jauheena (30 mg, 10 8 %), joka karakterisoitiin seuraavasti: NMR (CD30D) 6 8,33 (d, 1H, J= 4,8 Hz), 7,85 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 7,74 (t, 1H, J= 8,0 Hz), 7,66 (m, 4H), 7,41 (d, 1H, J= 8,5 Hz), 7,14 (m, 1H), 7,02 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 5,46 (bs, 1H), 5,16 (m, 1H), 4,60 (s, 2H), 4,23 (m, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,62 (m, 15 4H), 3,02 (m, 4H), 2,61 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 1,97 (m, 2H), 1,32 (d, 3H, J= 6,5 Hz); IR (KBr) 3206, 1708, 1607, 1578 cm-1; MS m/e 846 (M+H), 737, 717, HRMS laskettu C4iH44N5°iiS2:lle 846,2479, saatu 846,2380.
Eluoitiin Me0H:H20:lla (3:1), joka sisälsi 0,3 % 20 NH40Ac:tä, jolloin saatiin anhydrojohdannainen sinisenä kiinteänä aineena (120 mg, 34 %). NMR (CD30D) fi 8,40 (d, 1H, J= 4,1 Hz), 7,77 (m, 5H), 7,42 (m, 1H), 7,22 (m, 1H), 7,16 (m, 2H), 5,35 (bs, 1H), 5,26 (m, 1H), 4,65 (s, 2H), 4,00 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,67 (t, 2H, J= 6,5 Hz), 3,44 25 (m, 1H), 3,08 (t, 2H, J= 6,5 Hz), 2,49 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,63 (m, 1H), 1,19 (d, 3H, J= 6,5 Hz); MS m/e 828 (M+H) 699, 681, 495; HRMS laskettu C41H41N5010S2: lie 828,2372, saatu 828,2300.
Esimerkki 6 30 ADM-johdannaisten karakterisointi ADM:n vapautuminen eri pH-arvoissa alueella 4,5 - 7,4 keksinnön mukaisista ADM-johdannaisista, jotka valmistettiin edellä esimerkeissä 1-5 kuvatulla tavalla, tutkittiin HPLC-analyysiä käyttämällä. ADM-johdannaisista 35 valmistettiin kantaliuokset (1 mg/ml) metanoliin, ja eriä laimennettiin vesipuskuriliuokseen pH-arvoihin 4,5, 5,0 ja 100718 47 7,4 jotta saavutettaisiin lopulliset konsentraatiot noin 1,6 nmol/ml. Inkubointeja kussakin puskurissa suoritettiin 37 °C:ssa joka 24 tunnin ajan, ja erät analysoitiin lisäämällä HPLC-kolonniin konjugoitumattoman ADM:n määrän mää-5 rittämiseksi. Vapautunut materiaali tunnistettiin reten- tioajan perusteella kolonnissa ja eluoidun materiaalin UV-profiilin perusteella koskemattomaksi ADM:ksi. Vapau-tumisnopeudet ilmaistaan %-osuutena ADM:n maksimimäärästä, ja ne esitetään kuvioissa 10 - 12.
10 Kuten kuvissa kuvataan, keksinnön mukaisilla ADM- johdannaisilla oli laajat vapautumisnopeuksien alueet. ADM-johdannaisista vapautuneen materiaalin määrä kasvoi pH-arvon laskiessa arvosta 7 arvoon 4. ADM-johdannaisissa on happoherkkä sidosryhmä, josta seuraa ADM:n vapautuminen 15 vasta-aineproteiinista. Nämä tulokset ovat johdonmukaisia semikarbatsoni-, karbatsoni-, tiosemikarbatsoni-, karbok-sylaattihydratsoni- tai aryylihydratsonisidoksen olemassaolon kanssa, joka yhdistää ADM:n bifunktionaaliseen yhdisteeseen.
20 Esimerkki 7
Antrasykliini-immunokonj ugaattien valmistus Tässä esimerkissä kuvataan keksinnön mukaisten ant-rasykliini-immunokonjugaattien valmistus, jolloin edellä kuvatut ADM-johdannaiset (esimerkit 1 - 5) konjugoidaan • 25 monoklonaaliseen vasta-aineeseen.
Immunokonjugaattien valmistus, jotka sisältävät bifunktionaalisen yhdisteen sisällä disulfidisidok-sen Käytetty monoklonaalinen vasta-aine oli 5E9, joka 30 on valmistettu hybridoomasta ATCC No. HB21, joka on saata vissa laitoksesta American Type Culture Collection "ATCC", Rockville, MD. Monoklonaalinen vasta-aine 5E9 on IgGl-vasta-aine, joka on reaktiivinen transferriinireseptorin kanssa kaikissa jakautuvissa ihmissoluissa ja ristireak-35 tiivinen syöpäsolujen erilaisten histologisten tyyppien kanssa. 5E9 puhdistettiin BALB/c-hiirissä tuotetusta vat- 100718 48 saontelonesteestä menetelmällä, jonka on kuvannut: Bruck et ai.; "One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic Fluid by DEAE-Affigel Blue Chromatography", J. Immunol. Methods 5b (1982) 313-319).
5 Ennen ADM-johdannaisen saattamista reagoimaan vali tun monoklonaalisen vasta-aineen kanssa vasta-aine tioloi-tiin, ts. reaktiivisten sulfhydryyliryhmien lisäämiseksi vasta-ainemolekyyliin. 5E9-monoklonaalisen vasta-aineen (MAb) tiolointi suoritettiin käyttämällä SPDP:tä olennai-10 sesti tavalla, jonka on kubvannut: Greenfield et ai.; yl lä. Lyhyesti, SPDP:tä (Pierce Chemical Co., IL) (50 mM) lisättiin etanoliin liuotettuna 5E9-MAb:hen (5-10 mg/ml) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,2, jolloin saatiin lopullinen konsentraatio välillä 5-10 mM.
15 TReaktioseosta inkuboitiin 30 min 30 °C:ssa. Reagoimaton SPDP erotettiin SPDP-derivatisoidusta vasta-aineesta gee-lisuodatuskromatografiällä PD-10-kolonnia (Pharmacia) käyttämällä. Reaktiiviset pyridinyyliditioryhmät poistettiin peslkistämällä DTT- ylimäärällä. Pelkistetyt vasta-20 aineet ajettiin PD-10-kolonnin läpi, ja vapaita tioleja sisältäviä vasta-aineita käytettiin kondensointiin ADM-johdannaisten kanssa.
Myös vasta-aineproteiiniin lisättiin reaktiivisia tioliryhmiä 2-IT:tä käyttämällä. Vasta-aine (5-10 mg/ml .25 50 mM TEA:ssa, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) sekoitettiin 2-IT:n kanssa (Pierce Chemical Co., IL) lopulliseen kon-sentraatioon 5 - 10 mM. Reaktio sai edetä 90 min ajan 4 °C:ssa, ja tioloidut vasta-aineet erotettiin PD-10-ko-lonnilla, joka oli tasapainotettu 2 M NaCl/PBS:llä.
30 Vasta-aineeseen lisättyjen reaktiivisten tioliryh- ‘ mien lukumäärä määritettiin käyttämällä DTNBrtä (5,5'-di- tiobis-( 2-nitrobentsoehappo) (E412= 14150) menetelmällä, jonka on kuvannut: Ellman; Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959) 70-77).
35 Kukin ADM-johdannainen liuotettiin DMF:ään ja li sättiin pelkistettyyn SPDP-tioloituun MAb-5E9:ään PBS:ssä.
100718 49 ADM-johdannaisen määrä oli yhtäsuuri, kuin vasta-aineen tioliryhmien lukumäärä. Konjugointireaktiota inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa. Tämän ajanjakson jälkeen vasta-aineliuos dialysoitiin PBS:ää vastaan konjugoimattoman adriamysiini-5 johdannaisen poistamiseksi. Sitten vasta-aineliuosta käsi teltiin yön yli SM-2-BioBeads-helmillä (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Mabrhen sitoutuneen konjugoituneen antrasykliinin määrä määritettiin absorbanssilla aallonpituudella 495 nm (E495 = 8030). Vasta-aineproteiinin määrä 10 määritettiin absorbanssilla aallonpituudella 280 nm (1 mg/ml = 1,4 optisen tiheyden (O.D.) yksikköä). ADM-ab-sorbanssin päällekkäisyyden 280 nm:11a korjaamiseksi käytettiin seuraavaa yhtälöä: 15 A280 - (0,72 x A495 )
Vasta-aine (mg/ml) = - 1,4
Immunokonjugaateista analysoitiin konjugoimattoman 20 ADM:n tai ADM-johdannaisten läsnäolo HPLC-analyysiä käyt tämällä. HPLC suoritettiin käyttämällä Phenomenex-kolon-nia, joka oli täytetty 5-μπι IB-SIL C18-helmillä. Kolonniin lisättiin konjugoimatonta lääkettä, ADM-johdannaisia (ts. ADM:ää, joka oli konjugoitu kuhunkin edellä esimerkeissä 25 1-5 kuvatulla tavalla valmistetuista bifunktionaalisista yhdisteistä) (0,1 pmol), tai immunokonjugaatteja, jotka sisälsivät 0,5 - 5 μπιοί lääke-ekvivalenttia ja eluoitiin metanolilla ja 10 mM ammoniumfosfaatilla, pH 4,5 (70:30) nopeudella 1,5 ml/min. Tuotetut immunokonjugaatit eivät 30 sisältäneet merkittäviä määriä (alle 1 %) konjugoimatonta .. lääkettä HPLC-analyysillä määritettynä.
Esimerkki 8
Immunokonjugaattien karakterisointi
Edellä esimerkissä 7 kuvatulla tavalla valmistetut 35 immunokonjugaatit koostuivat ADM-molekyyleistä, jotka oli vat konjugoituneet bifunktionaalisen yhdisteen 13-keto-asemaan, joka muodosti sidoksen ADM:n ja MAb-5E9:n välil 100718 50 le. Lisäksi vapaita tioliryhmiä sisältävän MAb:n lisääminen ADM-johdannaiseen, joka sisälsi reaktiivisen pyridi-nyyliditioryhmän, johti disulfidisidoksen muodostumiseen bifunktionaalisessa yhdisteessä yhdistäen ADM:n MAb:hen.
5 Tämän suoritusmuodon mukaan valmistettuja immunokonjugaat- teja ovat mm., muttei rajoittuen, 5E9-ADM-semikarbatsoni-[3,42]; 5E9-ADM-karbatsoni-[4,37]; 5E9-ADM-tiosemikarbat-soni-[2,51]; 5E9-ADM-karboksylaattihydratsoni-[2,35]; ja 5E9-ADM-aryylihydratsoni-[2,52] , joissa nimen ensimmäinen 10 osa edustaa konjugaatin muodostamiseen käytettyä monoklo- naalista vasta-ainetta, toinen osa edustaa vasta-aineeseen liitettyä antrasykliiniä ja nimessä oleva numero tarkoittaa erityisen konjugaatin ADM/vasta-aine-moolisuhdetta.
Keksinnön mukaisten immunokonjugaattien sitomisak-15 tiivisuus määritettiin fluoresenssisitoutumismäärityksessä tavalla, jonka on kuvannut: Greenfield et ai.; "In Vitro Evaluation of Immunoconjugates Prepared by Linking Mitomycin C to Monoclonal Antibodies via Polyglutamic Acid Carriers", teoksessa Antibody Immunoconjugates and Radio-20 pharmaceuticals, vol. 2, s. 201 (1989). Lyhyesti, immuno- konjugaateista tehtiin sarjalaimennokset 100 pl:aan määri-tysväliaineita (RPMI 1640, joka oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia ja penisilliini/streptomysiiniä, Gibco, Gr and Island, N.Y.). CEM-karvainsoluja (ATCC no.
25 CCL 119) (1 x 106 solua), joita oli kasvatettu samassa vä liaineessa, kerättiin ja pestiin sentrifugoimalla, ja sus-pendoitiin sitten (1 x 106) väliaineeseen, joka sisälsi laimennettuja immunokonjugaatteja. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 4 °C:ssa solut pestiin ja suspendoitiin vielä 1 30 tunniksi 4 °C:ssa 100 pl:aan väliainetta, joka sisälsi 1:40-laimennettua vuohen anti-hiiri-IgG-FITC:tä (Cappel, Durham, NC). Solut pestiin ja analysoitiin käyttämällä Coulter Epics V-fluoresenssisoluanalysaattoria. Jokaisessa kokeessa käytettiin sdamalla tavalla laimennettua MAb:tä 35 konjugoimattomana positiivisena sitoutumiskontrollina.
Taulukossa 1 esitetään proteiinisaanto %-osuutena (erik- 100718 51 seen saadut), moolisuhteet (moolia ADM:ää/MAb) ja sitoutuminen ilmoitettuna %-osuutena alkuperäisestä sitoutumisesta.
Taulukko 1 5 5E9-immuno- proteiini- mooli- % alkuperäisestä konjugaattl_saanto (%)_suhteet sitoutumisesta semikarbatsoni 83 3,42 97 karbatsoni 74 4,37 92 10 tiosemikarbatsoni 61 2,51 72 karboksylaatti- hydratsoni 78 2,35 97 aryylihydratsoni 86 2,52 91 15 Kuten taulukossa 1 esitetään, 5E9-immunokonjugaa- teilla säilyi yli 90 % konjugoimattoman 5E9:n alkuperäisestä sitoutumisaktiivisuudesta (paitsi tiosemikarbatso-nilla). Tämä osoittaa, että ADM-johdannaisten konjugoinnista 5E9-MAb:hen seurasi vasta-aineen sitoutumisaktiivi-20 suuden suhteellisen vähäinen menetys. Proteiinisaannot osoittavat, että koko konjugointimenetelmän aikana säilytettiin suuret proteiinimäärät.
ADM:n vapautuminen karbatsoni-immunokonjugaatista Myös ADM:n vapautumisnopeudet kekssinnön mukaisesta 25 karbatsoni-immunokonjugaatista pH-arvoilla 4,5, 5,0 ja 7,4 tutkittiin HPLC-analyysillä tavalla, joka kuvattiin edellä esimerkissä 6 keksinnön mukaisille ADM-johdannaisille. Kuten kuvassa 13 esitetään, ADM:n vapautumisnopeus immuno-konjugaatista on olennaisen sama, kuin ADM:n karbatsoni-30 johdannaisella esimerkissä 6 nähty. ADM-immunokonjugaatis- *. ta vapautuneen materiaalin määrä kasvoi, kun pH-arvo laski 7:stä 4:ään. Tässä ADM-immunokonjugaatissa on happoherkkä sidosryhmä, josta seuraa ADM:n vapautuminen vasta-ainepro-teiinista. Nämä tulokset ovat johdonmukaisia hydratsonisi-35 doksen läsnäolon kanssa, joka sidos yhdistää ADM:n bifunk- tionaaliseen yhdisteeseen.
52 100718 Tässä kuvatut kokeelliset arvot osoittavat, että keksinnön mukaisista immunokonjugaateista vapautuu ADM-osa "fysiologisissa" olosuhteissa, ts. happamissa olosuhteissa, jotka ovat tyypillisiä lysosomiympäristölle.
5 Immunokonjugaattien sytotoksinen aktiivisuus
Keksinnön mukaisten immunokonjugaattien sytotoksi-suus määritettiin in vitro-testeissä käyttämällä kolonian-muodostusmääritystä pehmeässä agarissa käyttämällä Daudi (Burkitt'n lymfooma)-soluja (fenotyyppi: 5E9+, ATCC no.
10 HB21) tavalla, jonka on kuvannut: Greenfield et ai.; EP-patenttihakemus 328147, yllä. Daudi-soluja kasvatettiin täydellisessä väliaineessa (RPMI 1640-väliaine + 10 % naudan sikiön seerumia (FCS)). 1 x 105 solua 1 ml:ssa väliainetta altistettiin 1,5 tunnin ajan sarjalaimennetuille 15 5E9-ADM-immunokonjugaateille tai konjugoimattomalle ADM:lle. Kustakin laimennoksesta tehtiin kolminkertainen määritys. Kontrollit koostuivat samalla tavalla käsitellyistä soluista, joita ei altistettu lääkkeille. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin RPMI 1640-väliaineeseen, 20 joka sisälsi 15 % FBStää ja 0,3 % agaroosia (Marine Col loid, Rockland, ME). Sitten 1 ml solususpensiota (1 x 103) päällystettiin 0,4-% agaroosikerrokselle 6-kaivoisissa mikrotiitterilevyissä (Costar, Cambridge, MA). Näytteitä inkuboitiin 7-10 päivää 37 °C:ssa, ja tulokseksi saadut 25 kolonia värjättiin 0,5 ml:11a 1-mg/ml p-jodinitrotetrat- soliumviolettia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 48 tunnin ajan. Koloniat laskettiin käyttämällä Optimax 40-10-kuva-analysaattoria, ja kolonioanmuodostuksen esto määritettiin vertaamalla lääkkeellä käsiteltyjä tai immu-30 nokonjugaatilla käsiteltyjä soluja käsittelemättömään kontrolliin. Tulokset esitetään alla taulukossa 2 IC50:nä (konsentraatio, joka vaaditaan estämään kolonianmuodostus-ta 50 %:lla).
35 100718 53
Taulukko 2 5E9-immunokon-)ugaatti_.(M)a semikarbatsoni >5,1 x 10'7 5 karbatsoni 4,0 x 10'7 tiosemikarbatsoni 3,0 x 10'7 karboksylaattihydratsoni 5,9 x 10'7 aryylihydratsoni >6,4 x 10'7 10 “M = immunokonjugaatin moolikonsentraatio, joka vaaditaan estämään kolonianmuodostusta 50 %:lla 24 tunnin jälkeen mitattuna.
Kuten taulukossa 2 esitetään, ADM:n vapauttamisen lisäksi kaikilla pH-herkillä immunokonjugaateilla on mer-15 kittävä sytotoksinen aktiivisuus in vitro.
Esimerkki 9
Tioeetterisidoksen sisältävän antrasykliini-immuno- konjugaatin valmistus Tässä esimerkissä kuvataan vaihtoehtoinen suoritus-20 muoto keksinnön mukaisen antrasykliini-immunokonjugaatin valmistamiseksi, jossa konjugaatissa ADM on konjugoitu monoklonaaliseen vasta-aineeseen yhdellä keksinnön mukaisista ADM-johdannaisista, jotka on valmistettu edellä esimerkeissä 1-5 kuvatulla tavalla, ja joissa on joku 5 25 sidoksesta: semikarbatsoni, karbatsoni, tiosemikarbatsoni, karboksylaattihydratsoni ja aryylihydratsoni sen kiinnityskohtana ADM-molekyyliin. Lisäksi immunokonjugaatissa on tioeetterisidos osana sen vasta-aineeseen kiinnittymistä.
MAb 5E9 (2,5 mg 2,5 ml:ssa PBS:ää) saatetaan rea-30 goimaan SMPB:n (sukkinimidyyli-4-(p-maleimidofenyyli)buty- .· raattia 59,5 pg 100 pl:ssa tetrahydrofuraania) kanssa 30 eC:ssa 30 min ajan. pH säädetään natriumsitraattipus-kurilla arvoon 6,0. Seos ajetaan PD-10-geelisuodatuskolon-nin (Pharmacia) läpi maleimidiä sisältävän vasta-aineen 35 erottamiseksi reagoimattomista materiaaleista. Sitten edellä kuvatulla tavalla valmistetut ADM-johdannaiset 100718 54 (1 mg) liuotetaan 1 ml Me0H/H20:hon (9:1), ja 0,5 pmol kutakin ADM-johdannaista saatetaan reagoimaan 0,5 pmol kanssa tri-n-butyyli-fosfiinia 4:1 asetoni:H20:ssa ADM-johdannaisen pelkistetyn muodon valmistamiseksi. 10 min kuluttua 5 lisätään 0,1 M rikkiä tolueenissa jäljellä olevan fos- fiinin tuhoamiseksi. Sitten pelkistetyt ADM-johdannaiset sekoitetaan 5E9-maleimidiä sisältävän MAb:n kanssa. Näin valmistetut immunokonjugaatit puhdistetaan PD-10-geelisuo-datuskolonnin läpi ajamalla. Tapauksissa, joissa tolueeni-10 liuottimen poistaminen ei ole täydellistä ja orgaaninen liuotinkerros erottaa hieman proteiinia kellumaan reak-tioseoksesta, käytetään kevyttä ilmavirtaa liuottimen poistamiseen, ja denaturoitunut proteiini poistetaan pyörittämällä seosta 2 min ajan 16000 x g:llä. Kirkas super-15 natantti sisältää immunokonjugaatit ja geelisuodatetaan ja analysoidaan PBS:ssä pH-arvossa 7,4. ADM/vasta-aine-mooli-suhde määritetään spektrofotometrisesti edellä kuvatulla tavalla käyttämällä 0D2B0:tä ja 0D495:tä. Tyypillinen reaktio tuottaa immunokonjugaatteja, joilla on moolisuhteet 20 välillä 3 ja 4.
Tässä esimerkissä kuvatulla tavalla valmistettujen immunokonjugaattien sitoutuminen ja sytotoksinen aktiivisuus testattiin edellä kuvatulla tavalla.
Edellä olevat esimerkit havainnollistavat uusien 25 N-substituoitujen bifunktionaalisten hydratsiiniyhdis- teiden, näillä bifunktionaalisilla yhdisteillä valmistettujen ADM:n uusien N-substituoitujen hydratsonijohdannaisten ja uusien immunokonjugaattien valmistusta, joissa kon-jugaateissa ADM konjugoitiin vasta-aineeseen uuden hap-30 poherkän sidoksen kautta. Bifunktionaaliset yhdisteet kon- jugoituivat helposti sytotoksisen reagenssin, ADM:n ja solunkohdistamismolekyylin, monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. Konjugaateilla säilyi sekä vasta-aineen sitomisak-tiivisuus, (ts. kohdesoluspesifisyys) että sytotoksinen 35 lääke aktiivisuus, ja ne vapauttivat vapaata, modifioima- 100718 55 tonta ADM:ää happamissa olosuhteissa, jotka ovat tyypillisiä kohdesolujen soluympäristölle.
Siten keksinnön mukaiset uudet bifunktionaaliset yhdisteet ovat lupaavia käyttökelpoisten molekyylien kon-5 jugoimiseen, erityisesti sytotoksisten lääkkeiden vapaut tamiseen kohdesolupopulaatioon näiden solujen suosivaan tappamiseen hoidettaessa sairauksia, kuten syöpälajeja ja muita kasvaimia, ei-soluja tappavia virus- tai muita patogeeni-infektioita ja autoimmuunihäiriöitä.
10 Vaikka tässä on esitetty joukko keksinnön suoritus muotoja, on selvää, että perusrakennelmaamme voidaan muuttaa aikaansaamaan muita suoritusmuotoja, joissa käytetään keksinnön mukaisia bifunktionaalinen yhdisteitä, sytotoksisten reagenssien johdannaisia, konjugaatteja ja menetel-15 miä. Siksi ymmärretään, että keksinnön suoja-ala määritel lään paremminkin oheisilla patenttivaatimuksilla, kuin erityisillä suoritusmuodoilla, jotka on tässä edellä esitetty esimerkkinä.

Claims (15)

100718
1. Bifunktionaalinen N-substituoitu hydratsiiniyh-diste, jolla on kaava 5 H2NNHCONH(CH2)nSSR8 jossa n on kokonaisluku 1 - 4 ja Re on pyridyyli.
2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdis- 10 teen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) metoksikarbonyylisulfenyylikloridi saatetaan reagoimaan 2-aminoetaanitiolihydrokloridin ja 2-merkapto-pyridiinin kanssa 2-[(2-pyridyyli)ditio]etaaniamiinihyd- 15 rokloridin muodostamiseksi; b) mainittu hydrokloridi saatetaan reagoimaan tri-etyyliamiinin, fosgeenin ja t-butyylikarbatsaatin kanssa N-[2-[(2-pyridyyli)ditio]etyyli]-2-(tert-butoksikarbonyy-li)hydratsiinikarboksamidin muodostamiseksi; ja 20 c) mainittu hydratsiinikarboksamidi saatetaan rea goimaan trifluorietikkahapon kanssa N-[2-[(2-pyridyyli)-ditio]etyyli]hydratsiinikarboksamidin muodostamiseksi.
3. N-[2-[(2-pyridyyli)ditio]etyyli]hydratsiinikarboksamidi . .'25 4. Bifunktionaalinen N-substituoitu hydratsiiniyh- diste, jolla on kaava H2NNHCONHNHCONH (CH2) nSSR8 30 jossa n on kokonaisluku 1 - 4 ja R8 on pyridyyli.
5. Menetelmä patenttivaatimuksen 4 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) t-butyylikarbatsaatti, trietyyliamiini, trifos- 35 geeni ja 2-(2-pyridyyliditio)etaaniamiinihydrokloridi saa- 100718 tetaan reagoimaan 2-[[ [2-[(2-pyridyyli)ditio]etyyli]amino] karbonyyli]-2,2'-bis (tert-butoksikarbonyyli)karbonidi-hydratsidin kanssa; ja b) mainittu N-butoksikarbonyylikarbonidihydratsidi 5 saatetaan reagoimaan trifluorietikkahapon kanssa 2 —[[ [2 — [(2-pyridyyli)ditio]etyyli]amino]karbonyyli]karbonidihydr-atsidin valmistamiseksi. 6. 2-[[[2-[(2-pyridyyli)ditio]etyyli]amino]karbo nyyli] karbonidihydratsidi.
7. Bifunktionaalinen N-substituoitu hydratsiiniyh- diste, jolla on kaava H2NNHCSNH (CH2) mCH=CH (CH2) nSSR8 15 jossa m on 1 - 10 ja n on 1 - 4, jolloin m ja n ovat samo ja tai erisuuruisia ja R8 on pyridyyli.
8. Menetelmä patenttivaatimuksen 7 mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa 20 a) 1,4-dibromi-2-buteeni saatetaan reagoimaan ka- liumftalimidin kanssa l-bromi-4-(N-ftalimido)-2-buteenin valmistamiseksi; b) mainittu bromibuteeni saatetaan reagoimaan ka-liumtioasetaatin kanssa 1-(asetyylitio)-4-(N-ftalimido)-2- 25 buteenin valmistamiseksi; c) mainittu asetyylitiobuteeni saatetaan reagoimaan hydratsiinin kanssa l-amino-4-merkapto-2-buteenihydroklo-ridin muodostamiseksi; d) mainittu aminomerkaptobuteeni saatetaan reagoi- 30 maan metoksikarbonyylisulfenyylikloridin ja 2-merkaptopy- [· ridiinin kanssa l-amino-4-[(2-pyridyyli)ditio]-2-buteeni- hydrokloridin muodostamiseksi; e) mainittu aminobuteenihydrokloridi saatetaan reagoimaan TEA:n ja di-2-pyridyylitionokarbonaatin ja t-bu- 35 tyylikarbatsaatin kanssa N-[4-[(2-pyridyyli)ditio]-2-bu- 100718 tenyyli]-hydratsiinikarbotioamidin t-boc-johdannaisella suojatun karbotioamidin muodostamiseksi; ja f) mainittu t-boc-johdannainen saatetaan reagoimaan trifluorietikkahapon kanssa N-4-[(2-pyridyyli)ditio]-2-5 butenyyli]hydratsiinikarbotioamidin valmistamiseksi.
9. N-4-[(2-pyridyyli)ditio-2-butenyyli]hydrat-siinikarbotioamidi.
10. Bifunktionaalinen N-substituoitu hydratsiiniyh-diste, jolla on kaava 10 H2NNHCOO(CH2) nSSR6 jossa n on kokonaisluku 1 - 4 ja R8 on pyridyyli.
11. Menetelmä patenttivaatimuksen 10 mukaisen yh- 15 disteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) kloorikarbonyylisulfenyylikloridi saatetaan reagoimaan 2-merkaptoetanolin ja 2-merkaptopyridiinin ja sitten ammoniumkarbonaatin kanssa raa'an 2-(2-pyridyylidi- 20 tio)etanolin muodostamiseksi; ja b) mainittu 2-(2-pyridyyliditio)etanoli saatetaan reagoimaan karbonyylidi-imidatsolin ja hydratsiinin kanssa 2[(2-pyridyyli)ditio]etyylihydratsiinikarboksylaatin muodostamiseksi . . 25 12. 2-[(2-pyridyyli)ditio]etyylihydratsiinikarbok- sylaatti.
13. Bifunktionaalinen N-substituoitu hydratsiiniyh-diste, jolla on kaava
30 H2NNH-Ar-CONH (CH2) nSSRe « jossa n on kokonaisluku 1 - 4, R8 on pyridyyli ja Ar on fenyyli.
14. Menetelmä patenttivaatimuksen 13 mukaisen yh- 35 disteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa 100718 a) p-hydratsinobentsoehappo saatetaan reagoimaan di-t-butyylipyrokarbonaatin kanssa 4-(N-boc-hydratsino)-bentsoehapon muodostamiseksi; b) mainittu 4-(N-boc-hydratsino)bentsoehappo saate- 5 taan reagoimaan N-hydroksisukkinimidin ja DCC:n kanssa 4-(N-boc-hydratsiini)bentsoehapon N-hydroksisukkinimidies-terin muodostamiseksi; c) mainittu esteri saatetaan reagoimaan 2-(2-pyri-dyyliditio)etyyliamiinihydrokloridin ja trietyyliamiinin 10 kanssa N-[2-[(2-pyridyyli)ditio]etyyli-4-(N-boc-hydratsi no) bentsamidin muodostamiseksi; ja d) mainittu N- [2-[ (2-pyridyyli)ditio]etyyli-4-(N-boc-hydratsino)bentsamidi saatetaan reagoimaan trifluo-rietikkahapon kanssa N-[2-[(2-pyridyyliditio)etyyli]-4- 15 hydratsinobentsamidin muodostamiseksi.
15. N-[2-[(2-pyridyyli)ditio)etyyli]-4-hydratsi-nobentsamidi.
16. Menetelmä konjugaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että yhdistetään patenttivaatimuksen 1, 20 4, 7, 10 tai 13 mukainen yhdiste ensin ainakin yhden ant- rasykliinimolekyylin kanssa, joka sisältää vapaan karbo-nyyliryhmän, ja ainakin yhden monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka sisältää sulfhydryyliryhmän. 100718
FI912285A 1990-05-14 1991-05-10 Bifunktionaalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä, menetelmiä n iiden valmistamiseksi ja konjugaattien valmistusmenetelmä, jossa niitä käytetään FI100718B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07522996 US5137877B1 (en) 1990-05-14 1990-05-14 Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
US52299690 1990-05-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI912285A0 FI912285A0 (fi) 1991-05-10
FI912285A FI912285A (fi) 1991-11-15
FI100718B true FI100718B (fi) 1998-02-13

Family

ID=24083237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI912285A FI100718B (fi) 1990-05-14 1991-05-10 Bifunktionaalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä, menetelmiä n iiden valmistamiseksi ja konjugaattien valmistusmenetelmä, jossa niitä käytetään

Country Status (14)

Country Link
US (2) US5137877B1 (fi)
EP (1) EP0457250B1 (fi)
JP (2) JP3010319B2 (fi)
AT (1) ATE182141T1 (fi)
AU (1) AU646850B2 (fi)
CA (1) CA2042503C (fi)
DE (1) DE69131435T2 (fi)
DK (1) DK0457250T3 (fi)
ES (1) ES2134761T3 (fi)
FI (1) FI100718B (fi)
GR (1) GR3031402T3 (fi)
IE (1) IE911635A1 (fi)
PT (1) PT97639B (fi)
ZA (1) ZA913591B (fi)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5474765A (en) * 1992-03-23 1995-12-12 Ut Sw Medical Ctr At Dallas Preparation and use of steroid-polyanionic polymer-based conjugates targeted to vascular endothelial cells
AU3937693A (en) * 1992-04-10 1993-11-18 Brigham And Women's Hospital Methods and compositions for oral delivery of therapeutic agents
DE4236237A1 (de) * 1992-10-27 1994-04-28 Behringwerke Ag Prodrugs, ihre Herstellung und Verwendung als Arzneimittel
US5750088A (en) * 1993-03-30 1998-05-12 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Stable hydrazones linked to a peptide moiety as reagents for the preparation of radiopharmaceuticals
EP0715720A1 (en) * 1993-08-27 1996-06-12 Abbott Laboratories Hydrazine derivatized cells
US5858327A (en) * 1993-09-03 1999-01-12 Resolutions Pharmaceuticals, Inc. Hydrazino-type N2 S2 radionuclide chelating compounds
US5502246A (en) * 1994-03-22 1996-03-26 Eli Lilly And Company Solid-phase synthesis utilizing photochemical carbon-sulfur bond cleavage of thioethers
US6143864A (en) * 1994-06-28 2000-11-07 Merck & Co., Inc. Peptides
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
US5599686A (en) * 1994-06-28 1997-02-04 Merck & Co., Inc. Peptides
US5856571A (en) * 1995-06-07 1999-01-05 Cellpro, Incorporated Semicarbazide-containing linker compounds for formation of stably-linked conjugates and methods related thereto
WO1997014416A1 (en) * 1995-10-18 1997-04-24 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
EP0871490B1 (en) * 1995-12-22 2003-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Branched hydrazone linkers
US6177404B1 (en) 1996-10-15 2001-01-23 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US5948750A (en) * 1996-10-30 1999-09-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
JP2001505194A (ja) * 1996-11-05 2001-04-17 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 分枝ペプチド・リンカー
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6127333A (en) * 1997-07-10 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US7157418B1 (en) 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US20030215421A1 (en) * 1999-07-21 2003-11-20 Mcdonald John R. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
US6652836B2 (en) 1998-10-15 2003-11-25 Fluoroprobe, Inc. Method for viewing tumor tissue located within a body cavity
US6299860B1 (en) * 1998-10-15 2001-10-09 Fluoro Probe, Inc. Method for viewing diseased tissue located within a body cavity
US6222093B1 (en) * 1998-12-28 2001-04-24 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods for determining therapeutic index from gene expression profiles
US6444657B1 (en) 1998-12-31 2002-09-03 Guilford Pharmaceuticals Inc. Methods for treating certain diseases using naaladase inhibitors
US7192729B2 (en) 1999-07-06 2007-03-20 General Atomics Methods for assaying homocysteine
AU2001227679A1 (en) * 2000-02-25 2001-09-03 General Atomics Mutant nucleic binding enzymes and use thereof in diagnostic, detection and purification methods
WO2001071352A2 (en) * 2000-03-17 2001-09-27 The Salk Institute For Biological Studies Compositions associated with complex formation
US6610504B1 (en) 2000-04-10 2003-08-26 General Atomics Methods of determining SAM-dependent methyltransferase activity using a mutant SAH hydrolase
GB0012718D0 (en) * 2000-05-24 2000-07-19 Angeletti P Ist Richerche Bio Conjugates of aminodrugs
AU2001283740A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-25 University Of British Columbia Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours
AU2001285020A1 (en) * 2000-08-17 2002-02-25 Synapse Technologies, Inc. P97-active agent conjugates and their methods of use
US7445802B2 (en) * 2000-12-26 2008-11-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Site-specific in situ generation of allicin using a targeted alliinase delivery system for the treatment of cancers, tumors, infectious diseases and other allicin-sensitive diseases
CN1463270A (zh) 2001-05-31 2003-12-24 梅达莱克斯公司 细胞毒素、其有用的前体药物、连接基团和稳定剂
US20030232760A1 (en) * 2001-09-21 2003-12-18 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
RU2196604C1 (ru) * 2001-12-21 2003-01-20 Северин Евгений Сергеевич Полипептид, являющийся аналогом рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту, его конъюгат с доксорубицином и фармацевтическая композиция на его основе
US7282590B2 (en) * 2004-02-12 2007-10-16 The Research Foundation Of State University Of New York Drug conjugates
US7384760B2 (en) * 2004-04-30 2008-06-10 General Atomics Methods for assaying inhibitors of S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase and S-adenosylmethionine (SAM)-dependent methyltransferase
US7691962B2 (en) * 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
NZ550934A (en) * 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
US7541330B2 (en) * 2004-06-15 2009-06-02 Kosan Biosciences Incorporated Conjugates with reduced adverse systemic effects
US8288557B2 (en) * 2004-07-23 2012-10-16 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
DK1851250T3 (da) * 2005-02-18 2012-07-09 Medarex Inc Humant monoklonalt antistof mod prostataspecifikt membranantigen (psma)
US7714016B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
RS52470B (en) 2005-08-24 2013-02-28 Immunogen Inc. PROCEDURE FOR PREPARATION OF PURE CONJUGATED MEDICINES
AU2006294554B2 (en) * 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
KR20080068084A (ko) 2005-10-26 2008-07-22 메다렉스, 인코포레이티드 씨씨-1065 유사체를 제조하기 위한 방법 및 화합물
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
CN101616911A (zh) * 2007-02-21 2009-12-30 梅达莱克斯公司 具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物
AU2008256644B2 (en) 2007-05-24 2014-07-03 The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Intranuclear protein transduction through a nucleoside salvage pathway
WO2009039207A1 (en) * 2007-09-19 2009-03-26 Oncofluor, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
JP5769616B2 (ja) 2008-04-30 2015-08-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド クロスリンカーおよびそれらの使用
AU2015202204A1 (en) * 2008-04-30 2015-05-14 Immunogen, Inc. Cross-linkers and their uses
PT2816055T (pt) * 2008-05-27 2019-03-18 Genzyme Corp Análogos peptídicos de hormonas estimulantes de alfa-melanócitos
NZ623273A (en) 2008-12-05 2015-09-25 Abraxis Bioscience Llc Sparc binding scfvs
CA2799608C (en) 2009-05-28 2023-02-28 Richard H. Weisbart Amino acid sequences which enhance peptide conjugate solubility
SG10201810743WA (en) 2009-06-03 2018-12-28 Immunogen Inc Conjugation methods
GB201012410D0 (en) 2010-07-23 2010-09-08 Medical Res Council Intracellular immunity
EA201991268A3 (ru) 2011-03-29 2020-01-31 Иммуноджен, Инк. Получение конъюгатов "майтансиноид-антитело" одностадийным способом
EP2592103A1 (en) 2011-11-08 2013-05-15 Adriacell S.p.A. Polymer aldehyde derivatives
GB201202268D0 (en) 2012-02-09 2012-03-28 Medical Res Council Intracellular immunity
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
ES2701076T3 (es) 2012-11-24 2019-02-20 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Enlazadores hidrofílicos y sus usos para la conjugación de fármacos a las moléculas que se unen a las células
DK2968440T3 (da) 2013-03-15 2019-07-22 Zymeworks Inc Cytotoksiske og antimitotiske forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse heraf
CN106255513B (zh) 2013-12-27 2022-01-14 酵活有限公司 用于药物偶联物的含磺酰胺连接系统
SG11201605260VA (en) 2013-12-27 2016-07-28 Zymeworks Inc Var2csa-drug conjugates
CN114262344A (zh) 2014-02-28 2022-04-01 杭州多禧生物科技有限公司 带电荷链接体及其在共轭反应上的应用
KR102494557B1 (ko) 2014-09-17 2023-02-02 자임워크스 비씨 인코포레이티드 세포독성 및 항유사분열성 화합물, 그리고 이를 이용하는 방법
CN107001477A (zh) 2014-11-05 2017-08-01 南洋理工大学 经稳定化且自主的抗体vh结构域
NZ739830A (en) 2015-07-12 2021-12-24 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Bridge linkers for conjugation of cell-binding molecules
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
EP4242304A3 (en) * 2015-10-01 2024-02-07 Revolution Medicines, Inc. Methods and reagents for analyzing protein-protein interfaces
US20190330317A1 (en) 2016-06-15 2019-10-31 Yale University Anti-guanosine antibody as a molecular delivery vehicle
US10517958B2 (en) 2016-10-04 2019-12-31 Zymeworks Inc. Compositions and methods for the treatment of platinum-drug resistant cancer
KR20220147721A (ko) 2016-11-14 2022-11-03 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
US20210054102A1 (en) 2018-02-01 2021-02-25 Yale University Compositions and methods for enhancing nuclear translocation
WO2022013613A2 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Onena Medicines S.L. Antibodies against lefty proteins
CN113262311B (zh) * 2021-04-29 2022-08-05 武汉纳乐吉生命科技有限公司 肿瘤特异性刺激响应的羟烷基淀粉-阿霉素偶联物、其制备和应用
WO2023010060A2 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Novab, Inc. Engineered vlrb antibodies with immune effector functions
WO2023056450A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Yale University Compositions and methods for the treatment of autosomal dominant polycystic kidney disease and other diseases having upregulated mtor activity
WO2024050524A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for directing apolipoprotein l1 to induce mammalian cell death
WO2024064752A2 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Yale University Compositions of wet adhesives derived from vibrio cholerae biofilm adhesins and methods thereof

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1470054A1 (de) * 1963-11-09 1969-05-29 Merck Ag E Schwefelhaltige Pyridin-Derivate und Verfahren zu deren Herstellung
US4130562A (en) * 1975-01-10 1978-12-19 Givaudan Corporation Odorant or flavoring thiazolyl disulphides
SE430062B (sv) * 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4112217A (en) * 1977-09-02 1978-09-05 Sri International Bis-hydrazones of daunomycin and adriamycin
US4250303A (en) * 1977-10-17 1981-02-10 Sri International N-Benzyl anthracyclines
US4258193A (en) * 1978-07-13 1981-03-24 Toyo Jozo Kabushiki Kaisha Disulfide derivatives having S--S exchange reactivity
US4303785A (en) * 1978-08-05 1981-12-01 Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai Antitumor anthracycline antibiotics
US4202967A (en) * 1978-10-02 1980-05-13 Sri International N,N-pentamethylene derivatives of daunomycin and adriamycin
US4282031A (en) * 1979-01-03 1981-08-04 Gulf Oil Corporation Substituted thiosemicarbazides, their manufacture and use as plant growth regulants
US4252962A (en) * 1980-03-24 1981-02-24 Olin Corporation Process for producing 2-amino or selected 2-(substituted)amino-5-mercapto-1,3,4-thiadiazole compounds
US4301277A (en) * 1980-10-20 1981-11-17 Sri International 3-Deamino-3-(4-morpholinyl) derivatives of daunorubicin and doxorubicin
US4314054A (en) * 1981-03-23 1982-02-02 Sri International 3'-Deamino-3'-(4-methoxy-1-piperidinyl) derivatives of daunorubicin and doxorubicin
SE8102193L (sv) * 1981-04-06 1982-10-07 Pharmacia Ab Terapeutiskt aktiv organisk forening och dess anvendning
GB2116979B (en) * 1982-02-25 1985-05-15 Ward Page Faulk Conjugates of proteins with anti-tumour agents
US5162512A (en) * 1982-03-09 1992-11-10 Cytogen Corporation Amine derivatives of anthracycline antibodies
WO1983003971A1 (en) * 1982-05-12 1983-11-24 President And Fellows Of Harvard College Hybrid proteins
GB2122612B (en) * 1982-06-16 1985-09-25 May & Baker Ltd Cystamine derivatives
US4464529A (en) * 1982-07-20 1984-08-07 Sri International Analogues of morpholinyl daunorubicin and morpholinyl doxorubicin
US4590001A (en) * 1983-03-28 1986-05-20 Stjernholm Rune L Platinum bound to transferrin for use in the treatment of breast tumors
SE8302758L (sv) * 1983-05-17 1984-11-18 Pharmacia Ab Sett for uppspjelkning av disulfidbindningar och derigenom erhallen forening
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4522750A (en) * 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
JPS6157579A (ja) * 1984-08-29 1986-03-24 Toyama Chem Co Ltd ３−アミノピロリジンまたはその塩の製造法
US4591637A (en) * 1985-01-17 1986-05-27 Sri International Open chain-morpholino adriamycins
JPS61274658A (ja) * 1985-05-29 1986-12-04 Morii Shokuhin Kk 半生状はるさめの製造方法
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
IN165717B (fi) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4970303A (en) * 1988-02-03 1990-11-13 Xoma Corporation Linking agents and methods
FI102355B1 (fi) * 1988-02-11 1998-11-30 Bristol Myers Squibb Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi
US5157123A (en) * 1989-03-13 1992-10-20 Georgetown University S-(2-thiopyridyl)-l-cysteine, a heterobifunctional crosslinking reagent

Also Published As

Publication number Publication date
JPH04352765A (ja) 1992-12-07
US5349066A (en) 1994-09-20
EP0457250A2 (en) 1991-11-21
PT97639B (pt) 1998-08-31
JP3010319B2 (ja) 2000-02-21
AU646850B2 (en) 1994-03-10
AU7403891A (en) 1991-11-14
ZA913591B (en) 1992-02-26
DE69131435D1 (de) 1999-08-19
ES2134761T3 (es) 1999-10-16
GR3031402T3 (en) 2000-01-31
EP0457250B1 (en) 1999-07-14
PT97639A (pt) 1992-02-28
JP3234980B2 (ja) 2001-12-04
CA2042503C (en) 2002-07-23
DK0457250T3 (da) 1999-11-29
EP0457250A3 (en) 1992-07-01
FI912285A0 (fi) 1991-05-10
JP2000026404A (ja) 2000-01-25
FI912285A (fi) 1991-11-15
ATE182141T1 (de) 1999-07-15
IE911635A1 (en) 1991-11-20
US5137877A (en) 1992-08-11
US5137877B1 (en) 1996-01-30
CA2042503A1 (en) 1991-11-15
DE69131435T2 (de) 2000-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI100718B (fi) Bifunktionaalisia N-substituoituja hydratsiiniyhdisteitä, menetelmiä n iiden valmistamiseksi ja konjugaattien valmistusmenetelmä, jossa niitä käytetään
Kaneko et al. New hydrazone derivatives of adriamycin and their immunoconjugates-a correlation between acid stability and cytotoxicity
US6512101B1 (en) Branched hydrazone linkers
EP0328147B1 (en) Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production
US4952394A (en) Drug-monoclonal antibody conjugates
US5606017A (en) Thioether conjugates
AU631802B2 (en) Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
EP0398305B1 (en) Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production
US5241078A (en) Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
CA2239183C (en) Branched hydrazone linkers
CA2010164C (en) Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired