PT97639B - Processo para a preparacao de hidrazinas n-substituidas bifuncionais e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE HIDPAZINAS N-SUBSTITUlDAS BIFUNCIONAIS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS OUE AS CONTÊM

ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos compostos bifuncionais, a conjugados que contêm os compostos e a métodos para a sua preparação e utilização. De um modo mais específico, a presente invenção refere-se a hidrazinas N-substituídas que podem ligar-se a moléculas para alvejar populações célula res.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Jã se descreveram os compostos bifuncionais que permi tem a ligação de duas ou mais moléculas. Conhecem-se, por exemplo, os compostos bifuncionais para ligação de reagentes citotõ xicos a moléculas para alvejar populações celulares. Os compostos bifuncionais devem ser capazes de transportar e libertar estes tipos de reagentes citotõxicos, in vivo, para, por exemplo, proporcionar níveis suficientes, isto é, níveis terapêuticos de reagentes in vivo, sem danificar a actividade das moléculas projectadas. Para determinadas aplicações ê desejável a formação de um conjugado que contenha uma ligação sensível ao pH entre o reagente e as moléculas projectadas do conjugado, o que proporcionara a libertação do reagente citotõxicoem determi nados intervalos de pH.

Os reagentes especialmente úteis no tratamento do

-2Α cancro são as antraciclinas. As antraciclinas são compostos an tibiõticos, que apresentam actividade citotôxica. Estudos efec tuados, indicaram que as antraciclinas podem aniquilar as cêlu las de acordo com um certo número de mecanismos diferentes que incluem: 1) intercalação de moléculas de fármaco no ADN de uma célula, inibindo, assim, a sintese do ãcido nucleico dependente do ADN; 2) produção pelo fármaco de radicais livres que, em seguida, reagem com macromoléculas celulares para provocar a danificação das células ou 3) interacções das moléculas de fãr maco com a membrana celular (Peterson e outros, Transport And Storage of Anthracyclines In Experimental Systems And Human Leukemia, in Anthracycline Antibiotics In Câncer Therapy, Muçf gia et al. (Eds.), :p. 132 (Martinus Nijhoff Publishers, 1982; e Bachur, Free Radical Damage, id., pp. 97-102)). Devido ao seu potencial citotõxico, utilizaram-se as antraciclinas no tratamento de numerosos cancros, tais como leucemia, carcinoma da mama, carcinoma do pulmão, adenocarcinoma do ovário e sarco mas (Wiernik, Current Status OF Adriamycin And Daunomycin In Câncer Treatment, in Anthracyclines: Current Status And New Developments, Crooke e outros. (Eds.), pp. 273-294 (Academic Press, 1980)). As antraciclinas que se utilizam habitualmente englobam a adriamicina (ADM, também conhecida como doxorrubicina) e a daunomicina (DAU, também conhecida como daunorrubicina).

Embora estes compostos possam ser úteis no tratamento de neoplasmas e de outros estados de doença em que se pretende reduzir ou eliminar uma população celular alvo, a sua eficácia terapêutica ê, muitas vezes, limitada pela toxicidade dependente da dose associada â sua administração. Por exemplo, no tratamento de tumores, os efeitos secundários adversos carac teristicos destes compostos incluem mielossupressão e cardioto xicidade (Crooke, Goals For Anthracyclines: Analog Development At Bristol Laboratories, Anthracyclines; rCurrent Status And New Developments, supra, p. 11). No entanto, têm vindo a ser efectuadas tentativas no tratamento de tumores, para melhorar os efeitos terapêuticos destes compostos, ligando a antraciclina a anticorpos dirigidos contra os antigênicos associados ao tumor para formar imunoconjugados que libertem o fármaco selectivamente nas células tumorlgenas. (Hermentin e Seiler, Investigations with monoclonal antibody drug (anthracycline) conjugates, Behring Insti. Mitl., 82(1988) 197-215). Deste modo, o fármaco pode ser libertado ou projectado no sítio do tumor, podendo diminuir os seus efeitos secundários tóxicos sobre as células normais do organismo. Os imunoconjugados constituídos por antraciclinas, ADM ou DAU ligada a anticorpos monoclonais ou policlonais para antigénios associados a tumores, são conhe eidos na especialidade (por exemplo, Gallego et al., Preparation Of Four Daunomucin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumor Activity, Int. J. Câncer, 33 (1984) 737-744; e Arnon et al., In Vitro And In Vitro Efficacy Of Conjugates Of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies, Immunological Fev., (1982) 5-27).

As abordagens mais frequentemente utilizadas para li gação de uma antraciclina a um anticorpo, utilizaram a ligação do radical açúcar da antraciclina. Por exemplo, oxidou-se o ra dical açúcar por tratamento com periodato de sódio e ligou-se directamente a resíduos de lisina do anticorpo através da forma ção de uma base de Schiff (Hurwitz et al.,

The Covalent Bin-4L·.

ding Of Daunomycin And Adriamycin To Antibodies, With Retenti- * on of Both Drug And Andibody Activities, Câncer Res., 35 (1975) 1175-1181). De um modo alternativo, ligaram-se as antra ciclinas aos anticorpos através da ligação mediada por carbodiimida do grupo amino da antraciclina aos grupos carboxilo do anticorpo (Hurwitz et al., supra), ou a um grupo aminoalquilo (Hurwitz et al., The Effect in vivo of the Chemotherapeutic drug-antibody conjugates in two murine experimental tumors sys tems, Int. J. Câncer, 21 (1978) 747-755). Estas ligações não são facilmente hidrolisãveis e tornam difícil o controlo da li_ bertação da antraciclina. Também se ligaram as antraciclinas aos anticorpos, mediante ligação cruzada do açúcar do grupo amino do fármaco e os grupos amino do anticorpo com glutaraldeído (Belles-Isles et al., In Vitro Aetivity of Daunomycin-Anti-AlphaFetoprotein Conjugate On Mouse Hepatoma Cells, Br.

J. Câncer, 41 (1980) 841-42. No entanto, estudos efectuados com imunoconjugadas nos quais se modificou a porção açúcar do grupo amino da molécula da antraciclina por ligação ao anticorpo, indicaram uma perda de actividade citotõxica do fármaco conjugado. (Arnon et al., supra, paginas 7-8). Além disso, os estudos efectuados com análogos de antraciclinas indicaram que modificações nos açúcares amino das antraciclinas originavam um decréscimo de actividade citotõxica do análogo do fármaco rela tivamente ao fãrmaco da mesma família (Yamamoto et al., Antitumor Activity of Some Derivatives of Daunomycin At The Amino And Methyl Ketone Functions, J, Med. Chem., 15 (1972) 872-75).

Prepararam-se, ainda, outros imunoconjugados em que se ligou directamente a antraciclina, DAU, a um anticorpo, na posição carbono 14 (C-14) do fãrmaco. No entanto, a actividade citotoxica selectiva destes imunoconjugados contra as células tumorígenas não foi susceptível de ser reproduzida e revelou-se consistentemente apenas a uma concentração de 20 jig/ml (Gallego et al., supra).

No pedido de patente de invenção japonesa n9 274658 descreve-se a conjugação de uma antraciclina com um anticorpo através de uma ligação de acil-hidrazona em C-13. Efectuou-se esta conjugação utilizando métodos que envolvem a derivação do anticorpo e a subsequente reacção desses derivados com antraciclina. Estes métodos não são os preferenciais, devido ao fac to de a derivação do anticorpo envolver reacções não específicas indesejáveis e de se produzirem baixas relações antraciclj. na/anticorpo. De acordo com o primeiro método, tratou-se o anticorpo com carbodiimida na presença de hidrazina para se obter um derivado de anticorpo hidrazida que, depois, se faz reagir com a antraciclina, de tal modo que a antraciclina se ligue di rectamente ã estrutura do anticorpo. No entanto, os imunoconju gados resultantes são propensos a agregação das moléculas de anticorpo. Além disso, devido ao facto de este método necessitar de grupos carboxilo que podem ser limitados em número, estes imunoconjugados possuem uma baixa relação antraciclina/anticorpo (aproximadamente 1,1 a 1,3). O segundo método envolve a reacção do anticorpo com anidrido succínico, para se obter um derivado hemi-succinato do anticorpo. Faz-se reagir, seguidamente, este derivado com hidrazina para se produzir um anticorpo derivado de hidrazida que depois se faz reagir, em primeiro lugar, com a antraciclina, daunomicina. Esta segunda abor dagem ê imperfeita devido ao facto de a reacção do derivado de anticorpo com a hidrazina não ser específica, levando ã produ-6A ção de uma mistura de diferentes derivados de anticorpo, além do derivado de hidrazida pretendido. Deste modo, tal como se indica no pedido de patente de invenção japonesa n? 274 658, a relação molar entre a antraciclina e o anticorpo era muito baixa (aproximadamente 1, ver pedido de patente de invenção japonesa pág. 264, coluna 1). Ver também o pedido de patente de invenção europeia, publicação N9 294 294, no qual se descre ve a conjugação de um derivado de hidrazona C-13 de uma antraciclina com o radical de hidrato de carbono de um anticorpo.

Foram descritas outras hidrazonas de antraciclinas em Tong et al., J. Med. Chem., 21(1978) 732-37; Smith et al.,

J.Med. Chem., 21(1978) 280-83; e Brownlee et al., J.Chem Soc., (1986) 659-61'. Ver,também, a patente de invenção norte-america na n9 4 112 217, em que se descrevem bis-hidrazonas de DAU e de ADM.

Noutros estudos ligaram-se as antraciclinas a veículos de elevado peso molecular, tais como dextrano ou ãcido poliglutâmico, com o objectivo de potenciar a actividade citotôxica e de reduzir a toxicidade do fãrmaco (Arnon et al., supra, p. 5 e Hurwitz et al., Soluble Macromolecules As Carriers For Daunorubicin, J. Appl. Biochem., 2^(1980) 25-35. Também se ligaram por covalência estas antraciclinas, ligadas a veículos, a anticorpos dirigidos contra antigénios associados a tumores para se formarem imunoconjugados para projectar o fãrmaco citotõxico especificamente nas células tumorígenas. Por exemplo, li gou-se a ADM a um desses anticorpos anti-tumor através de uma ponte de carboximetildextrano-hidrazida pela qual se ligou a mo lêcula de ADM a um derivado hidrazida de carboximetilãextrano no earbonilo C-13 de ADM para formar uma hidrazona. Depois, li-7gou-se ο anticorpo ao derivado hidrazida de dextrano, com glutaraldeído, para formar um conjugado anticorpo adriamicina-dextrano (Arnon e outros, Monoclonal Antibodies As Carriers For Immunotargeting Of Drugs, in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, (Baldwin e outros, Eds.), 1985, pp. 365-83 e Hurwitz e outros, A Conjugate Of Adriamycin And Monoclonal Antibodies To Thy-1 Antigen inhibits A Human Neuroblastoma Cells In Vitro, Ann. N.Y. Acad. Sei. 417 (1983) 125-136).

No entanto, a utilização de veículos apresenta algumas desvantagens. Por exemplo, os imunoconjugados gue contêm veículos possuem dimensões bastante grandes e são rapidamente removidos pelo sistema reticuloendotelial, in vivo, (Dillman e outros, Preclinical Trials With Combinations And Conjugates Of T101 Monoclonal Antibody And Doxorubicin, Câncer Res., 46 (1986) 4886-4891). Esta rãpida remoção dos imunoconjugados que contêm veículos pode nao ser vantajosa para fins terapêuticos devido ao facto de ser possível que o fãrmaco nunca atinja o sítio em que se pretende a sua actuação. Alem disso, certificou-se que a presença de veículos de elevado peso molecular reduzem a actividade de ligaçao do anticorpo do conjugado (Embleton et al., Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents, in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, (Baldwin et al., Eds.), 1985 pp. 232-24). Para alêm disto, em estu dos com células tumorígenas não foi possível provar que os imu noconjugados gue contêm veículos de elevado peso molecular fos sem capazes de localizar as células tumorígenas, in vivo. (Cf. Ford et al., Localization And Toxicity Study Of A Vindesin-Anti-CEA Conjugate In Patients With Advanced Câncer, Br. J. Câncer, 47(1983) 35-42, que demonstra a localização de conjuga dos anticorpo-fãrmaco directamente conjugados com células tumorígenas in vivo).

Descreveram-se, deste modo, a conjugação de antraciclinas aos anticorpos, através da utilização de ligações e de veículos específicos. Tal como se referiu anteriormente, a uti lização destes imunoconjugados apresenta desvantagens distintas, dependendo da ligação ou do veículo específicos utilizados.

Também se descreveram determinados conjugados, ligan do-toxina. Na patente de invenção norte-americana n? 4 545 985, concedida a Pastan, descreve-se um conjugado de exotoxina, em que se liga a exotoxina de Pseudomonas (PE) a EGF numa relação de 1:2, para utilizar contra células que possuem numerosos receptores de EGF. Também se prepararam conjugados EGF-ricina A e EGF-toxina diftérica; Caxley e outros, Epidermal Growth Fac tor-Toxin A Chain Conjugates: EGF-Ricin A Is A Potent Toxin While EGF-Diphtheria Fragment A Is Nontoxic”, Cell, 22(1980) 563-570 e Shimizu et al., A Cytotoxic Epidermal Growth Factor Cross-Linked To Diohtheria Toxin A-Fragment, FEBS Letters,

118 (No.2)(1980) 274-78). Além disso, prepararam-se as proteínas de fusão da exotoxina de Pseudomonas, utilizando proteínas, polipéptidos e factores do crescimento, tais como TGF- , IL-2, IL-β e CD4 (Pastan et al., Novel Cytotoxic Agents Created By The Fusion Of Growth Factor And Toxin Genes, Fourth Internatl. Conference On Monoclonal Antibody Immunoconjugates For Câncer,

p. 36 (30 de Março a 1 de Abril, 1989); Lorberboum et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85(1988) 1922-1926; Chaudhary et al,,

Proc. Nátl, Acad. Sbi. USA, 84(1987) 4538-4542; Siegall et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 85/1988) 9738-9742; e Chaudhary et

-9al., Nature, 335 (1988) 369-372). Preparou-se uma proteína de fusão de toxina diftêrica-hormona estimulante dos melanócitos (Murphy et al., Genetic Construction, Expression And Melanoma-Selective Cytotoxicity Of A Diphtheria Toxin-Related «X-Melanocyte-Stimulating Hormone Fusion Protein, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83/1986) 8258-8262, e patente de invenção nor te-americana n9 4 675 382, concedida a Murphy). No entanto, os conjugados de ligandos constituídos por proteínas de toxinas podem mostrar-se imunogénicos em hospedeiros xenogénicos.

Para alem de tudo isto, ligaram-se quimicamente antra ciclinas, tais como ADM ou DAU, a determinadas proteínas ou a ligandos polipeptídicos, tais como a transferrina (pedido de patente de invenção britânica n9 2116979A) e a melanotropina (Varga e outros, Melanotropin-Daunomycin Conjugate Shows Receptor-Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Melanoma Cells, Nature, 267(1977) 56-58). 0 pedido de patente de invenção PCT Wo 88/00837 descreve a ligação de EGF através de um veículo polimérico a uma substância citotôxica, tal como DAU, e as patentes de invenção norte-americanas n9 4522750 e n9 4 590 001 descrevem a ligação de transferrina a um alcaloide de vinca e â platina, respectivamente.

O fármaco citotôxico que se devera utilizar no imunoconjugado deverá libertar-se através de um mecanismo de libertação condicional, isto ê, o fármaco citotôxico devera ser libertado num sítio específico, e não por uma hidrólise gradual, não específica do sítio. Pos-se a hipótese da translocação de imunoconjugados especiais para os lisossomas (deDuve, Lysosomes Revisited, Eur. J. Biochem., 137(1983) 391-397), que era ligeiramente acido (pH 5,0 a 5,5) (Poznansky e Juliano, Biolo

-10ζ gical Approach.es to the Controlled Delivery of Drugs: A Criticai Peview,

Pharmacol. Pev., 36/1984) 277-336) . A utilização de condições acidas para libertação do farmaco foi referida no desenvolvimen to dos ligantes cis-aconitílicos para ADM (Shen e Reiser, Cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin and Macromolecular Carriers:

A Model of pH-sensitiye Linkage Releasing Drug From a Lysosomotrophic Conjugate,' Biochem. Biophys/ Res. Coromun,, 102 (1981)

1048-1054 e Yang e Reisfeld, Doxoruhicin Conjugates With a Monoclonal Antibody Directed to a Human Melanoma-Associated Proteoglycan Suppresses the Growth of Established Tumor Xenografts in Nude Mice, Proc. Natl. Acad. Sei., 85/1988) 1189-1193), e de ligantes cetãlicQs â toxina diftêrica (Srinivasachar e Neville, New Protein Cross-Linking Reagents That Are Cleaved by Mild Acid, Biochemistry 28(1989) 2501-2509).

Greenfield e outros descreveram recentemente a formação de imunoconjugados sensíveis aos ácidos que continham o composto acil-hidrazina, 3- (2-piridilditio)-propionil-hidrazida, conjugado através de uma ponte de acil-hidrazona com a posição 13-ceto da molécula de antraciclina, e a conjugação deste derivado de antraciclina com uma molécula de um anticorpo ou de um ligando (Greenfield et al., pedido de patente de inven ção europeia n? 328 147, publicado a 16 de Agosto de 1989).

Seria útil proporcionar compostos bifuncionais adicio nais que possuíssem uma estrutura susceptível de permitir ligações sensíveis aos ácidos, entre as moléculas, incluindo moléculas para alvejar e moléculas reagentes, para utilização na terapia, in vivo.

SUMARIO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção proporciona novos compostos bifun cionais que se conjugam facilmente com moléculas uteis e métodos para a preparação dos referidos compostos bifuncionais. Os compostos bifuncionais contêm um grupo reactivo piridinilditio ou orto-nitrofenilditlo, A presente invenção proporciona também novos conjugados que contêm moléculas citotôxicas ligadas aos compostos bifuncionais para formarem derivados das moléculas citotôxicas e, subsequentemente, conjugados contendo o derivado citotôxico ligado a uma molécula susceptível de reagir com uma população de células alvo, que se pretende aniquilar. Esta molécula para alvejar pode ser uma proteína, tal como um anticorpo ou um ligando, tal como a bombesina ou EGP.

De acordo com um aspecto da presente invenção, sintetiza-se um novo composto bifuncional, a N-/* 2-Γ (2-piridinil)-ditio y-et±l /-hidrazinocarboxamida (composto 10) , e utiliza-se para formar um derivado semicarfaazona de ADM que contêm uma ligação de semicarbazcna na posição C-13 de ADM, que funciona como o sítio de ligação de ADM ao composto 10.

De acordo ccrn um outro aspecto preferencial, sintetiza-se e utiliza-se um novo composto bifuncional, a di-hidrazida (2-piridinil)-ditio J^-etil J^-amino ^/-carbonilj/-carhõnica (composto 11a), para formar um derivado carbazona de ADM contendo uma ligação de carbazona na posição C-13 de ADM que funciona como sítio de ligação de ADM ao composto 11a.

De acordo com um outro · aspecto preferencial, sintetiza-se e utiliza-se um novo composto bifuncional, a N-/* 4-/* (2-piridinil)-ditioJ?—2-butenil f-bidrazinocarbotioamida (com—

posto 12), para formar um derivado tio-semi-carbazona de ADM contendo uma ponte de tio-semicarbazona na posição C-13 de ADM, que funciona como sítio de ligação do ADM ao composto 12.

De acordo com um outro aspecto preferencial, sinteti za-se um novo composto bifuncional, o hidrazinocarboxilato de 2-/ (2-piridinil)-ditio /-etilo (composto 13), e utiliza-se para preparar um derivado hidrazona de ADM, contendo uma ligação de carboxilato-hidrazona na posição C-13 de ADM, gue funciona como sitio de ligação do ADM ao composto 13,

De acordo com um outro aspecto preferencial, sinteti za-se um novo composto bifuncional, a N-·/ 2-f (2-piridinil)-ditio /-etil /-hidrazinobenzamida (composto 15), e utiliza-se para preparar um derivado aril-hidrazona de ADM contendo uma ponte de aril-hidrazona na posição C-13 de ADM, que funciona como sítio de ligação de ADM ao composto 15,

De acordo, ainda, com outro aspecto da presente inven ção, liga-se um certo número de moléculas dos novos derivados de antraciclina anteriormente referidos a uma população de cêlulas alvo escolhidas. De preferência, a molécula que reage com as células ê um anticorpo, tratando-se de um anticorpo monoclonal. Cada molécula de derivado de antraciclina se liga ao anticorpo através do composto bifuncional ligado â antraciclina através de uma ponte de semicarbazona, carbazona, tio-semicarbazona, carboxilato-hidrazona ou aril-hidrazona, na posição C-13 da molécula de antraciclina para formar os novos imunoconjugados da presente invenção. XJm aspecto preferencial da presente invenção envolve, por exemplo, a síntese de uma nova molécula derivada de adriamicina que ê condensada com am anticorpo tiolado, originando a ligação da antraciclina ao anticorpo através do composto bifuncional. A ponte de hidrazona formada na posição C-13 do ADM funciona como o sitio de ligação ao ADM. De acordo com este aspecto, esta presente uma ligação de dissulfu reto, no composto bifuncional, através da qual este se liga ao anticorpo. De acordo com outro aspecto preferencial, reduz-se a molécula do derivado de adriamicina (ADM ligada ao composto bifuncional) para formar um grupo sulfidrilo e condensa-se o derivado resultante com um anticorpo derivado de maleimida. Es tas operações conduzem ã formação de um imunoconjugado que pos. sui uma ponte de hidrazona Ν-substituída, como o sítio de ligação do composto bifuncional na posição C-13 de ADM e uma pon te tio-éter no composto bifuncional, através da qual este se encontra ligado ao anticorpo.

Ainda de acordo ccm um outro aspecto preferencial da presente invenção, os novos derivados de antraciclina podem ser ligados por covalência a ligandos, tais como bombesina, transferrina ou ECE, daí resultando a ligação da antraciclina ao ligando através de um composto bifuncional. Tal como nos ou tros aspectos anteriormente referidos, a antraciclina liga-se ao composto bifuncional através de uma ponte de hidrazona formada na posição C-13 da antraciclina, De um modo vantajoso, o ligando ê tiolado antes da ligação ao derivado de antraciclina

mas também pode ser ligado directamente aos ligandos que possuam grupos tiol livres endógenos.

Como se toma evidente, a partir destes aspectos, a presente invenção proporciona novos compostos bifuncionais e de rivados de antraciclina utilizáveis para a preparação dos conjugados da presente invenção.

Qs imunoconjugados da presente invenção têm uma rela-14ção molar antraciclina/anticorpo de pelo menos 1:1 e atê 10:1 e, de preferência compreendida, entre 4;1 e 10:1, e conservam

tanto a actividade do anticorpo como a actividade citôxica do fármaco para o aniquilamento das células alvo seleccionadas.

Os conjugados antraciclina-ligando aqui descritos têm, vantajo samente, uma relação antraciclina/ligando de pelo menos 1:1 e atê 10;l, de preferência compreendida entre 4:1 e 10;1, A pon-? te sensível ao ácido que se encontra presente no sítio de ligação da antraciclina ao composto bifuncional destes conjuga-? dos ê igualmente adequada para a libertação do fármaco activo sob condiçoes ácidas, tais como as que se encontram tipicamen te no interior de uma célula, como, por exemplo, nas vesículas lisossomais.

A libertação de adriamicina por hidrólise de cada um dos derivados anteriormente referidos, em função do pH, demons trou que os novos derivados apresentam uma larga gama de velocidades de libertação sob. condições ácidas, imitando o meio li sossomal. Estes derivados também demonstraram citotoxicidade como imunoconjugados com o anticorpo monoclonal 5E9 contra o receptor da transferrina.

Os compostos bifuncionais de hidrazina N-substituida contêm um radical hidrazina e um radical reactivo piridinilditio ou orto-nitrofenlldltio. Podem utilizar-se estes novos com postos bifuncionais para ligar diversas moléculas de modo a formarem conjugados úteis, A molécula que se pretende ligar ao radical hidrazina do composto bifuncional contêm um grupo car-?' bonilo livre ou um grupo que ê derivado de modo a conter um grupo carbonilo, tal como uma molécula reagente citotóxica, Quan do se liga a molécula que contêm o grupo carbonilo ao radical hidrazina do composto bifuncional, formasse uma ponte de hidra zona, que é uma ponte de semicarbazona, carbazona, tio-semicarbazona, carboxilato-hidrazona ou de aril-hidrazona, confor·*· me o composto bifuncional da presente invenção utilizado para formar o conjugado. A molécula que se pretende ligar S extremi

dade do composto bifuncional que contêm o radical piridinildi= tio ou orto-nitrofenjldltio contêm um grupo sulfidrilo livre ou um grupo que se pode derivar de modo a conter um grupo sul= fidrilo, tal como uma molécula de anticorpo ou um ligando que reage, de um modo preferencial, com os antigênios ou recepto= res das células alvo que se pretendem aniquilar, 0 radical pi ridinilditio ê removido durante a reacção do anticorpo com o composto bifuncional. A molécula que contêm um grupo sulfidri10 livre ê, de preferência, uma molécula reagente citotêxica, tal como uma antraciclina susceptível de aniquilar as células seleccionadas, Num aspecto preferencial/ a ponte de hidrazona que une a molécula reagente citotoxica ao composto bifuncio= nal permite a libertação por sensibilidade ao pH do reagente citotôxico.

Podem utilizar=se os conjugados da presente inven= ção, formados por ligação de moléculas aos compostos bifuncionais da presente invenção, em composiçoes farmacêuticas, tais como as que sao constituídas por uma quantidade eficaz de pelo' menos um imunoconjugado da presente invenção e por um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também engloba métodos para a libertação selectiva de reagentes citotôxicos para uma população seleccionada de células alvo que se deseja eliminar, assim como métodos para o tratamento de um mamífero de um modo aceitável em farmácia com uma quantidade

-16eficaz sob o ponto de vista farmacêutico das composições da pre sente invenção.

Vantajosamente, os compostos, conjugados, composições farmacêuticas e métodos aqui descritos proporcionam uma via útil para a projecção de reagentes citotõxicos sobre uma população seleccionada de células, proporcionando o aniquilamento preferencial dessas células alvo no tratamento de doenças, tais como cancros e outros tumores, infecçoes virais nãò citocidicas e outras infecções patogénicas e distúrbios de auto-imunidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1, representa as estruturas dos novos deriv vados de adriamicina da presente invenção formados por reacção dos compostos hifuncionais da presente invenção com adriamicina, tal corno se descreve nos Exemplos 1-5,^vinfra.

A Figura 2, representa de uma forma esquemática a síntese do composto bifuncional N·*·/* (2Tp±r±âinil)^ditio -etil j7-hidrazinocarboxamida, utilizado para preparar o derivado semicarbazona de adriamicina, tal como se descreve no Exemplo 1, infra.

A Figura 3, representa, de uma forma esquemática, a síntese do composto bifunciçnal di^hidrazida 77^7 C2-piridinil)-ditio J^etil J^amino J^carhonil J^-carbônica, utili zado para preparar o derivado carbazona de adriamicina, tal co mo se descreve no Exemplo 2, infra.

A Figura 4, indica de uma forma esquemática a síntese do composto bifuncional 4^£ (2=piridinil)-ditio J⁷-2-butenil j7-hidrazinocarbotioamida, utilizado para preparar o deri

-17Ζ vado tio-semicarbazona de adriamicina, tal como se descreve no Exemplo 3, infra.

A Figura 5 indica de uma forma esquemática a síntese do composto bifuncional hidrazinocarboxilato de 2-/* (2-piridinil)-ditio 7-etilo, utilizado para preparar o derivado carboxi lato-hidrazona de adriamicina, tal como se descreve no Exemplo 4, infra.

A Figura 6 indica de uma forma esquemática a síntese do composto bifuncional N-/* (2^piridinil).-ditio J^etil j7=-4-rhi=· drazinobenzamida, utilizado para preparar o derivado aril-hi-^· drazona de adriamicina, tal como se descreve no Exemplo 5, infra.

A Figura 7 mostra de uma forma esquemática a preparação de imunoconjugados de acordo com a presente invenção, utilizando um anticorpo tiolado com SPDP, que se fez reagir com os compostos bifuncionais da presente invenção, tal como se descreve no Exemplo 7, infra.

A Figura 8 indica de uma forma esquemática a preparação de imunoconjugados de acordo com a presente invenção, utilizando um anticorpo tiolado com 2-IT, que se fez reagir com os compostos bifuncionais da presente invenção,

A Figura 9 indica de uma forma esquemática a preparação de imunoconjugados de acordo com a presente invenção que possuem uma ligação tio-éter entre o anticorpo e o composto bifuncional reduzido, utilizando um anticorpo que se fez reagir com SMPB para se adicionar grupos maleimida.

A Figura 10 é um gráfico de libertação de adriamicina em função do tempo, apôs a incubação de derivados de adriamicina da presente invenção, em tampão, a pH 4,5, tal como se des-18creve no Exemplo 6, infra

A Figura 11 representa um gráfico da libertação de adriamicina em função do tempo, apõs a incubação de derivados de adriamicina da presente invenção, em tampão, a pH 5,0, tal como se descreve no Exemplo 6, infra.

A Figura 12 ê um gráfico de libertação de adriamicina em função do tempo, apõs a incubação de derivados de adriamicina da presente invenção, em tampão, a pH 7,4, tal como se descreve no Exemplo 6, infra.

A Figura 13 ê um gráfico da libertação de adriamicina a partir do derivado carbazona de adriamicina, e de um imunoconjugado 5E9 deste derivado, em função do tempo apõs a incubação em tampão, a pH 4,5, tal como se descreve no Exemplo 7, infra.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO

No sentido de tornar mais compreensível a presente in venção fornece-se a descrição pormenorizada, que se segue:

Ά presente invenção refere-se a novos compostos bifun cionais de hidrazina N-substituídos N-/' 2-/* (2-piridinil)-ditiq7-etil y-hidrazinocarboxamida (composto 10) ; di-hidrazida 2-/* /* £ (2-piridinil)-ditio J/-etil -amino _7-carbonil J-carbónica (composto 11a); (2-piridinil) -ditio _7-2-butenil

-hidrazinocarbotioanida (ccmposto 12) ; hidrazino-acàrbcxilato de 2-/* (2-piridinil)-ditio *7-etilo (ccmposto 13); e N-/'2-/* (2-piridinil)-ditio J^-etil J⁷'-4-hidrazinobenzamida (composto 15) . uti lizam-se estes compostos para se formarem novos derivados hidra zonas N-substituídos, de reagentes citotõxicos, tais como as an traciclinas, e para se forra arem imunoconjugados,, quando associa

19- .

dos a um anticorpo. A presente invenção também se refere a processos para a preparação dos ccmpostos bifuncionais, dos deriva dos cites icos e dos imunoconjugados e a composições farmacêuticas e a métodos para a libertação dos reagentes citoxicos nas células alvo, para tratar doenças, tais cano cancros e outros tumores, infecções virais não citocídicas ou outras infecções patogênicas e distúrbios de carácter auto-imunitârio.

Os conjugados são constituídos pelo menos por uma molécula de um derivado citotõxice? ligada por um dos ccmpostos bifuncionais a pelo menos uma molécula reactiva am relação â população de células alvo. Esta molécula pode ser uma proteína, tal como um anticorpo, de preferência um anticorpo monoclonal, ou um ligando, tal como a bombesina ou EGF.

Assim, de acordo com um dos aspectos preferenciais, sintetizou-se o novo composto, N-/” 2-/^- (2-piridinil)-ditio J etily-hidrazinocarboxamida, composto 10, e utilizou-se para preparar o derivado semicarbazona de ADM que contem uma ponte de semicarbazona na posição C-13 de ADM. De acordo com outro aspecto preferencial, sintetizou-se o novo composto di-hidrazida 2-/ 2-/ (2-piridinil)-ditio J^-etil J^-gnino/^-carbonil

-carbónica, o composto 11a, e utilizou-se para preparar o derivado carbazona de ADM que tem uma ponte de carbazona na posição C-13 do ADM.

De acordo cem outro aspecto preferencial, sintetizou-hidrazinocarbotioamida, o composto 12, e utilizou-se para preparar o derivado tio-sam,icarba,zona de ADM que tem uma ponte de tio-semicarbazona na posição C-13 de ADM. Ainda de acordo ccm ou tro aspecto preferencial da presente invenção, sintetizou-se o

-se o novo cem posto N-Z” 4-/* (2-piridinil) -ditio J7-2-butenil J7-20-

ccmposto hidrazino-carbcxilato de 2-/* (2-piridin.il) -ditio /-eti lo, o ccm posto 13, e utilizou-se para preparar o derivado hidra zona de ADM que tem uma ponte carboxilato-hidrazona na posição C-13 de ADM. Ainda de acordo cem um outro aspecto preferencial

-piridinil)-ditio yetil^7-4-hidrazinobenzamida, o composto 15, para preparar o derivado aril-hidrazona de ADM que tem uma ponte aril-hidrazona na posição C-13 de ADM.

De acordo ccm outros aspectos, a presente invenção refere-se a conjugados que contêm pelo menos uma molécula reactiva para uma população de células alvo, tal ccmo um anticorpo ou ligando, e pelo menos uma molécula citotôxica que aniquila as células ligada aos novos compostos bifuncionais da presente invenção. Deste modo, de acordo cem outro aspecto preferencial, a presente invenção refere-se a imunoconjugados que contêm um anticorpo dirigido contra uma população de células alvo, por exemplo uma população de células tumorais tendo o anticorpo di versas moléculas de derivados de antraciclina ligadas â sua es trutura. As moléculas dos derivados de antraciclina encontram-se ligadas por covalência a um anticorpo tiolado, de modo a que se forme uma ponte de dissulfureto entre cada uma das molê cuias de fármaco e um anticorpo, encontrando-se o composto bifuncional ligado ao derivado de antraciclina por uma ligação de hidrazona na posição C-13 da antraciclina.

Pode ligar-se mais do que uma molécula de fármaco a cada uma das moléculas de anticorpo, utilizando um composto bi funcional da presente invenção por molécula de fármaco, A rela ção molar de 4:1 indica que 4 moléculas de fármaco Cisto ê, derivado de antraciclina) estão ligadas a cada anticorpo.

-21De acordo com un dos aspectos significativos, reduz-se o derivado de antraciclina para formar um grupo sulfidrilo e condensa-se este derivado de ADM com um anticorpo modificado por maleimida, formando-se uma ponte de tio-êter entre o anticorpo e a antraciclina.

Estes conjugados permitem a libertação de antracicli na não modificada, sensível ao pH, evitando modificações estru turais do fármaco que podem originar uma redução de citotoxici dade.

De acordo ainda cem um outro aspecto preferencial, a presente invenção engloba os conjugados antraciclina-ligando constituídos por um ligando, tal como um ligando polipeptídico ou um ligando peptídico, que reage com um ou mais reeeptores associados com a superfície celular da população de células al vo, tendo o ligando pelo menos uma molécula de um derivado de antraciclina ligada à sua estrutura. A antraciclina liga-se por covalência ao péptido através de um composto bifuncional que se encontra ligado â antraciclina na posição C-13 da antra ciclina por meio de uma ponte de hidrazona. De acordo com um aspecto alternativo, reduz-?se o derivado de antraciclina para formar um grupo sulfidrilo e, depois, condensa-se este derivado com um ligando modificado por maleimida.

Podem preparar-se os cçnjugados da presente invenção, passo a passo, pela formação inicial de um novo composto de hi drazina N-substituído que se utiliza para se formar um derivado hidrazona do reagente citotçxicc que se faz, depois, reagir com uma proteína ou ligando, com a especificidade adequada (ver Hardy, Purification And Coupling Of Tluorescent Proteins Tor Use In Tlow Cytometry”, in Handboçk Qff Experimental immunology,

-22Volume 1; Immunochemistry, D.M. Weir et al., (Eds.), pp. 31.4-31.12 (4 Ed., 1986), para a discussão de técnicas convencionais de acoplamento de anticorpos e Varga et al., supra, para a preparação de conjugados de ligandos).

comprimento do composto bifuncional que liga o rea gente citotôxico ao componente reactivo das células dos conjugados, pode variar conforme o composto bifuncional se encontre ligado através de uma das pontes de hidrazona anteriormente re feridas ao grupo earbonilo da molécula ou a moléculas reagente (s) citotõxica (s).

Qs reagentes citotôxicçs que constituem os conjugados da presente invenção podem ser qualquer molécula que contenha um grupo earbonilo. Estes reagentes incluem, mas não se limitam a, antraciclinas: adriamicina, daunomicina, detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, esorrubicina, 4'-THP-adriamicina, AD-32 e 3'-desamino-3(3-ciano-4*morfolinil)-do xurrubicina (Casazza,Experimental Studies On New Anthracycli nes, in Adriamycin: Its' Expandjng Role In Câncer Treatment,

M, Ogawa et al., (Eds.), pp, 439-52 (Excerpta Medica, 1984)).

Deve ter-se em consideração que molécula reactiva em relação âs células, â qual esta ligado o reagente citotçxico, no conjugado através de um composto bifuncional, pode ser molécula que se ligue ou que reaja ccm uma população de células que se pretenda eliminar e que pçssua um grupo sulfidrilo ou que possa ser modificada de modo a conter um grupo sulfidrilo ou um grupo maleimida. Estas moléculas incluem, mas não se limitam a, proteínas de elevado peso molecular (geralmente superior a 10 000 daltons), tais como anticorpos, proteínas de menor peso molecular (geralmente inferior a 10 000 daltons), li-23gandos polipeptídicos ou peptídicos e ligandos não peptidilicos.

Os anticorpos gue constituem os imunoconjugados da presente invenção podem ser qualquer anticorpo que reaja com uma população especifica de células alvo que se pretenda eliminar ou aniquilar. Os exemplos desses anticorpos incluem, em boram não se limitem apenas a estes, os anticorpos que se ligam a antigénios associados a tumores, tais corno os antigénios que se encontram nos carcinomas, melanomas, linfcmas, sarcomas õsseos ou de tecidos moles, assim como outros tumores, anticor pos que se liguem a antigénios associados a vírus ou a outros antigénios associados a patogenias e anticorpos que se liguem a antigénios anormais da superfície celular. Estes anticorpos podem ser policlonais ou, de preferência, monoclonais e podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade (DeWeger et al., Eradication Of Murine Lymphoma And Me lanoma Cells By Chloramhucil-Antibody Complexes, immunologicãlRev, 62:29-45 (1982) (e anticorpos monoclonais específicos de tumores produzidos e utilizados em conjugados); Yeh et al., Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclo nal Antibody-, Proc. Natl. Acad. Sei,, 76.(1979) 2927-31, e Brown et al., Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 With. Monoclonal Antibodies, J. Immunol,,

127 No.2)(1981) 539-46 (anticorpos monoclonais específicos de tumores produzidos)). Pode utilizar^se, por exemplo, o anticor po monoclonal L6 específico das células do carcinoma do pulmão humano ou o anticorpo monoclonal 791T/36 especifico das células do sarcoma osteogênico.

Para alêm disso, podem utilizar^se anticorpos não in

-24ternàlizantes ou, de preferência, anticorpos internalizantes. 0 termo anticorpo, tal como ê utilizado neste pedido de patente de invenção, inclui as moléculas ou fragmentos de anti-

corpos intactos que contêm a região de ligação activa da mole cuia do anticorpo, por exemplo, fragmentos Fab ou Fíab'^. Se se utilizarem anticorpos monoclonais, os anticorpos podem ser, embora não se limitem apenas a estas origens, de rato, de ori gem humana ou anticorpos quimera.

Também se deve considerar, no que se refere â presen te invenção, que o termo ligando engloba qualquer molécula que se ligue especificamente a um receptor associado à superfície celular de uma população de células alvo. Os ligandos preferenciais, que se podem utilizar para formar os conjugados antraciclina-ligando da presente invenção englobam, mas não se limitam a, proteínas, polipéptidos ou ligandos peptídicos, tais como a transferrína, o factor do crescimento epidérmico (EGF), bombesina, gastrina, o péptido de libertação da gastrina, o factor do crescimento derivado das plaquetas, IL-2, IL-6, factores do crescimento de tumores TGF-^fe TGF-y3, factor do crescimento da vacínia (VGF), insulina e factores do crescimento I e II semelhantes a insulina. Outros ligandos não peptidílicos englobam esteroides, hidratos de carbono e lectinas.

Assim, a molécula de alvejamento que reage com as células, corno, por exemplo, wa anticorpo ou um ligando dos con jugados da presente invenção, actua de modo a libertar as jho lêculas reagentes citotoxicas na população especifica de células alvo com as quais o anticorpo ou o ligando reage. Por exem pio, um anticorpo dirigido contra nro antigénip que se encontra na superfície de células tumorígeras ligar^se-â a estas cêlu-25las e libertara os reagentes citotôxicos nestas células tumorí genas ou, um anticorpo dirigido contra uma proteína do Vírus da Imunodificiência Humana (HIV) que causa a SIDA (AIDS) libertará os seus reagentes citotôxicos nas células infectadas por HIV. De modo semelhante, devido ao facto de as células de tumor, tais como carcinomas, expressarem preferencialmente de terminados receptores a alta densidade, tais como o receptor de EGF, ligar-se-â um ligando, tal como EGF, e libertara o rea gente citotôxico nas células de carcinoma,

A libertação do reagente citotôxico no interior ou no sítio da população de células particular ccm a qual o anticorpo ou o ligando reage, origina o aniquilamento preferencial dessas células. Deste modo, ê evidente que os conjugados da presente invenção são utilizáveis no tratamento de qualquer doença em que se pretenda eliminar uma população de células es pecifica que tenha um antigénio ou receptor da superfície de células que permita a ligação do conjugado. As doenças para as quais os presentes conjugados são. uteis englobam, embora não se limitem apenas a estas, os cancros e outros tumores, infecções virais não citocídicas e outras infecções patogênicas, tais como a SIDA (AIDS), herpes, CMV (citcmegalovirusj, EBV (Virus de Epstein Barr) e SSPE (pamencefalite esclerotica subaguda) e artrite reumatôide.

Sem a pretensão de limitar a presente invenção por qualquer teoria, crê-se. que as moléculas de reagente citotõxico ligadas ao anticorpo ou ao ligando, isto ê, sob a forma de conjugados da presente invenção, são libertadas nas células al vo que se pretende aniquilar através da especificidade do anti corpo ou do ligando, podendo, depois, entrar na célula através .4

-26da mesma via endocitica que conduz a internalização dos anti corpos ou ligandos não conjugados ligados â membrana (Pastan et al., Pathway Qf Endocytosis, in Endocytosis, (I. Pastan et al., Eds.)Plenum Press, 1985 pp. 1-44. Uma vez no interior da célula, as vesículas endocíticas que contêm o conjugado, fundem-se com os lisossomas primários para formar os lisossomas secundários (Embleton et al., supra, p. 334). Devido ao facto das moléculas citotóxicas se ligarem ao componente anticorpo ou ao componente ligando do conjunto através de pontes de hidra zona sensíveis aos ãcidos, a exposição do conjugado ao meio acido das vesículas endocíticas e dos lisossomas origina a libertação do reagente citotôxico, a partir do conjugado. Para além disto, crê-se que o reagente libertado se encontre na for ma de um reagente relativamente não modificado, capaz de exercer uma actividade citotôxica completa. Deste modo, a ponte sensível ao ãcido, do conjugado, ê altamente vantajosa para a libertação do reagente citotôxico no interior das células alvo, intensificando a citotcxicidade do conjugado contra essas cêlu las.

Em alternativa, pode clivar-se a ponte de hidrazona, sob condiçoes acidas e redutoras, no meio externo imediato ou que circunda as células alvo, por exemplo, no sítio de um tumor, sendo o fármaco libertado absorvido pelas células tumorígenas«

Exemplificam-se os compostos bifuncionais derivados de reagentes citotôxicos e conjugados da presente invenção e métodos para a sua preparação, de acordo com os aspectos pre ferenciais nos quais se utilizam antraciclina e adriaigicina.

De um modo geral, prepararam-se os derivados carbonilicos de

-27adriamicina tratando oloridrato de adriamicina com um dos cin co compostos bifuncionais da presente invenção, em metanol à temperatura ambiente. Descobriu-se que a adição de quantidades catalíticas de ãcido trifluoroacético (TFA) acelerava as reacções de condensação, de tal modo que a reacção se encontrava completa após agitação durante uma noite. Produziram-se poucos produtos secundários nestas reacções e para se efectuar o pro cedimento de purificação foi apenas necessário a precipitação com acetonitrilo. Estes procedimentos simplificados representam um melhoramento sobre os previamente referidos por Green field et al., supra, uma vez que são mais fáceis de executar, mais económicos, mais rápidos e proporcionam novos compostos bifuncionais, adicionais, para a conjugação de diversas moléculas.

De acordo com um primeiro aspecto, preparou-se um novo composto bifuncional fazendo reagir, em primeiro lugar, cloreto de metoxicarbonilsulfenilo com oloridrato de 2-aminoetanotiol e, depois, com 2-mercaptopiridina, para formar cloridrato de 2-/ (2-piridinil)-ditio J7-etanamina (ver Fig,2). Depois, fez-se reagir este composto com fosgénio, na presen ça de trietilamina (TEA) e, depois, com carbazato de t-butilo, para formar N-/” 2-/” (2-piridinil)-ditio j7-etil 7~2-(tert-buto xi-carbonil)-hidrazinocarboxamida, Em seguida, dissolveu-se a hidrazinocarboxamida em TFA para formar N-/*2—/* (2-piridinil)-ditio 7 -etil-hidrazinocarboxamida, composto 10, uma semicarbazida, que depois se fez reagir com cloridrato de adriami cina para formar o derivado semicarbazona de ADM, contendo um radical reactivo, piridinilditio, composto 1, Fig.l.

De acordo com outro aspecto preferencial, preparou-28-se um novo composto bifuncional de carbazida (Figura 3) . Fez^ -se reagir o composto carbazato de t-butilo com trifosgênio, na presença de TEA. Depois, adicionou-se cloridrato de 2-(2-piridinilditio)-etanamina, para formar a di-hidrazida 2-///2-/ (2-piridinil)-ditio/-etil /-amino /-carbonil -2,2’-bis-(tert-butoxicarbonil)-carbónica. Adicionou-se este composto intermédio a ãcido trifluoroacético para se formar a di-hidrazida 2-/^- //2-/ (2-piridinil) -ditio /-etil /-amino J-carbonil /-carbónica, composto 11a, que depois se adicionou a cloridrato de adriamicina para formar o derivado carbazona de ADM (composto 2, Figura 1), que continha um radical piridi niltio reactivo.

Ainda de acordo com um outro aspecto preferencial, formou-se um novo composto bifuncional tio-semicarbazida (Figura 4). De acordo com este aspecto, fez-se reagir ftalimida de potássio com l,4-dibromo-2-buteno para se formar o 1-bromo-4-(N-ftalimido)-2-buteno. Fez-se reagir este composto com tio acetato de potássio para formar o 1-(acetiltio)-4-(N-ftalimido) -2-buteno, que se fez reagir, depois, com hidrazina e se tratou com cloreto de metoxicarbonilsulfenilo, seguido de 2-mercapto-piridina para formar o cloridrato de l-amino-4-/^- (2-piridinil)-ditio /-2-buteno, Combinou-se este composto com TEA, seguido de tionocarbonato de di-2-piridilo e, depois, adi cionou-se, carbazato de t-butilo, para formar o derivado t-boc de N-/ 4-/ (2-piridinil)-ditio /-2-butenil /-hidrazinocarbotio amida, o composto 12, Dissolveu-se este composto em TFA, para se obter um composto sob a forma de uma goma, que se fez reagir, depois, com cloridrato de adriamicina e TFA para se formar o derivado tio-semicarbazona de ADM que tem uma ligação

-29de tio-semicarbazona na posição C-13 de ADM (composto 3, Figura 1) e que tem um radical piridinilditio reactivo.

Um outro aspecto preferencial envolve ainda a formação de um outro novo composto bifuncional (Figura 5). Fez-se reagir cloreto de clorocarbonil-sulfenilo com 2-mercaptoetanol e com 2-mercaptopiridina. Adicionou-se uma solução de car bonato de amónio, para formar o 2-f (2-piridinil)-ditio /-eta nol, sob a forma de um óleo incolor. Adicionou-se carbonildiimidazol e fez-se reagir a mistura com hidrazina para formar hidrazinocarboxilato de 2-f (2-piridinil)-ditio/-etilo, o composto 13. Fez-se reagir este composto com oloridrato de adriamicina e com TFA e, depois, com acetonitrilo, para formar o derivado carboxilato-hidrazona de ADM (composto 4, Figura 1) que tem uma ponte de carboxilato-hidrazona na posição C-13 de ADM e tem um radical piridinilditio reactivo.

Ainda de acordo com um outro aspecto preferencial, sintetizou-se um novo composto bifuncional (Figura 6). Preparou-se este composto, fazendo reagir acido £>-hidrazinobenzõico com pirocarbonato de di-t-butilo para formar acido 4-(N-boc-hidrazino)-benzõico, Fez-se reagir este composto com N-hidroxissuccinimida e DCC para se obter o éster N-hidroxissuç cinimídico; do ácido 4-N-boc-(hidrazino)-benzõico. Fez-se rea gir este composto com oloridrato de 2—f (2-piridinil)-ditio/-etanamina e TEA para obter a N-f 2-(2-piridinil)-ditio/-etil-4-N-boc-(hidrazino)-benzamida, Tratou-se, depois, este composto com TFA para formar N-.f 2-f (2-piridinil)-ditio/-etil/-4-hidrazinobenzamida, composto 15, que se fez depois reagir com oloridrato de adriamicina para formar o derivado aril-hidrazona de ADM, (composto 5, Figura 1) que tem uma pon-30te de aril-hidrazona na posição C-13 de ADM e tem um radical piridinilditio reactivo.

Utilizaram-se os novos derivados de hidrazona N-subs tituidos de ADM anteriormente referidos, para se formarem os conjugados da presente invenção. Fez-se reagir cada um dos derivados com um anticorpo monoclonal que tinha sido previamente tiolado com SPDP ou com 2-IT (2-iminotiolano), tal como se indica, respectivamente nas Figuras 7 e 8. Os imunoconjugados resultantes eram constituidos por moléculas de ADM conjugadas com o anticorpo monoclonal através do composto bifuncional ligado â posição C-13 de cada uma das moléculas de ADM através de uma ponte de hidrazona. Os compostos bifuncionais também contêm uma ponte de dissulfureto através da qual cada um deles se liga ao anticorpo.

Os compostos bifuncionais que unem o ADM e o anticor po podem ser constituídos por numerosos constituintes e ligações, desde que essas ligações incluam uma ponte de hidrazona sensivel a ãcidos, na posição C-13 da antraciclina, 0 anticorpo dos aspectos preferenciais foi o anticorpo monoclonal 5E9.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, combinam-se os novos compostos bifuncionais com adriamicina para formar um derivado que, em seguida, se faz reagir com o agente redutor ditiotreitol (DTT) ou tributilfosfina, para se obter um derivado de adriamicina contendo um grupo sulfidrilo (-SH) na extremidade do composto bifuncional. Faz-se, então, reagir este derivado com um anticorpo monoclonal ou com um ligando aos quais se ligaram grupos maleimida, por exemplo, fazendo reagir o anticorpo com butirato de succinimidil-4-(p-ma leimidofenilo) (SMPB), Forma-se um imunoconjugado que tem um composto bifuncional ligado por uma ponte de hidrazona na posi

-31ção C-13 de cada ADM e que tem uma ligação tio-éter, como par te da ligação ao anticorpo (ver Figura 9).

Deste modo, é evidente que o composto bifuncional que liga ADM e o anticorpo ou o ligando, pode ser constituído por diversos constituintes e ligações, desde que estas ligações incluam uma ponte de hidrazona na posição 13-ceto de ADM e um grupo piridinilditio ou orto-nitrofenilditio, reactivo para ligação do anticorpo.

De acordo com um outro aspecto, fazem-se reagir os novos derivados de ADM da presente invenção com um ligando, tal como bombesina, EGF ou transferrina, tendo-se derivado, em primeiro lugar, o ligando, de modo a possuir grupos tiol ou grupos maleimida. No caso da bombesina, introduz-se um resíduo de cisteina na extremidade amino do péptido para propor cionar um grupo sulfidrilo reactivo, para conjugação com o de rivado de ADM. No caso de EGF de murino, faz-se reagir o poli, péptido com SPDP para introduzir um grupo sulfidrilo reactivo na extremidade amino da molécula para conjugação. No caso da transferrina, faz—se reagir, em primeiro lugar, a proteína com 2-IT, para introduzir grupos tiol reactivos na estrutura da proteina. Em todos os casos, faz-se reagir, depois, o ligando tiolado com o derivado de ADM para formar um conjugado, de acordo com a presente invenção, antraciclina-ligando, que pos sui um composto bifuncional entre o ligando e ADM, encontran do-se o composto bifuncional ligado â posição C-13 de cada mo lêcula de antraciclina através de uma ponte de hidrazona.

Nestas condições, a presente invenção proporciona novos derivados hidrazona de antraciclinas, de formula geral

na qual

R^ representa um grupo NHCONH(CH₂)_nSSRg;

NHCONHNHCONH(CH_O) SSR_O;

ζ η o

NHCSNH(CH_n) CH=CH(CH_n) SSR₀;

m 2 n 8

NHCOO(CH-) SSR_O;

Zn o

NHArCONH(CH_O) SSR_Q?

ζ η o

NC0NH(CH₉) S-H;

NCONHNHCONH(CH₂)_nS-H ?

NHCSNH(CH₂)_mCH=CH(CH₂)_nS-H; NHCOO(CH₂)_nS-H; ou um grupo de fórmula geral NHArCONH(CH₂)_nS-H;

em que Rg representa um grupo de fórmula geral ou

X

X

-33na qual X representa um átomo de hidrogénio ou de ha logêneo ou um grupo nitro; e

Ar representa um grupo os símbolos men, representam números inteiros de 1 a 10, que podem ser iguais ou diferentes;

R₂ representa um grupo CHg, CHgOH, CHgOCO(CHg)gCHg,

OU CH_nOCOCH (OC-Hp.) „ ;

Z Ζ O 2

R₃ representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo

OCHg ou OH;

representa um grupo NHg, NHCOCFg, 4-morfolinilo,

3-ciano-4-morfolinilo, 1-piperidinilo, 4-metoxi-l-pi peridinilo, benzilamina, dibenzilamina, cianometilami na, ou l-ciano-2-metoxietilamina;

Rg representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo OH ou O-THP; e

Rg representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo OH^ _r com a condição de Rg não representar um grupo OH quan do Rg representa um grupo OH ou O-THP,

-34e formula geral

na qual

R^ representa um grupo NHCONH(CH₂)_nSSR_g;

NHCONHNHCONH(CH„) SSR„;

η o

NHCSNH(CH„) CH=CH(CH_) SSR_O;

m 2 η o

NHCOO(CH-) SSR_Q;

η o

NH-Ar-CONH(CH„) SSR_Q ;

z η o

NHCONH(CH„) S-H;

n

NHCONHNHCONH(CHg)_nS-H;

NHCSNH(CH_O) CH=CH(CH_) S-H;

m 2 n

NHCOO(CH₂) S-H ou

NH-Ar-CONH(CH_O) S-H 2 n

-35em que R_fi representa um grupo de fórmula geral ou

XX

em que X representa um ãtomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo NO;

Ar representa um grupo os símbolos m e n representam numeros inteiros de 1 a 10, que podem ser iguais ou diferentes;

R₂ representa um grupo CHg, CH₂OH, CH₂OCO(CH₂)gCHg OU CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂;

representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo OCH₃ ou OH;

r₄ e R₇ representam, cada um, independentemente, um ãtomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alquilo subs tituido, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, arilo, arilo substituido, aralquilo ou aralquilo substituído; ou R^ e R^ formam, conjuntamente com o ãtomo de azoto um anel tetragonal a heptacronal, podendo o referido anel encontrar-se eventualmente substituído; Rg representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo OH ou O-THP; e

R₆ representa um ãtomo de hidrogénio ou um grupo OH, com a condição de Rg não representar um grupo OH quan do Rg representa um grupo OH ou O-THP,

Os compostos bifuncionais anteriormente referidos e tos novos derivados hidrazona N—substituídos de antraciclina são compos

-36Os derivados hidrazona de antraciclina podem utilizar-se como novos reagentes citotóxicos e também como compostos intermédios na preparação dos novos conjugados da presente invenção.

Os derivados hidrazona de antraciclina encontram-se exemplificados, respectivamente, pela semicarbazona de adriamicina; car bazona de adriamicina; tio-semicarbazona de adriamicina; carbo xilato-hidrazona de adriamicina e aril-hidrazona de adriamicina, tal como se descreveu nos aspectos preferenciais aqui expostos.

Como se pode verificar a partir das formulas anterio res, os derivados hidrazona N-substituídos de ADM, da presente invenção, incluem hidrazonas N-substituídas de uma qualquer das diversas antraciclinas conhecidas, tais como a adriamicina, a daunomicina e a carminomicina. Para alem disso, os derivados incluem hidrazonas N-substituídas derivadas em sítios específicos da estrutura da antraciclina (por exemplo, hidrazona de 4’-ΤΗΡ-adriamicina e hidrazona de 3'-desamino-3’-(3-ciano-4-morfolinil)-adriamicina) ., Podem sintetizar-se estes últimos derivados, derivando, em primeiro lugar, a antraciclina para formar um análogo desejado e utilizando, depois, esse análogo, para preparar os derivados de hidrazona N-substituídos, da presente invenção. Os análogos conhecidos de antraciclina incluem os descritos nas patentes de invenção norte-americanas N9s, 4 464 529 e 4 301 277 (os análogos de antraciclina, 3’-desamino-3'-(4-morfolonilo) ou 3'-desamino-3'-(3-ciano-4-mor folinilo), nas patentes de invenção norte-americanas N9s 4 202 967 e 4 314 054 (análogos de antraciclina, 3’-desamino-3'-(1-piperidinilo) ou 3'-desamino-3’-(4-metoxi-l-piperidini lo), na patente de invenção norte-americana N9 4 250 303 (anã

logos de antraciclina N-benzilo ou Ν,Ν-dibenzilo), patente de invenção norte-americana N9 4 591 637 (análogos de antraciclina N-metoximetilo ou N-cianometilo e patente de invenção norte-americana N9 4 303 785 (análogos acetal de antraciclinas).

Deste modo, pode fazer-se reagir estes análogos conhe eidos de antraciclinas, tal como se descreveu anteriormente, para preparar novos derivados hidrazona de ADM que podem, depois, conjugar-se com uma molécula reactiva em relação a células, tal como um anticorpo ou um ligando, com uma especificidade desejada, tal como anteriormente se descreveu.

Como alternativa, pode produzir-se, em primeiro lugar um derivado hidrazona N—substituído não modificado (underivatized) de acordo com a presente invenção, tal como se descreveu, a partir da antraciclina não modificada (underiva tized) tal como adriamicina, daunomicina ou carminomicina, podendo, depois modificar-se este novo derivado para obter uma nova hidrazona N-substituída pretendida. Por exemplo, pode modificar-se o derivado de ADM semicarbazona no seu radical amino-açucar por aminação redutiva com 2,2'-oxidiacetaldeído uti lizando o procedimento descrito na patente de invenção norte-americana N9 4 646 529- para obter a semicarbazona de 3'-desa mino-3¹-(4-morfolino)-antraciclina. Para além disto, podem modificar-se os derivados de hidrazona na posição das fórmulas gerais I e II, tal como se encontra descrito na patente de invenção norte-americana N9 4 303 785 para obter derivados ace tal de hidrazona, tais como a hidrazona N-substituída 4'-THP-ADM,

Deve considerar-se que nestes procedimentos para a preparação das hidrazonas de acordo com a presente invenção, poder-se-á utilizar como compostos iniciais, hidrazonas N-subs

-38tituídas de outros reagentes, incluindo diversos agentes quimio terapêuticos. E que se podem utilizar outras antraciclinas alêm da ADM, tais como daunomicina ou carminomicina, para se obterem novos compostos, tais como hidrazona N-substituída de N-benzil-daunomicina ou hidrazona N-substituída de 3'-desamino-3¹-(4-morfolinil)-carminomicina e outros compostos utilizando os outros derivados, que também se encontram abrangidos pelo âmbito da presente invenção.

Avaliaram-se os derivados de antraciclina, de acordo com a presente invenção, em relação às velocidades de libertação do farmaco adriamicina, para valores de pH de 4,5, 5,0 e

7.4, tendo-se observado uma grande diversidade de velocidades de libertação. Para alêm disto, os imunoconjugados constituídos pelos derivados, conjugados com um anticorpo monoclonal foram avaliados em relação â libertação de adriamicina a pH

4.5. Ensaiaram-se os imunoconjugados quanto à sua toxicidade utilizando células Daudi, no ensaio de Inibição de Formação de Colónias revelando-se uma correlação entre a estabilidade dos derivados de hidrazona. Os imunoconjugados também apresentaram um largo intervalo de velocidades de libertação e demonstraram o aniquilamento de células comandado pelos anticorpos (toxicidade) para células tumorígenas, no ensaio de formação de colónias.

Os compostos de hidrazina N-substituídos da presente invenção, proporcionam compostos bifuncionais úteis para a ligação de moléculas, tais como reagentes de alvejamento e cito tóxicos. Quando se utilizam para ligar moléculas citotôxicas que contêm um grupo carbonilo, os compostos bifuncionais proporcionam uma ligação sensível aos ácidos que é clivada num de

terminado intervalo de pH para libertar o reagente citotoxico. Os imunoconjugados de antraciclina, de acordo com a presente invenção, parecem constituir um melhoramento em relação aos imu noconjugados anteriormente referidos, nos quais as antraciclinas eram directamente ligadas aos anticorpos através da porção amino-açúcar da antraciclina, uma vez que estes conjugados liga dos â porção amino-açúcar continham muitas vezes menores relações molares entre a antraciclina e o anticorpo, eram menos potentes do que ADM livre e apresentavam reduzidas propriedades de ligação do anticorpo (Arnon et al., immunological Rev., 62, Supra; Eurwitz et al., Câncer Res., 35, Supra, e Yamamoto et al., Supra). Para além disso, os estudos de estabilidade efectuados com os imunoconjugados da presente invenção, indicaram que a antraciclina se liberta sob condições acidas similares âs encontradas num meio celular. Deste modo, os imunoconjugados da presente invenção, podem libertar o fãrmaco relativamente não modificado, para ser fornecido âs células alvo. Os conjugados de acordo com a presente invenção proporcionam a libertação do fãrmaco num largo intervalo de valores de pH, o gue pode consti tuir uma vantagem para o fornecimento do fãrmaco.

Os compostos bifuncionais, os imunoconjugados da presente invenção e os métodos para a sua produção, encontram-se exemplificados, de acordo com os aspectos preferenciais, nos quais derivados de antraciclina e adriamicina são conjugados com o anticorpo monoclonal, 5E9, anti-receptor da transferrina.

A presente invenção engloba, também, as composições farmacêuticas, combinações e métodos para o tratamento de doenças, tais como cancros, e outros tumores, infecções virais não citocidicas ou outras infecções patogénicas e doenças de auto-40imunidade. De um modo mais especifico, a presente invenção engloba métodos para o tratamento de doenças em mamíferos, que consistem em administrar, de um modo farmacêuticamente aceitável, a um mamífero hospedeiro, uma quantidade eficaz sob o pon to de vista farmacêutico de pelo menos, um conjugado contendo antraciclina.

Como aspectos alternativos dos métodos da presente invenção, podem mencionar-se a administração, quer em simultâneo quer sequencialmente, de um certo número de conjugados diferentes, isto é, portadores de reagentes citotõxicos diferentes ou de diferentes anticorpos ou lígandos, para utilização em métodos de quimioterapia combinada.

Por exemplo, um dos aspectos da presente invenção, pode envolver a utilização de diversos imunoconjugados de antra ciclina, em que a especificidade do componente anticorpo do con jugado varie, isto ê, utilizam-se diversos imunoconjugados, pos suindo cada um deles um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio diferente ou a diferentes sítios ou epítopes do mesmo antigénio presente na população celular com interesse. O componente antraciclina destes imunoconjugados pode ser o mesmo ou pode variar. Este aspecto pode ser especialmente útil no tra tamento de determinados tumores em que as quantidades de diversos antigénios da superfície de um tumor ê desconhecida ou em que a população celular do tumor ê heterogénea na expressão do antigénio e se pretende ter a certeza de que é libertada uma quantidade eficaz de fãrmaco sobre todas as células do tumor no sítio do tumor. A utilização de diversos conjugados portadores de diferentes especificidades antigênicas ou de epítope, para o tumor aumenta a probabilidade de obtenção de fãrmaco suficiente no sitio do tumor. Adicionalmente, este aspecto é ainda impor-

-41tante para se atingir um alto grau de especificidade para o tu mor, devido ao facto de ser pequena a probabilidade de que os tecidos normais possuam todos os mesmos antigénios associados ao tumor (cf. Hellstrom et al., Monoclonal Antibodies to Two Determinants of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Com plement-Dependent-Cytotoxicity, J. immunol., 127 (No. 1) (1981)

157-160).

Como alternativa, podem utilizar-se alguns imunoconju gados diferentes, em que apenas o componente antraciclina varie. Por exemplo, pode ligar-se um determinado anticorpo â adria micina para formar um imunoconjugado e pode ligar-se a daunomicina para formar um segundo imunoconjugado. Depois, podem administrar-se ambos os conjugados a um hospedeiro que se pretenda tratar, e que se localizarão, devido ã especificidade do anticor po, no sítio da população celular seleccionada que se pretende eliminar. Ambos os fãrmacos serão libertados neste sítio. Quando existir alguma dúvida sobre a resistência de uma dada população celular ao fármaco, tal como no caso de um tumor, este aspecto da invenção pode ser importante devido ao facto de este método permitir a libertação de vários fãrmacos diferentes no sítio ou no interior das células alvo. Um aspecto adicional inclui a conjugação de mais do que um tipo de antraciclina com um determinado anticorpo para formar um imunoconjugado portador de uma variedade de moléculas de antraciclina diferentes ao longo da sua superfície, todas elas ligadas ao anticorpo através de uma ponte de hidrazona na posição 13-ceto. A administração de um imunoconjugado, de acordo com este procedimento, origina a libertação de vãrios fãrmacos diferentes no sítio ou no interior das células alvo. Para alêm disso, pode utilizar-se a

-42associação de conjugados de antraciclina-ligando, em gue o fãr maco pode ser dirigido contra uma população celular portadora de um antigénio específico, assim como contra um receptor espe cifico para o ligando, na sua superfície. Uma vez mais se pode utilizar um tipo de antraciclina ou vãrios fãrmacos diferentes nesta terapia combinada.

Podem administrar-se os conjugados da presente inven ção sob a forma de composições farmacêuticas utilizando modos de administração convencionais que incluem, embora não se limi tem à, administração por via intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou por administração directa no sítio de uma população celular seleccionada, tal como um tumor. No caso dos imunoconjugados, para tratamento in vivo pode ser útil uti. lizar conjugados constituídos por fragmentos de anticorpo, como os fragmentos Fab ou Ffab'^ ^ou anticorpos quimera.

As composições farmacêuticas da presente invenção que contêm os conjugados podem apresentar-se sob diversas formas de dosagem que incluem, mas não se limitam a, formas de dosagem só lidas, semi-sõlidas e líquidas, tais como comprimidos, pílulas, pós, soluções ou suspensões líquidas, supositórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injectãveis ou para infusão, A forma preferencial depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

Uma composição farmacêutica pode, ainda, conter veícu los convencionais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, conhecidos na especialidade, tais como proteínas séricas, desicj nadamente albumina sérica, substâncias tampão, tais como fosfatos, água, sais ou electrõlitos.

modo mais eficaz de administração e o regimen de do

-43sagem para as composiçoes que contem os conjugados, de acordo com a presente invenção, depende da gravidade e curso da doença, do estado de saúde do paciente, da resposta ao tratamento e do parecer do médico assistente. De acordo com o anteriormente exposto, as dosagens dos conjugados e de quaisquer compostos acompanhantes deverão ser estabelecidas para cada paciente. Todavia, uma dose eficaz de imunoconjugado de antraciclina da pre sente invenção pode estar compreendida entre cerca de 1 e cerca de 100 mg/m de antraciclina ou entre cerca de 500 e 5000 mg/m de anticorpo. Uma dose eficaz dos conjugados antraciclina-ligan ** do pode estar compreendida entre cerca de 1 e cerca de 100 mg/m^z 2 de antraciclina ou entre cerca de 1 e cerca de 100 mg/m de ligando .

Apresentam-se os exemplos que se seguem com o objecti vo de tornar mais compreensível a descrição da presente invenção.

Deverá ter-se em consideração que estes exemplos têm fins meramente ilustrativos e não devem ser entendidos como limitando de algum modo o âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS

Preparação de Compostos Bifuncionais e de Derivados de Adriamicina (ADM)

Os pontos de fusão (PF) foram determinados no aparelho para determinação do ponto de fusão de Fisher-Johns (Medford, MA) e não foram corrigidos. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foram obtidos num aparelho Bruker AM 300. Os es pectros de infra-vermelho (IV) processaram-se em pastilhas de KBr

-44ou em soluçoes de CHCl^ num aparelho P-E FTIR (Fourier Transfor mation Infrared) (Norwalk, CT), modelo 1800.Os espectros de mas sa (EM) e os espectros de massa de elevada resolução, (EMER) fo ram obtidos , respectivamente, com aparelhos Kratos MS25RFA e MS50TC (Manchester, Inglaterra). Efectuou-se a cromatografia rã pida utilizando gel de sílica Woelm (sílica-32-63) (Atlanta, GA). Efectuou-se a cromatografia de camada fina (TLC) em placas GHLF de gel de sílica Analtec (Newark, DE) ou placas de fase inversa, RPS-F, ambas de 250 microns. Para a cromatografia Líquida de Al ta Pressão (HPLC), de rotina, utilizou-se uma bomba P-E, 4 LC em serie, um detector de fluorescência HP 104 6A e uma coluna Phenomenex (Torrance, CA) 1B S11-5C18 (150 x 4,6 mm). A fase mo vel era constituída por uma mistura a 70:30 de metanol-tampão de fosfato (50 mmoles de fosfato de amónio, pH 4,4), com um cau dal de 1,5 ml/minuto. Para a determinação da velocidade de libertação, o sistema HPLC era constituído por duas bombas Waters, modelo 510, um dispositivo de auto-amostragem, modelo 712, e um controlador de gradiente, modelo 680. Efectuou-se a cromatografia numa coluna Waters C-18 e utilizou-se como fase móvel, respectivamente, uma mistura a 68:32 de tampão de formato de trietilamonio (0,05 M, pH 2,8) e de acetonitrilo. Detectou-se a fluorescência da adriamicina eluída utilizando um Detector de Fluorescência ABI, modelo 980 (excitação, 254 nm; emissão 550 nm) adquirido a Applied Biosystems, Ramsey, NJ. Utilizou-se tampão de acetato, para pH 4,5 e 5,0; utilizou-se tampão de solução sa lina de fosfato, para pH 7,4. O cloridrato de adriamicina foi adquirido a Sanraku Inc. (Japan). Todos os outros produtos químicos foram obtidos a partir de fontes comerciais.

As análises elementares foram realizadas no departa-45mento de análise da Bristol-Myers Squibb Company, Wallingford, CT e nos Oneida Research Services.

EXEMPLO 1

Preparação do Composto Bifuncional TO e do Derivado semjcarbazona de Adriamicina (ADM)

No exemplo que se segue, descreve-se um método para a preparação de um composto bifuncional e de um derivado semicarbazona de ADM que tem uma ponte de semicarbazona na posição C-13 de ADM. De acordo com este exemplo, preparou-se a N-/ 2-/*(2-piridinil)-ditioj-etil ^7-hidrazinocarbozamida, composto 10, de acordo com a sequência reaccional indicada na Figura 1. Fazendo reagir cloridrato de cisteamina com cloreto de metoxicarbonilsulfenilo seguido de 2-mercaptopiridina, obteve-se cio ridrato de 2-(2-piridinil)-ditioetanamina (composto 9, Figura 1). Fez-se reagir, por sua vez, este composto com fosgênio e carbazato de t-butilo, seguido de ãcido trifluoroacético (TFA), para se obter o produto desejado (composto 10).

Preparação de Cloridrato de 2-/* (2-piridinil)-ditio ^-etanamina

Agitou-se uma solução de cloreto de metoxicarbonilsul fenilo Zumach et al., Agnew Chem. International Edit. £ (1970) 54-63 J (6,33g, 50 mmoles) em metanol de grau HPLC (100 ml), sob atmosfera de azoto e arrefecimento com gelo. A esta solução, adi cionou-se, gota a gota, uma solução de cloridrato de 2-aminoetanotiol (5,7g, 50 mmoles) em metanol (50 ml). Apôs ter-se completado a adição, agitou-se a solução à temperatura ambiente (TA) durante 2 horas. Depois, evaporou-se o dissolvente e cristalizou -se o óleo residual em acetona (100 ml) obtendo-se um solido

-46(6,9g)

Dissolveu-se este sólido em metanol (100 ml). Arrefe ceu-se a solução em gelo, agitou-se sob atmosfera de azoto e tratou-se, gota a gota, com uma solução de 2-mercaptopiridina (3,82g, 34 mmoles) em metanol (50 ml). Agitou-se a solução durante 1 hora à temperatura ambiente, concentrou-se até um pequeno volume e diluiu-se lentamente com acetona atê se dar a cristalização. Após 1 hora no frigorífico, recolheu-se o sólido por filtração e secou-se, para se obter o composto cloridra to de 2-/(2-piridinil)-dltio y-etanamina (composto 9). Este composto foi descrito por Field et al,, J, Org. Chem., 29 (1964) 1632-1635 e Connor e Schroit, Biochem., 27 (1988) 848-851. O composto possuia as características seguintes: p.f. 123-125°C (5,8g, 52%). IV (KBr) 2952, 2913, 1610, 1575, 1559, 1451, 1115, 767 cm”¹. RMN (D₂O). & 8,46, 7,83, 7,34 (d, m, m 4H, Py) , 3,37 (t, 2H CH₂ ÇH₂ NH₂), 3,12 (t, 2H, SCHg CH₂). EM (m/e): 187 (corresponde a /'M+H.J7⁺) 170, 152, 142, 112, 104, 76,

Analise: calculado para ^C7^Hn^CLN2^2*¹/^ C, 37,00, H, 5,06,

N, 12,33. Encontrado: C, 36,82; H, 4,99, N, 12,37.

Preparação de N-/'2-/* (2-piridinil)-ditio ^7-etil J7-2-(tert.-butoxicarbonil)-hidrazinocarboxamida

Fez-se uma suspensão de cloridrato de 2-£ (2-piridinil)-ditio Z-etanamina (2,22g, 10 mmoles) em cloreto de metileno seco (100 ml) e tratou-se com trietilamina (TEA) (5,8 ml). Adicionou-se, gota a gota, esta solução a uma solução de fosgênio (10 ml de uma solução 1,93 M em tolueno) em cloreto de meti leno (200 ml) arrefecida com gelo e sob agitação. Seguiu-se o curso da reacção por TLC e quando jã não se encontrava presente

o reagente inicial, fez-se passar azoto através da mistura durante algum tempo. Adicionou-se, depois, carbazato de t-butilo (l,32g, 10 mmoles) e deixou-se a mistura em agitação durante a noite. Lavou-se a solução com água e evaporou-se o dissolvente. Efectuou-se a cromatografia do resíduo sobre sílica utilizando um sistema dissolvente constituído por uma mistura de cloreto de metileno/metanol (100:2). Reuniram-se as fracções adequadas, obtendo-se l,74g de N-7 2-/* (2-piridinil)-ditio y-etil y’^-2-(tert-butoxicarbonil)-hidrazinocarboxamida (composto 9a), sob a forma de uma espuma, que possuia as seguintes características; IV (KBr) 3281, 2979, 2932, 1723, 1672, 1577, 1560, 1545, 1448, 1419, 1253, 1161, 762 cm’¹. RMN (CDClg) & 8,50, 7,56, 7,51, 7,12 (4H, Py) , 3,51 (2H, CH₂), 2,89 (2H, ÇH₂S), 6,84, 6,37, 6,17 (3H, NH) , 1,44 (9H) , (CHg)₃C), EM (m/e) 345 (corresponde a /'M+H /⁺) , 317, 289, 245, 213, 178, 134, 112.

Preparação de (2-piridinil)-ditio y-etil 7-hidrazinocarboxamida

Dissolveu-se o composto N-/* 2-/ (2-piridinil)-ditio J7-etil 7-2-(tert-butoxicarbonil)-hidrazinocarboxamida (570 mg, 1,66 mmoles) em TFA arrefecido em’gelo (10 ml). Agitou-se a solução, arrefecendo em gelo durante 10 minutos e durante mais 10 minutos sem arrefecimento. Evaporou-se o excesso de TFA, sob pressão reduzida, tanto quanto possível, e cromatografou-se o resíduo sobre gel de sílica utilizando um sistema dissolvente constutuldo por uma mistura de cloreto· de' metileno/itetarei/fcidrõxido de amo nio concentrado (100:5:0,5). Reuniram-se as fracções adequadas para TLC e evaporou-se o dissolvente, obtendo-se um resíduo cri£ talino (0,42g, quantitativo). Preparou-se uma amostra analítica

-48-Ο por recristalizaçao em álcool isopropílico (IPA); p.f. 105 -107°C. O composto N-/’2-/' (2-piridinil) -ditio /-etil J^-hidra zinocarboxamida (composto 10) caracterizou-se do seguinte modo:

IV (KBr) 3336, 3220, 3064, 2949, 2934, 1670, 1623, 1575, 1562, 11-33, 1452, 1369, 1172, 1046, 770 cm¹. RMN (CD₃OD) £ 8,41, 7,78, 7,21 (4H, Py) , 3,43 (2H, NCHj , 2,91 (2H SCHJ . EM (m/e) 245 (corresponde a / M+H/⁺0, 221, 213, 162, 134, 112,

Análise: Calculado para ^8^Η]_2^Ν4θ®2^: C, 39,32; H, 4,95; N, 22,93; S, 26,24. Encontrado: C, 39,19; H, 4,86; N, 22,48; S, 25,02.

Preparação do derivado Semi-Carbazona de Cloridrato de Adriamicina e de N-/2-/ (2-piridinil)-ditio J7-etiT ,7-hidrazinocarboxamida

Adicionou-se o composto 10 (0,37g, 1,5 mmole) em meta nol (25 ml) a uma suspensão agitada de cloridrato de adriamicina (0,66g, 1,14 mmole) em metanol (50 ml), Adicionou-se TFA (5 gotas) e deixou-se a mistura em agitação durante a noite. Concentrou-se a solução límpida e efectuou-se a sua cromatografia numa coluna C-18 de gel de sílica utilizando como sistema dissolvente uma mistura de metanol/ãgua (60:40) que continha 0,3% de acetato de amónio. Reuniram-se as fracções adequadas e evapo rou-se o metanol, tanto quanto possível. Liofilizou-se a fase aquosa e dissolveu-se o resíduo em metanol e adicionou-se a ace tonitrilo. Recolheu-se por centrifugação o sólido de cor vermelha e secou-se, obtendo-se 0,65g (68%). O derivado semicarbazona de ADM caracterizou-se do seguinte modo: IV (KBr) 3399, 2976, 2936, 1671, 1618, 1578, 1538, 1417, 1286, 1210, 1117, 1015, 989, 764cm¹. RMN (CD₃OD) é> 8,25, 7,76, 7,62, 7,48, 7,07 (py, ph. Η) , 4,95 (H anomérico), 4,63 (CH₂OH), 4,24 (CH₃ÇH), 3,97 (OCH₃),

-493,5-2,9 (absorção de SSCH , -CH -, CH₂-NH), 1,29 (HC-CHg). EM (m/e) 770 (que corresponde a / M+H , 641, 437, 346. EMER: calculado ^35-^40^5^3.3.^2¹ 770,2166; Encontrado: 770,2157.

EXEMPLO 2

Preparação do Composto Bifuncional 11a e do derivado Carbazona de ADM

No exemplo que se segue descreve-se um processo para a preparação de um composto bifuncional de carbazida e do deri vado carbazona de ADM, possuindo uma ponte de carbazona na posição C-13 de ADM. De acordo com exemplo, a reacção, indicada na Figura 2 e descrita no exemplo 1, entre o cloridrato de 2(2-(piridinil)-ditio j7-etanamina e o carbazato de t-butilo, foi iniciada com carbazato de t-butilo e trifosgênio, tal como se indica na Figura 3, para se obter um composto bifuncional (composto 11a) , uma carbazida. Neste caso, fez-se reagir exces^ so de carbazato de t-butilo com fosgênio para se obter a di-hi drazida carbónica.

Preparação da di-hidrazida 2-£ /”2-/“ ( 2-piridinil)-ditio JI

-etil J-amino j7-carbon.il. J-2.,2 -bis (tert-butoxicarbonil) -carbónica

Dissolveu-se carbazato de t-butilo (0,396g, 3 mmoles) em clorofórmio seco (10 ml). Agitou-se a solução sob atmosfera de azoto ã temperatura ambiente e adicionou-se trietilamina (TEA) (0,6g, 6 mmoles). Seguiu-se a adição de trifosgênio (0,296 g, 1 mmole), de uma só vez. Deu-se uma vigorosa reacção e quando esta abrandou adicionou-se cloridrato de 2-(2-piridinilditio)-50

-etanamina (0,667 g, e mmoles) em clorofórmio contendo trietilamina (TEA) (0,3 g, 3 mmoles), Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1,5 horas e, depois, lavou-se com água (3 x 20 ml), secou-se e evaporou-se o dissolvente sob pressão reduzida, para se obter uma espuma (0,91 g), Efectuou-se a cro matografia deste produto sobre sílica, utilizando como sistema dissolvente uma mistura de cloreto de metileno/metanol (100:2) Observaram-se as fracçSes por TLC e reuniram-se de modo adequa do, para se obter a di-hidrazida 2-/*/ £ (2-piridinil)-ditio /-etil /-amino ^-carbonil /-2,2'-bis(tert-butoxicarbonil)-carbónica (composto 11), sob a forma de uma espuma (0,54 g, 52%). Caracterizou-se o composto 11, conforme se segue IV(KBr)

3302, 2980, 2933, 1726, 1683, 1498, 1252, 1160, 1047, 1018, 763cm^-1., RMN(CDC1₃) 8,50 7,57, 7,49, 7,10 (d,q,d,t, 4H, Py) ,

3,52 (t, 2H, SSÇH₂) 2,90 (t, 2H CONCH₂), 1,46 £ C(CH₃)₃/, 8,30, 6,50, 6,29 (b,s,s, NH) . EM (m/e) 503 (que corresponde a /M+H/+), 447, 431, 419, 403, 347, 303, 213, 179, 112.

Preparação da di-hidrazida 2-///2-/ (2.-pir.idinil)-ditio /

-etil /-amino/-carbonil ./-carbónica

Agitou-se o composto 11 (0,34 g, 0,68 mmole) durante 10 minutos com acido trifluoroacêtico (TFA) arrefecido em gelo (5 ml) e durante mais 10 minutos sem arrefecimento. Evaporou-se o TFA, tanto quanto possível, e efectuou-se a cromatografia do resíduo sobre sílica, utilizando como sistema dissolven te, uma mistura de cloreto de metileno/metanol/NH^OH concentra do (100:5:0,5). Reuniram-se as fracçóes adequadas e, após aveporação, obteve-se o composto 11a, sob a forma de uma espuma

-51Ç.

higroscôpica (0,2 g de produção quantitativa). 0 composto 11a foi caracterizado conforme se segue; IV (película) 3330, 2964,

2929, 1698, 1660, 1576, 1486, 1231, 1045, 759 cm¹. RMN (CDClg)

8,50 7,56, 7,10 (d,m,m,4H, Py) , 3,52 (q, 2H, CH₂N), 2,91 (t,

2H, CH^SS), 8,87, 8,85, 4,19, 3,78 (protões permutáveis de D₂O,

NH) . EM (m/e) 303 (que corresponde a / M+H , 213, 112.

Preparação do derivado, carb.az.ona d.e cloridrato. de adriamicina e da di-hidrazida. 2-/^/^2-/^- (2-pi.rid.inil.) -ditio y-et.i.1. j7-.amino J-c arbonilJ-carbõnica,

Deixou-se em agitação durante a noite cloridrato de adriamicina (356 mg, 0,6 mmole) e o composto 11a (0,2 g, 0,68 mmole) em metanol (50 ml) contendo 2 a 3 gotas de ácido trifluo acético (TFA). Obteve-se uma solução limpida, indicando a HPLC (sistema dissolvente constituido por uma mistura de metanol/solução de fosfato de amónio 0,0lM, a pH 4,5, a 70;30) que mais de 90% de adriamicina tinha sido convertida em semicarbazona.

Evaporou-se, por isso, o dissolvente e efectuou-se a cromatogra fia do resíduo numa coluna de C-18, utilizando um sistema dissolvente constituído por uma mistura de metanol/âgua (60;40) e que continha 0,3% de acetato de amónio, Analisaram-se as fracções por TLC da fase inversa (o mesmo dissolvente mas com 3% de acetato de amónio) e/ou por HPLC e reuniram-se as fracções isentas de adriamicina. Evaporou-se a maior parte do metanol sob condições de pressão reduzida, Liofilizou-se a solução aquo sa e dissolveu-se o resíduo de cor vermelha num pequeno volume de metanol. Filtrou-se a solução e adicionou-se a acetonitrilo (1 litro), agitado. Concentrou-se a solução límpida atê cerca

-52de um terço do seu volume, recolheu—se o solido obtido por centrifugação e secou-se para se obter a carbazona de ADM (com posto 4) (160 mg). Obteve-se uma segunda recolha mediante concentração da solução até 100 ml, diluição com éter e recolha do solido por centrifugação (rendimento total de 49%) , Caracte rizou-se este derivado carbazona do seguinte modo: IV(KBr):

3346, 2975, 2936, 1711, 1668, 1618, 1578, 1286, 1210, 1083, 1015, 765 cm¹. RMN(CD₃OD) <£ 8,43, 7,89, 7,77, 7,52, 7,21, (Py, H fenilo), 5,15 (H anomérico) 4,57 (CH^OH), 4,25 (CH₃CH), 3,99 (OCH₃), 3,53 (SSÇH₂), 3,17 (C-CH₂~, anel), 3,05 (ÇH₂NN=), 2,38 (-CH₂“, anel) 1,29 (CHCH₃) . ,EM(m/e) 828 (que corresponde a £ M+H J+) , 699, 572, 537, 377, 346, 289, 213,

EXEMPLO 3

Preparação do composto Bifuncional 12 e do derivado tio-seinicar· bazona de ADM

Neste exemplo descreve-se a preparação do composto bifuncional, composto 12, e do derivado semicarbezona de ADM, que possui uma ponte de tio-semicarbazona na posição C-13 de ADM. De acordo com este Exemplo, prepararou-se o análogo tio da semicarbazida descrita anteriormente no Exemplo 1 (composto 10), tal como se indica através do diagrama apresentado na Figura 4. Quando se utilizou a 2-/”(2-piridinil)-ditio y-etana mina observou-se uma eliminação de 2-mercaptopiridina, que pode ser imputada ao aumento de nucleofilia do radical tio-semicarbazida, no penúltimo passo do produto. Ultrapassou-se este problema utilizando o grupo trans-buteno, tal como se indica na Figura 4.

-53Preparação do l-bromo-4-(N-ftalaffiidoj-2-buteno

A uma solução de 1,4-dibromo-2-buteno (8,4 g, 40 mmoles) em dimetilformamida (200 ml) adicionou-se ftalimideto de potássio (4,62 g 24 mmoles), porção a porção, durante 1 hora. Após ter-se agitado durante uma noite, evaporou-se o dissolvente e partilhou-se o resíduo entre ãgua e cloreto de metileno. Lavou-se, diversas vezes, a fase orgânica com ãgua, secou-se e evaporou-se o dissolvente. Cristalizou-se o resíduo em 2-propa nol, obtendo-se o produto desejado, l-bromo-4-(N-ftalimido)-2-buteno (3,95 g, rendimento de 50%) ; que se caracterizou con forme se segue: p.f. 101-2°. IV(KBr) 1775, 1711, 1466, 1436, 1393, 723 cm¹. RMN (CDC1 )5 7,81, 7,73 (m,m 4H, fenilo), 5,88, 5,81 (m,m 2H, 2 =ÇH-) 4,30(d,2H CH₂-N), 3,90 (d,2HCH₂Br). MS (m/e) 280 (que corresponde a M+H J⁷*) , 200,.

Análise: Calculado para C 5,00 Encontrado: C, 52,35;

C,51,45; H, 3,60; N,

4,80 l₂Hio^BrN⁰2í H, 3,47, N,

Preparação do 1-(aeetiltio)-4-(N-ftalimido)-2-buteno

Aqueceu-se sob refluxo durante 30 minutos uma mistura de l-bromo-4-(N-ftalimido)-2-buteno (3,95 g; 14 mmoles) e tioacetato de potássio (1,77 g, 15,5 mmoles) em etanol absoluto (50 ml). Evaporou-se o dissolvente e extraiu-se o resíduo com cloreto de metileno. Evaporou-se o dissolvente obtendo-se um resíduo cristalino (3,85 g, rendimento de 99%) que se utili zou tal e qual no passo seguinte. Preparou-se uma amostra analítica por cristalização em 2-propanol, p.f. 69°-71°c,. Este composto caracterizou-se do seguinte modo: IV(KBr) 1769, 1713, 1688, 1427, 1391, 1114, 958 cm¹, RMN (CDClg) £ 7,80, 7,73 (m,m

-54i-f.

4H Ph) , 5,70 (xn, 2H, 2 =CH-) , 4,24 (d, 2H, CHg N) , 3,48 (t, 2H ÇHgS), 2,29 (s, 3H, C-ÇHg). EM (m/e) 276 (corresponde a fM+H /+) , 234, 200.

Análise: Calculado para C^^H^gNOgS: C, 61,07; H, 4,76; N, 5,09. Encontrado: C, 61,29; H, 4,82, N,5,21.

Preparação do cloridrato de 1 -amino-4.-/’ (2-pi.ridinil.)-ditio

Aqueceu-se sob refluxo uma solução de l-acetiltio-4-(N-ftalimido)-2-buteno (6,5 g, 23,6 mmoles) em etanoi absolu to (150 ml) e hidrazida (1,74, 54 mmoles). Seguiu-se a reacção por análise TLC e quando já não estavam presentes os compostos iniciais arrefeceu-se a solução em gelo e tratou-se com ãcido clorídrico 6N (10 ml). Formou-se um precipitado volumoso que se identificou como ftal-hidrazida (RMN,EM) e se filtrou. Concentrou-se o filtrado até 10 ml e diluiu-se com ãgua. Separou-se o sólido por filtração e lavou-se o filtrado com éter (2 vezes) e com cloreto de metileno (1 vez), filtrou-se através de Celite e liofilizou-se. Dissolveu-se o sólido numa pequena quantidade de metanol e filtrou-se a solução através de Celite, evaporou-se o dissolvente e submeteu-se o resíduo ao vazio durante a noite. Obteve-se um produto ceroso, higroscópico, que possuía as seguintes caracteristicas; RMN (DMSO-DgO) 6 5,83, 5,60 (m,m 2H, 2 =CH-) 3,40 (d, 2H CHgNHg),3,16 (d 2H, CHgSH) EM (m/e) 104 (corresponde a £ M+H /+), 87, 70, Dissolveu-se este produto ceroso em metanol de grau de HPLC (75 ml). Agitou-se a solução e tratou-se com cloreto de metoxicarbonilsulfenilo (3g, 23,7 mmoles), Decorridos 30 minutos jã não se detectavam compostos iniciais por TLC. Evaporou-se o dissolven

-55te e dissolveu-se novamente o resíduo em metanol (75 ml). Agitou-se a solução e tratou-se com 2-mercaptopiridina (2,7 g, mmoles). Decorridas 2 horas, evaporou-se o dissolvente e ex traiu-se o resíduo sob vazio intenso. Dissolveu-se, depois, o resíduo numa mistura de ácido clorídrico 0,01 Me metanol (90:10, 130 ml) . Lavou-se a solução turva com cloreto de metileno, filtrou-se através de Celite e liofilizou-se, obtendo-se o cloridrato de l-amino-4-/(2-piridinil)-ditio /-2-buteno, sob a for ma de um produto aveludado altamente higroscópio© (4g, 68%) que possuia as seguintes caracteristicas: IV(KBr) 3433, 2959, 2884, 1607, 1576, 1447, 1418, 1118, 767 cm^-1. RMN(D₂O)e> 8,51, 8,13, 8,02, 7,54 (m 4H, Py) 5,87, 572 (m,m 2H, 2 =ÇH-) 3,54 (d 2H, ÇH₂ NH₂) 3,43 (d 2H, CH₂ S). EM (m/e) 213 )corresponde a fM+H /+), 196, 112.

Preparação da N-/ 4-/ (2-piridinil) -ditio ./-2-b.uteni.l /-hidr.az inocarbotioamida

Fez-se uma suspensão do oloridrato de l-amino-4-/' (2-piridinil)-ditio /-2-buteno (1,5 g, 6 mmoles) em cloreto de metileno (30 ml) em agitação. Adicionou-se ácido trifluoroacético (1,46 g, 14,6 mmoles) e depois tionocarbonato de di-2-piridilo fKim e Yi, Tetrahedron Lett., /6 (1985) 1661-1664 f (1,4 g, 6 mmoles). Obteve-se uma solução límpida e a análise TLC demonstrou a ausência de compostos iniciais. Adicionou-se carbazato de t-butilo (0,8 g, 6 mmoles) e agitou-se a solução durante 1 hora. Lavou-se a solução com água e evaporou-se o dis solvente. Efectuou-se a cromatografia do resíduo sobre sílica, utilizando como sistema dissolvente uma mistura de cloreto de metileno/metanol (100:2) e voltou a efectuar-se nova cromato-56-

grafia utilizando como sistema dissolvente uma mistura de hexano/acetato de etilo (75:25), para se obter uma espuma que era o derivado T-boc de N-/”4-/*(2-piridinil)-ditio _7-2-butenily-hidrazinocarbotioamida (1,4 g, 58%), que se caracterizou do modo seguinte: IV(KBr) 3238, 2971, 2930, 1718, 1544, 1418,

1156, 762 cm¹. RMN (CDC1₃/D₂O)£ 8,43, 7,65, 7,08 (m, m, m 4H, py) 5,57 (m 2H, 2=CH), 4,12 (D 2H, €H₂ N) 3,45 (d 2H CH₂S),

1,46 (s 9H, 3 CH₃). EM (m/e) 387 (corresponde a £ M+H 355,

287, 276, 112.

Dissolveu-se a carbotioamida protegida (0,86 g, 2,2 mmoles) em ãcido trifluoroacêtico arrefecido em gelo. Conservou-se a solução em gelo durante 10 minutos (sob atmosfera de azoto) e durante um período adicional de 10 minutos sem arrefe cimento. Evaporou-se o excesso de ãcido, tanto quanto possível, sob vazio intenso e efectuou-se a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando um sistema dissolvente constituído por uma mistura de cloreto de metileno/metanol NH^OH concen trado (100:5:0,5). Reuniram-se as fracções adequadas para se obter o composto 12 sob a forma de uma goma (0,39 g; rendimento de 63%), que possuia as caracteristicas seguintes: IV (pelí cuia) 3322, 3198, 2974, 1626, 1574, 1560, 1538, 1448, 1418,

1224, 760 cm”¹. RMN (CDC1₃/D₂O) 8,41, 7,63, 7,11 (m m m 4H,

Py) 5,64 (m 2H, 2=CH), 4,20 (d 2H, CH₂N) 3,41 (d 2H, CH₂$), EM (m/e) 287 (corresponde a £ M+HJ/^) , 225, 221, 144, 112,

Preparação do derivado tio-s.emicarba.zona. do. cloridrato de Adriamicina e da N-£ 4-£ (2-2-p.ir.id.ini.l.) -ditio. y.-2-b.uten.il Z~h.idra.zinocarbotioamida

A uma suspensão agitada de cloridrato de adriamicina

(350 mg, 0,6 mmole) em metanol de grau HPLC (50 ml) adicionou-se uma solução do composto 12 (350 mg, 1,2 mmole) em metanol de grau HPLC (25 ml). Adicionou-se ãcido trifluoroacêtico (3-4 gotas) e deixou-se a mistura em agitação durante a noite. Obteve-se uma solução límpida e não se detectou adriamicina livre, quer por HPLC quer por TLC. Concentrou-se a solução atê um pequeno volume (5 ml) que se adicionou a aoetonitrilo (600 ml). Formou-se um precipitado que, apôs arrefecimento no frigo rifico, se recolheu por centrifugação e se secou sob vazio intenso (275 mg? rendimento de 54%). O derivado tio-semicarbazona possuia as seguintes características: IV (KBr) 34.18, 2934, 1616, 1578, 1534, 1414, 1284, 1208, 1012, 986 cm’¹. RMN (CD^QD) Ó 8,30, 7,80, 7,74, 7,52, (Py, 7H de fenilo), 5,60 (2=CH) 5,40 (H anomêrico) 4,67 (CHgOH), 4,22 (CHgCH), 4,09 (CHgN), 4,02 (QCHO), 3,5-1,88 (absorção em cacho incluindo-CHg-SS, -CH^-CH), 1,30 (CHg-CH). EM (m/e) 812 (corresponde a /”M+H 7+}, 701, 683, 669, 572, 554, 540, 536, 522, 504. EMER Calculado para ^C37^H4₂ ^N5 θ10^3^: θ12,2094; Encontrado: 812,2087.

EXEMPLO 4

Preparação do Composto Bifuncional 13 e do derivado carboxilato-hidrazona de ADM

Neste exemplo, descreve-se a preparação do novo composto bifuncional, o composto 13, e do derivado carboxilato-hi drazona de ADM. Prepara-se o composto bifuncional carboxilato-hidrazina a partir de mercaptoetanol que se converteu em piri dinilditioetanol, tal como se indica na Figura 5, Converteu-se, depois, este composto num derivado carbonílico activo que se

-58condensou com hidrazina.

Preparação do hi.draz.i.no.c.arb.ox.i.l.ato. de .2-./. (.2-p.ir.idinil) -ditio /-etilo

A uma solução arrefecida (ΟθΟ de cloreto de clorocar bonilsulfenilo (l,24g; 9,45 mmoles) em C^C^, adicionou-se, go ta a gota, 2-mercaptoetanol (737 mg, 9,45 mmoles). Agitou-se a mistura durante 30 minutos a uma temperatura compreendida entre 0° e 15°C, arrefeceu-se atê 0°C e tratou-se com uma solução de 2-mercaptopiridina (l,05g, 9,45 mmoles) em CH^C^ (15 ml) . Agitou-se a mistura a temperatura de 0 C durante 1 hora e agitou-se, depois, à temperatura ambiente durante 16 horas. Após adição de uma solução de carbonato de amónio (l,0g, em 20 ml de água), separaram-se as fases e lavou-se a fase orgânica com âgua, secou-se e concentrou-se sob vazio, para se obter 2-(2-piridinilditio)-etanol (l,75g), sob a forma de um óleo incolor. Adicio nou-se carbonildiimidazol (648 mg, 4 mmoles) a uma solução de 2-(2-piridinilditio)-etanol (714 mg, 3,8 mmoles) em CE^C^ (10 ml). Agitou-se a mistura durante 20 horas e arrefeceu-se, depois, com gelo, ate a temperatura de -2Q C e tratou-se com hidrazina (122 mg, 3,8 mmoles). Deixou-se a mistura em repouso â temperatura de -5 C durante 16 horas e concentrou-se, depois, sob vazio. Cromatografou-se o residuo sobre gel de sílica utilizando um sis tema dissolvente constituído por uma mistura de cloreto de metileno /metanol (100:1-3), para se obter o composto 13, hidrazinocarboxilato de 2-/ (2-piridinil)-ditio/-etilo (340 mg; rendimen to de 37%), sob a forma de um óleo incolor, que possuia as seguintes caracteristicas: RMN (CDCl^) & 8,46 (ÍH), 7,62 (2H),

7,08 (ÍH), 5,92 (ÍH), 4,35 (t, 2H), 3,70 (s, ZH), 3,01 (t, 2H),

1,56 (s, 2H). EM (m/e) 246 (corresponde a M+H/⁺) , 142, 103.

Preparação do derivado hidrazona de oloridrato de adrianticina e do hidrazinocarboxilato de 2-/* (2-piridinil) -ditio^-etilo

A uma suspensão de oloridrato de adriamicina (290 mg, 0,5 mmole) em metanol anidro (4 ml), adicionou-se uma solução do composto 13 (170 mg, 6,9 mmoles) em metanol (4 ml) e CF₃CO₂H (6 mg) em metanol (1 ml). Após agitação durante 24 horas, concentrou-se a mistura atê cerca de 4 ml e adicionou-se a esta so lução acetonitrilo (50 ml). Isolou-se o produto por centrifugação. Dissolveu-se o produto em ãgua/metanol e, depois, liofilizou-se para se obter o derivado hidrazona de adriamicina (354 mg, rendimento de 88%), sob a forma de um solido vermelho escuro, que possuia as seguintes características: RMN (CD₃OD)^8,34

(ÍH)	, 7,93 (d,	ÍH) ,	, 7,81 (m, 3H),	7,54 (d,	ÍH) ,	, 7,17 (m,	ÍH) ,
5,49	(m, ÍH) ,	5,19	(s, ÍH), 4,59	(m, 2H),	4,37	(m, 2H),	4,25 (m,
ÍH) ,	4,01 (s,	3H) ,	3,63 (m, ÍH),	3,54 (m,	ÍH) ,	3,10 (t,	3H) ,
2,37	(m, 2H),	2,03	(m, ÍH), 1,89	(m, 1H),	1,29	(d, 3H).	EM (m/e):
771	(correspon	de a	/* M+H J7+) , 642

EXEMPLO- 5

Preparação do Composto Bifuncional 15 e do derivado arii-hidrazona de ADM

Neste exemplo descreve-se o método para a preparação de um novo composto bifuncional, o composto 15, e do derivado aril-hidrazona de ADM que possui uma ponte de aril-hidrazona na posição C-13 de ADM. Preparou-se o composto 15 utilizando ãcido

4-(N-Boc-hidrazino)-benzõico, e incorporando o grupo 2-(2-piridinilditio)-etanamina, tal como se indica na Figura 6.

ãcido 4- (N-boc-hidrazino)-benzôicQ

Dissolveu-se ãcido £-hidrazinobenzóico (760 mg, 5 mmoles) em dioxano (10 ml), ãgua (5 ml) numa solução de NaOH lN (5 ml). Adicionou-se pirocarbonato de di-t-butilo (l,31g, 6 mmoles) â temperatura de 0 C e agitou-se a mistura reaccional â temperatura de 0°C durante 1 hora a temperatura ambiente durante 30 minutos. Decorido este intervalo de tempo, reduziu-se o volume da solução para metade e acidificou-se a solução com uma solução de ãcido clorídrico a 0,5% e extraíu-se com acetato de etilo. Reuni ram-se as soluções de acetato de etilo, lavou-se com uma solução saturada de cloreto de sedio e secou-se sobre sulfato de sódio.

A remoção do dissolvente proporcionou um sólido levemente acastanhado que se recristalizou em acetato de etilo e hexano (950 mg; rendimento de 75%) e que se caracterizou do seguin te modo: RMN (CD₃OD) & 7,84 (d, 2H, J=8,5Hz), 6,75 (d, 2H, J=8,5 Hz), 1,4⁸ (s, 9H); IV (KBr) 3316, 1688, 1607, 1298 cm¹.

Preparação do ãcido de N- 2 (2 -pir.idinil.) -ditio. ./-etiJj-A- (N-boc-hidrazlno)-benzamida

Agitou-se durante a noite â temperatura ambiente, ãcido 4-(N-boc-hidrazino)-benzóico (252 mg, 1 mmole), N-hidroxissuc cinimida (115 mg, 1 mmole) e diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) (247 mg, 1,2 mmole) em Ν,Ν-dimetilformamida (DMF) (5 ml). Filtrou-se a dicicloureia (DCU) e evaporou-se o filtrado. Cristalizou-se o resíduo por adição de êter etílico obtendo-se o éster N-hidroxis succinimldico do ãcido 4-(N-boc-hidrazino)-benzóico (300 mg). Dissolveu-se este produto (250 mg, 0,72 mmole) e cloridrato de 2-/ (2-piridinil)-ditio J^-etilamina (167 mg, 0,75 mmole) em N,N-dimetilformamida (4 ml). Apôs a adição de ãcido trifluoroacêti-

co (0,125 ml, 0,9 mmole), agitou-se a mistura durante a noite â temperatura ambiente. Removeu-se a Ν,Ν-dimetilformamida e cro matografou-se o residuo sobre SiO₂ (2% de MeOH/CH₂Cl₂), obtendo -se uma espuma (217 mg; rendimento de 52%), gue possuia as seguintes características: RMN (CDCl^) £> 8,37 (d, ÍH, J=5,l HZ), 8,01 (t largo, ÍH), 7,78 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,57 (m, ÍH), 7,46 (d, ÍH, J=8,l Hz), 7,09 (m, ÍH), 6,84 (d, 2H, J=8,7 Hz), 7,40 (s largo, ÍH), 5,92 (s largo, ÍH), 3,70 (m, 2H), 2,98 (t, 2H, J=5,8 Hz), 1,45 (s, 9H); IV (KBr) 3303, 1714, 1610, 1505 cm¹; em m/e 421 (M+H), 365, 321, 112, EMER calculado para ^C]_9^H25^N4°3^S2 421,1368, encontrado 421,1358.

Preparação de N-2-/* (2-piridinil) -ditio ^/-e.t.i.lJ-4-hidrazinobenzamida

Tratou-se o composto anterior (200 mg, 0,48 mmole) com ácido trifluoroacético (1,5 ml) ã temperatura de 0°C durante 1 hora. Decorrido este intervalo de tempo, evaporou-se o ãci do trifluoroacêtico e triturou-se o resíduo com éter etílico pa ra se obter, aproximadamente, 200 mg de N-/*2-/ (2-piridinil)-ditio y-etil y-4-hidrazinobenzamida (composto 15) sob a forma de um óleo, que possuia as seguintes características: RMN (CD^OD) à 8,38 (d, ÍH, J=4,5 Hz), 7,81 (m, 4H), 7,22 (t, ÍH, J=5,8 Hz), 6,97 (d, 2H, J=8,8 Hz), 3,67 (t, 2H, J=6,6 Hz), 3,06 (t, 2H, J=6,6 Hz); IV (película) 3278, 1674, 1613 cm^-1; EM m/e 321 (M+H.) .

Preparação do derivado ari.l-hi.draz.ona de, adriamicina e da N-/ 2(2-piridinilditio) -etil y-4-hidraz.inobenz.amida

Dissolveu-se o composto 15 e cloridrato de adriamicina (250 mg, 0,43 mmole) em metanol (15 ml) e agitou-se, no escuro, durante 2 dias. Removeu-se o dissolvente e efectuou-se a croma- ( · tografia do resíduo numa coluna C-18 de SiO₂, de fase inversa.

A eluição com uma mistura de MeOH/H^O (2:1) contendo 0,3% de NH^OAc deu o composto hidrazona 7, sob a forma de um pó cor de laranja (30 mg; rendimento de 8%), que possuia as seguintes caracter isticas: RMN (CDgOD) ê 8,33 (d, ÍH, J=4,8 Hz), 7,85 (d,

ÍH, J=7,9	Hz)	, 7,74 (t, ÍH,	J=8,0 Hz), 7,66 (m, 4H), 7,41 (d, 1
H, J=8,5	Hz) ,	7,14 (m, ÍH),	7,02 (d, 2H, J=8,8 Hz), 5,46	(s lar
go, ÍH),	5,16	(m, ÍH), 4,60	(s, 2H), 4,23 (m, ÍH), 3,91	(s, 3H),
3,62 (m,	4H) ,	3,02 (m, 4H),	2,61 (m, 1H), 2,38 (m, ÍH),	1,97 (m,
2H), 1,32	(d,	3H, J=6,5 Hz)	; IV (KBr) 3206, 1708, 1607,	1578 cm 1;

EM m/e 846 (M+H) , 737, 717, EMER calculado para ^C4i^H44^N5°x]_^S2 · 846,2479, observado 846,2380.

A eluição com uma mistura de MeOH/^O (3:1) contendo 0,3% de NH^OAc deu o derivado anidro, sob a forma de um sólido azul (120 mg; rendimento de 34%). RMN (CD^OD) & 8,40 (d, ÍH,

J=4,l Hz), 7,77 (m, 5H), 7,42 (m, ÍH), 7,22 (m, ÍH), 7,16 (m,

2H), 5,35 (s largo, ÍH), 5,26 (m, ÍH), 4,65 (s, 2H), 4,00 (m,

ÍH), 3,93 (s, 3H), 3,67 (t, 2H, J=6,5 Hz), 3,44 (m, ÍH), 3,08 (t, 2H, J=6,5 Hz), 2,49 (m, ÍH), 1,88 (m, ÍH), 1,63 (m, ÍH), 1,19 (d, 3H, J=6,5 Hz); EM m/e 828 (M+H.) 699, 681, 495; EMER calculado para ^₄^H₄^NgO^gS₂ 828,2372, observado 828,2300.

EXEMPLO 6

Caracterização dos Derivados de ADM

Estudou-se a libertação de ADM a partir dos derivados de ADM da presente invenção, preparados tal como se descreveu nos

Exemplos 1 a 5 anteriores, para diversos valores de pH, compreen-

-63didos entre 4,5 e 7,4, utilizando a análise HPLC. Prepararam-se soluções de reserva (1 mg/ml) de derivados de ADM em metanol e diluiram-se alíquotas em solução de tampão aquoso, a pH

4,5, 5,0 e 7,4, para se atingirem as concentrações finais de, aproximadamente, 1,6 mmole/ml. Efectuou-se a incubação de cada um dos tampões a 37°C durante atê 24 horas e analisaram-se as alíquotas, aplicando-as numa coluna de HPLC, para se determinar a quantidade de ADM não conjugada. Identificou-se o produto libertado sob a forma de ADM intacta pelo seu tempo de retenção na coluna e pelas caracteristicas de UV do material eluido. Exprimiram-se as velocidades de libertação sob a forma de percentagem da quantidade máxima de ADM, tal como se indica nas Figuras 10 a 12.

Tal como se ilustra nessas figuras, os derivados de ADM da presente invenção apresentam um largo intervalo de velocidades de libertação, A quantidade de produto libertado a partir dos derivados de ADM aumentou à medida que os valores de pH diminuiram desde 7 atê 4. Os derivados de ADM possuem um grupo de ligação sensivel aos ácidos, o que origina a libertação de ADM a partir da proteína dos anticorpos. Estes resultados são consistentes com a existência de uma ponte de semicarbazona, car bazona, tio-semicarbazona, carboxilato-hidrazona ou aril-hidrazona unindo a ADM ao composto bifuncional.

EXEMPLO 7

Preparação de Imunoconjugados de Antraciclina

Neste exemplo, descreve-se a preparação de imunoconjugados de antraciclina, de acordo com a presente invenção, em que

-64os derivados de ADM anteriormente descritos (Exemplos 1 a 5) são conjugados com um anticorpo monoclonal.

Preparação de Imunoconjugados que têm uma Ponte de Dissulfureto no Composto Bifuncional anticorpo monoclonal utilizado foi ο 5E9, produzido a partir do hibridoma ATCC n9 HB21, que se encontra dispo nível na American Type Culture Collection ATCC, em Rockville, MD. 0 anticorpo monoclonal 5E9 ê um anticorpo IgG-^, que reage com o receptor da transferrina em todas as células humanas em divisão e que entra em reacção cruzada com os diversos tipos histológicos de células cancerígenas. Purificou-se o anticorpo 5E9, a partir de fluido ascítico, produzido em ratos BALB/c, de acordo com o procedimento de Bruck et al., One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic Fluid by DEAE-Affigel Blue Chromatography, J'. Immuno1. Methods, 5b (1982) 313-319 .

Antes de se fazer reagir o derivado de ADM com o anticorpo monoclonal seleccionado, efectua-se a tiolação do anti corpo, isto é, introduzem-se grupos sulfidrilo reactivos na molécula de anticorpo, Efectua-se a tiolação do anticorpo monoclonal (MAb) 5E9 utilizando SPDP, essencialmente de modo descrito por Greenfield et al., supra. Resumidamente, adiciona-se SPDP, (pierce Chemical Co. IL) (50 mM), dissolvido em etanol, ao MAb 5E9 (5-10 mg/ml) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), a pH 7,2, para se obter uma concentração final compreendida entre 5 e 10 mM. Incubou-se a mistura reaccional du rante 30 minutos a 30 C, Separou-se o SPDP que nao reagiu do anticorpo derivado de SPDP, por cromatografia de filtração em

-65gel, utilizando uma coluna PD-10 (Pharmacia). Removeram-se os grupos reactivos piridinilditio, por redução com DTT em exces so. Fizeram-se passar os anticorpos reduzidos através de uma coluna PD-10 e utilizaram-se os anticorpos que continham tiol livre, para condensação com os derivados de ADM.

Também se introduziram grupos tiol reactivos nas pro teínas dos anticorpos, utilizando 2-IT. Misturou-se o anticorpo (5-10 mg/ml em TEA 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0) com 2-IT (Pierce Chemical Co,, IL) numa concentração final de 5-10 mM. Deixou-se prosseguir a reacção durante 90 minutos a 4°C e separaram-se os anticorpos tiolados numa coluna PD-10, equilibrada com NaCl/PBS 2M.

Determinou-se o número de grupos tiol reactivos in* corporados nos anticorpos, utilizando DTNB (ácido 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzõico) (E^^ ⁼14150), de acordo com o procedimento descrito por Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82 (1959) 70-77).

Dissolveu-se cada um dos derivados de ADM em dimetil formamida e adicionou-se ao MAb 5E9 reduzido e tiolado com

SPDP, em PBS. A quantidade de derivado de ADM foi equivalente ao número de grupos tiol que existiam no anticorpo. Deixou-se incubar a reacção de conjugação, durante uma noite, a 4°C.

Após este intervalo de tempo, dializou-se a solução de anticor po contra PBS para remover o derivado de adriamicina não conju gado. Tratou-se, depois, a solução de anticorpo com Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad Laboratories, Richmond,CA), durante uma noite. Determinou-se a quantidade de antraciclina conjugada ligada ao MAB, por absorvância a 495 nm (^E4g₅ = 8030) . A quantidade de proteína de anticorpo foi determinada por absorvância a 280 nm

-66(1 mg/ml = 1,4 unidades de D.O). Para se corrigir a sobreposição da absorvância de ADM a 280 nm, utilizou-se a seguinte fórmula:

Anticorpo (mg/ml) = Α^θθ - (0,72 X A_4g5 )

1,4

Analisaram-se os imunoconjugados quanto â presença de ADM ou de derivados de ADM utilizando a analise por HPLC.

Efectuou-se a HPLC utilizando uma coluna Phenomex com um enchi mento de gotas C18 IB-SIL, de 5 micron. Aplicou-se na coluna o fármaco não conjugado, os derivados de ADM (isto é, os conjugados de ADM para cada um dos compostos bifuncionais da pre sente invenção, preparados tal como se descreveu nos anteriores Exemplos 1 a 5) (0,1 ^imoles) ou os imunoconjugados que con tinham 0,5 a 5 ^amoles de fãrmacos equivalentes e eluiram-se com metanol e fosfato de amónio 10 mM, a pH 4,5 (70:30), a 1,5 ml/minuto. Os imunoconjugados produzidos não continham quantidades significativas (inferiores a 1%) de fármaco não conjugado, tal como se determinou por análise HPLC.

EXEMPLO 8

Caracterização dos Imunoconjugados

Os imunoconjugados, preparados do modo descrito antes no Exemplo 7, eram constituídos por moléculas de ADM conjugados na posição 13-ceto com um composto bifuncional que for mava uma ligação entre a ADM e o MAb 5E9. Além disso, a adição do MAb com grupos tiol livres ao derivado de ADM que continha um radical piridinilditio reactivo conduziu ã formação de uma ponte de dissulfureto no composto funcional unindo a ADM ao MAb. Os imunoconjugados preparados de acordo com este aspecto, en-67 ç

globam, emboram não se limitem, 5E9-ADM-semicarbazona-/* 3.42 5E9-ADM-carbazona-/ 4.37 J⁷; 5E9-ADM-tiosemicarbazona-/ 2.51 J⁷; 5E9-ADM-carboxilato-hidrazona-/ 2.35 J; e 5E9-ADM-aril-hidrazo na-/ 2.52 }, em que a primeira parte da designação representa o anticorpo monoclonal utilizado para formar o conjugado, a se gunda parte representa a antraciclina ligada ao anticorpo e os números entre parentêses representam a relação molar ADM/anticorpo no conjugado a que se referem.

Determinou-se a actividade de ligação dos imunoconju gados da presente invenção, num ensaio de ligação por fluorescência, descrito por Greenfield et al., em ”In vitro Evaluation of the Immunoconjugates Prepared by Linking Mitomycin C to Monoclonal Antibodies via Polyglutamic Acid Carriers in Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, (1989) Vol. 2, p.201. Resumidamente, diluiram-se em série os imunoconjugados em 100 pl de meios de ensaio (RPMI 1640 enriquecido com soro de feto de bovino a 10% e com penicilina/estreptomicina, Gibco, Grand Island, N.Y.). Recolheram-se e lavaram-se por centrífuga ção células tumorlgenas (CEM) (ATCC N9 CCL 119) (1 X 10^ células) desenvolvidas neste mesmo meio e, depois, suspenderam-se (1 χ 10θ) em meio contendo os imunoconjugados diluídos. Apôs 1 hora de incubação a 4°C, lavaram-se as células e suspenderam-se em 100 pl de meio que continha anti-IgG-FITC do rato desen volvida na cabra diluido a 1:40 (Cappel, Durham, NC) durante mais 1 hora, a 4°C. Lavaram-se as células e analisaram-se uti lizando um aparelho para analise de células por fluorescência Coulter Epics V. Para cada um dos ensaios, utilizou-se o MAb diluído de modo similar ao anteriormente descrito como um controlo de ligação positiva não conjugado. Indicam-se no Quadro 1

-68ί a percentagem de rendimento das proteínas (separadamente obtida),* as relações molares (moles de ADM/MAb) e a ligação expressa como uma percentagem da ligação original.

QUADRO 1

5E9 Imunoconjugados	Rendimento de	Relações . molares.	% de Ligação Original
Proteínas. .	(%)
Semicarbazona	83		3,42	97
Carbazona	74		4,37	92
Tio-semicarba- zona	61		2,51	72
Carboxilato-Hi- drazona	78		2,35	97
Aril-hidrazona	86		2,52	91

Tal como se indica no Quadro 1, os imunoconjugados de 5E9 conservam mais de 90% (com excepção da tio-semicarbazona) da actividade de ligação original do anticorpo 5E9 não con jugado. Este facto demonstra que a conjugação dos derivados de ADM ao MAb 5E9 origina a perda num grau relativamente pequeno da actividade de ligação do anticorpo. O rendimento das proteí nas indicou que se conservavam quantidades relativamente eleva das de proteínas ao longo do procedimento de conjugação.

Libertação de ADM a partir do Imunoconjugado de Carbazona

Também se efectuou o estudo das velocidades de libertação de ADM a partir do imunoconjugado com carbazona, da presente invenção, a pH 4,5, 5,0 e 7,4, por analise HPLC tal como anteriormente se descreveu no Exemplo 6, para os derivados de

ADM da presente invenção. Tal como se indica na Figura 13, a

-69velocidade de libertação de ADM a partir do imunoconjugado e essencialmente a mesma que se indicou no Exemplo 6 para o derivado carbazona de ADM. A quantidade de material libertado a par tir do imunoconjugado de ADM aumentou â medida que o pH diminuiu desde 7 atê 4. Este imunoconjugado contendo ADM possui um grupo de ligação sensível aos ácidos que origina a libertação de ADM a partir da proteína do anticorpo. Estes resultados são consistentes com a existência de uma ponte de hidrazona que une a ADM ao composto bifuncional.

Os dados experimentais aqui apresentados indicam que se liberta um radical ADM a partir dos imunoconjugados da presente invenção, sob condições fisiológicas, isto é, condições ácidas caracteristicas do meio lisossõmico.

Actividade citotôxica dos imunoconjugados

Determinou-se a citotoxicidade dos imunoconjugados da presente invenção, de acordo com ensaios in vitro, utilizando o Ensaio de Formação de Colónias em agar macio, utilizando células Daudi (linfoma de Burtkitt) (fenôtipo: 5E9⁺, ATCC N& HB21), tal como descrito por Greenfield et al., pedido de patente de invenção europeia n2 328 147,. supra. Desenvolveram-se as células de Daudi em meio completo (meio RPMI 1640, mais 10% de soro de feto de vitela (FCS)). Expuseram-se 1 X 10 células em 1 ml de meio, durante 1,5 horas, a imunoconjugados 5E9-ADM ou a ADM não conjugada, diluídos em série. Para cada uma das diluições efectuaram-se determinações em triplicado. As células de contro lo consistiam em células tratadas de modo similar, não expostas a fármacos. Lavaram-se depois as células e efectuou-se a sua sus pensão em meio RPMI 1640, que continha 15% de FBS e 0,3% de agarose (Marine Colloid, Rockland, ME). Colocou-se então, 1 ml da

suspensão de células (1 X 10 ) sobre uma camada de agarose a 0,4%, em placas de microtitulação de 6 cavidades (Costar, Cambridge, MA). Incubaram-se as amostras durante 7-10 dias a 37°C e coraram-se as colónias resultantes com 0,5 ml de 1 mg/ml de violeta de £-iodonitrotetrazõlio (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 48 horas. Contaram-se as colónias utilizando um ana lisador de imagem Optimax 40-10 e determinou-se a inibição de formação de colónias por comparação das células tratadas com o fármaco ou das células tratadas com os imunoconjugados, com as células de controlo não tratadas. Apresentam-se os resultados no Quadro 2, que se segue, como CI_3Q (a concentração necessária para inibir em 50% a formação de colónias).

QUADRO 2

Imunoconjugado 5E9	CI5.0	(Μ) &
Semicarbazona	>5,1 X	10’7
Carbazona	4,0 X	IO’7
Tio-semicarbazona	3,0 X	io’7
Carboxilato-hidrazona	5,9 X	io’7
Aril-hidrazona	> 6,4 X	io-7

a_M = concentração molar necessária do imunoconjugado para inibir, em 50% a formação de colónias, medida após 24 horas.

Tal como se indica no Quadro 2, além da libertação de

ADM, todos os imunoconjugados sensíveis ao pH possuem uma actividade citotóxica considerável, in vitro.

EXEMPLO 9

-71Ζ

Preparação de um Imuno conjugado' de Antraciclina contendo uma ligação Tio-éter

Neste exemplo, descreve-se um meio alternativo para a preparação de um imunoconjugado de antraciclina, de acordo com a presente invenção, em que se conjuga ADM com um anticorpo monoclonal através de um dos derivados de ADM, de acordo com a presente invenção, preparado tal como anteriormente se descre veu nos exemplos 1 a 5 e que possuem uma qualquer das cinco pon tes que se seguem: semicarbazona, carbazona, tio-semicarbazona, carboxilato-hidrazona e aril-hirazona, como ligação à molécula de ADM. Além disso, o imunoconjugado tem uma ligação tio-éter como parte da sua ligação ao anticorpo.

Fez-se reagir o MAb 5E9 (2,5 mg em 2,5 ml de PBS) com SNPB (4-(p-maleimidofenil)-butirato de succinimidilo, 54,5 ^J.g em 100 jil de tetra-hidrofurano) a 30°C durante 30 minutos. Ajus tou-se o pH para 6,0 com tampão de citrato de sédio. Passou-se a mistura através de uma coluna de filtração em gel, PD-10 (Phar macia), para separar o anticorpo que contêm maleimida, dos produtos que não reagiram. Dissolveram-se, então, os derivados de ADM (1 mg), preparados tal como anteriormente se referiu, em 1 ml de MeOH/E^O (9:1) e fez-se reagir 0,5 pmole de cada um dos derivados de ADM com 0,5 jimole de tri-n-butil-fosfina em uma mis tura de acetona/ãgua a 4:1, para se preparar a forma reduzida do derivado de ADM. Decorridos 10 minutos, adicionou-se 0,1 N de en xofre em tolueno, para destruir a fosfina restante. Misturaram-se, então os derivados de ADM reduzidos com o MAb 5E9 que contêm maleimida. Purificaram-se os imunoconjugados assim produzidos, fazendo-os passar através de uma coluna de filtração por

-72gel PD-10. Nos casos em que nao se efectuou completamente, a remoção do dissolvente tolueno e uma camada de dissolvente or gânico se separa, fazendo flutuar algumas proteínas da mistura reaccional, utiliza-se um jacto de ar suave para se remover o dissolvente e removem-se as proteínas desnaturadas fazendo girar a mistura durante 2 minutos a 16 000 Xg. O sobrenadante límpido contém os imunoconjugados e, é filtrado através de gel e analisado em PBS, a um pH de 7,4. Determinou-se a relação mo lar ADM/anticorpo, espectrofotometricamente, utilizando ^DG280 e ^d°4957 tal como anteriormente se referiu. Uma reacção caracteristica proporciona imunoconjugados com relações molares com preendidas entre 3 e 4.

A actividade de ligação e a actividade citotoxica dos imunoconjugados preparados do modo anteriormente descrito neste exemplo, ensaiaram-se tal como se referiu anteriormente.

Os exemplos anteriores demonstraram a preparação de novos compostos bifuncionais hidrazina N-substituidos, novos de rivados hidrazona N-substituidos de ADM, preparados com estes compostos bifuncionais e novos imunoconjugados nos quais ADM se encontra conjugada com um anticorpo através de uma nova ligação sensivel aos ãcidos. Os novos compostos bifuncionais são facilmente conjugáveis com um reagente citotõxico, com ADM e com uma molécula por alvejar células, um anticorpo monoclonal. Os conju gados conservaram tanto a actividade de ligação (isto ê, a espe cificidade para alvejar uma determinada população de células) como a actividade citotoxica do fãrmaco e libertavam ADM, livre e não modificada, sob condições de meio acido, caracteristicas do meio celular das células alvo.

Deste modo, os novos compostos bifuncionais dos imuno conjugados da presente invenção, mostraram-se prometedores na

conjugação de moléculas úteis, especialmente, para fornecimento de fãrmacos citotôxicos a uma população de células alvo, com o objectivo de aniquilar preferencialmente essas células no tra tamento de doenças, tais como cancros e outros tumores, infecções virais não citocídicas e de outras infecçoes patogénicas e em distúrbios de carácter auto-imunitário.

Embora se tenha anteriormente apresentado diversos as pectos da presente invenção, ê evidente que se pode alterar a sua descrição base, de modo a proporcionar outros aspectos, nos quais se podem utilizar os compostos bifuncionais, derivados de reagentes citotôxicos, conjugados e métodos da presente invenção.

No entanto, deverá considerar-se que o âmbito da presente invenção se encontra essencialmente definido pelas reinvindicações em anexo e não pelos aspectos específicos que se apresentaram anteriormente apenas a tílulo de exemplo.

Claims (58)

1. REIVINDICAgÕES

   1.- Processo para a preparação de hidrazinas N-substi tuídas bifuncionais de fórmula geral

   H₂NNHCONH(CH₂)_nSSRg na qual n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 10; e

   Rg representa um grupo de fórmula geral

   X

   -75em que

   X representa um átomo de hidrogénio ou de halogêneo ou um grupo N0₂, caracterizado pelo facto:

   a) de se fazer reagir cloreto de metoxicarbonilsulfeni lo com cloridrato de 2-aminoetanotiol e 2-mercaptopiridina para formar cloridrato de 2-[ (2-piridinil)-ditio]-etanamina;

   b) de se fazer reagir o referido cloridrato com trietilamina e fosgénio e carbazato de butilo terc. para formar N—[2-((2-piridinil)-ditio]-etil]-2-[butoxi terc.-carbonil)-hidrazinacarboxamida; e

   c) de se fazer reagir a referida hidrazinacarboxamida com ácido trifluoroacêtico para formar N-[2-[(2-piridinil)-ditio] -etil]-hidrazinacarboxamida.
2. 2.- Processo para a preparação de hidrazinas N-subs tituídas bifuncionais de fórmula geral

   H-NNHCONHNHCONH(CH-) SSR2 2 η o na qual n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 10; e

   R_g representa um grupo de fórmula geral ou

   X

   X em que

   X .representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo N0₂, caracterizado pelo facto:

   a) de se fazer reagir carbazato de butilo terc., trietilamina, trifosgénio e cloridrato de 2-(2-piridinilditio) -etanamina para formar di-hidrazida 2-[[[2-[(2-piridinil)-ditio]-etil]-amino]-carbonil]-2,2’-bis(butoxil terc.-carbonil)-carbónica; e

   b) de se fazer reagir a referida di-hidrazida N-butoxicarbonil-carbónica com ácido trifluoroacêtico para formar di-hidrazida 2-[[[2-[(2-piridinil)-ditio]-etil]-amino]-carbonil]-carbónica.
3. 3.- Processo para a preparação de hidrazinas N-substituídas bifuncionais de fórmula geral

   H-NNHCSNH(CH-) CH=CH(CH-) SSR_a z z m ζ π o na qual m e n representam números inteiros compreendidos entre 1 e 10, os quais são iguais ou diferentes; e Rg representa um grupo de fórmula geral ou

   X

   X em que

   X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo N0₂, caracterizado pelo facto:

   a) de se fazer reagir l,4-dibromo-2-buteno com ftalimi da de potássio para formar l-bromo-4-(N-ftalimido)-2-buteno;

   b) de se fazer reagir o referido bromobuteno com tioacetato de potássio para formar 1-(acetiltio)-4-(N-ftalimido) -2-buteno;

   c) de se fazer reagir o referido acetiltiobuteno com hidrazina para formar cloridrato de l-amino-4-mercapto-2-buteno;

   d) de se fazer reagir o referido amino-mercaptobuteno com cloreto de metoxicarbonil-sulfenilo e 2-mercaptopiridina pa ra formar cloridrato de l-amino-4-[ (2-piridinil)-ditio]-2-buteno;

   e) de se fazer reagir o referido cloridrato de amino-buteno com trietilamina (TEA) e tionocarbonato de di-2-piridini lo e carbazato de butilo terc. para formar a carbotioamida protegida do derivado t-boc de N-[4-[ (2-piridinil)-ditio]-2-butenil]-hidrazinacarbotioamida; e

   f) de se fazer reagir o referido derivado t-boc com áci do trifluoroacêtico para formar N-4-[(2-piridinil)-ditio]-2-butenil]-hidrazinacarbotioamida.
4. 4.- Processo para a preparação de hidrazinas N-substi tuídas bifuncionais de fórmula geral

   H_ONNHCOO(CH_) SSR_a 2 2 n o na qual n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 10; e

   Rg representa um grupo de fórmula geral . -> em que

   X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo NO₂, caracterizado pelo facto:

   a) de se fazer reagir cloreto de clorocarbonil-sulfenilo com 2-mercaptoetanol e 2-mercaptopiridina e depois com carbonato de amónio para formar 2-(2-piridinilditio)-etanol; e

   b) de se fazer reagir o referido 2-(2-piridinilditio)-etanol com carbonildiimidazol e hidrazina para formar carboxila to de 2-[ (2-piridinil)-ditio]-etil-hidrazina.
5. 5.- Processo para a preparação de hidrazinas N-substi tuídas de fórmula geral

   H₂NNH-Ar-CONH (CH^SSRg

   -ή

   -./ na qual n representa um número inteiro compreendido entre 1 e 10; e

   Rg representa um grupo de fórmula geral em que

   X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo NOg e Ar representa caracterizado pelo facto:

   a) de se fazer reagir ácido p-hidrazinobenzóico com di-t-butilpirocarbonato para formar ácido 4-(N-boc-hidrazino)-benzóico;

   b) de se fazer reagir o referido ãcido 4-(N-boc-hidrazino)-benzóico com N-hidroxi-succinimida e DCC para formar o éster N-hidroxi-succinimídico do ácido 4-(N-boc-hidrazina)-benzóico:

   c) de se fazer reagir o referido éster com cloridrato de 2-(2-piridinilditio.)-etilamina e trietilamina para formar

   Ν- [2- (2-piridinil) -ditio] -etil-4- (N-boc-hidrazino)-benzamida; e

   d) de se fazer reagir N-[2-[(2-piridinil)-ditio)-etil-4-(N-boc-hidrazino)-benzamida com ácido trifluoroacético para formar N-[2-[(2-piridinilditio)-etil]-4-hidrazinobenzamida.
6. 6. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se reduzir o referido composto assim obtido para formar um grupo sulfidrilo livre.
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracte rizado pelo facto de o reagente redutor ser ditiotreitol ou tributilfosfina.
8. 8. - Processo para a formação de um conjugado de um dos compostos obtidos nas reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se combinar o referido composto oom pelo menos uma molé cuia contendo um grupo carbonilo livre e pelo menos uma molécula contendo um grupo sulfidrilo.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a referida molécula contendo um grupo carbonilo ser um reagente citotôxico.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido reagente citotôxico ser uma

    -81 * antraciclina.
11. 11.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado pelo facto de a molécula contendo um grupo sulfidrilo ser uma molécula reactiva com uma população de células alvo.
12. 12.terizado pelo noclonal.

    Processo de acordo com a reivindicação 11, caracfacto de a referida molécula ser um anticorpo mo
13. 13.- Processo para a preparação de um conjugado, carac terizado pelo facto de se combinar um composto preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 6 com pelo menos uma molécula contendo um grupo carbonilo livre e pelo menos uma molécula possuindo grupos maleiimida ligados.
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a referida molécula contendo um grupo car bonilo livre ser uma antraciclina e de a referida molécula possuindo grupos maleiimida ligados ser um anticorpo.
15. 15. - Processo para a preparação de um derivado de antraciclina, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um composto preparado de acordo com as reivindicações 1 a 5 com uma antraciclina.
16. 16.- Processo de acordo com a reivindicação 15, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser seleccionada entre o grupo constituído por adriamicina, daunomicina, detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, esorubicina, 4’-THP-adriamicina, AD-32 e 3'-desamino-3'-{3-ciano-4-morfolinil)-doxorubicina.
17. 17. - Processo para a preparação de um conjugado, caracterizado pelo facto de se fazer reagir o derivado de antraci clina preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 15 com uma molécula reactiva com uma população de células alvo.
18. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, carac terizado pelo facto de a referida molécula ser um anticorpo reactivo com células tumorais.
19. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado pelo facto de o anticorpo monoclonal seleccionado entre o grupo constituído por 5E9, L6, 3A1 e G28,5.
20. 20. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de a antraciclina ser adriamicina e o referido anticorpo ser 5E9.
21. 21. - Processo de acordo com a reivindicação 17, carac-83terizado pelo facto de a referida molécula ser um ligante.
22. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 21, carac terizado pelo facto de o ligante ser uma molécula de proteína, polipeptído ou péptido.
23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de o ligante ser seieccionado entre o grupo constituído por bombesina, EGF, transferrina, gastrina, péptido libertador de gastrina, factor de crescimento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, TGF- Qe , TGF— , VGF, insulina e factores de crescimento I e II semelhantes a insulina.
24. 24. - Processo de acordo com a reivindicação 21, carac terizado pelo facto de o ligante ser um ligante não peptidílico seieccionado entre o grupo constituído por hidratos de carbono, esteróides e lectinas.
25. 25. - Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser cloridrato de semicar bazona de 13-N-[2-[(2-piridinil)-ditio]-etil]-hidrazinacarboxamida de adriamicina.
26. 26. - Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser cloridrato de di-hidra

    -84zida-carbazona de 13-2-[[[2-[(2-piridinil)-ditio]-etil]-amino]-carbonil]-carbónica de adriamicina.
27. 27. - Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser cloridrato de tio-semicarbazona de 13-N-4-[(2-piridinil)-ditio]-2-butenil-hidrazinacarbotioamida de adriamicina.
28. 28. - Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser cloridrato de carboxi lato-hidrazona de 13-2[ (2-piridinil)-ditio]-etil-hidrazina-carboxilato de adriamicina.
29. 29. - Processo de acordo cora a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser cloridrato de aril-hi drazona de 13-N-[2-[(2-piridinilditio)-etil]-4-hidrazina-benzamida de adriamicina.
30. 30. - Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser um derivado de antraciclina de fórmula geral na qual

    R^ representa - um-grupo-de fórmula geral

    NHCONH(CH₂)_nSSRg; NHCONHNHCONH(CH₂)_nSSRg,

    NHCSNH(CH₂)_mCH=CH(CH₂)_nSSRg; NHCOO(CH₂)_nSSRg ,·

    NH-Ar-CONH(CH-)„SSR_Q; NCONH(CH_O)„S-H;

    ζ π O Ζ IX

    NHCONHNHCONH(CH-) S-H; NHCSNH(CH_) CH=CH(CH-) S-H;

    2 n 2 m 2 n

    NHCOO(CH_) S-H ou NH-Ar-CONH(CH_O) S-H;

    2 n 2 n em que men representam números inteiros compreendidos entre 1 e 10, os quais são iguais ou diferentes;

    Rg representa um grupo de fórmula geral

    X em que

    X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo N0₂ e Ar representa um grupo

    R₂ representa um grupo CHg, CH₂OH, CH₂OCO(GH₂)gCHg, ou CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂;

    Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo OCHg ou OH;

    R^ representa um grupo NH₂, NHCOCF^, 4-morfolinilo,

    3-ciano-4-morfolinilo, 1-piperidinilo, 4-metoxi-l-piperidinilo, benzilamina, dibenzilamina, cianometilamina, ou l-ciano-2-metoxietilamina;

    Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo OH ou O-THP; e

    Rg representa um átomo de hodrogénio ou um grupo OH, com a condição de Rg não representar um grupo OH quando Rg representa um grupo OH ou O-THP.
31. 31.- Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser um derivado de antraciclina de fórmula geral na qual.

    R^ representa um grupo de fórmula geral

    NHCONH(CH-)_SSR_Q; NHCONHNHCONH(CH-)SSR-;

    ί η o 2 η o

    NHCSNH(CH₂)_mCH=CH(CH₂) _nSSRg; NHCOO(CH₂)_nSSRg;

    NH-Ar-CONH(CH-) SSR_Q; NCONH(CH-) S-H;

    2 n o 2 n

    NHCONHNHCONH(CH-) S-H; NNHCSNH(CH_) CH=CH(CH„) S-H;

    2 n 2 m 2 n

    NHCOO(CH₂)_nS-H ou NH-Ar-CONH(CH₂)_nS-H; em que men representam números inteiros compreendidos entre 1 e 10, os quais são iguais ou diferentes;

    Rg representa um grupo de fórmula geral

    X em que

    X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo N0₂ e Ar representa um grupo

    R₂ representa um grupo CHg, CH₂OH, CHjOCO (Cí^^CHy ou CH₂OCOCH(OC₂H₅)₂;

    R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo OH ou OCH₃;

    R^ e R^ representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo substituído, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, arilo, arilo substituído , aralquilo ou aralquilo substituído ; ou r₄, Ry e N formam em conjunto um anel com 4 a 7 membros, o qual pode ser eventualmente substituído;

    R5 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo OH ou O-THP; e

    Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo OH, com a condição de Rg não representar um grupo OH quando Rg representa um grupo OH ou O-THP.
32. 32. - Processo para a preparação de um conjugado, carac terizado pelo facto de se incorporar o derivado de antraciclina preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 30 ou 31 conjugado com pelo menos uma molécula reactiva.com uma população de células alvo.
33. 33. - Processo para a preparação de um conjugado compreendendo o derivado de antraciclina de acordo com as reivindicações 30 ou 31 conjugado com pelo menos um anticorpo, caracteri zado pelo facto de se fazer reagir o anticorpo com um agente de tiolação antes de se conjugar o referido anticorpo com o referido derivado de antraciclina.
34. 34. - Processo de. acordo com a reivindicação 33, caracs terizado pelo facto de o referido anticorpo ser reactivo com ce lulas tumorais.
35. 35. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser um anticorpo monoclonal seleccionado entre o grupo constituído por 5E9, L6,3A1 e G28,5.
36. 36. - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de o agente de tiolação ser SPDP ou 2-iminotiolano (2-IT).
37. 37. - Processo para a preparação de um conjugado compreendendo o derivado antraciclina de acordo com as reivindica ções 30 ou 31 conjugado com pelo menos um anticorpo, caracteri. zado pelo facto de o referido derivado de antraciclina ter sido reduzido antes da conjugação com o referido anticorpo e por compreender o passo de ligação dos grupos maleimida ao anticor po antes da reacção do referido anticorpo com o referido derivado.
38. 38. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de os grupos maleimida estarem ligados por reacção do anticorpo com butirato de succinimidil-4-(p-maleimido-fenilo).
39. 39. - Processo de acordo com a reivindicação 32, carac terizado pelo facto de a molécula reactiva com uma molécula de células alvo ser um ligante reactivo com uma população de células alvo.
40. 40. - Processo de acordo com a reivindicação 39, carac terizado pelo facto de o ligante ser seleccionado entre o grupo constituído por moléculas proteicas, polipeptídicas e peptidicas-.
41. 41.- Processo de acordo com a reivindicação 40, carac- terizado pelo facto de o ligante ser seleccionado entre o grupo constituído por bombesina, EGF, transferrina, gastrina, péptido libertador de gastrina, factor de crescimento derivado de plaque tas, IL-2, IL-6, TGF-^C , TGF-, VGF, insulina e factores de crescimento I e II semelhantes a insulina.
42. 42.- Processo para a preparação de um conjugado, carac terizado pelo facto de se incorporar pelo menos uma molécula pos suindo um grupo carbonilo livre ligado por um composto bifuncio nal possuindo um radical orto-nitrofenilditio ou piridinilditio reactivo a pelo menos uma molécima possuindo um grupo sulfidrilo livre, estando o referido composto bifuncional ligado à molécula possuindo um grupo sulfidrilo livre por uma ligação seleccionada entre o grupo constituído por ligações semicarbazona, carbazona, tio-semicarbazona, carboxilato-hidrazona e aril-hidra zona.
43. 43. - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de a molécula possuindo um grupo carbonilo livre ser uma molécula reagente citotoxica.
44. 44. - Processo de acordo com a reivindicação 43, carac terizado pelo facto de a molécula reagente citotoxica ser uma mo lécula de um reagente quimioterapêutico.
45. 45. - Processo de acordo com a reivindicação 44, carac terizado pelo facto de o reagente guimioterapêutico ser uma antraciclina e o composto bifuncional estar ligado ao grupo ceto na posição C-13 da referida molécula de antraciclina.
46. 46. - Processo de acordo com a reivindicação 45, carac terizado pelo facto de a antraciclina ser seleccionada entre o grupo constituído por adriamicina, daunanicina, detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, esorubicina, 4’-THP-adriamicina, AD-32 e 3’-desamino-3’-(3-ciano-4-morfolinil)-doxorubicina.
47. 47. - Processo de acordo com a reivindicação 42, carac terizado pelo facto de a referida molécula reactiva com as célu las ser um anticorpo ou um ligante.
48. 48. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo facto de a molécula ser um anticorpo reactivo com células tumorais.
49. 49. - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser reactivo com um antigénio associado com carcinomas, melanomas, linfornas, sarcomas de tecidos moles ou de osso.
50. 50.terizado pelo

    Processo de acordo com a reivindicação 49, caracfacto de o anticorpo ser um anticorpo monoclonal.
51. 51. - Processo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser seleccionado entre o grupo constituído por 5E9, L6, 3A1 e G28,5 e a antraciclina ser adriamicina.
52. 52. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo facto de a molécula ser um ligante.
53. 53. - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de o ligante ser seleccionado entre o grupo constituído por moléculas proteicas, polipeptícicas e peptídicas.
54. 54.- Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo facto de o ligante ser seleccionado entre o grupo constituído por bombesina, EGF transferrina, gastrina, péptido libertador de gastrina, factor de crescimento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, TGF-^X, , TGF- , VGF, insulina e factores de crescimento I e II semelhantes a insulina.
55. 55.- Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de o ligante ser um ligante não peptidílico.
56. 56. - Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo facto de o ligante ser seleccionado entre o grupo constituído por hidratos de carbono, esterôides e lectinas.
57. 57. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se incorporar, como ingrediente activo, uma quantidade efectiva de pelo menos um conju gado preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 41 em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
58. 58. - .Método para a administração de antraciclinas a uma população de células alvo a serem tratadas, caracterizado pe lo facto de se administrar 1 a 100 mg/m2 de antraciclina ou

    500 a 5 000 mg/m2 de anticorpos preparados pelo processo de acor do com a presente invenção.