JP2000026404A - 新規な二官能性化合物を含むコンジュゲ―ト及びその製法 - Google Patents

新規な二官能性化合物を含むコンジュゲ―ト及びその製法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞毒性試薬分子のドラッグデリバリーに適
したコンジュゲートを提供する。 【解決手段】 本発明は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二官
能性化合物、二官能性化合物に結合した細胞毒性試薬の
新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体、二官能性化合物と反応
した細胞毒性試薬分子少なくとも一つを含み、標的細胞
集団と反応する一分子と結合した新規コンジュゲート、
その製造方法および細胞毒性試薬を細胞の標的集団へ運
搬するための薬剤組成物および方法を提供する。本発明
のコンジュゲートのヒドラゾン結合は、標的細胞の外ま
たは内の酸性環境で、コンジュゲートからフリーの細胞
毒性試薬を放出させる。本発明の二官能性化合物、誘導
体、コンジュゲートおよび方法は、がん、感染、自己免
疫不全のような疾患を治療するため、標的細胞集団を選
択的に殺すための、抗体またはリガンドを介する薬剤輸
送システムで有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規な二官能性化合
物を含むコンジュゲート、その製法及びその使用法に関
する。さらに詳しくは、本発明は、細胞集団ターゲッテ
ィングのための分子と連結できるＮ−置換ヒドラジン化
合物を含むコンジュゲートに関する。
【０００２】
【従来の技術】二またはそれ以上の分子が連結できる二
官能性化合物はすでに知られている。例えば、細胞毒性
試薬を、細胞集団ターゲッティングのための分子に連結
する二官能性化合物は知られている。二官能性化合物
は、生体内でこのタイプの細胞毒性試薬の運搬と放出が
可能でなければならず、例えば、ターゲッティング分子
の活性を損なうことなく、生体内で治療上十分なレベル
の試薬を供給しなければならない。確実な適用のために
は、試薬とターゲッティング分子間にｐＨに敏感な連結
を含むコンジュゲートが形成され、ｐＨの一定の範囲で
細胞毒性試薬が放出されることが望まれる。
【０００３】がんの治療に特に有用な試薬は、アントラ
サイクリンである。アントラサイクリンは、細胞毒活性
を示す抗生物質化合物である。アントラサイクリンは、
以下のいくつかの異なるメカニズムによって、細胞を殺
す作用をするであろうことが研究されている。１）薬剤
分子の、細胞のＤＮＡへのインターカレーション、それ
によるＤＮＡ依存性核酸合成の阻害。２）細胞巨大分子
と反応して、細胞に損傷を引き起こすフリーラジカル
の、薬剤による生成。３）薬剤分子と細胞膜との相互作
用（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｐ
ｏｒｔ ＡｎｄＳｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ａｎｔｈｒａｃ
ｙｃｌｉｎｅｓ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉ
ａ”，ｉｎＡｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｓ Ｉｎ ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ．Ｍｕ
ｇｇｉａ ｅｔ ａｌ（Ｅｄｓ．），ｐ．１３２（Ｍａ
ｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
（１９８２）およびＢａｃｈｕｒ，“Ｆｒｅｅ Ｒａｄ
ｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ”，ｉｄ．ｐｐ．９７−１０
２）。その細胞毒性の高さ故に、アントラサイクリン
は、白血病、乳がん、肺がん、卵巣腺がん、肉腫のよう
な多くのがんの治療に用いられてきた（Ｗｉｅｒｎｉ
ｋ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ｏｆ Ａｄｒｉ
ａｍｙｃｉｎ Ａｎｄ Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”，ｉｎ Ａｎｔｈ
ｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ
ＡｎｄＮｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｃｒｏｏ
ｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ，），ｐｐ．２７３−９４
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８０））。通常
用いられるアントラサイクリンは、アドリアマイシン
（ＡＤＭドキソルビシンとしても知られる）とダウノマ
イシン（ＤＡＵダウノルビシンとしても知られる）を含
む。
【０００４】これら化合物は、新生物や、標的細胞集団
が弱められるか除去されるかが求められるような他の疾
患の状態の治療で有用であるかもしれないが、その治療
効果は、その投与に関係する服量依存性の毒性によっ
て、しばしば制限される。例えば、腫瘍の治療で、これ
ら化合物の典型的逆副作用は、骨髄障害と心臓毒性であ
る（Ｃｒｏｏｋｅ，“Ｇｏａｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｈｒ
ａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ Ａｔ Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ”，Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ： Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＳｔａｔｕｓＡｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ，前述、ｐ１１）。それ故腫瘍の治療でこれら化合
物の治療効果を改善するために、アントラサイクリン
を、腫瘍関連の抗原に向かう抗体に連結して、腫瘍細胞
へ薬剤を選択的に運搬するためのイムノコンジュゲート
形成の試みがされた。（Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ
Ｓｅｉｌｅｒ，“Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ Ｗｉ
ｔｈ ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕ
ｇ（Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ”，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉ．Ｍｉｔｌ．８２：
１９７−２１５（１９８８））。この方法で薬剤は腫瘍
の場所へ運搬または“ターゲッティング”でき、全身の
正常な細胞への有毒な副作用が減せるかもしれない。腫
瘍関連の抗原に対するポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体に連結した、アントラサイクリンＡＤＭまたは
ＤＡＵを含むイムノコンジュゲートはすでに知られてい
る（例えばＧａｌｌｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｄａｕｎｏｍｕｃｉ
ｎ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ７９１
Ｔ／３６ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ａｎｔｉ
−Ｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ ３３：７３７−４４（１９８４）、及びＡｒ
ｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｎｄ
Ｉｎ ＶｉｔｒｏＥｆｆｉｃａｃｙ Ｏｆ Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅｓ Ｏｆ Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ｗｉｔｈ
Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．６２：５−２７（１
９８２））。
【０００５】アントラサイクリンの抗体への付着への、
最もしばしば用いられるアプローチは、アントラサイク
リンのアミノ糖部分での連結が利用されてきた。例えば
アミノ糖は、過酸化ナトリウムで酸化され、Ｓｃｈｉｆ
ｆ塩基形成を介して、抗体のリジン残基に直接付着させ
た（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｃｏｖ
ａｌｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｏｆ Ｄａｕｎｏｍｙｃ
ｉｎ Ａｎｄ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ Ｔｏ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｔｈ ＲｅｔｅｎｔｉｏｎＯｆ Ｂ
ｏｔｈ Ｄｕｒｇ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｃｔ
ｉｖｉｔｉｅｓ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：１１
７５−１１８１（１９７５））。一方アントラサイクリ
ンのアミノ基と抗体のカルボキシル基との、カルボジイ
ミドを介する連結を通じて、アントラサイクリンは抗体
に連結された（Ｈｕｒｗｉｔｚｅｔ ａｌ．，前述）ま
たはアミノアルキル基（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａ
ｌ．，“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｏｆ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ−Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｉｎ Ｔｗｏ
Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｕｍｏｒ
Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２１：
７４７−７５５（１９７８））。これらと連結は容易に
加水分解されず、アントラサイクリンの放出管理を難し
くしている。又、薬剤のアミノ糖と抗体のアミノ基と
の、グルタルアルデヒドによるクロス連結によって、ア
ントラサイクリンは抗体に連結された（Ｂｅｌｌｅｓ−
Ｉｓｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｃ
ｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ−Ａｎｔｉ
−ＡｌｐｈａＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ Ｏｎ Ｍｏｕｓｅ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌ
ｓ”，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１，ｐｐ．８４１−
４２（１９８０））。しかしアントラサイクリン分子の
アミノ糖部分が、抗体との連結によって変形されたイム
ノコンジュゲートの研究で、コンジュゲートした薬剤の
細胞毒活性の損失が示された（Ａｒｎｏｎｅｔ ａ
ｌ．，前述，ｐ７−８）。更にアントラサイクリン類似
体の研究で、アントラサイクリンのアミノ糖を変形する
と、薬剤類似体の細胞毒活性が、親の薬剤に比し減少す
る結果となる（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａ
ｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｓｏｍｅ
Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ＯｆＤａｕｎｏｍｙｃｉｎ
Ａｔ Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｎｄ ＭｅｔｈｙｌＫ
ｅｔｏｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈ
ｅｍ．１５：８７２−７５（１９７２））。
【０００６】アントラサイクリンＤＡＵが、薬剤のＣ−
１４位置で抗体に直接連結したイムノコンジュゲートが
製造された。しかし腫瘍細胞へ向うこれらイムノコンジ
ュゲートの選択的細胞毒活性が容易に再生できず、２０
μｇ／ｍｌの濃度でだけ一貫して表われた（Ｇａｌｌｅ
ｇｏ ｅｔ ａｌ．，前述）。
【０００７】日本特許出願２７４６５８は、Ｃ−１３ア
シルヒドラゾン連結を介する、アントラサイクリンと抗
体とのコンジュゲート化を示している。このコンジュゲ
ート化は、抗体の誘導化と、その誘導体とアントラサイ
クリンとのその後の反応を含む方法で達成された。抗体
の誘導体化が望ましくない非特異的反応を含み、アント
ラサイクリン：抗体の比が非常に低いために、この方法
は不都合である。第一の方法によると、抗体をヒドラジ
ンの存在下カルボジイミドで処理して、ヒドラジド抗体
誘導体とし、次にアントラサイクリンと反応させて、ア
ントラサイクリンを抗体構造に直接連結した。しかし、
その結果生じたイムノコンジュゲートは、抗体分子の集
合体の傾向がある。更にこの方法は、数が限られるだろ
うカルボキシル基が求められるために、このコンジュゲ
ートは、アントラサイクリン：抗体の比が、約１．１〜
１．３と低い。第二の方法は、抗体を無水コハク酸と反
応させて、抗体のヘミ−コハク酸誘導体とする反応を含
む。この誘導体を次にヒドラジンと反応させて、抗体ヒ
ドラジド誘導体とし、更にアントラサイクリン、ダウノ
マイシンと反応させる。抗体誘導体とヒドラジンとの反
応が非特異的であり、望むヒドラジド誘導体に加えて、
種々の抗体誘導体の混合物を生成することにより、この
第二のアプローチは無効である。こうして、２７４６５
８出願に示されている通り、アントラサイクリンの抗体
に対するモル比が非常に低い（約１、日本出願２６４頁
１段を見よ）。又欧州特許出願、公開Ｎｏ．２９４２９
４には、アントラサイクリンのＣ−１３ヒドラゾン誘導
体と、抗体の炭化水素部分とのコンジュゲートが示され
ている。
【０００８】他にもアントラサイクリンヒドラゾンが示
されている（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．，２１：７３２−３７（１９７８）、Ｓｍｉｔ
ｈｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１：２８
０−８３（１９７８）、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｐｐ．６５９−６１
（１９８６））。米国特許４，１１２，２１７に、ＤＡ
ＵとＡＤＭのビス−ヒドラジンが示されている。
【０００９】他方、アントラサイクリンは、デキストラ
ンまたはポリグルタミン酸のような高分子量担体と連結
して、薬剤の細胞毒活性を高め、毒性を減している（Ａ
ｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，前述ｐ５およびＨｕｒｗｉｔ
ｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｍａｃｒｏｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｓ Ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ＦｏｒＤａ
ｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２，ｐｐ２５−３５（１９８０））。これら担体連
結のアントラサイクリンは、腫瘍細胞へ特異的に細胞毒
性試薬をターゲッティングするために、腫瘍関連の抗原
に向かう抗体と共有結合して、イムノコンジュゲートを
形成する。例えば、カルボキシ−メチル−デキストラン
ヒドラジドブリッジを介して、ＡＤＭはそのような“抗
腫瘍”抗体と連結し、そのヒドラジドブリッジでは、Ａ
ＤＭ分子はＣ−１３カルボニルでカルボキシメチルデキ
ストランのヒドラジド誘導体と連結して、ヒドラゾンを
形成している。その後抗体が、グルタルアルデヒドによ
りデキストランヒドラジド誘導体と連結して、アドリア
マイシン−デックス−抗体コンジュゲートを形成する
（Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｓ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｆ
ｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕ
ｇｏ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｈｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３６５−８３（１９８５）お
よびＨｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ Ｏｆ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ Ａｎｄ Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｏ Ｔｈ
ｙ−１ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａ Ｈｕ
ｍａｎ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｉ
ｎ Ｖｉｔｒｏ”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．４１７，ｐｐ．１２５−３６（１９８３））。
【００１０】しかし、担体の利用には確実に不利な点が
ある。例えば、担体を含むイムノコンジュゲートは大変
かさが大きく、生体内で細網内皮系により急速に移動す
る（Ｄｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｏｆ Ｔ１
０１ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｎ
ｄ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．４６：４８８６−９２（１９８６））。担体を含む
イムノコンジュゲートの速い動きは、コンジュゲートし
た薬剤が作用の予定された場所へ、すなわち殺されるべ
き細胞の標的群へ着かないかもしれないため、治療上不
利かもしれない。更に高分子量担体の存在は、イムノコ
ンジュゲートの安定性に悪い影響をあたえ、コンジュゲ
ートの抗体の結合活性を減すことが示された（Ｅｍｂｌ
ｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅ
ｎｔｓ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３２３−２４（１９８
５））。更に腫瘍細胞を研究すると、高分子量担体を含
むイムノコンジュゲートが、生体内で腫瘍細胞に局在す
る証拠はない。（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｎｄ ＴｏｘｉｃｉｔｙＳｔｕｄ
ｙ Ｏｆ Ａ Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ−Ａｎｔｉ−ＣＥＡ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉ
ｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒ”，Ｂｒ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ ４７：３５−４２（１９８３）は直接コ
ンジュゲートした薬剤−抗体コンジュゲートの、生体内
腫瘍細胞への局在を説明しているで、比較せよ）。
【００１１】こうして、特定の連結や担体の利用によ
る、アントラサイクリンと抗体とのコンジュゲート化は
示されている。上に概略を述べたように、これらイムノ
コンジュゲートの使用は、用いた特定の連結または担体
によっては明確に不利である。
【００１２】リガンド−毒素のコンジュゲートも示され
ている。Ｐａｓｔａｎによる米国特許４，５４５，９８
５は、プソイドモナル（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒
素（ＰＥ）が、多数のＥＧＦ受容体をもつ細胞に対して
用いるために、１：２の比でＥＧＦと連結した外毒素コ
ンジュゲートを示している。ＥＧＦ−リチンＡおよびＥ
ＧＦ−ジフテリア毒素コンジュゲートも作られた（Ｃａ
ｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒ
ｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｔｏｘｉｎ Ａ Ｃｈａｉｎ
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： ＥＧＦ−Ｒｉｃｉｎ Ａ
Ｉｓ Ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｔｏｘｉｎ Ｗｈｉｌｅ Ｅ
ＧＦ−Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａ
Ｉｓ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ”，Ｃｅｌｌ ２２：５６３−
７０（１９８０）およびＳｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａ
ｌ．，“Ａ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｃｒｏｓｏ−Ｌｉｎｋ
ｅｄＴｏ Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ Ｔｏｘｉｎ Ａ−Ｆ
ｒａｇｅｍｅｎｔ”，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １１
８（Ｎｏ．２）：２７４−７８（１９８０））。更にプ
ソイドモナス外毒素融合タンパク質は、タンパク質、ポ
リペプチドおよびＴＧＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｃ
Ｄ４のような増殖因子を用いて製造された（Ｐａｓｔａ
ｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
ＡｇｅｎｔｓＣｒｅａｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｆｕｓ
ｉｏｎ Ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎｄ
Ｔｏｘｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｌ．Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｙＩｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ，Ｐ３６（３月３０日
−４月１日 １９８９）、Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：１９２２−２６（１９８８）、Ｃｈａｕｄ
ｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８４：４５３８−４２（１９８
７），Ｓｉｅｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９７３８−４
２（１９８８），Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ，３３５：３６９−７２（１９８８））。
ジフテリア毒素−α−メラニン細胞刺激ホルモン融合タ
ンパク質が作られた（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，
“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ｓｅｌ
ｅｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ａ
ＤｉｐｈｔｈｅｒｉａＴｏｘｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ α
−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈ
ｏｒｍｏｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：８
２５８−６２（１９８６）。およびＭｕｒｐｈｙによる
米国特許４，６７５，３８２）。しかしタンパク毒素を
含むリガンドコンジュゲートは、異種の宿主に免疫原で
あるかもしれない。
【００１３】更に、ＡＤＭまたはＤＡＵのようなアント
ラサイクリンは、トランスフェリンのような一定のタン
パク質またはポリペプチドリガンドに化学的に連結した
（英国特許出願ＧＢ２１１６９７９Ａ）、またメラノト
ロピンに連結した（Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅ
ｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ−Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ Ｓｈｏｗｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｆｏｒ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅ
ｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ２６７：５６−５８（１９７
７））。ＰＣＴ特許出願Ｗ０ ８８／００８３７は、Ｅ
ＧＦが高分子担体を介してＤＡＵのような細胞毒性物質
と連結したことを示し、米国特許４，５２２，７５０と
４，５９０，００１は、トランスフェリンがビンカアル
カロイドやプラチナにそれぞれ連結したことを示してい
る。
【００１４】イムノコンジュゲートに用いられた細胞毒
性試薬は、条件付放出メカニズムを介して放出されるべ
きであって、すなわち、漸次の、非特異的な場所の加水
分解でなく、特定の場所で放出されるべきである。特定
のイムノコンジュゲートがリソソームへ輸送されると提
案された（ｄｅＤｕｖｅ，“Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ Ｒｅ
ｒｉｓｉｔｅｄ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３
７：３９１−３９７（１９８３））、リソソームはわず
かに酸性（ｐＨ５．０〜５．５）である。（Ｐｏｚｎａ
ｎｓｋｙ ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎｏ，“Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ
： Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ，Ｒｅｖ．３６：２７７−３３６（１９８
４）。コンジュゲートした薬剤放出のための酸性条件の
利用は、ＡＤＭへのシスアコニッチル連結の開発で報じ
られている（Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｒｅｉｓｅｒ，“Ｃｉ
ｓ−Ａｃｏｎｉｔｙｌ Ｓｐａｃｅｒ Ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ Ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ： Ａ Ｍｏｄｅｌ
Ｏｆ ＰＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｒ
ｅｌｅａｓｉｎｇ Ｄｒｕｇ Ｆｒｏｍ ＡＬｙｓｏｓ
ｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．１
０２：１０４８−１０５４（１９８１）およびＹａｎｇ
ａｎｄ Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，“Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉ
ｎＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ａ Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｏ
Ａ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ
ｅｓ Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｏｆ Ｅｓｔａｂｌｉｓ
ｈｅｄ Ｔｕｍｏｒ ＸｅｎｏｇｒａｆｔｓＩｎ Ｎｕ
ｄｅ Ｍｉｃｅ”，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８５：１１８９−１１９３（１９８８））またジ
フテリア毒素へのケタール連結で報じられている（Ｓｒ
ｉｎｉｖａｓａｃｈａｒ ａｎｄ Ｎｅｖｉｌｌｅ，
“Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｏｓｏ−Ｌｉｎｋｉｎ
ｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｔｈａｔ Ａｒｅ Ｃｌｅａｖ
ｅｄ Ｂｙ Ｍｉｌｄ Ａｃｉｄ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ２８：２５０１−２５０９（１９８９））。
【００１５】Ｇｒｅｅｎｆｅｉｌｄ他は、アシルヒドラ
ジン化合物を含む酸に敏感なイムノコンジュゲートの形
成を最近述べていて、アントラサイクリン分子の１３−
ケト位置にアシルヒドラゾン結合を介してコンジュゲー
トした３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオニルヒド
ラジドと、このアントラサイクリン誘導体の、抗体また
はリガンド分子へのコンジュゲート化について述べてい
る（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出
願Ｎｏ．３２８，１４７ １９８９年４月１６日公
開）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】ターゲッティングを含
む分子と、生体内で治療に用いられる試薬分子の間に、
酸に敏感な連結を提供するような構造の二官能性化合物
を含むコンジュゲートを提供するのは有意義である。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、有用な分子と
容易に結合する新規二官能性化合物と、その二官能性化
合物の製造方法を提供する。その二官能性化合物は反応
性ピリジニルジチオ基またはオルト−ニトロフェニルジ
チオ基を含む。特に、本発明はその二官能性化合物に連
結して、細胞毒性分子の誘導体を形成する細胞毒性分子
を含む新規コンジュゲートで、さらに殺されるべき標的
細胞集団と反応できる分子に連結した細胞毒性誘導体を
含む新規なコンジュゲートを提供する。このターゲッテ
ィング分子は抗体のようなタンパク質またはボンベシ
ン、ＥＧＦのようなリガンドであってよい。
【００１８】具体例によれば、新規二官能性化合物、Ｎ
−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラ
ジンカルボキサミド（化合物１０）が合成され、化合物
１０にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭのＣ−１
３位置にセミカルバゾン結合を含む、ＡＤＭのセミカル
バゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００１９】もう一つの具体例によれば、新規二官能性
化合物、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジ
ド（化合物１１ａ）が合成され、化合物１１ａにＡＤＭ
が付着する場所として働くＡＤＭのＣ−１３位置にカル
バゾン結合を含む、ＡＤＭのカルバゾン誘導体を形成す
るのに用いられる。
【００２０】もう一つの具体例では、新規二官能性化合
物、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブ
テニル〕ヒドラジンカルボチオアミド（化合物１２）が
合成され、化合物１２にＡＤＭが付着する場所として働
くＡＤＭのＧ１３位置にチオセミカルバゾン結合を含
む、ＡＤＭのチオセミカルバゾン誘導体を形成するのに
用いられる。
【００２１】もう一つの具体例によれば、新規二官能性
化合物、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒド
ラジンカルボキシレート（化合物１３）が合成され、化
合物１３にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭのＣ
−１３位置にカルボキシレートヒドラゾン結合を含む、
ＡＤＭのヒドラゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００２２】もう一つの具体例では、新規二官能性化合
物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕
−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）が合成さ
れ、化合物１５にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤ
ＭのＣ−１３位置にアリルヒドラゾン結合を含む、ＡＤ
Ｍのアリルヒドラゾン誘導体を形成するのに用いられ
る。
【００２３】本発明のその他の具体例によれば、上記新
規アントラサイクリン誘導体のいくつもの分子が、選ば
れた標的細胞集団と反応する分子に連結する。好ましく
は、細胞反応性分子は抗体であり、モノクローナル抗体
である。各アントラサイクリン誘導体分子は、アントラ
サイクリン分子のＣ−１３位置の、セミカルバゾン、カ
ルバゾン、チオセミカルバゾン、カルボキシレートヒド
ラゾン、アリルヒドラゾン結合を介してアントラサイク
リンに結合している二官能性化合物を介して、抗体と連
結し、本発明の新規イムノコンジュゲートを形成する。
例えば、本発明の好例は、新規アドリアマイシン誘導体
分子の合成を含み、この誘導体分子がチオール化した抗
体と縮合して、二官能性化合物を介して抗体にアントラ
サイクリンが付着する結果となる。ＡＤＭのＣ−１３位
置に形成されたヒドラゾン結合は、ＡＤＭに付着する場
所として働く。この例で、それを介して抗体に付着して
いる二官能性化合物の中に、ジスルフィド基が存在す
る。もう一つの好例によれば、アドリアマイシン誘導体
分子（二官能性化合物に結合したＡＤＭ）は還元されて
スルフヒドリル基を生じ、その結果できた誘導体が、マ
レイミド誘導化抗体と縮合する。この結果、ＡＤＭのＣ
−１３位置に二官能性化合物付着の場所としてＮ−置換
ヒドラゾン結合をもち、それを通して抗体に付着する二
官能性化合物内にチオエーテル結合をもつイムノコンジ
ュゲートを形成することになる。
【００２４】本発明のその他の具体例によれば、新規ア
ントラサイクリン誘導体が、ボンベシン、トランスフェ
リン、ＥＧＦのようなリガンドと共有結合して、二官能
性化合物を介してリガンドにアントラサイクリンが付着
する結果となる。上で述べた他の例のように、アントラ
アシクリンのＣ−１３位置に形成したヒドラゾン結合を
介して、アントラサイクリンは二官能性化合物に付着す
る。リガンドは先にチオール化されてアントラサイクリ
ン誘導体に連結するのが好ましいが、内在する遊離のチ
オール基を持つリガンドに直接付着してもよい。
【００２５】これらの具体例から明らかなように、本発
明は、この発明のコンジュゲート製造に有用な、新規二
官能性化合物とアントラサイクリン誘導体を提供する。
【００２６】本発明のイムノコンジュゲートは、アント
ラサイクリン：抗体モル比が少なくとも１：１から１
０：１で、好ましくは約４：１〜１０：１であり、選択
した標的細胞を殺すための、抗体と細胞毒性薬剤の両方
の活性が残る。この中で述べたアントラサイクリン−リ
ガンドコンジュゲートは、アントラサイクリン：リガン
ド比が少なくとも１：１から１０：１で、好ましくは約
４：１〜１０：１である。これらコンジュゲートの二官
能性化合物にアントラサイクリンが付着する場所に存在
する酸に敏感な結合は、例えばリソソーム小胞内のよう
な、細胞内で特徴的に出あうような酸性条件下で、活性
な薬剤を放出するのに理想的である。
【００２７】上に名をあげた誘導体の加水分解によるア
ドリアマイシンの放出が、ｐＨの関数として示され、そ
の新規誘導体は、リソソーム環境をまねた酸性条件下
で、大きなレンジの放出率をもった。これら誘導体は、
抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体５Ｅ９と
のイムノコンジュゲートとしての、細胞毒性も示され
た。
【００２８】Ｎ−置換ヒドラジン二官能性化合物は、ヒ
ドラジン部分と、反応性ピリジニルジチオまたはオルト
−ニトロフェニルジチオ部分を含む。これら新規二官能
性化合物は、いろいろな分子と連結して有用なコンジュ
ゲートを形成するのに用いられる。二官能性化合物のヒ
ドラジン部分に連結する分子は、遊離のカルボニル基ま
たは、カルボニル基を含むように誘導化される基を含
み、細胞毒性試薬分子などである。カルボニル基を含む
分子が二官能性化合物のヒドラジン部に連結する時、ヒ
ドラゾン結合が形成され、コンジュゲート形成に用いら
れる本発明の二官能性化合物によって、そのヒドラゾン
結合は、セミカルバゾン、カルバゾン、チオセミカルバ
ゾン、カルボキシレートヒドラゾン、アリルヒドラゾン
結合である。ピリジニルジチオまたはオルト−ニトロフ
ェニルジチオ部分を含む二官能性化合物の末端に連結す
る分子は、遊離のスルフヒドリル基またはスルフヒドリ
ル基を含むように誘導化できる基を含み、殺すべき標的
細胞の抗原または受容体と反応する、抗体分子またはリ
ガンドなどである。抗体と二官能性化合物との反応を通
じ、ピリジニルジチオ部分はなくなる。遊離のカルボニ
ル基を含む分子は、選択した細胞を殺すことができるア
ントラサイクリンのような細胞毒性分子が好ましい。好
例では、細胞毒性試薬分子を二官能性化合物に連結する
ヒドラゾン結合は、ｐＨに敏感に細胞毒性試薬を放出さ
せる。
【００２９】本発明の二官能性化合物との連結によって
形成された本発明のコンジュゲートは、本発明のイムノ
コンジュゲートの少なくとも一つの製薬上有効な量と、
製薬上許容しうる担体を含むような、薬剤組成物中で利
用できるだろう。本発明は又、除去したい標的細胞の選
ばれた集団へ、細胞毒性試薬を選択的に運ぶための方法
と同様に、本発明の組成物の製薬上有効な量で、製薬上
許容しうる手法により、哺乳動物を治療するための方法
も含む。
【００３０】好都合に、この中で示された化合物、コン
ジュゲート、薬剤組成物、および方法は、がんやその他
の腫瘍、非細胞致死性のウィルス性または他の病原性の
感染、自己免疫不全症のような疾患の治療で、その標的
細胞を選択的に殺すための、選ばれた細胞集団への細胞
毒性試薬のターゲッティングに有用なアプローチを提供
する。
【００３１】本発明が更によく理解されるように、詳細
な説明をする。
【００３２】本発明は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二官能
性化合物に関する：Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジ
チオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド（化合物１
０）、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド
（化合物１１ａ）、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジ
チオ〕−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミド
（化合物１２）、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チルヒドラジンカルボキシレート（化合物１３）、およ
びＮ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−
４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）。これらの
化合物を用いて、アントラサイクリンのような細胞毒性
試薬の新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体を形成し、抗体に
連結すると、イムノコンジュゲートを形成する。本発明
は又、二官能性化合物、細胞毒性誘導体およびイムノコ
ンジュゲートの製造方法、がんや他の腫瘍、非細胞致死
性のウィルス性または他の病原性の感染、自己免疫不全
のような疾患を治療するため、標的細胞へ細胞毒性試薬
を運ぶための、薬剤組成物および方法に関する。
【００３３】コンジュゲートは、二官能性化合物の一つ
によって、標的細胞集団と反応する分子少なくとも一つ
とつながった、細胞毒性誘導体分子少なくとも一つから
成る。この分子は、抗体、好ましくはモノクローナル抗
体のようなタンパク質またはボンベシン、ＥＧＦのよう
なリガンドであってよい。
【００３４】具体例をあげると、新規化合物、Ｎ−〔２
−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカ
ルボキサミド（化合物１０）が合成され、さらにＡＤＭ
のＣ−１３位置にセミカルバゾン結合を含み、ＡＤＭの
セミカルバゾン誘導体が形成される。又、新規化合物、
２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕
アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド（化合
物１１ａ）が合成され、さらにＡＤＭのＣ−１３位置に
カルバゾン結合をもつ、ＡＤＭのカルバゾン誘導体が形
成される。又、新規化合物、Ｎ−〔４−〔２−ピリジニ
ル）ジチオ〕−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオア
ミド（化合物１２）が合成され、さらにＡＤＭのＣ−１
３位置にチオセミカルバゾン結合をもつ、ＡＤＭのチオ
セミカルバゾン誘導体が形成される。又、新規化合物、
２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジンカ
ルボキシレート（化合物１３）が合成され、さらにＡＤ
ＭのＣ−１３位置にカルボキシレートヒドラゾン結合を
もつ、ＡＤＭのヒドラゾン誘導体が形成される。又、新
規化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）が
合成され、さらにＡＤＭのＣ−１３位置にアリルヒドラ
ゾン結合をもつ、ＡＤＭのアリルヒドラゾン誘導体を形
成する。
【００３５】他の具体例で、本発明は、抗体またはリガ
ンドのような、標的細胞集団と反応する分子少なくとも
一つと、細胞を殺す細胞毒性分子少なくとも一つを含
み、本発明の新規二官能性化合物により連結されるコン
ジュゲートに関する。又本発明は、と標的細胞集団、例
えば腫瘍細胞集団に向かう抗体を含むイムノコンジュゲ
ートに関し、その抗体は、その構造に連結したいくつも
のアントラサイクリン誘導体分子を持つ。アントラサイ
クリン誘導体分子は、チオール化した抗体に共有結合で
付着し、各薬剤分子と抗体の間にジスルフィド結合が形
成され、二官能性化合物は、アントラサイクリンのＣ−
１３位置のヒドラゾン結合により、アントラサイクリン
誘導体に付着している。薬剤分子毎に、本発明の二官能
性化合物一つを使い、一以上の薬剤分子が各抗体分子に
付着するかもしれない。モル比４：１は、４薬剤（すな
わちアントラサイクリン誘導体）分子が１抗体に付着す
ることを示す。
【００３６】他の具体例で、アントラサイクリン誘導体
は還元されてスルフヒドリル基を生じ、このＡＤＭ誘導
体が、マレイミド化した抗体と縮合して、抗体とアント
ラサイクリン間にチオエーテル結合をつくる。
【００３７】これらのコンジュゲートは、未修飾アント
ラサイクリン薬剤をｐＨに敏感に放出させ、結果的に細
胞毒性の減少となる薬剤の構造的修飾をしない。
【００３８】別の具体例で、本発明は、ポリペプチドま
たはペプチドリガンドのようなリガンドを含む、アント
ラサイクリン−リガンドコンジュゲートを包含し、その
リガンドは、標的細胞集団の細胞表面に関連する受容体
一以上と反応し、その構造に連結したアントラサイクリ
ン誘導体分子少なくとも一つをもつ。アントラサイクリ
ンは、アントラサイクリンのＣ−１３位置のヒドラゾン
結合を介してアントラサイクリンに付着している二官能
性化合物によって、ペプチドに共有的に結合している。
他の具体例で、アントラサイクリン誘導体は還元されて
スルフヒドリル基を生じ、この誘導体が、マレイミド化
したリガンドと縮合する。
【００３９】本発明のコンジュゲートは、一段ずつ製造
でき、まず新規Ｎ−置換ヒドラジン化合物をつくり、そ
れを用いて細胞毒性試薬のヒドラゾン誘導体をつくり、
更に適当な特異性をもつタンパク質またはリガンドと反
応させる（伝統的な抗体カップリング技術については、
Ｈａｒｄｙ，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＡｎｄＣｏ
ｕｐｌｉｎｇ Ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ＦｏｒＵｓｅ Ｉｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏ
ｍｅｔｒｙ”，ｉｎ ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍ
ｅ １：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗ
ｅｉｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３１．４−
３１．１２（４ｔｈ Ｅｄ．１９８６）、リガンドコン
ジュゲートの製造については、Ｖａｒｇａ ｅｔ ａ
ｌ．，前述を参照）。
【００４０】細胞毒性試薬を、コンジュゲートの細胞反
応性成分につなぐ二官性化合物の長さは、二官能性化合
物が先に述べたヒドラゾン結合を介して、一またはそれ
以上の細胞毒性試薬分子のカルボニル基に付着する限り
は、変えられる。
【００４１】本発明のコンジュゲートを構成する細胞毒
性試薬は、カルボニル基を含み、いかなる分子であって
もよい。そのような試薬は、限定するものではないが、
アントラサイクリン：アドリアマイシン、ダウノマイシ
ン、デトルビシン、カルミノマイシン、イダルビシン、
エピルビシン、エソルビシン、４′−ＴＨＰ−アドリア
マイシン、ＡＤ−３２，および３′−デアミノ−３′−
（３−シアノ−４−モルホリニル）ドキソルビシンを含
む（Ｃａｓａｚｚａ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｎｔａｌ
Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｎ Ｎｅｗ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌ
ｉｎｅｓ”，ｉｎ Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎｅ ： Ｉｔ
ｓ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ Ｉｎ Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｍ．Ｏｇａｗａ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｅｄｓ），ｐｐ．４３９−５２（Ｅｘｃｅｒｐｔ
ａ Ｍｅｄｉｃａ，１９８４））。
【００４２】細胞毒性試薬が二官能性化合物を介してコ
ンジュゲート内で連結する細胞反応性分子は、除去した
い細胞集団に結合するか反応し、スルフヒドリル基をも
つかスルフヒドリルまたはマレイミド基を含むように修
飾できる、いかなる分子であってもよいと理解されるべ
きである。そのような分子は、限定するものではない
が、抗体のような高分子量タンパク質（一般に１０，０
００ダルトン以上）、低分子量タンパク質（一般に１
０，０００ダルトン以下）、ポリペプチドまたはペプチ
ドリガンド、および非ペプチドリガンドを含む。
【００４３】本発明のイムノコンジュゲートを構成する
抗体は、除去または殺したい特定の標的細胞集団と反応
する、いかなる抗体であってもよい。そのような抗体の
例は、限定するものではないが、がん、黒色腫、リンパ
腫、骨または軟部組織肉腫、その他の腫瘍で見られる抗
原のような腫瘍関連の抗原に結合する抗体、ウィルス性
または他の病原性関連の抗原に結合する抗体、異常細胞
表面抗原に結合する抗体を含む。これら抗体はポリクロ
ーナルまたは好ましくはモノクローナル抗体であり、従
来十分に確立された技術を用いて製造できる（Ｗｅｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ
Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ａｎｄ Ｍｅｌａｎ
ｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｂｙ Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ
−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ．６２：２９−４５（１９
８２）（腫瘍に特異なポリクローナル抗体が製造され、
コンジュゲートに用いられた）、Ｙｅｈ ｅｔ ａ
ｌ．，“Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ
Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｉｄｅｎｔｉｆ
ｉｅｄ Ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：
２９２７−３１（１９７９）、Ｂｒｏｗｎ ｅｔａ
ｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ ＯｆＨｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ｐ９７ Ｗｉｔ
ｈ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（Ｎｏ．２）：５３９−４
６（１９８１）（腫瘍に特異なモノクローナル抗体の製
造）。例えば、ヒト肺がん細胞に特異なモノクローナル
抗体Ｌ６、または、骨肉腫細胞に特異なモノクローナル
抗体７９１Ｔ／３６が使用できる。更に非インターナリ
ジングまたは好ましくは、インターナリジングな抗体が
用いられる。この出願では、“抗体”という用語は、そ
のままの抗体または抗体分子の活性結合部分を含むフラ
グメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ′）2を包含す
る。モノクローナル抗体を用いるならば、抗体は、と限
定するものではないが、マウスまたはヒト起源、または
キメラ抗体であってよい。
【００４４】“リガンド”という用語は、標的細胞集団
の細胞表面に関連する受容体に特異的に結合する、いか
なると分子も含むと理解されるべきである。本発明のア
ントラサイクリン−リガンドコンジュゲート形成に用い
られる好ましいリガンドは、限定するものではないが、
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドリガンドを含
み、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ボン
ベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、血小板
由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、腫瘍増殖因子（Ｔ
ＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、ワクシニア増殖因子（ＶＧ
Ｆ）、インスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ
などである。非ペプチドリガンドは、ステロイド、炭化
水素、レクチンを含む。
【００４５】本発明のコンジュゲートの細胞反応性“タ
ーゲッティング”分子、例えば抗体またはリガンドは、
抗体またはリガンドが反応する特定の標的細胞集団へ細
胞毒性試薬分子を運ぶはたらきをする。例えば、腫瘍細
胞表面で見られる抗原に向かう抗体が、その腫瘍細胞
へ、細胞毒性試薬を運搬するだろうし、ＡＩＤＳをひき
おこすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のタンパク質に
向かう抗体が、その細胞毒性試薬をＨＩＶ感染細胞へ運
搬するだろう。同様にがんのような腫瘍細胞は、ＥＧＦ
受容体のような特定の受容体を高濃度で特異的に発現す
るので、ＥＧＦのようなリガンドが細胞毒性試薬をがん
細胞へ運搬するだろう。
【００４６】抗体またはリガンドが反応する特定の細胞
集団内またはその場所で、細胞毒性試薬が放出する結
果、その特定の細胞を選択的に殺すことになる。従っ
て、コンジュゲートが結合できる細胞表面抗原または受
容体をもつ特定の細胞集団の除去が望まれる疾患の治療
で、本発明のコンジュゲートが有用であることは明白で
ある。本発明のコンジュゲートが有用である疾患は、限
定するものではないが、がんやその他の腫瘍、エイズ、
ヘルペス、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）、ＥＢＶ
（エプスタインバーウィルス）、ＳＳＰＥ（亜急性硬化
性全脳炎）のような非細胞致死性のウィルスまたは他の
病原性感染、リュウマチ性関節炎を含む。
【００４７】理論にしばられずに、抗体−またはリガン
ド−連結細胞毒性試薬分子は、すなわち本発明のコンジ
ュゲートの形で、抗体またはリガンドの特異性を介し
て、殺すべき標的細胞へ運ばれて、細胞膜に結合したコ
ンジュゲートしてない抗体やリガンドのインターナリゼ
ーションに通じるのと同じエンドサイトな道を介して細
胞に入るものと信じる（Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，
“Ｐａｔｈｗａｙ ＯｆＥｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ”，ｉ
ｎ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，Ｉ，Ｐａｓｔａｎ ｅｔ
ａｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．１−４４（Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ，１９８５）。いったん細胞内に入ると、
コンジュゲートを含むエンドサイトな小胞は第一のリソ
ソームと融合し、第二のリソソームをつくる（Ｅｍｂｌ
ｅｔｏｎｅｔ ａｌ．，前述，ｐ．３３４）。細胞毒性
分子は、コンジュゲートの抗体またはリガンド成分と、
酸に敏感なヒドラゾン結合を介して結合しているので、
エンドサイトな小胞やリソソームの酸性環境にコンジュ
ゲートを曝すと、コンジュゲートから細胞毒性試薬を放
出することになる。更に放出された試薬は、十分な細胞
毒活性が可能な比較的未修飾の試薬の形であると信じら
れる。従って、コンジュゲートの酸に敏感な結合は、標
的細胞内での細胞毒性試薬の放出に大変有利で、その細
胞に対するコンジュゲートの細胞毒性を高めている。一
方、標的細胞の外部またはとり囲む直接の環境、例えば
腫瘍の場所での、酸性還元条件でヒドラゾン結合は開裂
し、放出された薬剤は腫瘍細胞にとりあげられるだろ
う。
【００４８】本発明の新規二官能性化合物、細胞毒性試
薬の誘導体およびコンジュゲート、およびその製造方法
は、アントラサイクリン、アドリアマイシンが用いられ
る例で示される。一般に、アドリアマイシンのカルボニ
ル誘導体は、アドリアマイシン塩酸塩を本発明の五つの
二官能性化合物の一つで、メタノール中室温で処理して
製造される。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を触媒量加え
ると、縮合反応を加速することがわかり、反応は一夜か
くはん後完了した。この反応では副生成物がほとんどな
く、精製処理はアセトニトリルによる沈澱化だけでよ
い。この簡素化された処理方法は、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌ
ｄらによってかつて報告されたものより優れていて、よ
り行ないやすく、より経済的で、より早く、種々の分子
とコンジュゲートするための追加の新規アドリアマイシ
ン誘導体を提供する。
【００４９】
【化１３】
【００５０】新規二官能性化合物、Ｎ−〔２−〔（２−
ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミ
ドの合成は以下の図式で示され、アドリアマイシンのセ
ミカルバゾン誘導体製造に用いられる。
【００５１】
【化１４】
【００５２】まずメトキシカルボニルスルフェニルクロ
リドを２−アミノエタンチオール塩酸塩と、次いで２−
メルカプトピリジンと反応させて、２−〔（２−ピリジ
ニル）ジチオ〕エタンアミン塩酸塩とする。この化合物
をトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下ホスゲンと、次
いでｔ−ブチルカルバザートと反応させて、Ｎ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−２−（ｔ−ブ
トキシ−カルボニル）ヒドラジンカルボキサミドとす
る。ヒドラジンカルボキサミドを次にＴＦＡに溶かし
て、Ｎ−〔２−〔２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒ
ドラジンカルボキサミド（化合物１０）、セミカルバジ
ドとし、次にアドリアマイシン塩酸塩と反応させて、反
応性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭのセミカルバゾ
ン誘導体（化１３の化合物１）とする。
【００５３】新規カルバジド二官能性化合物、２−
〔〔〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カ
ルボニル〕カルボニックジヒドラジドの合成は以下の図
式で示され、アドリアマイシンのカルバゾン誘導体製造
に用いられる。
【００５４】
【化１５】
【００５５】ｔ−ブチルカルバザートをＴＥＡの存在下
ホスゲンと反応させる。次いで２−（２−ピリジニルジ
チオ）エタンアミン塩酸塩を加えて、２−〔〔〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボ
ニル〕−２，２′−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）カ
ルボニックジヒドラジドとする。この中間体をＴＦＡに
加えて、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジ
ド（化合物１１ａ）とし、次いアドリアマイシン塩酸塩
に加えて、反応性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭの
カルバゾン誘導体（化１３の化合物２）とする。
【００５６】新規チオセミカルバジド二官能性化合物、
Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニ
ル〕ヒドラジンカルボチオアミドの合成は以下の図式で
示され、アドリアマイシンのチオセミカルバゾン誘導体
製造に用いられる。
【００５７】
【化１６】
【００５８】フタールイミドカリウムを１，４−ジブロ
モ−２−ブテンと反応させて、１−ブロモ−４−（Ｎ−
フタールイミド）−２−ブテンとする。この化合物をチ
オ酢酸カリウムと反応させて、１−（アセチルチオ）−
４−（Ｎ−フタールイミド）−２−ブテンとし、次にヒ
ドラジンと反応させ、メトキシカルボニルスルフェニル
クロリド、続いて２−メルカプトピリジンと反応させ
て、１−アミノ−４−〔（２−ピリジニル（チジオ〕−
２−ブテン塩酸塩とする。この化合物をＴＥＡと合わ
せ、ジ−２−ピリジルチオノカーボネート、次いでｔ−
ブチルカルバザートを加えて、Ｎ−〔４−〔（２−ピリ
ジニル）−ジチオ〕−２−ブテニル〕−ヒドラジンカル
ボチオアミド（化合物１２）のｔ−Ｂｏｃ誘導体とす
る。この化合物をＴＦＡに溶かして、ゴム状の化合物と
し、次にアドリアマイシン塩酸塩、ＴＦＡと反応させ
て、反応性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭのチオセ
ミカルバゾン誘導体（化１３の化合物３）とする。
【００５９】新規二官能性化合物、２〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕エチルヒドラジンカルボキシレートの合成
は以下の図式で示され、アドリアマイシンのカルボキシ
レートヒドラゾン誘導体製造に用いられる。
【００６０】
【化１７】
【００６１】クロロカルボニルスルフェニルクロリドを
２−メルカプトエタノール、２−メルカプトピリジンと
反応させる。炭酸アンモニウム溶液を加えて、２−（２
−ピリジニル）ジチオ）エタノールを無色オイルで得
る。カルボニルジイミダゾールを加え、更にヒドラジン
と反応させて、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチ
ルヒドラジンカルボキシレート（化合物１３）とする。
この化合物をアドリアマイシン塩酸塩、ＴＦＡ次いでア
セトニトリルと反応させて、反応性ピリジニルジチオ部
分をもつＡＤＭのカルボキシレートヒドラゾン誘導体
（化１３の化合物４）とする。
【００６２】新規化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミドの
合成は以下の図式で示され、アドリアマイシンのアリル
ヒドラゾン誘導体製造に用いられる。
【００６３】
【化１８】
【００６４】ｐ−ヒドラジノ安息香酸をジ−ｔ−ブチル
ピロカーボネートと反応させて、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒ
ドラジノ）安息香酸とする。この化合物をＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド、ＤＣＣと反応させて、４−Ｎ−Ｂｏ
ｃ−（ヒドラジノ）安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルとする。これを２−（２−ピリジニル）
ジチオ）エタンアミン塩酸塩、ＴＥＡと反応させて、Ｎ
−〔２−（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−Ｎ−
Ｂｏｃ−（ヒドラジノ）ベンズアミドとする。この化合
物をＴＦＡで処理して、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミド
（化合物１５）とし、更にアドリアマイシン塩酸塩と反
応させて、反応性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭの
アリルヒドラゾン誘導体（化１３の化合物５）とする。
【００６５】上述のＡＤＭのＮ−置換ヒドラゾン誘導体
は、本発明のコンジュゲートをつくるのに用いられる。
各誘導体は、ＳＰＤＰまたは２−ＩＴ（２−イミノチオ
ラン）で先にチオール化されたモノクローナル抗体と反
応させ、以下に示す通りである。
【００６６】
【化１９】
【００６７】
【化２０】
【００６８】二官能性化合物がＡＤＭのＣ−１３位置に
ヒドラゾン結合を通して付着する方法により、イムノコ
ンジュゲートは、モノクローナル抗体にコンジュゲート
したＡＤＭ分子から成る。二官能性化合物もジスルフィ
ド結合を含み、それを通して抗体に付着している。
【００６９】アントラサイクリンのＣ−１３位置に酸に
敏感なヒドラゾン結合を含む限り、ＡＤＭと抗体をつな
ぐ二官能性化合物は、いくつもの要素や結合を含んでよ
い。好例の抗体はモノクローナル抗体５Ｅ９である。
【００７０】又、新規二官能性化合物はアドリアマイシ
ンと化合して誘導体となり、更に還元剤ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）またはトリブチルホスフィンと反応し
て、二官能性化合物の末端にスルフヒドリル（−ＳＨ）
基を含むアドリアマイシン誘導体となる。例えば抗体を
スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブ
チラート（ＳＭＰＢ）と反応により、マレイミド基がす
でに付着しているモノクローナル抗体またはリガンドと
この誘導体を反応させる。各ＡＤＭのＣ−１３位置のヒ
ドラゾン結合により付着した二官能性化合物をもち、抗
体の付着部にチオエーナル結合をもつイムノコンジュゲ
ートが形成される。
【００７１】
【化２１】
【００７２】従って、ＡＤＭの１３−ケト位置のヒドラ
ゾン結合と、抗体と結びつくための反応性ピリジニルジ
チオまたはオルト−ニトロフェニルジチオ基を含む限
り、ＡＤＭと抗体またはリガンドとをつなぐ二官能性化
合物は、いくつもの要素や結合を含んでよいのは明白で
ある。
【００７３】又、本発明の新規ＡＤＭ誘導体を、ボンベ
シン、ＥＧＦ、トランスフェリンのようなリガンドと反
応させる。リガンドは最初にチオール基またはマレイミ
ド基をもつよう誘導化される。ボンベシンの場合、シス
テイン残基がペプチドのアミノ末端に導入されて、ＡＤ
Ｍ誘導体とのコンジュゲーションのための反応性スルフ
ヒドリル基となる。ネズミＥＧＦの場合、ポリペプチド
がＳＰＤＰと反応して、分子のアミノ末端に反応性スル
フヒドリル基を導入する。トランスフェリンの場合、タ
ンパク質がまず２−ＩＴと反応して、タンパク構造に反
応性チオール基を導入する。各々の場合、チオール化し
たリガンドは次にＡＤＭ誘導体と反応して、本発明のア
ントラサイクリン−リガンドコンジュゲートとなり、そ
のコンジュゲートはリガンドとＡＤＭ間に二官能性化合
物をもち、その二官能性化合物はヒドラゾン結合を介し
て各アントラサイクリン分子のＣ−１３位置に付着して
いる。
【００７４】本発明が、次の一般式Ｉ
【００７５】
【化２２】
【００７６】（ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じ
であるか異なるものであり）、Ｒ2 はＣＨ3 、ＣＨ2 Ｏ
Ｈ、ＣＨ2 ＯＣＯ（ＣＨ2 ）3 ＣＨ3 またはＣＨ2 ＯＣ
ＯＣＨ（ＯＣ2 Ｈ5 ）2 でありＲ3 はＯＣＨ3 、ＯＨま
たは水素であり、Ｒ4 はＮＨ２、ＮＨＣＯＣＦ3 、４−
モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピ
ペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジ
ルアミン、ジベンジルアミン、シアノメチルアミンまた
は１−シアノ−２−メトキシエチルアミンでありＲ5 は
ＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素であり、Ｒ6 はＯＨまたは
水素であって、Ｒ 5 がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時に
はＲ6 はＯＨでない〕および一般式ＩＩ
【００７７】
【化２３】
【００７８】（ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じ
であるか異なるものであり）、Ｒ2 はＣＨ3 、ＣＨ2 Ｏ
Ｈ、ＣＨ2 ＯＣＯ（ＣＨ2 ）3 ＣＨ3 またはＣＨ2 ＯＣ
ＯＣＨ（ＯＣ2 Ｈ5 ）2 であり、Ｒ3 はＯＣＨ3 、ＯＨ
または水素であり、Ｒ4 およびＲ7 は各々、水素アルキ
ル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキ
ル、アリル、置換アリル、アラルキルまたは置換アラル
キルであるかまたはＲ4、Ｒ7 およびＮと共に、置換さ
れていてもよい４〜７員環を形成し、Ｒ5 はＯＨ、Ｏ−
ＴＨＰまたは水素であり、Ｒ6 はＯＨまたは水素であっ
て、Ｒ5 がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ6 はＯ
Ｈでない〕を有するアントラサイクリンの新規ヒドラジ
ン誘導体を提供するのは明白である。
【００７９】上述の二官能性化合物およびアントラサイ
クリンのＮ−置換ヒドラゾン誘導体は新規化合物であ
る。アントラサイクリンのヒドラゾン誘導体は新規細胞
毒性試薬として用いられ、また本発明の新規コンジュゲ
ート製造の中間体でもある。アントラサイクリンのヒド
ラゾン誘導体は、アドリアマイシンセミカルバゾン、ア
ドリアマイシンカルバゾン、アドリアマイシンチオセミ
カルバゾン、アドリアマイシンカルボキシレートヒドラ
ゾン、アドリアマイシンアリルヒドラゾンによって例示
され、各々具体例で示される。
【００８０】上の式からわかるように、本発明のＮ−置
換ヒドラゾンＡＤＭ誘導体は、アドリアマイシン、ダウ
ノマイシン、カルミノマイシンのような多くの既知のア
ントラサイクリンのうちのいずれのＮ−置換ヒドラゾン
も含む、更に、アントラサイクリン構造上特異的な場所
で誘導化されたＮ−置換ヒドラゾンも含む（例えば、
４’−ＴＨＰ−アドリアマイシンヒドラゾン、３’−デ
アミノ−３’−（３−シアノ−４−モルホリニル）アド
リアマイシンヒドラゾン）。後者の誘導体は、まずアン
トラサイクリンを誘導化して、望む類似体とし、その類
似体を用いて本発明のＮ−置換ヒドラゾン誘導体とし、
合成できる。既知のアントラサイクリン類似体は、Ｕ．
Ｓ．特許Ｎｏ．４，４６４，５２９、４，３０１，２７
７（３’−デアミノ−３’−（４−モルホリニル）また
は３’−デアミノ−３’−（３−シアノ−４−モルホリ
ニル）アントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎ
ｏ．４，２０２，９６７、４，３１４，０５４（３’−
デアミノ−３’−（１−ピペリジニル）または３’−デ
アミノ−３’−（４−メトキシ−１−ピペリジニル）ア
ントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，２
５０，３０３（Ｎ−ベンジルまたはＮ，Ｎ−ジベンジル
アントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，
５９１，６３７（Ｎ−メトキシメチルまたはＮ−シアノ
メチルアントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎ
ｏ．４，３０３，７８５（アントラサイクリンのアセタ
ール類似体）記載のものを含む。これら既知のアントラ
サイクリン類似体は、上で述べたように反応して、ＡＤ
Ｍの新規ヒドラゾン誘導体となり、望む特異性をもつ抗
体またはリガンドのような細胞反応性分子と上で述べた
ようにコンジュゲートできる。
【００８１】一方、本発明の誘導化しないＮ−置換ヒド
ラゾン誘導体がまず、上で述べたように誘導化しないア
ントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ダウノマ
イシン、カルミノマイシンから製造され、この新規誘導
体が次に誘導化されて、望むように置換した新規Ｎ−置
換ヒドラゾンとなる。例えば、セミカルバゾンＡＤＭ誘
導体が、Ｕ．Ｓ．特許４，４６４，５２９記載の方法に
よる、２，２’−オキシジアセトアルデヒドによる還元
的アミノ化により、アミノ糖部分で誘導化され、３’−
デアミノ−３’−（４−モルホリノ）アントラサイクリ
ンのセミカルバゾンとなる。更に、Ｎ−置換ヒドラゾン
誘導体は、式ＩおよびＩＩのＲ5 の位置で、Ｕ．Ｓ．特
許４，３０３，７８５記載のように誘導化され、４’−
ＴＨＰ−ＡＤＭ Ｎ−置換ヒドラゾンのようなヒドラゾ
ンのアセタール誘導体となる。
【００８２】本発明のヒドラゾンを誘導化する方法は、
種々の化学療法剤を含め、他の試薬のＮ−置換ヒドラゾ
ンを出発物質として用いられると理解すべきである。ダ
ウノマイシン、カルミノマイシンのようなＡＤＭ以外の
アントラサイクリンが用いられ、Ｎ−ベンジルダウノマ
イシンＮ−置換ヒドラゾン、３’−デアミノ−３’−
（４−モルホリニル）カルミノマイシンＮ−置換ヒドラ
ゾンのような新規化合物が製造され、これも本発明の範
囲内である。
【００８３】本発明のアントラサイクリン誘導体は、ｐ
Ｈ４．５、５．０、７．４での薬剤アドリアマイシンの
放出率で評価され、大きなレンジの放出率を示した。更
に、モノクローナル抗体にコンジュゲートした誘導体か
ら成るイムノコンジュゲートは、ｐＨ４．５でのアドリ
アマイシンの放出率で評価された。イムノコンジュゲー
トはコロニー形成阻害検定でＤａｕｄｉ細胞を用いて細
胞毒性をテストされ、ヒドラゾン誘導体の安定性との相
関性が表された。イムノコンジュゲートも大きなレンジ
の放出率を示し、コロニー形成検定で腫瘍細胞に対し、
抗体に導かれた細胞殺傷力（細胞毒性）を示した。
【００８４】本発明のＮ−置換ヒドラジン化合物は、タ
ーゲッティングする分子と細胞毒性試薬を連結するのに
有用な二官能性化合物である。カルボニル基を含む細胞
毒性分子を連結するのに用いると、ｐＨのある範囲内で
開裂して細胞毒性試薬を放出する。酸に敏感な結合を提
供する。本発明のアントラサイクリンイムノコンジュゲ
ートは、過去に報じられたイムノコンジュゲートよりも
重要であることは明らかで、過去に報じられたものは、
アントラサイクリンが抗体にアントラサイクリンのアミ
ノ糖部分を通して直接連結していて、これらアミノ糖連
結コンジュゲートはしばしば、抗体に対するアントラサ
イクリンのモル比がより低く、フリーのＡＤＭより弱
く、抗体結合特性の減少を示すからである（Ａｒｎｏｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅ
ｖ．６２，前述、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５，前述、ｙａｍａｍｏｔｏ ｅ
ｔ ａｌ．，前述）。更に本発明のイムノコンジュゲー
トの安定性が研究され、アントラサイクリンがイムノコ
ンジュゲートから、細胞環境で見られるのと同様の酸性
条件で放出されることを示した。従って、本発明のイム
ノコンジュゲートは、標的細胞へ運搬して比較的未修飾
の薬剤を放出するだろう。上述のコンジュゲートは薬剤
輸送に有利な、ｐＨのある範囲での薬剤の放出を提供す
るだろう。
【００８５】本発明の二官能性化合物、イムノコンジュ
ゲート、その製造方法は、アントラサイクリン、アドリ
アマイシンの誘導体が、抗−トランスフェリン受容体モ
ノクローナル抗体、５Ｅ９とコンジュゲートしている例
で示される。
【００８６】本発明は又、がんやその他の腫瘍、非細胞
致死性のウィルス性または他の病原性の感染、自己免疫
不全のような疾患の治療のための、薬剤組成物、組み合
わせ、方法を含む。特に、アントラサイクリンを含むコ
ンジュゲート少なくとも１つの製薬上の有効量が製薬上
許容しうる手法で宿主哺乳動物に投与される。哺乳動物
の疾患治療のための方法を含む。
【００８７】本発明方法の一つの例は、組み合わせ化学
療法の方法で用いるために、同時にまたは続いて、いく
つかの異なるコンジュゲート、すなわち異なる細胞毒性
試薬をもつか異なる抗体またはリガンドをもつコンジュ
ゲートの投与を含む。例えば、コンジュゲートの抗体成
分の特異性が異なるアントラサイクリン イムノコンジ
ュゲートのいくつもの使用は本発明の具体例に含まれ、
すなわちいくつものイムノコンジュゲートが用いられ、
関心のある細胞集団に存在する、異なった抗原または同
じ抗原の異なった場所またはエピトープに特異的に結合
する抗体を各々もっている。これらイムノコンジュゲー
トのアントラサイクリン成分は同じであっても違ってい
てもよい。例えば、この例は、腫瘍表面の種々の多数の
抗原が既知であるか、腫瘍細胞集団が抗原の表れ方で異
種であって、十分な量の薬剤を腫瘍の場所で腫瘍細胞す
べてにターゲッティングすると確信したい、特定の腫瘍
の治療で特に有用であろう。腫瘍に対し異なる抗原特異
性または異なるエピトープ特異性をもつ、いくつものコ
ンジュゲートの使用は、腫瘍の場所で十分な薬剤を得る
可能性を増す。更に、正常な組織が、腫瘍に関連した抗
原と同じものすべてをもっている可能性は小さいから、
腫瘍に対して高度の特異性を達成するために重要である
（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｗｏ Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｎ
ｔｉｇｅｎ ｐ９７ Ａｃｔ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ
ａｌｌｙ Ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，１２７（Ｎｏ．１）ｐｐ．１５７−１６０（１
９８１）参照）。
【００８８】一方、コンジュゲートのアントラサイクリ
ン成分だけが変わる、いくつもの異なるイムノコンジュ
ゲートが用いられる。例えば、特定の抗体がアドリアマ
イシンと連結して一つのイムノコンジュゲートをつく
り、ダウノマイシンと連結して第二のイムノコンジュゲ
ートをつくる。両方のコンジュゲートが宿主に投与さ
れ、除去したい選ばれた細胞集団の場所に、抗体の特異
性によって偏圧する。両方の薬剤がその場所で放出され
る。この方法は、標的細胞内または場所で、いくつもの
異なる薬剤が放出されるから、腫瘍のような特定の細胞
集団の薬剤耐性に関して不確かな時、この例は重要であ
ろう。もう一つの例は、アントラサイクリンの１以上の
型と、一つの特定の抗体とのコンジュゲーションを含
み、できたイムノコンジュゲートは、表面に沿って種々
の異なるアントラサイクリン分子をもち、すべて１３−
ケトヒドラゾン結合を介して抗体に連結している。この
例のイムノコンジュゲートの投与は、標的細胞内または
場所で、いくつもの異なる薬剤が放出することになる。
更にアントラサイクリン−リガンドコンジュゲートの組
み合わせを使用すると、薬剤は細胞表面に特定の抗体同
様受容体をもつ細胞集団へターゲッティングされる。一
種のアントラサイクリンまたはいくつもの異なる薬剤が
この組み合わせ療法で用いられる。
【００８９】本発明のコンジュゲートは、薬剤組成物の
形で、伝統的な投与方法を用いて投与され、限定するも
のではないが、静脈内、腹膜内、経口、リンパ内、また
は腫瘍のような選ばれた細胞集団の場所への直接投与を
含む。静脈内投与が好ましい。イムノコンジュゲートの
場合、生体内治療用に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 のよう
な抗体フラグメントまたはキメラ抗体を含むコンジュゲ
ートの使用が有用であろう。
【００９０】コンジュゲートを含む、本発明の薬剤組成
物は種々の投与形であってよく、限定するものではない
が、固体、半固体、液体の投薬形を含み、錠剤、丸薬粉
剤、溶体溶液または懸濁液、座薬、重合したマイクロカ
プセルまたはマイクロペシクル、リポソーム、注入でき
るまたは溶解しない溶液などである。好ましい形は、投
与方法や治療適用による。
【００９１】薬剤組成物は、伝統的な製薬上許容しうる
担体を含み、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク
質、リン酸塩のような緩衝液物質、水、生理食塩水、電
解液などである。
【００９２】本発明のコンジュゲート成分に対する、投
与、投薬管理の最も効果的な方法は、疾患の厳しさや道
すじ、患者の治ゆ力や治療の反応、治療する医師の判断
による。更にコンジュゲートと何か添付する化合物の投
与形は、個々の患者によるべきだ。しかしながら、本発
明のアントラサイクリン イムノコンジュゲートの有効
投薬量は、アントラサイクリン約１〜１００ｍｇ／ｍ2
または抗体約５００〜５０００ｍｇ／ｍ2 の範囲であろ
う。アントラサイクリン−リガンドコンジュゲートの有
効投薬量は、アントラサイクリン約１〜１００ｍｇ／ｍ
2 またはリガンド約１〜１００ｍｇ／ｍ2 の範囲であろ
う。
【００９３】上に述べた発明をさらに良く理解されるよ
うに、実施例を置く。これら実施例は説明の目的のため
だけであって、この発明の範囲を限定するものでないこ
とを理解すべきである。
【００９４】
【実施例】二官能性化合物およびアドリアマイシン（Ａ
ＤＭ）の誘導体の製造 融点（ＭＰ）はＦｉｓｈｅｒ−Ｊｏｈｎｓ（Ｍｅｄｆｏ
ｒｄ，ＭＡ）融点測定装置で測定し、未修正である。核
磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｃｋｅｒ ＡＭ
３００機器で得た。赤外（ＩＲ）スペクトルはＫＢｒ
小球またはＣｈＣｌ3 溶液でＰ−Ｅ ＦＴＩＲ（フーリ
エ変換赤外）機器（Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＴ）、型１８０
０でとった。ＭＳ（質量分析）とＨＲＭＳ（高分解能質
量分析）はＫｒａｔｏｓ ＭＳ２５ＲＦＡとＭＳ５０Ｔ
Ｃ機器（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）でそれぞれ得
た。フラシュ クロマトグラフィーはＷｏｅｌｍ（Ａｔ
ｌａｎｔａ，ＧＡ）シリカゲルゲル（シリカ３２−６
３）を用いて行った。薄膜クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）はＡｎａｌｔｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）シリカゲ
ルＧＨＬＦプレートまたはＲＰＳ−Ｆ逆相プレート、共
に２５０ミクロンで行った。ルーチン高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）用に、Ｐ−Ｅポンプ、シリーズ
４ＬＣ、ＨＰ １０４６Ａ蛍光検出器、Ｐｈｅｎｏｍｅ
ｎｅｘ（Ｊｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）ＩＢ Ｓｉｌ−５Ｃ
１８（１５０×４．６ｍｍ）カラムが用いられた。移動
相は７０：３０メタノール−リン酸塩緩衝液（５０ｍｍ
ｏｌリン酸アンモニウム、ｐＨ４．４）であり、流速
１．５ｍｌ／分で行った。放出率測定のため、ＨＰＬＣ
システムは、二台のＷａｔｅｒｓポンプ型５１０、オー
トサンプラー型７１２、傾斜コントローラー型６８０を
含んだ。クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ Ｃ−１８
カラムで行い、移動相はギ酸トリエチル−アンモニウム
緩衝液（０．０５Ｍ ｐＨ２．８）とアセトニトリルが
各々６８：３２の混合液である。溶離したアドリアマイ
シンの蛍光は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｒａｍｓｅｙ，ＮＪから得たＡＢＩ蛍光検出器型９
８０（励起、２５４ｎｍ；蛍光、５５０ｎｍ）を用いて
検出された。酢酸塩緩衝液はｐＨ４．５と５．０で用い
られ、リン酸緩衝溶液はｐＨ７．４で用いられた。アド
リアマイシン塩酸塩はサンラク（日本）から得た。その
他のすべての化学薬品は市販源から得た。元素分析はＢ
ｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＴの分析部門とＯｎ
ｅｉｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓで行っ
た。
【００９５】実施例１ 二官能性化合物１０およびＡＤＭのセミカルバゾン誘導
体の製造 この実施例は二官能性化合物と、ＡＤＭのＣ−１３位置
にセミカルバゾン結合をもつＡＤＭのセミカルバゾン誘
導体を製造する方法を述べる。Ｎ−〔２−〔（２−ピリ
ジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド
（化合物１０）は化１４に示した反応で製造される。シ
ステアミン塩酸塩をメトキシカルボニルスルフェニル
クロリド次いで２−メルカプトピリジンと反応させて２
−（２−ピリジニル）ジチオエタンアミン塩酸塩（化１
４の化合物９）とする。これを次にホスゲンとｔ−ブチ
ル カルバザート、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
と反応させて、望む生成物（化合物１０）を得る。
【００９６】２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタン
アミン塩酸塩の製造 メトキシカルボニルスルフェニル クロリド（Ｚｕｍａ
ｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｎｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔ．９：５４−６３（１９
７０），（６．３３ｇ，５０ｍｍｏｌ）のＨＰＬＣのグ
リードのメタノール（１００ｍｌ）溶液をＮ2 下かくは
んし、氷で冷やす。これに、２−アミノエタン−チオー
ル塩酸塩（５．７ｇ、５０ｍｍｏｌ）のメタノール（５
０ｍｌ）溶液を滴下する。加え終って、室温（ＲＴ）で
２時間かくはんする。溶媒を蒸発させ、残オイルをアセ
トン（１００ｍｌ）から結晶化させ、固体（６．９ｇ）
が得られる。この固体をメタノール（１００ｍｌ）に溶
かす。氷で冷やし、Ｎ2 下かくはんし、２−メルカプト
ピリジン（３．８２ｇ、３４ｍｍｏｌ）のメタノール
（５０ｍｌ）溶液を滴下する。１時間ＲＴでかくはん
し、少量に濃縮し、結晶化するまでアセトンで除々に希
釈する。冷蔵庫に１時間置いた後、固体を濾過して集
め、乾燥して、化合物２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エタンアミン塩酸塩（化合物９）を得る。この化合
物はＦｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ，２９：１６３２−１６３５（１９６４）およびＣｏ
ｎｎｏｒ ａｎｄＳｃｈｒｏｉｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
７：８４８−８５１（１９８８）にかかれている。化合
物の特性は次の通りである。 ｍｐ １２３−５°（５．８ｇ，５２％）．ＩＲ（ＫＢ
ｒ）２９５２，２９１３，１６１０，１５７５，１５５
９，１４５１，１１１５，７６７ｃｍ-1． ＮＭＲ（Ｄ
2 Ｏ）．δ ８．４６，７．８３，７．３４（ｄ，ｍ，
ｍ ４Ｈ，Ｐｙ），３．３７（ｔ，２Ｈ ＣＨ2 ＣＨ
2 ＮＨ2 ），３．１２（ｔ，２Ｈ，ＳＣＨ2 Ｃ
Ｈ2 ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）：１８７（［Ｍ＋Ｈ］+ に相
当）１７０，１５２，１４２，１１２，１０４，７６． 元素分析：計算値Ｃ7 Ｈ11ＣＬＮ2 Ｓ2 ．１／４ Ｈ2
Ｏ： Ｃ，３７．００，Ｈ，５．０６，Ｎ，１２．３
３． 実測値Ｃ，３６．８２： Ｈ，４．９９，Ｎ，１
２．３７．
【００９７】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン
カルボキサミド） ２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタンアミン塩酸塩
（２．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン（１
００ｍｌ）に懸濁させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）
（５．８ｍｌ）で処理する。この溶液を、氷で冷やしな
がらかくはんするホスゲン（１．９３Ｍトルエン溶液１
０ｍｌ）の塩化メチレン（２００ｍｌ）溶液に滴下す
る。反応をＴＬＣでモニターし、出発物質がなくなった
ら、しばらくの間混合液にＮ2 を通す。その後ｔ−ブチ
ル カルバザート（１．３２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加
え、一夜かくはんする。溶液を水で洗い、溶媒を蒸発さ
せる。残渣を、塩化メチレン：メタノール（１００：
２）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフィーする。適
当なフラクションを集め、１．７４ｇのＮ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−２−（ｔ−ブ
トキシカルボニル）ヒドラジンカルボキサミド（化合物
９ａ）を泡状で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３２８１，２９７９，２９３２，１７２
３，１６７２，１５７７，１５６０，１５４５，１４４
８，１４１９，１２５３，１１６１，７６２ｃｍ-1．
ＮＭＲ（ＣＤＣＬ3 ）δ ８．５０，７．５６，７．５
１，７．１２（４Ｈ，Ｐｙ），３．５１（２Ｈ，Ｃ
Ｈ 2 ），２．８９（２Ｈ，ＣＨ 2 Ｓ），６．８４，６．
３７，６．１７（３Ｈ，ＮＨ），１．４４（９Ｈ），
（ＣＨ3 ）3 Ｃ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）３４５（［Ｍ＋
Ｈ］+ に相当），３１７，２８９，２４５，２１３，１
７８，１３４，１１２．
【００９８】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕ヒドラジンカルボキサミド Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−２
−（ｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジンカルボキサミ
ド（５７０ｍｇ，１．６６ｍｏｌ）を氷で冷やしたＴＦ
Ａ（１０ｍｌ）に溶かす。氷中で１０分間かくはんし、
続いて冷やさずに１０分間かくはんする。ＴＦＡを減圧
でできるだけ蒸発させ、残渣を塩化メチレン：メタノー
ル：農水酸化アンモニウム（１００：５：０．５）溶媒
系を用いシリカでクロマトグラフィーする。適当なフラ
クションをＴＬＣによって集め、溶媒を蒸発させて結晶
性残渣（０．４２ｇ、定量的）を残す。分析用サンプル
はＩＰＡから結晶化し、ｍｐ１０５−７°、Ｎ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカル
ボキサミド（化合物１０）は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３３６，３２２０，３０６４，２９４
９，２６３４，１６７０，１６２３，１５７５，１５６
２，１１−３３，１４５２，１３６９，１１７２，１０
４６，７７０ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．
４１，７．７８，７．２１（４Ｈ，Ｐｙ），３．４３
（２Ｈ，ＮＣＨ2 ），２．９１（２Ｈ，ＳＣＨ2 ）．
ＭＳ（ｍ／ｅ）２４５（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当，２２１，
２１３，１６２，１３４，１１２． 元素分析：計算値Ｃ8 Ｈ12Ｎ4 ＯＳ2 ： Ｃ，３９．３
２，Ｈ，４．９５；Ｎ，２２．９３；Ｓ，２６．２４．
実測値Ｃ，３９．１９；Ｈ，４８６；Ｎ，２２．４
８；Ｓ，２５．０２．
【００９９】アドリアマイシン塩酸塩およびＮ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕 ヒドラジンカルボキサミドのセミカルバゾン誘導体の製
造 化合物１０（０．３７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）のメタノー
ル（２５ｍｌ）溶液をアドリアマイシン塩酸塩（０．６
６ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍｌ）懸
濁液にかくはんしながら加える。ＴＦＡ（５滴）を加
え、一夜かくはんする。澄んだ溶液を濃縮し、０．３％
酢酸アンモニウムを含むメタノール：水（６０：４０）
を溶媒系として用いＣ−１８カラムでクロマトグラフィ
ーする。適当なフラクションを集め、メタノールをでき
るだけ蒸発させる。水相を凍結乾燥し、残渣をメタノー
ルに溶かし、アセトニトリルに加える。濾過により赤色
の固体を集め、乾燥する（０．６５ｇ、６８％）。ＡＤ
Ｍのセミカルバゾン誘導体は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３９９，２９７６，２９３６，１６７
１，１６１８，１５７８，１５３８，１４１７，１２８
６，１２１０，１１１７，１０１５，９８９，７６４ｃ
ｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．２５，７．７
６，７．６２，７．４８，７．０７（ｐｙ，ｐｈ，
Ｈ），４．９５（アノマ−Ｈ），４．６３（ＣＨ2 Ｏ
Ｈ），４．２４（ＣＨ 3 ＣＨ），３．９７（ＯＣ
Ｈ3 ），３．５−２．９（クラスター吸収ＳＳＣＨ2 ，
−ＣＨ2 −，ＣＨ2 −ＮＨ），１．２９（ＨＣ−Ｃ
Ｈ 3 ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）７７０（［Ｍ＋Ｈ］+ に相
当），６４１，４３７，３４６． ＨＲＭＳ：計算値Ｃ
35Ｈ40Ｎ5 Ｏ11Ｓ2 ：７７０．２１６６；実測値：７７
０．２１５７．
【０１００】実施例２ 二官能性化合物１１ａおよびＡＤＭのカルバゾン誘導体
の製造 この実施例は、カルバジド二官性化合物とＡＤＭのＣ−
１３位置にカルバゾン結合をもつＡＤＭのカルバゾン誘
導体を製造する方法を述べる。２−〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕−エタンアミン塩酸塩をｔ−ブチルカルバ
ザート、トリホスゲンと反応させて、化１５に示すよう
に、二官性化合物（化合物１１ａ）、カルバジドを得
る。過剰のｔ−ブチルカルバザートはホスゲンと反応し
てカルボニック ヒドラジドとなる。
【０１０１】２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，２’−ビス
（ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニック ジヒドラジ
ド ｔ−ブチル カルバザート（０．３９６ｇ，３ｍｍｏ
ｌ）を乾燥クロロホルム（１０ｍｌ）に溶かす。その溶
液をＮ2 下、ＲＴでかくはんし、ＴＥＡ（０．６ｇ、６
ｍｍｏｌ）を加える。これにトリホスゲン（０．２９６
ｇ、１ｍｍｏｌ）を一気に加える。活発な反応が起こ
り、静まってから、２−（２−ピリジニルジチオ）エタ
ンアミン塩酸塩（０．６６７ｇ、３ｍｍｏｌ）のＴＥＡ
（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を含むクロロホルム溶液を加
える。ＲＴで１．５時間かくはんし、水（３×２０ｍ
ｌ）で洗い乾燥して、減圧で溶媒を蒸発させると、泡
（０．９１ｇ）が残る。これを塩化メチレン：メタノー
ル（１００：２）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフ
ィーする。フラクションをＴＬＣでモニターし集める
と、化合物２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，２’−ビス
（ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニック ジヒドラシ
ド（化合物１１）を泡状で得る（０．５４ｇ、５２
％）。化合物１１は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３０２，２９８０，２９３３，１７２
６，１６８３，１４９８，１２５２，１１６０，１０４
７，１０１８，７６３ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）
δ ８．５０，７．５７，７．４９，７．１０，（ｄ，
ｑ，ｄ，ｔ，４Ｈ，Ｐｙ），３．５２（ｔ，２Ｈ，ＳＳ
ＣＨ2 ）２．９０（ｔ，２Ｈ ＣＯＮＣＨ2 ），１．４
６［Ｃ（ＣＨ3 ）3 ］，８．３０，６．５０，６．２９
（ｂ，ｓ，ｓ，ＮＨ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）５０３（［Ｍ
＋Ｈ］+ に相当），４４７，４３１，４１９，４０３，
３４７，３０３，２１３，１７９，１１２．
【０１０２】２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニック ジヒ
ドラジド 化合物１１（０．３４ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に氷で冷
やしたＴＦＡ（５ｍｌ）を加えて１０分間かくはんし、
続いて冷やさずに１０分間かくはんする。ＴＦＡをでき
るだけ蒸発させ、残渣を、塩化メチレン：メタノール：
濃ＮＨ4 ＯＨ（１００：５：０．５）溶媒系を用いシリ
カでクロマトグラフィーする。適当なフラクションを集
め、蒸発後化合物１１ａを吸湿性泡で得る（０．２ｇ、
定量的収率）。化合物１１ａは次のような特性である。 ＩＲ（フィルム）３３３０，２９６４，２９２９，１６
９８，１６６０，１５７６，１４８６，１２３１，１０
４５，７５９ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ８．
５０，７．５６，７．１０（ｄ，ｍ，ｍ，４Ｈ，Ｐ
ｙ），３．５２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ 2 Ｎ），２．９１
（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2 ＳＳ），８．８７，８．８５，４．
１９，３．７８（Ｄ2 Ｏ可交換プロトン，ＮＨ）． Ｍ
Ｓ（ｍ／ｅ）３０３（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当），２１３，
１１２．
【０１０３】アドリアマイシン塩酸塩および２−
〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミ
ノ〕カルボニル〕カルボニック ジヒドラシドのカルバ
ゾン誘導体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（３５６ｍｇ、０．６ｍｍｏ
ｌ）と化合物１１ａ（０．２ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）
を、２〜３滴のＴＦＡを含むメタノール（５０ｍｌ）中
で一夜かくはんする。澄んだ溶液が得られ、ＨＰＬＣ
（メタノール：０．０１Ｍリン酸アンモニウム溶液、ｐ
Ｈ４．５、７０：３０溶媒系）は、９０％以上のアドリ
アマイシンがセミカルバゾンに変わったことを示す。溶
媒を蒸発させ、残渣を、０．３％酢酸アンモニウムを含
むメタノール：水（６０：４０）溶媒系を用いＣ−１８
カラムでクロマトグラフィーする。逆相ＴＬＣ（０．３
％酢酸アンモニウムを除き同じ溶媒系）および／または
ＨＰＬＣでフラクションをモニターし、アドリアマイシ
ンのないフラクションを集める。メタノールの大部分を
減圧で蒸発させる。水溶液を凍結乾燥し、赤色の残渣を
少量のメタノールに溶かす。溶液を濾過し、アセトニト
リル（１１）にかきまぜながら加える。澄んだ溶液を約
１／３まで濃縮し、得られた固体を遠心分離により集
め、乾燥して、ＡＤＭのカルバゾン（化合物４）（１６
０ｍｇ）を得る。溶液を１００ｍｌにまで濃縮し、エー
テルで希釈し、遠心分離により固体を集めて、更に８５
ｍｇ得る（合計収率４９％）。このカルバゾン誘導体は
次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３３４６，２９７５，２９３６，１７
１１，１６６８，１６１８，１５７８，１２８６，１２
１０，１０８３，１０１５，７６５ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．４３，７．８９，７．７
７，７．５２，７．２１，（Ｐｙ，Ｈ），５．１５（ア
ノマ−Ｈ）４．５７（ＣＨ2 ＯＨ），４．２５（ＣＨ3
ＣＨ），３．９９（ＯＣＨ 3 ），３．５３（ＳＳＣ
Ｈ 2 ），３．１７（−ＣＨ2 −，ｒｉｎｇ），３．０５
（ＣＨ 2 ＮＨ＝），２．３８（−ＣＨ2 −，環）１．２
９（ＣＨＣＨ 3 ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）８２８（［Ｍ＋
Ｈ］+ に相当），６９９，５７２，５３７，３７７，３
４６，２８９，２１３．
【０１０４】実施例３ 二官能性化合物１２およびＡＤＭのチオセミカルバゾン
誘導体の製造 この実施例は、二官能性化合物（化合物１２）とＡＤＭ
のＣ−１３位置にチオセミカルバゾン結合をもつＡＤＭ
のチオセミカルバゾン誘導体を製造する方法を述べる。
この実施例では、実施例１で述べたセミカルバジド（化
合物１０）のチオ類似体を化１６に図示するように製造
する。２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタンアミン
を用いると、最後から二番目の工程で、チオセミカルバ
ジド部分の求核性が強いために２−メルカプトピリジン
の脱離が見られた。この問題は化１６に示すようにトラ
ンス−２−ブテン基を用いてきりぬけた。
【０１０５】１−ブロモ−４−（Ｎ−フタルイミド）−
２−ブテンの製造 １，４−ジブロモ−２−ブテン（８．４ｇ、４０ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ（２００ｍｌ）溶液にフタール酸イミドカ
リウム（４．６２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を１時間かけて少
量ずつ加える。一夜かきまぜた後、溶媒を蒸発させ、残
渣を水と塩化メチレンに分配する。有機相を数回水で洗
い、乾燥し、溶媒を蒸発させる。残渣を２−プロパノー
ルから結晶化させて、望む生成物１−ブロモ−４−（Ｎ
−フタルイミド）−２−ブテン（３．９５ｇ、５９％）
を得、次のような特性である。 ｍｐ １０１−２°． ＩＲ（ＫＢｒ）１７７５，１７
１１，１４６６，１４３６，１３９３，７２３ｃｍ-1．
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ７．８１，７．７３（ｍ，
ｍ ４Ｈ，ｐｈ），５．８８，５．８１（ｍ，ｍ ２
Ｈ，２＝ＣＨ -1）４．３０（ｄ，２Ｈ ＣＨ 2 −Ｎ），
３．９０（ｄ，２Ｈ ＣＨ 2 Ｂｒ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）
２８０（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当），２００． 元素分析：計算値 Ｃ12Ｈ10ＢｒＮＯ2 ：Ｃ，５１．４
５；Ｈ，３．６０；Ｎ，５．００． 実測値： Ｃ，５
２．３５； Ｈ，３．４７，Ｎ，４．８０．
【０１０６】１−（アセチルチオ）−４−（Ｎ−フタル
イミド）−２−ブテンの製造 無水エタノール（５０ｍｌ）中の、１−ブロモ−４−
（Ｎ−フタルイミド）−２−ブテン（３．９５ｇ、１４
ｍｍｏｌ）とチオ酢酸カリウム（１．７７ｇ、１５．５
ｍｍｏｌ）の混合物を１／２時間還流する。溶媒を蒸発
させ、残渣を蒸発させ、残渣を塩化メチレンで抽出す
る。溶媒を抽出させて、結晶性残渣（３．８５ｇ、９９
％）を得、そのまま次の工程で用いる。分析用サンプル
は２−プロパノールから結晶化し、ｍｐ６９−７１°で
ある。この化合物は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）１７６９，１７１３，１６８８，１４２
７，１３９１，１１１４，９５８ｃｍ-1． ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3 ）δ ７．８０，７．７３（ｍ，ｍ４Ｈ Ｐ
ｈ），５．７０（ｍ，２Ｈ ２ ＝ＣＨ−），４．２４
（ｄ，２Ｈ，ＣＨ 2 Ｎ），３．４８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ
2 Ｓ），２．２９（ｓ，３Ｈ，Ｃ−ＣＨ 3 ）． ＭＳ
（ｍ／ｅ）２７６（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当），２３４，２
００． 元素分析：計算値Ｃ14Ｈ13ＮＯ3 Ｓ： Ｃ，６１．０
７； Ｈ，４．７６；Ｎ，５．０９． 実測値： Ｃ，
６１．２９；Ｈ，４．８２，Ｎ，５．２１．
【０１０７】１−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジ
チオ〕−２−ブテン塩酸塩の製造 １−アセチルチオ−４−（Ｎ−フタルイミド）−２−ブ
テン（６．５ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）の無水エタノール
（１５０ｍｌ）溶液とヒドラジン（１．７４ｇ、５４ｍ
ｍｏｌ）を還流する。反応をＴＬＣで追い、出発物質が
なくなってから、溶液を氷で冷やし、６ＮＨＣｌ（１０
ｍｌ）で処理する。生じたかさ高の沈澱物はフタルヒド
ラジドと固定され（ＮＭＲ，ＭＳ）濾過する。濾液を１
０ｍｌまで濃縮し、水で希釈する。固体を濾過して除
き、濾液をエーテル（２Ｘ）と塩化メチレン（１Ｘ）で
洗い、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、凍結乾燥する。固体を少
量のメタノールに溶かし、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、溶媒
を蒸発させ、一夜排気する。ろう状の吸湿性物質を得、
次の特性をもつ。 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ2 Ｏ）δ ５．８３，５．６０
（ｍ，ｍ ２Ｈ，２ ＝ＣＨ−）３．４０（ｄ，２Ｈ
ＣＨ2 ＮＨ2 ），３．１６（ｄ ２Ｈ，ＣＨ 2 ＳＨ）Ｍ
Ｓ（ｍ／ｅ）１０４（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当），８７，７
０． このろう状物質をＨＰＬＣグレードのメタノール（７５
ｍｌ）に溶かす。溶液をかくはんし、メトキシカルボニ
ルスルフェニル クロリド（３ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）
で処理する。１／２時間後、ＴＬＣで出発物質は見つか
らない。溶媒を蒸発させ、メタノール（７５ｍｌ）に溶
かす。溶液をかくはんし、２−メルカプトピリジン
（２．７ｇ、２４ｍｍｏｌ）で処理する。２時間後溶媒
を蒸発させ、高真空で排気する。残渣を、０．０１Ｎ
ＨＣｌとメタノール混合液（９０：１０、１３０ｍｌ）
に溶かす。濁った溶液を塩化メチレンで洗い、Ｃｅｌｉ
ｔｅで濾過し、凍結乾燥して、１−アミノ−４−［（２
−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテン塩酸塩を吸湿性の
高い綿毛状物質（４ｇ、６８％）として得、次のような
特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４３３，２９５９，２８８４，１６０
７，１５７６，１４４７，１４１８，１１１８，７６７
ｃｍ-1． ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ）δ ８．５１，８．１３，
８．０２，７．５４（ｍ ４Ｈ，Ｐｙ）５．８７，５７
２（ｍ，ｍ ２Ｈ，２ ＝ＣＨ−）３．５４（ｄ ２
Ｈ，ＣＨ 2 ＮＨ2 ）３．４３（ｄ ２Ｈ，ＣＨ
2 Ｓ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）２１３（［Ｍ＋Ｈ］+ に相
当），１９６，１１２．
【０１０８】Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミドの製造 １−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−
ブテン塩酸塩（１．５ｇ、６ｍｍｏｌ）をかきまぜなが
ら塩化メチレン（３０ｍｌ）に懸濁させる。ＴＥＡ
（１．４６ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を加え、続いてジ−
２−ピリジル チオノカーボネート（Ｋｉｍ ａｎｄ
Ｙｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：１６
６１−１６６４（１９８５）），（１．４ｇ、６ｍｍｏ
ｌ）を加える。澄んだ溶液が得られ、ＴＬＣが出発物質
のないことを示す。ｔ−ブチル カルバザート（０．８
ｇ、６ｍｍｏｌ）を加え、１時間かくはんする。溶液を
水で洗い、溶媒を蒸発させる。残渣を塩化メチレン：メ
タノール（１００：２）溶媒系を用いシリカでクロマト
グラフィーし、ヘキサン：酢酸エチル（７５：２５）溶
媒系を用いて再クロマトグラフィーして、Ｎ−〔４−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル〕ヒドラ
ジンカルボチオアミドのｔ−Ｂｏｃ誘導体（１．４ｇ、
５８％）を泡状で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３２３８，２９７１，２９３０，１７１
８，１５４４，１４１８，１１５６，７６２ｃｍ-1．
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ／Ｄ2 Ｏ）δ ８．４３，７．６
５，７．０８（ｍ，ｍ，ｍ ４Ｈ，ｐｙ）５．５７（ｍ
２Ｈ，２＝ＣＨ），４．１２（ｄ ２Ｈ，ＣＨ 2
Ｎ）３．４５（ｄ ２Ｈ ＣＨ 2 Ｓ），１．４６（Ｓ
９Ｈ，３ ＣＨ3 ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）３８７（［Ｍ＋
Ｈ］+ に相当），３５５，２８７，２７６，１１２．
【０１０９】保護カルボチオアミド（０．８６ｇ、２．
２ｍｍｏｌ）を氷で冷やしたＴＦＡに溶かす。氷で１０
分間冷やし（Ｎ2 下）、続いて１０分間冷やさずに置
く。過剰の酸をできるだけ高真空で蒸発させ、残渣を塩
基メチレン：メタノール：濃ＮＨ4 ＯＨ（１００：５：
０．５）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフィーす
る。適当なクラクションを集めて、化合物１２をゴム状
（０．３９ｇ、６３％）で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（フィルム）３３２２，３１９８，２９７４，１６
２６，１５７４，１５６０，１５３８，１４４８，１４
１８，１２２４，７６０ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3
／Ｄ2 Ｏ）δ ８．４１，７．６３，７．１１（ｍ ｍ
ｍ ４Ｈ，Ｐｙ）５．６４（ｍ ２Ｈ，２＝ＣＨ），
４．２０（ｄ ２Ｈ，ＣＨ 2 Ｎ）３．４１（ｄ ２Ｈ，
ＣＨ 2 Ｓ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）２８７（［Ｍ＋Ｈ］+ に
相当），２２５，２２１，１４４，１１２．
【０１１０】アドリアマイシン塩酸塩およびＮ−〔４−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル〕 ヒドラジンカルボチオアミドのチオセミカルバゾン誘導
体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（３５０ｍｇ、０．６ｍｍｏ
ｌ）のＨＰＬＣグレードのメタノール（５０ｍｌ）懸濁
液かきまぜながら、化合物１２（３５０ｍｇ、１．２ｍ
ｍｏｌ）のＨＰＬＣグレードのメタノール（２５ｍｌ）
溶液を加える。ＴＦＡ（３〜４滴）を加え、一夜かくは
んする。澄んだ溶液が得られ、フリーのアドリアマイシ
ンが残っていないことがＨＰＬＣまたはＴＬＣで示され
る。溶液を少量（５ｍｌ）に濃縮し、アセトニトリル
（６００ｍｌ）に加える。沈澱を生じ、冷蔵庫で冷やし
て、遠心分離で集め、高真空で乾燥させる（２７５ｍ
ｇ、５４％）。チオセミカルバゾン誘導体は、次のよう
な特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４１８，２９３４，１６１６，１５７
８，１５３４，１４１４，１２８４，１２０８，１０１
２，９８６ｃｍ-1． ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ８．３
０，７．８０，７．７４，７．５２，（Ｐｙ，ｐｈ ７
Ｈ），５．６０（２＝ＣＨ）５．４０（アノマ−Ｈ）
４．６７（ＣＨ 2 ＯＨ），４．２２（ＣＨ 3 ＣＨ）４．
０９（ＣＨ2 Ｎ）４．０２（ＯＣＨ3 ）３．５−１．８
８（クラスタ−吸収−ＣＨ 2 −ＳＳ，−ＣＨ2 −Ｃ
Ｈ），１．３０（ＣＨ 3 −ＣＨ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）８
１２（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当），７０１，６８３，６６
９，５７２，５５４，５４０，５３６，５２２，５０
４． ＨＲＭＳ計算値 Ｃ37Ｈ42Ｎ5Ｏ10Ｓ3 ： ８１
２．２０９４； 実測値８１２．２０３７．
【０１１１】実施例４ 二官能性化合物１３およびＡＤＭのカルボキシレートヒ
ドラゾン誘導体の製造 この実施例は、新規二官能性化合物１３およびＡＤＭの
カルボキシレートヒドラゾン誘導体の製造を述べてい
る。カルボキシレートヒドラゾン二官能性化合物は、化
１７に示すように、メルカプトエタノールを誘導化して
ピリジニルジチオエタノールとし、この化合物を活性化
カルボニル誘導体に変えてヒドラジンと縮合させて製造
する。
【０１１２】２−〔（２−（ピリジニル）ジチオ〕エチ
ル ヒドラジンカルボキシレートの製造 クロロカルボニルフェニル クロリド（１．２４ｇ、
９．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ2 Ｃｌ2 （１０ｍｌ）冷溶液
（０℃）に、２−メルカプトエタノール（７３７ｍｇ、
９．４５ｍｍｏｌ）を滴下する。３０分間０°〜１５℃
でかくはんし、０℃に冷やして、２−メルカプトピリジ
ン（１．０５ｇ、９．５４ｍｍｏｌ）のＣＨ2 Ｃｌ
2 （１５ｍｌ）溶液で処理する。０℃で１時間かくはん
し、次に室温で１６時間かくはんする。炭酸アンモニウ
ム溶液（水２０ｍｌ中に１．０ｇ）を加えて、相を分
け、有機相を水で洗い、乾燥し、減圧濃縮して粗２−
（２−ピリジニルジチオ）エタノール（１．７５ｇ）を
無色オイルで得る。カルボニルジ−イミダゾール（６４
８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を２−（２−ピリジニルジチオ）
エタノール（７１４ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）のＣＨ2 Ｃ
ｌ2 （１０ｍｌ）溶液に加える。混合物を２０分間かく
はんし、−２０℃に冷やし、ヒドラジン（１２２ｍｇ、
３．８ｍｍｏｌ）で処理する。−５℃に１６時間置き、
減圧濃縮する。残渣を塩化メチレン：メタノール（１０
０：１〜３）溶媒系をシリカゲルでクロマトグラフィー
して、化合物１３．２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル ヒドラジンカルボキシレート（３４０ｍｇ、３
７％）を無色のオイルで得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ８．４６（１Ｈ），７．６２
（２Ｈ），７．０８（１Ｈ），５．９２（１Ｈ），４．
３５（ｔ，２Ｈ），３．７０（ｓ，ＺＨ），３．０１
（ｔ，２Ｈ），１．５６（ｓ，２Ｈ）． ＭＳ（ｍ／
ｅ）２４６（［Ｍ＋Ｈ］+ 相当），１４２，１０３．
【０１１３】アドリアマイシン塩酸塩および２〔（２−
ピリジニル）ジチオ〕エチル ヒドラジンカルボキシレ
ートのヒドラゾン誘導体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（２９０ｍｇ、０．５ｍｍｏ
ｌ）の無水メタノール（４ｍｌ）懸濁液に、化合物１３
（１７０ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍ
ｌ）溶液を、ＣＦ3 ＣＯ2 Ｈ（６ｍｇ）のメタノール
（１ｍｌ）溶液を加える。２４時間かくはんし、約４ｍ
ｌまで濃縮し、この溶液にアセトニトリル（５０ｍｌ）
を加える。生成物を遠心分離で分ける。固体を水−メタ
ノールに溶かし、凍結乾燥し、アドリアマイシンのヒド
ラゾン誘導体（３５４ｍｇ、８８％）を暗赤色の固体で
得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．３４（１Ｈ），７．９３
（ｄ，１Ｈ），７．８１（ｍ，３Ｈ），７．５４（ｄ，
１Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｍ，１
Ｈ），５．１９（ｓ，１Ｈ），４．５９（ｍ，２Ｈ），
４．３７（ｍ，２Ｈ），４．２５（ｍ，１Ｈ），４．０
１（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｍ １Ｈ），３．５４
（ｍ，１Ｈ），３．１０（ｔ，３Ｈ），２．３７（ｍ，
２Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．８９（ｍ，１
Ｈ），１．２９（ｄ，３Ｈ）． ＭＳ（ｍ／ｅ）：７７
１（［Ｍ＋Ｈ］+ に相当），６４２．
【０１１４】実施例５ 二官能性化合物１５およびＡＤＭのアリルヒドラゾン誘
導体の製造 この実施例は、新規二官能性化合物（化合物１５）およ
びＡＤＭのＣ−１３位置にアリルヒドラゾン結合をもつ
ＡＤＭのアリルヒドラゾン誘導体の製造方法を述べてい
る。化合物１５は、４−Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ安息香
酸を用い、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン
基を結合させて、化１８に示すように製造される。
【０１１５】４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸
の製造 ｐ−ヒドラジノ安息香酸（７６０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）
を、ジオキサン（１０ｍｌ）、水（５ｍｌ）、１ＮＮａ
ＯＨ溶液（５ｍｌ）に溶かす。ジ−ｔ−ブチルピロカー
ボネート（１．３１ｇ、６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、０
℃で１時間、ＲＴで３０分かくはんする。その後溶液の
かさを半分にし、０．５％ＨＣｌ溶液で酸酸性にし、Ｅ
ｔＯＡｃで抽出する。集めたＥｔＯＡｃ溶液をブライン
で洗い、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥する。溶媒を除くとわずか
に褐色の固体が得られ、ＥｔＯＡｃとヘキサンから再結
晶する（９５０ｍｇ、７５％）。次のような特性であ
る。 ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ７．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝
８．５ Ｈｚ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５ Ｈ
ｚ），１．４8 （ｓ，９Ｈ）； ＩＲ（ＫＢｒ）３３１
６，１６８８，１６０７，１２９８ｃｍ-1．
【０１１６】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル−４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）ベンズアミド
の製造 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ）中
の、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸（２５２
ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（１１５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシル−カル
ボジミイド（ＤＣＣ）（２４７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）
を一夜室温でかくはんする。ジシクロヘキシルウレア
（ＤＣＵ）を濾過して除き、濾液を蒸発させる。残渣に
Ｅｔ2 Ｏを加えて結晶化させて、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒ
ドラジノ）安息香酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド
エステル（３００ｍｇ）を得る。この物質（２５０ｍ
ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）と２−（２−ピリジニルジチ
オ）エチルアミン塩酸塩（１６７ｍｇ、０．７５ｍｍｏ
ｌ）をＤＭＦ（４ｍｌ）に溶かす。ＴＦＡ（０．１２５
ｍｌ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、一夜室温でかくはんす
る。ＤＭＦを除き、ＳｉＯ2でクロマトグラフィー（２
％ ＭｅＯＨ−ＣＨ2 Ｃｌ2 ）して、泡状物（２１７ｍ
ｇ、５２％）を得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）δ ８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
５．１ Ｈｚ），８．０１（ｂｔ，１Ｈ），７．７８
（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ），７．５７（ｍ，１
Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１ Ｈｚ），７．
０９（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７
Ｈｚ），７．４０（ｂｓ，１Ｈ），５．９２（ｂｓ，１
Ｈ），３．７０（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ
＝５．８ Ｈｚ），１．４５（ｓ，９Ｈ）； ＩＲ（Ｋ
Ｂｒ）３３０３，１７１４，１６１０，１５０５ｃ
ｍ-1； ｍｓ ｍ／ｅ ４２１（Ｍ＋Ｈ），３６５，３
２１，１１２，ＨＲＭＳ計算値Ｃ19Ｈ23Ｎ4 Ｏ3 Ｓ2
４２１．１３６８，実測値４２１．１３５８．
【０１１７】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミドの製造 先の化合物（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をＴＦＡ
（１．５ｍｌ）で０℃で１時間処理する。その後ＴＦＡ
を蒸発させ、残渣をＥｔ2 Ｏで粉砕して、約２００ｍｇ
のＮ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−
４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）をオイル状
で得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．５ Ｈｚ），７．８１（ｍ，４Ｈ），７．２２
（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８ Ｈｚ），６．９７（ｄ，２
Ｈ），Ｊ＝８．８ Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ−
６．６ Ｈｚ），３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈ
ｚ）； ＩＲ（フィルム）３２７８，１６７４，１６１
３ｃｍ-1； ＭＳ ｍ／ｅ ３２１（Ｍ＋Ｈ）．
【０１１８】アドリアマイシンおよびＮ−〔２−〔（２
−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベン
ズアミドのアリルヒドラゾン誘導体の製造 化合物１５とアドリアマイシン塩酸塩（２５０ｍｇ、
０．４３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍｌ）に溶かし、
暗室で２日間かくはんする。溶媒を除去し、Ｃ−１８逆
相ＳｉＯ2 でクロマトグラフィーする。０．３％ＮＨ4
ＯＡｃを含むＭｅＯＨ：Ｈ2 Ｏ＝２：１で溶出して、ヒ
ドラゾン化合物５（３０ｍｇ、８％）を橙色粉末で得、
次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．８ Ｈｚ），７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９ Ｈ
ｚ），７．７４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ），７．
６６（ｍ，４Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５
Ｈｚ），７．１４（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｄ，２Ｈ，
Ｊ＝８．８ Ｈｚ），５．４６（ｂｓ，１Ｈ），５．１
６（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），４．２３
（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｍ，
４Ｈ），３．０２（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｍ，１
Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），１．９７（ｍ，２Ｈ），
１．３２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５ Ｈｚ）； ＩＲ（Ｋ
Ｂｒ）３２０６，１７０８，１６０７，１５７８ｃ
ｍ-1； ＭＳ ｍ／ｅ ８４６（Ｍ＋Ｈ），７３７，７
１７，ＨＲＭＳ計算値Ｃ41Ｈ44Ｎ5 Ｏ11Ｓ2 ，８４６．
２４７９，実測値８４６．２３８０．
【０１１９】０．３％ ＮＨ4 ＯＡｃを含むＭＣＯＨ：
Ｈ2 Ｏ＝３：１で溶出して無水の誘導体（１２０ｍｇ、
３４％）を青色固体で得る。 ＮＭＲ（ＣＤ3 ＯＤ）δ ８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．１ Ｈｚ），７．７７（ｍ，５Ｈ），７．４２
（ｍ，１Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），７．１６（ｍ，
２Ｈ），５．３５（ｂｓ，１Ｈ），５．２６（ｍ，１
Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），
３．９３（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．
５ Ｈｚ），３．４４（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｔ，２
Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．４９（ｍ，１Ｈ），１．８
８（ｍ，１Ｈ），１．６３（ｍ，１Ｈ），１．１９
（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５ Ｈｚ）； ＭＳ ｍ／ｅ ８
２８（Ｍ＋Ｈ）６９９，６８１，４９５； ＨＲＭＳ計
算値Ｃ41Ｈ41Ｎ5 Ｏ10Ｓ2 ８２８．２３７２，実測値
８２８．２３００．
【０１２０】実施例６ ＡＤＭ誘導体の特性 実施例１〜５で述べたように製造された、本発明のＡＤ
Ｍ誘導体からのＡＤＭの放出は、ｐＨ４．５〜７．４
で、ＨＰＬＣ分析を用いて研究された。ＡＤＭ誘導体の
保存溶液（１ｍｇ／ｍｌ）はメタノールでつくられ、ア
リコートは水性緩衝溶液ｐＨ４．５、５．０、７．４に
希釈され、約１．６ｎｍｏｌ／ｍｌまで達した。各緩衝
液でのインキュベーションは３７℃で２４時間まで行わ
れ、アリコートは、ＨＰＬＣカラムに入れて分析され、
コンジュゲートしていないＡＤＭ量を測定した。放出物
質は、カラムでの保持時間から、また溶出物質のＵＶプ
ロフィールからそのままのＡＤＭと同定された。放出率
は、ＡＤＭの最大量の百分率で表され、図１〜３に示
す。
【０１２１】図に示されるように、本発明のＡＤＭ誘導
体は大きなレンジの放出率を示した。ＡＤＭ誘導体から
の放出物質の量は、ｐＨが７か４に下がるに従って、増
した。ＡＤＭ誘導体が酸に敏感な結合をもっている結
果、抗体タンパク質からＡＤＭが放出することになる。
これらの結果は、ＡＤＭを二官能性化合物につないでい
るセミカルバゾン、カルバゾン、チオセミカルバゾン、
カルボキシレートヒドラゾン、アリルヒドラゾン結合の
存在で一貫している。
【０１２２】実施例７ アントラサイクリン イムノコンジュゲートの製造 この実施例は、本発明によるアントラサイクリン イム
ノコンジュゲートの製造を述べ、実施例１〜５で述べた
ＡＤＭ誘導体がモノクローナル抗体とコンジュゲートさ
れる。
【０１２３】二官能性化合物内にジスルフィド結合をも
つイムノコンジュゲートの製造 用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡＴ
ＣＣＮｏ．ＨＢ２１から産する５Ｅ９であり、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ“ＡＴＣＣ”（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から
入手できる。モノクローナル抗体５Ｅ９は、すべての分
裂するヒト細胞上のトランスフェリン受容体と反応し、
腫瘍細胞の種々の組織学上の型とクロス反応する、Ｉｇ
Ｇ抗体である。５Ｅ９は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに産する
腹水から精製された（Ｂｒｕｃｋｅｔ ａｌ．，“Ｏｎ
ｅ−Ｓｔｅｐ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏ
ｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｒｏｍ Ａｓｃｉｔｉｃ Ｆｌｕｉｄ ｂｙ ＤＥ
ＡＥ−Ａｆｆｉｉｇｅｌ Ｂｌｕｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
５ｂ：３１３−３１９（１９８２））。
【０１２４】ＡＤＭ誘導体を選ばれたモノクローナル抗
体と反応させる前に、抗体をチオール化する。すなわち
抗体分子に反応性スルフヒドリル基を導入する。５Ｅ９
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のチオール化は、ＳＰＤ
Ｐを用いて本質的にはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａ
ｌ．，前述に述べられるように行われる。簡単に述べる
と、ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，ＩＬ）（５０ｍＭ）をエタノールに溶かし、リン
酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中の５Ｅ９ＭＡｂ
（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）に加えて、最終濃度が５〜１０
ｍＭ間となる。反応混合物を３０分３０℃でインキュベ
ートとする。未反応のＳＰＤＰをＳＰＤＰ誘導化抗体か
ら、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いゲ
ル濾過クロマトグラフィーにより分離する。反応性ピリ
ジニルジチオ部分は、過剰のＤＴＴで還元して除去す
る。還元した抗体をＰＤ−１０カラムに通し、遊離のチ
オールを含む抗体がＡＤＭ誘導体との縮合に用いられ
る。
【０１２５】反応性チオール基は、２−ＩＴを用いても
抗体タンパク質に導入される。抗体（５０ｍＭ ＴＥ
Ａ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．
０に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）を２−ＩＴと（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＩＬ）最終濃度５〜１０
ｍＭで混合する。反応は９０分間４℃で進み、チオール
化された抗体は、２Ｍ ＮａＣｌ／ＰＢＳで平衡化され
たＰＤ−１０カラムで分離される。
【０１２６】抗体についた反応性チオール基の数は、Ｄ
ＴＮＢ（５，５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸）
（Ｅ412 ＝１１４１５０）を用い、Ｅｌｌｍａｎ，Ａｒ
ｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２：７０−
７７（１９５９）記載の方法により測定される。
【０１２７】各ＡＤＭ誘導体をＤＭＦに溶かし、還元さ
れたＳＰＤＰ−チオール化ＭＡｂ５Ｅ９のＰＢＳ溶液に
加える。ＡＤＭ誘導体の量は、抗体上のチオール基の数
と当量である。コンジュゲート化反応は一夜４℃でイン
キュベートして行われる。その後、抗体溶液をＰＢＳで
透析し、コンジュゲートしていないアドリアマイシン誘
導体を除く。次に抗体溶液をＳＭ−２ ＢｉｏＢｅａｄ
ｓ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃ
ｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で一夜処理する。ＭＡｂに結合しコ
ンジュゲートしたアントラサイクリンの量は、４９５ｎ
ｍ（Ｅ495 ＝８０３０）での吸光度により測定される。
抗体タンパク質の量は、２８０ｎｍで吸光度で測定され
る（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４ Ｏ．Ｄ．単位）。２８０ｎ
ｍでのＡＤＭ吸光度の重なりを補正するために次の式を
用いる。
【０１２８】
【数１】
【０１２９】イムノコンジュゲートは、コンジュゲート
していないＡＤＭやＡＤＭ誘導体の存在に対して、ＨＰ
ＬＣ分析を用いて分析された。ＨＰＬＣは５ミクロンＩ
Ｂ−ＳＩＬＣ１８ビーズで充填したＰｈｅｎｏｍｅｎｅ
ｘカラムを用い行った。コンジュゲートしていない薬
剤、ＡＤＭ誘導体（すなわち、実施例１〜５で述べたよ
うに製造された、本発明の二官能性化合物の各々にコン
ジュゲートしたＡＤＭ）（０．１μｍｏｌ）、０．５〜
５μｍｏｌ薬剤当量を含むイムノコンジュゲートをカラ
ムに入れ、メタノールと１０ｍＭリン酸アンモニウム、
ｐＨ４．５（７０：３０）、１．５ｍｌ／分で溶出し
た。生成したイムノコンジュゲートは、ＨＰＬＣ分析で
測定したように、コンジュゲートしていない薬剤を意味
ある程には含まなかった（１％以下）。
【０１３０】実施例８ イムノコンジュゲートの特性 実施例７で述べたように製造したイムノコンジュゲート
は、１３−ケト位置で二官能性化合物にコンジュゲート
したＡＤＭ分子から成り、その二官能性化合物がＡＤＭ
とＭＡｂ５Ｅ９間に連結を形成している。更にＭＡｂを
遊離のチオール基によって、反応性ピリジニルジチオ部
分を含むＡＤＭ誘導体に加えると、ＡＤＭとＭＡｂをつ
なぐ二官能性化合物中にジスルフィド結合が形成される
ことになる。この実施例によってつくられたイムノコン
ジュゲートは、限定するものではないが、５Ｅ９−ＡＤ
Ｍ−セミカルバゾン−〔３．４２〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−
カルバゾン−〔４．３７〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−チオセミ
カルバゾン−〔２．５１〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−カルボキ
シレートヒドラゾン−〔２．３５〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−
アリルヒドラゾン−〔２．５２〕を含み、名称の最初の
部分はコンジュゲートをつくるのに用いたモノクローナ
ル抗体を表し、第二の部分は抗体に連結したアントラサ
イクリンを表し、数字はコンジュゲート中のＡＤＭ／抗
体のモル比を表す。
【０１３１】本発明のイムノコンジュゲートの結合活性
は蛍光結合検定で測定された（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ
ｅｔ．ａｌ．，“Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｖａｌｕａｔｉ
ｏｎｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｐｒｅ
ｐａｒｅｄ ｂｙ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｍｉｔｏｍｙｃｉ
ｎ Ｃ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ Ｖｉａ Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ”ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｖｏｌ．２，ｐ２０１
（１９８９））。簡単に述べると、イムノコンジュゲー
トを連続的に１００μｌ検定培地に希釈する（ＲＰＭＩ
１６４０に１０％胎児ウシ血清とペニシリン／ストレプ
トマイシンを補う、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａ
ｎｄ，Ｎ．Ｙ．）。同じ培地で育てたＣＥＭ腫瘍細胞
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ１１９）（１×１０6 セル）
を取り出し、遠心分離により洗い、希釈したイムノコン
ジュゲートを含む培地に懸濁させる（１×１０6 ）。４
℃で１時間インキュベートした後、細胞を洗い、１：４
０希釈ヤギ抗−マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｃａｐｐｅ
ｌ，Ｄｕｒｈａｍ．ＮＣ）を含む培地１００μｌに懸濁
させ、更に４℃で１時間置く。細胞を洗い、Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｖ蛍光細胞分析器を用い分析する。
各実験に対して、同様に希釈したＭＡｂがコンジュゲー
トしていない正の結合対照として用いられる。タンパク
質収率の百分率（分離して得た）、モル比（ＡＤＭ／Ｍ
Ａｂのモル数）、元の結合活性の百分率で表した結合活
性は表１に示される。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】表１に示されるように、５Ｅ９イムノコン
ジュゲートは、コンジュゲートしていない５Ｅ９の元の
結合活性の９０％以上（チオセミカルバゾンを除く）を
保有した。このことは、ＡＤＭ誘導体の５Ｅ９とのコン
ジュゲートの結果、抗体の結合活性が比較的小さい程度
のロスですむことを示している。タンパク質収率は、タ
ンパク質の大部分がコンジュゲート化処理を通して維持
されたことを示す。
【０１３４】カルバゾンイムノコンジュゲートからのＡ
ＤＭの放出 本発明のカルバゾンイムノコンジュゲートからのＡＤＭ
の放出率は、ｐＨ４．５、５．０、７．４で、ＨＰＬＣ
分析により、実施例６でＡＤＭ誘導体に対して述べたよ
うに研究された。図４に示されるように、イムノコンジ
ュゲートからのＡＤＭの放出率は、実施例６でＡＤＭの
カルバゾン誘導体に対して示されたものと、本質的に同
じである。ＡＤＭ−イムノコンジュゲートから放出され
る物質量は、ｐＨが７から４に下がるにつれて増した。
このＡＤＭ−イムノコンジュゲートが酸に敏感な結合基
をもっている結果、抗体タンパク質からＡＤＭの放出と
なる。この結果はＡＤＭを二官能性化合物につなぐヒド
ラゾン結合の存在で一貫している。
【０１３５】ここで述べる実験デーダは、ＡＤＭ部分が
本発明のイムノコンジュゲートから、“生理学的”条
件、すなわちリソソーム環境で特徴的な酸性条件で放出
されることを示している。
【０１３６】イムノコンジュゲートの細胞毒活性 本発明のイムノコンジュゲートの細胞毒活性は、Ｇｒｅ
ｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔａｌ．，欧州特許出願Ｎｏ．３２
８，１４７記載のように、Ｄａｕｄｉ（バーキットリン
パ腫）細胞（表現型：５Ｅ９+ 、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ
２１）を用い軟アガルでのＣｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、インビトロ試験により測
定された。Ｄａｕｄｉ細胞は、完全培地（１０％胎児ウ
シ血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地）で成
長させた。培地１ｍｌ中１×１０5 セルを、１．５時
間、連続的に希釈した５Ｅ９−ＡＤＭイムノコンジュゲ
ートまたはコンジュゲートしていないＡＤＭにさらし
た。各希釈に対し３回測定した。対照は、薬剤にさらさ
ず同様に処理した細胞から成る。その後細胞を洗い、１
５％ＦＢＳと０．３％アガロース（Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏ
ｌｌｏｉｄ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を含むＲＰＭＩ
１６４０培地に懸濁させた。懸濁液の１ｍｌ（１×１０
3 セル）を、６つのウェルマイクロチタープレート（Ｃ
ａｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の０．４％ア
ガロース層に置いた。試料を３７℃で７〜１０日間イン
キュベートし、その結果のコロニーをｐ−ヨードニトロ
テトラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１ｍｇ／
ｍｌの０．５ｍｌで、４８時間着色した。コロニーはＯ
ｐｔｉｍａｘ ４０−１０ イメージアナライザーを用
いて数えられ、コロニー形成の阻害が、薬剤処理または
イムノコンジュゲート処理細胞を非処理対照に比較して
測定された。その結果が表２にＩＣ50（コロニー形成を
５０％阻害するのに要する濃度）として表される。
【０１３７】
【表２】
【０１３８】表２に示されるように、ＡＤＭ放出の他
に、酸に敏感なイムノコンジュゲートのすべてが意味深
いインビトロ細胞毒活性をもつ。
【０１３９】実施例９チオエーテル結合を含むアントラサイクリンイムノコン
ジュゲートの製造 この実施例は、本発明によるアントラサイクリンイムノ
コンジュゲートを製造するもう一つの具体例を述べてい
て、実施例１〜５で述べたように製造され、ＡＤＭ分子
に付着する場所として、セミカルバゾン、カルバゾン、
チオセミカルバゾン、カルボキシレートヒドラゾン、ア
リルヒドラゾンの５つの結合のいずれかをもつ、二官能
性化合物の一つを介して、ＡＤＭはモノクローナル抗体
にコンジュゲートしている。更にイムノコンジュゲート
は、抗体に付着する場所として、チオエーテル結合をも
つ。
【０１４０】ＭＡｂ ５Ｅ９（ＰＢＳ２．５ｍｌ中２．
５ｍｇ）ＳＭＰＢ（１００μｌテトラヒドロフラン中ス
クシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ
ラート５９．５μｇ）で、３０℃で３０分間処理する。
ｐＨをクエン酸ナトリウム緩衝液で６．０に調整する。
ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通
して、未反応物質からマレイミドを含む抗体を分離す
る。先のように製造したＡＤＭ誘導体（１ｍｇ）を１ｍ
ｌ ＭｅＯＨ／Ｈ2 Ｏ（９：１）に溶かし、各々のＡＤ
Ｍ誘導体の０．５μｍｏｌを、４：１アセトン：Ｈ2 Ｏ
中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン０．５μｍｏｌと反応
させて、ＡＤＭ誘導体の還元形にする。１０分後、０．
１Ｍ硫黄のトリエン溶液を加え、残っているホスフィン
をこわす。還元したＡＤＭ誘導体を５Ｅ９マレイミドを
含むＭＡｂと混ぜる。そうして生成したイムノコンジュ
ゲートをＰＤ−１０ゲル濾過カラムを通して精製する。
トルエン溶媒の除去が十分でない。橙色溶媒層が反応混
合物と浮遊する何かタンパク質に分離する場合には、溶
媒を除くために空気の弱流を用い、変性したタンパク質
は、反応混合物を２分間１６０００×ｇで回転させて除
く。澄んだ上清がイムノコンジュゲートを含み、ゲル濾
過して、ｐＨ７．４ＰＢＳ中で分析する。ＡＤＭ／抗体
モル比は、上で述べたようにＯＤ280 とＯＤ495 を用い
て分光測光的に測定される。典型的な反応で、モル比３
〜４のイムノコンジュゲートがつくられる。
【０１４１】この実施例でこうして製造されたイムノコ
ンジュゲートの結合活性、細胞毒活性が先に述べたよう
にテストされる。
【０１４２】上の実施例は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二
官能性化合物、これら二官能性化合物でつくられたＡＤ
Ｍの新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体、ＡＤＭが抗体に新
規酸に敏感な連結を介してコンジュゲートしている新規
イムノコンジュゲートの製造を示している。二官能性化
合物は細胞毒性試薬、ＡＤＭおよび細胞にターゲッテン
グする分子、モノクローナル抗体と容易にコンジュゲー
トした。コンジュゲートは、抗体結合活性（すなわち標
的細胞特異性）と細胞毒性薬剤活性の両方を維持し、標
的細胞の細胞環境で特徴的な酸性条件でフリーの変形さ
れないＡＤＭを放出した。
【０１４３】従って、本発明の新規二官能性化合物、イ
ムノコンジュゲートは、有用な分子のコンジュゲート化
を約束し、特にがんやその他の腫瘍、非細胞致死性のウ
ィルス性または他の病原性感染、自己免疫不全のような
疾患の治療で、その細胞を特異的に殺すために、標的細
胞集団に細胞毒性試薬を運ぶためにコンジュゲートす
る。
【０１４４】
【化２４】
【０１４５】
【化２５】
【０１４６】
【化２６】
【０１４７】
【化２７】
【０１４８】
【化２８】
【０１４９】
【化２９】
【０１５０】
【化３０】
【０１５１】
【化３１】
【０１５２】
【化３２】
【０１５３】
【化３３】
【０１５４】
【化３４】
【０１５５】上にこの発明のいくつもの具体例をあげた
が、基本的構成は、この発明の二官能性化合物、細胞毒
性試薬の誘導体、コンジュゲート、方法を利用する他の
具体例の提示にかえられるのは明白である。それ故、本
発明の範囲は、ここに添えるクレームに限定されるべき
で、実施例の方法であげた特定の具体例に限定されるべ
きでないことは正しく評価されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ４．５の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図２】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ５．０の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図３】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ７．４の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図４】実施例７に記載したように、ｐＨ４．５の緩衝
液でインキュベートした時間の関数として、本発明のア
ドリアマイシンのカルバゾン誘導体から、および５Ｅ９
イムノコンジュゲートからのアドリアマイシンの放出を
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ Ｅ Ｔ Ｃ０７Ｃ 323/44 Ｃ０７Ｃ 323/44 Ｃ０７Ｄ 213/71 Ｃ０７Ｄ 213/71 405/12 405/12 Ｃ０７Ｈ 15/252 Ｃ０７Ｈ 15/252 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 デビッド ウィルナー アメリカ合衆国コネチカット州 06514 ハムデンリーリング ロード ９ (72)発明者 アイボ モンコビック アメリカ合衆国コネチカット州 06422 ダーハムモーロ ドライブ 44 (72)発明者 ロバート エス グリーンフィールド アメリカ合衆国コネチカット州 06492 ウォリングフォード シーター ヒル ロ ード 10 (72)発明者 ゲリー アール ブラスロースキイ アメリカ合衆国コネチカット州 06033 グラストンベリー ヘリテージ ドライブ 124

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳ
    Ｒ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）
    n ＳＳＲ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、又は Ｈ2 ＮＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 〔式中、ｍ及びｎは１〜１０の整数であり、同じである
    か又は異なり、Ｒ8 は 【化１】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ2 又はハロゲンである）であり、
    Ａｒは 【化２】 である〕をもつＮ−置換ヒドラジン二官能性化合物を、
    遊離のカルボニル基を含む分子の少なくとも１つ及びス
    ルフヒドリル基を含む分子の少なくとも１つと結合させ
    て形成されるコンジュゲート。
  2. 【請求項２】 カルボニル基を含む分子が細胞毒性試薬
    である、請求項１のコンジュゲート。
  3. 【請求項３】 細胞毒性試薬がアントラサイクリンであ
    る、請求項２のコンジュゲート。
  4. 【請求項４】 スルフヒドリル基を含む分子が標的細胞
    集団と反応する分子である、請求項１のコンジュゲー
    ト。
  5. 【請求項５】 分子がモノクローナル抗体である、請求
    項４のコンジュゲート。
  6. 【請求項６】 式 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳ
    Ｒ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）
    n ＳＳＲ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、又は Ｈ2 ＮＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 〔式中、ｍ及びｎは１〜１０の整数であり、同じである
    か又は異なり、Ｒ8 は 【化３】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ2 又はハロゲンである）であり、
    Ａｒは 【化４】 である〕をもち、還元剤により還元されて遊離のスルフ
    ヒドリル基を形成する、Ｎ−置換ヒドラジン二官能性化
    合物を、遊離のカルボニル基を含む分子の少なくとも１
    つ及び付着したマレイミド基をもつ分子の少なくとも１
    つと結合させて形成されるコンジュゲート。
  7. 【請求項７】 遊離のカルボニル基を含む分子がアント
    ラサイクリンであり、付着したマレイミド基をもつ分子
    が抗体である請求項６のコンジュゲート。
  8. 【請求項８】 式 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳ
    Ｒ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）
    n ＳＳＲ8 、 Ｈ2 ＮＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、又は Ｈ2 ＮＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 〔式中、ｍ及びｎは１〜１０の整数であり、同じである
    か又は異なり、Ｒ8 は 【化５】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ2 又はハロゲンである）であり、
    Ａｒは 【化６】 である〕をもつＮ−置換ヒドラジン二官能性化合物を、
    アントラサイクリンと反応させて製造するアントラサイ
    クリン誘導体。
  9. 【請求項９】 アントラサイクリンが、アドリアマイシ
    ン、ダウノマイシン、デトルビシン、カルミノマイシ
    ン、イダルビシン、エピルビシン、エソルビシン、４′
    −ＴＨＰ−アドリアマイシン、ＡＤ−３２および３′−
    デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−
    ドキソルビシンから成る群から選ばれる、請求項８のア
    ントラサイクリン誘導体。
  10. 【請求項１０】 請求項８のアントラサイクリン誘導体
    を、標的細胞集団と反応する分子と反応させて製造する
    コンジュゲート。
  11. 【請求項１１】 分子が、腫瘍細胞と反応する抗体であ
    る、請求項１０のコンジュゲート。
  12. 【請求項１２】 抗体が、５Ｅ９、Ｌ６、３Ａ１および
    Ｇ２８．５から成る群から選ばれるモノクローナル抗体
    である、請求項１１のコンジュゲート。
  13. 【請求項１３】 アントラサイクリンがアドリアマイシ
    ンであり、抗体が５Ｅ９である、請求項１１のコンジュ
    ゲート。
  14. 【請求項１４】 分子がリガンドである、請求項１０の
    コンジュゲート。
  15. 【請求項１５】 リガンドがタンパク質、ポリペプチ
    ド、またはペプチド分子である、請求項１４のコンジュ
    ゲート。
  16. 【請求項１６】 リガンドが、ボンベシン、ＥＧＦ、ト
    ランスフェリン、ガストリン、ガストリン放出ペプチ
    ド、血小板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ
    −α、ＴＧＦ−β、ＶＧＦ、インスリンおよびインスリ
    ン様増殖因子ＩおよびＩＩから成る群から選ばれる、請
    求項１５のコンジュゲート。
  17. 【請求項１７】 リガンドが、炭化水素、ステロイドお
    よびレクチンから成る群から選ばれる非ペプチドリガン
    ドである、請求項１４のコンジュゲート。
  18. 【請求項１８】 アドリアマイシン１３−Ｎ−〔２−
    〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジン−カ
    ルボキサミドセミカルバゾン塩酸塩。
  19. 【請求項１９】 アドリアマイシン１３−２−〔〔〔２
    −〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カル
    ボニル〕カルボニックジヒドラジドカルバゾン塩酸塩。
  20. 【請求項２０】 アドリアマイシン１３−Ｎ−４−
    〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル−ヒドラ
    ジンカルボチオアミドチオセミカルバゾン塩酸塩。
  21. 【請求項２１】 アドリアマイシン１３−２−〔（２−
    ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジンカルボキシレー
    トカルボキシレートヒドラゾン塩酸塩。
  22. 【請求項２２】 アドリアマイシン１３−Ｎ−〔２−
    〔（２−ピリジニルジチオ）エチル〕−４−ヒドラジノ
    ベンズアミドアリールヒドラゾン塩酸塩。
  23. 【請求項２３】 式 【化７】 〔式中、Ｒ1 は、ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、
    ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、ＮＨ
    ＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳ
    Ｒ8 、ＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、ＮＨ−Ａｒ−
    ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）nＳＳＲ8 、ＮＨＣＯＮＨ（Ｃ
    Ｈ2 ）n Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ 2 ）
    n Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ
    2 ）n Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n Ｓ−ＨまたはＮ
    Ｈ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n Ｓ−Ｈ〔式中、ｍ、ｎ
    は１〜１０の整数であって、同じであるか異なるもので
    あり、Ｒ8 は 【化８】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ2 またはハロゲンである）であ
    り、Ａｒは 【化９】 である〕であり、Ｒ2 はＣＨ3 、ＣＨ2 ＯＨ、ＣＨ2 Ｏ
    ＣＯ（ＣＨ2 ）3 ＣＨ3 またはＣＨ2 ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
    2 Ｈ5 ）2 であり、Ｒ3 はＯＣＨ3 、ＯＨまたは水素で
    あり、Ｒ4はＮＨ2 、ＮＨＣＯＣＦ3 、４−モルホリニ
    ル、３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニ
    ル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミ
    ン、ジベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−
    シアノ−２−メトキシエチルアミンであり、Ｒ5 はＯ
    Ｈ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素であり、Ｒ6 はＯＨまたは水
    素であって、Ｒ5 がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時には
    Ｒ6 はＯＨでない〕を有するアントラサイクリン誘導
    体。
  24. 【請求項２４】 式 【化１０】 〔式中、Ｒ1 は、ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、
    ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、ＮＨ
    ＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）n ＳＳ
    Ｒ8 、ＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n ＳＳＲ8 、ＮＨ−Ａｒ−
    ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）nＳＳＲ8 、ＮＨＣＯＮＨ（Ｃ
    Ｈ2 ）n Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）
    n Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ2 ）m ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ
    2 ）n Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＯＯ（ＣＨ2 ）n Ｓ−ＨまたはＮ
    Ｈ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ2 ）n Ｓ−Ｈ〔式中、ｍ、ｎ
    は１〜１０の整数であって、同じであるか異なるもので
    あり、Ｒ8 は 【化１１】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ2 またはハロゲンである）であ
    り、Ａｒは 【化１２】 である〕であり、Ｒ2 はＣＨ3 、ＣＨ2 ＯＨ、ＣＨ2 Ｏ
    ＣＯ（ＣＨ2 ）3 ＯＨまたはＣＨ2 ＯＣＯＣＨ（ＯＣ2
    Ｈ5 ）2 であり、Ｒ3 はＯＣＨ3 、ＯＨまたは水素であ
    り、Ｒ4 およびＲ7 は各々、水素、アルキル、置換アル
    キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリー
    ル、置換アリール、アルアルキルまたは置換アルアルキ
    ルであるかまたはＲ4 、Ｒ7 およびＮは一緒になって、
    置換されていてもよい４〜７員環を形成し、Ｒ5 はＯ
    Ｈ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素であり、Ｒ6 はＯＨまたは水
    素であって、Ｒ5 がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時には
    Ｒ6 はＯＨでない〕を有するアントラサイクリン誘導
    体。
  25. 【請求項２５】 標的細胞集団と反応する分子の少なく
    とも１つとコンジュゲートした、請求項２３または２４
    のアントラサイクリン誘導体を含むコンジュゲート。
  26. 【請求項２６】 分子が抗体である、請求項２５のコン
    ジュゲート。
  27. 【請求項２７】 抗体が腫瘍細胞と反応する、請求項２
    ６のコンジュゲート。
  28. 【請求項２８】 抗体が、５Ｅ９、Ｌ６、３Ａ１および
    Ｇ２８．５から成る群から選ばれるモノクローナル抗体
    である、請求項２７のコンジュゲート。
  29. 【請求項２９】 抗体を先にチオール化剤と反応させ
    て、アントラサイクリン誘導体とコンジュゲートさせる
    ことから成る、請求項２６のコンジュゲートを製造する
    方法。
  30. 【請求項３０】 チオール化剤がＳＰＤＰまたは２−Ｉ
    Ｔである、請求項２９の方法。
  31. 【請求項３１】 アントラサイクリン誘導体を先に還元
    して抗体とコンジュゲートさせる、請求項２６のコンジ
    ュゲートを製造する方法であって、抗体に先にマレイミ
    ド基を付着させて抗体を誘導体と反応させる工程を含む
    方法。
  32. 【請求項３２】 マレイミド基が、抗体とスクシンイミ
    ジル−４−（Ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートとの
    反応によって付着する、請求項３１の方法。
  33. 【請求項３３】 標的細胞集団と反応する分子が、標的
    細胞と反応するリガンドである、請求項２５のコンジュ
    ゲート。
  34. 【請求項３４】 リガンドが、タンパク質、ポリペプチ
    ドおよびペプチド分子から成る群から選ばれる請求項３
    ３のコンジュゲート。
  35. 【請求項３５】 リガンドが、ボンベシン、ＥＧＦ、ト
    ランスフェリン、ガストリン、ガストリン放出ペプチ
    ド、血小板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ
    −α、ＴＧＦ−β、ＶＧＦ、インスリンおよびインスリ
    ン様増殖因子ＩおよびＩＩから成る群から選ばれる、請
    求項３４のコンジュゲート。
  36. 【請求項３６】 反応性ピリジニルジチオまたはオルト
    −ニトロフェニルジチオ部分を有する二官性化合物によ
    って、遊離のスルフヒドリル基を有する分子少なくとも
    １つと連結した、遊離のカルボニル基を有する分子少な
    くとも１つを含むコンジュゲートであって、その二官性
    化合物は、セミカルバゾン、カルバゾン、チオセミカル
    バゾン、カルボキシレートヒドラゾンおよびアリールヒ
    ドラゾン結合から成る群から選ばれる結合によって、遊
    離のスルフヒドリル基を有する分子に付着している。
  37. 【請求項３７】 遊離のカルボニル基を有する分子が細
    胞毒性試薬分子である、請求項３６のコンジュゲート。
  38. 【請求項３８】 細胞毒性試薬分子が化学療法剤分子で
    ある、請求項３７のコンジュゲート。
  39. 【請求項３９】 化学療法剤がアントラサイクリンであ
    り、二官性化合物が、アントラサイクリン分子のＣ−１
    ３位のケト基に連結している、請求項３８のコンジュゲ
    ート。
  40. 【請求項４０】 アントラサイクリンが、アドリアマイ
    シン、ダウノマイシン、デトルビシン、カルミノマイシ
    ン、イダルビシン、エピルビシン、エソルビシン、４′
    −ＴＨＰ−アドリアマイシン、ＡＤ−３２および３′−
    デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−
    ドキソルビシンから成る群から選ばれる、請求項３９の
    コンジュゲート。
  41. 【請求項４１】 細胞反応性分子が抗体またはリガンド
    である、請求項３６のコンジュゲート。
  42. 【請求項４２】 分子が腫瘍細胞と反応する抗体であ
    る、請求項４１のコンジュゲート。
  43. 【請求項４３】 抗体が、がん、黒色腫、リンパ腫、骨
    または軟部組織肉腫に関連する抗原と反応する、請求項
    ４２のコンジュゲート。
  44. 【請求項４４】 抗体がモノクローナル抗体である、請
    求項４３のコンジュゲート。
  45. 【請求項４５】 抗体が、５Ｅ９、Ｌ６、３Ａ１および
    Ｇ２８．５から成る群から選ばれ、アントラサイクリン
    がアドリアマイシンである、請求項４４のコンジュゲー
    ト。
  46. 【請求項４６】 分子がリガンドである、請求項４１の
    コンジュゲート。
  47. 【請求項４７】 リガンドが、タンパク質、ポリペプチ
    ドおよびペプチド分子から成る群から選ばれる、請求項
    ４６のコンジュゲート。
  48. 【請求項４８】 リガンドが、ボンベシイン、ＥＧＦ、
    トランスフェリン、ガストリン、ガストリン放出ペプチ
    ド、血小板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ
    −α、ＴＧＦ−β、ＶＧＦ、インスリンおよびインスリ
    ン様増殖因子ＩおよびＩＩから成る群から選ばれる、請
    求項４７のコンジュゲート。
  49. 【請求項４９】 リガンドが非ペプチドリガンドであ
    る、請求項４６のコンジュゲート。
  50. 【請求項５０】 リガンドが、炭化水素、ステロイドお
    よびレクチンから成る群から選ばれる、請求項４９のコ
    ンジュゲート。
  51. 【請求項５１】 請求項３５によるコンジュゲートの少
    なくとも１つの製薬上有効な量と、製薬上許容しうる担
    体とを含む、疾患治療上有用な製薬上許容しうる組成
    物。
  52. 【請求項５２】 請求項５１の組成物でもって、処置す
    べき標的細胞集団にアントラサイクリンを運ぶ方法。
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