JPH05238952A - 抗体を伴う薬物のクラスター複合体 - Google Patents

抗体を伴う薬物のクラスター複合体

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JPH05238952A
JPH05238952A JP4172624A JP17262492A JPH05238952A JP H05238952 A JPH05238952 A JP H05238952A JP 4172624 A JP4172624 A JP 4172624A JP 17262492 A JP17262492 A JP 17262492A JP H05238952 A JPH05238952 A JP H05238952A
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Gary A Koppel
ゲイリー・アレン・コッペル
Robin E Offord
ロビン・イー・オフォード
Keith Rose
キース・ローズ
William L Scott
ウィリアム・レオナード・スコット
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Eli Lilly and Co
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 一つの抗体分子によって、多数の薬物分子を
ある細胞に向かわせることを可能にする、標的化薬物複
合体を提供する。 【構成】 下記式Ｉ 〔式中、Ａｂは望ましくない細胞に付随する抗原を認識
する抗体又はその抗原認識フラグメント、Ｒは該細胞に
対する細胞毒性作用を有する薬物残基、Ｒ１はヒドロキ
シ基又はカルボキシ保護基、Ｘは−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ
−ＣＯ−、Ｚは などの基、ｍは２〜６、ｎは１〜４、ｐは０〜５、ｑは
０〜３、ｒは１〜１０、ｓは０〜２、ｔは１〜３、Ｙは
結合、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ２−Ｈ
Ｃ＝など、Ｒ２はＣ１〜５アルキレン、フェニレン又は
ピロリルを示す〕で示される薬物複合体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有機化学、薬化学及び
免疫学の分野に属し、望ましくない細胞に大用量の細胞
毒性薬物を運ぶ輸送手段を提供するものである。抗体、
好ましくはモノクローナル抗体が、標的に向かう物質で
あり、各々の抗体が多数の薬物分子を運ぶことを可能に
するリンカー化学が提供される。該複合体の製造のため
の中間体もまた提供される。
【０００２】長年、薬化学者は、疾病の処置のための、
より特異的且つ強力な薬物を提供するために研究をして
きた。細胞の特異的異常の創生により機能する、癌及び
その他の疾病の場合、殆どの有用な薬物は、異常細胞を
殺すことによって機能する細胞毒性型のものであった。
無論このような薬物は、かなり強力な、且つ危険な、生
命を脅かしさえする副作用が希ではない。したがって、
細胞毒性薬物の全身的用量を投与することなく、係る薬
物が、作用を受けるべき細胞を直接標的とするような機
構を開発するための努力が長い間なされてきた。このよ
うな薬物の標的への運搬のために抗体を使用した成果に
関する多くの特許及び文献が刊行されている。しかしな
がら現在のところ、治療用途に認め得る抗体−薬物複合
体はまだ無い。
【０００３】本発明は、抗体１分子に細胞毒性薬物の多
数の分子を簡便に結合させる新規な調節可能なリンカー
化学を提供し、故に薬物の標的への運搬の分野における
著しい進歩を象徴するものである。本発明に係る調節可
能なリンカー化学によって多数の細胞毒性薬物分子を抗
体に結合させる能力は、先行技術の結合法にしばしば見
られる抗体の不活性化の問題を減少させる。
【０００４】本発明は、式：
【化３】 ［式中、Ａｂは、望ましくない細胞に付随する抗原を認
識する抗体またはその抗原認識フラグメントであり；Ｒ
は、該細胞に対して細胞毒性作用を有する薬物の残基で
あり；Ｒ1はヒドロキシ基またはカルボキシ保護基であ
り；Ｘは−ＮＨ−（ＣＨ2）t−ＣＯ−；
【０００５】Ｚは
【化４】 であり；ｍは２ないし約６であり；ｎは１ないし約４で
あり；ｐは０ないし約５であり；ｑは０ないし約３であ
り；ｒは１ないし約１０であり；ｓは０−２であり；ｔ
は１ないし約３であり、且つ種々のＸ基におけるｔの値
は各々互いに独立しており；
【０００６】Ｙは、結合または式： （Ｅ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ2−Ｈ
Ｃ＝または （Ｆ）−ＣＯ−Ｒ4−Ｒ3−Ｒ2−ＨＣ＝ で示されるリンカー基であり；Ｒ2はＣ1−Ｃ5アルキレ
ン、フェニレンまたはピロリルであり；Ｒ3は結合また
は−ＮＨ−ＣＯ−であり；Ｒ4は結合またはＣ1−Ｃ5ア
ルキレンであり；但し、Ｒ3及びＲ4の両者が結合でない
限り、Ｒ3及びＲ4のどちらも結合ではなく、ここでＡｂ
の各分子は、１ないし約１０個の−Ｙ＝結合に結合して
いる］で示される生理学的に許容し得る薬物複合体を提
供するものである。
【０００７】さらに本発明は、本発明に係る複合体及び
非経口投与可能な媒質からなる医薬組成物、並びに薬物
による処置の必要な患者に本発明の複合体を非経口投与
することからなる処置方法を提供する。さらに本発明
は、該複合体を製造するための中間体を提供し、この中
間体は、式：
【化５】 を有し、基Ｒ5は個別に同じまたは異なったアミノ保護
基または水素を表わし；
【０００８】Ｒ6はヒドロキシ保護基または水素；
【化６】 である。
【０００９】さらに、本発明は、式：
【化７】 で示される修飾された薬物を提供する。本明細書全般に
わたり、温度は全て摂氏である。百分率、濃度等の表現
は全て、別途記載の無い限り重量単位におけるものであ
る。薬物複合体の濃度及び用量に対する記載は全て、そ
の複合体に含まれる薬物の量または濃度に関するもので
ある。
【００１０】上記の式において、使用される一般的及び
個別的化学用語は、有機化学、とりわけアミノ酸化学に
おける通常の意義を有する。例えば、Ｃ1−Ｃ5アルキレ
ンという語は、メチレン、エチレン、プロピレン及びイ
ソプロピレン、ｎ−ブチレン及びイソブチレン、１，３
−ジメチルプロピレン等のような基を意味する。フェニ
レンという語は、メタまたはパラ位に結合したフェニル
基を意味し、ピロリル基は任意の位置、しかしながら好
ましくは２，５−位に結合することができる。
【００１１】Ｙ、Ｒ3及びＲ4は結合を表わし得る。Ｙが
結合として示される場合、その意味は、抗体または抗体
フラグメントが、二重結合により、直接、基Ｙに隣接す
る窒素に結合しているということである。Ｒ3及びＲ4が
結合である場合、基Ｒ2は基Ｙを終結させるカルボニル
に直接つながっている。
【００１２】リンカー化合物及び中間体は、しばしばア
ミノ酸の鎖及び集合から成り立っている事が理解できる
であろう。上記の式は係るアミノ酸の立体化学的型を同
定しておらず、本発明は、任意の天然または非天然の配
置が機能することを意図している。与えられたいかなる
状況においても、混合物でなく単一の形のアミノ酸を使
用することが好ましい。
【００１３】上の式においてヒドロキシ保護基という語
は、ヒドロキシ基を保護するために有機化学者により使
用される任意の基をさし、この場合、反応は分子の他の
官能基部分において行なわれ、これらは従来の教科書、
特に、グリーン、プロテクティブ・グループス・イン・
オーガニック・シンセシス（ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒ
ｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）、ジョン・ウィレー・アンド・サンズ、ニューヨー
ク（１９８１）の第２章に詳細に記述されている。典型
的なこのようなヒドロキシ保護基は、ホルミル、２−ク
ロロアセチル、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェ
ニルメチル、４−ニトロベンゾイル、フェノキシカルボ
ニル、ｔ−ブチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラ
ニル、アリル、テトラヒドロチエニル、２−メトキシ−
エトキシメチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチ
ル、イソブチリル、ｔ−ブトキシカルボニル、エトキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル等を包含する。
【００１４】アミノ保護基は上記のグリーンの教科書の
第７章に記載してあり、特に、メトキシカルボニル、ジ
イソプロピルメチル、メトキシカルボニルのような基、
９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）（こ
れが特に好ましい）、エトキシカルボニル及びハロエト
キシカルボニル、ホルミル、アセチル及びハロアセチ
ル、プロピオニル、アリールプロピオニル等のようなア
ルカノアート類、ブチリル及びハロブチリル、ベンゾイ
ル及び４−メトキシベンゾイルのような置換ベンゾイ
ル、並びに合成有機化学者により普通に知られ且つ使用
されるその他の基を包含する。
【００１５】カルボキシ保護基はグリーンの第５章に詳
細に論じられている。係る基は、例えばエステル及びア
ミド、特にエステルを包含する。メチル、メトキシエト
キシメチル、トリクロロエチル、メチルチオエチル、メ
トキシメチル、及びベンジルオキシメチルのようなアル
キルエステルが通常使用される。ジフェニルメチル及び
トリフェニルメチル、４−ニトロベンジル及び４−メト
キシベンジル、並びに４−ハロベンジルのようなベンジ
ルエステルもまた有用である。トリエチルスタニル及び
トリブチルスタニルもまた良い保護基であり、アリルの
ようなアルケン及びシンナミルエステル、並びにシクロ
ペンチル及びシクロヘキシルエステル等のようなシクロ
アルキルもまた同様である。グリーンは、これら及びそ
の他の非常に多くのカルボキシ保護基を導入及び除去す
るために使用される反応を説明している。
【００１６】本発明の幾つかの態様は好ましい態様であ
り、個別に記述すべきである。例えば、式Ｉの各細胞毒
性複合体、式ＶＩＩＩの修飾された薬物、及び式ＩＩ−
ＶＩの種々の中間体は、本発明の好ましい態様である。
より詳細には、以下の短い段落に本発明の個々の態様を
列挙するが、その各々が好ましい態様である。以下に述
べる制限を組み入れて、より限定された好ましい態様を
さらに規定できる事が理解できるであろう。
【００１７】Ａｂは癌細胞に付随する抗原を認識し；Ａ
ｂは抗体フラグメントであり；Ｒは癌細胞に対して細胞
毒性作用を持ち；Ｒは式ＩＸを有し；Ｒは式Ｘを有し；
Ｒ1はヒドロキシであり；Ｒ1はカルボキシ保護基であ
り；ｔは１であり；ｔは２または３であり；ｍは約４で
あり；ｍは２ないし約４であり；ｍは約４ないし約６で
あり；ｎは１であり；ｎは１−２であり；ｐは０ないし
約３であり；ｐは約３ないし約５であり；ｐは約３であ
り；ｑは０または１であり；ｒは約３ないし約７であ
り；ｒは１ないし約５であり；ｒは約５ないし約１０で
あり；ｓは０であり；ｓは１または２であり；Ｙは結合
であり；Ｙは基Ｅであり；Ｙは基Ｆであり；Ｒ2はフェ
ニレンまたはピロリルであり；Ｒ2はピロリルであり；
Ｒ3及びＲ4は結合であり；Ｒ3は−ＮＨ−ＣＯ−であ
り；Ｒ4はＣ1−Ｃ3アルキレンであり；各Ａｂ分子は１
個の−Ｙ＝結合に結合しており；各Ａｂ分子は１ないし
約５個の−Ｙ＝結合に結合しており；各Ａｂ分子は約３
ないし約８個の−Ｙ＝結合に結合している。
【００１８】上記の好ましい語及び基は、細胞毒性複合
体、式ＩＩ−ＶＩで示される種々の中間体化合物、及び
式ＶＩＩＩの薬物に対して等しく好ましい制限を構成す
る事が理解できるであろう。好ましい中間体は、好まし
い複合体または薬物を製造するために使用される。
【００１９】上記の構造式及び本発明に係る好ましい態
様の考察は、本発明を構成する複合体、中間体及び修飾
された薬物を完全に描写していると信ぜられる。しかし
ながら、本発明の化学は多少複雑であり、本化合物の命
名はかなり難解である。読者が本発明の全容を理解する
ことを助けるために、本発明の幾つかの個別的態様を概
略的な形で記載する。命名は非常に長く難解であるた
め、本発明の個別的態様は、構造式ＩないしＶＩＩＩの
略号化した名称を用いて、表の形で個々の構成成分を指
定することにより特定する。例えば、基Ｚの特定は、対
応する式Ｉの構造に関してＡ、Ｂ、ＣまたはＤにより指
定される。
【００２０】下の表１においては、式ＶＩの中間体化合
物の基を表わす。
【表１】 p t z q r t s m R6 R1 R5(Xp) R5(CHNHR5) 5 3 D 2 1 1 2 4 ヘ゛ンシ゛ル OH t-Boc t-Boc 3 2 B 3 3 3 2 6 CH2OCH3 OH H CO2CH3 2 3 - 0 9 1 1 3 H OH CO2CCl3 H 4 1 A 1 10 - 0 5 アセチル OCH2OCH3 H H 0 - C 1 5 - 0 2 H OCH2CCl3 CO2CH2CH2SO2CH3 Fmoc 1 3 - 0 7 2 1 4 アリル OC(CH3)3 CO2CH(CH3)C2H5 H 0 - D 1 10 1 1 6 CH2OC(CH3)3 OH CO2アリル アセチル 5 1 A 3 4 - 0 2 CH2CCl3 Oアリル H H 0 - - 0 6 3 2 3 H Oトリチル H ヘ゛ンソ゛イル 1 1 C 2 1 2 1 5 CO2CH3 OCH2(4-Br フェ H H ニル) 2 3 B 1 8 1 1 4 CH2(4-Br フェ OH CO2CH2(4-NO2 フェ COCH2COCH3 ニル) ニル) 4 2 - 0 2 - 0 6 H OCH2(4-NO2 フ Fmoc CO2CH2CH2I ェニル
【００２１】下に説明するように、式ＶＩの中間体化合
物を使用して式Ｖの中間体を製造する。以下の表２は式
Ｖの化合物の基を示す。この表において保護基Ｒ5、Ｒ6
及びＲ1は無視してあり、また、読者は、その状況にお
いてそれが好都合ならば、常套的保護基により中間体の
これらの位置を保護できる事が理解できるであろう。
【表２】 （Ｘp） （Ｘs） ｎ ｐ ｔ ｚ ｑ ｒ ｔ ｓ ｍ １ １ ３ − ０ １ − ０ ６ ４ ０ − − ０ ２ ３ １ ５ １ ３ １ Ｄ ２ １０ − ０ ２ ３ ５ ２ Ａ １ ４ １ ２ ３ １ ０ − Ｂ ３ ６ ２ １ ２ １ ２ １ − ０ ８ １ １ ６ ２ １ ３ Ｃ １ ２ − ０ ５ ４ ５ １ Ｄ ３ ７ − ０ ４ １ ４ ２ − ０ ３ １ ２ ３
【００２２】式Ｖの中間体から追加の工程により製造さ
れる式ＩＶの中間体は、ビス−アルデヒド基の付加によ
り修飾された、表１及び表２に記載された化合物によっ
て例示される。この群のＲ2成分はさらに、メチレン、
エチレン、ペンチレン、プロピレン、イソブチレン、ｔ
−ブチレン、２−エチルプロピレン等のような基、並び
にｍ−フェニレン、ｐ−フェニレン、２，４−ピロリレ
ン、３，４−ピロリレン等の結合基によって例示され
る。
【００２３】式ＩＶの化合物が式ＩＩＩの中間体に変換
される時、これらはさらに基Ｙ及び式Ｉの複合体の抗体
部分を含む。抗体及び抗体フラグメントの例を下記に示
す。基Ｙが結合である時、この結合の性格は自明であ
る。Ｙが式Ｅを有する時、Ｒ2はこのＹリンカーの唯一
の可変成分であるため、Ｙの例は、すぐ上に示したＲ2
基によって例示される。
【００２４】Ｙが式Ｆの基である時、以下のものがその
例である。
【表３】 Ｒ4 Ｒ3 Ｒ2 − − ｍ−フェニレン −（ＣＨ2）4− −ＮＨ−ＣＯ− ｐ−フェニレン −ＣＨ2（ＣＨ3）2Ｃ− −ＮＨ−ＣＯ− ３，４−ピロリレン − − ２，５−ピロリレン − − ２，３−ピロリレン −ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2− −ＮＨ−ＣＯ− −ＣＨ2− −ＣＨ2− −ＮＨ−ＣＯ− −ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）− − − −Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2− −（ＣＨ2）3 −ＮＨ−ＣＯ− −（ＣＨ2）5− −（ＣＨ2）5 −ＮＨ−ＣＯ− −ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2
【００２５】最後に、式Ｉの複合体が、式ＩＩの中間体
と薬物ヒドラジドとの反応により完成される場合、本発
明のこの態様に係る物質は、上に記載したリンカー化学
の様々な例、及び、薬物を詳細に論じている本明細書の
部分に記載され例示されている様々な薬物によって例示
される。
【００２６】本発明の複合体は、抗体、或る細胞毒性薬
物、及び抗体を薬物と結合させる有機化学的基から成り
立つ。さらに本発明は、化学的結合基の製造に使用され
る重要な中間体を提供する。抗体及び薬物をまず個別に
論じ、次に中間体及びこれらの合成を説明し、最後に、
複合体の合成及び生物学的挙動の例を示す。
【００２７】抗体 本発明の薬物複合体の機能が、該薬物の生物学的効力及
び抗体の抗原選択性によって決定されることは理解でき
るであろう。特定の薬物がそこへ好都合に運搬される細
胞に付随する抗原を認識する抗体を選択する。例えば、
もし薬物が抗新生物薬であるならば、腫瘍細胞に付随す
る抗原を認識する抗体を選択する。用いられる薬物の性
質によって、或る場合には細胞により内部移行している
抗体の選択が好ましく、または、表面抗原を認識するこ
とにより、細胞表面に存続する抗体の使用が好ましいこ
ともある。
【００２８】抗体の供給源は本発明にとって重要ではな
い。これは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇ
Ｄを含む免疫グロブリンの任意のクラスまたはサブクラ
スから選択することができる。同様に、抗体がその薬物
の作用が有用である細胞を標的とする限り、起源となる
種は重要でない。
【００２９】当分野の現在の状態においては、モノクロ
ーナル抗体及びそれらのフラグメントが薬物複合体に最
も使用されており、これらの使用が本発明において好ま
しい。しかしながら、ポリクローナル抗体及びそれらの
フラグメントが排除される訳ではない。より新しい型の
抗原結合分子が組替え技術によって産生され得る。例え
ば、ホジソン、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）第９巻、４２１−２５（１９９１）を
参照されたい。
【００３０】したがって、一部分は或る生物種由来であ
り、別の部分は別の生物種から誘導された、キメラの、
且つ人間に適合させた抗体を取得し、本発明に使用する
ことができる。抗体が、処置されるべき細胞を標的とす
る限り、その抗体の起源及び性質は重要ではない。当業
者は、候補とする抗体との複合体を容易に製造し、これ
らを評価することができる。抗体及び複合体を評価する
方法についての若干の説明を、便宜のために供する。第
一に、この抗体は、妥当な量の抗体を製造できるに充分
安定な修飾微生物またはハイブリドーマによって産生さ
れねばならない。抗体自体は精製され易く、そしてとり
わけ妥当な濃度での化学的操作ができるに充分水溶性で
なければならない。
【００３１】候補とする抗体により製造された複合体
は、まず抗原結合能について評価する。遊離の抗体の結
合能からの多少の低下は予期され且つ許容し得る。次
に、その複合体を試験して、抗癌薬の場合には細胞毒性
のような、抗原陽性細胞に対するインビトロの効力を測
定する。有効な複合体は、高濃度の薬物を細胞に運ぶ能
力のため、同じ検定においては、遊離の薬物より幾分低
い効力を持ち得る。初めの２つの試験で受け入れられた
複合体を、次いでジョンソン及びラグーザ、キャンサー
・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第４７巻３１
１８−２２（１９８７）に教示されるように、ヌードマ
ウスのヒト腫瘍異種移植モデルにおいて評価する。候補
とする複合体は、例えば、遊離薬物、遊離薬物及び遊離
抗体の混合物、並びに非標的免疫グロブリンを伴う複合
体に対して、ヌードマウスにおいて試験し、全体として
効力または安全性の改善を示さねばならない。用量範囲
の考察を異種移植モデルにおいて実施せねばならない。
【００３２】異種移植モデルにおいて効力のある複合体
は、対象となる抗原を、人において見られるのと類似の
パターンで発現することが知られている動物における試
験に供する。もしこの複合体が、係る試験において該抗
原への有意な程度の結合をもたらし、且つ、もしこれ
が、治療される異種移植モデルにより予想される用量に
おいて妥当に毒性が低いならば、その候補複合体は治療
薬としての可能性を有すると考えることができる。
【００３３】正しく選択された抗体フラグメントは、無
傷の抗体と同じ効果を有することが理解できるであろ
う。したがって、本発明の実施において、処置される細
胞に付随する抗原を認識する抗体フラグメント、特にＦ
（ａｂ'）2フラグメントは、無傷の抗体と全く同様に有
用であり得る。リンカー基が抗体と反応し結合する機構
は、リンカー中の基Ｙに依存する。基Ｙの結合機構は、
後に複合体の合成の項で詳細に説明する。
【００３４】式Ｉは、１ないし約１０のリンカー−薬物
部分が抗体の各分子に結合することを示している。与え
られた複合体のバッチは必ず薬物−リンカー対抗体の比
率に或る範囲を有する分子を含むであろうから、無論、
抗体分子当りのこのような部分の数は平均値である。各
抗体分子に幾つかの薬物分子が結合する場合、無論、高
価な抗体の最も有効な使用法を採る。しかしながら、薬
物−リンカー部分の分子の過大な数の結合は、通常、抗
体がその抗原を認識し結合する能力に悪い影響を及ぼ
す。そこで、妥協した抗体の置換程度を見いださねばな
らない。Ｙがカルボヒドラジドである時、好ましい置換
は、カルボキシ末端上の逆プロテオリシスによるもので
あり、故に抗体上のカルボキシ末端の数が、最大可能置
換程度を規定する。
【００３５】本発明における使用のために、膨大な数の
抗体が免疫学者にとって入手可能であり、且つ、さらに
有用な抗体が、関連雑誌の刊行の度に開示されつつあ
る。本発明の実施に適用できる抗体を徹底的に列挙する
ことは不可能であり、且つ全く不必要である。通常の技
量を有する免疫学者及び化学者は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロック
ビル、メリーランド、ＵＳＡ、のカタログ、及びリンス
コッツ・ディレクトリー・オブ・イミュノロジカル・ア
ンド・バイオロジカル・リエイジャンツ（Ｌｉｎｓｃｏ
ｔｔ'ｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｇ
ｅｎｔｓ）、リンスコッツ・ディレクトリー出版、４０
グレン・ドライブ、ミル・バレイ、カリフォルニア、
ＵＳＡ、９４９４１のような供給源から抗体を選択する
ことが全く可能である。したがって、当業者にとって
は、腫瘍の、微生物の、真菌の、ウイルスの、寄生虫
の、マイコプラズマのまたは組織適合抗原、並びに病原
体表面抗原、毒素、酵素、アレルゲン、及び生理学的に
重要な細胞に関連するその他の型の抗原のような、事実
上任意の抗原決定基に対する抗体を選択するのは簡単な
ことである。
【００３６】本発明の最も好ましい使用は、癌細胞、特
に扁平癌の細胞、腺癌の細胞、小細胞癌腫の細胞、グリ
オーマ細胞、黒色腫細胞、腎細胞癌腫の細胞、移行細胞
癌腫の細胞、肉腫細胞、腫瘍血管系を支持する細胞、並
びに白血病及びリンパ腫のようなリンパ腫瘍の細胞を包
含する癌細胞へ細胞毒性薬物を運搬する場合である。こ
れら全ての細胞を標的とする適当な抗体が入手でき、供
給源はリンスコッツにある。別法として、常法によるこ
のような抗体の産生に必要なハイブリドーマを、ＡＴＣ
Ｃ及びその他のセルラインコレクションから取得するこ
とができる。本発明の抗癌的側面における使用のために
は、幾つかの現在知られている抗体が特に興味深い。例
えば、好ましい特異的抗体は、ＡＴＣＣハイブリドーマ
ＨＢ９６８２により産生されるＬ／ｌＣ２である。
【００３７】もう一つの興味深い抗体は、バーキ等、キ
ャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃ
ｈ）、４４、６８１−８６（１９８４）に最初に開示さ
れたＫＳｌ／４である。モノクローナル抗体ＫＳｌ／４
の異なった領域のコード化配列を含む幾つかのプラスミ
ドは、ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリ
ー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ピオーリア、イリノ
イ、Ｕ．Ｓ．Ａ．に現在寄託されており、ここから入手
することができる。このプラスミドは当業者によって組
み替え手段によるキメラ抗体の産生に使用することがで
き、その抗体は、腺癌の細胞に高密度で見いだされる細
胞表面抗原に結合する。係る抗体の組み立ては、米国特
許４９７５３６９号に詳細に論じられている。以下のプ
ラスミドはＫＳｌ／４に関連している。
【００３８】プラスミドｐＧＫＣ２３１０、軽鎖のコー
ド化配列、軽鎖に付随する信号ペプチド、並びに５'及
び３'非翻訳領域；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＭ２９４
／ｐＧＫＣ２３１０、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３５６から単
離。プラスミドｐＧ２Ａ５２、重鎖のコード化配列、重
鎖に付随する信号ペプチドのコード化配列、並びに５'
及び３'非翻訳領域；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＭ２９
４／ｐＧ２Ａ５２、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３５７から単
離。
【００３９】プラスミドＣＨＫＣ２−６、軽鎖可変領域
のコード化配列、軽鎖に付随する信号ペプチドのコード
化配列、及びヒトＩｇＧの軽鎖不変領域をコードしてい
る配列；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨＫＣ２−
６、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３５８から単離。プラスミドＣ
ＨＫＣ２−１８、誘導体軽鎖可変領域のコード化配列、
軽鎖に付随する信号ペプチドのコード化配列、及びヒト
ＩｇＧの軽鎖不変領域をコードしている配列、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨＫＣ２−１８、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８３５９から単離。
【００４０】プラスミドＣＨ２Ａ５、重鎖可変領域のコ
ード化配列、重鎖に付随する信号ペプチドのコード化配
列、及びヒトＩｇＧ１の重鎖不変領域をコードしている
配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＭ２９４／ＣＨ２Ａ
５、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３６０から単離。プラスミドＣ
Ｈ２Ａ５ＩＧ２、重鎖可変領域のコード化配列、重鎖に
付随する信号ペプチドのコード化配列、及びヒトＩｇＧ
２の重鎖不変領域をコードしている配列、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨ２Ａ５ＩＧ２、ＮＲＲＬ Ｂ−
１８３６１から単離。
【００４１】プラスミドＣＨ２Ａ５ＩＧ３、重鎖可変領
域のコード化配列、重鎖に付随する信号ペプチドのコー
ド化配列、及びヒトＩｇＧ３の重鎖不変領域をコードし
ている配列、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨ２Ａ
５ＩＧ３、ＮＲＲＬ Ｂ−１８３６２から単離。プラス
ミドＣＨ２Ａ５ＩＧ４、重鎖可変領域のコード化配列、
重鎖に付随する信号ペプチドのコード化配列、及びヒト
ＩｇＧ４の重鎖不変領域をコードしている配列、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ５／ＣＨ２ＡＩＧ４、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８３６３から単離。
【００４２】ＡＴＣＣハイブリドーマ、ＨＢ２１により
産生される抗体５Ｅ９Ｃ１１は、多くの腫瘍によって発
現されるトランスフェリンレセプターを認識する。ナシ
ョナル・キャンサー・インスティテュート（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手
できるＢ７２．３と呼ばれる抗体は、乳癌及び結腸癌の
両者により発現される抗原を認識する。非腫瘍抗原に対
する反応性を有する二つの興味深い抗体がＯＫＴ３及び
ＯＫＴ４であり、これらはそれぞれ末梢のＴ細胞及びヒ
トヘルパーＴ細胞に結合する。これらは、ＣＲＬ８００
１及びＣＲＬ８００２としてＡＴＣＣに寄託されている
ハイブリドーマにより産生される。
【００４３】種々の治療目的に有用な抗体のさらなる供
給源は以下の通りである。免疫調整及び腫瘍の治療に有
用な、抗ヒトリンパ球及び単球抗体は、ＡＴＣＣカルチ
ャーＨＢ２、ＨＢ４４、ＨＢ７８及びＨＢ１３６により
産生される。腫瘍の治療に有用な抗トランスフェリンレ
セプター抗体は、ＡＴＣＣカルチャーＨＢ８４により産
生される。ＡＴＣＣカルチャーＨＢ８０５９は、結腸直
腸癌のモノシアルガングリオシドに対する抗体を産生
し、カルチャーＢ８１３６は、免疫調整及びＴ細胞白血
病の治療に有用な、成熟ヒトＴ細胞表面抗原に対する抗
体を産生する。
【００４４】さらに、ＡＴＣＣハイブリドーマＨＢ９６
２０は、ＣＥＭ２３１.６.７と呼ばれる簡便な抗−癌性
胚抗原を産生する。シュローム等は文献中に、腫瘍関連
抗原に対する親和性を有する幾つかの興味深い抗体を提
出している。特に、このグループによる以下の記事及び
特許が重要である。
【００４５】キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ）５０、１２９１−９８（１９９０）、
キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）４５、５７６９−８０（１９８５）、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）４３、５９８−６
０７（１９８９）、米国特許４５２２９１８号、米国特
許４６１２２８２号、欧州特許公開０３９４２７７号、
欧州特許公開０２２５７０９号。
【００４６】本発明の文脈において機能的なシュローム
のグループにより教示される抗体は、Ｄ６１２、ＣＯＬ
−１ないしＣＯＬ−１５、ＣＣ−１、ＣＣ−８、ＣＣ−
９、ＣＣ−１１、ＣＣ−１４、ＣＣ−１５、ＣＣ−２
０、ＣＣ−２６、ＣＣ−２９、ＣＣ−３０、ＣＣ−４
１、ＣＣ−４６、ＣＣ−４８、ＣＣ−４９、ＣＣ−５
２、ＣＣ−５５、ＣＣ−５７、ＣＣ−６０、ＣＣ−６
３、ＣＣ−６６、ＣＣ−７２、ＣＣ−７４、ＣＣ−７
８、ＣＣ８３、ＣＣ−８７、ＣＣ−９０、ＣＣ−９２な
る呼称を有する抗体を包含する。
【００４７】免疫学者または薬物の標的への運搬の分野
における知識を有する者は、該分野で一般に知られる刊
行物及び前記の手引としての実施例及び記述を助けとし
て、任意の適当な薬物が、その薬物によって処置される
任意の所望の細胞を標的とするための抗体を、容易に選
択することができる。
【００４８】薬物 本発明の本質は、式Ｉに開示されるリンカーによって薬
物及び抗体を結合する方法である事、そして、薬物及び
抗体のいずれも本発明を限定するものではないという事
が理解できるであろう。したがって、本発明のリンカー
は、任意の型の細胞毒性薬物と共に好都合に使用するこ
とができ、且つ使用される。式Ｉにおいて、Ｒは、−Ｃ
Ｏ−基で終わる薬物の一部分を意味する薬物の残基であ
ることを示し、これはカルボキシもしくはカルボニル
型、またはヒドラジド型のいずれかまたは両方において
細胞毒性活性を有する。無論、その薬物が利益をもたら
す細胞を、該抗体が標的とすることが必要である。本発
明における使用に好ましい薬物は、メソトレキサート類
の薬物、及びビンカ類の薬物である。
【００４９】係る薬物は以下の構造式によって表わすこ
とができる：
【化８】 ［式中、Ｒ15は水素、−ＣＨ3または−ＣＨＯであり；
Ｒ8及びＲ9を単独で考える時、Ｒ9は水素であり、Ｒ7及
びＲ8のうち一方がエチルであり他方が水素またはヒド
ロキシであり；Ｒ8及びＲ9をこれらが結合している炭素
と一緒に考える時、これらはオキシラン環［この場合Ｒ
7はエチルである］を形成し；Ｒ10は水素、（Ｃ1−Ｃ3
アルキル）−ＣＯ−、またはクロロ置換−（Ｃ1−Ｃ3ア
ルキル）−ＣＯ−である］
【００５０】
【化９】 ［式中、Ｒ12は、
【化１０】 −Ｓ−または−Ｏ−であり；Ｒ11は−ＣＯ−、−ＳＯ2
−、−ＣＯ−（ＣＨ2）u−または−ＣＯ−ＮＨ−であ
り；Ｒ13は水素またはＣ1−Ｃ3アルキルであり；ｕは１
または２であり；
【００５１】Ｚ'は、
【化１１】 であり、ｖは１−６であり；ｗは１−２２であり；Ｒ14
はヒドロキシまたは生理学的に許容し得る塩を完成させ
る基である］
【００５２】例としてのさらなる薬物は、ベルカリン類
及びカリケアミシン類である。ベルカリン類は、元来土
壌の真菌により産生される大環状トリコテカン誘導体の
一群である。米国特許３０８７８５９号が初期の参考文
献であり、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．第４５巻８
４０（１９６２）はこの群の７つの成員を教示してい
る。メルク・インデクス（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ）第
１１版、１５６６（１９８９）は関連書目を挙げてい
る。特許公開ＷＯ９００３４０１Ａ１号はヒドラゾン誘
導体を教示している。ベルカリン類の構造はベルカリン
Ａにより例示でき、これを、本発明における薬物として
の使用に好適な修飾型で下記に示す。
【化１２】
【００５３】カリケアミシン類は細胞毒性薬物の新規な
一群である。メイエーズ等、ジャーナル・オブ・アンテ
ィバイオティクス（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）ＸＬ
ＩＩ、５５８−６３（１９８９）。この化合物の複雑な
構造をカリケアミシンγ１により下記に示す；この分子
は、本発明における複合体合成に好適となるよう、末端
スルフィド結合を修飾してある。
【００５４】
【化１３】 式中、Ｗはフェニレンまたはアルキレン、例えばエチレ
ン、メチレン、１，１−ジメチルエチレン、イソプロピ
レン等である。この群のさらなる成員は、１または２個
の糖部分が除去されている、または小さなアシル基が加
わっているという点で異なっている。
【００５５】最も好ましい薬物は、上記式ＩＸのビンカ
化合物である。その構造式は、幾つかの異なった属名ま
たは種名を有する薬物またはその誘導体である化合物を
含むことが理解できるであろう。したがって、このビン
カ薬物の複雑な命名を単純化するために、本明細書中で
はこれらをビンブラスチンの誘導体として命名する。ビ
ンブラスチンは、Ｒ15がメチルであり、Ｒ7がエチルで
あり、Ｒ8がヒドロキシであり、Ｒ9が水素であり、Ｒ10
がアセチルであり、Ｃ23位のカルボニル基が上に示され
るようなカルボキサミドではなくメチルエステルの形で
ある、上記の式で示される化合物であることが理解でき
るであろう。次の表は、本発明に使用される薬物を例示
する幾つかのビンカ薬物を表わす。
【００５６】
【表４】 R15 R7 R8 R9 R10 H H C2H5 H H CH3 C2H5 OH H H CHO C2H5 H H COCH3 CHO OH C2H5 H COC2H5 CH3 C2H5 オキシラン COCH(CH3)2 H C2H5 H H COCH2Cl CH3 C2H5 オキシラン COCHClCH2Cl H C2H5 オキシラン COCCl3 CHO OH C2H5 H CO(CH2)2CHCl2 CH3 H C2H5 H H CH3 C2H5 OH H H
【００５７】式Ｘの細胞毒性薬物はメソトレキサート、
アミノプテリンまたはこれらの誘導体である。メソトレ
キサート薬物類はヒドラジド型で用いられる。これら薬
物の種々の不斉中心の立体特異型は示されていない。当
業者は、当技術において明らかに説明されるように、薬
物の立体化学がその活性に影響を及ぼし得ることが理解
できるであろう。本発明に係る複合体のための中間体を
製造する際には、好ましくはメソトレキサート薬物の通
常の立体化学を使用するが、式Ｘは全ての立体化学的型
を包含する。
【００５８】式Ｘの薬物中で変わり得る種々の基を個別
に論じ、各々の好ましい定義を幾つか述べる。好ましい
メソトレキサート薬物ヒドラジドが好ましい構成基から
成り、適切な文献の知識を有する薬化学者はこのような
任意の薬物ヒドラジドを製造できるということが理解で
きるであろう。
【００５９】基Ｒ12は、硫黄、酸素、アミノまたはメチ
レン（最後の２つは所望によりＣ1−Ｃ3アルキルで置換
されていてもよい）であってよい架橋基である。このよ
うな基の典型的なものは、アミノ、メチレン、メチルア
ミノ、プロピルアミノ、１，１−プロピレン及び１，１
−イソブチレンである。好ましいＲ12基はアミノ及びメ
チルアミノである。
【００６０】基Ｒ11は、カルボニル、スルホニル、アセ
チル、プロピオニルまたはカルボキサミドであってよい
架橋基である。最後の３つの例においては、カルボニル
基は基Ｚに隣接している。最も好ましいＲ11基はカルボ
ニルであり、アセチル及びプロピオニルもまた好まし
い。
【００６１】基Ｚ'は一方の端にアミノ基を持ち、これ
はＲ11基に結合しており、そして他端にカルボニルまた
はスルホニル基を持ち、これは＝Ｎ−ＨＮ基に結合して
いる。式ＧのＺ基はグルタミン酸から誘導され、ｔが１
でない時にはポリグルタミン酸の残基を構成する。しか
しながら式Ｇの好ましいＺ'基はｔが１である場合のも
のである。
【００６２】式ＨのＺ'基はスルホニルで終わり、よっ
て対応するスルホン酸の残基である。式Ｈの基は１また
は２個のメチレン基、好ましくは２個のメチレン基を有
する。式ＪのＺ'基は様々な長さのアミノ酸であり、こ
れは１ないし２２のメチレン基を含み得る。式Ｊの基の
好ましい群は１ないし１０個のメチレン基、より好まし
くは３ないし８個のメチレン基を含む。最も好ましい
Ｚ'基は、ｖが１である式Ｇの基、及びｕが３ないし８
である式Ｊの基である。
【００６３】式Ｇ、Ｈ及びＪで示される基において、カ
ルボキシ基Ｒ14は遊離または塩の形で存在する。この塩
は、生理学的に許容し得るカルボン酸の塩を形成するこ
とのできる任意の基をもって形成される。アルカリ金属
及びハロゲン化水素塩が特に適当である。即ち、ナトリ
ウム、カリウム及びリチウム塩、並びに塩酸、臭化水素
酸及びフッ化水素酸塩が、本発明の実施に特に有用であ
る。しかしながら、薬化学において許容し得る他の塩類
もまた有用である。例えば、トリエチルアミン、トリエ
タノールアミン、エチルジメチルアミン等のようなアミ
ン塩が有用であり、テトラアルキルアンモニウム塩、
（ベンジルまたはフェニル）トリアルキルアンモニウム
塩等を包含する四級アンモニウム塩類もまた同様であ
る。アンモニウム塩の中では、テトラブチルアンモニウ
ム、ベンジルトリメチルアンモニウム、及びテトラメチ
ルアンモニウムが典型的且つ好ましい塩である。しかし
ながら、薬化学者はカルボン酸の塩を頻繁に使用し、Ｒ
14が塩を形成する基である本発明の塩は、生理学的に許
容し得る塩を形成する任意の塩基によって製造すること
ができる。
【００６４】式Ｘの基を誘導する必要な中間体は薬化学
文献にあり、当業者はこれらのうちいずれをも入手する
ことができる。メソトレキサート薬物の合成に関する有
用な総論は、ラーマン及びチャブラ、「ザ・ケミストリ
ー・オブ・メソトレキサート・アンド・イッツ・アナロ
ーグズ」、メディシナル・リサーチ・レビューズ（Ｍｅ
ｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．）第８巻Ｎｏ．１、
９５−１５５（１９８８）である。
【００６５】合成 本発明化合物の骨組みは、基本的には、天然アミノ酸ま
たは幾分修飾されたアミノ酸で成り立っていることは理
解できるであろう。例えば、ｔが３であるＸ基は非αア
ミノ酸である。指摘したように、種々のアミノ酸構成員
は、上に論じたようにＤまたはＬ型のいずれかであり得
る。
【００６６】式ＩＩ−ＶＩの中間体、及び最終的細胞毒
性複合体、並びに式ＶＩＩＩの修飾薬物の組み立てに使
用される合成法は、基本的にはアミノ酸中間体からペプ
チドを合成する際に常套的に適用される方法である。出
発化合物及び中間体上の様々な反応性官能基をブロック
または保護して、他の反応性官能基との結合反応を実施
することは、このような化学において常套的である。し
たがって、このような反応が終了した後には保護官能基
の除去が必要になる。係る保護及び脱保護工程は、有機
化学、とりわけペプチド化学においては全く常套的な事
であって、本明細書中で詳細に説明することは必ずしも
しない。しかしながら、前記で引用した保護基について
のグリーンの教科書が、本明細書中使用される中間体上
に見いだされる全ての反応性官能基のための保護基を詳
細に説明しており、且つこれら保護基を導入及び除去す
る簡便な方法を概説していることを記しておく。
【００６７】さらに、本発明の中間体のようなアミノ酸
構成物の製造のために最も簡便な方法は、自動ペプチド
合成機の使用による方法であることもまた理解できるで
あろう。このような機械は広く使用されており、文献中
に記載されてきた。係るペプチド合成機は容易に入手で
き、その良く知られている製造者はアプライド・バイオ
システムズ・Ｉｎｃ．、フォスター・シティー、ＣＡ９
４４０４、（ＡＢＩ）であって、モデル４３０Ａとして
知られる装置を市販している。本発明に係る全化合物を
合成する最も簡便な方法は、式ＶＩＩの中間体の合成で
始まる。
【化１４】
【００６８】上の中間体の合成を下記の製造例１に例示
するが、ここでこの中間体は自動ペプチド合成機で合成
される。上の中間体は式Ｘ及びＺの出発物質、及び下記
のアミノ酸から製造する。
【化１５】
【００６９】中間体ＶＩＩの合成がペプチド合成機で行
なわれる場合、基Ｒ1が、アミノ酸反応の基質を提供す
るためにこのような化学で使用される樹脂を表わすとい
うことは理解できるであろう。好ましい方法の次工程
は、式：
【化１６】 で示される追加のアミノ酸出発化合物との反応により、
式ＶＩＩの中間体を式ＶＩの中間体に変換することであ
る。
【００７０】この反応は、常套的化学により手動で簡便
に行なわれる。次に、もしアミノオキシ基及びＸｐ基の
間にアシルスペーサーを提供すること、またはアミノオ
キシアルキレン基を提供することが望まれるならば、適
当な工程を実施する。まず、Ｒ5保護基を、個々のＲ5基
にとって好適な常套的手段により、基Ｘpから除去す
る。もしアミノオキシアシル基、例えば好ましいアミノ
オキシアセチル基が使用されるはずであるならば、これ
は、アミノオキシ酢酸の適当に保護された誘導体、また
は任意の適当なアミノオキシアルカン酸との反応によっ
て提供することができる。一般に、活性エステル型、最
も好ましくはＮ−スクシンイミドエステル型で酸を使用
する必要があるであろう。このようにして式Ｖの中間体
を製造する。下記の実施例及び製造例に示されるよう
に、この中間体は本発明に係る全ての細胞毒性複合体の
製造に使用される。
【００７１】中間体Ｖの製造後の合成の方向は、使用す
るＹ基による。Ｙ基が単なる結合であるならば、式Ｉの
複合体は、適正に製造された抗体または抗体フラグメン
トを用いて、非保護型の式Ｖの中間体の直接反応によっ
て製造する。この場合、抗体またはフラグメントに対す
る結合はオキシム結合であり、抗体は、これを酸化して
抗体またはフラグメントの炭水化物部分にアルデヒド官
能基を得ることによって製造する。抗体のこのような反
応は過去に多数発表されており、例えばマッカーン等、
欧州特許公開０８８６９５号及び米国特許４６７１９５
８号；並びにラグーザ等、欧州特許公開２４７７９２号
による。
【００７２】このような反応は、所望の抗体または抗体
フラグメントを過ヨウ素酸塩、メタ過ヨウ素酸塩または
その他の適当な酸化剤で酸化し、その結果炭水化物中の
隣位のジオール間の結合を破壊して元の結合の両側にア
ルデヒド基を生成することによって実施する。生成され
るジアルデヒド単位の数は、酸化剤の量、時間、温度、
溶媒、及び酸化の濃度、蛋白上にある隣位のジオール炭
水化物単位の数、並びにこれらジオールの酸化剤への立
体的接近可能性の結果である。別法として、例えばガラ
クトースオキシダーゼによる酵素的酸化を使用すること
もできる。この試薬は、炭水化物鎖上のガラクトース残
基の６−ＣＨ2ＯＨ位の、アルデヒド官能性への変換を
触媒する。
【００７３】酸化した抗体または抗体フラグメントを、
次に、抗体との反応として一般に下記の実施例に例示す
るような条件の下で、式Ｖの中間体と反応させる。抗体
または抗体フラグメントの各分子上で起こるこのような
反応の数は、一般に１ないし約１０まで変わり得、各抗
体分子上のアルデヒド基の数、及び立体効果によって変
わる。中間体Ｖとの反応は、水性混合物、最も好ましく
は、抗体を損なわない緩衝化された水溶液中で実施す
る。特に好適な水性媒質は、酢酸イオン濃度が約０．１
ｍｏｌである酢酸塩緩衝液である。反応媒質のｐＨは約
４．５−６の範囲の僅かな酸性とすべきである。無論、
抗体の比較的低い溶解性のため、反応混合物の濃度は通
常かなり低い。混合物の反応温度は約０゜ないし約４０
゜、好ましくは約０゜ないし約２５゜であり、反応時間
は２４時間までが通常適当である。抗体複合体の精製は
下記に論じ、実施例に例示する。このような反応におい
て、中間体Ｖは完全に脱保護されていることが理解でき
るであろう。
【００７４】別法として、Ｙが式Ｅで示される基である
時、式Ｖの中間体を適当なビス−アルデヒドとの反応に
より中間体ＩＶに変換する。例えば、Ｒ2がフェニレン
である時この中間体はｍまたはｐベンゼンジアルデヒド
であり、または、Ｒ2がピロリルである時、これはピロ
ール−２，５−ジアルデヒドのようなピロールジアルデ
ヒドである。この中間体はアルキレンジアルデヒドであ
ってもよい。下記実施例４に示されるように、反応は０
゜ないし５０゜の範囲の中庸の温度で、最も好ましくは
水性緩衝液、例えば酢酸塩緩衝液中で、中性または適度
な酸性ｐＨにおいて容易に実施できる。無論、中間体Ｖ
の末端アミノ基は反応が実施される前に脱保護されねば
ならず、また、側鎖の保護基は除去、または状況におい
てそれが好都合である時には除去しなくてよい。
【００７５】式ＩＶの中間体をカルボヒドラジド修飾抗
体または抗体フラグメントと反応させる。カルボヒドラ
ジド（ＮＨ2−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2）は、オフォー
ド及びローズ、欧州特許公開３５９４２８号及び３６０
４３３号の教示に従って、所望の抗体または抗体フラグ
メントと反応させる。反応は適当なプロテアーゼ、特に
キモトリプシンまたはトリプシン、またはリジルエンド
ペプチダーゼのようなエンドペプチダーゼ類、またはカ
ルボキシペプチダーゼＹのようなエキソペプチダーゼ類
の存在下で実施する。オフォード及びローズは、このよ
うな反応が、標的物に対して位置特異的複合体を産む、
抗体またはフラグメントの末端カルボキシ基を伴うカル
ボヒドラジドの特異的反応につながることを教示してい
る。即ち、Ｆ（ａｂ'）様抗体フラグメントを使用する
と、１または２の結合基が抗体の各分子に結合し、Ｆ
（ａｂ'）2様フラグメントまたは完全な抗体を使用する
と、１分子当り４個までの結合基が可能となる。
【００７６】抗体上にカルボヒドラジドを配置する反応
は、イミド結合を作り出す逆プロテオリシスとして特徴
付けられ、一般に酵素反応に好適な条件の下で実施す
る。水性緩衝液を構成し得る水性反応媒質を使用すべき
であり、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミ
ド、アセトニトリル等のような少量の水混和性有機溶媒
をこの混合物の構成成分として使用することができる。
一般に、反応は周囲温度に近い温度、例えば約０゜ない
し約４０゜で、ほぼ中性のｐＨ、例えば約４ないし約９
で実施する。
【００７７】最後に、記載した型の複合体の製造におい
ては、カルボヒドラジド修飾抗体を、酸化抗体との反応
について上に記載した条件とほぼ同様の条件で、式ＩＶ
の中間体と反応させる。Ｙ基が式Ｆの基である時、抗体
をまずこのＹ中間体： ＨＯ2Ｃ−Ｒ4−Ｒ3−Ｒ2−ＣＨＯ でアシル化する。
【００７８】反応を最もうまく実施するには、この中間
体は、好ましくはＮ−スクシンイミドエステルのような
活性エステルの形でなければならない。好ましくは、Ｒ
3が−ＮＨ−ＣＯ−でありＲ4がエチレン基のような小さ
なアルキレン基でありＲ2が最も好ましくはピロリルで
あるアミノ酸である、これらの中間体は、酸性または活
性化されたエステルのいずれかの形で常法によって容易
に製造される。
【００７９】Ｙ基中間体及び抗体の反応は、酸化抗体と
の反応の項で上に記載されたのと同様の水性媒質中で簡
便に実施できる。この場合反応はアシル化であって、Ｙ
中間体の活性化されたカルボキシ基が、主として抗体ま
たは抗体フラグメントのリジンのアミノ基と反応する。
しかしながらこのアシル化は、ヒドロキシ基、フェノー
ル基、イミダゾール環及び恐らくは抗体またはフラグメ
ントの他の部分をも攻撃し得る。各Ａｂ分子上において
多数のこのような基が利用できるため、Ａｂ分子当りの
アシル化の数は確定されないが、反応体の濃度、反応の
温度、時間及び一般的に理解されるその他の因子によっ
て調節することができる。上記式Ｉの化合物の定義にお
いて指摘したように、Ａｂ分子当り約１０ものアシル化
が起こり得る。
【００８０】抗体または修飾抗体との上の反応は、抗体
及び−Ｙ＝結合基が配置されており、該中間体の側鎖が
完全に脱保護されている式ＩＩＩの型の中間体を提供す
る。式ＩＩＩの中間体は、酸化によって式ＩＩの中間体
に変換される。このような酸化は下記の実施例６に例示
し、これは過ヨウ素酸塩、メタ過ヨウ素酸塩等のような
酸化剤によって容易に実施できる。水性反応混合物、特
に淡水が適当である。適度に過剰、例えば２ないし１０
倍過剰の酸化剤の使用が望ましい。反応混合物の濃度
は、抗体の限られた溶解性のため、必然的にかなり低い
であろう。この酸化は非常に迅速であり、数分間ないし
１時間の範囲の反応時間が適当であることがわかった。
酸化が完了、または所望の程度まで完了した後、過剰の
酸化剤を水溶液としてのエチレングリコールの添加によ
り失活させ、次いで式ＩＩの中間体を下記のようにクロ
マトグラフィーによって精製する。
【００８１】式Ｉの複合体の製造の最終工程は、式ＩＩ
の中間体と薬物ヒドラジドとの反応である。本発明に使
用される薬物は、上記に詳しく論じている。そこで説明
したように、該薬物は、本発明で使用可能であるために
は、ヒドラジド型である。式ＩＩの中間体と薬物ヒドラ
ジドとの反応は水性緩衝液中で簡便に実施され、中でも
希酢酸塩緩衝液が好ましいことが見いだされた。抗体の
溶解性に適応させるため、反応混合物の濃度はやはり比
較的低くなければならず、該薬物との反応は、約４ない
し約７の範囲のｐＨで実施するのが最も簡便である。か
なりの過剰量、少なくとも５倍過剰の薬物ヒドラジドの
使用が望ましく、反応は比較的緩慢であることがわかっ
た。時には２４時間またはこれ以上の反応時間が必要で
ある。無論、この比較的長い反応中、壊れ易い抗体を保
護するため、薬物ヒドラジドとの反応は、緩和な条件、
典型的には約０℃ないしほぼ周囲温度で実施せねばなら
ない。
【００８２】最後に、式Ｉの生成物を精製するが、この
多段階工程の過程において、種々の中間体を精製するこ
とが望ましいかも知れない。読者には、適当な精製法の
洞察のため、下記の製造例及び実施例を参照することが
望まれる。無論一つの最良の精製法がある訳ではなく、
精製は、製造される特定の中間体及び生成物に適合する
よう調節されねばならないことは理解できるであろう。
一般に精製は透析及びクロマトグラフィー法により行な
われる。攪拌セル内でのような、燐酸塩緩衝化食塩水ま
たは類似の低濃度緩衝液への透析は、非常に希薄な反応
混合物中で製造された生成物及び中間体の濃縮のために
特に簡便な方法である。高性能、高速液体クロマトグラ
フィーは一般に好ましい精製法であり、このための多様
な媒体が、ファルマシアのような会社によって作られて
いる。このような製造業者により作られた生成物の文献
は調べるべきではあるが、これらの生成物のクロマトグ
ラフィーによる精製は、他の多数の蛋白を基礎とする物
質の精製と異なる訳ではない。蛋白生成物が当分野にお
いてしばしば分析されるように、クロマトグラフィー操
作の生成物含有画分を同定し、中間体及び生成物の濃度
を紫外分光法により測定することができる。
【００８３】式ＶＩＩＩの修飾薬物の合成を、式ＶＩの
中間体の製造まで、記載されたのと実質上同じ手法で実
施する。次いでこの中間体を側鎖の基において脱保護
し、式ＩＩの中間体の合成の考察において上に記載した
ように酸化する。次に、式ＶＩＩＩに対応する酸化中間
体を薬物ヒドラジドと反応させて、式ＶＩＩＩの所望生
成物を製造する。Ｒ1及びＲ5保護基は、状況の好ましさ
に応じて除去または残存させる。
【００８４】以下の製造例及び実施例は、本発明化合物
を製造する手法をさらに例示するものである。無論、以
下の製造例及び実施例は、本明細書に記載される全ての
化合物の製造において、当業者が手引として使用するこ
とができるということが理解できるであろう。リンカー
中間体及び当複合体のリンカー部分の命名はかなり複雑
である。したがって、下記の殆どの場合、極めて複雑な
命名の問題を回避するため、リンカー中間体の同定は構
造式によって示す。
【００８５】製造例１
【化１７】 上の構造式中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル保護基を意味し、ｔ−Ｂｏｃはｔ−ブトキシカ
ルボニル保護基を意味し、ＰＡＭはＡＢＩより得られる
フェニルアセトアミドメチル樹脂を意味する。Ｆｍｏｃ
プロトコルを用いるＡＢＩ４３０Ａ自動ペプチド合成機
を利用して、上記ノナペプチドの合成のために、ｔ−Ｂ
ＯＣ−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＯ−ＰＡＭ０．５ｍｍｏｌを出
発物質として使用した。各合成サイクルをニンヒドリン
分析によって管理し、各サイクルにおける結合は本質的
に定量的であることがわかった。収量は、樹脂結合型の
所望中間体１．１３ｇであった。
【００８６】実施例１
【化１８】 上の構造式中、Ｐｈという語はフェニル基を意味する。
上記製造例１で製造された中間体をトリフルオロ酢酸４
０ｍｌで１時間処理し、次いでこの中間体を濾過し、ジ
クロロメタンで洗浄し、乾燥した。ヒドロキシ上にベン
ジル保護基、窒素上にｔ−ブトキシカルボニル保護基、
そしてカルボキシ基上にＮ−ヒドロキシスクシンイミド
基を有するセリン１．９６ｇをジメチルスルホキシド５
ｍｌに溶解し、Ｎ−メチルモルホリンの添加により、溶
液の見かけのｐＨを８とした。製造例１の脱保護された
中間体をこの溶液に加え、見かけのｐＨを再調節して８
とした。混合物を暗所、周囲温度で２０時間攪拌し、濾
過し、沈澱を、ジメチルスルホキシド１０ｍｌ、メタノ
ール２０ｍｌずつで３回、そしてジクロロメタン２０ｍ
ｌずつで３回洗浄した。収量は所望の中間体１．１５ｇ
であった。次に、樹脂を、強く攪拌しながらピペリジン
２ｍｌ及びジメチルホルムアミド２ｍｌの混合物で３時
間処理してＦｍｏｃ基を除去し、次いでこの樹脂を濾過
し、ジクロロメタン１０ｍｌずつで３回洗浄し、乾燥し
た。収量は、中間体０．９５ｇであった。
【００８７】製造例２
【化１９】 実施例１の中間体１００ｍｇを、まずトリフルオロ酢酸
１ｍｌで３０分間処理することにより、脱保護し、樹脂
から開裂させた。次いでトリフルオロメタンスルホン酸
１００μｌを加え、混合物を６０分間激しく攪拌した。
次にジエチルエーテル４ｍｌを加え、開裂した樹脂の存
在下で遠沈により沈澱を回収し、ジエチルエーテル４ｍ
ｌずつで３回洗浄した。次いで、水３ｍｌに溶解し、
０．２μフィルターで濾過して樹脂の粒子を除去するこ
とにより、ペプチドを回収し、ＷＩＳＰ自動試料注入器
を備えたウォーターズ・インストルメントの高速液体ク
ロマトグラフィーによって同定した。カラムは２５０ｍ
ｍｘ４ｍｍのマッチェリー・ナゲル・ヌクレオシル３０
０Ａ ５μｍ Ｃ８ ミディアムであり、０．６ｍｌ／
分で注入した。溶離液は、溶媒Ａ（トリフルオロ酢酸１
ｇ／ｌ）５分間で開始し、次いで溶媒Ｂ（９０％水性ア
セトニトリル中トリフルオロ酢酸１ｇ／ｌ）を加えて２
％／分で１００％のＢに至る勾配とした。吸収を２１４
ｍｍで監視した。主たる成分を、無勾配の溶媒Ａ１００
％を用いるクロマトグラフィーによって精製し、上記所
望のノナペプチドと一致することが示された。収量は約
２６ｍｇであった。
【００８８】実施例２
【化２０】 上記実施例１で製造された中間体３００ｍｇを、ジメチ
ルスルホキシド８ｍｌ中、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル
アミノオキシ酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル３．３ｍｍｏｌと、周囲温度、ｐＨ８で反応させる
ことにより、アシル化した。混合物を１８時間攪拌し、
次いで樹脂を濾過し、ジメチルスルホキシド、メタノー
ル、及びジクロロメタン各々１０ｍｌずつで３回洗浄
し、デシケーター中で減圧乾燥すると、所望中間体２４
７ｍｇが得られた。
【００８９】実施例３
【化２１】 実施例２の中間体１００ｍｇをトリフルオロ酢酸３．５
ｍｌで１時間処理した。次いで樹脂を濾過し、ジクロロ
メタン１０ｍｌずつで５回洗浄し、減圧乾燥した。次
に、処理した樹脂５０ｍｇを、トリフルオロ酢酸０．５
ｍｌを添加し、１５分間攪拌し、トリフルオロメタンス
ルホン酸５０μｌを加え、さらに３０分間激しく攪拌す
ることにより、開裂させた。次いで、ジエチルエーテル
４ｍｌを加え、沈澱を遠沈により回収し、ジエチルエー
テル４ｍｌずつで３回洗浄した。次いで、沈澱を水４ｍ
ｌに取り、０．２μｍフィルターで濾過して樹脂の粒子
を除去した。蒸発時の収量は、白色固体１４．９ｍｇで
あった。成分を、実質上上記製造例２に示したようにク
ロマトグラフィーにより分離し、主要な成分を集め、陽
イオン高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）によっ
て、所望の中間体に一致することを見いだした。収量は
３．４ｍｇであった。
【００９０】実施例４
【化２２】 上記実施例３で製造した中間体の水溶液（２９ｎｍｏｌ
／μｌ）３００μｌに、イソフタルアルデヒドの溶液
（１３．４ｍｇをアセトニトリル０．５ｍｌに溶解し、
ここに０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）２
ｍｌを加えた）１．２ｍｌを加えた。反応混合物を周囲
温度（２２℃）で９０分間攪拌し、流速１ｍｌ／分を用
いる外は製造例２の記載と同様にして、生成物を逆相Ｈ
ＰＬＣにより単離した。試料は３００μｌを５回適用し
た。各適用について、溶媒Ａ１００％における注入の
後、１００％Ａで５分間、次いで１．７５％Ｂ／分で４
分間、次いで無勾配の７％Ｂで１０分間、次いで１％Ｂ
／分で３０分間溶出し、２１４ｎｍで監視した。過剰の
イソフタルアルデヒドが最初の主要なピークとして、そ
して生成物が第二の主要なピークとして溶出した。プー
ルした生成物のピークを蒸発させて、ＦＡＢ−ＭＳによ
り同定される生成物５．２５ｍｇを得た。
【００９１】製造例３ 抗体００７Ｂのペプチド性Ｆ
（ａｂ'）2フラグメント 本明細書中、上の抗体の項で述べた抗体ＫＳ１／４を産
生するハイブリドーマから誘導されるサブクローンであ
るハイブリドーマによって、抗体００７Ｂは産生され
る。抗体００７ＢのＦ（ａｂ'）2フラグメントを、抗体
００７Ｂをペプシンで消化することにより調製する。ま
ず、１％酢酸中の抗体００７Ｂの溶液を、抗体５及び１
０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で作成する。次にこの溶液のｐ
Ｈを４．２−４．３に調節し、次いで溶液を３７℃に温
める。ここに、１％酢酸中のペプシン溶液を、１０及び
２０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で加える。ペプシンの量と抗
体の量との比は０．０３／１である。混合物を３７℃で
穏やかに攪拌し、４−８時間後、元の抗体の８０％が消
化された時に反応を停止させる。次いで１Ｍトリエタノ
ールアミンを反応混合物中の最終濃度５０ｍＭまで加
え、希水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調節すること
により、反応を停止させる。次に、まず反応混合物を１
７０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．５）２用量で希釈し、この希釈
溶液をさらなる酢酸で４．５に調節することによって、
抗体フラグメントを精製する。沈澱が形成され、次いで
混合物を２００００ｘｇで２０分間遠沈することにより
透明とする。次に、この透明になった混合物をＳ−セフ
ァロースＦＦカラム上のクロマトグラフィーに付し、ま
ず１７０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．５）、次いで上記溶離液か
ら、最初の溶離液中２５０ｍＭ塩化ナトリウムに至る直
線勾配で溶出する。このクロマトグラフィーからの００
７Ｂフラグメント含有画分を、２８０ｎｍのＵＶ分析及
びＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルによって同定する。生成物含有
画分をプールし、トリエタノールアミンを最終濃度５０
ｍＭまで加え、この後ｐＨを７．４に調節する。次いで
抗体フラグメント生成物を限外濾過により濃縮する。
【００９２】製造例４ アクロモバクター由来抗体００
７Ｂ Ｆ（ａｂ'）2フラグメントのカルボヒドラジド誘
導体 カルボヒドラジド１２．４ｇを水に溶解し、ｐＨ及び容
量を、水及び酢酸の添加により、ｐＨ５．５の溶液５０
ｍｌが得られるまで調節した。この溶液８１５μｌを抗
体００７ＢのＦ（ａｂ'）2フラグメント１６．３ｍｇに
周囲温度で加え、アクロモバクタープロテアーゼの１０
ｍｇ／ｍｌ溶液８１μｌを加えた。この混合物を周囲温
度で３時間、時折穏やかに攪拌した。次いでカリクレイ
ントリプシンインヒビター（バイエル）の７８ｍｇ／ｍ
ｌ溶液１０６μｌを加え、混合物をスーパーロース１２
カラム（ファルマシア）に適用し、０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ４．６）緩衝液で溶出した。３００ｎｍにお
ける吸収により同定される生成物含有画分をプールし、
約２００μｌの容量まで濃縮した。この工程を２回実施
し、生成物をプールして、カルボヒドラジドが反応し、
抗体フラグメントの末端カルボキシ基に結合している所
望生成物約１５．９ｍｇを得た。
【００９３】実施例５
【化２３】 製造例４の修飾抗体４１０μｌに、１５１ｍｇ／ｍｌの
水溶液として実施例４の中間体７．９μｌを加えた。混
合物を穏やかに攪拌し、周囲温度で２０時間保持し、次
いで０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）で平
衡化し、溶出する、スーパーロース１２ ＨＲ １０／
３０カラムにロードした。蛋白のピークを濃縮し、ｐＨ
６．９５に調節した５０ｍＭイミダゾールで平衡化し溶
出するスーパーロースカラムに再び適用した。Ｆ（ａ
ｂ'）2の大きさの物質を４００μｌに濃縮して、所望の
中間体約８．９ｍｇを得た。
【００９４】実施例６
【化２４】 上記実施例５で製造された中間体に、２２．８ｍｇ／ｍ
ｌを含有するメタ過ヨウ素酸ナトリウムの水溶液１７．
８μｌを加えた。混合物を周囲温度で５分間穏やかに攪
拌し、次いで、１１．２μｌ／ｍｌを含むエチレングリ
コールの水溶液１７．８μｌの添加により、酸化を停止
させた。次に、反応混合物を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．６）で平衡化し溶出するスーパーロース１２
ＨＲ１０／３０カラムにロードした。蛋白を含有する
ピークを３８０μｌに濃縮して、所望生成物約８．６ｍ
ｇを得た。
【００９５】実施例７
【化２５】 上の構造式において、−ＣＯ−ビンブラスチンという語
は、ビンカ核の３位において、Ｃ23カルボニル基を介し
て結合している、ビンカ薬物ビンブラスチンを意味す
る。上記実施例６で製造された中間体に、０．１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．６）中０．１Ｍ４−デスアセチル
−２３−デスメトキシビンブラスチン−２３−ヒドラジ
ンを含有する溶液８６．３μｌを加えた。反応混合物を
周囲温度で１８時間インキュベートし、次に、０．１Ｍ
塩化ナトリウム（ｐＨ７）を含有する５０ｍＭ燐酸二水
素ナトリウム緩衝液に対して４゜で透析した。沈澱とし
て回収された生成物を、０．２％サルコシル（ラウリル
サルコシンナトリウム）を含有する燐酸緩衝化食塩水に
溶解した。生成物は２８０及び３２０ｎｍにおける紫外
分光法により同定した。
【００９６】実施例８
【化２６】 製造例３におけるように製造された抗体００７Ｂ Ｆ
（ａｂ'）2フラグメント２０ｍｇを０．３４Ｍホウ酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８．６）に、２３．２ｍｇ／ｍｌ
の濃度まで溶媒交換した。この溶液に、３−（５−ホル
ミルピロール−２−イルカルボニルアミノ）プロピオン
酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのアセトニ
トリル溶液２８μｌを、４．３ｍｇ／ｍｌの濃度で加え
た。混合物を周囲温度で１時間攪拌し、次に、分子量１
００００で分離する膜を備えた攪拌セル中で、酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．６）中に透析することにより、
濃縮した。生成溶液は、１１．５ｍｇ／ｍｌを含有する
溶液１．４４ｍｌという形で、抗体００７Ｂフラグメン
トの３−（５−ホルミルピロール−２−イルカルボニル
アミノ）プロピオニル誘導体１６．５ｍｇを含有してい
た。３００及び２８０ｎｍにおける吸収を測定するＵＶ
分光法により測定したところ、この生成物の結合比率
は、抗体フラグメント１ｍｏｌ当りホルミルピロールリ
ンカー１．５ｍｏｌであった。
【００９７】上の中間体の半量、即ち生成溶液０．７２
ｍｌを、固体としての前記実施例３の中間体０．５７ｍ
ｇと合し、この混合物を周囲温度で２４時間攪拌した。
次いでこれを０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過
し、次に攪拌セル中でｐＨ６．９のイミダゾール緩衝液
への溶媒交換によって精製した。生成物を乾固付近まで
濃縮し、イミダゾール緩衝液２ｍｌを加え、溶媒交換工
程を２回反復した。生成物は、所望物質５．８ｍｇを含
有する溶液１．４４ｍｌの形の、上の構造式で示される
所望中間体であると同定された。
【００９８】実施例９
【化２７】 実施例８の生成物を、イミダゾール緩衝液中の５ｍｇ／
ｍｌメタ過ヨウ素酸ナトリウム３１μｌと合し、実質
上、前記実施例６に示されるように酸化反応を実施し、
エチレングリコールで反応停止させた。反応混合物を、
攪拌セル中での酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）へ
の溶媒交換により精製して、所望生成物５．４ｍｇを含
有する生成物溶液１．５ｍｌが得られたことを、３００
及び２８０ｎｍにおけるＵＶ分析によって測定した。
【００９９】実施例１０
【化２８】 実施例９の生成物に４−デスアセチル−２３−デスメト
キシビンブラスチンヒドラジドの固体６．５ｍｇを加
え、混合物を周囲温度で３６時間攪拌した。次いでこの
混合物を１０分間遠沈して透明にし、燐酸塩緩衝化食塩
水（ｐＨ７．４）で溶出する２６ｘ１．５ｃｍのセファ
デックスＧ−２５（ファルマシア）カラム上のクロマト
グラフィーに付した。生成物含有画分を合し、０．２μ
ｍメンブレンフィルターで濾過して、所望生成物１．４
３ｍｇを含有する溶液３．１６ｍｌを得た。２７０及び
２８０ｎｍの吸収を測定する紫外分光法による生成物の
分析は、これが、抗体フラグメント１ｍｏｌ当り８ｍｏ
ｌのビンブラスチンを含むことを示した。
【０１００】実施例１１
【化２９】 抗体００７ＢのＦ（ａｂ'）2フラグメント１００ｍｇ及
び３−（５−ホルミルピロール−２−イルカルボニルア
ミノ）プロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルから出発して、実施例１０の生成物の別途合成を
実施し、アシル化抗体１０３ｍｇを、抗体フラグメント
１ｍｏｌ当りリンカー１．３ｍｏｌの結合比率で得た。
この中間体に、実施例３の中間体７．２ｍｇを加え、実
施例８に示されるように反応を行なった。イミダゾール
緩衝液（ｐＨ６．９５）中の溶液１２．８ｍｌとしてこ
の中間体９１．３ｍｇの収量が得られた。
【０１０１】この中間体生成物を実施例６に記載のよう
にメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、溶液１３．３
ｍｌの形で、実施例９に記載のような酸化された中間体
８９．３ｍｇを得た。ここに４−デスアセチル−２３−
デスメトキシビンブラスチンヒドラジド硫酸塩５７．６
ｍｇを加え、反応混合物を周囲温度で一夜攪拌した。次
にこの混合物を前記実施例１０に記載のようにクロマト
グラフィーによって精製し、所望生成物８０ｍｇを燐酸
塩緩衝化食塩水中の溶液２４．９ｍｌの形で得た。前記
実施例１０に記載のような分析により測定した結合比率
は、抗体フラグメント１ｍｏｌ当りビンブラスチン５．
３ｍｏｌであった。生成物を攪拌セルにより濃縮し、
０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、燐酸塩緩
衝化食塩水中の６ｍｇ／ｍｌの溶液１０．９ｍｌの形
で、生成物６５ｍｇを得た。結合比率はビンブラスチン
５．０ｍｏｌ／ｍｏｌ（００７Ｂフラグメント）であっ
た。
【０１０２】４℃で３日間放置した後に生成物中に形成
された沈澱を０．２μｍの濾過によって除くと、６．２
ｍｇ／ｍｌの溶液１０．２ｍｌの形の生成物６３ｍｇが
得られ、この結合比率は３．９ｍｏｌ／ｍｏｌであっ
た。この生成物を非修飾抗体フラグメントと比較してＰ
３−ＵＣＬＡ癌腫細胞と結合する能力を測定した。結合
を免疫蛍光測定によって決定し、この生成物が天然の抗
体フラグメントの７８％の結合力を有することがわかっ
た。したがって、複合体化した抗体は、癌腫細胞との結
合において尚有効であるという事が明らかとなった。
【０１０３】さらに、本実施例の複合体化した生成物の
細胞毒性を、Ｐ３−ＵＣＬＡ細胞において、デスアセチ
ルビンブラスチンヒドラジドと比較して測定した。本実
施例の生成物の５０％阻害用量は０．０１７μｇ／ｍｌ
であり、複合体化していないビンカ薬物のこれに相当す
る用量は０．００１μｇ／ｍｌ以下であった。
【０１０４】実施例１２
【化３０】 抗体００７Ｂ１０ｍｇを０．３４Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８．６）１ｍｌ中に透析し、３−（５−ホルミルピロ
ール−２−イルカルボニルアミノ）プロピオン酸、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル０．１ｍｇと反応さ
せ、これをアセトニトリル２４μｌに加えた。反応混合
物を周囲温度で１時間攪拌し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ５．６）で溶出するセファデックスＧ−２
５カラム上のクロマトグラフィーにより精製した。生成
物含有画分を０．２μｍのメンブレンフィルターで濾過
すると、本抗体の３−（５−ホルミルピロール−２−イ
ルカルボニルアミノ）プロピオニル誘導体６．２ｍｇが
得られた。結合比率は、抗体１ｍｏｌにつきリンカー
２．７ｍｏｌであった。
【０１０５】生成物の溶液を攪拌セル中で濃縮して、濃
度６．４ｍｇ／ｍｌの誘導体化された抗体溶液０．９ｍ
ｌを得た。ここに実施例３の中間体０．６７ｍｇを加
え、混合物を周囲温度で一夜攪拌した。次いで反応混合
物を、分子量３００００で分離する膜を備えた攪拌セル
を用いて、精製し、ｐＨ６．９のイミダゾール緩衝液中
に溶媒交換した。
【０１０６】この生成物は、生成物５．２ｇを含む溶液
１．４ｍｌから成り、これは、抗体が００７Ｂ Ｆ（ａ
ｂ'）2ではなく００７Ｂである外は実施例８の生成物に
相当していた。この生成物を、実施例６の記載と実質的
に同様にして、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、そ
して反応をエチレングリコールで停止させ、前記実施例
９の生成物に対応する酸化生成物４．６ｍｇを、濃度
２．３ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中の
溶液として得た。
【０１０７】この溶液に４−デスアセチル−２３−デス
メトキシビンブラスチンヒドラジド硫酸塩８．６７ｍｇ
を加え、混合物を周囲温度で一夜攪拌した。反応混合物
を遠沈し、次いで燐酸塩緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）で
溶出するセファデックスＧ−２５カラム上のクロマトグ
ラフィーによって精製した。生成物含有画分を合して、
溶液５．３ｍｌの形の所望生成物２．２ｍｇを含有する
ことがわかった。紫外分光法による分析は、結合比率
が、抗体１ｍｏｌにつきビンブラスチン１２ｍｏｌであ
ることを示した。
【０１０８】この複合体がＰ３−ＵＣＬＡ細胞に結合す
る能力を非修飾抗体と比較した。結合力は非修飾抗体の
８４％であって、癌腫細胞に結合する強い能力を示して
いることがわかった。Ｐ３−ＵＣＬＡ細胞に対する本実
施例の生成物の細胞毒性を測定したところ、遊離のデス
アセチルビンブラスチンヒドラジドの０．００３μｇ／
ｍｌに比べ、５０％阻害用量は０．０２７μｇ／ｍｌで
あるとわかった。
【０１０９】実施例１３
【化３１】 抗体００７Ｂ２５．８ｍｇを、前記実施例１２に記載の
ように３−（５−ホルミルピロール−２−イルカルボニ
ルアミノ）プロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル０．４２ｍｇと反応させた。反応混合物の濃
縮により、抗体１ｍｏｌにつきリンカー基４．２ｍｏｌ
を有する、溶液２．８ｍｌの形の、誘導体化された抗体
１８．７ｍｇが得られた。生成物を実施例３の中間体
３．６ｍｇと反応させるが、これは固体として加え、周
囲温度で一夜攪拌した。次いで反応混合物を濃縮し、イ
ミダゾール緩衝液（ｐＨ６．９）中へのセファデックス
Ｇ−２５サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し
て、溶液６．５ｍｌの形の生成物１６．４ｍｇを得た
が、これは抗体Ｆ（ａｂ'）2フラグメントでなく００７
Ｂに基づいている外は前記実施例８の生成物に相当す
る。２８０及び３００ｎｍの吸収を測定する紫外分光法
による分析は、この段階におけるリンカー結合比が４．
６であることを示した。
【０１１０】この生成物を実施例６に記載のようにメタ
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、溶液４．１ｍｌの形で
１４．３ｍｇが得られたこの酸化中間体を、４−デスア
セチル−２３−デスメトキシビンブラスチンヒドラジド
硫酸塩１７．６ｍｇと反応させた。反応混合物をｐＨ
７．４の燐酸塩緩衝化食塩水で溶出するセファデックス
Ｇ−２５のクロマトグラフィーによって精製し、生成物
含有画分を合して、所望生成物２．４ｍｇを、溶液７．
６ｍｌの形で得た。２７０及び２８０ｎｍにおける吸収
を測定する紫外分光法による分析は、抗体１ｍｏｌ当り
ビンカ薬物２３ｍｏｌの結合比を示した。
【０１１１】実施例１４
【化３２】 受理番号ＨＢ９６８２の下でアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから入手されるＬ／１Ｃ２ハイブ
リドーマを培養することにより、抗体Ｌ／１Ｃ２を調製
する。バイアルを円状に揺り動かしながら３７℃の水浴
中で内容物を融解させることにより、生存細胞を回収す
る。次に細胞懸濁液を平衡塩溶液（グランド・アイラン
ド・バイオロジカル・カンパニー（ＧＩＢＣＯ）、３１
７５スタレイ・ロード、グランド・アイランド、ニュー
ヨーク１４０７２）で１：２に希釈し、この懸濁液を血
清の下敷を通して遠沈して細胞を極低温媒質から分離す
る。上清を吸引し、細胞ペレット中の細胞を、Ｔ７５組
織培養フラスコに入れた１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ
−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）及び５０μｇ／ｍｌ硫酸ゲ
ンタミシン（ＧＩＢＣＯ）を添加した培地（ベントレッ
クスＨＬ−１、ベントレックス・ラボラトリーズ、ポー
トランド、ＭＥ）に、３７℃、５％二酸化炭素中で懸濁
する。ほぼ全面生長している培養から上清を集め、残っ
た細胞を遠沈により除く。プロテインＡセファロースカ
ラム（ファルマシア）を通すことにより、この、細胞を
含まない上清から抗体を精製する。抗体はカラムに結合
し、培地は０．０１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で
洗い流す。次いで抗体を０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ３．５）でカラムから溶出する。溶出した抗体は
直ちに１Ｍトリズマ緩衝液（シグマ、セント・ルイス、
ＭＯ）（ｐＨ７．４）で中性とし、０．０１Ｍ燐酸ナト
リウム（ｐＨ７．４）及び０．１５Ｍ塩化ナトリウムを
含有する真空透析機（バイオ−モレキュラー・ダイナミ
クス、ビーバートン、ＯＲ）中で透析及び濃縮する。抗
体調製物は０．２μｍ孔で濾過することにより滅菌し、
使用時まで４℃で保存する。
【０１１２】ペプシン１２．６ｍｇ／ｍｌを含有するペ
プシン溶液２．４ｍｌを燐酸塩緩衝化食塩水２７０ｍｌ
中のＬ／１Ｃ２抗体１．５ｇに加えることにより、抗体
Ｌ／１Ｃ２のＦ（ａｂ'）2フラグメントを調製する。混
合物を３７℃で２時間２０分間保持し、次いでトリエタ
ノールアミンの添加により反応を停止させる。次に、生
成物を、０．１５Ｍ酢酸ナトリウムで溶出するセファロ
ース・ファスト・フロー・カラム上のクロマトグラフィ
ーによって濃縮する。Ｆ（ａｂ'）2を含有する画分を合
し、透析により濃縮して、抗体Ｌ／１Ｃ２のＦ（ａ
ｂ'）2フラグメント９９２ｍｇを含有する生成物の溶液
１００ｍｌを得た。
【０１１３】０．３４Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．６）
０．８ｍｌ中の抗体Ｌ／１Ｃ２のＦ（ａｂ'）2フラグメ
ント２０ｍｇを、アセトニトリル溶液２８μｌとして添
加される３−（５−ホルミルピロール−２−イルカルボ
ニルアミノ）プロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル０．１２ｍｇと反応させた。混合物を周囲
温度で１時間攪拌し、次いで、分子量３００００で分離
する膜を用いて、攪拌セル中で溶媒を０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．６）に交換した。収量１５．４
ｍｇの誘導体化された抗体が、溶液１．３ｍｌの形で得
られた。紫外分光法による分析は、抗体フラグメント１
ｍｏｌにつきリンカー１．６ｍｏｌであることを示し
た。
【０１１４】この生成物の溶液に、実施例３の中間体
１．１ｍｇを加え、混合物を周囲温度で一夜攪拌した。
次いでこれを攪拌セル中で精製し、同時にイミダゾール
緩衝液（ｐＨ６．９５）に溶媒交換した。この生成物
は、抗体００７Ｂの代わりにＬ／１Ｃ２を伴う実施例８
の生成物に対応する物質を、イミダゾール緩衝液中の溶
液１．９ｍｌの形で１２．８ｍｇ含有していた。
【０１１５】この生成物を実施例６の記載と実質上同様
にしてメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化して、０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）中の溶液２ｍｌの
形の酸化生成物１２．０ｍｇを得た。溶液０．９ｍｌに
相当する上記生成物５．４ｍｇを４−デスアセチル−２
３−デスメトキシビンブラスチンヒドラジド硫酸塩３．
９ｍｇと反応させ、生成物を実施例１０に記載のように
精製及び単離して、所望生成物３．９ｍｇを燐酸塩緩衝
化食塩水中の溶液２．７ｍｌの形で得た。結合比率は抗
体フラグメント１ｍｏｌに対しビンブラスチン７．２ｍ
ｏｌであると決定された。
【０１１６】実施例１５
【化３３】 上記実施例１４からの酸化中間体５．４ｍｇをメソトレ
キサート−γ−ヒドラジド２．５ｍｇと合し、混合物を
周囲温度で一夜攪拌した。次に反応混合物をセファデッ
クスＧ−２５上のサイズ排除クロマトグラフィーにより
精製し、０．２μｍの膜で濾過して、所望生成物５．４
ｍｇを燐酸緩衝化食塩水の溶液３．３ｍｌとして得た。
２６０及び２８０ｎｍにおけるＵＶ分析は、結合比率が
メソトレキサート４ｍｏｌ／抗体フラグメント１ｍｏｌ
であることを示した。
【０１１７】本発明の複合体、及び式ＶＩＩＩの薬物
は、望ましくない細胞の増殖を阻害する方法において有
用であり、これが本発明の重要な部分である。したがっ
て、本発明はさらに、薬用組成物、最も好ましくは非経
口組成物であって患者の身体への注射に好適なものを包
含する。係る組成物は薬化学において普通に使用される
方法により調製される。本複合体は、生理学的に許容し
得る流体、例えば生理食塩水及びその他の安全に非経口
投与し得る水性溶液に良好に溶解する。
【０１１８】非経口投与のための生成物は、しばしば使
用直前の再構成のために、固体、好ましくは凍結乾燥形
で調製及び販売される。係る製剤は本発明の有用な組成
物である。これらの製造は薬化学者にはよく理解されて
いる。一般にこれらは、等張性を付与するための無機
塩、及び、乾燥した調製物を再構成時に速やかに溶解さ
せることのできる、乳糖のような分散剤の混合物を含
む。このような調製物は高純度の水を用いて、その薬物
を基準とした既知の濃度に再構成される。
【０１１９】本発明に係る複合体の最適な用量及び投与
計画は、処置する医師により患者の状態に照らして定め
られねばならない。無論、細胞毒性薬物は、一つながり
の投与の間に数日または数週間の間隔をおいて、分割用
量の形で投与するのが通例である。
【０１２０】処置の個々の目的、及び投与すべき用量範
囲は、薬物の実体及びその患者の処置されるべき状態に
よって変わる。薬物の個別的効力並びにそれらの適当な
用量及び頻度についての指標は医学文献から得られるで
あろう。
フロントページの続き (72)発明者 ロビン・イー・オフォード スイス1239コレックス−ボシィ、リュー ト・ドルネックス65番 (72)発明者 キース・ローズ スイス1208ジュネーブ、シュマン・ボワセ レッティ７番 (72)発明者 ウィリアム・レオナード・スコット アメリカ合衆国46208インディアナ州イン ディアナポリス、バッキンガム・ドライブ 144番

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、 Ａｂは、望ましくない細胞に付随する抗原を認識する抗
    体またはその抗原認識フラグメントであり；Ｒは、該細
    胞に対する細胞毒性作用を有する薬物の残基であり；Ｒ
    1はヒドロキシ基またはカルボキシ保護基であり；Ｘは
    −ＮＨ−（ＣＨ2）t−ＣＯ−；Ｚは 【化２】 であり；ｍは２ないし約６であり；ｎは１ないし約４で
    あり；ｐは０ないし約５であり；ｑは０ないし約３であ
    り；ｒは１ないし約１０であり；ｓは０−２であり；ｔ
    は１ないし約３であり、且つ種々のＸ基におけるｔの値
    は各々互いに独立しており；Ｙは、結合または式： （Ｅ）−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ2−Ｈ
    Ｃ＝または （Ｆ）−ＣＯ−Ｒ4−Ｒ3−Ｒ2−ＨＣ＝ で示されるリンカー基であり；Ｒ2はＣ1−Ｃ5アルキレ
    ン、フェニレンまたはピロリルであり；Ｒ3は結合また
    は−ＮＨ−ＣＯ−であり；Ｒ4は結合またはＣ1−Ｃ5ア
    ルキレンであり；但し、Ｒ3及びＲ4の両者が結合でない
    限り、Ｒ3及びＲ4のどちらも結合ではなく、ここでＡｂ
    の各分子は、１ないし約１０個の−Ｙ＝結合に結合して
    いる］で示される生理学的に許容し得る薬物複合体。
  2. 【請求項２】 Ｙが式ＥまたはＦを有し；ｔが１であ
    り；ｑが０であり；ｒが約３ないし約７であり；ｐが０
    ないし約３である請求項１の複合体。
  3. 【請求項３】 Ｒ2がピロリルであり；ｓが１であり；
    ｍが約４ないし約６であり；Ａｂが癌細胞に付随する抗
    原を認識し；Ｒが癌細胞に対する細胞毒性作用を有す
    る、請求項２の複合体。
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