JP3062696B2 - 新規リンカーを有するアントラサイクリンコンジュゲート及びその製造法 - Google Patents
新規リンカーを有するアントラサイクリンコンジュゲート及びその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なアントラサイクリンコンジユゲート
及びその製造法に関する。特に、本発明は、排除すべき
特定の細胞群の一つと反応性を有する分子と、13−ケト
位のアシルヒドラゾン結合を介して結合している少なく
とも１個のアントラサイクリンから成るところのコンジ
ユゲートに関する。
及びその製造法に関する。特に、本発明は、排除すべき
特定の細胞群の一つと反応性を有する分子と、13−ケト
位のアシルヒドラゾン結合を介して結合している少なく
とも１個のアントラサイクリンから成るところのコンジ
ユゲートに関する。
このように本発明の一つの具体例に従えば、該コンジ
ユゲートは、排除すべき特定の細胞群の一つと反応性を
有する抗体（該抗体は該骨格中に共有結合で結合する細
胞に対し毒性を示す１個又は複数のアントラサイクリン
分子を持つている）から成つている。各アントラサイク
リン分子は、リンカーアームを介して抗体に結合してお
り、そして該アントラサイクリンは、そのアントラサイ
クリンの13−ケト位の酸感受性のアシルヒドラゾン結合
を介してそのリンカーに結合している。本発明のより好
ましい具体例としては、アドリアマイシンイムノコンジ
ユゲート（アドリアマイシンは13−ケト位のアシルヒド
ラゾン結合を介してリンカーアームに結合している）が
あげられる。該リンカーはさらに該イムノコンジユゲー
トに該抗体を結合せしめる部分の一部としてジスルフイ
ド結合またはチオエーテル結合を含有している。
ユゲートは、排除すべき特定の細胞群の一つと反応性を
有する抗体（該抗体は該骨格中に共有結合で結合する細
胞に対し毒性を示す１個又は複数のアントラサイクリン
分子を持つている）から成つている。各アントラサイク
リン分子は、リンカーアームを介して抗体に結合してお
り、そして該アントラサイクリンは、そのアントラサイ
クリンの13−ケト位の酸感受性のアシルヒドラゾン結合
を介してそのリンカーに結合している。本発明のより好
ましい具体例としては、アドリアマイシンイムノコンジ
ユゲート（アドリアマイシンは13−ケト位のアシルヒド
ラゾン結合を介してリンカーアームに結合している）が
あげられる。該リンカーはさらに該イムノコンジユゲー
トに該抗体を結合せしめる部分の一部としてジスルフイ
ド結合またはチオエーテル結合を含有している。
本発明の別の具体例に従えば、該アントラサイクリン
分子は上皮細胞増殖因子（epidernal growth factor,EG
F）またはボムベシン（bombesin）のようなリガンドに
リンカーアームを介して結合し、そして該アントラサイ
クリンは、そのアントラサイクリンの13−ケト位の酸に
感受性のアシルヒドラゾン結合を介して該リンカーに結
合している。該リンカーは、さらにその骨格中にジスル
フイド結合またはチオエーテル結合を含有していてよ
い。加えて、本発明に従つて、アントラサイクリンの新
規アシルヒドラゾン誘導体が合成され、本発明のコンジ
ユゲートを製造するのに使用される。
分子は上皮細胞増殖因子（epidernal growth factor,EG
F）またはボムベシン（bombesin）のようなリガンドに
リンカーアームを介して結合し、そして該アントラサイ
クリンは、そのアントラサイクリンの13−ケト位の酸に
感受性のアシルヒドラゾン結合を介して該リンカーに結
合している。該リンカーは、さらにその骨格中にジスル
フイド結合またはチオエーテル結合を含有していてよ
い。加えて、本発明に従つて、アントラサイクリンの新
規アシルヒドラゾン誘導体が合成され、本発明のコンジ
ユゲートを製造するのに使用される。
本発明のコンジユゲートの酸に感受性のアシルヒドラ
ゾン結合は、標的細胞（ターゲツト細胞）の外部または
内部の酸性環境中でそのコンジユゲートからのアントラ
サイクリンの遊離（放出）を許容する。それ故に本発明
のコンジユゲート及びその方法は、癌及びその他の腫
瘍、殺細胞性でないウイルス感染症またはその他の病原
性感染症、及び自己免疫疾患のような病気の治療の際、
特定の細胞群の一つ（selected population of cells）
を選択的に攻撃（killing）するための抗体又はリガン
ド・仲介（mediated）ドラツグデリバリーシステムに使
用されて有用である。
ゾン結合は、標的細胞（ターゲツト細胞）の外部または
内部の酸性環境中でそのコンジユゲートからのアントラ
サイクリンの遊離（放出）を許容する。それ故に本発明
のコンジユゲート及びその方法は、癌及びその他の腫
瘍、殺細胞性でないウイルス感染症またはその他の病原
性感染症、及び自己免疫疾患のような病気の治療の際、
特定の細胞群の一つ（selected population of cells）
を選択的に攻撃（killing）するための抗体又はリガン
ド・仲介（mediated）ドラツグデリバリーシステムに使
用されて有用である。
（従来技術及び解決すべき課題） アントラサイクリンは、細胞毒活性を示すところの抗
生物質化合物である。アントラサイクリンは、次のよう
なメカニズムを含む多くの異なつたメカニズムによつて
細胞を殺すように働くことが研究で示されてきている： １）細胞のDNA中に該薬剤分子が挿入（intercalation）
され、それによりDNA依存の核酸合成を阻止する； ２）薬剤によつてフリーラジカルが産性され、次にその
フリーラジカルは細胞の高分子（macro−molecule）と
反応して細胞を傷害する； ３）薬剤分子と細胞膜との相互作用〔例えば、C.Peters
on et al.,“Transport And Storage of Anthracycline
s In Experimental Systems And Human Leukemia",Anth
racycline Antibiotics In Cancer Therapy,F.M.Muggia
et al.（ed.s）,p.132（Martinus Nijhoff Publishers
1982）;N.R.Bachur,“Free Radical Damage",id pp.97
−102、参照〕。その細胞毒活性が強いことから、アン
トラサイクリンは、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌、及
び肉腫（sarcoma）のような数多くの癌の治療に用いら
れてきた〔例えば、P.H.Wiernik,“Current Status of
Adriamycin And Daunomycin In Caneer Treatment",Ant
hracyclines:Current Status And New Developments,S.
T.Crooke et al.（eds.）、pp.273−94（Academic Pres
s 1980）参照〕。普通用いられるアントラサイクリンと
しては、アドリアマイシン及びダウノマイシンがあげら
れる。
生物質化合物である。アントラサイクリンは、次のよう
なメカニズムを含む多くの異なつたメカニズムによつて
細胞を殺すように働くことが研究で示されてきている： １）細胞のDNA中に該薬剤分子が挿入（intercalation）
され、それによりDNA依存の核酸合成を阻止する； ２）薬剤によつてフリーラジカルが産性され、次にその
フリーラジカルは細胞の高分子（macro−molecule）と
反応して細胞を傷害する； ３）薬剤分子と細胞膜との相互作用〔例えば、C.Peters
on et al.,“Transport And Storage of Anthracycline
s In Experimental Systems And Human Leukemia",Anth
racycline Antibiotics In Cancer Therapy,F.M.Muggia
et al.（ed.s）,p.132（Martinus Nijhoff Publishers
1982）;N.R.Bachur,“Free Radical Damage",id pp.97
−102、参照〕。その細胞毒活性が強いことから、アン
トラサイクリンは、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌、及
び肉腫（sarcoma）のような数多くの癌の治療に用いら
れてきた〔例えば、P.H.Wiernik,“Current Status of
Adriamycin And Daunomycin In Caneer Treatment",Ant
hracyclines:Current Status And New Developments,S.
T.Crooke et al.（eds.）、pp.273−94（Academic Pres
s 1980）参照〕。普通用いられるアントラサイクリンと
しては、アドリアマイシン及びダウノマイシンがあげら
れる。
これら化合物は、特定の細胞群を排除することが求め
られているところの新生物（neoplasm）及びその他の疾
患状態を治療するにあたり有用であるけれども、その治
療上の効果は、しばしばその投与に伴なう投与量に依存
した毒性によつて制限を受けている。例えば、腫瘍の治
療にあたつては、骨髄障害及び心機能障害といつた副作
用があげられる〔S.T.Crooke,“Goals For Anthracycli
ne Analog Development At Bristol Laboratories",Ant
hracyclines:Current Status And New Developments,su
pra p.11,参照〕。それ故に、腫瘍の治療にあたり、腫
瘍関連抗原に向けられた抗体にそのアントラサイクリン
を結合せしめることによりこれら化合物の治療上の効果
を高めるための試みがなされてきた。この方法では、そ
の薬剤は、腫瘍部位に運ばれまたは“ターゲツト化（tr
ageted）”されることができ、体内の正常な細胞に対す
るそれの毒性を伴つた副作用を減らしうる。従来、腫瘍
関連抗原に対するポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体に結合せしめられたアントラサイクリン化合
物、アドリアマイシン（adriamycin,ADM）またはダウノ
マイシン（daunomycin,DAU）から成るイムノコンジユゲ
ートが知られている〔例えば、J.Gallego et al.,“Pre
paration of Four Daunomycin−Monoclonal Antibody 7
91T/36 Cojugates With Anti−Tumour Activity",Int.
J.Cancer,33,pp.737−44（1984）及びR.Arnon et al.,
“In Vitro And In Vivo Efficacy of Conjugates of D
aunomycin With Anti−Tumor Antibodies",Immunologic
al Rev.62,pp.5−27（1982）参照〕。
られているところの新生物（neoplasm）及びその他の疾
患状態を治療するにあたり有用であるけれども、その治
療上の効果は、しばしばその投与に伴なう投与量に依存
した毒性によつて制限を受けている。例えば、腫瘍の治
療にあたつては、骨髄障害及び心機能障害といつた副作
用があげられる〔S.T.Crooke,“Goals For Anthracycli
ne Analog Development At Bristol Laboratories",Ant
hracyclines:Current Status And New Developments,su
pra p.11,参照〕。それ故に、腫瘍の治療にあたり、腫
瘍関連抗原に向けられた抗体にそのアントラサイクリン
を結合せしめることによりこれら化合物の治療上の効果
を高めるための試みがなされてきた。この方法では、そ
の薬剤は、腫瘍部位に運ばれまたは“ターゲツト化（tr
ageted）”されることができ、体内の正常な細胞に対す
るそれの毒性を伴つた副作用を減らしうる。従来、腫瘍
関連抗原に対するポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体に結合せしめられたアントラサイクリン化合
物、アドリアマイシン（adriamycin,ADM）またはダウノ
マイシン（daunomycin,DAU）から成るイムノコンジユゲ
ートが知られている〔例えば、J.Gallego et al.,“Pre
paration of Four Daunomycin−Monoclonal Antibody 7
91T/36 Cojugates With Anti−Tumour Activity",Int.
J.Cancer,33,pp.737−44（1984）及びR.Arnon et al.,
“In Vitro And In Vivo Efficacy of Conjugates of D
aunomycin With Anti−Tumor Antibodies",Immunologic
al Rev.62,pp.5−27（1982）参照〕。
アントラサイクリンを抗体に結合せしめるための最も
よく用いられる方法は、アントラサイクリンのアミノ糖
部分の結合を利用するものである。例えば、該アミノ糖
は、過ヨウ素酸ナトリウム処理により酸化され、直接に
該抗体のリジン残基にシツフ塩基の形成を通して結合せ
しめられる〔例えば、E.Hurwitz et al.,“The Covalen
t Binding Of Daunomycin And Adriamycin To Antibodi
es,With Reteution Of Both Drug And Antibody Activi
ties",Cancer Res.,35,pp.1182−86（1975）参照〕。
よく用いられる方法は、アントラサイクリンのアミノ糖
部分の結合を利用するものである。例えば、該アミノ糖
は、過ヨウ素酸ナトリウム処理により酸化され、直接に
該抗体のリジン残基にシツフ塩基の形成を通して結合せ
しめられる〔例えば、E.Hurwitz et al.,“The Covalen
t Binding Of Daunomycin And Adriamycin To Antibodi
es,With Reteution Of Both Drug And Antibody Activi
ties",Cancer Res.,35,pp.1182−86（1975）参照〕。
また別の方法としては、アントラサイクリンのアミノ
糖を抗体のカルボキシル基にカルボジイミド−仲介結合
を通して結合アントラサイクリンを抗体に結合せしめら
れている〔例えば、E.Hurwitz et al.,supra参照〕。さ
らにまた、該薬剤のアミノ糖と抗体のアミノ基とをグル
タルアルデヒドでもつて交差結合（cross−link）せし
めることによりアントラサイクリンを抗体に結合せしめ
られる〔例えば、M.Belles−Isles et al.,“In Vitro
Activity Of Daunomycin−Anti−Alpha Fetoprotein Co
njugate On Mouse Hepatoma Cells",Br.J.Cancer,41,p
p.841−42（1980）参照〕。しかしながら、該アントラ
サイクリンのアミノ糖部分が抗体に対する結合で修飾さ
れている場合には、コンジユゲート化された薬剤の細胞
毒活性が失なわれていることがイミノコンジユゲートで
の研究によつて示されている〔例えば、R.Arnon et a
l.,supra pp.7−８参照〕。加えて、アントラサイクリ
ンアナローグについての研究は、該アミノ糖におけるア
ントラサイクリンの修飾は、その親である薬剤に比して
そのアナローグ薬剤の細胞毒活性を減少せしめることに
なることを示している〔例えば、K.Yamamoto et al.“A
ntitumor Activity Of Some Derivatives Of Daunomyci
n At The Amino And Methyl Ketone Functions,“J.Me
d.Chem.,15,pp.872−75（1972）参照〕。
糖を抗体のカルボキシル基にカルボジイミド−仲介結合
を通して結合アントラサイクリンを抗体に結合せしめら
れている〔例えば、E.Hurwitz et al.,supra参照〕。さ
らにまた、該薬剤のアミノ糖と抗体のアミノ基とをグル
タルアルデヒドでもつて交差結合（cross−link）せし
めることによりアントラサイクリンを抗体に結合せしめ
られる〔例えば、M.Belles−Isles et al.,“In Vitro
Activity Of Daunomycin−Anti−Alpha Fetoprotein Co
njugate On Mouse Hepatoma Cells",Br.J.Cancer,41,p
p.841−42（1980）参照〕。しかしながら、該アントラ
サイクリンのアミノ糖部分が抗体に対する結合で修飾さ
れている場合には、コンジユゲート化された薬剤の細胞
毒活性が失なわれていることがイミノコンジユゲートで
の研究によつて示されている〔例えば、R.Arnon et a
l.,supra pp.7−８参照〕。加えて、アントラサイクリ
ンアナローグについての研究は、該アミノ糖におけるア
ントラサイクリンの修飾は、その親である薬剤に比して
そのアナローグ薬剤の細胞毒活性を減少せしめることに
なることを示している〔例えば、K.Yamamoto et al.“A
ntitumor Activity Of Some Derivatives Of Daunomyci
n At The Amino And Methyl Ketone Functions,“J.Me
d.Chem.,15,pp.872−75（1972）参照〕。
該アントラサイクリン、すなわちダウノマイシンを、
該薬剤の14−位炭素（Ｃ−14）部位で抗体に直接結合し
たところの別のイムノコンジユゲートが製造されてい
る。しかしながら、これらのイムノコンジユゲートの腫
瘍細胞に対する細胞毒活性の選択性はその再現性が容易
なものでなく、20μg/mlの濃度でのみ確実にそれが示さ
れるものであつた〔J.Gallego et al.,supra参照〕。
該薬剤の14−位炭素（Ｃ−14）部位で抗体に直接結合し
たところの別のイムノコンジユゲートが製造されてい
る。しかしながら、これらのイムノコンジユゲートの腫
瘍細胞に対する細胞毒活性の選択性はその再現性が容易
なものでなく、20μg/mlの濃度でのみ確実にそれが示さ
れるものであつた〔J.Gallego et al.,supra参照〕。
特願昭59−274658号明細書（特開昭61−155344号公
報）には、13位のケト基のアシルヒドラゾン結合を介し
て抗体に結合するアントラサイクリンコンジユゲートが
開示されている。このコンジユゲーシヨン化は、抗体を
誘導体化するし、次にその誘導体をアントラサイクリン
と反応させることを含む方法を用いて行なわれる。該抗
体の誘導体化は望ましくない非特異的な反応が含まれ、
大変にアントラサイクリン：抗体比が低いものが得られ
ることからこれらの方法は良い方法ではない。
報）には、13位のケト基のアシルヒドラゾン結合を介し
て抗体に結合するアントラサイクリンコンジユゲートが
開示されている。このコンジユゲーシヨン化は、抗体を
誘導体化するし、次にその誘導体をアントラサイクリン
と反応させることを含む方法を用いて行なわれる。該抗
体の誘導体化は望ましくない非特異的な反応が含まれ、
大変にアントラサイクリン：抗体比が低いものが得られ
ることからこれらの方法は良い方法ではない。
その第一の方法に従えば、抗体はヒドラジンの存在下
にカルボジイミドで処理され、ヒドラジド抗体誘導体と
し、次にアントラサイクリンと反応させ、該アトラサイ
クリンを直接に抗体骨格に結合させる。しかしながら、
得られたイムノコンジユゲートは、該抗体分子がアグリ
ゲートしやすい。さらに、本方法は抗体分子上のカルボ
ン酸基が必要であるが、その数は限られていることか
ら、これらのイムノコンジユゲートは、アントラサイク
リン：抗体比が低い（約1.1−1.3）。
にカルボジイミドで処理され、ヒドラジド抗体誘導体と
し、次にアントラサイクリンと反応させ、該アトラサイ
クリンを直接に抗体骨格に結合させる。しかしながら、
得られたイムノコンジユゲートは、該抗体分子がアグリ
ゲートしやすい。さらに、本方法は抗体分子上のカルボ
ン酸基が必要であるが、その数は限られていることか
ら、これらのイムノコンジユゲートは、アントラサイク
リン：抗体比が低い（約1.1−1.3）。
その第２の方法は、該抗体とコハク酸無水物とを反応
させ、抗体のアミド酸誘導体とする方法を含むものであ
る。次にこの誘導体をヒドラジンと反応させ、抗体ヒド
ラジド誘導体を得、次にこれをアントラサイクリン化合
物、ダウノマイシンと反応させる。この第２の方法はそ
の抗体誘導体とヒドラジンとの反応は非特異的なもので
あり、所望のヒドラジド誘導体に加えて、種々の抗体誘
導体の混合物の形成に導びく点に問題がある。このよう
に、特願274658号に示されているように、抗体に対する
アントラサイクリンのモル比は、大変に低いものである
（約１である、特願274658号 第264頁，第１欄）。ま
た、欧州特許出願公開第294294号には、抗体の糖類基
に、アントラサイクリンのＣ−13ヒドラゾン誘導体をコ
ンジユゲート化したものが開示されている。
させ、抗体のアミド酸誘導体とする方法を含むものであ
る。次にこの誘導体をヒドラジンと反応させ、抗体ヒド
ラジド誘導体を得、次にこれをアントラサイクリン化合
物、ダウノマイシンと反応させる。この第２の方法はそ
の抗体誘導体とヒドラジンとの反応は非特異的なもので
あり、所望のヒドラジド誘導体に加えて、種々の抗体誘
導体の混合物の形成に導びく点に問題がある。このよう
に、特願274658号に示されているように、抗体に対する
アントラサイクリンのモル比は、大変に低いものである
（約１である、特願274658号 第264頁，第１欄）。ま
た、欧州特許出願公開第294294号には、抗体の糖類基
に、アントラサイクリンのＣ−13ヒドラゾン誘導体をコ
ンジユゲート化したものが開示されている。
また、その他のアントラサイクリンヒドラゾンが、
Ｇ。L.Tong et al.,J.Med.Chem.,21,pp.732−37（197
8）T.Smith et al.,J.Med.Chem.,21,pp.280−83（197
8）；及びR.T.C.Brownlee et al.,J.Chem.Soc.pp.659−
61（1986）に開示されている。また米国特許第4,112,21
7号には、ダウノマイシン及びアドリアマイシンのビス
−ヒドラゾンが開示されている。
Ｇ。L.Tong et al.,J.Med.Chem.,21,pp.732−37（197
8）T.Smith et al.,J.Med.Chem.,21,pp.280−83（197
8）；及びR.T.C.Brownlee et al.,J.Chem.Soc.pp.659−
61（1986）に開示されている。また米国特許第4,112,21
7号には、ダウノマイシン及びアドリアマイシンのビス
−ヒドラゾンが開示されている。
また他の研究においては、アントラサイクリンは、そ
の細胞毒性を高めるため及びその薬剤の毒性を減らすた
め、デキストランまたはポリグルタミン酸のような高分
子担体に結合せしめられている〔例えば、R.Arnon et a
l.,supra.p.5及びE.Hurwitz et al.,“Soluble Macromo
lecules As Carriers For Daunorubicin",J.Appl.Bioch
em.,2,pp.25−35（1980）参照〕。これらの担体結合ア
ントラサイクリンも腫瘍関連抗原に対する抗体に共有結
合せられ、腫瘍細胞に対して特異性を持つように細胞毒
薬剤のターゲツテイングがなされるようイムノコンジユ
ゲート形成されている。例えば、アドリアマイシンは、
カルボキシメチル−デキストランヒドラジド結合を介し
て「抗腫瘍」抗体に結合せしめられ、該アドリアマイシ
ン分子は、アドリアマイシンのテトラサイクリン環のＣ
−13位カルボニル側鎖位でカルボキシメチルデキストラ
ンのヒドラジン誘導体に結合している。次に抗体を該デ
キストランヒドラジド誘導体とグルタルアルデヒドでも
つて結合せしめ、アドリアマイシン−デキストラン−抗
体コンジユゲートを形成せしめる〔R.Arnon et al.,“M
onclonal Antibodies As Carriers For Immunotargetin
g Of Drugs",Monoclonal Antibodies For Cancer Detec
tion And Therapy,R.W.Baldwin et al.（eds.）,pp.365
−83（1985）及びE.Hurwitz et al.,“A Conjugate Of
Adriamycim And Monoclonal Antibodies To Thy−1 Ant
igen Inhibits Human Neuroblastome Cells In Vitro",
Ann.N.Y.Acad.Sci.,417,pp.125−36（1983）参照〕。
の細胞毒性を高めるため及びその薬剤の毒性を減らすた
め、デキストランまたはポリグルタミン酸のような高分
子担体に結合せしめられている〔例えば、R.Arnon et a
l.,supra.p.5及びE.Hurwitz et al.,“Soluble Macromo
lecules As Carriers For Daunorubicin",J.Appl.Bioch
em.,2,pp.25−35（1980）参照〕。これらの担体結合ア
ントラサイクリンも腫瘍関連抗原に対する抗体に共有結
合せられ、腫瘍細胞に対して特異性を持つように細胞毒
薬剤のターゲツテイングがなされるようイムノコンジユ
ゲート形成されている。例えば、アドリアマイシンは、
カルボキシメチル−デキストランヒドラジド結合を介し
て「抗腫瘍」抗体に結合せしめられ、該アドリアマイシ
ン分子は、アドリアマイシンのテトラサイクリン環のＣ
−13位カルボニル側鎖位でカルボキシメチルデキストラ
ンのヒドラジン誘導体に結合している。次に抗体を該デ
キストランヒドラジド誘導体とグルタルアルデヒドでも
つて結合せしめ、アドリアマイシン−デキストラン−抗
体コンジユゲートを形成せしめる〔R.Arnon et al.,“M
onclonal Antibodies As Carriers For Immunotargetin
g Of Drugs",Monoclonal Antibodies For Cancer Detec
tion And Therapy,R.W.Baldwin et al.（eds.）,pp.365
−83（1985）及びE.Hurwitz et al.,“A Conjugate Of
Adriamycim And Monoclonal Antibodies To Thy−1 Ant
igen Inhibits Human Neuroblastome Cells In Vitro",
Ann.N.Y.Acad.Sci.,417,pp.125−36（1983）参照〕。
しかしながら、その担体の使用は、ある種の欠点を伴
なう。例えば、担体含有イムノコンジユゲートはその大
きさがかなり大きくて、生体内で細胞内皮系によつてす
みやかに除去される〔例えば、R.O.Dillman et al.,“P
reclinical Trials With Combinations And Conjugates
Of T101 Monoclonal Antibody And Doxorubicin",Canc
er Res.,46,pp.4886−91（1986）参照〕。このすみおか
な担体含有イムノコンジユゲートの除去は、該コンジユ
ゲート化された薬剤が、その作用すると考えられる部
位、すなわち、殺されるべき特定の細胞群にまで決して
到達し得ないことから治療上優れているとはできない。
加えて、高分子担体が存在すると、そのイムノコンジユ
ゲートの安定性にマイナスの効果を及ぼし、該コンジユ
ゲートの抗体の結合活性を減少せしめることが示されて
いる〔例えば、M.J.Embleton et al.,“Antibody Targe
ting Of Anti−Concer Agents",Monoclonal Antibodies
For Cancer Detection And Therapy,R.W.Baldwin et a
l.（eds.）,pp,323−24（1985）参照〕。さらに、腫瘍
細胞についての研究で、高分子担体含有イムノコンジユ
ゲートが生体内で腫瘍細胞に集まることができるとの証
拠は何もない。C.H.J.Ford et al.,“Localization And
Toxicity Study Of A Vindesine−Anti−CEA Conjugat
e In Patients With Advanced Cancer",Br.J.Cancer.
“Br.J.Cancer,47,35−42（1983）には、直接にコンジ
ユゲート化された薬剤−抗体コンジユゲートが生体内で
腫瘍細胞に分布していることが示されているのと対比さ
れる。
なう。例えば、担体含有イムノコンジユゲートはその大
きさがかなり大きくて、生体内で細胞内皮系によつてす
みやかに除去される〔例えば、R.O.Dillman et al.,“P
reclinical Trials With Combinations And Conjugates
Of T101 Monoclonal Antibody And Doxorubicin",Canc
er Res.,46,pp.4886−91（1986）参照〕。このすみおか
な担体含有イムノコンジユゲートの除去は、該コンジユ
ゲート化された薬剤が、その作用すると考えられる部
位、すなわち、殺されるべき特定の細胞群にまで決して
到達し得ないことから治療上優れているとはできない。
加えて、高分子担体が存在すると、そのイムノコンジユ
ゲートの安定性にマイナスの効果を及ぼし、該コンジユ
ゲートの抗体の結合活性を減少せしめることが示されて
いる〔例えば、M.J.Embleton et al.,“Antibody Targe
ting Of Anti−Concer Agents",Monoclonal Antibodies
For Cancer Detection And Therapy,R.W.Baldwin et a
l.（eds.）,pp,323−24（1985）参照〕。さらに、腫瘍
細胞についての研究で、高分子担体含有イムノコンジユ
ゲートが生体内で腫瘍細胞に集まることができるとの証
拠は何もない。C.H.J.Ford et al.,“Localization And
Toxicity Study Of A Vindesine−Anti−CEA Conjugat
e In Patients With Advanced Cancer",Br.J.Cancer.
“Br.J.Cancer,47,35−42（1983）には、直接にコンジ
ユゲート化された薬剤−抗体コンジユゲートが生体内で
腫瘍細胞に分布していることが示されているのと対比さ
れる。
このように、特定の結合及び担体（キヤリヤー）を用
いての抗体へのアントラサイクリンのコンジユゲート化
が示されている。上記概説したように、これらのイムノ
コジユゲートの使用は、使用される特定の結合または担
体に依存するところの明らかな欠点をもたらす。
いての抗体へのアントラサイクリンのコンジユゲート化
が示されている。上記概説したように、これらのイムノ
コジユゲートの使用は、使用される特定の結合または担
体に依存するところの明らかな欠点をもたらす。
ある種のイガンド−トキシンコンジユゲートもまた知
られている。例えば、I.Pastanの米国特許第4,545,985
号には多くのEGFレセプターを持つている細胞に対して
使用するためのシユードモナス（Pseudomonas）エンド
トキシン（PE）がEGFに1:2の比で結合せしめられている
エンドトキシンコンジユゲートが開示されている。また
EGF−リシンＡ及びEGF−ジフテリアトキシンコンジユゲ
ートも作られている〔例えば、D.B.Cawley et al.,“Ep
idermal Growth Factor−Toxin A Chain Conjugates:EG
F−Ricin A Is A Potent Toxin While EGF−Diphtheria
Fragment A Is Nontoxic",Cell,22,pp.568−70（198
0）及び、N.Shimizu et al.,“A Cytotoxic Epidermal
Growth Factor Cross−Linked To Diphtheria Toxin A
−Fragment",FEBS Letters,118（No.2）、pp.274−78
（1980）参照〕。さらに、シユードモナスエンドトキシ
ン融合タンパク質は、TGF−α、IL−２、IL−６及びCD4
のようなタンパク質、ポリペプチド及び増殖因子（grow
th factor）を用いて製造される〔例えば、I.Pastan et
al.,“Novel Cytotoxic Agents Created By The Fusio
n Of Growth Factor And Toxin Genes",Fourth Interna
tl.Conference On Monoclonal Antibody Immunoconjuga
tes For Cancer,p.36（３月30日−４月１日、1989）H.L
orberboum et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.1922
−26（1988）;V.K.Chaudhary et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,84,pp.4538−42（1987）;C.B.Siegall et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.9738−42（1988）；及び
V.K.Chaudhary et al.,Nature,335,pp.369−72（1988）
参照〕。そして、ジフテリアトキシン−α−メラノサイ
ト刺激ホルモン融合タンパク質も作られている〔J.R.Mu
rphy et al.,“Genetic Construction,Expression And
Melanoma−Selective Cytotoxieity Of A Diphtheria T
oxin−Related α−Melanocyte−Stimulating Hormone
Fusion Protein",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,pp.8258
−62（1986）及びJ.R.Murphyの米国特許第4,675,382号
参照〕。しかしながら、タンパク質トキシンを含有する
リガンドコンジユゲートは、異種の宿主体において免疫
原性を示す傾向がある また、ADMまたはDAUのようなアントラサイクリンは、
トランスフエリン〔英国特許第出願第2116979A号参照〕
又はメラノトロピン（melanotropin）〔J.M.Varga et a
l.,“Melanotropin−Daunomycin Conjugate Shows Rece
ptor−Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Me
lanoma Cells",Nature,267,pp.56−58（1977）参照〕の
ようなある種のタンパク質又はポリペプチドガンドに化
学的に結合せしめられた。更に、PCT特許出願公開WO88
−00837（ダウノマイシンのような細胞毒物質にポリマ
ー担体を介して結合したEGF）及び米国特許第4,522,750
号並びに米国特許第4,590,001号（それぞれヴインカア
ルカロイド及び白金に結合したトランスフエリン）参
照。
られている。例えば、I.Pastanの米国特許第4,545,985
号には多くのEGFレセプターを持つている細胞に対して
使用するためのシユードモナス（Pseudomonas）エンド
トキシン（PE）がEGFに1:2の比で結合せしめられている
エンドトキシンコンジユゲートが開示されている。また
EGF−リシンＡ及びEGF−ジフテリアトキシンコンジユゲ
ートも作られている〔例えば、D.B.Cawley et al.,“Ep
idermal Growth Factor−Toxin A Chain Conjugates:EG
F−Ricin A Is A Potent Toxin While EGF−Diphtheria
Fragment A Is Nontoxic",Cell,22,pp.568−70（198
0）及び、N.Shimizu et al.,“A Cytotoxic Epidermal
Growth Factor Cross−Linked To Diphtheria Toxin A
−Fragment",FEBS Letters,118（No.2）、pp.274−78
（1980）参照〕。さらに、シユードモナスエンドトキシ
ン融合タンパク質は、TGF−α、IL−２、IL−６及びCD4
のようなタンパク質、ポリペプチド及び増殖因子（grow
th factor）を用いて製造される〔例えば、I.Pastan et
al.,“Novel Cytotoxic Agents Created By The Fusio
n Of Growth Factor And Toxin Genes",Fourth Interna
tl.Conference On Monoclonal Antibody Immunoconjuga
tes For Cancer,p.36（３月30日−４月１日、1989）H.L
orberboum et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.1922
−26（1988）;V.K.Chaudhary et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,84,pp.4538−42（1987）;C.B.Siegall et al.,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,85,pp.9738−42（1988）；及び
V.K.Chaudhary et al.,Nature,335,pp.369−72（1988）
参照〕。そして、ジフテリアトキシン−α−メラノサイ
ト刺激ホルモン融合タンパク質も作られている〔J.R.Mu
rphy et al.,“Genetic Construction,Expression And
Melanoma−Selective Cytotoxieity Of A Diphtheria T
oxin−Related α−Melanocyte−Stimulating Hormone
Fusion Protein",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,pp.8258
−62（1986）及びJ.R.Murphyの米国特許第4,675,382号
参照〕。しかしながら、タンパク質トキシンを含有する
リガンドコンジユゲートは、異種の宿主体において免疫
原性を示す傾向がある また、ADMまたはDAUのようなアントラサイクリンは、
トランスフエリン〔英国特許第出願第2116979A号参照〕
又はメラノトロピン（melanotropin）〔J.M.Varga et a
l.,“Melanotropin−Daunomycin Conjugate Shows Rece
ptor−Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Me
lanoma Cells",Nature,267,pp.56−58（1977）参照〕の
ようなある種のタンパク質又はポリペプチドガンドに化
学的に結合せしめられた。更に、PCT特許出願公開WO88
−00837（ダウノマイシンのような細胞毒物質にポリマ
ー担体を介して結合したEGF）及び米国特許第4,522,750
号並びに米国特許第4,590,001号（それぞれヴインカア
ルカロイド及び白金に結合したトランスフエリン）参
照。
（課題の解決） 本発明は攻撃を受けるべく（又は殺傷されるべく）選
択された（又は特定された）標的（ターゲット）細胞群
と反応し得るリガンドにリンカーアームを介して細胞毒
性のアントラサイクリン分子を結合した新規なアントラ
サイクリンーリガンドコンジュゲート、及び少なくとも
１つの該コンジュゲートを有効成分として含む選択され
た細胞群の攻撃用薬剤を提供する。この細胞反応性分子
はボンベシン又はEGFのようなリガンドであることがで
きる。
択された（又は特定された）標的（ターゲット）細胞群
と反応し得るリガンドにリンカーアームを介して細胞毒
性のアントラサイクリン分子を結合した新規なアントラ
サイクリンーリガンドコンジュゲート、及び少なくとも
１つの該コンジュゲートを有効成分として含む選択され
た細胞群の攻撃用薬剤を提供する。この細胞反応性分子
はボンベシン又はEGFのようなリガンドであることがで
きる。
本発明の具体例の一つに従えば、多くのアントラサイ
クリン分子が特定のターゲツト細胞群の一つ（selected
traget cell population）と反応性の抗体に結合させ
られる。各々のアントラサイクリンは、リンカーアーム
を介して該抗体に結合せしめられ、該アントラサイクリ
ンは、その13−ケト位のアシルヒドラゾン結合を介して
該リンカーに結合して、本発明の新規イムノコンジユゲ
ートを形成する。例えば、本発明の好ましい具体例とし
ては、新規なアンドリアマイシンヒドラゾン誘導体（AD
M−HZN）の合成があげられ、そのADM−HZNは次にチオー
ル化された抗体と縮合せしめられて、該アントラサイク
リンをリンカーアームを介して該抗体に結合せしめてい
る。該ADMのＣ−13位に形成せしめられたアシルヒドラ
ゾン結合は、該ADMを該リンカーに結合せしめるサイト
としての働きをする。さらに、ジスルフイド結合は、抗
体結合サイトとしての該リンカー中な存在している。本
発明の他の好ましい具体例に従えば、該ADM−HZNは還元
せしめられて、スルフヒドリル基を形成し、そして得ら
れる新規なヒドラゾン誘導体は、マレイミド誘導体化さ
れた抗体を縮合せしめられる。これは、ADMのＣ−13位
に結合するリンカーサイトとしてのアシルヒドラゾン結
合を有するリンカーアームと、抗体に結合するリンカー
部としての該リンカ中のチオエーテル結合の形成に導
く。
クリン分子が特定のターゲツト細胞群の一つ（selected
traget cell population）と反応性の抗体に結合させ
られる。各々のアントラサイクリンは、リンカーアーム
を介して該抗体に結合せしめられ、該アントラサイクリ
ンは、その13−ケト位のアシルヒドラゾン結合を介して
該リンカーに結合して、本発明の新規イムノコンジユゲ
ートを形成する。例えば、本発明の好ましい具体例とし
ては、新規なアンドリアマイシンヒドラゾン誘導体（AD
M−HZN）の合成があげられ、そのADM−HZNは次にチオー
ル化された抗体と縮合せしめられて、該アントラサイク
リンをリンカーアームを介して該抗体に結合せしめてい
る。該ADMのＣ−13位に形成せしめられたアシルヒドラ
ゾン結合は、該ADMを該リンカーに結合せしめるサイト
としての働きをする。さらに、ジスルフイド結合は、抗
体結合サイトとしての該リンカー中な存在している。本
発明の他の好ましい具体例に従えば、該ADM−HZNは還元
せしめられて、スルフヒドリル基を形成し、そして得ら
れる新規なヒドラゾン誘導体は、マレイミド誘導体化さ
れた抗体を縮合せしめられる。これは、ADMのＣ−13位
に結合するリンカーサイトとしてのアシルヒドラゾン結
合を有するリンカーアームと、抗体に結合するリンカー
部としての該リンカ中のチオエーテル結合の形成に導
く。
本発明の更に別の好ましい具体例に従えば、該新規AD
M−HZNの中間体は、チオール化されたリガンド、例え
ば、ボムベシン、トランスフエリンまたはEGFのような
チオール化されたリガンドに共有結合され、該アントラ
サイクリンをリンカーアームを介して該リガンドに結合
せしめる。上記した他の具体例におけるように、該アン
トラサイクリンは、そのＣ−13位において形成せしめら
れたアシルヒドラゾン結合を介して該リンカーに結合せ
しめられる。加えて、ジスルフイド結合またはチオエー
テル結合は、該リンカー骨格中に存在していてもよい。
これらの具体的な態様から明らかなように、本発明は、
また本発明のコンジユゲートを製造するにあたり有用な
アントラサイクリンの新規アシルヒドラゾン誘導体を提
供する。
M−HZNの中間体は、チオール化されたリガンド、例え
ば、ボムベシン、トランスフエリンまたはEGFのような
チオール化されたリガンドに共有結合され、該アントラ
サイクリンをリンカーアームを介して該リガンドに結合
せしめる。上記した他の具体例におけるように、該アン
トラサイクリンは、そのＣ−13位において形成せしめら
れたアシルヒドラゾン結合を介して該リンカーに結合せ
しめられる。加えて、ジスルフイド結合またはチオエー
テル結合は、該リンカー骨格中に存在していてもよい。
これらの具体的な態様から明らかなように、本発明は、
また本発明のコンジユゲートを製造するにあたり有用な
アントラサイクリンの新規アシルヒドラゾン誘導体を提
供する。
さらに詳しくは、本発明は、攻撃を受けるべく選択さ
れた細胞群と反応するリガンドに結合した少なくとも１
つのアントラサイクリン分子からなり、該アントラサイ
クリンはＣ−13位にケト基をもち且つ該リガンドにリン
カーアームを介して連結し、該リンカーアームは該アン
トラサイクリンの13−ケト位でアシルヒドラゾン結合に
よって該アントラサイクリンと共有結合しそしてさらに
ジスルフィド又はチオエーテル結合によって該リガンド
と共有結合し、該リガンドはボンベシン、EGF、トラン
スフェリン、ガストリン、ガストリン−放出ペプチド、
血小板由来増殖因子、IL−２、IL−６、TGF−α、VGF、
TGF−β、インスリン、及びインスリン様増殖因子Ｉ及
びIIからなる群から選ばれることを特徴とするアントラ
サイクリン−リガンドコンジュゲート、及び該アントラ
サイクリン−リガンドコンジュゲートの少なくとも１種
を有効成分として含む選択された細胞群の攻撃用薬剤を
提供する。
れた細胞群と反応するリガンドに結合した少なくとも１
つのアントラサイクリン分子からなり、該アントラサイ
クリンはＣ−13位にケト基をもち且つ該リガンドにリン
カーアームを介して連結し、該リンカーアームは該アン
トラサイクリンの13−ケト位でアシルヒドラゾン結合に
よって該アントラサイクリンと共有結合しそしてさらに
ジスルフィド又はチオエーテル結合によって該リガンド
と共有結合し、該リガンドはボンベシン、EGF、トラン
スフェリン、ガストリン、ガストリン−放出ペプチド、
血小板由来増殖因子、IL−２、IL−６、TGF−α、VGF、
TGF−β、インスリン、及びインスリン様増殖因子Ｉ及
びIIからなる群から選ばれることを特徴とするアントラ
サイクリン−リガンドコンジュゲート、及び該アントラ
サイクリン−リガンドコンジュゲートの少なくとも１種
を有効成分として含む選択された細胞群の攻撃用薬剤を
提供する。
本発明のイムノコンジユゲートは、おおよそ４−10の
モル比のアントラサイクリン：抗体のもので、特定のタ
ーゲツト細胞を殺傷するための抗体活性及び細胞毒薬剤
活性の両方を保持している。本明細書に記載のアントラ
サイクリン−リガンドコンジユゲートとしては、少なく
とも１のアントラサイクリン：リガンド比を持ち、レセ
プター（receptor）結合活性及び細胞毒薬剤活性の両方
を持つものであることができる。該アントラサイクリン
のこれらコンジユゲートのリンカーアーム部への結合部
位（サイト）に存在する酸に感受性を有するヒドラゾン
結合、そしてさらには本発明の好的な具体的態様におけ
る該リンカーアーム内のジスルフイド結合またはチオエ
ーテル結合は、細胞内、例えばリソゾーム小胞中で遭遇
するような典型的な条件のような還元的及び酸性条件で
活性を有する薬物を放出するのに理論的に適している。
モル比のアントラサイクリン：抗体のもので、特定のタ
ーゲツト細胞を殺傷するための抗体活性及び細胞毒薬剤
活性の両方を保持している。本明細書に記載のアントラ
サイクリン−リガンドコンジユゲートとしては、少なく
とも１のアントラサイクリン：リガンド比を持ち、レセ
プター（receptor）結合活性及び細胞毒薬剤活性の両方
を持つものであることができる。該アントラサイクリン
のこれらコンジユゲートのリンカーアーム部への結合部
位（サイト）に存在する酸に感受性を有するヒドラゾン
結合、そしてさらには本発明の好的な具体的態様におけ
る該リンカーアーム内のジスルフイド結合またはチオエ
ーテル結合は、細胞内、例えばリソゾーム小胞中で遭遇
するような典型的な条件のような還元的及び酸性条件で
活性を有する薬物を放出するのに理論的に適している。
本発明のコンジユゲートは、医薬組成物、すなわち医
薬上有効な量の本発明のコンジユゲートの少なくとも一
つと薬学上許容しうる担体とからなる医薬組成物のよう
なものに使用されうる。本発明はまた、排除することが
望まれるターゲツト細胞の特定の群の一つに、細胞毒薬
剤を選択的にデリバーするための方法並びに医薬上有効
な量の本発明の組成物でもつて、医薬上許容される方法
で哺乳動物を処置する方法に関する。
薬上有効な量の本発明のコンジユゲートの少なくとも一
つと薬学上許容しうる担体とからなる医薬組成物のよう
なものに使用されうる。本発明はまた、排除することが
望まれるターゲツト細胞の特定の群の一つに、細胞毒薬
剤を選択的にデリバーするための方法並びに医薬上有効
な量の本発明の組成物でもつて、医薬上許容される方法
で哺乳動物を処置する方法に関する。
優利には、本明細書において開示されたコンジユゲー
ト、医薬組成物及びその方法は、癌及びその他の腫瘍、
非殺細胞性のウイルス感染症またはその他の病原性感染
症、及び自己免疫疾患のような疾病を治療するにあた
り、特定のターゲツト細胞の群の一つを選択的に殺傷す
るために、細胞毒性を有するアントラサイクリン薬物を
該特定の細胞群の一つにターゲツテイングするための有
効な方法を提供する。
ト、医薬組成物及びその方法は、癌及びその他の腫瘍、
非殺細胞性のウイルス感染症またはその他の病原性感染
症、及び自己免疫疾患のような疾病を治療するにあた
り、特定のターゲツト細胞の群の一つを選択的に殺傷す
るために、細胞毒性を有するアントラサイクリン薬物を
該特定の細胞群の一つにターゲツテイングするための有
効な方法を提供する。
以下本発明を更に詳細に説明する。本明細書中に開示
されている本発明をより完全に理解する目的で、次によ
り詳細に説明を行なう。
されている本発明をより完全に理解する目的で、次によ
り詳細に説明を行なう。
本発明は、癌及びその他の腫瘍、殺細胞性でないウイ
ルス感染症またはその他の病原性感染症、そして自己免
疫疾患のような病気の治療用に有用な、新規なアントラ
サイクリンコンジユゲート、新規なアントラサイクリン
アシルヒドラゾン誘導体、それらの化合物の製造方法、
それらの医薬組成物、及び排除することが望まれる特定
の細胞群の一つに細胞毒性を持つアントラサイクリンを
デリバーするための方法に関する。特に本発明は、アン
トラサイクリンが13−ケト基のアシルヒドラゾン結合を
介して、排除されることが求められている特定の細胞群
の一つと反応性を有する分子に結合し、排除されること
が求められている特定の細胞群の一つと反応性を有する
分子に少なくとも１個のアントラサイクリン分子が結合
していることからなるアントラサイクリンコンジユゲー
トに関する。該細胞に反応性を有する分子としては、抗
体のようなタンパク質あるいはボムベシンまたはEGFの
ようなリガンドであつてよい。
ルス感染症またはその他の病原性感染症、そして自己免
疫疾患のような病気の治療用に有用な、新規なアントラ
サイクリンコンジユゲート、新規なアントラサイクリン
アシルヒドラゾン誘導体、それらの化合物の製造方法、
それらの医薬組成物、及び排除することが望まれる特定
の細胞群の一つに細胞毒性を持つアントラサイクリンを
デリバーするための方法に関する。特に本発明は、アン
トラサイクリンが13−ケト基のアシルヒドラゾン結合を
介して、排除されることが求められている特定の細胞群
の一つと反応性を有する分子に結合し、排除されること
が求められている特定の細胞群の一つと反応性を有する
分子に少なくとも１個のアントラサイクリン分子が結合
していることからなるアントラサイクリンコンジユゲー
トに関する。該細胞に反応性を有する分子としては、抗
体のようなタンパク質あるいはボムベシンまたはEGFの
ようなリガンドであつてよい。
かくして、本発明の一つの好ましい態様に従えば、本
発明は、ある特定の細胞に対する抗体であつて、その抗
体骨格に結合せられた多くのアントラサイクリン分子を
有する抗体からなるイムノコンジユゲートに関する。該
アントラサイクリン分子は、該抗体に共有結合されてお
り、各薬剤分子と該抗体との間にはリンカーアームが形
成されそして該リンカーは該アントラサイクリンの13−
ケト基の位置のアシルヒドラゾン結合により該アントラ
サイクリンに結合している。本発明の別の好ましい態様
に従えば、本発明は、特定の細胞群の細胞の表面と関連
した１個またはそれ以上のレセプターと反応するところ
のリガンド（ポリペプチドまたはペプチドリガンドのよ
うなリガンド）であつて、その骨格に結合した少なくと
も１個のアントラサイクリン分子を持つリガンドから成
るアントラサイクリン−リガンドコンジユゲートにも関
する。該アントラサイクリンは、アシルヒドラゾン結合
を介して該アントラサイクリンの13−ケト基の位置で該
アントラサイクリンに結合するところのリンカーアーム
によつて該ペプチドに共有結合している。
発明は、ある特定の細胞に対する抗体であつて、その抗
体骨格に結合せられた多くのアントラサイクリン分子を
有する抗体からなるイムノコンジユゲートに関する。該
アントラサイクリン分子は、該抗体に共有結合されてお
り、各薬剤分子と該抗体との間にはリンカーアームが形
成されそして該リンカーは該アントラサイクリンの13−
ケト基の位置のアシルヒドラゾン結合により該アントラ
サイクリンに結合している。本発明の別の好ましい態様
に従えば、本発明は、特定の細胞群の細胞の表面と関連
した１個またはそれ以上のレセプターと反応するところ
のリガンド（ポリペプチドまたはペプチドリガンドのよ
うなリガンド）であつて、その骨格に結合した少なくと
も１個のアントラサイクリン分子を持つリガンドから成
るアントラサイクリン−リガンドコンジユゲートにも関
する。該アントラサイクリンは、アシルヒドラゾン結合
を介して該アントラサイクリンの13−ケト基の位置で該
アントラサイクリンに結合するところのリンカーアーム
によつて該ペプチドに共有結合している。
本発明のコンジユゲートは、最初に新規なアントラサ
イクリン−ヒドラゾン誘導体を形成することからなる多
段工程法によつて製造することができ、その形成された
アントラサイクリン−ヒドラゾン誘導体は次に適当な特
異性を持つところのタンパク質またはリガンドと反応さ
せられるのである〔例えば、抗体における慣用的カツプ
リング方法については、R.R.Hardy,“Purification And
Conpling Of Fluorcscent Proteins For Use In Flow
Cytometry",Handbook Of Experimental Immunology,Vol
ume 1:Immunochemistry,D.M.Weir et al.（eds）.pp.3
1.4−31.12（4th Ed.1986）参照；リガンドコンジユゲ
ートの製造法についてはJ.M.Varga et al.,supra参
照〕。該アントラサイクリンを該コンジユゲートの細胞
と反応性を有する成分に結合せしめるリンカーアームの
長さは、該リンカーの該アントラサイクリンへの結合部
分が該アントラサイクリンのＣ−13位でアシルヒドラゾ
ンのかたちからなる限り種々のものであることができ
る。該リンカーアームは、さらに別の結合（ジスルフイ
ド結合、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート
結合、エーテル結合またはエステル結合のような結合）
を、該薬剤と該細胞と反応性を有する分子との間の結合
部の間のいずれかの部分に有していることができを。
イクリン−ヒドラゾン誘導体を形成することからなる多
段工程法によつて製造することができ、その形成された
アントラサイクリン−ヒドラゾン誘導体は次に適当な特
異性を持つところのタンパク質またはリガンドと反応さ
せられるのである〔例えば、抗体における慣用的カツプ
リング方法については、R.R.Hardy,“Purification And
Conpling Of Fluorcscent Proteins For Use In Flow
Cytometry",Handbook Of Experimental Immunology,Vol
ume 1:Immunochemistry,D.M.Weir et al.（eds）.pp.3
1.4−31.12（4th Ed.1986）参照；リガンドコンジユゲ
ートの製造法についてはJ.M.Varga et al.,supra参
照〕。該アントラサイクリンを該コンジユゲートの細胞
と反応性を有する成分に結合せしめるリンカーアームの
長さは、該リンカーの該アントラサイクリンへの結合部
分が該アントラサイクリンのＣ−13位でアシルヒドラゾ
ンのかたちからなる限り種々のものであることができ
る。該リンカーアームは、さらに別の結合（ジスルフイ
ド結合、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート
結合、エーテル結合またはエステル結合のような結合）
を、該薬剤と該細胞と反応性を有する分子との間の結合
部の間のいずれかの部分に有していることができを。
本発明のコンジユゲートを含有するところのアントラ
サイクリンは、13位の炭素部（Ｃ−13）にケト基を有す
るいかなるアントラサイクリンであつてもよい。かよう
なアントラサイクリンとしては、特に限定されないが、
アドリアマイシン（adriamycin）、ダウノマイシン（da
unomycin）、デトルビシン（detorubicin）、カルミノ
マイシン（carminomycin）、イダルビシン（idarubici
n）、エピルビシン（epirubicin）、エソルビシン（eso
rubicin）、４′−THF−アドリアマイシン、AD−32及び
３′−デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニ
ル）−ドキソルビシン（doxorubicin）があげられる
〔A.M.Casazza,“Experimental Studies On New Anthra
cyclines",Adriamycin;Its Expanding Role In Cencer
Treatment,M.Ogawa et al.（eds）,pp.439−52（Excerp
ta Medica 1984）参照〕。
サイクリンは、13位の炭素部（Ｃ−13）にケト基を有す
るいかなるアントラサイクリンであつてもよい。かよう
なアントラサイクリンとしては、特に限定されないが、
アドリアマイシン（adriamycin）、ダウノマイシン（da
unomycin）、デトルビシン（detorubicin）、カルミノ
マイシン（carminomycin）、イダルビシン（idarubici
n）、エピルビシン（epirubicin）、エソルビシン（eso
rubicin）、４′−THF−アドリアマイシン、AD−32及び
３′−デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニ
ル）−ドキソルビシン（doxorubicin）があげられる
〔A.M.Casazza,“Experimental Studies On New Anthra
cyclines",Adriamycin;Its Expanding Role In Cencer
Treatment,M.Ogawa et al.（eds）,pp.439−52（Excerp
ta Medica 1984）参照〕。
該コンジユゲートにおいて該アントラサイクリンに結
合しているところの細胞と反応性を有する分子として
は、排除することが求められている細胞群に結合するか
あるいは反応するところのいかなる分子であつてもよい
ということが理解されよう。かような分子としては、そ
れに限定されるわけではないが、抗体のような巨大分子
タンパク質（一般的には、10,000ダルトンよりも大きな
もの）、比較的低分子量のタンパク質（一般的には、1
0,000ダルトンよりも小さなもの）、ポリペプチドまた
はペプチドリガンド、及び非ペプチド性リガンドがあげ
られる。
合しているところの細胞と反応性を有する分子として
は、排除することが求められている細胞群に結合するか
あるいは反応するところのいかなる分子であつてもよい
ということが理解されよう。かような分子としては、そ
れに限定されるわけではないが、抗体のような巨大分子
タンパク質（一般的には、10,000ダルトンよりも大きな
もの）、比較的低分子量のタンパク質（一般的には、1
0,000ダルトンよりも小さなもの）、ポリペプチドまた
はペプチドリガンド、及び非ペプチド性リガンドがあげ
られる。
このように、本発明のイムノコンジユゲートを含むと
ころの抗体は、排除すべきあるいは殺傷すべき（攻撃す
べき）ことが望まれるところの特定の細胞群の一つと反
応性を有するいかなる抗体であつてもよい。このような
抗体の例としては、それには限定されないが、癌腫（ca
rcinoma）、黒色腫（メラノーマ、melanoma）、リンパ
腫（lymphoma）、骨または軟組織の肉腫（sarcoma）並
びにその他の腫瘍に見出される抗原のような腫瘍関連抗
原（tumro−associated antigen）に結合するところの
抗体、ウイルスまたはその他の病原体と関連した抗原に
結合する抗体、及び正常でない（abnormal）細胞の表面
抗原に結合する抗体があげられる。これらの抗体はポリ
クローナル抗体であることもできるし、また好ましくは
モノクローナル抗体であることができ、当該分野でよく
知られた方法を用いて製造することができる〔例えば、
R.A.De Weger et al.,“Eradication of Murine Lympho
ma And Melanoma Cells By Chlorambucil−Antibody Co
mplexes"、Immunological Rev.62、pp.29−45（1982）
（腫瘍特異ポリクローナル抗体の製造及びコジユゲート
への使用）及びM.Yeh et al.,“Cell Surface Antigens
Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibo
dy"、Proc.Natl.Acad.Sci.,76、pp.2927−31（1979）及
びJ.P.Brown et al.,“Structural Chavacterization O
f Human Melanoma Associated Antigen p97 with Monoc
lonal Antibodies"、J.Immunol.,127（No.2）、pp.539
−46（1981）（腫瘍に特異的なモノクローナル抗体の製
造）参照〕。例えば、モノクローナル抗体L6（ヒト肺癌
に特異性を有する）及びモノクローナル抗体791T/36
（骨原性肉腫（osteogenic sareoma〕細胞に特異性を有
する）が使用できる。
ころの抗体は、排除すべきあるいは殺傷すべき（攻撃す
べき）ことが望まれるところの特定の細胞群の一つと反
応性を有するいかなる抗体であつてもよい。このような
抗体の例としては、それには限定されないが、癌腫（ca
rcinoma）、黒色腫（メラノーマ、melanoma）、リンパ
腫（lymphoma）、骨または軟組織の肉腫（sarcoma）並
びにその他の腫瘍に見出される抗原のような腫瘍関連抗
原（tumro−associated antigen）に結合するところの
抗体、ウイルスまたはその他の病原体と関連した抗原に
結合する抗体、及び正常でない（abnormal）細胞の表面
抗原に結合する抗体があげられる。これらの抗体はポリ
クローナル抗体であることもできるし、また好ましくは
モノクローナル抗体であることができ、当該分野でよく
知られた方法を用いて製造することができる〔例えば、
R.A.De Weger et al.,“Eradication of Murine Lympho
ma And Melanoma Cells By Chlorambucil−Antibody Co
mplexes"、Immunological Rev.62、pp.29−45（1982）
（腫瘍特異ポリクローナル抗体の製造及びコジユゲート
への使用）及びM.Yeh et al.,“Cell Surface Antigens
Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibo
dy"、Proc.Natl.Acad.Sci.,76、pp.2927−31（1979）及
びJ.P.Brown et al.,“Structural Chavacterization O
f Human Melanoma Associated Antigen p97 with Monoc
lonal Antibodies"、J.Immunol.,127（No.2）、pp.539
−46（1981）（腫瘍に特異的なモノクローナル抗体の製
造）参照〕。例えば、モノクローナル抗体L6（ヒト肺癌
に特異性を有する）及びモノクローナル抗体791T/36
（骨原性肉腫（osteogenic sareoma〕細胞に特異性を有
する）が使用できる。
また更には、内在化していない（non−internalizn
g）抗体及び好ましくは内在化している（internalizin
g）抗体を使用することができる。本明細書において使
用せられている「抗体」という用語は、インタクト（in
tact）な抗体分子及び該抗体の結合活性を有する領域を
含有するフラグメント、例、FadまたはＦ（ab′）２を
も含むものである。モノクローナル抗体が使用せられる
場合、その抗体は、それには限定されるものではない
が、マウス起源の抗体またはヒト起源の抗体、またはキ
メラ抗体（chimeric antibody）であつてよい。
g）抗体及び好ましくは内在化している（internalizin
g）抗体を使用することができる。本明細書において使
用せられている「抗体」という用語は、インタクト（in
tact）な抗体分子及び該抗体の結合活性を有する領域を
含有するフラグメント、例、FadまたはＦ（ab′）２を
も含むものである。モノクローナル抗体が使用せられる
場合、その抗体は、それには限定されるものではない
が、マウス起源の抗体またはヒト起源の抗体、またはキ
メラ抗体（chimeric antibody）であつてよい。
本明細書において使用せられている「リガンド」とい
う用語は、特定のターゲツト細胞群の細胞表面に結合し
たレセプターに特異的に結合するところのいかなる分子
をも含むことは、理解されよう。本発明のアントラサイ
クリン−リガンドコンジユゲートを形成するために用い
ることのできる好ましいリガンドとしては、それには限
定されないが、トランスフエリン、EGF、ボムベシン、
ガストリン、ガストリン−放出ペプチド、血小板由来増
殖因子、IL−２、IL−６、TGF−α、VGF、TGF−β、イ
ンシユリン、インシユリン様増殖因子Ｉ及びIIのような
タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドリガンドが
あげられる。その他の非ペプチド性リガンドとしては、
ステロイド、糖類（carbohyd rates）及びレクチンがあ
げられる。
う用語は、特定のターゲツト細胞群の細胞表面に結合し
たレセプターに特異的に結合するところのいかなる分子
をも含むことは、理解されよう。本発明のアントラサイ
クリン−リガンドコンジユゲートを形成するために用い
ることのできる好ましいリガンドとしては、それには限
定されないが、トランスフエリン、EGF、ボムベシン、
ガストリン、ガストリン−放出ペプチド、血小板由来増
殖因子、IL−２、IL−６、TGF−α、VGF、TGF−β、イ
ンシユリン、インシユリン様増殖因子Ｉ及びIIのような
タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドリガンドが
あげられる。その他の非ペプチド性リガンドとしては、
ステロイド、糖類（carbohyd rates）及びレクチンがあ
げられる。
このように、本発明のコンジユゲートの細胞と反応性
を有する分子、例えば抗体あるいはリガンドは、該抗体
またはリガンドと反応性を有する特定の細胞群の所に該
アントラサイクリン分子をデリバー（deliver）するよ
うに働くのである。例えば、腫瘍細胞の表面に見出され
る抗原に対する抗体は、該腫瘍細胞に結合し、そのアン
トラサイクリンを該腫瘍細胞にデリバーするし、AIDSを
起こすところのヒト免疫不全症候群ウイルス（Human Im
munodeficiency Virus;HIV）のタンパク質に対する抗体
は、その細胞毒性を有するアントラサイクリンをHIV感
染細胞の所にデリバーするのである。同様に、腫瘍細胞
（癌腫のような腫瘍細胞）は、特に高密度である種のレ
セプター（EGFレセプターのようなレセプター）を発現
するので、EGFのようなリガンドは、癌腫細胞に結合し
て、そのアントラサイクリンを該癌腫細胞にデリバーす
る。
を有する分子、例えば抗体あるいはリガンドは、該抗体
またはリガンドと反応性を有する特定の細胞群の所に該
アントラサイクリン分子をデリバー（deliver）するよ
うに働くのである。例えば、腫瘍細胞の表面に見出され
る抗原に対する抗体は、該腫瘍細胞に結合し、そのアン
トラサイクリンを該腫瘍細胞にデリバーするし、AIDSを
起こすところのヒト免疫不全症候群ウイルス（Human Im
munodeficiency Virus;HIV）のタンパク質に対する抗体
は、その細胞毒性を有するアントラサイクリンをHIV感
染細胞の所にデリバーするのである。同様に、腫瘍細胞
（癌腫のような腫瘍細胞）は、特に高密度である種のレ
セプター（EGFレセプターのようなレセプター）を発現
するので、EGFのようなリガンドは、癌腫細胞に結合し
て、そのアントラサイクリンを該癌腫細胞にデリバーす
る。
該抗体あるいはリガンドが反応するところの特定の細
胞群のサイトの内部あるいはそのサイト部での該薬剤の
放出は、これら特定の細胞を優先的に殺傷することにつ
ながる。かくして、本発明のコンジユゲートは、該コン
ジユゲートの結合を許容するところの細胞表面抗原また
はレセプターを有するところの特定の細胞群であつて、
排除されることが求められるところのいかなる病気の治
療にも有用であることは明らかである。
胞群のサイトの内部あるいはそのサイト部での該薬剤の
放出は、これら特定の細胞を優先的に殺傷することにつ
ながる。かくして、本発明のコンジユゲートは、該コン
ジユゲートの結合を許容するところの細胞表面抗原また
はレセプターを有するところの特定の細胞群であつて、
排除されることが求められるところのいかなる病気の治
療にも有用であることは明らかである。
本発明のコンジユゲートを用いることのできる病気と
しては、それに限定されないが、癌またはその他の腫
瘍、AIDS、ヘルペス、CMV（サイトメガロウイルス）、E
BV（エプスタインバールウイルス）及びSSPE（亜急性硬
化性全脳炎、subacute sclerosis panencephalitis）の
ような殺細胞性のないウイルス感染症またはその他の病
原性感染症、及びリユーマチ性関節炎があげられる。
しては、それに限定されないが、癌またはその他の腫
瘍、AIDS、ヘルペス、CMV（サイトメガロウイルス）、E
BV（エプスタインバールウイルス）及びSSPE（亜急性硬
化性全脳炎、subacute sclerosis panencephalitis）の
ような殺細胞性のないウイルス感染症またはその他の病
原性感染症、及びリユーマチ性関節炎があげられる。
理論的に裏付けられている訳ではないが、抗体と結合
したアントラサイクリン分子またはリガンドと結合した
アントラサイクリン分子、すなわち、本発明のコンジユ
ゲートの形態にある抗体あるいはリガンドと結合したア
ントラサイクリン分子は、その抗体またはリガンドの有
する特異性を介して殺傷されるべきターゲツト細胞中に
デリバーされ、次に細胞膜に結合したコンジユゲート化
されていない抗体あるいはリガンドが内在化されるのと
同じエンドサイト−シス経路を介して該細胞の中に入る
と思われる〔例えば、I.Pastan et al.,“Pathway Of E
ndocytosis"、Endocytosis,I.Pastan et al.（eds）、p
p.1−44（Plenum Press 1985）参照〕。
したアントラサイクリン分子またはリガンドと結合した
アントラサイクリン分子、すなわち、本発明のコンジユ
ゲートの形態にある抗体あるいはリガンドと結合したア
ントラサイクリン分子は、その抗体またはリガンドの有
する特異性を介して殺傷されるべきターゲツト細胞中に
デリバーされ、次に細胞膜に結合したコンジユゲート化
されていない抗体あるいはリガンドが内在化されるのと
同じエンドサイト−シス経路を介して該細胞の中に入る
と思われる〔例えば、I.Pastan et al.,“Pathway Of E
ndocytosis"、Endocytosis,I.Pastan et al.（eds）、p
p.1−44（Plenum Press 1985）参照〕。
一旦細胞内に入ると、該コンジユゲートを含んでいる
エンドサイト−シス顆粒は、リソゾーム（primary lyso
some）と融合して、新たなリソゾーム（seeondary lyso
some）を形成する〔例えば、M.J.Embleton et al.,supr
a,p.334参照〕。該アントラサイクリン分子は酸に感受
性を有するアシルヒドラゾン結合を介して該コンジユゲ
ートの抗体またはリガンド成分に結合しているので、該
コンジユゲートが該エンドサイト−シス顆粒あるいはリ
ソゾームの酸性環境にさらされると、そのコンジユゲー
トから該アントラサイクリンを放出（遊離）することに
なる。さらに、放出されたアントラサイクリンは充分な
細胞毒活性を示すところの比較的に修飾のなされていな
い薬剤であるものと思われる。かくして、該コンジユゲ
ートの酸に感受性であるヒドラゾン結合は、細胞毒性を
有する薬剤をターゲツト細胞内で放出するに非常に優れ
た利点を有しており、該コンジユゲートのそれらの細胞
に対する細胞毒活性をいつそう高めているのである。ま
た、一方該ヒドラゾン結合は、ターゲツト細胞のすぐ外
部の部分あるいはターゲツト細胞をとり囲む部分（例え
ば、腫瘍部位）の酸性あるいは還元性の条件のもとで開
裂することができ、その遊離した薬剤は、該腫瘍細胞に
より取り込まれうるのである。
エンドサイト−シス顆粒は、リソゾーム（primary lyso
some）と融合して、新たなリソゾーム（seeondary lyso
some）を形成する〔例えば、M.J.Embleton et al.,supr
a,p.334参照〕。該アントラサイクリン分子は酸に感受
性を有するアシルヒドラゾン結合を介して該コンジユゲ
ートの抗体またはリガンド成分に結合しているので、該
コンジユゲートが該エンドサイト−シス顆粒あるいはリ
ソゾームの酸性環境にさらされると、そのコンジユゲー
トから該アントラサイクリンを放出（遊離）することに
なる。さらに、放出されたアントラサイクリンは充分な
細胞毒活性を示すところの比較的に修飾のなされていな
い薬剤であるものと思われる。かくして、該コンジユゲ
ートの酸に感受性であるヒドラゾン結合は、細胞毒性を
有する薬剤をターゲツト細胞内で放出するに非常に優れ
た利点を有しており、該コンジユゲートのそれらの細胞
に対する細胞毒活性をいつそう高めているのである。ま
た、一方該ヒドラゾン結合は、ターゲツト細胞のすぐ外
部の部分あるいはターゲツト細胞をとり囲む部分（例え
ば、腫瘍部位）の酸性あるいは還元性の条件のもとで開
裂することができ、その遊離した薬剤は、該腫瘍細胞に
より取り込まれうるのである。
本発明のイムノコンジユゲート及びその製造法は、各
種の抗体にコンジユゲート化されたアントラサイクリ
ン、すなわちアドリアマイシンを例にあげ、好ましい態
様として具体的に説明しうる。
種の抗体にコンジユゲート化されたアントラサイクリ
ン、すなわちアドリアマイシンを例にあげ、好ましい態
様として具体的に説明しうる。
先ず第１に、新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導
体は、２段階の反応によつて合成された。二官能性の複
素環系試薬SPDP（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート）は、ヒドラジンと反応
させることができ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オニルヒドラジドを生成し、次に該ヒドラジドは、アド
リアマイシン塩酸塩（ADM−HCl）と反応せしめられ、新
規なADMのアシルヒドラゾン誘導体（ピリジルで保護さ
れたジスルフイド部を含有している）を形成せしめる。
トリフルオロ酢酸のような酸触媒が、ヒドラゾン生成反
応を促進するために使用することができる。生成せしめ
られた誘導体は、アドリアマイシン13−｛３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・塩酸塩
（ADM−HZN）と呼ぶことができる（第１図参照）。
体は、２段階の反応によつて合成された。二官能性の複
素環系試薬SPDP（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート）は、ヒドラジンと反応
させることができ、３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オニルヒドラジドを生成し、次に該ヒドラジドは、アド
リアマイシン塩酸塩（ADM−HCl）と反応せしめられ、新
規なADMのアシルヒドラゾン誘導体（ピリジルで保護さ
れたジスルフイド部を含有している）を形成せしめる。
トリフルオロ酢酸のような酸触媒が、ヒドラゾン生成反
応を促進するために使用することができる。生成せしめ
られた誘導体は、アドリアマイシン13−｛３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・塩酸塩
（ADM−HZN）と呼ぶことができる（第１図参照）。
この新規ADM−ヒドラゾン誘導体は次に前もつてSPDP
でチオール化され、次に還元されているか、あるいは２
−IT（２−イミノチオラン）でチオール化されていると
ころのモノクローナル抗体と反応せしめられる（第２図
参照）。得られたイムノコンジユゲートは、アシルヒド
ラゾン結合を介してそれぞれのADMのＣ−13位に結合す
るリンカーアームによつて該モノクローナル抗体に結合
するADM分子からなるもので、該リンカーアームはさら
に該抗体に結合するところのジスルフイド結合を有して
よいものである（第２図参照）。
でチオール化され、次に還元されているか、あるいは２
−IT（２−イミノチオラン）でチオール化されていると
ころのモノクローナル抗体と反応せしめられる（第２図
参照）。得られたイムノコンジユゲートは、アシルヒド
ラゾン結合を介してそれぞれのADMのＣ−13位に結合す
るリンカーアームによつて該モノクローナル抗体に結合
するADM分子からなるもので、該リンカーアームはさら
に該抗体に結合するところのジスルフイド結合を有して
よいものである（第２図参照）。
本発明の別の具体的な態様としては、上記した該ADM
−HZNをさらに還元剤DDT（ジチオトレイトール、dithio
treitol）またはトリブチルホスフインと反応させ、13
−｛３−（メルカプトプロピオニル）｝アドリアマイシ
ン・ヒドラゾンを形成させるところの別の新規なアドリ
アマイシンヒドラゾン誘導体の合成法をあげることがで
きる（第17図参照）。次にこの誘導体はマレイミド基が
結合せしめられているモノクローナル抗体（例えば、抗
体をSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフ
エニル）ブチレート）と反応させることにより得られ
る）と反応させられる。第17図に示ささているように、
各ADMのＣ−13位にヒドラゾン結合によつて結合したリ
ンカーアームを持ち、さらに該抗体への結合部位として
チオエーテル結合を有するイムノコンジユゲートが形成
される。かくして、該薬剤及び抗体を結合しているリン
カーアームは、これらの結合としてアントラサイクリン
の13−ケト基の位置に酸に感受性を有するヒドラゾン結
合がある限り、数多くの構成要素及び結合を含有してい
てもよい。
−HZNをさらに還元剤DDT（ジチオトレイトール、dithio
treitol）またはトリブチルホスフインと反応させ、13
−｛３−（メルカプトプロピオニル）｝アドリアマイシ
ン・ヒドラゾンを形成させるところの別の新規なアドリ
アマイシンヒドラゾン誘導体の合成法をあげることがで
きる（第17図参照）。次にこの誘導体はマレイミド基が
結合せしめられているモノクローナル抗体（例えば、抗
体をSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフ
エニル）ブチレート）と反応させることにより得られ
る）と反応させられる。第17図に示ささているように、
各ADMのＣ−13位にヒドラゾン結合によつて結合したリ
ンカーアームを持ち、さらに該抗体への結合部位として
チオエーテル結合を有するイムノコンジユゲートが形成
される。かくして、該薬剤及び抗体を結合しているリン
カーアームは、これらの結合としてアントラサイクリン
の13−ケト基の位置に酸に感受性を有するヒドラゾン結
合がある限り、数多くの構成要素及び結合を含有してい
てもよい。
本発明の別の具体的態様に従えば、本発明の新規なAD
M−HZN誘導体は、最初にチオール基を有するように誘導
体化されたリガンドのいずれとも、すなわち、ボンベシ
ン、EGFまたはトランスフエリンのそのようなリガンド
のいずれとも反応させられうる。ボムベシンの場合に
は、そのペプチドのアミノ末端にシステイン残基が導入
され、ADM−HZNとコンジユゲートを形成するための反応
性のスルフヒドリル基を与える。マウスEGFの場合に
は、SPDPで該ポリペプチドを処理し、その分子のアミノ
末端にADM−HZNとコンジユゲートを形成するための反応
性スルフヒドリル基を導入した。トランスフェリンの場
合には、該タンパク質を２−ITと最初に反応させ、該タ
ンパク質骨格中に反応性チオール基を導入した。各場合
において、該チオール化されたリガンドは次にADM−HZN
と反応せしめられ、該リガンドと該薬剤との間にリンカ
ーを有する本発明のアントラサイクリン−リガンド・コ
ンジユゲートを形成し、そこで該リンカーはアシルヒド
ラゾン結合を介して各々のアントラサイクリンのＣ−13
位に結合している。更に、該リンカーは、その骨格中に
ジスルフイド結合を含有していた（第27図参照）。ま
た、ADM−HZNは、DTTで還元することができ（上記のイ
ムノコンジユゲートの製造におけるように）、次にさら
に上記したようにマレイミド基に結合しているリガンド
と反応させることができる。
M−HZN誘導体は、最初にチオール基を有するように誘導
体化されたリガンドのいずれとも、すなわち、ボンベシ
ン、EGFまたはトランスフエリンのそのようなリガンド
のいずれとも反応させられうる。ボムベシンの場合に
は、そのペプチドのアミノ末端にシステイン残基が導入
され、ADM−HZNとコンジユゲートを形成するための反応
性のスルフヒドリル基を与える。マウスEGFの場合に
は、SPDPで該ポリペプチドを処理し、その分子のアミノ
末端にADM−HZNとコンジユゲートを形成するための反応
性スルフヒドリル基を導入した。トランスフェリンの場
合には、該タンパク質を２−ITと最初に反応させ、該タ
ンパク質骨格中に反応性チオール基を導入した。各場合
において、該チオール化されたリガンドは次にADM−HZN
と反応せしめられ、該リガンドと該薬剤との間にリンカ
ーを有する本発明のアントラサイクリン−リガンド・コ
ンジユゲートを形成し、そこで該リンカーはアシルヒド
ラゾン結合を介して各々のアントラサイクリンのＣ−13
位に結合している。更に、該リンカーは、その骨格中に
ジスルフイド結合を含有していた（第27図参照）。ま
た、ADM−HZNは、DTTで還元することができ（上記のイ
ムノコンジユゲートの製造におけるように）、次にさら
に上記したようにマレイミド基に結合しているリガンド
と反応させることができる。
このように、該ADMのＣ−13位にヒドラゾン結合によ
つて結合しているリンカーアームを有し、該リンカーア
ームはまたその骨格中にチオエーテル結合を含有してい
るADM−リガンド・コンジユゲートが製造されうる。
つて結合しているリンカーアームを有し、該リンカーア
ームはまたその骨格中にチオエーテル結合を含有してい
るADM−リガンド・コンジユゲートが製造されうる。
本発明は、式Ｉ、IIまたはIII: （上式中Ｒ１はCH３、CH２OH、CH２OCO（CH２）３C
H３、またはCH２OCOCH（OC２Ｈ５）２で； Ｒ２は で； ＸはＨ、NO２またはハロゲンで、 Ｒ３はOCH３、OHまたは水素原子で； Ｒ４はNH２、NHCOCF３、４−モルホリニル、３−シア
ノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキ
シ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルア
ミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メト
キシエチルアミンで； Ｒ５はOH、Ｏ−THPまたは水素原子で； Ｒ６はOHLまたは水素原子（但し、Ｒ５がOHまたはＯ
−THPの時Ｒ６はOHではない）で； ｎは１〜10の整数である） （上式中： Ｒ１はCH３、CH２OH、CH２OCO（CH２）３CH３、また
はCH２OCOCH（OC２Ｈ５）２で； Ｒ３はOCH３、OHまたは水素原子で； Ｒ４はNH２、NHCOCF３、４−モルホリニル、３−シア
ノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキ
シ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルア
ミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メト
キシエチルアミンで； Ｒ５はOH、Ｏ−THPまたは水素原子で； Ｒ６はOHまたは水素原子（但し、Ｒ５がOHまたはＯ−
THPである時にはＲ６はOHではない）で； ｎは１〜10の整数である）、 （上式中： Ｒ１はCH３、CH２OH、CH２OCO（CH２）３CH３、また
はCH２OCOCH（OC２Ｈ５）２で； Ｒ２は、 ＸはＨ、NO２またはハロゲンで、 Ｒ３はOCH３、OHまたは水素原子で； Ｒ４及びＲ７は独立に水素原子、アルキル、置換アル
キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリー
ル、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルで
あるか；あるいはＲ４、Ｒ７及びＮは一緒になつて４〜
７員環（該環は任意に置換されていてよい）を形成し、 Ｒ５はOH、Ｏ−THPまたは水素原子で； Ｒ６はOHまたは水素原子（但し、Ｒ５がOHまたはＯ−
THPの時、Ｒ６はOHではない）で、 ｎは１〜10の整数である） を有する13−ケト基を含有しているアントラサイクリン
の新規アシルヒドラゾン誘導体を提供することも明らか
である。
H３、またはCH２OCOCH（OC２Ｈ５）２で； Ｒ２は で； ＸはＨ、NO２またはハロゲンで、 Ｒ３はOCH３、OHまたは水素原子で； Ｒ４はNH２、NHCOCF３、４−モルホリニル、３−シア
ノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキ
シ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルア
ミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メト
キシエチルアミンで； Ｒ５はOH、Ｏ−THPまたは水素原子で； Ｒ６はOHLまたは水素原子（但し、Ｒ５がOHまたはＯ
−THPの時Ｒ６はOHではない）で； ｎは１〜10の整数である） （上式中： Ｒ１はCH３、CH２OH、CH２OCO（CH２）３CH３、また
はCH２OCOCH（OC２Ｈ５）２で； Ｒ３はOCH３、OHまたは水素原子で； Ｒ４はNH２、NHCOCF３、４−モルホリニル、３−シア
ノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキ
シ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジルア
ミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メト
キシエチルアミンで； Ｒ５はOH、Ｏ−THPまたは水素原子で； Ｒ６はOHまたは水素原子（但し、Ｒ５がOHまたはＯ−
THPである時にはＲ６はOHではない）で； ｎは１〜10の整数である）、 （上式中： Ｒ１はCH３、CH２OH、CH２OCO（CH２）３CH３、また
はCH２OCOCH（OC２Ｈ５）２で； Ｒ２は、 ＸはＨ、NO２またはハロゲンで、 Ｒ３はOCH３、OHまたは水素原子で； Ｒ４及びＲ７は独立に水素原子、アルキル、置換アル
キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリー
ル、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルで
あるか；あるいはＲ４、Ｒ７及びＮは一緒になつて４〜
７員環（該環は任意に置換されていてよい）を形成し、 Ｒ５はOH、Ｏ−THPまたは水素原子で； Ｒ６はOHまたは水素原子（但し、Ｒ５がOHまたはＯ−
THPの時、Ｒ６はOHではない）で、 ｎは１〜10の整数である） を有する13−ケト基を含有しているアントラサイクリン
の新規アシルヒドラゾン誘導体を提供することも明らか
である。
上記のアントラサイクリン・アシルヒドラゾンは、本
発明のコンジユゲートを製造するにあたつての新規中間
体を示しており、本明細書において好適な具体的態様と
して記載されているようにそれぞれADM−HZN及び13−
｛３−（メルカプトプロピオニル）｝アドリアマイシン
・ヒドラゾンを例としてあげることができる。
発明のコンジユゲートを製造するにあたつての新規中間
体を示しており、本明細書において好適な具体的態様と
して記載されているようにそれぞれADM−HZN及び13−
｛３−（メルカプトプロピオニル）｝アドリアマイシン
・ヒドラゾンを例としてあげることができる。
上記化学式からわかるように、本発明のアシルヒドラ
ゾン中間体としては、アドリアマイシン、ダウノマイシ
ン及びカルシノマイシンのような多くの公知のアントラ
サイクリンのいずれのヒドラゾンも含むものである。更
に、該中間体としては、アントラサイクリン骨格の特定
の場所の誘導体であるアシルヒドラゾン（例えば、４′
−THP−アドリアマイシンヒドラゾンまたは３′−デア
ミノ−３′（３−シアノ−４−モルホリニル）アドリア
マイシン・ヒドラゾン）があげられる。これらの後の方
で述べた中間は、最初に該アントラサイクリンを誘導体
化し、所望のアナローグを形成せしめ、次に該アナロー
グを用いて本発明のヒドラゾン中間体を形成せしめるこ
とにより合成することができる。公知のアントラサイク
リンアナローグとしては、米国特許第4,464,529号ある
いは米国特許第4,301,277号に記載されているもの
（３′−デアミノ−３′（４−モルホリニル）アントラ
サイクリンアナローグまたは３′−デアミノ−３′（３
−シアノ−４−モルホリニル）アントラサイクリンアナ
ローグ）、米国特許第4,202,967号または米国特許第4,3
14,054号に記載されているもの（３′−デアミノ−３′
−（１−ピペリジニル）アントラサイクリンアナローグ
または３′−デアミノ−３′−（４−メトキシ−１−ピ
ペリジニル）アントラサイクリンアナローグ）、米国特
許第4,250,303号に記載されているのも（Ｎ−ベンジル
またはN,N−ジベンジルアントラサイクリンアナロー
グ）、米国特許第4,591,637号に記載されているもの
（Ｎ−メトキシメチルまたはＮ−シアノメチルアントラ
サイクリンアナローグ）及び米国特許第4,303,785号に
記載されているもの（アントラサイクリンのアセタール
アナローグ）があげられる。かくして、これら公知のア
ントラサイクリンアナローグは上記本明細書で記載した
ように（第１図参照）して反応させ、新規なアシルヒド
ラゾンとされ、次にそれは、上記本明細書で記載したよ
うに所望の特異性を有する抗体またはリガンドとコンジ
ユゲート化することができる。
ゾン中間体としては、アドリアマイシン、ダウノマイシ
ン及びカルシノマイシンのような多くの公知のアントラ
サイクリンのいずれのヒドラゾンも含むものである。更
に、該中間体としては、アントラサイクリン骨格の特定
の場所の誘導体であるアシルヒドラゾン（例えば、４′
−THP−アドリアマイシンヒドラゾンまたは３′−デア
ミノ−３′（３−シアノ−４−モルホリニル）アドリア
マイシン・ヒドラゾン）があげられる。これらの後の方
で述べた中間は、最初に該アントラサイクリンを誘導体
化し、所望のアナローグを形成せしめ、次に該アナロー
グを用いて本発明のヒドラゾン中間体を形成せしめるこ
とにより合成することができる。公知のアントラサイク
リンアナローグとしては、米国特許第4,464,529号ある
いは米国特許第4,301,277号に記載されているもの
（３′−デアミノ−３′（４−モルホリニル）アントラ
サイクリンアナローグまたは３′−デアミノ−３′（３
−シアノ−４−モルホリニル）アントラサイクリンアナ
ローグ）、米国特許第4,202,967号または米国特許第4,3
14,054号に記載されているもの（３′−デアミノ−３′
−（１−ピペリジニル）アントラサイクリンアナローグ
または３′−デアミノ−３′−（４−メトキシ−１−ピ
ペリジニル）アントラサイクリンアナローグ）、米国特
許第4,250,303号に記載されているのも（Ｎ−ベンジル
またはN,N−ジベンジルアントラサイクリンアナロー
グ）、米国特許第4,591,637号に記載されているもの
（Ｎ−メトキシメチルまたはＮ−シアノメチルアントラ
サイクリンアナローグ）及び米国特許第4,303,785号に
記載されているもの（アントラサイクリンのアセタール
アナローグ）があげられる。かくして、これら公知のア
ントラサイクリンアナローグは上記本明細書で記載した
ように（第１図参照）して反応させ、新規なアシルヒド
ラゾンとされ、次にそれは、上記本明細書で記載したよ
うに所望の特異性を有する抗体またはリガンドとコンジ
ユゲート化することができる。
また、本発明の誘導体化されていないアシルヒドラゾ
ン中間体は、最初に誘導体化されていないアントラサイ
クリン（アドリアマイシン、ダウノマイシンまたはカル
ミノマイシンのようなもの）から本明細書において記載
されているようにして製造されることができ、次にこの
新規中間体は誘導体化され所望の置換基を持つ新規なア
シルヒドラゾンにされる。例えば、ADM−HZNは、米国特
許第4,464,529号に記載された方法を用いて、2,2′−オ
キシジアセトアルデヒドで処理して還元的アミノ化して
該アミノ糖部分の誘導体化がなされ、３′−デアミノ−
３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）アドリアマイ
シン・ヒドラゾンを与えることができる。同様にして、
ADM−HZNは、そのアミノ糖部分において誘導体化がなさ
れることができ、新規なアシルヒドラゾン誘導体（３′
−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）ADM・ヒドラ
ゾン（米国特許第4,301,277号参照）、３′−デアミノ
−３′−（１−ピペリジニル）ADM・ヒドラゾン（米国
特許第4,202,967号参照）、３′−デアミノ−３′−
（４−メトキシ−１−ピペリジニル）ADM・ヒドラゾン
（米国特許第4,314,054号参照）、Ｎ−ベンジルADM・ヒ
ドラゾン（米国特許第4,250,303号参照）あるいはＮ−
メトキシメチルADM・ヒドラゾン及びＮ−シアノメチルA
DM・ヒドラゾン（米国特許第4,591,637号参照）のよう
な新規アシルヒドラゾン誘導体）を与える。加えて、AD
M−HZNは、米国特許第4,303,785号に記載されているよ
うに式Ｉ−IIIのＲ５位において誘導体化することがで
き、４′−THP−ADM・ヒドラゾンのような該ヒドラゾン
のアセタール誘導体を与える。
ン中間体は、最初に誘導体化されていないアントラサイ
クリン（アドリアマイシン、ダウノマイシンまたはカル
ミノマイシンのようなもの）から本明細書において記載
されているようにして製造されることができ、次にこの
新規中間体は誘導体化され所望の置換基を持つ新規なア
シルヒドラゾンにされる。例えば、ADM−HZNは、米国特
許第4,464,529号に記載された方法を用いて、2,2′−オ
キシジアセトアルデヒドで処理して還元的アミノ化して
該アミノ糖部分の誘導体化がなされ、３′−デアミノ−
３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）アドリアマイ
シン・ヒドラゾンを与えることができる。同様にして、
ADM−HZNは、そのアミノ糖部分において誘導体化がなさ
れることができ、新規なアシルヒドラゾン誘導体（３′
−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）ADM・ヒドラ
ゾン（米国特許第4,301,277号参照）、３′−デアミノ
−３′−（１−ピペリジニル）ADM・ヒドラゾン（米国
特許第4,202,967号参照）、３′−デアミノ−３′−
（４−メトキシ−１−ピペリジニル）ADM・ヒドラゾン
（米国特許第4,314,054号参照）、Ｎ−ベンジルADM・ヒ
ドラゾン（米国特許第4,250,303号参照）あるいはＮ−
メトキシメチルADM・ヒドラゾン及びＮ−シアノメチルA
DM・ヒドラゾン（米国特許第4,591,637号参照）のよう
な新規アシルヒドラゾン誘導体）を与える。加えて、AD
M−HZNは、米国特許第4,303,785号に記載されているよ
うに式Ｉ−IIIのＲ５位において誘導体化することがで
き、４′−THP−ADM・ヒドラゾンのような該ヒドラゾン
のアセタール誘導体を与える。
本発明のアシルヒドラゾンの誘導体化のためのこれら
の新規な方法は、出発物質としてADM以外のアントラサ
イクリン（ダウノマイシンあるいはカルミノマイシンの
ようなもの）のヒドラゾンにも用いることができて、Ｎ
−ベンジルダウノマイシン・ヒドラゾンや３′−デアミ
ノ−３′−（４−モルホリニル）カルミノマイシン・ヒ
ドラゾンのような新規な化合物を与え、そしてそれら化
合物もまた本発明の範囲内のものであることは理解され
るべきである。
の新規な方法は、出発物質としてADM以外のアントラサ
イクリン（ダウノマイシンあるいはカルミノマイシンの
ようなもの）のヒドラゾンにも用いることができて、Ｎ
−ベンジルダウノマイシン・ヒドラゾンや３′−デアミ
ノ−３′−（４−モルホリニル）カルミノマイシン・ヒ
ドラゾンのような新規な化合物を与え、そしてそれら化
合物もまた本発明の範囲内のものであることは理解され
るべきである。
本発明に従つて製造されるアントラサイクリン−抗体
イムノコンジユゲートを各種のアツセイ条件下に調べる
と、該イムノコンジユゲートは、リンパ腫細胞並びに癌
腫細胞の双方に対して抗体結合活性を保持しており、そ
してそれらの細胞に対して抗体指向性の殺傷活性を示す
ことがわかつた。かくして、該アントラサイクリンによ
つて該コンジユゲートの抗体が特異性を示すところの抗
原を有する細胞は充分な程度に殺傷されるのに対して、
そのような適当な抗原を持たない細胞は攻撃されない。
実際、いくつかの実験で、抗体によりデリバーされるア
ントラサイクリンは、コンジユゲート化されていないア
ントラサイクリンの等しい量のものより非常に多きな活
性を示すことが見出された。その遊離薬剤と抗体にコン
ジユゲート化された薬剤との間で測定されたその効果の
違いは、腫瘍細胞への取り込みのメカニズム及び細胞内
輸送（transport）メカニズムの違いによるものであり
うる。
イムノコンジユゲートを各種のアツセイ条件下に調べる
と、該イムノコンジユゲートは、リンパ腫細胞並びに癌
腫細胞の双方に対して抗体結合活性を保持しており、そ
してそれらの細胞に対して抗体指向性の殺傷活性を示す
ことがわかつた。かくして、該アントラサイクリンによ
つて該コンジユゲートの抗体が特異性を示すところの抗
原を有する細胞は充分な程度に殺傷されるのに対して、
そのような適当な抗原を持たない細胞は攻撃されない。
実際、いくつかの実験で、抗体によりデリバーされるア
ントラサイクリンは、コンジユゲート化されていないア
ントラサイクリンの等しい量のものより非常に多きな活
性を示すことが見出された。その遊離薬剤と抗体にコン
ジユゲート化された薬剤との間で測定されたその効果の
違いは、腫瘍細胞への取り込みのメカニズム及び細胞内
輸送（transport）メカニズムの違いによるものであり
うる。
さらに、マウスに異種間移植されたヒト腫瘍を用いて
の研究で、本発明のイムノコンジユゲートは生体内（in
vivo）で腫瘍の生育を阻止し、それはある場合には完
全に腫瘍を退行（regressino）させるという活性を示し
た。本発明のイムノコンジユゲートは、コンジユゲート
化されていないアントラサイクリンよりも非常に大きな
活性を示しそして腫瘍増殖阻止活性が極めて大きいこと
が示された。さらに、本発明のイムノコンジユゲート
は、遊離の薬剤よりも動物に対して極めて副作用等が少
なくて許容性の高いものであり、コンジユゲート化され
ていないアントラサイクリン単独と比べて少なくとも10
倍以下の非常に低い毒性しか持たなかつた。
の研究で、本発明のイムノコンジユゲートは生体内（in
vivo）で腫瘍の生育を阻止し、それはある場合には完
全に腫瘍を退行（regressino）させるという活性を示し
た。本発明のイムノコンジユゲートは、コンジユゲート
化されていないアントラサイクリンよりも非常に大きな
活性を示しそして腫瘍増殖阻止活性が極めて大きいこと
が示された。さらに、本発明のイムノコンジユゲート
は、遊離の薬剤よりも動物に対して極めて副作用等が少
なくて許容性の高いものであり、コンジユゲート化され
ていないアントラサイクリン単独と比べて少なくとも10
倍以下の非常に低い毒性しか持たなかつた。
本発明のイムノコンジユゲートの結合特性及び細胞毒
活性は、アントラサイクリンのアミノ糖部分を介して直
接に抗体に結合せしめられているアントラサイクリンを
開示する従来報告されたいかなるイムノコンジユゲート
より優れていることがわかつた。従来のこれらのアミノ
糖に結合したイムノコンジユゲートは、より低度の抗体
に対するアントラサイクリンのモル比を示し、遊離の薬
剤に比べてその細胞毒活性が低下し、抗体結合特性にお
いても劣ることがわかつた〔例えば、R.Arnon et al.,I
mmunological Rev.,62、supra;E.Hurwitz et al.,Cance
r Res.,35、supra;及びR.Yamamoto et al.,supra参
照〕。
活性は、アントラサイクリンのアミノ糖部分を介して直
接に抗体に結合せしめられているアントラサイクリンを
開示する従来報告されたいかなるイムノコンジユゲート
より優れていることがわかつた。従来のこれらのアミノ
糖に結合したイムノコンジユゲートは、より低度の抗体
に対するアントラサイクリンのモル比を示し、遊離の薬
剤に比べてその細胞毒活性が低下し、抗体結合特性にお
いても劣ることがわかつた〔例えば、R.Arnon et al.,I
mmunological Rev.,62、supra;E.Hurwitz et al.,Cance
r Res.,35、supra;及びR.Yamamoto et al.,supra参
照〕。
さらに、本発明のイムノコンジユゲートの安定性を調
べたところ、細胞における環境で見出される還元性及び
酸性の条件と類似の条件下で該アントラサイクリンをイ
ムノコンジユゲートから遊離（放出）されることが示さ
れた。
べたところ、細胞における環境で見出される還元性及び
酸性の条件と類似の条件下で該アントラサイクリンをイ
ムノコンジユゲートから遊離（放出）されることが示さ
れた。
本明細書に記載された本発明のイムノコンジユゲート
で該薬物の高い細胞毒活性が保持されているという観測
は、ターゲツト細胞に比較的に修飾されていない薬剤が
デリバーされているという事実を示すものとしうる。
で該薬物の高い細胞毒活性が保持されているという観測
は、ターゲツト細胞に比較的に修飾されていない薬剤が
デリバーされているという事実を示すものとしうる。
加えて、反応条件を選ぶことにより、アントラサイク
リン：抗体のモル比をおおよそ４−10になるように（幾
つかの異なつたイソタイプの抗体を用いる）することが
できる。該ADM−HZNと縮合させた後に回収されるタンパ
ク質量は、モル比を10より大きなものとすると急激に低
下する。10よりも大きなモル比を有するイムノコンジユ
ゲートを得るにあたつての主な限界は、水溶液中におけ
るコンジユゲートの溶解性が低下すること及びタンパク
質とのアントラサイクリンの物理的な会合に起因してい
ることがわかつた。
リン：抗体のモル比をおおよそ４−10になるように（幾
つかの異なつたイソタイプの抗体を用いる）することが
できる。該ADM−HZNと縮合させた後に回収されるタンパ
ク質量は、モル比を10より大きなものとすると急激に低
下する。10よりも大きなモル比を有するイムノコンジユ
ゲートを得るにあたつての主な限界は、水溶液中におけ
るコンジユゲートの溶解性が低下すること及びタンパク
質とのアントラサイクリンの物理的な会合に起因してい
ることがわかつた。
また、生体内での研究で、本発明のアントラサイクリ
ン−リガンドコンジユゲートはターゲツト細胞を殺傷す
る活性を有することが示された。例えば、我々の研究で
は、本発明のアントラサイクリン−リガンドコジユゲー
トのあるものは、腫瘍に対しての細胞毒活性を示す一方
で特異的なレセプター結合活性を保持していることが示
された。かくして、本明細書において記載されたように
して製造されたcys−ボムベシン−ADMコンジユゲート
は、コンジユゲート化されていないcys−ボムベシンに
おいて実測されるのと等しいボムベシンレセプター陽性
細胞セルラインに対する結合活性を示し、生体内試験で
形質転換された繊維芽細胞セルラインに対して非常に高
い細胞毒活性を示した。実際、cys−、ボムベシン−ADM
コンジユゲートは遊離のADMあるいはADM−HZNよりもは
るかに高い活性を示した。加えて、EGF−ADM・コンジユ
ゲート並びにトランスフエリン−ADM・コンジユゲート
は、本明細書において記載されているようにして製造さ
れることができた。
ン−リガンドコンジユゲートはターゲツト細胞を殺傷す
る活性を有することが示された。例えば、我々の研究で
は、本発明のアントラサイクリン−リガンドコジユゲー
トのあるものは、腫瘍に対しての細胞毒活性を示す一方
で特異的なレセプター結合活性を保持していることが示
された。かくして、本明細書において記載されたように
して製造されたcys−ボムベシン−ADMコンジユゲート
は、コンジユゲート化されていないcys−ボムベシンに
おいて実測されるのと等しいボムベシンレセプター陽性
細胞セルラインに対する結合活性を示し、生体内試験で
形質転換された繊維芽細胞セルラインに対して非常に高
い細胞毒活性を示した。実際、cys−、ボムベシン−ADM
コンジユゲートは遊離のADMあるいはADM−HZNよりもは
るかに高い活性を示した。加えて、EGF−ADM・コンジユ
ゲート並びにトランスフエリン−ADM・コンジユゲート
は、本明細書において記載されているようにして製造さ
れることができた。
生体内試験での我々の研究で、本発明のイムノコンジ
ユゲートは遊離の薬剤より非常に強い抗腫瘍活性を有
し、より体内での毒性が減じられていることが示され、
それは該コンジユゲートがより治療指数が改善されてい
ることを示している。このように、本発明は、癌及びそ
の他の腫瘍、殺細胞性でないウイルス感染症またはその
他の病原性感染症、及び免疫疾患のような病気の治療の
ための医薬組成物、配合物あるいは治療のための方法に
も関する。特に、本発明は、医薬として有効な量の少な
くとも一種のアントラサイクリン含有コンジユゲート
を、薬学的に許容される方法で宿主哺乳動物に投与する
ところの哺乳動物の病気の治療法を含むものである。
ユゲートは遊離の薬剤より非常に強い抗腫瘍活性を有
し、より体内での毒性が減じられていることが示され、
それは該コンジユゲートがより治療指数が改善されてい
ることを示している。このように、本発明は、癌及びそ
の他の腫瘍、殺細胞性でないウイルス感染症またはその
他の病原性感染症、及び免疫疾患のような病気の治療の
ための医薬組成物、配合物あるいは治療のための方法に
も関する。特に、本発明は、医薬として有効な量の少な
くとも一種のアントラサイクリン含有コンジユゲート
を、薬学的に許容される方法で宿主哺乳動物に投与する
ところの哺乳動物の病気の治療法を含むものである。
別の本発明の方法の具体的態様としては、組み合わせ
ての化学療法において使用するための多くの異なつたコ
ンジユゲート（すなわち異なつたアントラサイクリンあ
るいは異つた抗体またはリガンドを持つているコンジユ
ゲート）の投与（同時または順次いずれかによる投与）
があげられる。例えば、本発明の一つの具体的態様とし
ては、該コンジユゲートの抗体成分の特異活性が異なつ
ているところの種々のアントラサイクリン−イムノコン
ジユゲートを使用すること、すなわちそれぞれのイムノ
コンジユゲートが異なつた抗原に特異的に結合する抗体
または問題の細胞群の上に存在する同一の抗原上の異な
つたサイトまたはエピトープに特異的に結合する抗体を
有するところのものを複数用いることを含むことができ
る。これらのイムノコンジユゲートのアントラサイクリ
ン成分は同一であつてもよいし、あるいは異なつていて
もよい。例えば、この具体的な態様は、腫瘍の表面上の
各種の抗原の量が未知であつたり、腫瘍細胞群がその抗
原の発現性においてヘテロジーニアスであつたり、また
充分な量の薬剤を腫瘍部位の腫瘍細胞にターゲツト化さ
れていることが確実なようにすることが求められる場合
に腫瘍のある種のものを処置するにあたつて特に有用で
ある。腫瘍に対して異なつた抗原特異性または異なつた
エピトープ特異性を有する複数のコンジユゲートの使用
は、腫瘍部位における充分量の薬剤の存在を得る可能性
を高めるものである。さらに、この具体的な態様は、正
常な組織が同一の腫瘍関連抗原を有する可能性は低い
〔参照、I.Hellstrom et AL.,“Monoclonal Antibodies
To Two Determinauts Of Melanoma Antigen p 97 Act
Synevgistically In Complement−Dependent Cytotoxic
ity"、J.Immunol.127（No.1）pp 157−60（1981）〕こ
とから高いレベルの腫瘍特異性を達成しうるので重要で
ある。
ての化学療法において使用するための多くの異なつたコ
ンジユゲート（すなわち異なつたアントラサイクリンあ
るいは異つた抗体またはリガンドを持つているコンジユ
ゲート）の投与（同時または順次いずれかによる投与）
があげられる。例えば、本発明の一つの具体的態様とし
ては、該コンジユゲートの抗体成分の特異活性が異なつ
ているところの種々のアントラサイクリン−イムノコン
ジユゲートを使用すること、すなわちそれぞれのイムノ
コンジユゲートが異なつた抗原に特異的に結合する抗体
または問題の細胞群の上に存在する同一の抗原上の異な
つたサイトまたはエピトープに特異的に結合する抗体を
有するところのものを複数用いることを含むことができ
る。これらのイムノコンジユゲートのアントラサイクリ
ン成分は同一であつてもよいし、あるいは異なつていて
もよい。例えば、この具体的な態様は、腫瘍の表面上の
各種の抗原の量が未知であつたり、腫瘍細胞群がその抗
原の発現性においてヘテロジーニアスであつたり、また
充分な量の薬剤を腫瘍部位の腫瘍細胞にターゲツト化さ
れていることが確実なようにすることが求められる場合
に腫瘍のある種のものを処置するにあたつて特に有用で
ある。腫瘍に対して異なつた抗原特異性または異なつた
エピトープ特異性を有する複数のコンジユゲートの使用
は、腫瘍部位における充分量の薬剤の存在を得る可能性
を高めるものである。さらに、この具体的な態様は、正
常な組織が同一の腫瘍関連抗原を有する可能性は低い
〔参照、I.Hellstrom et AL.,“Monoclonal Antibodies
To Two Determinauts Of Melanoma Antigen p 97 Act
Synevgistically In Complement−Dependent Cytotoxic
ity"、J.Immunol.127（No.1）pp 157−60（1981）〕こ
とから高いレベルの腫瘍特異性を達成しうるので重要で
ある。
さらにまた、複数の異なつたイムノコンジユゲート
は、該コンジユゲートのアントラサイクリン成分のみが
異なる場合にも使用することができる。例えば、特定の
抗体をアドリアマイシンに結合させて、一方のイムノコ
ンジユゲートとし、その抗体をダウノマイシンに結合さ
せ、第２番目のイムノコンジユゲートとすることができ
る。次に両方のコンジユゲートは、治療を受くべき宿主
に投与されることができ、その抗体の特異性に基づい
て、排除されることが求められる特定の細胞群の部位に
局在化するよう集められる。次に両薬剤は、該部位で放
出される。
は、該コンジユゲートのアントラサイクリン成分のみが
異なる場合にも使用することができる。例えば、特定の
抗体をアドリアマイシンに結合させて、一方のイムノコ
ンジユゲートとし、その抗体をダウノマイシンに結合さ
せ、第２番目のイムノコンジユゲートとすることができ
る。次に両方のコンジユゲートは、治療を受くべき宿主
に投与されることができ、その抗体の特異性に基づい
て、排除されることが求められる特定の細胞群の部位に
局在化するよう集められる。次に両薬剤は、該部位で放
出される。
腫瘍のような特定の細胞群の薬剤の抵抗性にはいくら
かのバラツキが存在し、本具体的な態様による方法では
種々の異なつた薬剤をターゲツト細胞の部位であるいは
ターゲツト細胞内に放出させることができるのでこの具
体的な態様は重要である。更なる具体的な態様として
は、一種以上のアントラサイクリンを特定の抗体に結合
せしめて、13−ケト基のアシルヒドラゾン結合を介して
そのすべてが抗体に結合するところのその表面に多くの
各種異つたアントラサイクリン分子を持つイムノコンジ
ユゲートを形成せしめることがあげられる。この具体的
態様での該イムノコンジユゲートの投与により、ターゲ
ツト細胞の部位またはターゲツト細胞中で多くの各種異
つた薬剤の放出がもたらされる。さらには、アントラサ
イクリン−抗体・コンジユゲート及びアントラサイクリ
ン−リガンド・コンジユゲートの組み合せが、特定の抗
原と共にその表面上に特定のリガンド用のレセプターを
持つている細胞群に該薬剤がターゲツト化されることが
できる場合として使用することができる。一種のアント
ラサイクリンと数多くの異つた薬剤の配合治療法が再度
使用することができる。
かのバラツキが存在し、本具体的な態様による方法では
種々の異なつた薬剤をターゲツト細胞の部位であるいは
ターゲツト細胞内に放出させることができるのでこの具
体的な態様は重要である。更なる具体的な態様として
は、一種以上のアントラサイクリンを特定の抗体に結合
せしめて、13−ケト基のアシルヒドラゾン結合を介して
そのすべてが抗体に結合するところのその表面に多くの
各種異つたアントラサイクリン分子を持つイムノコンジ
ユゲートを形成せしめることがあげられる。この具体的
態様での該イムノコンジユゲートの投与により、ターゲ
ツト細胞の部位またはターゲツト細胞中で多くの各種異
つた薬剤の放出がもたらされる。さらには、アントラサ
イクリン−抗体・コンジユゲート及びアントラサイクリ
ン−リガンド・コンジユゲートの組み合せが、特定の抗
原と共にその表面上に特定のリガンド用のレセプターを
持つている細胞群に該薬剤がターゲツト化されることが
できる場合として使用することができる。一種のアント
ラサイクリンと数多くの異つた薬剤の配合治療法が再度
使用することができる。
本発明のアントラサイクリンコンジユゲートは、静脈
内、腹腔内、経口またはリンパ腺内投与、または腫瘍の
ような特定の細胞群の部位への直接的な投与を含むが、
それには限定されない通常行なわれる投与方法を用いて
医薬組成物のかたちで投与されることができる。静脈内
投与は好ましいものである。本発明のイムノコンジユゲ
ートの場合、生体内での処置のためには、FabまたはＦ
（ab′）２のような抗体フラグメントまたはキメラ抗体
から成るコンジユゲートを使用することが有用でありう
る。
内、腹腔内、経口またはリンパ腺内投与、または腫瘍の
ような特定の細胞群の部位への直接的な投与を含むが、
それには限定されない通常行なわれる投与方法を用いて
医薬組成物のかたちで投与されることができる。静脈内
投与は好ましいものである。本発明のイムノコンジユゲ
ートの場合、生体内での処置のためには、FabまたはＦ
（ab′）２のような抗体フラグメントまたはキメラ抗体
から成るコンジユゲートを使用することが有用でありう
る。
本発明の医薬組成物−アントラサイクリンコンジユゲ
ートからなるもの−は、錠剤、ピル剤、粉末剤、液体溶
液剤または懸濁剤、坐剤、ポリマーを用いたマイクロカ
プセル剤またはマイクロ粒子剤、リポゾーム剤、注射ま
たは灌注することのできる溶液剤のような固体または半
固体または液体の投与剤形があげられるがそれには限定
されないところの各種の投与形態であつてよい。その好
ましい形は、投与法あるいは治療法によつて異なる。
ートからなるもの−は、錠剤、ピル剤、粉末剤、液体溶
液剤または懸濁剤、坐剤、ポリマーを用いたマイクロカ
プセル剤またはマイクロ粒子剤、リポゾーム剤、注射ま
たは灌注することのできる溶液剤のような固体または半
固体または液体の投与剤形があげられるがそれには限定
されないところの各種の投与形態であつてよい。その好
ましい形は、投与法あるいは治療法によつて異なる。
また医薬組成物は、ヒト血清アルブミンのような血清
タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、水または塩ま
たは電解質のような当該分野で知られた通常の薬学的に
許容される担体を含有していてよい。
タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、水または塩ま
たは電解質のような当該分野で知られた通常の薬学的に
許容される担体を含有していてよい。
本発明のコンジユゲート組成物の投与法及び投与用剤
の摂取法の一番有効な方法は、病状の程度及び進行状
態、患者の身体的状態、その治療に対する応答性、そし
て治療にあたる医者の判断に応じて変えることができ
る。したがつて、該コンジユゲートの用量及びそれに付
随する化合物は、それぞれの患者に応じて決められるべ
きである。しかしながら、本発明のアントラサイクリン
イムノコンジユゲートの有効量は、約１〜約100mg/m２
のアントラサイクリンとなるか、または約500−5000mg/
m２の抗体となる範囲であつてよい。アントラサイクリ
ン−リガンドコンジユゲートの有効量は、約１〜約100m
g/m２のアントラサイクリンとなるか、または約１〜約1
00mg/m２のリガンドとなる範囲であつてよい。
の摂取法の一番有効な方法は、病状の程度及び進行状
態、患者の身体的状態、その治療に対する応答性、そし
て治療にあたる医者の判断に応じて変えることができ
る。したがつて、該コンジユゲートの用量及びそれに付
随する化合物は、それぞれの患者に応じて決められるべ
きである。しかしながら、本発明のアントラサイクリン
イムノコンジユゲートの有効量は、約１〜約100mg/m２
のアントラサイクリンとなるか、または約500−5000mg/
m２の抗体となる範囲であつてよい。アントラサイクリ
ン−リガンドコンジユゲートの有効量は、約１〜約100m
g/m２のアントラサイクリンとなるか、または約１〜約1
00mg/m２のリガンドとなる範囲であつてよい。
本明細書において記載された本発明を更に充分に理解
するため、次に実施例を示す。これらの実施例は、それ
を具体的に説明するためだけのものであつて、いかなる
意味でも本発明の範囲を限定することを意図するもので
はないことは理解されるべきである。
するため、次に実施例を示す。これらの実施例は、それ
を具体的に説明するためだけのものであつて、いかなる
意味でも本発明の範囲を限定することを意図するもので
はないことは理解されるべきである。
実施例1. 次なる実施例は、薬剤が、それの13−ケト基の位置の
ヒドラゾン結合を介してモノクローナル抗体に直接結合
しているところの本発明に従つた新規なアントラサイク
リンイムノコンジユゲートの製造法を示すためのもので
ある。
ヒドラゾン結合を介してモノクローナル抗体に直接結合
しているところの本発明に従つた新規なアントラサイク
リンイムノコンジユゲートの製造法を示すためのもので
ある。
本実施例に記載された特定の具体的態様としては、AD
Mをモノクローナル抗体にコンジユゲート化し、該イム
ノコンジユゲートのADM分子への結合部としてアシルヒ
ドラゾン結合を持つリンカーアームを有し、該リンカー
はさらに該抗体への結合部としてジスルフイド結合を有
しているところのイムノコンジユゲートの形成を含むも
のである。本具体例は、またADM（ADM−HZN）の新規ア
シルヒドラゾン誘導体をも提供する。
Mをモノクローナル抗体にコンジユゲート化し、該イム
ノコンジユゲートのADM分子への結合部としてアシルヒ
ドラゾン結合を持つリンカーアームを有し、該リンカー
はさらに該抗体への結合部としてジスルフイド結合を有
しているところのイムノコンジユゲートの形成を含むも
のである。本具体例は、またADM（ADM−HZN）の新規ア
シルヒドラゾン誘導体をも提供する。
アドリアマイシン・ヒドラゾンの合成 本具体例のイムノコンジユゲート製造における最初の
ステツプとしては、次のようにして最初のADM−ヒドラ
ゾン誘導体を合成するものである： イソプロピルアルコール中の0.3mlの1Mヒドラゾン、
（NH２NH２）溶液を、THF（テトラヒドロフラン）3ml中
のSPDP（70mg,0.22mmol）の冷却溶液中に加えた。20℃
で20分間撹拌した後、生成物をCH２Cl２で抽出し、次に
塩水で洗い、Ｋ２CO３上で乾燥した。溶媒をエバポレー
シヨンした後得られた残留物を中性アルミナ（５％Ｍ６
OH,95％CH２Cl２）上でクロマトグラフイーにかけ、21m
g（41％）の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル
・ヒドラジド（第１図の化合物２）を得た。このヒドラ
ジド及びアドリアマイシン・HCl（三楽（株）から入
手）（48mg,0.083mmol）を5mlのＭ６OH中に溶解し、次
に暗室中室温で６日間撹拌した。反応混合物を逆相薄層
クロマトグラフイー（TLC）（Ｍ６OH:H２Ｏ＝2:1、３％
w/vNH４OAc含有）にかけた。この処理の後、溶媒をエバ
ポレーシヨンし、残留物をC18カラム（Ｍ６OH:H２Ｏ＝
3:2、３％w/vNH４OAc含有）上のクロマトグラフイーに
かけた。分画を一緒にして、凍結乾燥し、過剰のNH４OA
cを減圧下に除去した。残留物をＭ６OH中で溶解し、ア
セトニトリルを加えて沈澱させ、45mg（72％）のアドリ
アマイシン・13−｛３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オニル｝−ヒドラゾン塩酸塩（以降ADM−HZNという）
（第１図の化合物４）を得た。ADM−HZNは次なる特性を
有する： mp＞125°色が暗色化し、明確な値を示さない;NMR（ア
セトン−ｄ６，δ）1.25（s,3H,J＝6Hz）、1.77（m,1
H）、2.06（m,1H）、2.30（m,1H）、2.53（d,1H,J＝15H
z）、2.89−3.18（m,6H）、3.71（m,1H）、3.85（m,1
H）、3.97（m,1H）、4.07（s,3H）、4.78（s,2H）、5.2
1（m,1H）、5.58（t,1H,J＝7Hz）、7.12（m,1H）、7.64
（d,1H,J＝8Hx）、7.75（m,2H）、7.90（t,1H,J＝8H
z）、7.98（d,1H,J＝8Hz）、8.37（d,1H,J＝4Hz）、10.
50（s,1H）、10.52（s,1H）、14.19（bs,1H）;IR（KB
r）3438、1674、1618、1579、1419、1286、1016、988、
698cm-1;FABMS（グリセロール）m/6755（Ｍ＋１）、73
7、645、625、609。
ステツプとしては、次のようにして最初のADM−ヒドラ
ゾン誘導体を合成するものである： イソプロピルアルコール中の0.3mlの1Mヒドラゾン、
（NH２NH２）溶液を、THF（テトラヒドロフラン）3ml中
のSPDP（70mg,0.22mmol）の冷却溶液中に加えた。20℃
で20分間撹拌した後、生成物をCH２Cl２で抽出し、次に
塩水で洗い、Ｋ２CO３上で乾燥した。溶媒をエバポレー
シヨンした後得られた残留物を中性アルミナ（５％Ｍ６
OH,95％CH２Cl２）上でクロマトグラフイーにかけ、21m
g（41％）の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル
・ヒドラジド（第１図の化合物２）を得た。このヒドラ
ジド及びアドリアマイシン・HCl（三楽（株）から入
手）（48mg,0.083mmol）を5mlのＭ６OH中に溶解し、次
に暗室中室温で６日間撹拌した。反応混合物を逆相薄層
クロマトグラフイー（TLC）（Ｍ６OH:H２Ｏ＝2:1、３％
w/vNH４OAc含有）にかけた。この処理の後、溶媒をエバ
ポレーシヨンし、残留物をC18カラム（Ｍ６OH:H２Ｏ＝
3:2、３％w/vNH４OAc含有）上のクロマトグラフイーに
かけた。分画を一緒にして、凍結乾燥し、過剰のNH４OA
cを減圧下に除去した。残留物をＭ６OH中で溶解し、ア
セトニトリルを加えて沈澱させ、45mg（72％）のアドリ
アマイシン・13−｛３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オニル｝−ヒドラゾン塩酸塩（以降ADM−HZNという）
（第１図の化合物４）を得た。ADM−HZNは次なる特性を
有する： mp＞125°色が暗色化し、明確な値を示さない;NMR（ア
セトン−ｄ６，δ）1.25（s,3H,J＝6Hz）、1.77（m,1
H）、2.06（m,1H）、2.30（m,1H）、2.53（d,1H,J＝15H
z）、2.89−3.18（m,6H）、3.71（m,1H）、3.85（m,1
H）、3.97（m,1H）、4.07（s,3H）、4.78（s,2H）、5.2
1（m,1H）、5.58（t,1H,J＝7Hz）、7.12（m,1H）、7.64
（d,1H,J＝8Hx）、7.75（m,2H）、7.90（t,1H,J＝8H
z）、7.98（d,1H,J＝8Hz）、8.37（d,1H,J＝4Hz）、10.
50（s,1H）、10.52（s,1H）、14.19（bs,1H）;IR（KB
r）3438、1674、1618、1579、1419、1286、1016、988、
698cm-1;FABMS（グリセロール）m/6755（Ｍ＋１）、73
7、645、625、609。
モノクローナル抗体のチオール化 上記されたようにして製造されたADM−HZN化合物を当
該モノクローナル抗体と反応させる前に、抗体はチオー
ル化されなければならない、すなわち、反応性のスルフ
ヒドリル基を抗体分子中に導入しなければならない。
該モノクローナル抗体と反応させる前に、抗体はチオー
ル化されなければならない、すなわち、反応性のスルフ
ヒドリル基を抗体分子中に導入しなければならない。
使用されるモノクローナル抗体としては： １）5E9（分裂するすべてのヒト細胞上のトランスフエ
リン・レセプターに反応性を有し、そして癌細胞の各種
の組織タイプのものと交差反応性を有しているIgG１抗
体）； ２）T33A1（以下、「3A1」という）（40KdヒトＴ細胞抗
原と反応性を有し、そしてまた多くのＴ細胞白血病に見
出されるIgG１抗体）； ３）G28.5（50KdヒトＢ細胞抗原と反応性を有し、そし
てまたヒトＢ細胞リンパ腫とも反応性を有しているIgG
１抗体）； ４）G28.1（39KdヒトＢ細胞抗原と反応性を有し、そし
てまたＢ細胞リンパ腫と反応性を有しているIgG１抗
体）； ５）L6（ヒト肺癌の小細胞癌でないものの上にあるグリ
コピツド抗原に反応性を有するIgG2a抗体） 5E9モノクローナル抗体及びT33A1モノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマは、ATCC（American Type Cu
lture Collection）から入手した。それぞれの抗体は、
C.Bruck et al.,“One−Step Purification Of Mouse M
onoclonal Antibodies From Asutic Fluid By DEAE−Af
figel Blue Chromatography,“J.Immun Methods,56、p
p.313−19（1982）の方法に従つて、BALB/Cマウスにお
いて製造された腹水から精製された。精製されたG28.
5、G28.1及びL6は、Drs.J.Ledbetter及びI.Hellstrom
（Oncogen,Seattle,WA）から得られた。L6モノクローナ
ル抗体及びG28.5モノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマは、それぞれATCC受託番号HB8677（1984年12月
６日に寄託）及びATCC受託番号HB9110（1986年５月22日
に寄託）のもとにATCCに寄託されている。G28.1モノク
ローナル抗体は、CD37抗原の主要エピトープと反応性を
有しているところの当該分野で知られている多くの抗体
の一つであり、A.J.Michael（ed.）、Leukocyte Typing
III,Oxford University Press（U.K.1987）においてそ
の特性が示されている。これらCD37抗体の多くは、市販
されて入手することができる。
リン・レセプターに反応性を有し、そして癌細胞の各種
の組織タイプのものと交差反応性を有しているIgG１抗
体）； ２）T33A1（以下、「3A1」という）（40KdヒトＴ細胞抗
原と反応性を有し、そしてまた多くのＴ細胞白血病に見
出されるIgG１抗体）； ３）G28.5（50KdヒトＢ細胞抗原と反応性を有し、そし
てまたヒトＢ細胞リンパ腫とも反応性を有しているIgG
１抗体）； ４）G28.1（39KdヒトＢ細胞抗原と反応性を有し、そし
てまたＢ細胞リンパ腫と反応性を有しているIgG１抗
体）； ５）L6（ヒト肺癌の小細胞癌でないものの上にあるグリ
コピツド抗原に反応性を有するIgG2a抗体） 5E9モノクローナル抗体及びT33A1モノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマは、ATCC（American Type Cu
lture Collection）から入手した。それぞれの抗体は、
C.Bruck et al.,“One−Step Purification Of Mouse M
onoclonal Antibodies From Asutic Fluid By DEAE−Af
figel Blue Chromatography,“J.Immun Methods,56、p
p.313−19（1982）の方法に従つて、BALB/Cマウスにお
いて製造された腹水から精製された。精製されたG28.
5、G28.1及びL6は、Drs.J.Ledbetter及びI.Hellstrom
（Oncogen,Seattle,WA）から得られた。L6モノクローナ
ル抗体及びG28.5モノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマは、それぞれATCC受託番号HB8677（1984年12月
６日に寄託）及びATCC受託番号HB9110（1986年５月22日
に寄託）のもとにATCCに寄託されている。G28.1モノク
ローナル抗体は、CD37抗原の主要エピトープと反応性を
有しているところの当該分野で知られている多くの抗体
の一つであり、A.J.Michael（ed.）、Leukocyte Typing
III,Oxford University Press（U.K.1987）においてそ
の特性が示されている。これらCD37抗体の多くは、市販
されて入手することができる。
いずれのこれらの抗体もSPDPで次のようにしてチオー
ル化された： SPDP（Pierce Chemical Co.,IL）（50ml）（エタノール
に溶解）を、PBS中で選択したモノクローナル抗体、例
えば5E9（５−10mg/ml）に加え、５−10mMの最終濃度の
ものとした。反応混合物を30分間30℃でインキユベーシ
ヨンした。未反応のSPDPを、PD−10カラム（Pharmaci
a）を用いたゲルフイルトレーシヨンクロマトグラフイ
ーにかけてSPDP誘導体化された抗体から分離した。過剰
なDTTで還元してチオピリジル保護基を除去した。還元
された抗体をPD−10カラムに通し、該遊離のチオールを
含有する抗体は該ADM−HZN誘導体との縮合に用いられた
（第２図参照）。
ル化された： SPDP（Pierce Chemical Co.,IL）（50ml）（エタノール
に溶解）を、PBS中で選択したモノクローナル抗体、例
えば5E9（５−10mg/ml）に加え、５−10mMの最終濃度の
ものとした。反応混合物を30分間30℃でインキユベーシ
ヨンした。未反応のSPDPを、PD−10カラム（Pharmaci
a）を用いたゲルフイルトレーシヨンクロマトグラフイ
ーにかけてSPDP誘導体化された抗体から分離した。過剰
なDTTで還元してチオピリジル保護基を除去した。還元
された抗体をPD−10カラムに通し、該遊離のチオールを
含有する抗体は該ADM−HZN誘導体との縮合に用いられた
（第２図参照）。
反応性のチオール基または２−ITを用いて抗体タンパ
ク質上に導入された： 抗体（50mMトリエチルアミン、50mM NaCl及び1mM EDT
A、pH8.0中の５−10mg/ml）を最終濃度５−10mMの２−I
T（Pierce Chemical Co.,IL）と混合した。反応混合物
を90分間４℃で処理し、チオール化された抗体を2M NaC
l/PBSで平衡化したPD−10カラム上で分離した。抗体上
に導入された反応性チオール基の数は、G.L.Ellman,Arc
h.Biochem.Biophys.82、pp.70−77（1959）の方法に従
つて、DTNB（5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）（E412＝14150）を用いて決定した。
ク質上に導入された： 抗体（50mMトリエチルアミン、50mM NaCl及び1mM EDT
A、pH8.0中の５−10mg/ml）を最終濃度５−10mMの２−I
T（Pierce Chemical Co.,IL）と混合した。反応混合物
を90分間４℃で処理し、チオール化された抗体を2M NaC
l/PBSで平衡化したPD−10カラム上で分離した。抗体上
に導入された反応性チオール基の数は、G.L.Ellman,Arc
h.Biochem.Biophys.82、pp.70−77（1959）の方法に従
つて、DTNB（5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香
酸）（E412＝14150）を用いて決定した。
チオール化モノクローナル抗体をADM−HZNでコンジユ
ゲート化する 次の上記のようにしてチオール化されたモノクローナ
ル抗体をそれぞれADM−HZNに結合せしめるところの種々
のコンジユゲート化法が実施される（第２図参照）。
ゲート化する 次の上記のようにしてチオール化されたモノクローナ
ル抗体をそれぞれADM−HZNに結合せしめるところの種々
のコンジユゲート化法が実施される（第２図参照）。
ADM−HZNはメタノールに溶解され、PBS中のSPDP−チ
オール化抗体または2M NaCl/PBS中の２−IT−チオール
化抗体に加えられる。代表的な実施例においては、10当
量のADM−HZNを10−20個の反応性のチオール基を含有す
るモノクローナル抗体中に加えられる。コンジユゲーシ
ヨン化反応は、４℃で１晩インキユベーシヨンしてなさ
れた。反応混合物を10,000×ｇで遠心し、次にコンジユ
ゲート化したADMをPD−10カラムを通して未反応ADMから
分離した。抗体に結合したコンジユゲート化されたアン
トラサイクリンの量を495nm（E495＝8030）の吸光度に
より測定した。抗体タンパク質の量は、280nm（1mg/ml
＝1.4OD単位）の吸光度により測定した。280nmにおける
ADM吸収の重なりを補正するため、次なる式を使用し
た： A280:280nmでの吸光度 A495:495nmでの吸光度 HPLC分析法を用いてイムノコンジユゲートにコンジユ
ゲート化されていないADMまたはADM誘導体が存在するか
否かを分析した。HPLCは、５ミクロンのIB−SIL C18ビ
ーズをパツクしたPhenomenexカラムを用いてなされた。
コンジユゲート化されていないADM−HCl、ADM−HZN（0.
1μmole）、または0.5−５μmoleの薬剤当量を含有する
イムノコンジユゲートをそのカラムにかけ、1.5ml/min
でメタノール及び10mMリン酸アンモニウム、pH4.5（70:
30）の液で溶出した。PHLC分析法により製造されたいず
れのイムノコンジユゲートも、何ら有意な量（＜１％）
のコンジユゲート化されていない薬剤も含有していなか
つた。
オール化抗体または2M NaCl/PBS中の２−IT−チオール
化抗体に加えられる。代表的な実施例においては、10当
量のADM−HZNを10−20個の反応性のチオール基を含有す
るモノクローナル抗体中に加えられる。コンジユゲーシ
ヨン化反応は、４℃で１晩インキユベーシヨンしてなさ
れた。反応混合物を10,000×ｇで遠心し、次にコンジユ
ゲート化したADMをPD−10カラムを通して未反応ADMから
分離した。抗体に結合したコンジユゲート化されたアン
トラサイクリンの量を495nm（E495＝8030）の吸光度に
より測定した。抗体タンパク質の量は、280nm（1mg/ml
＝1.4OD単位）の吸光度により測定した。280nmにおける
ADM吸収の重なりを補正するため、次なる式を使用し
た： A280:280nmでの吸光度 A495:495nmでの吸光度 HPLC分析法を用いてイムノコンジユゲートにコンジユ
ゲート化されていないADMまたはADM誘導体が存在するか
否かを分析した。HPLCは、５ミクロンのIB−SIL C18ビ
ーズをパツクしたPhenomenexカラムを用いてなされた。
コンジユゲート化されていないADM−HCl、ADM−HZN（0.
1μmole）、または0.5−５μmoleの薬剤当量を含有する
イムノコンジユゲートをそのカラムにかけ、1.5ml/min
でメタノール及び10mMリン酸アンモニウム、pH4.5（70:
30）の液で溶出した。PHLC分析法により製造されたいず
れのイムノコンジユゲートも、何ら有意な量（＜１％）
のコンジユゲート化されていない薬剤も含有していなか
つた。
本発明のイムノコヂユゲートの特性 このようにして製造されたイムノコンジユゲートはそ
の薬剤と各モノクローナル抗体との間にプリツジを形成
するところのリンカーアームにその13−ケト基の位置で
コンジユゲート化されたADM分子から成るものであつ
た。さらに、遊離のチオール基を持つモノクローナル抗
体を、チオピリジル基で保護されたジスルフイド結合を
持つADM−HZHに加えると、ADMを該抗体を結合せしめて
いるリンカー中にジスルフイド結合が形成されることに
なつた（第２図参照）。本具体例に従つて製造されたイ
ムノコンジユゲートとしては、5E9−ADM−7.5、3A1−AD
M−7.0、L6−ADM−9.0及びG28.1−ADM−9.0があげられ
るが、それに限定されるものではない（上記において、
最初の表示記号は、コンジユゲートを製造するにあたり
用いられたモノクローナル抗体を表わしており、その第
２番目の部分は該抗体に結合せしめられたアントラサイ
クリンを示しており、そしてその数字は、特定のイムノ
コンジユゲート中のADM/抗体のモル比を示している）。
の薬剤と各モノクローナル抗体との間にプリツジを形成
するところのリンカーアームにその13−ケト基の位置で
コンジユゲート化されたADM分子から成るものであつ
た。さらに、遊離のチオール基を持つモノクローナル抗
体を、チオピリジル基で保護されたジスルフイド結合を
持つADM−HZHに加えると、ADMを該抗体を結合せしめて
いるリンカー中にジスルフイド結合が形成されることに
なつた（第２図参照）。本具体例に従つて製造されたイ
ムノコンジユゲートとしては、5E9−ADM−7.5、3A1−AD
M−7.0、L6−ADM−9.0及びG28.1−ADM−9.0があげられ
るが、それに限定されるものではない（上記において、
最初の表示記号は、コンジユゲートを製造するにあたり
用いられたモノクローナル抗体を表わしており、その第
２番目の部分は該抗体に結合せしめられたアントラサイ
クリンを示しており、そしてその数字は、特定のイムノ
コンジユゲート中のADM/抗体のモル比を示している）。
本具体例で達成されるADM/抗体のモル比は、モノクロ
ーナル抗体上に導入されるチオール基の数及びチオール
化された抗体に加えられるADM−HZNの量によつて異な
る。第３図及び第４図の分布図は、ADM−HZNを、おおよ
そ８個のチオール基を含有している5E9モノクローナル
抗体または3A1モノクローナル抗体のいずれかと縮合せ
しめるとADM/抗体の比３−４が達成されることを示して
いる。代表例では、タンパク質に対して10倍モルだけ過
剰な量のADM−HZNをこれら反応液中に加えた。18−25個
のチオール基を持つ抗体が用いられる場合にはADM/抗体
比は８−10にまで大きくなつた。モノクローナル抗体を
チオール化するためにSPDPまたは２−ITを用いた場合に
は、そこにはADM/抗体比に有意の差はなかつた（第３図
と第４図を比較）。しかしながら、薬物を続いて抗体に
コンジユゲートしての最終タンパク質収量については、
２−ITでチオール化された抗体に比較してSPDPでチオー
ル化された抗体の方が幾分か高いものであつた（第５図
参照）。一般的にはSPDPでチオール化された5E9及び3A1
のような抗体においては50−80％のタンパク質の収率が
得られたが、一方２−ITを使用してチオール化された同
じ抗体では20−50％の収率であつた。加えて、SPDPまた
は２−ITを用いて行なわれるコンジユゲーシヨン化につ
いて5E9及び3A1のようなIgG１イソタイプのモノクロー
ナル抗体を使用すると幾分良好なイムノコンジユゲート
収量が得られた（第６図及び第７図参照）。
ーナル抗体上に導入されるチオール基の数及びチオール
化された抗体に加えられるADM−HZNの量によつて異な
る。第３図及び第４図の分布図は、ADM−HZNを、おおよ
そ８個のチオール基を含有している5E9モノクローナル
抗体または3A1モノクローナル抗体のいずれかと縮合せ
しめるとADM/抗体の比３−４が達成されることを示して
いる。代表例では、タンパク質に対して10倍モルだけ過
剰な量のADM−HZNをこれら反応液中に加えた。18−25個
のチオール基を持つ抗体が用いられる場合にはADM/抗体
比は８−10にまで大きくなつた。モノクローナル抗体を
チオール化するためにSPDPまたは２−ITを用いた場合に
は、そこにはADM/抗体比に有意の差はなかつた（第３図
と第４図を比較）。しかしながら、薬物を続いて抗体に
コンジユゲートしての最終タンパク質収量については、
２−ITでチオール化された抗体に比較してSPDPでチオー
ル化された抗体の方が幾分か高いものであつた（第５図
参照）。一般的にはSPDPでチオール化された5E9及び3A1
のような抗体においては50−80％のタンパク質の収率が
得られたが、一方２−ITを使用してチオール化された同
じ抗体では20−50％の収率であつた。加えて、SPDPまた
は２−ITを用いて行なわれるコンジユゲーシヨン化につ
いて5E9及び3A1のようなIgG１イソタイプのモノクロー
ナル抗体を使用すると幾分良好なイムノコンジユゲート
収量が得られた（第６図及び第７図参照）。
本発明のイムノコンジユゲートの結合活性は、125I−
ラベルで標識化された抗体を用いる競合アツセイ法によ
つて測定した。それぞれ抗原について陽性の細胞及び抗
原について陰性の細胞（１×10６）は、２％FBSを含有
するRPMI1640の0.1mlに懸濁化され、初濃度が50μg/ml
で、順次２倍に希釈されたコンジユゲート化されてない
モノクローナル抗体またはイムノコンジユゲートの0.1m
lと混合した。該細胞懸濁液（２本組）を４℃で１時間
混合しながらインキユベーシヨンした。次に細胞を２回
洗滌し、125Iでラベルされた均一な抗体（１−50×10４
cpm/μｇ抗体タンパク質の比活性）５μg/mlを含有する
液0.1ml中に懸濁する。サンプルを４℃で１時間インキ
ユベーシヨンし、次に４℃に冷却されたジブチル：ジノ
ニルフタレートの1:1混合物0.15ml上に置いた。サンプ
ルを10,000×ｇで１分間４℃で遠心し、細胞に結合して
いるカウント数（ペレツト,pellet）をLKBガンマーカウ
ンターを用いて測定した。
ラベルで標識化された抗体を用いる競合アツセイ法によ
つて測定した。それぞれ抗原について陽性の細胞及び抗
原について陰性の細胞（１×10６）は、２％FBSを含有
するRPMI1640の0.1mlに懸濁化され、初濃度が50μg/ml
で、順次２倍に希釈されたコンジユゲート化されてない
モノクローナル抗体またはイムノコンジユゲートの0.1m
lと混合した。該細胞懸濁液（２本組）を４℃で１時間
混合しながらインキユベーシヨンした。次に細胞を２回
洗滌し、125Iでラベルされた均一な抗体（１−50×10４
cpm/μｇ抗体タンパク質の比活性）５μg/mlを含有する
液0.1ml中に懸濁する。サンプルを４℃で１時間インキ
ユベーシヨンし、次に４℃に冷却されたジブチル：ジノ
ニルフタレートの1:1混合物0.15ml上に置いた。サンプ
ルを10,000×ｇで１分間４℃で遠心し、細胞に結合して
いるカウント数（ペレツト,pellet）をLKBガンマーカウ
ンターを用いて測定した。
本発明のイムノコンジユゲートによる残留結合活性
は、下記表１に示される。
は、下記表１に示される。
ａ〔Ｉｔ〕＝抗体トレーサーを50％阻害するところの抗
体コンジユゲートのモル濃度ｂ 〔Ｔｔ〕＝抗体トレーサーを50％阻害することろの抗
体のモル濃度c Kconj＝次式： （KAbはScatchard分析によつて決められたコンジユゲー
ト化されていないMAbの平衡定数である） を用いて計算された相対（Ｋ）親和性 該表に示されているように、SPDPを用いて製造され、
3.5〜8.5のモル比の範囲を有する5E9イムノコンジユゲ
ートは、コンジユゲート化されていない5E9に比べて、
そのもともとの結合活性の80％以上もの結合活性を保持
していた。また２−ITを用いて製造された5E9イムノコ
ンジユゲートは、非常に高い結合活性を保持していた。
SPDPを用いて製造された3A1イムノコンジユゲートは、
その抗体の結合活性がすこし失なわれていた。一般的に
は、ADMをこれらの抗体またはその他の抗体にコンジユ
ゲート化すると、その抗体の結合活性は、比較的には僅
かだが低下する。
体コンジユゲートのモル濃度ｂ 〔Ｔｔ〕＝抗体トレーサーを50％阻害することろの抗
体のモル濃度c Kconj＝次式： （KAbはScatchard分析によつて決められたコンジユゲー
ト化されていないMAbの平衡定数である） を用いて計算された相対（Ｋ）親和性 該表に示されているように、SPDPを用いて製造され、
3.5〜8.5のモル比の範囲を有する5E9イムノコンジユゲ
ートは、コンジユゲート化されていない5E9に比べて、
そのもともとの結合活性の80％以上もの結合活性を保持
していた。また２−ITを用いて製造された5E9イムノコ
ンジユゲートは、非常に高い結合活性を保持していた。
SPDPを用いて製造された3A1イムノコンジユゲートは、
その抗体の結合活性がすこし失なわれていた。一般的に
は、ADMをこれらの抗体またはその他の抗体にコンジユ
ゲート化すると、その抗体の結合活性は、比較的には僅
かだが低下する。
第８図は、本発明の２個のイムノコンジユゲート、5E
9−ADM−7.5及び3A1−ADM−7.0の結合活性のカーブを、
コンジユゲート化されていないモノクローナル抗体5E9
及び3A1の結合活性のカーブと比較して示したものであ
る。これらのカーブを得るため、該イムノコンジユゲー
トを１×10６個の抗原について陽性のHSB−２ターゲツ
ト細胞を含有する完全生育培地0.1ml中で４℃でインキ
ユベーシヨンした。１時間後に、その細胞をその培地で
２回洗い、更に30分間FITCでラベルされたヤギの抗マウ
スIgG（Boehringer−Mannheim）の1:40希釈物を含有す
る培地0.1ml中でインキユベーシヨンした。該細胞をCou
lter Epics V蛍光細胞アナライザー中で分析した。その
細胞表面の蛍光は、同様にして希釈されたコンジユゲー
ト化されていないモノクローナル抗体を用いて得られた
蛍光と比較された。図に示されているように、それぞれ
該イムノコンジユゲートの結合活性が保持されていると
いうことは、抗原について陽性の細胞を飽和するのに必
要なイムノコンジユゲートの濃度は、コンジユゲート化
されていない抗体の場合必要な濃度よりもせいぜいそれ
が２倍に希釈されている程度に大きいものであるという
事実によつて示される。コンジユゲート化されていない
抗体と該イムノコンジユゲートとの間でその蛍光強度の
プラトー値の違いは、FITC−ヤギ抗マウスの第二次試薬
が該コンジユゲート化されていない抗体に比して該イム
ノコンジユゲートに対してその結合活性が低下している
ことによることが見出された。
9−ADM−7.5及び3A1−ADM−7.0の結合活性のカーブを、
コンジユゲート化されていないモノクローナル抗体5E9
及び3A1の結合活性のカーブと比較して示したものであ
る。これらのカーブを得るため、該イムノコンジユゲー
トを１×10６個の抗原について陽性のHSB−２ターゲツ
ト細胞を含有する完全生育培地0.1ml中で４℃でインキ
ユベーシヨンした。１時間後に、その細胞をその培地で
２回洗い、更に30分間FITCでラベルされたヤギの抗マウ
スIgG（Boehringer−Mannheim）の1:40希釈物を含有す
る培地0.1ml中でインキユベーシヨンした。該細胞をCou
lter Epics V蛍光細胞アナライザー中で分析した。その
細胞表面の蛍光は、同様にして希釈されたコンジユゲー
ト化されていないモノクローナル抗体を用いて得られた
蛍光と比較された。図に示されているように、それぞれ
該イムノコンジユゲートの結合活性が保持されていると
いうことは、抗原について陽性の細胞を飽和するのに必
要なイムノコンジユゲートの濃度は、コンジユゲート化
されていない抗体の場合必要な濃度よりもせいぜいそれ
が２倍に希釈されている程度に大きいものであるという
事実によつて示される。コンジユゲート化されていない
抗体と該イムノコンジユゲートとの間でその蛍光強度の
プラトー値の違いは、FITC−ヤギ抗マウスの第二次試薬
が該コンジユゲート化されていない抗体に比して該イム
ノコンジユゲートに対してその結合活性が低下している
ことによることが見出された。
本具体例のイムノコンジユゲート（L6−ADMコンジユ
ゲート）の各種のpH領域（4.0〜7.0）での安定性が、HP
LC分析法を用いて調べられた。L6−ADM−9.0コンジユゲ
ートをリン酸塩緩衝液中、24時間37℃で、指示されたそ
れぞれのpHでインキユベーシヨンした。次に各溶液をHP
LCカラムにかけ、コンジユゲート化されていない薬剤の
量を測定した。第９図に示すように、異なつたpH下で24
時間インキユベーシヨンした後に検知された単一生成物
は、ADM−HClスタンダードのカラム滞留時間と同じ値を
示した。24時間の後にそのイムノコンジユゲートから放
出される物質の量は、pHが７から４へと下がるとそれに
つれ増加した。「未処理」コントロールとは、pH7.4の
リン酸塩緩衝液中−20℃で保存されたコンジユゲートに
ついてのクロマトグラフイー値をいう。したがつて、該
イムノコンジユゲートは、該抗体タンパク質からADMを
放出することを起こす酸に感受性を有する結合群を持つ
ことが明らかである。これらの結果は、第２図に記載さ
れているように該ADMがリンカーアームに結合せしめら
れるところのヒドラゾン結合を持つことと一致するもの
である。
ゲート）の各種のpH領域（4.0〜7.0）での安定性が、HP
LC分析法を用いて調べられた。L6−ADM−9.0コンジユゲ
ートをリン酸塩緩衝液中、24時間37℃で、指示されたそ
れぞれのpHでインキユベーシヨンした。次に各溶液をHP
LCカラムにかけ、コンジユゲート化されていない薬剤の
量を測定した。第９図に示すように、異なつたpH下で24
時間インキユベーシヨンした後に検知された単一生成物
は、ADM−HClスタンダードのカラム滞留時間と同じ値を
示した。24時間の後にそのイムノコンジユゲートから放
出される物質の量は、pHが７から４へと下がるとそれに
つれ増加した。「未処理」コントロールとは、pH7.4の
リン酸塩緩衝液中−20℃で保存されたコンジユゲートに
ついてのクロマトグラフイー値をいう。したがつて、該
イムノコンジユゲートは、該抗体タンパク質からADMを
放出することを起こす酸に感受性を有する結合群を持つ
ことが明らかである。これらの結果は、第２図に記載さ
れているように該ADMがリンカーアームに結合せしめら
れるところのヒドラゾン結合を持つことと一致するもの
である。
本実施例の具体例に従つて、ADMは、ジスルフイド結
合をも含有しているところのリンカーアームを介して抗
体に結合している（第２図参照）。したがつて、本具体
例のイムノコンジユゲートはDTTで還元することによりA
DM部を放出することができる。それ故に、L6−ADMコン
ジユゲート、L6−ADM−9.0を、10倍過剰な量のDTTで処
理し、室温で15分間インキユベーシヨンし、次にHPLCカ
ラムにかけてみた。同時にADM−HCl及びADM−HZN標準液
をかけた。クロマトグラフイーにより得られたピークは
第10図に示す。DTTを加える前にはL6−ADM−9.0は、何
ら測定されうるようなコジユゲート化されていない薬剤
のピークを示さなかつた。HPLC分析により、ADM−HZN誘
導体よりむしろADM−HClのカラム滞留時間に類似してい
る値を有する単一ピークの存在が示された（第10図参
照）。DTT処理の後放出されたADMの量は抗体に結合せし
められた出発ADM当量のおおよそ99％であつた。第９図
及び第10図の実験ゲータは、ADM様部分が、本発明のイ
ムノコンジユゲートから、「生理的な（physiologi
c）」条件、すなわち、酸性の条件あるいは還元性の条
件（典型的な細胞環境）下で遊離（放出）せられること
を示している。
合をも含有しているところのリンカーアームを介して抗
体に結合している（第２図参照）。したがつて、本具体
例のイムノコンジユゲートはDTTで還元することによりA
DM部を放出することができる。それ故に、L6−ADMコン
ジユゲート、L6−ADM−9.0を、10倍過剰な量のDTTで処
理し、室温で15分間インキユベーシヨンし、次にHPLCカ
ラムにかけてみた。同時にADM−HCl及びADM−HZN標準液
をかけた。クロマトグラフイーにより得られたピークは
第10図に示す。DTTを加える前にはL6−ADM−9.0は、何
ら測定されうるようなコジユゲート化されていない薬剤
のピークを示さなかつた。HPLC分析により、ADM−HZN誘
導体よりむしろADM−HClのカラム滞留時間に類似してい
る値を有する単一ピークの存在が示された（第10図参
照）。DTT処理の後放出されたADMの量は抗体に結合せし
められた出発ADM当量のおおよそ99％であつた。第９図
及び第10図の実験ゲータは、ADM様部分が、本発明のイ
ムノコンジユゲートから、「生理的な（physiologi
c）」条件、すなわち、酸性の条件あるいは還元性の条
件（典型的な細胞環境）下で遊離（放出）せられること
を示している。
本発明のイムノコンジユゲートの細胞毒活性 本発明のイムノコンジユゲードは、種々のアツセイ系
を用いて試験管内で（in vitro）その細胞毒活性がテス
トされた。軟寒天コロニー形成アツセイ法に従えば、Da
udi細胞（バーキツトリンパ腫,Burkitt′s lymphoma）
（フエノタイプ:5E9＋,3A1−）〔ATCCより入手〕を完全
倍地（RPM1 1640倍地＋10％胎児牛血清〕中で生育させ
た。1mlの倍地中の１×10５個の細胞を、1.5時間、連続
的に希釈された5E9−ADMまたは3A1−ADMイムノコンジユ
ゲートまたはコンジユゲート化されていないADM液にさ
らした。各希釈について各三つづつ測定を行なつた。コ
ントロールは、薬剤にはさらされていないが同様に処理
された細胞からなるものである。次に細胞を洗滌し、15
％FBS及び0.3％アガロース（Marine Colloid）を含有す
るRPMI 1640倍地中に懸濁した。次に1mlの細胞懸濁液
（１×10３個細胞）を、６−ウエルのマイクロタイター
プレート（Costar）中の0.4％寒天層上に重層した。サ
ンプルを37℃で７−10日間インキユベーシヨンし、得ら
れたコロニーを48時間1mg/mlのｐ−ヨードニトロテトラ
ゾリウムバイオレツト（Sigma）0.5mlでもつて染色し
た。コロニー数をOptimax40−10イメージアナライザー
を用いて数え、コロニー形成の阻害率を薬剤で処理また
はイムノコンジユゲートで処理した細胞と未処理コント
ロールとを比較して決めた。
を用いて試験管内で（in vitro）その細胞毒活性がテス
トされた。軟寒天コロニー形成アツセイ法に従えば、Da
udi細胞（バーキツトリンパ腫,Burkitt′s lymphoma）
（フエノタイプ:5E9＋,3A1−）〔ATCCより入手〕を完全
倍地（RPM1 1640倍地＋10％胎児牛血清〕中で生育させ
た。1mlの倍地中の１×10５個の細胞を、1.5時間、連続
的に希釈された5E9−ADMまたは3A1−ADMイムノコンジユ
ゲートまたはコンジユゲート化されていないADM液にさ
らした。各希釈について各三つづつ測定を行なつた。コ
ントロールは、薬剤にはさらされていないが同様に処理
された細胞からなるものである。次に細胞を洗滌し、15
％FBS及び0.3％アガロース（Marine Colloid）を含有す
るRPMI 1640倍地中に懸濁した。次に1mlの細胞懸濁液
（１×10３個細胞）を、６−ウエルのマイクロタイター
プレート（Costar）中の0.4％寒天層上に重層した。サ
ンプルを37℃で７−10日間インキユベーシヨンし、得ら
れたコロニーを48時間1mg/mlのｐ−ヨードニトロテトラ
ゾリウムバイオレツト（Sigma）0.5mlでもつて染色し
た。コロニー数をOptimax40−10イメージアナライザー
を用いて数え、コロニー形成の阻害率を薬剤で処理また
はイムノコンジユゲートで処理した細胞と未処理コント
ロールとを比較して決めた。
第11図は、5E9抗原陽性で且つ3A1抗原陰性のバーキツ
トリンパ腫細胞Daudi細胞において1.5時間の処理の後の
5E9−ADMコンジユゲート、5E9−ADM−7.5及び3A1−ADM
コンジユゲート、3A1−ADM−7.0の細胞毒活性を比較し
て示すものである。このイムノコンジユゲートの両方共
２−ITによるチオール化によつて製造された。その用量
反応曲線を比較すると、抗原を有しているターゲツト細
胞に対するもともとの結合活性の93％を残して保有する
（第８図参照）ところの5E9−ADM−7.5は、結合性を有
しないコンジユゲートのコントロール、3A1−ADM−7.0
よりも著しく強い活性を持つことが示されている。
トリンパ腫細胞Daudi細胞において1.5時間の処理の後の
5E9−ADMコンジユゲート、5E9−ADM−7.5及び3A1−ADM
コンジユゲート、3A1−ADM−7.0の細胞毒活性を比較し
て示すものである。このイムノコンジユゲートの両方共
２−ITによるチオール化によつて製造された。その用量
反応曲線を比較すると、抗原を有しているターゲツト細
胞に対するもともとの結合活性の93％を残して保有する
（第８図参照）ところの5E9−ADM−7.5は、結合性を有
しないコンジユゲートのコントロール、3A1−ADM−7.0
よりも著しく強い活性を持つことが示されている。
限界希釈アツセイ法（これは、殺傷される細胞のlog
値の測定法を与える）が、より長期間の処理（24時間）
を使用し、上記２種のイムノコンジユゲートの細胞毒性
を有する薬剤活性のみるために使用せられた。本アツセ
イ法は、本質的には、M.Colombatti at al.,“Selectiv
e Killing Of Target Cells By Antibody−Ricin A Cha
in Or Antibody−Gelonin Hybrid Molecules;Compariso
n Of Cytoloxic Potency And Use In Immunoselection
Procedures"、J.Immunol.131、pp.309−95（1983）記載
されているようにしてNalmlwa細胞（フエノタイプ:5E9
＋,3A1−）を用いて行なわれた。ATCCから得られた細胞
は、22時間該イムノコンジユゲートとインキユベーシヨ
ンされ、洗滌され、殺傷された細胞のlog値を測定し
た。殺傷された細胞のlog値（log cell kill）は、限界
細胞濃度の生育しないウエルを求めることによつて決め
られる播種効率に基づいて計算される。
値の測定法を与える）が、より長期間の処理（24時間）
を使用し、上記２種のイムノコンジユゲートの細胞毒性
を有する薬剤活性のみるために使用せられた。本アツセ
イ法は、本質的には、M.Colombatti at al.,“Selectiv
e Killing Of Target Cells By Antibody−Ricin A Cha
in Or Antibody−Gelonin Hybrid Molecules;Compariso
n Of Cytoloxic Potency And Use In Immunoselection
Procedures"、J.Immunol.131、pp.309−95（1983）記載
されているようにしてNalmlwa細胞（フエノタイプ:5E9
＋,3A1−）を用いて行なわれた。ATCCから得られた細胞
は、22時間該イムノコンジユゲートとインキユベーシヨ
ンされ、洗滌され、殺傷された細胞のlog値を測定し
た。殺傷された細胞のlog値（log cell kill）は、限界
細胞濃度の生育しないウエルを求めることによつて決め
られる播種効率に基づいて計算される。
第12図において示されるように、5E9−ADM−7.5は、
結合性を持たない3A1−ADM−7.0コンジユゲートと比較
して、テストされた濃度では１〜２だけ大きな殺傷され
た細胞のlog値を与える。最大用量の5E9−ADM−7.5にお
いては５までの値の殺傷された細胞のlog値が測定され
た。さらに結合性を持たない3A1イムノコンジユゲート
において細胞毒活性が検知されているが、その値は、コ
ンジユゲート化されていないADMの等しい量のものより
劣るものであつた。一方、5E9イムノコンジユゲートの
活性は、遊離のADMの等しい量よりも２、３の濃度で非
常に高いものであつた。
結合性を持たない3A1−ADM−7.0コンジユゲートと比較
して、テストされた濃度では１〜２だけ大きな殺傷され
た細胞のlog値を与える。最大用量の5E9−ADM−7.5にお
いては５までの値の殺傷された細胞のlog値が測定され
た。さらに結合性を持たない3A1イムノコンジユゲート
において細胞毒活性が検知されているが、その値は、コ
ンジユゲート化されていないADMの等しい量のものより
劣るものであつた。一方、5E9イムノコンジユゲートの
活性は、遊離のADMの等しい量よりも２、３の濃度で非
常に高いものであつた。
上述したように、5E9−ADM−7.5及び3A1−ADM−7.0イ
ムノコンジユゲートは、チオール化剤として２−ITを用
いて合成される。チオール化剤としてSPDPを用いて製造
されたイムノコンジユゲートの免疫特異的な細胞毒性活
性もまた測定される。第13図は、上記した軟寒天コロニ
ー形成アツセイ法を用いて、チオール化剤としてSPDPを
用いて製造された5E9−ADM及び3A1−ADMイムノコンジユ
ゲートのDaudi細胞に対する選択的な細胞毒活性を示す
ものである。第14図にはさらにSPDPを用いて製造された
イムノコンジユゲートの選択的細胞毒活性が示されてい
るが、そこでは、軟寒天コロニー形成アツセイ法を用い
て２種のG28.1抗原陽性細胞（Dandi細胞及びNamalwa細
胞）、及び１種のG28.1抗原陰性ヒトＴ細胞白血病細胞
セルライン（HSB−２）においてのG28.1−ADM−9.0イム
ノコンジユゲートの作用をテストした。該HSB−２細胞
はATCCから得られる。該図に示されているように、該イ
ムノコンジユゲートは２種の抗原陽性細胞セルラインに
対しては細胞毒活性を示したが、抗原陰性細胞セルライ
ンに対してはそれを示さなかつた。またDr.M.Brattain
〔Bristol−Baylor Labs,Houston,Tx〕より入手した固
着依存性（anchorage−dependent）のヒト結腸癌セルラ
イン（HCT116）を用いてのコロニー形成アツセイ法にお
いて該イムノコンジユゲート（5E9−ADM−7.5）は選択
的に抗原陽性細胞を殺傷することが示された。
ムノコンジユゲートは、チオール化剤として２−ITを用
いて合成される。チオール化剤としてSPDPを用いて製造
されたイムノコンジユゲートの免疫特異的な細胞毒性活
性もまた測定される。第13図は、上記した軟寒天コロニ
ー形成アツセイ法を用いて、チオール化剤としてSPDPを
用いて製造された5E9−ADM及び3A1−ADMイムノコンジユ
ゲートのDaudi細胞に対する選択的な細胞毒活性を示す
ものである。第14図にはさらにSPDPを用いて製造された
イムノコンジユゲートの選択的細胞毒活性が示されてい
るが、そこでは、軟寒天コロニー形成アツセイ法を用い
て２種のG28.1抗原陽性細胞（Dandi細胞及びNamalwa細
胞）、及び１種のG28.1抗原陰性ヒトＴ細胞白血病細胞
セルライン（HSB−２）においてのG28.1−ADM−9.0イム
ノコンジユゲートの作用をテストした。該HSB−２細胞
はATCCから得られる。該図に示されているように、該イ
ムノコンジユゲートは２種の抗原陽性細胞セルラインに
対しては細胞毒活性を示したが、抗原陰性細胞セルライ
ンに対してはそれを示さなかつた。またDr.M.Brattain
〔Bristol−Baylor Labs,Houston,Tx〕より入手した固
着依存性（anchorage−dependent）のヒト結腸癌セルラ
イン（HCT116）を用いてのコロニー形成アツセイ法にお
いて該イムノコンジユゲート（5E9−ADM−7.5）は選択
的に抗原陽性細胞を殺傷することが示された。
該癌細胞の単層培養物をトリプシン−EDTA（GIBCO）
で処理し、培養フラスコから取り出し、洗つてから、22
−ゲージの針を通して、単細胞懸濁液を得た。5E9−ADM
−7.5、3A1−ADM−7.0またはコンジユゲート化されてい
ないADMを、１×10５個の該癌細胞を含有する培地0.2ml
で順次希釈した。それぞれの希釈液を３本づつ作成し
た。コントロールとしては未処理細胞または抗体で処理
された細胞があげられる。細胞は３時間インキユベーシ
ヨンされた後培地で１回洗滌され、次に1mlと培地中の
１×10３個の細胞を12−ウエルのマイクロタイタープレ
ート（Costar）中に播種した。プレートを37℃で７−10
日間インキユベーシヨンし、次に10分間無水メタノール
で固定化した。コロニーを結晶性バイオレツトで染色
し、Optimax 40−10イメージアナライザーで測定した。
第15図に示されているように、該癌細胞は5E9−ADM−7.
5により処理された場合には、3A1−ADM−7.0により処理
された場合に比べて非常に強い細胞毒作用を受けること
が示されている。
で処理し、培養フラスコから取り出し、洗つてから、22
−ゲージの針を通して、単細胞懸濁液を得た。5E9−ADM
−7.5、3A1−ADM−7.0またはコンジユゲート化されてい
ないADMを、１×10５個の該癌細胞を含有する培地0.2ml
で順次希釈した。それぞれの希釈液を３本づつ作成し
た。コントロールとしては未処理細胞または抗体で処理
された細胞があげられる。細胞は３時間インキユベーシ
ヨンされた後培地で１回洗滌され、次に1mlと培地中の
１×10３個の細胞を12−ウエルのマイクロタイタープレ
ート（Costar）中に播種した。プレートを37℃で７−10
日間インキユベーシヨンし、次に10分間無水メタノール
で固定化した。コロニーを結晶性バイオレツトで染色
し、Optimax 40−10イメージアナライザーで測定した。
第15図に示されているように、該癌細胞は5E9−ADM−7.
5により処理された場合には、3A1−ADM−7.0により処理
された場合に比べて非常に強い細胞毒作用を受けること
が示されている。
ADMのアミノ糖の所で抗体に結合した薬剤は、その薬
剤活性が著しく失なわれていることを示すイムノコンジ
ユゲートをもたらすという数多くの報告が示されている
ので、軟寒天コロニー形成アツセイ系を用いて、leu−a
laジペプチドリンカーを介して該薬剤のアミノ糖の所で
ADMを抗体に結合せしめることにより製造されたイムノ
コンジユゲートについてその細胞毒活性を測定した。第
16図に示されているように、Daudi細胞において5E9−AD
M−4.0及び3A1−ADM−3.9ペプチド結合コンジユゲート
はいずれも細胞毒活性を示さなかつた。コンジユゲート
を製造するのに用いられたADM−Leu−ala誘導体は、コ
ンジユゲート化されていないADMの等しい量のものより
約2logの値以上不活性である。
剤活性が著しく失なわれていることを示すイムノコンジ
ユゲートをもたらすという数多くの報告が示されている
ので、軟寒天コロニー形成アツセイ系を用いて、leu−a
laジペプチドリンカーを介して該薬剤のアミノ糖の所で
ADMを抗体に結合せしめることにより製造されたイムノ
コンジユゲートについてその細胞毒活性を測定した。第
16図に示されているように、Daudi細胞において5E9−AD
M−4.0及び3A1−ADM−3.9ペプチド結合コンジユゲート
はいずれも細胞毒活性を示さなかつた。コンジユゲート
を製造するのに用いられたADM−Leu−ala誘導体は、コ
ンジユゲート化されていないADMの等しい量のものより
約2logの値以上不活性である。
実施例2. 本実施例は、ADM分子への結合部としてアシルヒドラ
ゾン結合を有し、そして更に抗体への結合部としてチオ
エーテル結合を有しているリンカーアームを介してADM
がモノクローナル抗体に結合しているところの本発明に
従つたアントラサイクリンイムノコンジユゲートの製造
法を説明するものである。また本具体例では新規なADM
のアシルヒドラジド誘導体が提供される。
ゾン結合を有し、そして更に抗体への結合部としてチオ
エーテル結合を有しているリンカーアームを介してADM
がモノクローナル抗体に結合しているところの本発明に
従つたアントラサイクリンイムノコンジユゲートの製造
法を説明するものである。また本具体例では新規なADM
のアシルヒドラジド誘導体が提供される。
リンカーアーム内にチオエーテル結合を有するイムノ
コンジユゲートの製造法。
コンジユゲートの製造法。
モノクローナル抗体5E9（2.5mlリン酸塩緩衝化塩水液
中2.5mg）をSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート）（100μｌのテトラヒド
ロフラン中の59.5μｇ）と、30℃で30分間反応させた。
クエン酸ナトリウム緩衝液でpHを6.0に合わせた。混合
物をPD−10ゲルフイルトレーシヨンカラム（Pharmaci
a）に通し、未反応物質からマレイミド含有抗体を分離
した。実施例１に記載のようにして製造されたADM−HZN
誘導体（1mg）を次に1mlM6OH/H２Ｏ（9:1）中に溶解
し、0.5μmoleのADM−HZNを4:1のアセトン：H2O中で0.5
umoleのトリ−ｎ−ブチルホスフインと反応させ、新規
な還元されたADM−HZNを製造した（第12図参照）。10分
後に、トルエン中の0.1M硫黄を残留ホスフインを分解す
るために加えた。還元されたADM−HZNは次に5E9マレイ
ミド含有抗体と混合せられる。このようにして製造され
たイムノコンジユゲートはPD−10ゲルフイルトレーシヨ
ンカラムを通して精製された。トルエン溶媒の除去が完
全になされない場合には、反応混合物からタンパク質を
浮かべて流し、勇気溶媒相を分離した。空気をおだやか
に流し、溶媒を除去し、16,000×ｇで２分間混合物を遠
心して変性したタンパク質を除去した。次にイムノコン
ジユゲートを含有する澄んだ上清液をゲル過にかけ、
pH7.4のGPBS中で分析した。ADM/抗体比は、実施例１に
おいて記載したようにOD230及びOD495の吸光度を測定し
て決めた。代表的な反応では３〜４のモル比のイムノコ
ンジユゲートを得た。
中2.5mg）をSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレ
イミドフェニル）ブチレート）（100μｌのテトラヒド
ロフラン中の59.5μｇ）と、30℃で30分間反応させた。
クエン酸ナトリウム緩衝液でpHを6.0に合わせた。混合
物をPD−10ゲルフイルトレーシヨンカラム（Pharmaci
a）に通し、未反応物質からマレイミド含有抗体を分離
した。実施例１に記載のようにして製造されたADM−HZN
誘導体（1mg）を次に1mlM6OH/H２Ｏ（9:1）中に溶解
し、0.5μmoleのADM−HZNを4:1のアセトン：H2O中で0.5
umoleのトリ−ｎ−ブチルホスフインと反応させ、新規
な還元されたADM−HZNを製造した（第12図参照）。10分
後に、トルエン中の0.1M硫黄を残留ホスフインを分解す
るために加えた。還元されたADM−HZNは次に5E9マレイ
ミド含有抗体と混合せられる。このようにして製造され
たイムノコンジユゲートはPD−10ゲルフイルトレーシヨ
ンカラムを通して精製された。トルエン溶媒の除去が完
全になされない場合には、反応混合物からタンパク質を
浮かべて流し、勇気溶媒相を分離した。空気をおだやか
に流し、溶媒を除去し、16,000×ｇで２分間混合物を遠
心して変性したタンパク質を除去した。次にイムノコン
ジユゲートを含有する澄んだ上清液をゲル過にかけ、
pH7.4のGPBS中で分析した。ADM/抗体比は、実施例１に
おいて記載したようにOD230及びOD495の吸光度を測定し
て決めた。代表的な反応では３〜４のモル比のイムノコ
ンジユゲートを得た。
チオエーテル結合を有するイムノコンジユゲートの細胞
毒活性 本実施例の具体例に従つて製造された多くのイムノコ
ンジユゲートは、DNA合成の阻害度を測るところの３Ｈ
−チミジン取り込みアツセイ法を用い抗原陽性腫瘍細胞
対抗原陰性腫瘍細胞のそれぞれに対する細胞毒活性を調
べてテストした。本アツセイ法に従えば、該イムノコン
ジユゲートあるいはコンジユゲート化されていないADM
の希釈は完全な培地でなされ、各希釈液100μｌを96−
ウエルのマイクロタイタープレート中の各ウエルに加え
た。それぞれの希釈は、三本づつおこなつた。腫瘍細胞
を培地に懸濁し、１×10５個の細胞を含有する100μｌ
を各ウエル中に次に加えた。細胞を５％CO２の湿気のあ
る雰囲気中で24時間37℃でインキユベーシヨンした。１
μCi〔６−３Ｈ〕チミジン（New England Nuclear,15Ci
/mmole）を含有する50μｌをそれぞれのウエルに入れ、
37℃で４時間インキユベーシヨンした。細胞をMillitit
er svプレート（Millipore）に移し、25％の冷トリクロ
ロ酢酸（TCA）で沈殿処理した。沈殿５％の冷TCAで10回
洗つた。フイルターを乾燥し、パンチで穴をあけてと
り、Econofluor液体シンチレーシヨン液（New England
Nuclear）中でカウントした。すべてのカウントはバツ
クグラウンドカウントを差し引き補正した。
毒活性 本実施例の具体例に従つて製造された多くのイムノコ
ンジユゲートは、DNA合成の阻害度を測るところの３Ｈ
−チミジン取り込みアツセイ法を用い抗原陽性腫瘍細胞
対抗原陰性腫瘍細胞のそれぞれに対する細胞毒活性を調
べてテストした。本アツセイ法に従えば、該イムノコン
ジユゲートあるいはコンジユゲート化されていないADM
の希釈は完全な培地でなされ、各希釈液100μｌを96−
ウエルのマイクロタイタープレート中の各ウエルに加え
た。それぞれの希釈は、三本づつおこなつた。腫瘍細胞
を培地に懸濁し、１×10５個の細胞を含有する100μｌ
を各ウエル中に次に加えた。細胞を５％CO２の湿気のあ
る雰囲気中で24時間37℃でインキユベーシヨンした。１
μCi〔６−３Ｈ〕チミジン（New England Nuclear,15Ci
/mmole）を含有する50μｌをそれぞれのウエルに入れ、
37℃で４時間インキユベーシヨンした。細胞をMillitit
er svプレート（Millipore）に移し、25％の冷トリクロ
ロ酢酸（TCA）で沈殿処理した。沈殿５％の冷TCAで10回
洗つた。フイルターを乾燥し、パンチで穴をあけてと
り、Econofluor液体シンチレーシヨン液（New England
Nuclear）中でカウントした。すべてのカウントはバツ
クグラウンドカウントを差し引き補正した。
本具体例に従つたイムノコンジユゲート（5E9−ADM−
3.9）は、5E9抗原陽性のNamalwa細胞及びHSB−２細胞に
対して非常に高い細胞毒活性を示した（第18図参照）。
該イムノコンジユゲートは、コンジユゲート化されてい
ないADMの等しい農度のものに比べて非常に高い活性を
持つていた。別の実験においては、3A1−ADM−6.0イム
ノコンジユゲートは、0.1μg/ml ADMより低に濃度で、3
A1−抗原ン陽性HSB−２に対し細胞毒活性を示すが、3A1
−抗原陰性のNamalwa細胞に対しては活性が見出されな
かつた。より高い濃度では、該イムノコンジユゲートの
細胞毒活性は、両方のセルラインに対してほぼ同じもの
であつた。
3.9）は、5E9抗原陽性のNamalwa細胞及びHSB−２細胞に
対して非常に高い細胞毒活性を示した（第18図参照）。
該イムノコンジユゲートは、コンジユゲート化されてい
ないADMの等しい農度のものに比べて非常に高い活性を
持つていた。別の実験においては、3A1−ADM−6.0イム
ノコンジユゲートは、0.1μg/ml ADMより低に濃度で、3
A1−抗原ン陽性HSB−２に対し細胞毒活性を示すが、3A1
−抗原陰性のNamalwa細胞に対しては活性が見出されな
かつた。より高い濃度では、該イムノコンジユゲートの
細胞毒活性は、両方のセルラインに対してほぼ同じもの
であつた。
実施例3. 生体内（in vivo）における本発明イムノコンジユゲー
トの抗腫瘍活性 次に本発明のイムノコンジユゲートの抗腫瘍活性を生
体内（in vivo）試験でみた。特に、該イムノコンジユ
ゲートは、マウス中のヒトＢリンパ腫瘍の生育阻害活性
を試験された。
トの抗腫瘍活性 次に本発明のイムノコンジユゲートの抗腫瘍活性を生
体内（in vivo）試験でみた。特に、該イムノコンジユ
ゲートは、マウス中のヒトＢリンパ腫瘍の生育阻害活性
を試験された。
組織培養維持されているリンパ系細胞を皮下（s.c.）
接種して、一次的なDandi及びRamos（バーキツトリンパ
腫）固型腫瘍をBALB/cヌードマウスに作つた。Ramos細
胞セルラインはATCCから入手できる。次にDandi及びRam
os腫瘍は、PBS中の１×10７個の腫瘍細胞/0.1mlをマウ
スの側腹部の皮下に移植し、体重20−25g（Harlan Spra
gue−Dawley）の４−６週令の雌BALB/c（nu/nu）マウス
中in vivoで順次継代された。
接種して、一次的なDandi及びRamos（バーキツトリンパ
腫）固型腫瘍をBALB/cヌードマウスに作つた。Ramos細
胞セルラインはATCCから入手できる。次にDandi及びRam
os腫瘍は、PBS中の１×10７個の腫瘍細胞/0.1mlをマウ
スの側腹部の皮下に移植し、体重20−25g（Harlan Spra
gue−Dawley）の４−６週令の雌BALB/c（nu/nu）マウス
中in vivoで順次継代された。
腫瘍セルラインは、共に200〜400mm３の線型の増殖率
を示した。対数増殖期での平均腫瘍容積を二倍にする時
間はDaudi腫瘍では6.9±0.8日で、Ramos腫瘍では4.4±
0.6日であつた。腫瘍の容積（Ｖ）は次式： （上式中Ｌ＝長さ（mm）でＷは幅（mm）である） を用いて計算される。腫瘍の容積がDaudi腫瘍で400−60
0mm３に、Ramos腫瘍で250−400mm３に達した時にマウス
をランダムに５−10匹の群に分け、ADM−HCl（すなわち
遊離の薬剤）、本発明のADM−イムノコンジユゲート、
コンジユゲート化されていないモノクローナル抗体、コ
ンジユゲート化されていないモノクローナル抗体とADM
との混合物のそれぞれで処置した。試験されたイムノコ
ンジユゲート（すなわち、その抗体成分は攻撃されるべ
き腫瘍細胞と反応性を有している）によつて得られた抗
腫瘍活性を、結合性を持たないコンジユゲート（すなわ
ち該腫瘍群とは反応性を有さないコンジユゲート）を用
いて得られたものと比較することにより細胞殺傷性の特
異性が示されている。抗体＋遊離の薬剤の混合物は、薬
剤を抗体に共有結合する必要性を示すためのコントロー
ルである。
を示した。対数増殖期での平均腫瘍容積を二倍にする時
間はDaudi腫瘍では6.9±0.8日で、Ramos腫瘍では4.4±
0.6日であつた。腫瘍の容積（Ｖ）は次式： （上式中Ｌ＝長さ（mm）でＷは幅（mm）である） を用いて計算される。腫瘍の容積がDaudi腫瘍で400−60
0mm３に、Ramos腫瘍で250−400mm３に達した時にマウス
をランダムに５−10匹の群に分け、ADM−HCl（すなわち
遊離の薬剤）、本発明のADM−イムノコンジユゲート、
コンジユゲート化されていないモノクローナル抗体、コ
ンジユゲート化されていないモノクローナル抗体とADM
との混合物のそれぞれで処置した。試験されたイムノコ
ンジユゲート（すなわち、その抗体成分は攻撃されるべ
き腫瘍細胞と反応性を有している）によつて得られた抗
腫瘍活性を、結合性を持たないコンジユゲート（すなわ
ち該腫瘍群とは反応性を有さないコンジユゲート）を用
いて得られたものと比較することにより細胞殺傷性の特
異性が示されている。抗体＋遊離の薬剤の混合物は、薬
剤を抗体に共有結合する必要性を示すためのコントロー
ルである。
結果は、腫瘍の生育（Ｔ−Ｃ）阻止率または処置群の
生育カーブを、未接種コントロールと比較した時に腫瘍
の容積を倍化するに要する時間（TVDT）における遅れか
ら評価されるところの腫瘍倍化遅延率（TDD）として表
わされる。TDDは次式によつて計算される。
生育カーブを、未接種コントロールと比較した時に腫瘍
の容積を倍化するに要する時間（TVDT）における遅れか
ら評価されるところの腫瘍倍化遅延率（TDD）として表
わされる。TDDは次式によつて計算される。
（上式中Ｔ＝処置群における腫瘍量が3000mm３に達する
までの時間（日数）、Ｃ＝コントロール群における腫瘍
が3000mm３に達するまでの時間（日数）、そしてTVDT
（腫瘍の容積を倍化するに要する時間）＝コントロール
（処置されていない）マウスにおける腫瘍の容積が1500
−3000mm３に増大するに要する時間（日数）である） この実験結果において各群の各点は平均腫瘍容積を示し
ている。
までの時間（日数）、Ｃ＝コントロール群における腫瘍
が3000mm３に達するまでの時間（日数）、そしてTVDT
（腫瘍の容積を倍化するに要する時間）＝コントロール
（処置されていない）マウスにおける腫瘍の容積が1500
−3000mm３に増大するに要する時間（日数）である） この実験結果において各群の各点は平均腫瘍容積を示し
ている。
これらの実験において、Daudi腫瘍及びRamos腫瘍にお
けるADM−イムノコンジユゲートの抗腫瘍活性は： ａ）等しい投与量及び同じ投与方法並びにスケジユール
での遊離の薬剤で得られたもの、 ｂ）一番最適な投与量、投与方法及びスケジユールで投
与された遊離の薬剤で得られたもの、 と比較された。
けるADM−イムノコンジユゲートの抗腫瘍活性は： ａ）等しい投与量及び同じ投与方法並びにスケジユール
での遊離の薬剤で得られたもの、 ｂ）一番最適な投与量、投与方法及びスケジユールで投
与された遊離の薬剤で得られたもの、 と比較された。
本明細書において記載のすべての実験においてはADM
−HClで処理するための薬剤は、50−100λDMSOをその粉
末の薬剤に加え、次に溶解した薬剤をPBSで希釈して、
注射日にmg/kg/injの特定用量となし、腫瘍を有するマ
ウスにそれを静脈内（i.v.尾部静脈）または腹腔内（i.
p.）に投与した。
−HClで処理するための薬剤は、50−100λDMSOをその粉
末の薬剤に加え、次に溶解した薬剤をPBSで希釈して、
注射日にmg/kg/injの特定用量となし、腫瘍を有するマ
ウスにそれを静脈内（i.v.尾部静脈）または腹腔内（i.
p.）に投与した。
この実験で用いられたADM−イムノコンジユゲートは
実施例１に記載されたようにして製造し、それはすべて
もともとの抗体の結合活性の90％以上の活性を保持して
いるものであつた。これらの実験においては、特にモノ
クローナル抗体5E9及びG28.1がイムノコンジユゲートの
抗体成分として用いられた。ADM−イムノコンジユゲー
トは４℃でPBS中に貯蔵され、その製造後２週間以内に
用いられた。試験されたイムノコンジユゲートのすべて
及びコンジユゲート化されていない抗体コントロールi.
p.投与された。
実施例１に記載されたようにして製造し、それはすべて
もともとの抗体の結合活性の90％以上の活性を保持して
いるものであつた。これらの実験においては、特にモノ
クローナル抗体5E9及びG28.1がイムノコンジユゲートの
抗体成分として用いられた。ADM−イムノコンジユゲー
トは４℃でPBS中に貯蔵され、その製造後２週間以内に
用いられた。試験されたイムノコンジユゲートのすべて
及びコンジユゲート化されていない抗体コントロールi.
p.投与された。
本発明書においては、治療スケジユールを表わす記号
「Q7D×３」とは、薬剤で処理される群のマウスは、３
回注射され、そしてその各注射は７日間の間隔でなされ
る、すなわち、３週間の間毎週１回注射投与されるよう
な治療スケジユールを示すものである。同様に、「Q5D
×２」とは、薬剤で処置される群のマウスは５日間の間
隔で全部で２回の薬剤またはコンジユゲートが投与され
るような治療スケジユールを示している。「Q1D×１」
は、唯１回のみの注射投与を示している。かくして、該
治療スケジユールの表示では、その最初の数字は注射の
間隔（日数）を示し、その最後の数字はそのスケジユー
ル当たりの全注射回数を示すように定義されている。
「Q7D×３」とは、薬剤で処理される群のマウスは、３
回注射され、そしてその各注射は７日間の間隔でなされ
る、すなわち、３週間の間毎週１回注射投与されるよう
な治療スケジユールを示すものである。同様に、「Q5D
×２」とは、薬剤で処置される群のマウスは５日間の間
隔で全部で２回の薬剤またはコンジユゲートが投与され
るような治療スケジユールを示している。「Q1D×１」
は、唯１回のみの注射投与を示している。かくして、該
治療スケジユールの表示では、その最初の数字は注射の
間隔（日数）を示し、その最後の数字はそのスケジユー
ル当たりの全注射回数を示すように定義されている。
本発明のADM−イムノコンジユゲートの抗腫瘍活性
は、それ故にまず最初に遊離のADM−HCl薬剤と対応する
かまたは等しい用量、投与方法及びスケジユールで比較
検討された。
は、それ故にまず最初に遊離のADM−HCl薬剤と対応する
かまたは等しい用量、投与方法及びスケジユールで比較
検討された。
5E9−ADMイムノコンジユゲート、5E9−ADM−1.8（モ
ル比＝MR＝1.8ADM分子/MAB）のDandi腫瘍に対する抗腫
瘍活性は、α）対応する薬剤投与量（4.1mg/kg/inj）の
コンジユゲート化されていないADM−HCl、ｂ）対応する
抗体量（630mg/kg/inj）の5E9モノクローナル抗体、
ｃ）5E9抗体＋ADM−HCl（4.1mg ADM＋630mg 5E9）の混
合物、及びｄ）コントロールとしての結合性を有しない
イムノコンジユゲート、L6−ADM−8.6（4.1mg/kg/inj A
DM） の活性と比較された。
ル比＝MR＝1.8ADM分子/MAB）のDandi腫瘍に対する抗腫
瘍活性は、α）対応する薬剤投与量（4.1mg/kg/inj）の
コンジユゲート化されていないADM−HCl、ｂ）対応する
抗体量（630mg/kg/inj）の5E9モノクローナル抗体、
ｃ）5E9抗体＋ADM−HCl（4.1mg ADM＋630mg 5E9）の混
合物、及びｄ）コントロールとしての結合性を有しない
イムノコンジユゲート、L6−ADM−8.6（4.1mg/kg/inj A
DM） の活性と比較された。
一番最初の腫瘍の大きさが800−1100mm３であるとこ
ろの腫瘍の移植後20日目と25日目に（すなわち、Q5D×
２スケジユール）、マウス（５匹マウス／群）は、i.p.
投与処理された。本実験で用いられた投与量は、遊離の
薬剤のi.p.での最大許容投与量（maximum tolerated do
se,MTD）、すなわちいかなるルートあるいはスケジユー
ルを介して投与されてもLD10（10％の動物の致死量）を
来たすところの薬剤の用量を示している（下表１参
照）。
ろの腫瘍の移植後20日目と25日目に（すなわち、Q5D×
２スケジユール）、マウス（５匹マウス／群）は、i.p.
投与処理された。本実験で用いられた投与量は、遊離の
薬剤のi.p.での最大許容投与量（maximum tolerated do
se,MTD）、すなわちいかなるルートあるいはスケジユー
ルを介して投与されてもLD10（10％の動物の致死量）を
来たすところの薬剤の用量を示している（下表１参
照）。
第21図に示すように、5E9−ADMコンジユゲートは有意
に優れた抗腫瘍活性を示した。さらにその抗腫瘍活性
は、遊離の薬剤の等しい用量で測定されるものよりも非
常に大きなものであつた。下記表４に示すように、該コ
ンジユゲートで処置された５匹のマウスのうちの三匹
は、完全に腫瘍が退行（治癒,cure）しており、それは
＞1.5TDDに相当するものであつた。これに対し、ADM−H
Cl及びコンジユゲート化されていない5E9並びにL6−ADM
の結合性を持たないコンジユゲートは何らの抗腫瘍活性
も示さなかつた。ADM−HCl＋5E9の混合物を用いた場合
にいくらかの腫瘍生育阻止が観察されたが、その効果は
変わり易いもので、統計的には無意味な0.2TDDでしかな
いものであつた。
に優れた抗腫瘍活性を示した。さらにその抗腫瘍活性
は、遊離の薬剤の等しい用量で測定されるものよりも非
常に大きなものであつた。下記表４に示すように、該コ
ンジユゲートで処置された５匹のマウスのうちの三匹
は、完全に腫瘍が退行（治癒,cure）しており、それは
＞1.5TDDに相当するものであつた。これに対し、ADM−H
Cl及びコンジユゲート化されていない5E9並びにL6−ADM
の結合性を持たないコンジユゲートは何らの抗腫瘍活性
も示さなかつた。ADM−HCl＋5E9の混合物を用いた場合
にいくらかの腫瘍生育阻止が観察されたが、その効果は
変わり易いもので、統計的には無意味な0.2TDDでしかな
いものであつた。
本実験において、遊離の薬物は、４−5mg/kgを超える
用量でi.p.投与すると毒性を示すことから4.1mg/kg/inj
の用量で投与された。このような低い用量では、遊離の
ADMもADM＋モノクローナル抗体の混合物も共に不活性で
あつた。一方、第21図から明らかなように、このような
低い用量でさえ、該ADM−イムノコンジユゲートは、腫
瘍生育阻止活性を有していた。
用量でi.p.投与すると毒性を示すことから4.1mg/kg/inj
の用量で投与された。このような低い用量では、遊離の
ADMもADM＋モノクローナル抗体の混合物も共に不活性で
あつた。一方、第21図から明らかなように、このような
低い用量でさえ、該ADM−イムノコンジユゲートは、腫
瘍生育阻止活性を有していた。
次に、最適化された投与量、投与ルート及びスケジユ
ールで投与されたコンジユゲート化されていない薬剤を
用いて得られた抗腫瘍活性と比較してのDaudi腫瘍にお
ける該ADM−イムノコンジユゲートの抗腫瘍活性を測定
することをした。それ故最初に、Daudi細胞に最高の抗
腫瘍活性を誘導するところのADM−HClの用量及び投与ル
ート及びスケジユールを決定した。この最適な条件をみ
つけるため、マウスに種々の投与量、投与ルート及びス
ケジユールを用いてADM−HClを投与した。接種の間隔は
用いられた処置スケジユールによつてことなつている。
次にTDD値を上記したようにして決定した。この最適な
条件をみつけるための調査の結果を下記表２に要約す
る。表２から理解できるように、i.v.投与され、Q7D×
３のスケジユールで投与するのが、11mg/kg/injの用量
において腫瘍の生育を遅延化すること及び腫瘍の退行化
速度の双方で一番適した抗腫瘍反応性をもたらし、そし
てその用量がQ7D×３のスケジユールでi.v.投与の際の
薬剤のMTDである。
ールで投与されたコンジユゲート化されていない薬剤を
用いて得られた抗腫瘍活性と比較してのDaudi腫瘍にお
ける該ADM−イムノコンジユゲートの抗腫瘍活性を測定
することをした。それ故最初に、Daudi細胞に最高の抗
腫瘍活性を誘導するところのADM−HClの用量及び投与ル
ート及びスケジユールを決定した。この最適な条件をみ
つけるため、マウスに種々の投与量、投与ルート及びス
ケジユールを用いてADM−HClを投与した。接種の間隔は
用いられた処置スケジユールによつてことなつている。
次にTDD値を上記したようにして決定した。この最適な
条件をみつけるための調査の結果を下記表２に要約す
る。表２から理解できるように、i.v.投与され、Q7D×
３のスケジユールで投与するのが、11mg/kg/injの用量
において腫瘍の生育を遅延化すること及び腫瘍の退行化
速度の双方で一番適した抗腫瘍反応性をもたらし、そし
てその用量がQ7D×３のスケジユールでi.v.投与の際の
薬剤のMTDである。
ａそれぞれの薬剤の群からの結果b T-C：処置されないコントロール（Ｃ）と比較しての薬
物処理群（Ｔ）の値で、腫瘍が3000mm３に達するに要す
る時間の遅れを日で表わしたもの 完全な退行（Complete Regressiohn,CR）： 触診してわかる腫瘍の大きさより小さい腫瘍量に一次的
に減少すること 治療（cure）：腫瘍が再び生育するという微候がなんら
ないところの完全な退行ｃ D/T:ある動物群中の死亡数／全数最終の薬剤投与の後
55日目まで薬物による死亡数を記録した。
物処理群（Ｔ）の値で、腫瘍が3000mm３に達するに要す
る時間の遅れを日で表わしたもの 完全な退行（Complete Regressiohn,CR）： 触診してわかる腫瘍の大きさより小さい腫瘍量に一次的
に減少すること 治療（cure）：腫瘍が再び生育するという微候がなんら
ないところの完全な退行ｃ D/T:ある動物群中の死亡数／全数最終の薬剤投与の後
55日目まで薬物による死亡数を記録した。
Daudi腫瘍における遊離の薬剤の抗腫瘍活性をさらに
第22図に示してある。Q7D×３のスケジユールでi.v.投
与され、異種間移植されたDaudi腫瘍の生育は、ADM−HC
lの処置でそれぞれ９、10または11mg/kg/注射（injecti
on）でその用量に依存して著しく阻害された。コントロ
ールのマウスは処理しなかつた。ATD（11mg/kg/inj）で
の腫瘍の生育阻止量は28日で、それは1.1TDDに相当する
ものであつた。
第22図に示してある。Q7D×３のスケジユールでi.v.投
与され、異種間移植されたDaudi腫瘍の生育は、ADM−HC
lの処置でそれぞれ９、10または11mg/kg/注射（injecti
on）でその用量に依存して著しく阻害された。コントロ
ールのマウスは処理しなかつた。ATD（11mg/kg/inj）で
の腫瘍の生育阻止量は28日で、それは1.1TDDに相当する
ものであつた。
さらにi.p.投与での各種のスケジユールがテストされ
た。上記で議論したように、i.p.投与でのADM−HClのMT
Dは、４−5mg/kg/injであることがわかる。表2Bからわ
かるように、遊離の薬物はi.p.投与でのそのMTDではDau
di細胞に不活性であつた。かくして、遊離の薬物の最高
の抗腫瘍活性は、MTDが11mg/kg/injの場合（この投与量
で薬剤はDaudi腫瘍細胞の生育阻害を示す）、i.v.投与
でもつて得られるということがわかつた。
た。上記で議論したように、i.p.投与でのADM−HClのMT
Dは、４−5mg/kg/injであることがわかる。表2Bからわ
かるように、遊離の薬物はi.p.投与でのそのMTDではDau
di細胞に不活性であつた。かくして、遊離の薬物の最高
の抗腫瘍活性は、MTDが11mg/kg/injの場合（この投与量
で薬剤はDaudi腫瘍細胞の生育阻害を示す）、i.v.投与
でもつて得られるということがわかつた。
それ故に、これらの試験から、Daudi腫瘍における抗
腫瘍活性のための最適なADM−HClの用量はおおよそ11mg
/kg/injで、最適の投与スケジユールはQ7D×３であり、
最適の投与ルートはi.v.であることがわかつた。
腫瘍活性のための最適なADM−HClの用量はおおよそ11mg
/kg/injで、最適の投与スケジユールはQ7D×３であり、
最適の投与ルートはi.v.であることがわかつた。
次に上記したような最適な条件下で投与される遊離の
ADM−HCl薬剤の抗腫瘍活性と、本発明のADM−イムノコ
ンジユゲートのDaudi腫瘍における抗腫瘍活性とを比較
した。Q5D×２のスケジユールで、i.p.投与されたG28.1
−ADMイムノコンジユゲート、G28.1−ADM−7.6（MR＝7.
6薬剤/MAB）を、Q7D×３のスケジユールでi.v.投与され
たADM−HClと10、11及び12mg/kg/injで比較した。第23
図及び下記表３に示すように、遊離の薬剤は、８匹のマ
ウスのうち２匹において完全な腫瘍の退行（治癒）を示
すと共に11mg/kg（そのMTD）で腫瘍の生育の遅延化日数
28日を与え活性を示した。本発明のイムノコンジユゲー
トは、その最大の試験用量（18.7mgADM、Q5D×２、i.
p.）でも良好な許容性（死亡はなんらないそして何らの
体重の減少もない）を示し、８匹の処置動物のうち３匹
では完全な腫瘍の退行を示すと共に遊離の薬剤よりも高
い抗腫瘍活性を示した。結合性を有しないL6−イムノコ
ンジユゲート、コンジユゲート化されていないG28.1及
びコンジユゲート化されていないG28.1＋ADM−HClの混
合物では何らの抗腫瘍活性もなかつた。本発明のADM−
イムノコンジユゲートは、至適化された用量及び投与ス
ケジユール、そしてi.v.またはi.p.投与においてコンジ
ユゲート化されていない薬剤により達成することのでき
るものよりもはるかに大きな腫瘍生育阻害を示すことが
わかつた。
ADM−HCl薬剤の抗腫瘍活性と、本発明のADM−イムノコ
ンジユゲートのDaudi腫瘍における抗腫瘍活性とを比較
した。Q5D×２のスケジユールで、i.p.投与されたG28.1
−ADMイムノコンジユゲート、G28.1−ADM−7.6（MR＝7.
6薬剤/MAB）を、Q7D×３のスケジユールでi.v.投与され
たADM−HClと10、11及び12mg/kg/injで比較した。第23
図及び下記表３に示すように、遊離の薬剤は、８匹のマ
ウスのうち２匹において完全な腫瘍の退行（治癒）を示
すと共に11mg/kg（そのMTD）で腫瘍の生育の遅延化日数
28日を与え活性を示した。本発明のイムノコンジユゲー
トは、その最大の試験用量（18.7mgADM、Q5D×２、i.
p.）でも良好な許容性（死亡はなんらないそして何らの
体重の減少もない）を示し、８匹の処置動物のうち３匹
では完全な腫瘍の退行を示すと共に遊離の薬剤よりも高
い抗腫瘍活性を示した。結合性を有しないL6−イムノコ
ンジユゲート、コンジユゲート化されていないG28.1及
びコンジユゲート化されていないG28.1＋ADM−HClの混
合物では何らの抗腫瘍活性もなかつた。本発明のADM−
イムノコンジユゲートは、至適化された用量及び投与ス
ケジユール、そしてi.v.またはi.p.投与においてコンジ
ユゲート化されていない薬剤により達成することのでき
るものよりもはるかに大きな腫瘍生育阻害を示すことが
わかつた。
5E9イムノコンジユゲート及びG28.1イムノコンジユゲ
ート種々の調製物を用いての無胸腺マウスに異種間移植
されたDaudi腫瘍における抗腫瘍活性値を第４表に要約
して示した。抗体用量で500mg/kgまたはそれ以上で一致
して最も高い応答性が得られた。これらの用量では、1.
8〜8.6のモル比を有するコンジユゲートを用いて抗腫瘍
活性が得られた。モノクローナル抗体の用量を増加させ
ると、TDD（すなわち腫瘍生育の阻害）及び腫瘍退行率
の双方において対応する増大があるという事実からわか
るように、コンジユゲート化された薬剤の用量よりもそ
の抗体の用量より抗腫瘍活性が異なるようである。すべ
ての試験において、平行して等しい抗体用量で且つ等し
いコンジユゲート化された薬剤用量でなされた結合性を
持たないL6−ADMコンジユゲートでは何ら抗腫瘍活性が
見出されなかつた（結果は示されていない）。本発明の
イムノコンジユゲートは、更に、遊離の薬剤（等しい薬
物用量では活性がない）と比較してもその活性が著しく
高めらていることがこの表からわかる。
ート種々の調製物を用いての無胸腺マウスに異種間移植
されたDaudi腫瘍における抗腫瘍活性値を第４表に要約
して示した。抗体用量で500mg/kgまたはそれ以上で一致
して最も高い応答性が得られた。これらの用量では、1.
8〜8.6のモル比を有するコンジユゲートを用いて抗腫瘍
活性が得られた。モノクローナル抗体の用量を増加させ
ると、TDD（すなわち腫瘍生育の阻害）及び腫瘍退行率
の双方において対応する増大があるという事実からわか
るように、コンジユゲート化された薬剤の用量よりもそ
の抗体の用量より抗腫瘍活性が異なるようである。すべ
ての試験において、平行して等しい抗体用量で且つ等し
いコンジユゲート化された薬剤用量でなされた結合性を
持たないL6−ADMコンジユゲートでは何ら抗腫瘍活性が
見出されなかつた（結果は示されていない）。本発明の
イムノコンジユゲートは、更に、遊離の薬剤（等しい薬
物用量では活性がない）と比較してもその活性が著しく
高めらていることがこの表からわかる。
下記表５には、本発明のADM−イムノコンジユゲート
とコンジユゲート化されていない薬剤を用いて得られた
毒性の低減性についてが示されている。
とコンジユゲート化されていない薬剤を用いて得られた
毒性の低減性についてが示されている。
それからわかるように、本発明のイムノコンジユゲー
トは、i.p.投与で遊離のADMよりも少なくとも10倍以上
は毒性が少ない。
トは、i.p.投与で遊離のADMよりも少なくとも10倍以上
は毒性が少ない。
最後に、第26A図及び表６には、ヒトRamos腫瘍におけ
るG28.1−ADMコンジユゲートの抗腫瘍活性が示されてい
る。また、Ramos腫瘍における本発明のイムノコンジユ
ゲートの抗腫瘍効果を、最適の結果を与え、そして16−
18mg/kg/injの用量の一回のみの投与であることが前も
つて決められたところの条件下での遊離ADM−HClを使用
してのものと比較した（第24図及び第25図を参照）。試
験された最も多い本発明のイムノコンジユゲートの用量
（10.6mg/kg）では、該コンジユゲートの抗腫瘍活性は
遊離の薬剤の18mg/kg（25％の致死性）を用いて得られ
るものより0.5TDDだけ優れており、ADM−HClの16mg/kg
（12％の致死性）のものより1.0TDDだけ優れていた。本
投与量における本発明のコンジユゲートは処置された動
物すべてにおいて何らの体重の減少も死亡例ももたらさ
ず良好な許容性を示した。またG28.1−ADMの抗腫瘍活性
は、第26B図に示されているように用量依存性のもので
あることが見出された。かくして、該コンジユゲートの
投与量を減少させると、TDD及び完全な腫瘍の退行数が
減少した。L6−ADM（結合性を持つていない）コンジユ
ゲートの相当する用量（10.6mg/kg）では活性はない。
るG28.1−ADMコンジユゲートの抗腫瘍活性が示されてい
る。また、Ramos腫瘍における本発明のイムノコンジユ
ゲートの抗腫瘍効果を、最適の結果を与え、そして16−
18mg/kg/injの用量の一回のみの投与であることが前も
つて決められたところの条件下での遊離ADM−HClを使用
してのものと比較した（第24図及び第25図を参照）。試
験された最も多い本発明のイムノコンジユゲートの用量
（10.6mg/kg）では、該コンジユゲートの抗腫瘍活性は
遊離の薬剤の18mg/kg（25％の致死性）を用いて得られ
るものより0.5TDDだけ優れており、ADM−HClの16mg/kg
（12％の致死性）のものより1.0TDDだけ優れていた。本
投与量における本発明のコンジユゲートは処置された動
物すべてにおいて何らの体重の減少も死亡例ももたらさ
ず良好な許容性を示した。またG28.1−ADMの抗腫瘍活性
は、第26B図に示されているように用量依存性のもので
あることが見出された。かくして、該コンジユゲートの
投与量を減少させると、TDD及び完全な腫瘍の退行数が
減少した。L6−ADM（結合性を持つていない）コンジユ
ゲートの相当する用量（10.6mg/kg）では活性はない。
上記実施例においては、新規な酸に感受性を有するア
シルヒドラゾン結合を介して細胞毒活性を有するアント
ラサイクリン薬剤を抗体に結合せしめているところの新
規なアントラサイクリンイムノコンジユゲートの製造法
が示されている。該イムノコンジユゲートは、抗体結合
活性（すなわちターゲツト細胞特異性）及び細胞毒薬剤
活性の両方の保持しており、ターゲツト細胞の細胞環境
に代表される酸性条件または還元性条件下で遊離の修飾
のなされていない薬剤を遊離（放出）することができ
る。これらのコンジユゲートの抗腫瘍活性は、生体内
（in vivo）及び試験管内（in vitro）の両方で示すこ
とができ、遊離のコンジユゲート化されていないアント
ラサイクリンにより得られる活性よりもはるかに多きな
ものであることが示された。さらに、該イムノコンジユ
ゲートは、in vivoにおいてそのコンジユゲート化され
ていない薬剤よりもはるかに大きな許容性（tolerate
d）を有していた。このように本発明のイムノコンジユ
ゲートは、高い改善された治療係数（抗腫瘍活性対毒性
の）を有し、癌またはその他の腫瘍、殺細胞性でないウ
イルス感染症またはその他の病原性感染症または自己免
疫疾患のような病気の治療において、特定の細胞群の一
つを選択的に殺傷する目的で、細胞毒性を持つ薬剤をそ
の細胞にデリバー（運搬）するに特に有用である。
シルヒドラゾン結合を介して細胞毒活性を有するアント
ラサイクリン薬剤を抗体に結合せしめているところの新
規なアントラサイクリンイムノコンジユゲートの製造法
が示されている。該イムノコンジユゲートは、抗体結合
活性（すなわちターゲツト細胞特異性）及び細胞毒薬剤
活性の両方の保持しており、ターゲツト細胞の細胞環境
に代表される酸性条件または還元性条件下で遊離の修飾
のなされていない薬剤を遊離（放出）することができ
る。これらのコンジユゲートの抗腫瘍活性は、生体内
（in vivo）及び試験管内（in vitro）の両方で示すこ
とができ、遊離のコンジユゲート化されていないアント
ラサイクリンにより得られる活性よりもはるかに多きな
ものであることが示された。さらに、該イムノコンジユ
ゲートは、in vivoにおいてそのコンジユゲート化され
ていない薬剤よりもはるかに大きな許容性（tolerate
d）を有していた。このように本発明のイムノコンジユ
ゲートは、高い改善された治療係数（抗腫瘍活性対毒性
の）を有し、癌またはその他の腫瘍、殺細胞性でないウ
イルス感染症またはその他の病原性感染症または自己免
疫疾患のような病気の治療において、特定の細胞群の一
つを選択的に殺傷する目的で、細胞毒性を持つ薬剤をそ
の細胞にデリバー（運搬）するに特に有用である。
実施例4. 次なる実施例は、アトリアマイシンの13−ケト基の位
置のアシルヒドラゾン結合を介してアドリアマイシンが
ペプチドリガンド、ボムベシンに結合しているところの
新規アントラサイクリン−リガンドコンジユゲートの製
造法を示すものである。
置のアシルヒドラゾン結合を介してアドリアマイシンが
ペプチドリガンド、ボムベシンに結合しているところの
新規アントラサイクリン−リガンドコンジユゲートの製
造法を示すものである。
ボムベシン−ADMコンジユゲートの製造 アミノ酸配列： を有する粗製cys−ボムベシンをVega Biotechnologies
（Tuscon,Arizona）に従つて製造した。
（Tuscon,Arizona）に従つて製造した。
別の方法としては、Fmoc保護されたアミノ酸の活性化
ペンタフルオロエステルを用いてMilligen9050ペプシド
シンセサイザーでcys−ボムベシンを合成した。合成さ
れたペプチドを樹脂から離脱させ、側鎖保護基を２時間
25℃で92.5％トリフルオロ酢酸、2.5％チオフエノール
及び５％フエノール中でインキユベーシヨンして除去し
た。次にcys−ボムベシンをC18逆相HPLC（Perkin Elmer
410 Bio HPLC）、次いでイオン交換HPLCにかけて粗製
ペプチド混合物から精製した。代表的な製造例において
は、10mgの粗ペプチドと20mgのジチオスレイトール（DT
T）を0.01M酢酸アンモニウム液pH6.0中の10％アセトニ
トリル液に溶解し、0.01M酢酸アンモニウム液pH6.0中の
10−50％アセトニトリル液のグラジエントを用いて分離
した。溶出液はOD280でモニターした。分画（1ml）を集
め、反応性のチオール基を含有している分画を、実施例
１において記載したようにしてDTNBを反応させて検知同
定した。これらの反応性のチオール基を含有している分
画を、ボムベシンレセプターと相互作用することが知ら
れているボムベシンペプチドの部位に結合するところの
抗ボムベンシンモノクローナル抗体を用いたELISAアツ
セイ法によりボムベシンの免疫反応性を試験した。該ア
ツセイは次のようにし行なわれた： ボムベシンペプチド（100ng−１μｇ）を37℃で２時
間Immulon II ELISAプレートに吸着せしめた。そのプレ
ートを37℃で２時間３％ゼラチンでもつてブロツクし、
0.05％トウイーン20を含有するPBSで５回洗し37℃で１
時間マウスの抗ボムベシン抗体（Boehringer Mannhei
m）と共にインキユベーシヨンし、次にTween20含有PBS
で５回洗滌した。次に該プレートをペルオキシダーゼで
標識されたウサギの抗マウスIg（Boehringer Mannhei
m）と共にインキユベーシヨンし、次に市販製品の使用
指示（Kirkegaard及びPerry）に従つてTMB基質と共に展
開した。
ペンタフルオロエステルを用いてMilligen9050ペプシド
シンセサイザーでcys−ボムベシンを合成した。合成さ
れたペプチドを樹脂から離脱させ、側鎖保護基を２時間
25℃で92.5％トリフルオロ酢酸、2.5％チオフエノール
及び５％フエノール中でインキユベーシヨンして除去し
た。次にcys−ボムベシンをC18逆相HPLC（Perkin Elmer
410 Bio HPLC）、次いでイオン交換HPLCにかけて粗製
ペプチド混合物から精製した。代表的な製造例において
は、10mgの粗ペプチドと20mgのジチオスレイトール（DT
T）を0.01M酢酸アンモニウム液pH6.0中の10％アセトニ
トリル液に溶解し、0.01M酢酸アンモニウム液pH6.0中の
10−50％アセトニトリル液のグラジエントを用いて分離
した。溶出液はOD280でモニターした。分画（1ml）を集
め、反応性のチオール基を含有している分画を、実施例
１において記載したようにしてDTNBを反応させて検知同
定した。これらの反応性のチオール基を含有している分
画を、ボムベシンレセプターと相互作用することが知ら
れているボムベシンペプチドの部位に結合するところの
抗ボムベンシンモノクローナル抗体を用いたELISAアツ
セイ法によりボムベシンの免疫反応性を試験した。該ア
ツセイは次のようにし行なわれた： ボムベシンペプチド（100ng−１μｇ）を37℃で２時
間Immulon II ELISAプレートに吸着せしめた。そのプレ
ートを37℃で２時間３％ゼラチンでもつてブロツクし、
0.05％トウイーン20を含有するPBSで５回洗し37℃で１
時間マウスの抗ボムベシン抗体（Boehringer Mannhei
m）と共にインキユベーシヨンし、次にTween20含有PBS
で５回洗滌した。次に該プレートをペルオキシダーゼで
標識されたウサギの抗マウスIg（Boehringer Mannhei
m）と共にインキユベーシヨンし、次に市販製品の使用
指示（Kirkegaard及びPerry）に従つてTMB基質と共に展
開した。
遊離のスルフヒドリル基を含有し、ボムベシンの免疫
反応性を示す分画を数回のカラム処理から得たものをプ
ールし、さらに10％アセトニトリル液中の２−５％塩の
グラジエント（500mM酢酸アンモニウム、pH6.0）を用い
てイオン交換HPLC（Aquapore CX−300、10μｍカラム、
Raininより入手）にかけ精製した。溶出液はOD280でモ
ニターし、1mlの分画とし、それを上記したようにしてD
TNB法により遊離のチオール基について及びELISAアツセ
イ法によりボムベシンの免疫反応性について試験した。
分画をプールし、Savent Speed−vacを用いて濃縮し、
上記したようにして再度C18カラムのHPLCのクラムトグ
ラフイーにかけた。最終的なcys−ボムベシン生成物はH
PLCクロマトグラフイーで単一のピークを示した（第28
図参照）。次に該精製cys−ボムベシンを次のようにし
てADM−HZNとの反応に用いた： 精製cys−ボムベシンを、1mg/mlの精製Lys３−ボムベ
シンに対するA280の値を2.08を基に10mM酢酸アモニウム
液（1.25−2mg/ml）中の約５−8mg/4ml液となした。7M
NH４OH液でpH7.0に合わせ、次に2.5−4mgのADM−HZNの4
00μｌメタノール液を加えた。溶液を渦巻かせ、20℃で
１時間置いた。次に断続的に混合しながら４℃で12時間
置いた。アセトニトリル濃度を分離処理を通して40％に
保持する以外は上記遊離ペプチドにおいて概説したとこ
ろの条件を用い該cys−ボムベシン−ADMコンジユゲート
をイオン交換HPLCにより遊離の薬剤から分離した。コン
ジユゲートを含有する分画をプールし、Savant speed−
vac上で濃縮化し、上記したようにして逆相HPLC分離の
ため出発緩衝液に溶解した。遊離のペプチドを次に逆相
HPLCクロマトグラフイーにより（遊離のペプチドの精製
について上記で記載したようにして）該ペプチド−薬剤
コンジユゲートから分離した。カラムは280nmと495nmで
モニターした。該コンジユゲートを含有する分画をプー
ルし、溶媒を除去し、その特性を調べるため−20℃で保
存した。
反応性を示す分画を数回のカラム処理から得たものをプ
ールし、さらに10％アセトニトリル液中の２−５％塩の
グラジエント（500mM酢酸アンモニウム、pH6.0）を用い
てイオン交換HPLC（Aquapore CX−300、10μｍカラム、
Raininより入手）にかけ精製した。溶出液はOD280でモ
ニターし、1mlの分画とし、それを上記したようにしてD
TNB法により遊離のチオール基について及びELISAアツセ
イ法によりボムベシンの免疫反応性について試験した。
分画をプールし、Savent Speed−vacを用いて濃縮し、
上記したようにして再度C18カラムのHPLCのクラムトグ
ラフイーにかけた。最終的なcys−ボムベシン生成物はH
PLCクロマトグラフイーで単一のピークを示した（第28
図参照）。次に該精製cys−ボムベシンを次のようにし
てADM−HZNとの反応に用いた： 精製cys−ボムベシンを、1mg/mlの精製Lys３−ボムベ
シンに対するA280の値を2.08を基に10mM酢酸アモニウム
液（1.25−2mg/ml）中の約５−8mg/4ml液となした。7M
NH４OH液でpH7.0に合わせ、次に2.5−4mgのADM−HZNの4
00μｌメタノール液を加えた。溶液を渦巻かせ、20℃で
１時間置いた。次に断続的に混合しながら４℃で12時間
置いた。アセトニトリル濃度を分離処理を通して40％に
保持する以外は上記遊離ペプチドにおいて概説したとこ
ろの条件を用い該cys−ボムベシン−ADMコンジユゲート
をイオン交換HPLCにより遊離の薬剤から分離した。コン
ジユゲートを含有する分画をプールし、Savant speed−
vac上で濃縮化し、上記したようにして逆相HPLC分離の
ため出発緩衝液に溶解した。遊離のペプチドを次に逆相
HPLCクロマトグラフイーにより（遊離のペプチドの精製
について上記で記載したようにして）該ペプチド−薬剤
コンジユゲートから分離した。カラムは280nmと495nmで
モニターした。該コンジユゲートを含有する分画をプー
ルし、溶媒を除去し、その特性を調べるため−20℃で保
存した。
別法としては、ボムベシン−ADMコンジユゲートは、A
DMを該ペプチドのリジン残基（Lys３）の所でボムベシ
ンペプチドに結合することにより製造される。この方法
によると、ボムベシン（Lys３−ボムベシンという）を2
5℃で１時間pH8.5で３モルの過剰量のSPDPとインキユベ
ーシヨンさせた。該ボムベシンはC18逆相HPLCにより過
剰のSPDPから分離せしめられ、過剰量のDTTでもつて還
元せしめられ、そして次に上記したようにしてC18逆相H
PLCによつて再度クロマトグラフイー処理された。還元
されたペプチドは次に25℃で１時間２モル過剰量のADM
−HZNとインキユベーシヨンされ、次に４℃で14時間イ
ンキユベーシヨンされる。該薬剤からの該ペプチド薬剤
コンジユゲートを分離しようとする試みは、二つの理由
から問題が多かつた： １）上記cys−ボムベシンの製造にあたり記載されたよ
うなC18のクロマトグラフイーにおいては、該ペプチド
−薬剤コンジユゲート（上記したようにELISAアツセイ
法で検知される）は、疎水性を示し、還元されたペプチ
ドとは異なるがADM−HZNの単独のものと非常に似た行動
を示す， ２）リジン３残基を介してのボムベシンの修飾は、該ペ
プチド上の電荷を変化させ、遊離の薬剤からイオン交換
クロマトグラフイーによつて分離することを困難にさせ
る。それ故、cys−ボムベシンペプチドを介しての結合
が好ましかつた。
DMを該ペプチドのリジン残基（Lys３）の所でボムベシ
ンペプチドに結合することにより製造される。この方法
によると、ボムベシン（Lys３−ボムベシンという）を2
5℃で１時間pH8.5で３モルの過剰量のSPDPとインキユベ
ーシヨンさせた。該ボムベシンはC18逆相HPLCにより過
剰のSPDPから分離せしめられ、過剰量のDTTでもつて還
元せしめられ、そして次に上記したようにしてC18逆相H
PLCによつて再度クロマトグラフイー処理された。還元
されたペプチドは次に25℃で１時間２モル過剰量のADM
−HZNとインキユベーシヨンされ、次に４℃で14時間イ
ンキユベーシヨンされる。該薬剤からの該ペプチド薬剤
コンジユゲートを分離しようとする試みは、二つの理由
から問題が多かつた： １）上記cys−ボムベシンの製造にあたり記載されたよ
うなC18のクロマトグラフイーにおいては、該ペプチド
−薬剤コンジユゲート（上記したようにELISAアツセイ
法で検知される）は、疎水性を示し、還元されたペプチ
ドとは異なるがADM−HZNの単独のものと非常に似た行動
を示す， ２）リジン３残基を介してのボムベシンの修飾は、該ペ
プチド上の電荷を変化させ、遊離の薬剤からイオン交換
クロマトグラフイーによつて分離することを困難にさせ
る。それ故、cys−ボムベシンペプチドを介しての結合
が好ましかつた。
ボムベシン−ADMコンジユゲートの特性 上記したようにしてcys−ボムベシンから製造された
ボムベシン−ADMコンジユゲートは、第27図に示された
ところの構造を有しており、該ADMは、アシルヒドラゾ
ン結合を介して13−ケト基の位置のリンカーアームに結
合している。ペプチドと薬剤とを結ぶリンカーは、その
骨格中にジスルフイド結合を含有している。第29図は、
該cys−ボムベシン−ADMコンジユゲートのマススペクト
ル図を示すものである。この分析でcys−ボムベシンとA
DMの1:1付加体に相当する2357の分子イオンが示されて
いる。
ボムベシン−ADMコンジユゲートは、第27図に示された
ところの構造を有しており、該ADMは、アシルヒドラゾ
ン結合を介して13−ケト基の位置のリンカーアームに結
合している。ペプチドと薬剤とを結ぶリンカーは、その
骨格中にジスルフイド結合を含有している。第29図は、
該cys−ボムベシン−ADMコンジユゲートのマススペクト
ル図を示すものである。この分析でcys−ボムベシンとA
DMの1:1付加体に相当する2357の分子イオンが示されて
いる。
該cys−ボムベシン−ADMコンジユゲートは、Swiss3T3
細胞（ATCCから入手しうる正常マウス繊維芽細胞セルラ
イン）上のボムベシンレセプターへの結合活性について
調べられた。結合性は125I−ラベルで標識されたガスト
リン放出ペプチド（GRP）を用いた競合アツセイ法を用
いて測定された。GRPは、ボムベシンのようにSwiss 3T3
細胞のようなボムベシンレセプターについて陽性の細胞
の表面上のボムベシンレセプターに結合する。こうし
て、125I−標識化GRPは、種々の濃度のcys−ボムベシ
ン、GRP又はcys−ボムベシン−ADMコンジユゲートと共
にインキユベーシヨンされ、特異的に結合した放射活性
を定量的に測定する。こうして、125I−GRPの結合の阻
害率が測定される。該アツセイは次のようにして行なわ
れた： Swiss 3T3細胞を10％胎児牛血清、ペニシリン（100ユ
ニツト/ml）及びストレプトマイシン（100μg/ml）で補
なつたMEM培地（完全培地）中で150cm2のＴ型フラスコ
内でコンフルエントにまで（５−７日間）生育させた。
細胞がコンフルエントな状態に達した後、その培地を、
インシユリン（５μg/ml）、トランスフエリン（５μg/
ml）及びナトリウムセレナント（５μg/ml）を補なつた
MEM完全培地でもつて置き換えた。細胞をさらに24時間
インキユベーシヨンして、ラバー製の道具（policema
n）でもつてRPMI/HITS〔BSA（5mg/ml）、HEPES（4.7mg/
ml）、インシユリン（５μg/ml）、トランスフエリン
（５μg/ml）及びナトリウムセレナイド（5ng/ml）を含
有するRPMI1640倍地〕中へかき取つて収穫した。細胞を
１回洗い、22−ゲージの針を３回通して、単一細胞の懸
濁物を得た。次に10μｌのcys−ボムベシン、GRPまたは
該ボムベシン−ADMコンジユゲートを各種の希釈度で
（３組づつ）、５×10５個の細胞を含む試験管に加え、
次に150μｌの152I−GRP（2ng/ml、2000Ci/mmol）を加
えた。試験管を混合処理し、攪拌装置にのせて室温で１
時間インキユベーシヨン処理した。細胞に結合した125I
−GRPをマイクロフユージチユーブ中の1:1のジブチルフ
タレート：ジオクチルフタレート層上で12,000×ｇで遠
心して分離した。該チユーブをドライアイス上で凍結
し、細胞ペレツトを切断してLKB1275ガンマーカウンタ
ーで計数した。
細胞（ATCCから入手しうる正常マウス繊維芽細胞セルラ
イン）上のボムベシンレセプターへの結合活性について
調べられた。結合性は125I−ラベルで標識されたガスト
リン放出ペプチド（GRP）を用いた競合アツセイ法を用
いて測定された。GRPは、ボムベシンのようにSwiss 3T3
細胞のようなボムベシンレセプターについて陽性の細胞
の表面上のボムベシンレセプターに結合する。こうし
て、125I−標識化GRPは、種々の濃度のcys−ボムベシ
ン、GRP又はcys−ボムベシン−ADMコンジユゲートと共
にインキユベーシヨンされ、特異的に結合した放射活性
を定量的に測定する。こうして、125I−GRPの結合の阻
害率が測定される。該アツセイは次のようにして行なわ
れた： Swiss 3T3細胞を10％胎児牛血清、ペニシリン（100ユ
ニツト/ml）及びストレプトマイシン（100μg/ml）で補
なつたMEM培地（完全培地）中で150cm2のＴ型フラスコ
内でコンフルエントにまで（５−７日間）生育させた。
細胞がコンフルエントな状態に達した後、その培地を、
インシユリン（５μg/ml）、トランスフエリン（５μg/
ml）及びナトリウムセレナント（５μg/ml）を補なつた
MEM完全培地でもつて置き換えた。細胞をさらに24時間
インキユベーシヨンして、ラバー製の道具（policema
n）でもつてRPMI/HITS〔BSA（5mg/ml）、HEPES（4.7mg/
ml）、インシユリン（５μg/ml）、トランスフエリン
（５μg/ml）及びナトリウムセレナイド（5ng/ml）を含
有するRPMI1640倍地〕中へかき取つて収穫した。細胞を
１回洗い、22−ゲージの針を３回通して、単一細胞の懸
濁物を得た。次に10μｌのcys−ボムベシン、GRPまたは
該ボムベシン−ADMコンジユゲートを各種の希釈度で
（３組づつ）、５×10５個の細胞を含む試験管に加え、
次に150μｌの152I−GRP（2ng/ml、2000Ci/mmol）を加
えた。試験管を混合処理し、攪拌装置にのせて室温で１
時間インキユベーシヨン処理した。細胞に結合した125I
−GRPをマイクロフユージチユーブ中の1:1のジブチルフ
タレート：ジオクチルフタレート層上で12,000×ｇで遠
心して分離した。該チユーブをドライアイス上で凍結
し、細胞ペレツトを切断してLKB1275ガンマーカウンタ
ーで計数した。
第30図に示されているように、GRP、cys−ボムベシン
及びcys−ボムベシン−ADMコンジユゲートによつて125I
−ラベル化GRPの3T3細胞に対する結合の対する特異的競
合が存在する。より重合なことには、それら三つの分子
種は、ボムベシンレセプターに対して類似の親和性を示
しその三つの分子種の競合性のカーブには何ら有意な差
異がない。かくして、ADMをボムベシンに結合しても、
該ペプチドの結合活性を妨害せず、該コンジユゲート
は、ボムベシン−レセプターが陽性である細胞への結合
活性が保持されている。我々が行なつた他の実験ではcy
s−ボムベシン及びボムベシンは該レセプター陽性の細
胞に等しい結合活性を持つことが確認された。
及びcys−ボムベシン−ADMコンジユゲートによつて125I
−ラベル化GRPの3T3細胞に対する結合の対する特異的競
合が存在する。より重合なことには、それら三つの分子
種は、ボムベシンレセプターに対して類似の親和性を示
しその三つの分子種の競合性のカーブには何ら有意な差
異がない。かくして、ADMをボムベシンに結合しても、
該ペプチドの結合活性を妨害せず、該コンジユゲート
は、ボムベシン−レセプターが陽性である細胞への結合
活性が保持されている。我々が行なつた他の実験ではcy
s−ボムベシン及びボムベシンは該レセプター陽性の細
胞に等しい結合活性を持つことが確認された。
ボムベシン−ADMソンジユゲートの細胞毒活性 本発明のcys−ボムベシン−ADMコンジユゲートの細胞
毒性活性を３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
測定した。このアツセイ法に従えば、その細胞表面にボ
ムベシンレセプターを担持する各種の細胞が、96−ウエ
ルのマイクロタイタープレート（5000個細胞／ウエル）
に加えられ、EME倍地中37℃で24時間生育せしめられ
る。これらの細胞としては、上記したようなSwiss 3T3
繊維芽細胞セルライン、SVT2細胞セルライン（ATCCから
入手しうる形質転換された繊維芽細胞セルライン）、及
びHCT116細胞セルライン（実施例１に記載された結腸癌
細胞セルライン）があげられる。cys−ボムベシン−ADM
コンジユゲート、ADM、ADM−HZN、またはcys−ボムベシ
ン−ADM＋20μg/mlボムベシンの混合物の希釈は、RPMI1
640倍地、牛血清アルブミン（5mg/ml）、HEPES（0.02
M）、インシユリン（５μg/ml）、トランスフエリン
（５μg/ml）及びナトリウムセレナイト（５μg/ml）を
含有するHITS倍地中でなされた。コンジユゲート、薬剤
あるいは混合物のそれぞれの希釈物50μｌ（それぞれ三
組づつ）を細胞が入れられたウエル中に加えられ、37℃
で最小１時間インキユベーシヨンした。コントロールの
ウエルは、倍地のみを加え、保持された。細胞は次に洗
滌され、200μｌの新鮮な倍地を加えられ、ウエルを、
５％CO２の湿つた雰囲気下37℃でHITS倍地中でさらに38
−44時間インキユベーシヨンした。３Ｈ−チミジンの１
μCi（New England Nuclear）の50μｌ倍地液をそれぞ
れのウエル中に加え、37℃で４時間インキユベーシヨン
した。EDTA（0.53nM）中のトリプシン（0.05％）液を加
えて15分間処理し、細胞をマツシユハーベスター（mash
harvester）中に収穫した。フイルターをRPI3a90Bシン
チレーシヨン液に置き、Beckman LS5801シンチレーシヨ
ンカウンター中で計数した。細胞毒活性は次式を用いて
決定した： かくして、本発明のコンジユゲートの存在下にボムベシ
ン−レセプター陽性細胞セルラインのDNAへの３Ｈ−チ
ミジン取り込みの阻害率を測定し、該細胞上への該コン
ジユゲートの細胞毒性作用を求めた。第31図に示すよう
に、該cys−ボムベシン−ADM−コンジユゲートは、SVT2
細胞に対して非常に高い細胞毒活性を示し、実際に遊離
のADMあるいはADM−HZNよりも非常に作用が強い。該cys
−ボムベシン−ADMコンジユゲートの細胞毒性活性の一
部は過剰量のボムベシン（すなわち該コンジユゲート＋
ボムベシンの混合物）によつてブロツクされ、それは、
該コンジユゲートの細胞毒活性は該コンジユゲートのボ
ムベシンレセプターへの特異的な結合にすくなくとも一
部は起因することを示すものである。第32図及び第33図
において示されているように、該コンジユゲートはまた
HCT116細胞及びSwiss 3T3細胞に対しても特異的な細胞
毒性活性（２時間の処理）を示した。
毒性活性を３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
測定した。このアツセイ法に従えば、その細胞表面にボ
ムベシンレセプターを担持する各種の細胞が、96−ウエ
ルのマイクロタイタープレート（5000個細胞／ウエル）
に加えられ、EME倍地中37℃で24時間生育せしめられ
る。これらの細胞としては、上記したようなSwiss 3T3
繊維芽細胞セルライン、SVT2細胞セルライン（ATCCから
入手しうる形質転換された繊維芽細胞セルライン）、及
びHCT116細胞セルライン（実施例１に記載された結腸癌
細胞セルライン）があげられる。cys−ボムベシン−ADM
コンジユゲート、ADM、ADM−HZN、またはcys−ボムベシ
ン−ADM＋20μg/mlボムベシンの混合物の希釈は、RPMI1
640倍地、牛血清アルブミン（5mg/ml）、HEPES（0.02
M）、インシユリン（５μg/ml）、トランスフエリン
（５μg/ml）及びナトリウムセレナイト（５μg/ml）を
含有するHITS倍地中でなされた。コンジユゲート、薬剤
あるいは混合物のそれぞれの希釈物50μｌ（それぞれ三
組づつ）を細胞が入れられたウエル中に加えられ、37℃
で最小１時間インキユベーシヨンした。コントロールの
ウエルは、倍地のみを加え、保持された。細胞は次に洗
滌され、200μｌの新鮮な倍地を加えられ、ウエルを、
５％CO２の湿つた雰囲気下37℃でHITS倍地中でさらに38
−44時間インキユベーシヨンした。３Ｈ−チミジンの１
μCi（New England Nuclear）の50μｌ倍地液をそれぞ
れのウエル中に加え、37℃で４時間インキユベーシヨン
した。EDTA（0.53nM）中のトリプシン（0.05％）液を加
えて15分間処理し、細胞をマツシユハーベスター（mash
harvester）中に収穫した。フイルターをRPI3a90Bシン
チレーシヨン液に置き、Beckman LS5801シンチレーシヨ
ンカウンター中で計数した。細胞毒活性は次式を用いて
決定した： かくして、本発明のコンジユゲートの存在下にボムベシ
ン−レセプター陽性細胞セルラインのDNAへの３Ｈ−チ
ミジン取り込みの阻害率を測定し、該細胞上への該コン
ジユゲートの細胞毒性作用を求めた。第31図に示すよう
に、該cys−ボムベシン−ADM−コンジユゲートは、SVT2
細胞に対して非常に高い細胞毒活性を示し、実際に遊離
のADMあるいはADM−HZNよりも非常に作用が強い。該cys
−ボムベシン−ADMコンジユゲートの細胞毒性活性の一
部は過剰量のボムベシン（すなわち該コンジユゲート＋
ボムベシンの混合物）によつてブロツクされ、それは、
該コンジユゲートの細胞毒活性は該コンジユゲートのボ
ムベシンレセプターへの特異的な結合にすくなくとも一
部は起因することを示すものである。第32図及び第33図
において示されているように、該コンジユゲートはまた
HCT116細胞及びSwiss 3T3細胞に対しても特異的な細胞
毒性活性（２時間の処理）を示した。
実施例5. 本実施例は、13−ケト基のアシルヒドラゾン結合によ
つてADMに結合するところのリンカーを介してADMがポリ
ペプチドリガンド、EGFに結合しているところの本発明
の別のアントラサイクリン−リガンド・コンジユゲート
の製造を説明するものである。
つてADMに結合するところのリンカーを介してADMがポリ
ペプチドリガンド、EGFに結合しているところの本発明
の別のアントラサイクリン−リガンド・コンジユゲート
の製造を説明するものである。
EGF−ADM・コンジユゲートの製造 本発明の具体例に従えば、ADMはBiomedical Technolo
gies,Inc（Staughton.MA）から購入されたマウスEGFに
結合せしめられる。該EGFはマウスの下顎腺から得ら
れ、Cohen,J.B.C.,237,pp1555−62（1962）の方法を修
飾した方法で精製されるし、また無菌凍結乾燥粉末（ca
t＃:BT−201）として0.1mg/ampのものを購入しうる。ま
たSarvage et at.,J.Biol.Chem.22,p.7669（1973）参
照。次に該ペプチドは、SPDPを用いてチオール化され、
該ペプチド上に反応性チオール基を導入できる。しかし
ながら、マウスEGFの場合、SPDPが結合するためのリジ
ン残基がその中にないので、SPDPの結合する唯一の場所
は、アミノ末端のアミノ酸部分であり、それは、（DTT
による還元処理の後）EGF分子あたりすくなくとも１個
の反応性スルフヒドリル基を持つ分子を生ずる。ヒトEG
Fのチオール化は理論的には、その分子はリジン分子を
そのうちに有するので、より多くの置換を可能にする。
gies,Inc（Staughton.MA）から購入されたマウスEGFに
結合せしめられる。該EGFはマウスの下顎腺から得ら
れ、Cohen,J.B.C.,237,pp1555−62（1962）の方法を修
飾した方法で精製されるし、また無菌凍結乾燥粉末（ca
t＃:BT−201）として0.1mg/ampのものを購入しうる。ま
たSarvage et at.,J.Biol.Chem.22,p.7669（1973）参
照。次に該ペプチドは、SPDPを用いてチオール化され、
該ペプチド上に反応性チオール基を導入できる。しかし
ながら、マウスEGFの場合、SPDPが結合するためのリジ
ン残基がその中にないので、SPDPの結合する唯一の場所
は、アミノ末端のアミノ酸部分であり、それは、（DTT
による還元処理の後）EGF分子あたりすくなくとも１個
の反応性スルフヒドリル基を持つ分子を生ずる。ヒトEG
Fのチオール化は理論的には、その分子はリジン分子を
そのうちに有するので、より多くの置換を可能にする。
かくして、EGFをまず、0.1mlのPBSに溶解し、1.0mg/m
lの最終濃度にした。この溶液に0.01mlのSPDP（最終濃
度:10mM）（抗体のチオール化について実施例１におい
て記載したようにして購入したものを希釈した）を加え
た。反応混合物を30℃で30分間インキユベーシヨンし
て、次に0.02mlのDTT（50mM）を加え、チオピリジル保
護基を除去した。過剰のDTT及びSPDPを3,500の分子量を
カツトオフする透析メンブレン（Spectrum Medical Ind
ustries Inc.,cat＃:132723）を用いてPBSに対してマイ
クロ透析してチオール化EGFから取り除いた。
lの最終濃度にした。この溶液に0.01mlのSPDP（最終濃
度:10mM）（抗体のチオール化について実施例１におい
て記載したようにして購入したものを希釈した）を加え
た。反応混合物を30℃で30分間インキユベーシヨンし
て、次に0.02mlのDTT（50mM）を加え、チオピリジル保
護基を除去した。過剰のDTT及びSPDPを3,500の分子量を
カツトオフする透析メンブレン（Spectrum Medical Ind
ustries Inc.,cat＃:132723）を用いてPBSに対してマイ
クロ透析してチオール化EGFから取り除いた。
次にチオール化されたマウスEGFは上記実施例１に記
載されているようにして製造され希釈された５−６倍過
剰な量のADM−HZNと反応せしめられた。本実施例におい
ては、0.01mlのADM−HZN（1.2×10２Ｍ）を、最終的な
容量が0.2mlで４℃に冷却されたPBS中の0.1mgのSPDPで
チオール化されたEGF中に加えられた。反応混合物を４
℃で１晩インキユベーシヨンし、上記SPDPの除去のとこ
ろで述べたようにしてPBSに対して透析し、未反応の薬
剤を該コンジユゲートから除去した。
載されているようにして製造され希釈された５−６倍過
剰な量のADM−HZNと反応せしめられた。本実施例におい
ては、0.01mlのADM−HZN（1.2×10２Ｍ）を、最終的な
容量が0.2mlで４℃に冷却されたPBS中の0.1mgのSPDPで
チオール化されたEGF中に加えられた。反応混合物を４
℃で１晩インキユベーシヨンし、上記SPDPの除去のとこ
ろで述べたようにしてPBSに対して透析し、未反応の薬
剤を該コンジユゲートから除去した。
該コンジユゲートの純度をHPLCによつて測定した（第
34図参照）。HPLCは５ミクロンのRP18ビーズをパツクし
たBrowaleeカラム上で行なわれた。EGF−ADM−コンジユ
ゲートは、コンジユゲート化されてないマウスEGF（同
じ原料及びロツト番号のもの）及びコンジユゲート化さ
れていないADMと比較された。ソンプルをギ酸アンモニ
ウムCpH2.8）／アセトニトリルグラジエントでもつて1.
0ml/minで溶出した。第34図に示すように、該コンジユ
ゲート化されたEGF（すなわち本発明のEGF−ADMコンジ
ユゲート）をコンジユゲート化されていないEGFと比較
すると、該タンパク質はその滞留時間において新しいタ
ンパク質ピークのところに均一な程度にシフトしている
ことがわかる。同様に、該コジユゲート化されていない
ADMと比較すると、遊離のADMのところからコンジユゲー
ト化された薬剤のピークのところにその滞留時間がシフ
トされていることが観測された。本HPLCクロマトグラフ
イー図は、最終のコンジユゲート調製物中には遊離の薬
剤（495nmで検知）、または遊離のリガンド（280nmで検
知）は１％以下であることが示されている。
34図参照）。HPLCは５ミクロンのRP18ビーズをパツクし
たBrowaleeカラム上で行なわれた。EGF−ADM−コンジユ
ゲートは、コンジユゲート化されてないマウスEGF（同
じ原料及びロツト番号のもの）及びコンジユゲート化さ
れていないADMと比較された。ソンプルをギ酸アンモニ
ウムCpH2.8）／アセトニトリルグラジエントでもつて1.
0ml/minで溶出した。第34図に示すように、該コンジユ
ゲート化されたEGF（すなわち本発明のEGF−ADMコンジ
ユゲート）をコンジユゲート化されていないEGFと比較
すると、該タンパク質はその滞留時間において新しいタ
ンパク質ピークのところに均一な程度にシフトしている
ことがわかる。同様に、該コジユゲート化されていない
ADMと比較すると、遊離のADMのところからコンジユゲー
ト化された薬剤のピークのところにその滞留時間がシフ
トされていることが観測された。本HPLCクロマトグラフ
イー図は、最終のコンジユゲート調製物中には遊離の薬
剤（495nmで検知）、または遊離のリガンド（280nmで検
知）は１％以下であることが示されている。
該コンジユゲートの純度はまた、非還元SDS−PAGEゲ
ル（８−25％のグラジエントゲル）におけるSDS−PAGE
分析で決定された（データは示されていない）。それぞ
れのタンパク質のバンドは、銀染色された（Pharmacia
Phastgel銀染色キツト;cat＃:17−0617−01）。該EGF−
ADMコンジユゲート（おおよそ0.1mg/ml及び0.05mg/ml）
は、コンジユゲート化されていないマウスEGFの三つの
希釈液（1mg/ml、0.1mg/ml及び0.01mg/ml）と比較され
た。EGF−ADM調製物中には、コンジユゲート化されてい
ないEGFタンパク質に相当するようないかなるタンパク
質バンドの微候もなかつた。本実験はEGF−ADMコンジユ
ゲート調製物中にはコンジユゲート化されていないEGF
のいかなる微候もないという第34図の結果を支持するも
のである。
ル（８−25％のグラジエントゲル）におけるSDS−PAGE
分析で決定された（データは示されていない）。それぞ
れのタンパク質のバンドは、銀染色された（Pharmacia
Phastgel銀染色キツト;cat＃:17−0617−01）。該EGF−
ADMコンジユゲート（おおよそ0.1mg/ml及び0.05mg/ml）
は、コンジユゲート化されていないマウスEGFの三つの
希釈液（1mg/ml、0.1mg/ml及び0.01mg/ml）と比較され
た。EGF−ADM調製物中には、コンジユゲート化されてい
ないEGFタンパク質に相当するようないかなるタンパク
質バンドの微候もなかつた。本実験はEGF−ADMコンジユ
ゲート調製物中にはコンジユゲート化されていないEGF
のいかなる微候もないという第34図の結果を支持するも
のである。
EGF−ADMコンジユゲートの結合活性の保持 ADM−HZNをEGFに化学的に結合した後のEGF結合活性が
保持されていることを、A431細胞セルラインを用いて競
合ラジオアイソトープアツセイ法を用いて決定した。本
細胞はヒト肺癌由来のもので、１−４×10７個のEGF分
子を結合できる（結果は示していない）。10％FCSを含
有するRPMI1640生育倍地で希釈された細胞を96−ウエル
のマイクロタイタープレートに播種し（５×10５個細胞
／ウエル）、アツセイ前に24時間保持した。アツセイ当
日、付着性の細胞群として成育しているA431細胞を２％
牛血清アルブミンを含有するDMEM（以後緩衝液Ａとい
う）で洗つた。細胞（三組で行なう）を順次２倍に希釈
されたEGFまたはEGF−ADMの緩衝液Ａ液0.05ml及び緩衝
液Ａで希釈された125I−ラベル化EGF（50ng/ml）の0.05
ml（最終容量:0.1ml/ウエル）と共にインキユベーシヨ
ンした。細胞を４℃で４時間インキユベーシヨンした
後、緩衝液Ａで３回洗つた。細胞を1.0M NaOH液で可溶
化して96−ウエルのプラスチツク製プレートから除去
し、細胞に結合している125I−EGFの量をLKBモデル1272
ガンマーカウンターでもつてカウントして測定した。
保持されていることを、A431細胞セルラインを用いて競
合ラジオアイソトープアツセイ法を用いて決定した。本
細胞はヒト肺癌由来のもので、１−４×10７個のEGF分
子を結合できる（結果は示していない）。10％FCSを含
有するRPMI1640生育倍地で希釈された細胞を96−ウエル
のマイクロタイタープレートに播種し（５×10５個細胞
／ウエル）、アツセイ前に24時間保持した。アツセイ当
日、付着性の細胞群として成育しているA431細胞を２％
牛血清アルブミンを含有するDMEM（以後緩衝液Ａとい
う）で洗つた。細胞（三組で行なう）を順次２倍に希釈
されたEGFまたはEGF−ADMの緩衝液Ａ液0.05ml及び緩衝
液Ａで希釈された125I−ラベル化EGF（50ng/ml）の0.05
ml（最終容量:0.1ml/ウエル）と共にインキユベーシヨ
ンした。細胞を４℃で４時間インキユベーシヨンした
後、緩衝液Ａで３回洗つた。細胞を1.0M NaOH液で可溶
化して96−ウエルのプラスチツク製プレートから除去
し、細胞に結合している125I−EGFの量をLKBモデル1272
ガンマーカウンターでもつてカウントして測定した。
EGF−ADMコンジユゲートのA431細胞上のレセプターへ
の結合活性は、第35図に示されており、それは、EGF−A
DMの濃度を高めると共に125I−ラベル化EGFの結合が阻
害されることで示されている。値は125I−EGF結合の阻
害率（B/Bo）として示されており、Ｂは、各種阻害剤の
濃度における細胞に結合した放射活性のカウント数で、
Boは何らの阻害剤のない場合の細胞に結合した放射活性
のカウント数である。二つの異なつたEGF−ADMコンジユ
ゲート調製物がコンジユゲート化されていないEGFと比
較された。両方のコンジユゲート調製物は、同様な結合
活性を示した。コンジユゲート化されていないEGFと比
較した時、EGF−ADMコンジユゲートはA431腫瘍ターゲツ
ト細胞上のEGFレセプターに対する結合活性がほんの僅
かした低下していないことを示している。
の結合活性は、第35図に示されており、それは、EGF−A
DMの濃度を高めると共に125I−ラベル化EGFの結合が阻
害されることで示されている。値は125I−EGF結合の阻
害率（B/Bo）として示されており、Ｂは、各種阻害剤の
濃度における細胞に結合した放射活性のカウント数で、
Boは何らの阻害剤のない場合の細胞に結合した放射活性
のカウント数である。二つの異なつたEGF−ADMコンジユ
ゲート調製物がコンジユゲート化されていないEGFと比
較された。両方のコンジユゲート調製物は、同様な結合
活性を示した。コンジユゲート化されていないEGFと比
較した時、EGF−ADMコンジユゲートはA431腫瘍ターゲツ
ト細胞上のEGFレセプターに対する結合活性がほんの僅
かした低下していないことを示している。
実施例6. 本発明のコンジユゲートについての別の実施例は、13
−ケト基のアシルヒドラゾン結合を介して薬剤に結合す
るところのリンカーを介しており、ADMがタンパク質リ
ガンド、トランスフエリンに結合しているところのアン
トラサイクリン−リガンドコンジユゲートの製造法につ
いてのものである。
−ケト基のアシルヒドラゾン結合を介して薬剤に結合す
るところのリンカーを介しており、ADMがタンパク質リ
ガンド、トランスフエリンに結合しているところのアン
トラサイクリン−リガンドコンジユゲートの製造法につ
いてのものである。
トランスフエリン−ADMコンジユゲートの製造 5.1mgのヒトホロトランスフエリン（holo−trans−fe
rrin）（100％鉄で置換されたもの、Sigma）を50mMのト
リエタノールアミン、50mM NaCl及び1mM EDTAを含有す
る緩衝液pH8.0に溶解した。次に40μｌの２−IT（50m
M）を加え、混合物を３時間37℃でインキユベーシヨン
した。該チオール化されたペプチドを実施例１において
記載したようにしてPD−10カラム（Pharmacia）にかけ
分離した。次に135μｌのADM−HZN（2.1mM）をPBS緩衝
液中の2.7mlのチオール化トランスフエリン中に加え、
反応混合物を１晩４℃でインキユベーシヨンした。反応
混合物を次に2000rpmで10分間遠心し、トランスフエリ
ン−ADMコンジユゲートをPD−10カラムを通して未反応
のADMから分離した。コンジユゲートを含むボイド部を
集めた。1mg/mlのトランスフエリンに対するA280の値１
を用いて、ADM/トランスフエリンのモル比は4.6である
ことがわかつた。
rrin）（100％鉄で置換されたもの、Sigma）を50mMのト
リエタノールアミン、50mM NaCl及び1mM EDTAを含有す
る緩衝液pH8.0に溶解した。次に40μｌの２−IT（50m
M）を加え、混合物を３時間37℃でインキユベーシヨン
した。該チオール化されたペプチドを実施例１において
記載したようにしてPD−10カラム（Pharmacia）にかけ
分離した。次に135μｌのADM−HZN（2.1mM）をPBS緩衝
液中の2.7mlのチオール化トランスフエリン中に加え、
反応混合物を１晩４℃でインキユベーシヨンした。反応
混合物を次に2000rpmで10分間遠心し、トランスフエリ
ン−ADMコンジユゲートをPD−10カラムを通して未反応
のADMから分離した。コンジユゲートを含むボイド部を
集めた。1mg/mlのトランスフエリンに対するA280の値１
を用いて、ADM/トランスフエリンのモル比は4.6である
ことがわかつた。
実施例４〜６は、細胞毒性を持つアントラサイクリン
薬剤が、攻撃されることが求められている特定の細胞群
の一つに関連したレセプターと反応性を有するリガンド
に結合せしめられたところのアントラサイクリン−リガ
ンドコンジユゲートの製造法を示すものである。該アン
トラサイクリンは新規な酸に感受性のアシルヒドラゾン
結合を介して該リガンドに結合している。本明細書に開
示されたコンジユゲートは、該リガンドのレセプターへ
の結合能力と共に該リガンドを介してターゲツト化され
た細胞群に対しての該アントラサイクリンの細胞毒性活
性の両方を保持している。
薬剤が、攻撃されることが求められている特定の細胞群
の一つに関連したレセプターと反応性を有するリガンド
に結合せしめられたところのアントラサイクリン−リガ
ンドコンジユゲートの製造法を示すものである。該アン
トラサイクリンは新規な酸に感受性のアシルヒドラゾン
結合を介して該リガンドに結合している。本明細書に開
示されたコンジユゲートは、該リガンドのレセプターへ
の結合能力と共に該リガンドを介してターゲツト化され
た細胞群に対しての該アントラサイクリンの細胞毒性活
性の両方を保持している。
本明細書においては本発明の数多くの具体的態様が示
されているが、その基本的な構成は変えることができ
て、本発明のイムノコンジユゲート及びその方法を用い
たその他の具体的態様もなしうることは明らかである。
それ故本発明の範囲は、実施例でこれまで本明細書にお
いて具体的に説明された具体例に限定されることなく、
特許請求の範囲において定義されたものによることが認
められよう。
されているが、その基本的な構成は変えることができ
て、本発明のイムノコンジユゲート及びその方法を用い
たその他の具体的態様もなしうることは明らかである。
それ故本発明の範囲は、実施例でこれまで本明細書にお
いて具体的に説明された具体例に限定されることなく、
特許請求の範囲において定義されたものによることが認
められよう。
第１図は、本発明のイムノコンジユゲートの製造に用い
られる新規なADM−HZNヒドラゾン誘導体の合成法を模式
図に図示したものである。 第２図は、先ずモノクローナル抗体（MAB）がSPDP（Ｎ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート）または２−IT（２−イミノチオラン）のい
ずれかを用いてチオール化され、次にそのチオール化さ
れた抗体をADM−HZNと反応させて、そのADMの13−ケト
位のヒドラゾン結合及びリンカーアーム内のジスルフイ
ド結合を持つ本発明のイムノコンジユゲートを形成して
いるところの本発明の一つの具体的な態様であるイムノ
コンジユゲートの合生法を模式的に図示したものであ
る。 第３図は、モノクローナル抗体上に置換されて存在する
反応性チオール基の数（SH/MAB比）と、SPDPでチオール
化されたモノクローナル抗体5E9及び3A1をADM−HZNと縮
合せしめて製造されるイムノコンジユゲート中で達成さ
れるところの最終的なADM−MABのモル比とを比較するた
めの分布図である。 第４図は、該SH/MAB比と、２−ITでチオール化された抗
体5E9及び3A1をADM−HZNと反応させて製造されたイムノ
コンジユゲート中で達成されるところの最終的なADM/MA
Bのモル比とを比較するための分布図である。 第５図は、SPDPでチオール化された抗体または２−ITで
チオール化された抗体のいずれかを用いて製造された本
発明のコンジユゲートのタンパク質の収率とADM/MABの
モル比との間の関係を示すための分布図である。 第６図は、IgG１イソタイプ（例.5E9及び3A1）のモノク
ローナル抗体またはIgG２イソタイプ（例.L6）のモノク
ローナル抗体のいずれかを用いて製造したイムノコンジ
ユゲートにおいて得られるタンパク質の収率と、ADM/MA
Bのモル比とを比較するための分布図である。各抗体はS
PDPでチオール化された。 第７図は、各抗体が２−ITでもつてチオール化されてい
ることを除き、（第６図に示されているように）IgG１
及びIgG２のイソタイプのモノクローナル抗体を有する
イムノコンジユゲートのタンパク質の収率と、ADM/MAB
のモル比とを比較するための分布図である。 第８図は、それぞれコンジユゲート化されてないモノク
ローナル抗体の結合曲線と比較した本発明のイムノコン
ジユゲートの結合曲線を示すグラフ図である。 第９図は、pH4−７の範囲にわたつての本発明のイムノ
コンジユゲートの安定性を示すHPLCクロマトグラフイー
図である。本クロマトグラフイー図は、そのpHがより酸
性となると該イムノコンジユゲートから遊離のADMがよ
り放出されることを示し、本発明の該アシルヒドラゾン
は結合は酸に感受性であることを示している。 第10図は、本発明のイムノコンジユゲートからDTTによ
る処理の後ADMが放出されることを示すところのHPLCク
ロマトグラフイー図である。 第11図は、本発明のイムノコンジユゲートのDaudiセル
ラインに対する選択的な細胞毒性作用を軟寒天コロニー
形成アツセイ法を用いてグラフとして描いたものであ
る。 第12図は、本発明のイムノコンジユゲートのNamalwa細
胞に対する選択的な細胞毒性作用及び遊離のADMに比べ
て該イムノコンジユゲートの作用が高められていること
を限界希釈アツセイ法を用いてグラフとして描いたもの
である。 第13図は、本発明のイムノコンジユゲートのDaudi細胞
に対する選択的な細胞毒性作用を軟寒天コロニー形成ア
ツセイ法でもつてグラフとして描いたものである。 本例においては、該イムノコンジユゲートは、SPDPでチ
オール化されて製造された。 第14図は、チオール化剤としてSPDPを用いて製造された
本発明の別のイムノコンジユゲートの選択的な細胞毒性
作用をグラフとして示したものである。本イムノコンジ
ユゲートは、抗原について陽性のDaudi細胞やNamalwa細
胞に対しては細胞毒作用を示すが、抗原が陰性のHSB−
２細胞にはそれを示さないことが、軟寒天コロニー形成
アツセイ法を用いて示されている。 第15図は、本発明の5E9イムノコンジユゲート及び3A1イ
ムノコンジユゲートのヒト結腸癌（colon carcinoma）
セルライン（5E9＋、3A1−）に対して選択的な細胞毒作
用を示すことが、コロニー形成アツセイ法を用いて示さ
れている。 第16図は、leu−alaのジペプチドリンカーを介してADM
のアミノ糖残基においてADMのモノクローナル抗体に結
合せしめることにより製造されたイムノコンジユゲート
のDaudi細胞に対する細胞毒性は、それがなくなつてい
ることをグラフで示したものである。 第17図は、本発明の新規なADM−HZN誘導体を還元し、次
にSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プチレート）で処理された抗体と反応させ、その
骨格中にチオエーテル結合を持つたリンカーを有するイ
ムノコンジユゲートを形成させたところの本発明のイム
ノコンジユゲートの合成法を模式的に示す図である。 第18図は、該リンカーアーム中に13−ケト基のアシルヒ
ドラゾン結合に加えて、チオエーテル結合を有する本発
明のイムノコンジユゲートの細胞毒活性をグラフに示し
たものである。該イムノコンジユゲートは遊離のADMに
比較してNamalwa細胞に対して非常に大きな効力を有す
ることが、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法で示され
ている。 第19図は、第18図におけると同じ３Ｈ−チミジン取り込
みアツセイ法を用い第18図のイムノコンジユゲートのHS
B−２細胞に対する細胞毒活性をグラフに示したもので
ある。 第20図は、該３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用い
て抗原について陽性の細胞及び抗原について陰性の細胞
のそれぞれに対する該リンカーアーム中に13−ケト基の
アシルヒドラゾン結合に加えてチオエーテル結合を持つ
本発明のイムノコンジユゲートの選択的な細胞毒活性を
グラフとして示すものである。 第21図は、マウスに異種間移植（xenograft）したヒト
のDaudi腫瘍における本発明のイムノコンジユゲートの
生体内（in vivo）での抗腫瘍活性をグラフで示すもの
である。該イムノコンジユゲートは、それと等しい量の
遊離のADMを用いて得られるよりもはるかに大きな抗腫
瘍活性を示した。 第22図は、マウスに異種間移植したヒトのDaudi腫瘍に
おけるADMの生体内での抗腫瘍活性を、Q7D×３処置スケ
ジユールを用いると共にi.v.投与法を用いADMの投与量
を変え時間を追つてグラフに図示したものである。 第23図は、マウスに異種間移植したヒトのDaudi腫瘍に
おける本発明のイムノコンジユゲートの生体内での抗腫
瘍活性を、最適量の遊離のADM（10−11mg/kg/注射（in
j）の用量でQ7D×３の処理スケジユールのもとi.v.投与
される）の相当する抗腫瘍活性と比較してグラフに示し
たものである。該イムノコンジユゲートは非常に大きな
抗腫瘍活性を示した。 第24図は、i.v.投与法を用いると共に種々の処理スケジ
ユール並びに投与量を用いてのマウスに異種間移植した
ヒトのRamos腫瘍におけるADMの生体内抗腫瘍活性を表に
して示した図である。 第25図は、１回注射処理によるスケジユールと共にi.v.
投与法を用いて、マウスに異種間移植されたヒトのRamo
s腫瘍におけるADMの生体内での抗腫瘍活性を、種々のAD
Mの用量について時間を追つてグラフにして示したもの
である。 第26A図は、本発明のイムノコンジユゲートの生体内で
の抗腫瘍活性をマウスに異種間移植したヒトのRamos腫
瘍においてみたものを、最適な形態での遊離のADM（16
−18mg/kg/injをQ1D×１の処置スケジユールでi.v.投与
される）の相当する抗腫瘍活性と比較してグラフとして
示している。該イムノコンジユゲートは、遊離のADMよ
りもはるかに強い抗腫瘍活性を示した。 第26B図は、該イムノコンジユゲートの抗腫瘍作用の用
量依存性をみるため、該イムノコンジユゲートの生体内
での抗腫瘍活性を、該コンジユゲートの種々の投与量に
おいて時間をおつて図示したものである。第26A図及び
第26B図において試験をなされたイムノコンジユゲート
の投与量は、その欄外に示された抗体を示すのと同じ記
号のコンジユゲート化されたアントラサイクリンの所に
示されている。 第27図は、ａ）本発明のボムベシン−ADMコンジユゲー
ト;b）本発明のEGF−ADMコンジユゲート；及びｃ）本発
明のトランスフエリン−ADMコンジユゲートの各化学構
造式を図示するものである。 第28図は、それぞれcys−ボムベシンの逆相Ｃ−18カラ
ム及びイオン交換CX−300カラム上での二つのHPLCクロ
マトグラフイー図を示すものである。各クロマトグラフ
イー図は200nm及び280nmにおけるものである。その図形
は、本発明のボムベシン−ADMコンジユゲートを構築す
るに用いられたcys−ボムベシン調製物の純度を示すも
のである。 第29図は、本発明のcys−ボムベシン−ADMコンジユゲー
トのマススペクトル図である。 第30図は、125I−GRPを種々の濃度の本発明のcys−ボム
ベシン−ADMコンジユゲート、cys−ボムベシン又はGRP
と一緒にインキユベーシヨンし、125I−GRPのSwiss 3T3
細胞への結合の阻害率を測定することからなるSwiss 3T
3細胞における競合結合アツセイ法の結果をグラフとし
て示すものである。本アツセイ結果は、該細胞上のボム
ベシンレセプターへの該cys−ボムベシン−ADMコンジユ
ゲートによる結合活性は保持されていることを示してい
る。 第31図は、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
SVT2細胞に対する本発明のcys−ボムベシン−ADMコンジ
ユゲートの細胞毒活性をグラフとして示すものである。
該コンジユゲートは、該細胞に対し遊離のADMまたはADM
−HZNに比較して非常に大きな活性を示した。 第32図は、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
のHCT116細胞に対する本発明のcys−ボムベシン−ADM−
コンジユゲートの細胞毒作用をグラフで示すものであ
る。 第33図は、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
のSwiss 3T3細胞に対する本発明のcys−ボムベシン−AD
Mコンジユゲートの細胞毒作用をグラフで示すものであ
る。 第34図は、本発明のEGF−ADMコンジユゲート調製物の純
度を示すHPLCクロマトグラフイー図である。 第35図は、125I−EGFを、種々の濃度の本発明のEGF−AD
MコンジユゲートまたはEGFと一緒にインキユベーシヨン
し、125I−EGFのA431細胞への結合の阻害率を測定する
ことからなるA431細胞における競合結合アツセイ法の結
果を示すグラフである。本アツセイ結果は、該細胞上の
EGFレセプターへのEGF−ADMコンジユゲートによる結合
活性は保持されていることを示している。
られる新規なADM−HZNヒドラゾン誘導体の合成法を模式
図に図示したものである。 第２図は、先ずモノクローナル抗体（MAB）がSPDP（Ｎ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート）または２−IT（２−イミノチオラン）のい
ずれかを用いてチオール化され、次にそのチオール化さ
れた抗体をADM−HZNと反応させて、そのADMの13−ケト
位のヒドラゾン結合及びリンカーアーム内のジスルフイ
ド結合を持つ本発明のイムノコンジユゲートを形成して
いるところの本発明の一つの具体的な態様であるイムノ
コンジユゲートの合生法を模式的に図示したものであ
る。 第３図は、モノクローナル抗体上に置換されて存在する
反応性チオール基の数（SH/MAB比）と、SPDPでチオール
化されたモノクローナル抗体5E9及び3A1をADM−HZNと縮
合せしめて製造されるイムノコンジユゲート中で達成さ
れるところの最終的なADM−MABのモル比とを比較するた
めの分布図である。 第４図は、該SH/MAB比と、２−ITでチオール化された抗
体5E9及び3A1をADM−HZNと反応させて製造されたイムノ
コンジユゲート中で達成されるところの最終的なADM/MA
Bのモル比とを比較するための分布図である。 第５図は、SPDPでチオール化された抗体または２−ITで
チオール化された抗体のいずれかを用いて製造された本
発明のコンジユゲートのタンパク質の収率とADM/MABの
モル比との間の関係を示すための分布図である。 第６図は、IgG１イソタイプ（例.5E9及び3A1）のモノク
ローナル抗体またはIgG２イソタイプ（例.L6）のモノク
ローナル抗体のいずれかを用いて製造したイムノコンジ
ユゲートにおいて得られるタンパク質の収率と、ADM/MA
Bのモル比とを比較するための分布図である。各抗体はS
PDPでチオール化された。 第７図は、各抗体が２−ITでもつてチオール化されてい
ることを除き、（第６図に示されているように）IgG１
及びIgG２のイソタイプのモノクローナル抗体を有する
イムノコンジユゲートのタンパク質の収率と、ADM/MAB
のモル比とを比較するための分布図である。 第８図は、それぞれコンジユゲート化されてないモノク
ローナル抗体の結合曲線と比較した本発明のイムノコン
ジユゲートの結合曲線を示すグラフ図である。 第９図は、pH4−７の範囲にわたつての本発明のイムノ
コンジユゲートの安定性を示すHPLCクロマトグラフイー
図である。本クロマトグラフイー図は、そのpHがより酸
性となると該イムノコンジユゲートから遊離のADMがよ
り放出されることを示し、本発明の該アシルヒドラゾン
は結合は酸に感受性であることを示している。 第10図は、本発明のイムノコンジユゲートからDTTによ
る処理の後ADMが放出されることを示すところのHPLCク
ロマトグラフイー図である。 第11図は、本発明のイムノコンジユゲートのDaudiセル
ラインに対する選択的な細胞毒性作用を軟寒天コロニー
形成アツセイ法を用いてグラフとして描いたものであ
る。 第12図は、本発明のイムノコンジユゲートのNamalwa細
胞に対する選択的な細胞毒性作用及び遊離のADMに比べ
て該イムノコンジユゲートの作用が高められていること
を限界希釈アツセイ法を用いてグラフとして描いたもの
である。 第13図は、本発明のイムノコンジユゲートのDaudi細胞
に対する選択的な細胞毒性作用を軟寒天コロニー形成ア
ツセイ法でもつてグラフとして描いたものである。 本例においては、該イムノコンジユゲートは、SPDPでチ
オール化されて製造された。 第14図は、チオール化剤としてSPDPを用いて製造された
本発明の別のイムノコンジユゲートの選択的な細胞毒性
作用をグラフとして示したものである。本イムノコンジ
ユゲートは、抗原について陽性のDaudi細胞やNamalwa細
胞に対しては細胞毒作用を示すが、抗原が陰性のHSB−
２細胞にはそれを示さないことが、軟寒天コロニー形成
アツセイ法を用いて示されている。 第15図は、本発明の5E9イムノコンジユゲート及び3A1イ
ムノコンジユゲートのヒト結腸癌（colon carcinoma）
セルライン（5E9＋、3A1−）に対して選択的な細胞毒作
用を示すことが、コロニー形成アツセイ法を用いて示さ
れている。 第16図は、leu−alaのジペプチドリンカーを介してADM
のアミノ糖残基においてADMのモノクローナル抗体に結
合せしめることにより製造されたイムノコンジユゲート
のDaudi細胞に対する細胞毒性は、それがなくなつてい
ることをグラフで示したものである。 第17図は、本発明の新規なADM−HZN誘導体を還元し、次
にSMPB（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフエ
ニル）プチレート）で処理された抗体と反応させ、その
骨格中にチオエーテル結合を持つたリンカーを有するイ
ムノコンジユゲートを形成させたところの本発明のイム
ノコンジユゲートの合成法を模式的に示す図である。 第18図は、該リンカーアーム中に13−ケト基のアシルヒ
ドラゾン結合に加えて、チオエーテル結合を有する本発
明のイムノコンジユゲートの細胞毒活性をグラフに示し
たものである。該イムノコンジユゲートは遊離のADMに
比較してNamalwa細胞に対して非常に大きな効力を有す
ることが、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法で示され
ている。 第19図は、第18図におけると同じ３Ｈ−チミジン取り込
みアツセイ法を用い第18図のイムノコンジユゲートのHS
B−２細胞に対する細胞毒活性をグラフに示したもので
ある。 第20図は、該３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用い
て抗原について陽性の細胞及び抗原について陰性の細胞
のそれぞれに対する該リンカーアーム中に13−ケト基の
アシルヒドラゾン結合に加えてチオエーテル結合を持つ
本発明のイムノコンジユゲートの選択的な細胞毒活性を
グラフとして示すものである。 第21図は、マウスに異種間移植（xenograft）したヒト
のDaudi腫瘍における本発明のイムノコンジユゲートの
生体内（in vivo）での抗腫瘍活性をグラフで示すもの
である。該イムノコンジユゲートは、それと等しい量の
遊離のADMを用いて得られるよりもはるかに大きな抗腫
瘍活性を示した。 第22図は、マウスに異種間移植したヒトのDaudi腫瘍に
おけるADMの生体内での抗腫瘍活性を、Q7D×３処置スケ
ジユールを用いると共にi.v.投与法を用いADMの投与量
を変え時間を追つてグラフに図示したものである。 第23図は、マウスに異種間移植したヒトのDaudi腫瘍に
おける本発明のイムノコンジユゲートの生体内での抗腫
瘍活性を、最適量の遊離のADM（10−11mg/kg/注射（in
j）の用量でQ7D×３の処理スケジユールのもとi.v.投与
される）の相当する抗腫瘍活性と比較してグラフに示し
たものである。該イムノコンジユゲートは非常に大きな
抗腫瘍活性を示した。 第24図は、i.v.投与法を用いると共に種々の処理スケジ
ユール並びに投与量を用いてのマウスに異種間移植した
ヒトのRamos腫瘍におけるADMの生体内抗腫瘍活性を表に
して示した図である。 第25図は、１回注射処理によるスケジユールと共にi.v.
投与法を用いて、マウスに異種間移植されたヒトのRamo
s腫瘍におけるADMの生体内での抗腫瘍活性を、種々のAD
Mの用量について時間を追つてグラフにして示したもの
である。 第26A図は、本発明のイムノコンジユゲートの生体内で
の抗腫瘍活性をマウスに異種間移植したヒトのRamos腫
瘍においてみたものを、最適な形態での遊離のADM（16
−18mg/kg/injをQ1D×１の処置スケジユールでi.v.投与
される）の相当する抗腫瘍活性と比較してグラフとして
示している。該イムノコンジユゲートは、遊離のADMよ
りもはるかに強い抗腫瘍活性を示した。 第26B図は、該イムノコンジユゲートの抗腫瘍作用の用
量依存性をみるため、該イムノコンジユゲートの生体内
での抗腫瘍活性を、該コンジユゲートの種々の投与量に
おいて時間をおつて図示したものである。第26A図及び
第26B図において試験をなされたイムノコンジユゲート
の投与量は、その欄外に示された抗体を示すのと同じ記
号のコンジユゲート化されたアントラサイクリンの所に
示されている。 第27図は、ａ）本発明のボムベシン−ADMコンジユゲー
ト;b）本発明のEGF−ADMコンジユゲート；及びｃ）本発
明のトランスフエリン−ADMコンジユゲートの各化学構
造式を図示するものである。 第28図は、それぞれcys−ボムベシンの逆相Ｃ−18カラ
ム及びイオン交換CX−300カラム上での二つのHPLCクロ
マトグラフイー図を示すものである。各クロマトグラフ
イー図は200nm及び280nmにおけるものである。その図形
は、本発明のボムベシン−ADMコンジユゲートを構築す
るに用いられたcys−ボムベシン調製物の純度を示すも
のである。 第29図は、本発明のcys−ボムベシン−ADMコンジユゲー
トのマススペクトル図である。 第30図は、125I−GRPを種々の濃度の本発明のcys−ボム
ベシン−ADMコンジユゲート、cys−ボムベシン又はGRP
と一緒にインキユベーシヨンし、125I−GRPのSwiss 3T3
細胞への結合の阻害率を測定することからなるSwiss 3T
3細胞における競合結合アツセイ法の結果をグラフとし
て示すものである。本アツセイ結果は、該細胞上のボム
ベシンレセプターへの該cys−ボムベシン−ADMコンジユ
ゲートによる結合活性は保持されていることを示してい
る。 第31図は、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
SVT2細胞に対する本発明のcys−ボムベシン−ADMコンジ
ユゲートの細胞毒活性をグラフとして示すものである。
該コンジユゲートは、該細胞に対し遊離のADMまたはADM
−HZNに比較して非常に大きな活性を示した。 第32図は、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
のHCT116細胞に対する本発明のcys−ボムベシン−ADM−
コンジユゲートの細胞毒作用をグラフで示すものであ
る。 第33図は、３Ｈ−チミジン取り込みアツセイ法を用いて
のSwiss 3T3細胞に対する本発明のcys−ボムベシン−AD
Mコンジユゲートの細胞毒作用をグラフで示すものであ
る。 第34図は、本発明のEGF−ADMコンジユゲート調製物の純
度を示すHPLCクロマトグラフイー図である。 第35図は、125I−EGFを、種々の濃度の本発明のEGF−AD
MコンジユゲートまたはEGFと一緒にインキユベーシヨン
し、125I−EGFのA431細胞への結合の阻害率を測定する
ことからなるA431細胞における競合結合アツセイ法の結
果を示すグラフである。本アツセイ結果は、該細胞上の
EGFレセプターへのEGF−ADMコンジユゲートによる結合
活性は保持されていることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/28 Ａ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｐ 31/00 37/14 35/00 37/24 37/02 37/26 (72)発明者 ゲリー アール ブラスロースキイ アメリカ合衆国コネチカツト州 06033 グラストンバリー ヘリテージ ドラ イブ 124 (72)発明者 リー ジエイ オレク アメリカ合衆国カリフオルニア州 94801 リツチモンド ナインテイーン ス ストリート 570 (72)発明者 金子 卓史 アメリカ合衆国コネチカツト州 06437 ギルフオード ノースウツド ドライ ブ 398 (72)発明者 ピーター エイ キーナー アメリカ合衆国コネチカツト州 064171 キリンワース カウ ヒル ロード ８ (56)参考文献 特許2740841（ＪＰ，Ｂ２) 特表 平４−503068（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／9823（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 15/252 A61K 31/704 A61K 38/00 A61K 38/16 A61K 38/22 A61K 38/38 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】攻撃を受けるべく選択された細胞群と反応
するリガンドに結合した少なくとも１つのアントラサイ
クリン分子からなり、該アントラサイクリンはＣ−13位
にケト基をもち且つ該リガンドにリンカーアームを介し
て連結し、該リンカーアームは該アントラサイクリンの
13−ケト位でアシルヒドラゾン結合によって該アントラ
サイクリンと共有結合しそしてさらにジスルフィド又は
チオエーテル結合によって該リガンドと共有結合し、該
リガンドはボンベシン、EGF、トランスフェリン、ガス
トリン、ガストリン−放出ペプチド、血小板由来増殖因
子、IL−２、IL−６、TGF−α、VGF、TGF−β、インス
リン、及びインスリン様増殖因子Ｉ及びIIからなる群か
ら選ばれることを特徴とするアントラサイクリンーリガ
ンドコンジュゲート。 - 【請求項２】該アントラサイクリンがアドリアマイシ
ン、ダウノマイシン、デトルビシン、カルミノマイシ
ン、イダルビシン、エピルビシン、エソルビシン、４′
−THP−アドリアマイシン、AD−32及び３′−デアミノ
−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−ドキソル
ビシンからなる群から選ばれる請求項１記載のアントラ
サイクリンーリガンドコンジュゲート。 - 【請求項３】該リガンドがボンベシンであり、該アント
ラサイクリンがアドリアマイシンである請求項１記載の
アントラサイクリンーリガンドコンジュゲート。 - 【請求項４】該リガンドがEGFであり、該アントラサイ
クリンがアドリアマイシンである請求項１記載のアント
ラサイクリンーリガンドコンジュゲート。 - 【請求項５】該リガンドがトランスフェリンであり、該
アントラサイクリンがアドリアマイシンである請求項１
記載のコンジュゲート。 - 【請求項６】攻撃を受けるべく選択された細胞群と反応
するリガンドに結合した少なくとも１つのアントラサイ
クリン分子からなり、該アントラサイクリンはＣ−13位
にケト基をもち且つ該リガンドにリンカーアームを介し
て連結し、該リンカーアームは該アントラサイクリンの
13−ケト位でアシルヒドラゾン結合によって該アントラ
サイクリンと共有結合しそしてさらにジスルフィド又は
チオエーテル結合によって該リガンドと共有結合し、該
リガンドはボンベシン、EGF、トランスフェリン、ガス
トリン、ガストリン−放出ペプチド、血小板由来増殖因
子、IL−２、IL−６、TGF−α、VGF、TGF−β、インス
リン、及びインスリン様増殖因子Ｉ及びIIからなる群か
ら選ばれる、アントラサイクリンーリガンドコンジュゲ
ートの少なくとも１種を有効成分として含むことを特徴
とする選択された細胞群の攻撃用薬剤。 - 【請求項７】該薬剤が製薬的に許容しうる担体を含む請
求項６記載の薬剤。 - 【請求項８】選択された細胞群が、癌、非悪性腫瘍、非
細胞破壊ウイルス感染又は病原性感染、及び自己免疫疾
患からなる群から選ばる請求項６記載の薬剤。
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