JPH0327321A - 新規リンカーを有するアントラサイクリンコンジュゲート及びその製造法 - Google Patents

新規リンカーを有するアントラサイクリンコンジュゲート及びその製造法

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JPH0327321A
JPH0327321A JP2125629A JP12562990A JPH0327321A JP H0327321 A JPH0327321 A JP H0327321A JP 2125629 A JP2125629 A JP 2125629A JP 12562990 A JP12562990 A JP 12562990A JP H0327321 A JPH0327321 A JP H0327321A
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卓史 金子
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規たアントラサイクリンコンジュゲート及
びその製造法に関丁る。特に、本発明は、排除すべき特
定の細胞群の一つと反応性を有する分子と、ｌ３−ケト
位のアシルヒドラゾン結合を介して結合している少はく
とも１個のアントラサイクリンから成るところのコンジ
ュゲートに関する。
このように本発明の一つの具体例に従えば、該コンジュ
ゲートは、排除すべぎ特定の細胞群の一つと反応性を有
する抗体（該抗体は該骨格中に共有結合で結合する細胞
に対し毒性を示す１個又は複数のアントラサイクリン分
子を持っている）から或っている。各アントラサイクリ
ン分子は、リンカーアームを介して抗体に結合しており
、そして該アントラサイクリ／◆ま、そのアントラサイ
クリンの１３一ケ→位の酸感受性のアシルヒドラゾン結
合を介してそのリンカーに結合している。本発明のより
好ましい具体例とじては、アドリアマイシンイムノコン
ジュゲート（アドリアマイシンは１３−ケト位のアシル
ヒドラゾン結合を介してリンカーアームに結合している
）があげられる。該リンカーはさらに該イムノコンジュ
ゲートに該抗体を結合せしめる部分の一部としてジスル
フィド結合またはチオエーテル結合を含有している。
本発明の別の具体例に従えば、該アントラサイクリン分
子は上皮細胞増殖因子（ａｐｉｄｍｒ％ａｊ　　ｇｒｏ
ｗ！ｈ　ｆａｅｔｏｒ＊ＥＧ）’）またはボムベシン（
ｂｏｒｍｂａａｔｍ）のようなリガンドにリンカーアー
ムを介して結合し、そして該アントラサイクリンは、そ
のアントラサイクリンの１３−ケト位の酸に思受性のア
シルヒドラゾン結合を介して該リンカーに結合している
。該リンカーは、さらにその骨格中にジスルフィド結合
またはテオエーテル結合を含有していてよい。加えて、
本発明に従って、アントラサイクリンの新規アシルヒド
ラゾン誘導体が合或され、本発明のコンジュゲートを製
造するのに使用される。
本発明のコンジュゲートの酸に感受性のアシルヒドラゾ
ン結合は、標的細胞（ターゲット細胞）の外部または内
部の酸性環境中でそのコンジュゲートからのアントラサ
イクリンの遊離（放出）を許容丁る。それ故に本発明の
コンジュゲート及びその方法は、癌及びその他の腫瘍、
殺細胞性でないウィルス感染症またはその他の病原性感
染症、及び自己免疫疾患のような病気の治療の際、特定
の細胞群の一つ（ａｇｉ＃ａｔｅｄ　ｐｏｐｓｌａｔｉ
ｏｓ　ｏｆ　ｃａｌｌｇ）を選択的に攻撃（ｋｉｌｌｉ
％ｇ）丁るための抗体又はリガンド・仲介（ｓ＊ｄ４ａ
ｔｓｄ）ドラッグデリバリーシステムに使用されて有用
である。
（従来技術及び屏決すべき課題ノ アントラサイクリンは、細胞毒活性を示すところの抗生
物質化合物である。アントラサイクリンは、次のような
メカニズムを含む多くの異なったメカニズムによって細
胞を殺すように働くことが研究で示されてきている：ｌ
）細胞のＤＮＡ中に該薬剤分子が挿入（ｉｎｔａｒｅａ
ｌａ−ｔｉｏ％）され、それによりＤＮＡ依存の核酸合
成を阻止する； ２）薬剤によってフリーラジカルが産生さ札次にそのフ
リーラジカルは細胞の高分子（ｎａａｒｏ一溝●ｌａｅ
ｍｌｍ）と反応して細胞を傷害する； ３）薬剤分子と細胞膜との相互作用〔例えば、Ｃ，１１
ｔａｒａｏ＊　　ａｔ　　ａｌ．．−ＴｒｃＬｎｓｐｏ
ｒｔ　　Ａｎｄ　　Ｓｔｏｒａｇｅｏｆ　　Ａ＊ｔｈｒ
ａｅｙｅｌｉｓｅａ　　Ｉ％　　Ｅｘｐｍｔｉｍｅｎｔ
ａｌＳｙｓｔｅｍｓ　　Ａｓｄ　　Ｈｓｓａ＊　　Ｌａ
ｓｋａｍｉａｌｎｔルｃａｎｃｅｌｉｎｇＡｓｔｉｈｉ
ｏｔ４ｃｍ　　Ｉｓ　　Ｃａｓａｍｒ　　Ｔｈａｒａｐ
ｙ．Ｆ．　　Ｍ．Ｍｓｇｇｉａ　ａｔ　ａｌＡａｄ．ａ
）ｗｐ．１３２（ＭａｒｔｉｓｓａＮｉｊｈｏｆｆ　Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　　１９８２）：Ｎ．Ｒ．Ｂ８ａｋ
ｓｒ＊＠Ｆｒｇｓ　Ｒａｄｉａａｌ　Ｄａｍａｇｅ−，
ｉｄ　ｐｐ．　９　７−１　０　２、参照〕。その細胞
毒活性が強いことから、アントラサイクリンは、白血病
、乳癌、肺癌、卵巣腺癌、及び肉腫（ａｉｒａｏｍ一の
ような数多くの癌の治療に用いられてきた〔例えば、Ｐ
．Ｈ．Ｗｉｇｒｓｉｋ＋−Ｃｕｒｒｅｓｔ　Ｓｔａｔｕ
ｓ　ｏｆＡｄｒ４ａｍｙｅｉｓ　Ａｎｄ　Ｄａｓｓｏｇ
＆ｙｅｉｎ　Ｉｓ　Ｃａｓｔｅｒ（ａｄｓ．）、　ｐｊ
．　　２７３−９４（Ａｃａｄｔｓｓｃ　　Ｐｒａｙｓ
１９８０）参照〕。普通用いられるアントラサイクリン
としては、アドリアマイシン及びダウノマイシンがあげ
られる。
これら化合Ｗは、特定の細胞群を排除丁ろことが求めら
れているところの新生物（ｓａｏｐｌａａ一及びその他
の疾患状態を治療するにあたり有用であるけれども，そ
の治療上の効果は，しばしばその投与に伴ｒｌう投与量
に依存した毒性によって制限を受けている。例えば、腫
瘍の治療にあたっては、骨髄障害及び心機能障害といっ
た副作用があげられる（　Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｇ，”　
Ｇｏａｌｓ　　Ｆｏｒ　　ＡｎｔｋｒａｃｗｃＬ＜ｘｍ
Ａｎａｌｏｇ　　Ｄａｖｍｌｏｐｎｈａｎｔ　　Ａｔ　
　Ｂｒｉａｔｏｔ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　，
腫瘍の治療にあたり，腫瘍関連抗原に向けられた抗体に
そのアントラサイクリンを結合せしめることによりこれ
ら化合物の治療上の効果を高めるための試みがなされて
きた。
この方法では．その薬剤は．腫瘍部位に運ばれまたは１
ターゲット化（　ｔａｒｇｍｃｇｄ　）　”されること
ができ，体内の正常な細胞に対するそれの毒性を伴った
副作用を減らしつる。従来，腫瘍関連抗原に対するポリ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体に結合せしめ
られたアントラサイクリン化合物、アドリアマイシン（
　ａｄｒｉａｍｙｅｉ％，ＡＤＭ）またはダクノマイシ
ン（　ｄａｓｎ◇ｍｙｅｉｎ，ＤＡＵ）かラ成ルイムノ
コンジュゲートが知られている〔例えば、Ｊ．ＧＬ０Ｌ
Ｌｌｍｇｏ　　６８　１ＬＬ．，＠Ｐｒｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　ＦｏｕｒＤａｓｎｏｔｎｙｅｉｎ−Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　７９１７’／３　
６　　Ｃｏｎｊｂｇａｔａｓ　Ｖ／ｉｔｈ　　Ａｎｔｉ
　−Ｔｓｍｏｓｒ　　ｋｔｉｖｉｔｙτＩｎｔ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｍｒ．３３，ｐｐ．７３７−４４（　１９８４）
及びＲ．Ａｒｎｏｎ　ａｔ　ａＬ．，−　Ｉｎ　Ｖｉｔ
ｒｏ　Ａｎｄ　Ｉｎ　Ｖ５ｖｏＥｆｆｉｃａｃｙ　Ｏ／
　Ｃ６％ｊ％ｇａｔｍ８　　０ｆ　ｉ）（Ｌｓ％Ｄｍｙ
ＣｔｎＷｉｔｈ　Ａｎｇｉ−Ｔｓｍｏｒ　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ”＋　ＩｎｍｓｎｏＬｏｇｉ　−ｃａＪ　Ｒａ
ｗ．６２，ｐｐ．５−２７（１９８２）参照〕。
アントラサイクリンを抗体に結合せしめるための最もよ
く用いられる方法は，アントラサイクリンのアミノ糖部
分の結合を利用するものである。例えば、該アミノ糖は
，過？ウ素酸ナトリウム処理により酸化され、直接に該
抗体のりジン残基にシッフ塩基の形戒を通して結合せし
められる〔例えば，Ｅ．Ｂｓｒｗｉｇｚ　　ａｔ　ａｔ
．＊”Ｔｈａ　ＣｏｖａｔｇｎｇＢｉｎｄｉｎｇ　Ｏｆ
　Ｌ）ａｓｎｏｍｙｃｉｎ　Ａｎｄ　Ａｄｒｉａｍｙｃ
ｉｎＴｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｉａｓ＋Ｗｉｓｋ　Ｒ＊ｔｇ
ｓｔｉｏｎ　Ｏ／　ＢｏｇんＤｔ−ｓｇ　　Ａｎｄ　　
Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　Ａｃｔｉｖｉｔｉｇｓ’．Ｃａｎ
ｃｍｒＲａｎ．，３５　．ｐｐ．１１８２　　８６（１
９７５）参照］。
また別の方法としては、アントラサイクリンのアミノ糖
を抗体のカルボキシル基にカルボジイ■ドー仲介結合を
通して結合アントラサイクリンを抗体に結合せしめられ
ている〔例えば，　Ｅ．ｕｂｒｗｔｔｇ　ａｔ　ａＬ．
．ｌｔｓｐｒａ参照〕。さらにまた，該栗剤のアミノ糖
と抗体のアミノ基とをグルタルアルデヒドでもって交差
結合（　ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ　）せしめることにより
アントラサイクリンを抗体に結合せしめられる〔例えば
＊　”．Ｂ６１１ｍｇ−’ａｌｇ８　１ｇ　ＧＬ−ａ　
　＠’ｎ〆４１デＯ　　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　　Ｏｆ　　
Ｄａ％ｎＯ％１１Ｃｉｎ−Ａｎｔｉ−ＡｌｐｈｔＬＦａ
ｔａｐｒｏｔｍｉｎ　　Ｃｏｎｊｓｇａｔａ　　Ｏｎ　
Ｍｏｓｓｓ　　ｆｌａｐａｔｔｍａＣａｌｌ〆，Ｂｙ．
Ｊ．Ｃａｎｅａｒ＋　　４　ｉ　　ｙ　　ｐｐ．８　４
　１−４　２（１９８０）参照〕。しかしながら，該ア
ントラサイクリンのアミノｍ部分が抗体に対する結合で
修飾されている場合には，コンジュゲート化された薬剤
の細胞毒活性が失たわれていることがイミノコンジュゲ
ートでの研究によって示されている〔例えば、Ｒ　−Ａ
ｒｎＱｎ　ａ　ｔ　Ｇ　ｊ　．ｒ　８　％ｐｒＧｐｐ．
７−８参照〕。加えて、アントラサイクリンアナローグ
についての研究は、該アミノ糖におけるアントラサイク
リンの修飾は．七の親である薬剤に比してそのアナロー
グ薬剤の細胞毒活性を減少せしめることにはることを示
している〔例えば、Ｋ，Ｙａｖｍｍｏｓｏ　ａｔ　ａＬ
．＠ＡｎｔｉｓｓｔｍｏｒＡｃｔｉ會ｉｇ　　Ｏ／　　
Ｓｏｍｅ　　Ｌ）ｍｒｉ＊ａｔｉｖｍｓ０１Ｄａｓｓｏ
ｍｙｃｉｓ　Ａｔ　Ｔｈｅ　Ａｍｉｎｏ　Ａｎｄ　Ｍａ
ｔルｙｔＫａｔｏｎａ　Ｆｓｎｃｔｉｏｎｓ．＠Ｊ．Ｍ
ｇｄ．Ｃｈｇ釦，　１５ｔｐｐ−８７２−７５（１９７
２）参闇〕。
該アントラサイクリン，すなわちダウノマイシンを，該
薬剤の１４一位炭素（ｃ−　１　４　）部位で抗体に直
接結合したところの別のイムノコンジュゲートが製造さ
れている。
しかしながら，これらのイムノコンジュゲートの腫瘍細
胞に対する細胞毒活性の選択性はその再現性が容易なも
のでなく、２０μｊ’／ｍｔｆ）１１度でのみ確実にそ
札が示されるものであった〔Ｊ．ＧａＬｔａｇｏ　ａｔ
　ａｌ．＊ａｓｐｒａ参照〕。
４１［２７４６ｓｓ号には、１３位のケト基のアクルヒ
ドラゾン結合を介して抗体に結合するアントラサイクリ
ンコンジエグートが開示されている。このコンジュグ−
７ヨン化は，抗体を誘導体化するし，次にその誘導体を
アントラナイクリンと反応させることを含む方法を用い
て行なわれる。該抗体の誘導体化は望ましくない非特異
的な反応が含まれ，大変にアントラサイクリン：抗体比
が低いものが得られることからこれらの方法は良い方法
ではない。
その第一の方法に従えば、抗体はヒドラジンの存在下に
カルポジイミドで処理され，ヒドラジド抗体誘導体とし
，次にアントラサイクリンと反応させ．該アントラサイ
クリンを直接に抗体骨格に結合させる。しかしながら，
得られたイムノコンジュゲートは、該抗体分子がアグリ
グートしやすい。さらに，本方法は抗体分子上のカルボ
ン酸基が必要であるが，その数は限られていることから
，これらのイムノコンジエグートは、アントラサイクリ
ン：抗体比が低い（約１．１−１．３）。
その第２の方法は％該抗体とコハク酸無水物とを反応さ
せ，抗体のアミド酸誘導体とする方法を含むものである
。
次にこの誘導体をヒドラジンと反応させ，抗体ヒドラジ
ド誘導体を得，次にこれをアントラサイクリン化合物，
ダウノマイシンと反応させる。この第２の方法はその抗
体誘導体とヒドラジンとの反応は非特異的なものであり
、所望のヒドラジド誘導体に加えて、種々の抗体誘導体
の混合物の形成に導びく点に問題がある。このように、
特願２７４６５８号に示されているように、抗体に対す
るアントラサイクリンのモル比は、大変に低いものであ
る（約１である，特願２７４６５８号　第２６４頁，第
１欄）。また、欧州特許出願公開第２９４２９４号には
、抗体の糖類基に、アントラサイ４り冫のＣ−１３ヒド
ラゾン誘導体をコンジュゲート化したものが開示されて
いる。
また、その他のアントラサイクリンヒドラゾンが、Ｇ．
２１．ｐｐ．２８０−８３（１９７８）；及びＲ．Ｔ．
Ｃ．ＢｒｏｓｎｎＬａｅ　　ａｔ　αｔ．，Ｊ．Ｃ五−
ｎ＋．ｓｏｅ．ｐｐ．６５９−６１（１９８６）に開示
されている。また米国特許第４１１２．２１７号には，
ダウノマイクン及びアドリアマイシンのビスーヒドラゾ
ンが開示されている。
また他の研究においては，アントラサイクリンは，その
細胞毒性を高めるため及びその薬剤の毒性を減らすため
，デキストランまたはポリグルタミン酸のような高分子
担体に結合せしめられている〔例えば，　Ｒ．Ａｒｎｏ
ｎ　ｓｔ　（ＬＬ．ｅｓｓｐｒａ．ｐ．５及びＥ．Ｈｕ
ｒｗｉｔＶａｔ　ａｌ．ｅ＠ｓｏｌｓｂｌａＭａｅｒｏ
ｍｏｌａｃｓｌａＦＡｓ　　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　　Ｆｏ
ｒｌ）ａ％ｎｏｒｓｂｉｃｉｎ”．Ｊ．Ａｐｐｔ．Ｂｔ
ｏｃｈａｔｎ．＋２　ｅ　ｐｐ．　２５−３５（１９８
０）参照〕。これらの担体結合アントラサイクリンも腫
瘍関連抗原に対丁る抗体に共有結合せられ、腫瘍細胞に
対して特異性を持つように細胞１１栗剤のターゲツテイ
ングがなされるようイムノコンジュグート形成されてい
る。例えば，アドリアマイシンは，カルボキシメチル−
デキストランヒドラジド結合を介して「抗腫瘍」抗体に
結合せしめられ，該アドリアマイシン分子は，アドリア
マイシンのテトラサイクリン環のＣ−１３位カルボニル
側鎖位でカルボキシメチルデキストランのヒドラジン誘
導体に結合している。次に抗体を該デキストランヒドラ
ジド誘導体とグルタルアルデヒドでもって結合せしめ，
アドリアマイシンーデキストラン−抗体コンジュグート
を形成せしめる（Ｒ．Ａｒｎｏｘ　　ａｔ　　ａｌ．，
＠Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｓ
　　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　　Ｆｏｒ　　７ｓｓｓ％ｏｔａ
ｒｇｍｔｉｎσ　Ｏｆαｌ．（ｅｄａ．）．ｐｐ．３６
５−８３（　１９８５）及びＥ．Ｈｓｒｓｎｉｔｚ　ａ
ｔ　ａｌ．，−Ａ　Ｃ’ｏｎｊｓｇａｔｍ　ＯｆＡｄｒ
ｉａｔｙｈｙｃｉｍ　Ａｎｄ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　　Ａｔｓ＊ｉｂｏｄｔａｓＴｏ　Ｔｈｙ−Ｉ　　Ａｎ
ｔｉｇｅｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｉｎｍａｎＮｅｕｒ
ｏｂｌａｓｔｏｍａ　Ｃａｌｌｓ　Ｉｔｓ　Ｖｉｔｒｏ
　　，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｅａｄ．Ｓｃｉ．．４１７，
ｐｐ．１２５−３６（１９８３）参照〕。
しかしながら．その担体の使用は、ある種の欠点を伴な
う。例えば、担体含有イムノコンジュゲートはその大き
さがかなり大きくて、生体内で細網内皮系によってすみ
やかに除去される〔例えば．Ｒ．０．υ＜ｔｔｍａｎ　
ａｔ　ａｔ．，＠Ｐｒａｃｌｉｎｉａａｌ　Ｔｒｉａｌ
ｓ　Ｗｉ＊ルＣｏｍｂｉｓａｓｉｏｎｓＡｎｄ　Ｃｏｎ
ｊｓｇａｔａｓ　Ｏｆ　７’ｌ０１　　Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｎｄ　Ｌ）ｏｚｏｒｓｂｔ
ｃｉｎ　　，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｓ。
４６，ｐｐ．４８８６−９１（１９８６）参照〕。この
丁みおかな担体含有イムノコンジュグートの除去は，該
コンジュゲート化された薬剤が，その作用すると考えら
れる部位，すなわち，殺されるべき特定の細胞詳にまで
決して到達し得ｒｘいことから治療上優れているとはで
きない。加えて、高分子担体が存在すると，そのイムノ
コンジュゲートの安定性にマイナスの効果を及ぼし，該
コンジュゲートの抗体の結合活性を減少せしめることが
示されている〔例えば、Ｍ，Ｊ，Ｅｍｂｔａｔｏｎ　　
ａｔ　　ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　Ｔａｒｇａ＊
ｉｎ４０ｆ　Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　　Ａｇａｎｔａ
−　＋　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　
　Ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｎ
ｄＴｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．　　Ｂａｔｄｗｉｎ　　ａ
ｔ　　ａｌ．（ａｄｓ．）ｍｐｐ＊３２３−２４（１９
８５）参照〕。さらに，腫瘍細胞についての研究で．高
分子担体含有イムノコンジュグートが生体内で腫瘍細胞
に集まることができるとの証拠は何もない。
Ｃ．Ｈ．Ｊ．Ｆｏｒｄ　１ｔＧｌ．＊’ＬＯＧ（Ｌｌｉ
ｇ（Ｌｔイｏｎ　ＡｎｄＴｏｍｉｃｉｔｙ　Ｓｔｓｄｙ
　（７／　Ａ　Ｖｉｎｄｍａｉｎａ−Ａｎｔｉ−ＣＥＡ
Ｃｏｎｊｓｇａｔｍ　Ｉｎ　Ｐａｓｉａｎｔａ　Ｗｉｔ
ルＡｄｖａｎｃｅｄｃａ％ｃａｒ’　，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｍｒ，−　Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃａｒｅ　　４７　，
３５−４２（１９８３）には，直接にコンジュグート化
された薬剤一抗体コンジュゲートが生体内で腫瘍細胞に
分布していることが示されているのと対比される。
このように、特定の結合及び担体（キャリャー）を用い
ての抗体へのアントラサイクリンのコンジュゲート化が
示されている。上記概説したように，これらのイムノコ
ンジュゲートの使用は，使用される特定の結合または担
体に依存するところの明らかな欠点をもたらす。
ある種のりガンドートキシンコンジュゲートもまた知ら
れている。例えば，　Ｉ．Ｐａａｔａｎの米国特許第４
，５　４　５．９８５号には多くのＥＧＦレセプターを
持っている細胞に対して使用するための７ェードモナス
（　Ｐｓｍｓｄｏｍｏｔｓａａ）エンドトキシン（ＰＥ
）がＥＧＦに１＝２の比で結合せしめられている工冫ド
トキクンコンジュゲートが開示されている。またＥＧＰ
−リシンＡ及びＥＧＦ−ジフテリアトキシンコンジュゲ
ートも作られている〔例えば，　Ｄ．Ｂ．Ｃａｗｌｍｙ
ａｔ　　ａｌ．ｅ　＠Ｅｐｉｄｍｒｍａｌ　　Ｇｒｏｗ
ｌ五　Ｆａｃｔｏｒ−ＴｏｘｉｎＡ　Ｃｈａｉｎ　Ｃｏ
ｎｊｓｇａｔｍｓ：ＥＧＦ−Ｒｉｃｉｎ　Ａ　Ｉｓ　Ａ
Ｐｏｔａｎｔ　Ｔｏｘｉｎ　Ｉｉ’ｈｉｌａ　ＥＧＦ−
１）ｉｐｈｔルーｖｉａＦｒＧＱｎ＆ｇｎｇ　　Ａ　Ｉ
Ｓ　　ＮＯｎｇ０８８（ｊ　　　＃　Ｃｇ　Ｌ　ｊ　＊
　２　２　ｅ　ｐｐ　．５６８−７０（１９８０）及び
，　Ｎ．Ｓｈｔｍｉｍｍａｔ　ａＬ．，”Ａ　Ｃｙｔｏ
ｔｏｚｉｃ　Ｅｐｉｄａｒｖｍａｌ　ＧｒｏｗｔｈＦａ
ｃｔｏｒ　　Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ　　Ｔｏ　　Ｄ
ｉｐｈｓｈａｒｉａ　　ＴａｘｉｓＡ−Ｆｒａｇｔｍｍ
ｎｔ−，ＦＥＥＳ　　ＬａｔｔａｖａｅｌｌＢ（４２）
、ｐｐ．２７４〜７８（１９８０）参照〕。さらに，シ
ュードモナスエンドトキシン融合夕冫パク質は．ＴＧＦ
−α，ＩＬ−２、ＩＬ−５及びＣＤ４のような夕冫パク
質、ポリペプチド及び増殖因子（ｇデ●ｗｔｈ　ｆαｃ
ｔｏデ）を用いて製造される〔例えば．Ｉ．Ｐａ＃ｔ（
Ｌｎ　ａｔ　Ｇｇ．，−Ｎｏｖａｌｔ’ｙ＠ｏｔＯＺｉ
ｅ　Ａ１１ａ％ｇ＃　Ｃｒａｔｘｇａｄ　ＢＷ　７’Ａ
＃　Ｆ％ａｔＯｎＯｆ　　Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏ
ｒ　　Ａｎｄ　　Ｔｏｘｉｎ　　Ｇａｎｇｓ”Ｆｏｕｒ
ｔｈ　　Ｉｎｔ　ｍｒｎａｔ　ｊ　．Ｃｏｎｆａｒｅｎ
ｃｍ　Ｏｎ　Ｍｃｙｎｏｃｌｏｎａｌ９．　３　６　（
　３月３０日−４月１日，　　１　９　８　９　）Ｈ　
．　Ｌｏｒｂａｒｂｏｓｍａｔ　　ａｌ．＊Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５＋ｐｐ−１
９２２−２６　（１９８８　）；Ｖ．Ｋ．Ｃｈａ％Ｌｄ
ｈａｒｙ　ａｔａｔ．．ｐｒｏｃ．ｙａｔｔ．Ａｃａｔ
ｔ．ｓｃｔ　．ｔｙｓＡｍｓ　４　ｔ　ｐｐ−４５３８
−４２（　１９８７）；Ｃ．Ｂ．ＳｉｍｇａｌＬ　　ａ
ｔ　ａｔ．．Ｐｒｏｃ．ＮａｓＬ．Ａｃａｄ．．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ＋８５＊ｐｐ．９　７３Ｂ　−４２（１９８８
）；及びＶ．Ｋ．Ｃルａｓｄｈａｒｙ　ａｔ　ａｌ．ａ
Ｎ（Ｌｇ％デー，３３５，ｐｐ．３６９−７２（１９８
８）参照〕。
そして，ジフテリアトキシンーα−メラノサイト刺激ホ
ルモン融合夕冫バク質も作られている［Ｊ．Ｒ．Ｍｓｒ
ｐｈｙ　　ａｔａｌ．嘗＠Ｇａ％ａｔｉｃ　Ｃｏｎｓｔ
ｒｓｃｔｉｏｎ．ＥｍｐｒｍｓａｉｏｎＡｎｄ　Ｍａｌ
ａｎｏｆＩ＆ａ−Ｓａｌａｃ客ｉｖｍ　Ｃｙｔｏｇｏｚ
ｉａｉｔｙ　ＯｆＡ　Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　Ｔｏｘｉ
ｎ−Ｒｅｌａｔｅｄα−Ｍａｌ（Ｌｎ＠Ｃｌｔｍ−Ｓｔ
ｉｔｎｓｌａｔｉｎｇ　　Ｈｏｒｗ＋ｏｎａ　　Ｆｕｓ
ｉｏｎ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ＊８３ｅｐｐ．８２５Ｂ−６２
（１９８６）及びＪ．Ｒ．Ｍｓｒｐｈｙの米国特許第４
，６７５，３８２号参照〕。しかしながら、夕冫パク質
トキシンを含有するりガンドコンジエグートは，異種の
宿主体において免疫原性を示す傾向がある また，ＡＤＭまたはＤＡＵのようなアントラサイクリン
は，トランス７エリン〔英国特許出願第２１１６９７９
，４号参照〕又はメラノトａビン（　ｖａｎ　Ｌａｎｅ
　ｔｒｏｐｉｔｓ　）　（　／．Ｍ７ａｒｇａ　　ａｔ
　　ａｌ．，＠ＭｍＬａｎｏｔｒｏｐｉｎ−１）ａｓｎ
ｏｍｙｃｉｎＣｏｎｊｓｇａｔａ　　Ｓルｏｗｎ　　Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍａｄｉｔｘ＊ａｄＣｙｔｏｔｏｚｉ
ｅｉｔｙ　　Ｆｏｒ　　Ｃ曽１ｔ聾ｒａｄ　　Ｍｓｒｉ
ｎａ　　ＭｍＬａｎｏｔｓａＣａｌｌｓ−，Ｎａｔｓｒ
Ｂ２６７ｅｐｐ．５６　　５８（１９７７）参照〕のよ
うなある種の夕冫パク質又はポリペプチドリガンドに化
学的に結合せしめられた。更に，ｐｃｒ特許出願公開Ｗ
０８８／００８３７号（ダウノマイシンのようた細胞毒
物質にポリマー担体な介して結合したＥＧＦ）及び米国
特許第４．５　２　２，７　５　０号並びに米国竹許第
４５９α００１号（それそれヴインカアルカロイド及び
白金に結合したトランスフエリン）参照。
（ｌ！題の解決） 本発明＆転攻撃すべき（殺傷すべき）％定の標的（夕一
ゲット）細胞群の一つ反応することのできる分子にリン
カーアームを介して細胞毒作用を有するアントラサイク
リン分子を結合せしめるための新規な化学手法を提供す
る。本細胞反応性分子としては、抗体のようなタンパク
質またはボムペシン若しくはＥＧＦのようなりガンドで
あることができる。
本発明の具体例の一つに従えば、多くのアントラサイク
リン分子が特定のターゲット細胞群の一′）．（ａｇｉ
ｄａｔｅｄｔａｒｇｅｔ　　ｃａｌｌ　　ｐｏｐ％ｌａ
ｔｉｏｓ）と反応性の抗体に結合＼ させられる。各々のアントラサイクリンは、リンカーア
ームを介して該抗体に結合せしめられ、該アントラサイ
クリンは、その１３−ケト位のアシルヒドラゾン結合を
介して該り冫カーに結合して、本発明の新規イムノコン
ジュゲートを形成する。例えば、本発明の好ましい具体
例としては、新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体
（ＡＤＭ−ＨＺＮ）の合或があげられ、そのＡＤＭ−Ｈ
ＥＮは次にチオール化された抗体と縮合せしめられて、
該アントラサイクリンをリンカーアームを介して該抗体
に結合せしめている。該崩のＣ−１３位に形或せしめら
れたアシルヒドラゾン結合は、該ＡＤＭ’ｌ（該り冫カ
ーに結合せしめるサイトとしての働きをする。さらに、
ジスルフィド結合は、抗体結合サイトとしての該り／力
一中に存在している。本発明の他の好ましい具体例に従
えば、該ＡＤＭ−ＨＺＮは還元せしめられて、スルフヒ
ドリル基を形或し、そして得られる新規なヒドラゾン誘
導体は、マレイミド誘導体化された抗体と縮合せしめら
れる。これは、ＡＤＨのＣ−１３位に結合するリンカー
サイトとしてのアシルヒドラゾン結合を有するリンカー
アームと、抗体に結合するリンカ一部としての該リンカ
中のチオエーテル結合の形成に導く。
本発明の更に別の好ましい具体例に従えば、該新規ＡＤ
Ｍ−ＨＺＮ中間体は、チオール化されたリガンド、例え
ば、ボムベシン、トランスフエリンまたはＥＧＦのよう
なチオール化されたリガンドに共有結合され、該アント
ラサイクリンをリンカーアームを介して該リガンドに結
合せしめる。
上記した他の具体例におげろように、該アントラサイク
リン＆ちそのＣ−１３位において形成せしめられたアシ
ルヒドラゾン結合を介して該リンカ一に結合−ピしめら
れる。加えて、ジスルフィド結合またはチオエーテル結
合は、該リンカー骨格中に存在していてもよい。これら
の具体的な態様から明らかなように，本発明は、また本
発明のコンジュグートを製造するにあたり有用なアント
ラサイクリンの新規アシルヒドラゾン誘導体を提供する
。
本発明のイムノコンジュグートは，おおよそ４〜１０の
モル比のアントラサイクリン：抗体のもので、特定のタ
ーゲット細胞を殺傷するための抗体活性及び細胞毒薬剤
活性の両方を保持している。本明細書に記載のアントラ
サイクリンーリガンドコンジュグートとしては，少なく
とも１のアントラサイクリン：リガンド比を持ち，レセ
プタ−（デ−ｃａｐｔｏｒ　）結合活性及び細胞毒楽剤
活性の内方七持つものであることができる。該アントラ
サイクリンのこれらコンジュゲートのリンカーアーム部
への結合部位（サイト）に存在丁る酸に感受性χ有丁る
ヒドラゾン結合．そしてさらには本発明の好的な具体的
態様における該リンヵ一アーム内のジスルフィド結合ま
たはチオエーテル結合は、細胞内，例えばりソゾーム小
胞中で遭遇丁るような典型的た条件のような還元的及び
酸性条件で活性を有する薬物を放出するのに理論的に適
している。
本発明のコンジュゲートは、医薬組底物，丁なわち医薬
上有効な量の本発明のコンジュグートの少なくとも一つ
と薬学上許容しうる担体とからなる医薬組或物のようｒ
ｘ．ものに使用されつる。本発ＢＡはまた、排除丁るこ
とか望まれるターグット細胞の特定の詳の一つに，細胞
毒薬剤を選択的にデリバーするための方法並Ｑに医薬上
有効な量の本発明の組成物でもって，医薬上許容される
方法で噛乳動物娶処置する方法に関する。
優利には、本明細書において開示されたコンジュグート
，医薬組成物及びその方法は、癌及びその他ｆ：？朧瘍
、非殺細胞性のウイルス感染症またはその他の病原性感
染症．及び自己免疫疾患のような疾病を治療するにあた
り，特定のターゲット細胞の群の一つを選択的に殺傷す
るために、細胞毒性を有するアントラサイクリン薬物を
該特定の細胞詳の一つにターゲッテイングするための有
効な方法を提供する。
以下本発明を更に詳細に説明する。本明細書中に開示さ
れている本発明をより完全に理解する目的で、次により
詳細に説明を行なう。
本発明は，癌及びその池の鹿瘍、殺細胞性でｒＬいウイ
ルス感染症またはその他の病原性感染症，そして自己免
疫疾患のような病気の治療用に有用な，新規なアントラ
サイクリンコンジュグート，′＃規なアントラサイクリ
ンアシルヒドラゾン誘導体，それらの化合物の製造方法
，それらの医薬組成物，及び排除することが望まれる特
定の細胞群の一つに細胞４性を持つアントラサイクリン
をデリバーするための方法に関する。特に本発明は，ア
ントラサイクリンがｌ３−クト基のアシルヒドラゾン結
合を介して，排除されることが求められている特定の細
胞群の一つと反応注ヲ有する分子に結合し，排除される
ことが求められている特定の細胞群の一つと反応性を有
丁る分子に少なくとも１個のアントラサイクリン分子が
結合していることからなるアントラサイクリンコンジュ
ゲートに関する。該細胞に反応性を有する分子としては
，抗体のようなタンパク質あるいはポムベクンまたはＥ
ＧＦのようなりがンドであってよい。
かくして，本発８Ａｆ）一つの好ましい態様に従えば，
本発明は，ある特定の細胞に対す抗体であって，その抗
体骨格に結合せられた多くのアントラサイクリン分子を
有する抗体からなるイムノコンジュゲートに関する。該
アントラサイクリン分子は，該抗体に共有結合されてお
り、各薬剤分子と該抗体との間にはリンカーアームが形
成され、そして該リンカーは該アントラサイクリンの１
３−ケト基の位置？アシルヒドラゾン結合により該アン
トラサイクリンに結合している。本発明の別の好ましい
態様に従えば、本発明は．％定の細胞群の細胞の表面と
関連した１個またはそれ以上のレセプターと反応すると
ころのリガンド（ポリペプチドまたはベプチドリガンド
のようなりがンド）であって，その骨格に結合した少な
くとも１個のアントラサイクリン分子を持つリガンドか
ら成るアントラサイクリンーリガンドコンジュグートに
も関丁る。該アントラサイクリンは．アシルヒドラゾン
結合を介して該アントラサイクリンの１３一クト基の位
置で該アントラサイクリンに結合するところのリンカー
アーム■よって該ペプチドに共有結合している。
本発明のコンジュグートは，最初に新規なアントラサイ
クリンーヒドラゾン誘導体を形或することからなる多段
工程法によって製造丁ることかでき．その形威されたア
ントラナイタリンーヒドラゾン誘導体は次に適当な特異
性を持つところの夕／パクＩＸ′ｆ．たはリガンドと反
応させられるのである〔例えば，抗体における慣用的カ
ップリング方法については，Ｒ，Ｒ．ＨａｒｄｙどＰｓ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＡｎｄＣｏｎｐｌｉｎｇ　Ｌ）
ｆ　　Ｆｌ＠ｏｔｃｓｃａｎ＊　　Ｆｒｅｔｔｉｎｇ　
　ＦｏｒＵｓｓ　　Ｉｓ　　ＦＬｏｖ　　（；ｙ＊ｏｓ
＊ｔｒｙ　　ｓＨａｎｄｂｏｏｋ　　υｆＥｚｐｍｒｉ
ｔｍａｎｓａｊ　　ＩｓｍｓｎｏκＯＱｌ＊ＶＯｌｓｍ
ａ　　ｌ：Ｉｔｍｎｓｎｏｃｋｍｔｎｉｓ　ｔｒｙ＊Ｌ
）．Ｍ．ＩＰ’ａｉｒ　ａ　ｔ　ａｌ　．　（　ａｄｓ
　）　．ｐｐ．３Ｌ４〜３１．１２（４ｔＡ　Ｅｄ．１
９８６）参照；リガンドコンジュグートの製造法につい
てはＪ，Ｍ．Ｖａデｇａ●客　αｇ．．　８ｓｐｒα参
ト〕。該アントラサイクリンヲ該コンジエグートの細胞
と反応性を有丁る成分に結合せしめるリンカーアームの
長さは，該リンカーの該アントラサイクリンへの結合部
分が該アントラサイクリンＱ）Ｃ−１３位でアシルヒド
ラゾンのかたちになる限り種々のものであることができ
る。該リンカーアームは，さらに別の結合（ジスルフィ
ド結合．チオエーテル紹合．アξド結合．カルバメート
結合，エーテル結合またはエステル結合のような結合）
を．該薬剤と該細胞と反応性を有する分子との間の結合
部の間のいずれかの部分に有していることができを。
本発明のコンジエグートを含有するところのアントラサ
イクリンは，１３位の炭素部（Ｃ−１３）にクト基を有
するいかなるアントラサイクリンであってもよい。かよ
うなアントラサイクリンとしては，特に限定されないが
，アドリアマイシン（αｄｒｉａｒｍｙｃｉｎ　）　，
　ｆウノマイシン（ｄａｓｎｏｍｙｃｉｎ　）．デトル
ビシン（　ｄａｔｏｒｕｂｉｃｉｎ　）、カルミノマイ
シン（　ｃａｒ惰ｉπｏｗａｙｃｉｎ），イダルビシン
（　ｉｄａｒｓｂｉｃｉｎ　）、エビルビシン（　ａｐ
ｉｒｓｂｉｃｉｘ）、エノルビシン（　ａｓｏｒｓｂｉ
ｃｉｎ）、４’−ＴＨＦ−７ドリアマイシン．ＡＤ−３
２及び３′−デアミノ−３’−　（　３−シアノ−４〜
モルホリニル）−ドキソルビシン（　ｄｏｚｏへｂｉｃ
ｉｎ）があげられる（　Ａ．ｍ．ｃａａａｇｇａ．”ｐ
：ｚｐａｒｉｍａ旧ａｔＳｔ＊ｄｉａｍ　Ｏｎ　Ｎｅｗ
　ＡｎｔｈｒａｃｙａＬｉｎｍｓＡｄｒｉａｍｙｃｉｎ
；Ｉｔｓ　　Ｅｙｇｐａｎｄｉｎｇ　　Ｒｏｌｅ　　Ｉ
ｎ　　ＣａｎｃｅｒＴｒｇａｔｗｈａｎｔ．Ｍ．Ｏｇａ
ｗａ　ａｔ　ｃＬＬ　．（　ａｄｓ　）　＋　ｐｐ．　
４３９５　２　（　Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍａｄｉｃａ　
ｌ　９　８　４　）参照〕。
該コンジュゲートにおいて該アントラサイクリンに結合
しているところの細胞と反応性を有する分子としては，
耕除丁ることか求められている細胞詳に結合するかある
いは反応するところのいかなる分子であってもよいとい
うことが埋屏されよう。かような分子としては．それに
限定されるわけではないが，抗体のような巨大分子夕冫
バク質（一般的には，１０，０００ダルトンよりも大き
なもの）、比較的低分子量の夕冫パク質（一般的には．
１０．０００ダルトンよりも小さなもの），ポリベブチ
ドまたはペプチドリガンド，及び非ペプテド性リガンド
があげられる。
このようｖｃ．本発ＢＡＩＯイムノコンジュゲートを含
むところの抗体は．排除丁べきあるいは殺傷丁べき（攻
撃すべき）ことが望まれるところの特定の細胞群の一つ
と反応性を有するいかなる抗体であってもよい。このよ
うな抗体の例としては，それには限定されないが、癌腫
（Ｃａデｃｉｎｏｍａ）　ｈ黒色腫（メラノーマ．１ｒ
ｈａｌＧ１％ｏｍα）、リンパ腫（　ｔｙｔｇｐｈｏｍ
α）、骨または軟組織の肉ＰＭＣｓａｒｃｏｍａ　）並
びにその他の腫瘍に見出される抗原のような腫瘍関連抗
原（　ｔｓｔｎｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉ
ｇｅｎ）に結合するところの抗体，ウイルスまたはその
池の病原体と関連した抗原に結合丁る抗体，及び正常で
ない（　ａｂｎｏｒｍａｌ　　）ＩＩＡ胞の表面抗原に
結合する抗体があげられる。これらの抗体はポリクロー
ナル抗体であることもできるし，また好ましくはモノク
ローナル抗体であることができ、当該分野でよく知られ
た方法を用いて製造することができる〔例えば、Ｒ．Ａ
．Ｄ−　μ’ａｇａｒ　　ａｔ　　ａｌ．ｙ　　＠Ｅｒ
ａｄｉｃａｔｉｏｓ　　ｏｆＭｕｔｉｎｙ　Ｌｙｍｐｈ
ｏｍａ　Ａｎｄ　Ｍｅｌａｎｏｍａ　Ｃａｌｌｓ　Ｂｙ
ＣｈＬｏｒａｔｍｂｓａｉｌ　−Ａｓ目ｉｂｏｄｙ　Ｃ
ｏｍｐｉａｚｍａＩｒｓｍｓｎｏｌｏｇｉａａｌ　Ｒａ
ｍ．　６　２、９ｐ．　　２９−４５（１９８２）（腫
瘍特異ポリクローナル抗体の製造及びコンジュゲートへ
の使用）及びＡｆ．　Ｙｍｈ　ａｔ　　ａｌ．．　＠Ｃ
ａｌｌＳｓｒｆａａａ　Ａｓｔｉｇｍｎａ　Ｏｆ　Ｈｕ
ｔｎａｓ　Ｍｅｌａｎｏｍａ　Ｉｄｇ−ｎ＊ｉｆｉｍｄ
　　Ｂｙ　　ＭｏｓｏａＬｏｎａＬ　　Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　　　，　　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓ
ａｉ．，　７　６、ｐｐ．２９２７−３１（１９７９）
及びＪ　．Ｐ．　Ｂｒｏｗｎ　ｓｔ　ａＪ　．　＋　＠
Ｓｔｒｓｃ−ｔｓｒａｌ　　Ｃｈａｖａａｔｍｖｉｇａ
ｔｉｏ舊　Ｏｆ　Ｅｓｔｎａｎ　ＭｅｌａｎｏｍａＡａ
ａｏａｉａｔａｄ　Ａｓｔｉｇａｓ　ｐ　９　７　ｗｉ
ｔｈ　ＭｏｓｏｅｌｏｓａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｍｓ　　
，　Ｊ．　＃ｙ＋ｓｓｓｓｏｊ　．　ｅ　１　２　７　
（４２　）、ｐｐ．ｓｓ９−＜６ｃ１９ｓ１）Ｃｍ瘍に
特異的なモノクローナル抗体の製造）参照〕。例えば、
モノクローナル抗体Ｌ６（ヒト肺癌に特異性を有する）
及びモノクローナル抗体７　９　１　Ｔ／３　６　（骨
原性肉魔［　ｏａｔａｏｇａｖｓｉａ　ｓａｖｅ　−０
％ａ］　細胞に特異性を有する）が使用できる。
また更には、内在化していない（旧鴨一ｉ％ｔａｒ引目
４　−ｇｉ％ｇ）抗体及び好ましくは内在化している（
　ｉｓｔａｒｎａ−Ｈｓｉ％ｇ）抗体を使用することが
できる。本明細書において使用せられている「抗体」と
いう用語は、インタクト（ｔ％ｔａｅｇ　）な抗体分子
及び該抗体の結合活性を有する領域を含有するフラグメ
ント、例、Ｆｅｄまたは’（６６’）ｔをも含むもので
ある。モノクローナル抗体が使用せられる場合、その抗
体は、それには限定されるものではないが、マウス起源
の抗体またはヒト起源の抗体、またはキメラ抗体（ｃｈ
ｉｆＩ＆ｅｒｉａ　ａｓｔｉｂｏｄｙ）であってよい。
本明細書において使用せられている「リガンド」という
用語Ｌ特定のターゲット細胞群の細胞表面に結合したレ
セプターに特異的に結合するところのいかｔｘる分子を
も含むことは、埋解されよう。本発明のアンドラサイク
リンーリガンドコンジΔゲートを形成するために用いる
ことのできる好ましいリガンドとしては、それには限定
されないが、トランスフエリン、ＥＧＦ，ボムペシン、
ガストリン、カストリンー放出ペプチド、血小板由来増
殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ一α、ＶＧＦ，Ｔ
ＧＦ−μ、インシュリン、インシュリン様増殖因子■及
び■のようなタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチ
ドリガンドがあげられる。その他の非ペプチド性リガン
ドとしては、ステロイド、糖類（ｏａｒｂｏｈｙｄ　デ
ａｔｏｍ　）　　及びレクチンがあげられる。
このように、本発明のコンジュゲートの細胞と反応性を
有する分子、例えば抗体あるいはりガンドは、該抗体ま
たはリガンドと反応性を有する特定の細胞群の所に該ア
ントラサイクリン分子をデリバー（ｄｅｌｉｖｅｒ）す
るように働くのである。例えば、腫瘍細胞の表面に見出
される抗原に対する抗体は、該Ｊｆｉ細胞に結合し、そ
のアントラサイクリンを＃腫瘍細胞にデリバーするし、
ＡＩＤＳを起こすところのヒト免疫不全症候群ウイルス
（＃ｓｍａ％Ｉｍｗ＊ｓｓｏ−ｄｍｆｔａ４ａｓｅｙ　
Ｖｉｒｓａ　：ＨＩＶ）（１）ｐ　冫パク質に対する抗
体は、その細胞毒性を有するアントラサイクリンをＨＩ
Ｖ感染細胞の所にデリバーするのである。同様に、朧瘍
細胞（＆Ｉｉのよう々腫瘍細胞）は、轡に高密度である
種のレセブター（ＥＧＦレセプターのようなレセブター
）を発現するので、ＥＧＦのようなリガンドは、癌腫細
胞に結合して、そのアントラサイクリンを該癌腫細胞に
デリバーする。
該抗体あるいはリガンドが反応するところの特定の細胞
群のサイトの内部あるいはそのサイト部での該薬剤の放
出は、これら特定の細胞を優先的に殺傷することにつな
がる。
かくして、本発明のフンジュゲートは、該コンジュゲー
トの結合を許容するところの細胞表面抗原またはレセプ
ターを有するところの特定の細胞群であって、排除され
ることが求められるところのいかなる病気の治療にも有
用であることは明らかである。
本発明のコンジュゲートを用いることのできる病気とし
ては、それに限定されｋい力丸癌またはその他の腫瘍、
ＡＩＤＳ，ヘルペス、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）
、ＥＢＶ（エプスタインパールウイルス）及びＳＳＰＥ
（亜急性硬化性全脳炎、ｓ＊ｂａａｓｔａ　　ａａｌａ
ｒｏａｉａ　ｐａｎｅｓ　−ａｍｐｈａｌｉｔｉａ　）
のような殺細胞性のないウイルス感染症またはその他の
病原性感染症、及びリューマチ性関節炎があげられる。
理論的に裏付けちれている訳では々いが、抗体と結合し
たアントラサイクリン分子またはリガンドと結合したア
ントラサイクリン分子、すたわち、本発明のコンジュゲ
ートの形態にある抗体あるいはりガンドと結合したアン
トラサイクリン分子は、その抗体またはりガンドの有す
る特異性を介して殺傷されるべきターゲット細胞中にデ
リパーさへ次に細胞膜に結合したコンジュゲート化され
ていたい抗体あるいはリガンドが内在化されるのと回じ
エンドサイトーシス経路を介して該細胞の中に入ると思
われる〔例えば、１．　Ｐａｓｔａｓ　ａｔ　ａｌ．，
　＠Ｐａｔｈｗａｙ　Ｏｆ　Ｅ鴨ｄｏｏｙｔｏ−ｓｉａ
”、Ｅｎｄｏｃ１１ｔｏａｉａ＋　７．　Ｐａｓｔａｖ
ｓ　ａｔ　ａｊ．（　ａｄｓ　）、ｐｐ．１−４　４　
（７’ｌｓｓｓｍ　　Ｐｒａａａ　　１　９　８　５　
）参照〕。
一旦細胞内に入ると、該コンジュゲートを含んでいるエ
ンドサイトーシス顆粒は、リソゾーム（ｐｒｉｍａｒｙ
　　ｌｙｅ−ｏａｏｗｈｍ）と融合して、新たなリソゾ
ーム（　ａｍａｏｔＬｄａｒｙｌｙａｏａｏｖｙ＋ａ　
）を形成する〔例えば、Ｍ．Ｊ　．　Ｅｍｂｌｍｔｏｓ
ａｔ　ａＪ−＊　ａｓｐｔａ＋ｐ．　３３４参照〕。該
アントラサイクリン分子は酸に感受性を有するアシルヒ
ドラゾン結合を介して該フンジュゲートの抗体またはり
ガンド成分に結合しているので，該コンジュゲートが該
エンドサイトーシス顆粒あるいはりソゾームの酸性環境
にさらされると、そのコンジュグートから該アントラサ
イクリンを放出（遊離）することになる。さらに、放出
されたアントラサイクリンは、充分な細胞毒活性を示す
ところの比較的に修飾のｔｘされていｋい薬剤であるも
のと思われる。かくして、該フンジュゲートの酸に感受
性であるヒドラゾン結合は、細胞毒性を有する薬剤をタ
ーゲット細胞内で放出するに非常に優れた利点を有して
おり、該コンジスグートのそれらの細胞に対する細胞毒
活性をいっそう高めているのである。また、一方該ヒド
ラゾン結合は、ターゲット細胞のすぐ外部の部分あるい
はターゲット細胞をとり囲む部分（例えば、腫瘍部位）
の酸性あるいは還元性の条件のもとで開裂することがで
き、その遊離した薬剤は、該腫瘍細胞により取り込まれ
うるのである。
本発明のイムノコンジュゲート及びその製造法は、各種
の抗体にコンジュゲーＬ化されたアントラサイクリン、
すなわちアドリアマイシンを例にあげ、好ましい態様と
して具体的に説明しうる。
先ず第１に、新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘導体
は、２段階の反応によって合成された。二百能性の複素
環糸試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−
ビリジルジテオ）プロピオネート）は、ヒドラジンと反
応させることができ、３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオニルヒドラジドを生成し、次に該ヒドラジドは、ア
ドリアマイシン塩酸塩（ＡＤＭ−ＨＣｉｌ）と反応せし
められ新規なＡＤＨのアシルヒドラゾン誘導体（ピリジ
ルで保護されたジスルフィド部を含有している）を形成
せしめる。トリフルオロ酢酸のような酸触媒が、ヒドラ
ゾン生成反応を促進するために使用することができる。
生成せしめられた誘導体は、アドリアマイシン１３−　
４　３−（　２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒ
ドラゾン・塩酸塩（ＡＤＭ−ＨＺＮ）と呼ぶことができ
る（第１図参照）。
この新規ＡＤＭ−ヒドラゾンｖｊ尋体は次に前もってｓ
ｐＤｐでチオール化され、次に還元されているか、ある
いは２−ＩＴ＜　２−イミノチオラン）でチオール化さ
れているところのモノクローナル抗体と反応せしめられ
る（第２図参照）。得られたイムノコンジュゲートは、
アシルヒドラゾン結合を介してそれぞれのＡＤＭのＣ−
１３位に結合するリンカーアームによって該モノクロー
ナル抗体に結合するＡＤＨ分子からなるもので、該リン
カーアームはさらに該抗体に結合するところのジスルフ
ィド結合を有してよいものである（第２図参照）。
本発明の別の具体的な態様としては、上記した該ＡＤＨ
−ＨＺＮをさらに還元剤ＤＤＴ（ジチオトレイトール、
ｄ４ｔｋｉｏｔｒｍｉｔｏｌ　）またはトリブチルホス
フインと反応させ、１　３−　（　３−（メルカプトプ
ロピオニル）｝アドリアマイシン・ヒドラゾンを形威さ
せるところの別の新規なアドリアマイシンヒドラゾン誘
導体の合成法をあげることができる（第１７図参照）。
次にこの誘導体はマレイミド基が結合せしめられている
モノクローナル抗体（例エば、抗体をＳＭＰＢ（スクシ
ンイミジル−４〜（ｊ−マレイミドフエニル）ブチレー
ト）と反応させることにより得られる）と反応させられ
る。第１７図に示されているように、各ＡＤＨのＣ−１
３位にヒドラゾン結合によって結合したリンカーアーム
を持ち、さらに該抗体への結合部位としてテオエーテル
結合を有するイムノコンジュゲートが形成される。かく
して、該薬剤及び抗体を結合しているリンカーアームは
、これらの結合としてアントラサイクリンの１３−ケト
基の位置に酸に感受性を有するヒドラゾン結合がある限
り、数多くの構成要素及び結合を含有していてもよい。
本発明の別の具体的態様に従えば、本発明の新規なＡＤ
Ｈ−１１２Ｎ誘導体は、最初にチオール基を有するよう
に誘導体化されたリガンドのいずれとも、すなわち、ポ
ンベシン、ＥＧＦまたはトランスフェリンのそのような
リガンドのいずれとも反応させられうる。ボムベシンの
場合には、そのペプチドの７ミノ末端にシスティン残基
が導入さｆｇ　ＡＤＭ−ＨＺＮとフンジュゲートを形成
するための反応性のスルフヒドリル基を与える。マウス
ＥＧＦの場合には、ＳＰＤＰで該ポリペプチドを処理し
、その分子のアミノ末端にＡＤＭ−ＨＺＮとコンジュゲ
ートを形或するための反応性スルフヒドリル基を導入し
？，＝　　｝ランスフエリンの場合には一該タンパク質
を２−ＩＴと最初に反応させ、該タンパク質骨格中に反
応性チオール基を導入した。各場合において、該テオー
ル化されたリガンドは次にＡＤＭ−ＨＺＮと反応せしめ
ら札該リガンドと該薬剤との間にリンカーを有する本発
明のアントラサイクリン−リガンド・コンジュゲートを
形成し、そこで核リンカーはアシルヒドラゾン結合を介
して各々のアントラサイクリ／のＣ−１３位に結合して
いる。更に、該リンカーは、その骨格中にジスルフィド
結合を含膏していた（第２７図＃照）。また、ＡＤＭ−
ＨＺＮは、ＤＴＴで還元することができ（上記のイムノ
コンジュゲートの製造におけるように）、次にさらに上
記したようにマレイミド基に結合しているリガンドと反
応させることができる。
このように、該ＡＤＨの（；’−１３位にヒドラゾン結
合によって結合しているリンカーアームを有し、該リン
カーアームはまたその骨格中にチオエーテル結合を含有
しているＡＤＭ−リガンド・コンジュゲートが製造され
うる。
本発明は、式Ｉ，■または■： （上式中Ｒ息はＣＨ，、ＣＭ，ＯＲ％ＣＭ，ＯＣＯ　（
　ＣＭ，），ＣＨいまたはＣＭ，ＯＣＯＣＥ（ＱＣ，Ｈ
，），で；ＸはＨ，ＮＯ，またはノ１ロゲンで， １８　ハＯｃＨ，、ＯＨｉたは水素原子で：Ｒ４はＮＨ
，、ＮＨＣＯＣＦｓ１　４〜モルホリニル、３−シアノ
−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４〜メトキシ
ー１−ピペリジニル、ペンジルアミン、シヘンジルアミ
ン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−メトキ
シエチルアミンで： ＲＩはＯＨ、ｏ−ｒｒｉｐ　　または水素原子で：Ｒ●
はＯＨまたは水素原子（但し、Ｒ“がＯＲまたは０−Ｔ
ＨＰＩ）時Ｒ＠　はＯＨではない）で：鴨は１〜１０の
整数である） ｋＬｓ （上式中二 ＲｌはＣＨ，、ＣＨ，ＯＲ％ＣＭ，ＯＣＯ（ＣＥ，）ｓ
ＣＨ，、またはＣＭ，ＯＣＯＣＨ（ＱＣ，ＩＩ，），で
；Ｒ畠はｏｃｎ，、ＯＲまたは水素原子で：Ｒ４はＮＨ
，、ＮＨＣＯＣＦ，、４〜モルホリニル、３−シアノ−
４−モルホリニル、ｌ−ピペリジニル、４〜メトキシー
ｌ−ビペリジニル、べ冫ジルアミン、ジベンジルアミン
、シアノメチルアミンまたはｌ−シアノ−２−メトキシ
エチルアミンで； Ｒ場はＯＲ，０−ＴＨＰ　または水素原子で；Ｒ６はＯ
Ｈまたは水素原子（但し、ＲｓがＯＨまたは０−ＴＨＰ
である時にはＲ６はＯＨではない）で；悌は１〜１０の
整数である）、 Ｑ （上式中： Ｒ１はＣＥｓ，ＣＭ，ＯＲ％ＣＢ，ＯＣＯ（ＣＭ，）ｓ
ＣＨ，．またはＣＭ，ＯＣＯＣＨ（ＱＣ，Ｈｓ），で；
Ｒ２は、 ＸはＨ．ＮＯ，またはハロゲンで、 Ｒｓ　はＯＣＲ，，ＯＨｉたは水素原子で：Ｒ４及びＲ
１は独立に水素原子、アルキル、置換アルキル、シクロ
アルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリー
ル、アラルキルまたは置換アラルキルであるか：あるい
はＲ４、Ｒ？及びＮは一緒になって４〜７員環（該環は
任意に置換されていてよい）を形成し、 Ｒ審はＯＨ．０−ＴＨＰ　　または水素原子で；Ｒ６は
ＯＲまたは水素原子（但し、ＲＩがＯＲまたは０−ＴＨ
Ｐの時、Ｒ＠はＯＨではない）で、鴨は１〜１０の整数
である） を有する１３−ケト基を含有しているアントラサイクリ
ンの新規アシルヒドラゾン誘導体を提供することも明ら
かである。
上記のアントラサイクリン・アシルヒドラゾンは、本発
明のコンジュゲートを製造するにあたっての新規中間体
を示しており、本明細書において好適な具体的態様とし
て記載されているようにそれぞれＡＤＭ−ＨＺＮ及び１
３一｛３−（メルカプトプロビオニル）｝アドリアマイ
シン・ヒドラゾンを例としてあげることができる。
上記化学式からわかるように、本発明のアシルヒドラゾ
ン中間体としては、アドリアマイシン、ダウノマイシン
及びカルシノマイシンのよう々多くの公知のアントラサ
イクリンのいずれのヒドラゾンも含むものである。更に
、該中間体としては、アントラサイクリン骨格の峙定の
場所の誘導体であるアシルヒドラゾン（例えば、４’−
ｒｎｐ−アドリアマイシンヒドラゾンまたは３′−デア
ミノ−３’−（３−シアノ−４−モルホリニル）アドリ
アマイシン・ヒドラゾン）があげられる。これらの後の
方で述べた中間体は、最初に該アントラサイクリンを誘
導体化し、所望のアナローグを形成せしめ、次に該アナ
ローグを用いて本発明のヒドラゾン中間体を形成せしめ
ることにより合成することができる。公知のアントラサ
イクリンアナローグとしては、米国特許第４．４　６　
４．５　２　９号あるいは米国特許第４，３　０　１，
２７７号に記載されているもの（　ａ’−７”ぐノー３
’−　（　４〜モルホリニル冫アントラサイクリンアナ
ローグまたは３′−デアミノー３’−（　３−シアノ−
４−モルホリニル）アントラサイクリンアナローグ）、
米国特許第４．２　０　２．９６７号または米国特許第
４．３　１　４，０　５　４号に記載されているもの（
３′−デアミノー３’−（１−ビペリジニル）アント２
サイクリンアナローグまたは３′−デアミノ−３′−（
４〜メトキシ−１−ピペリジニル）アントラサイクリン
アナローグ）、米国特許第４，２　５　０，３　０　３
号に記載されているもの（Ｎ−ベンジルまたはＮ，Ｎ−
ジベンジルアントラサイクリンアナローグ）、米国特許
第４，５　９　１．６　３　７号に記載されているもの
（Ｎ−メトキシメチルまたはＮ−シアノメチルアントラ
サイクリンアナローグ）及び米国特許第４，３　０　３
，７　８　５号に記載されているもの（アントラサイク
リンのアセタールアナローグ）があげられる。かくして
、これら公知のアントラサイクリンアナローグは上記本
明細書で記載したように（第１図参照）して反応させ、
新規たアシルヒドラゾンとさ札次にそれは、上記本明細
書で記載したように所望の特異性を有する抗体またはリ
ガンドとコンジュゲート化することができる。
また、本発明の誘導体化されていないアシルヒドラゾン
中間体は、最初κ誘導体化されていないアントラサイク
リン（アドリアマイシン、ダウノマイシンまたはカルミ
ノマイシンのよ５なもの）から本明細書において記載さ
れているようにして製造されることができ、次にこの新
規中間体は誘導体化され所望の置換基を持つ新規々アシ
ルヒドラゾンにされる。例えば、ＡＤＨ−ＨＺＮは、米
国特許第４，４　６　４，５　２　９号に記載された方
法を用いて、２，２′−オキシジアセトアルデヒドで処
理して還元的アミノ化して該アミノ糖部分の誘導体化が
なさへ　３′−デアミノ−３′一（３−シアノ−４−モ
ルホリニル）アドリアマイシン・ヒドラゾンを与えるこ
とができる。同様にして、ＡＤＨ−ＨＺＮは、そのアミ
ノ糖部分において誘導体化がむされることができ、新規
ｋアシルヒドラゾン誘導体（３′−デアミノ−３’−　
（　４〜モルホリエル）ＡＤＨ・ヒドラゾン（米国特許
第４，３　０　１，２　７　７号参照）、３′−デアミ
ノ−３′一（１−ビベリジニル）ＡＤＭ・ヒドラゾン（
米国特許第４．２　０　２．９　６　７号参照）、３′
−デアミノー３’−（４〜メトキシ−１−ビペリジニル
）ＡＤＭ・ヒドラゾン（米国特許第４，３　１　４，０
　５　４号参照）、Ｎ−ベンジルＡＤＨ・ヒドラゾン（
米国特許第４．２　５　０，３　０　３号参照）あるい
はＮ−メトキシメチルＡＤＨ・ヒドラゾン及びＮ−シア
ノメチルＡＤＭ・ヒドラ／ン（米国特許第４．５　９　
１．６　３　７号参照）のよう１．１新規アシルヒドラ
ゾン誘導体）を与える。加えて、ＡＤＨ−ＨＺＮは、米
国特許第４，３　０　３，７　８　５号に記載されてい
るように式Ｉ−ｍのＲ１位において誘導体化することが
でき、４’−ＴＨＰ−ＡＤＭ・ヒドラゾンのような該ヒ
ドラゾンのアセタール誘導体を与える。
本発明のアシルヒドラゾンの誘導体化のためのこれらの
新規な方法は、出発物質としてＡＤＭ以外のアントラサ
イクリン（ダウノマイシンあるいはカルミノマイシンの
ようたもの）のヒド２ゾンにも用いることができて、Ｎ
−ペンジルダウノマイシン・ヒドラゾンや３′−デアミ
ノ−３′−（４〜モルホリニル）カルミノマイシン・ヒ
ドラゾンのよような新規な化合物を与え、そしてそれら
化合物もまた本発明の範囲内のものであることは理解さ
れるべきである。
本発明に従って製造されるアントラサイクリンー抗体イ
ムノコンジュゲートを各種のアツセイ条件下に調べると
、該イムノコンジュゲートは、リンパ腫細胞並びに癌腫
細胞の双方に対して抗体結合活性を保持しており、そし
てそれらの細胞に対して抗体指向性の殺傷活性を示すこ
とがわかった。かくして、該アントラサイクリンによっ
て該コンジュゲートの抗体が特異性を示すところの抗原
を有する細胞は充分ｋ程度に殺傷されるのに対して、そ
のような適当な抗原を持たない細胞は攻撃され々い。実
際、いくつかの実験で、抗体によりデリバーされるアン
ドラサイクリンは、コンジュゲート化されていないアン
トラサイクリンの等しい量のものより非常に大きな活性
を示すことが見出された。
その遊離薬剤と抗体にコンジュゲート化された薬剤との
間で測定されたその効果の違いは、腫瘍細胞への取り込
みのメカニズム及び細胞内輸送（ｔｒα％ａｐｏデｔ）
メカニズムの違いによるものでありうる。
さらに、マウスに異種間移植されたヒトの腫瘍を用いて
の研究で、本発明のイムノコンジュゲートは生体内０ｉ
ｖｉｇａ）で腫瘍の生育を阻止し、それはある場合には
完全に腫瘍を退行（　ｒａｇデ−ａｍｉｏ％）させると
いう活性を示した。本発明のイムノコンジュゲートは、
コンジュゲート化されていないアントラサイクリンより
も非常に大き々活性を示しそして腫瘍増殖阻止活性が極
めて大きいことが示された。さらに、本発明のイムノコ
ンジュゲートは、遊離の薬剤よりも動物に対して極めて
副作用等が少なくて許容性の高いものであり、コンジュ
ゲート化されていないアントラサイクリン単独と比べて
少なくとも１０倍以下の非常に低い毒性しか持たなかっ
た。
本発明のイムノコンジュゲートの結合特性及び細胞毒活
性は、アントラサイクリンのアミノ糖部分を介して直接
に抗体に結合せしめられているアントラサイクリンを開
示する従来報告されたいかｋるイムノコンジュゲートよ
り優れていることがわかった。従来のこれらのアミノ糖
に結合したイムノコンジュゲートは、より低度の抗体に
対するアントラサイクリンのモル比を示し、遊離の薬剤
に比べてその細胞毒活性が低下し、抗体結合特性におい
ても劣ることがわかった〔例えば、Ｒ．　Ａｒｓｏ％ａ
　ｔ　ａ　ｌ　．　ｒ　Ｉｒｗｎｓｓｏ　ｌ　ｏ　−ｇ
４ａａｌ　　Ｒａｇ−ｍ　　６２、　ｓｓｐｒａ：　　
Ｅ．Ｂｓｒｗｉｔｇ　　ａｔ　　ａＬ．＋Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒａａ．ｍ　３　５、ａｓｐｒａ　：及びＲ．　Ｙ（
４ｍａｎｈｏ　ｔ　ｏａｔ　ａｌ．＊　ａｓｐｒａ参照
〕。
さらに、本発明のイムノコンジュゲートの安定性を調べ
たところ、細胞における環境で見出される還元性及び酸
性の条件と類似の条件下で該アントラサイクリンをイム
ノコンジュゲートから遊離（放出）されることが示され
た。
本明細書に記載された本発明のイムノコンジュゲートで
該薬物の高い細胞毒活性が保持されているという観測は
、ターゲット細胞に比較的に修飾されていない薬剤がデ
リバーされているという事実を示すものとしうる。
加えて、反応条件を選ぶことにより、アントラサイクリ
ン：抗体のモル比をおおよそ４〜１０になるように（幾
つかの異ｋつたイソタイプの抗体を用いる）することが
できる。該ＡＤＨ−ＥＺＮと縮合させた後に回収される
タンパク質量は、モル比をｌＯより太き々ものとすると
急激に低下する。１０よりも大きなモル比を有するイム
ノコンジュゲートを得るにあたっての主な限界は、水溶
液中におけるコンジュゲートの溶解性が低下すること及
び夕冫パク質とのアントラサイクリンの物埋的た会合に
起因していることがわかった。
また、生体内での研究で、本発明のアントラサイクリン
ーリガンドコンジュゲートはターゲット細胞を殺傷する
活性を有することが示された。例えば、我々の研究では
、本発明のアントラサイクリンーリガンドコンジュゲー
トのあるものは、腫瘍に対しての細胞毒活性を示す一方
で特異的なレセプター結合活性を保持していることが示
された。かくして、本明細書において記載されたように
して製造されタリ８−ボムペシンーＡＤＨコンジュケー
トハ、コンジュグート化されていｔｘいｅｙａ−ボムペ
シンにおいて実測されるのと等しいボムベシンレセプタ
ー陽性細胞セルラインに対する結合活性を示し、生体内
試験で形質転換された繊維芽細胞セルラインに対して非
常に高い細胞毒活性を示した。
実際、ｅｙａ−ポムベシンーＡＤＨコンジュグートは遊
離のＡＤＨあるいはＡＤＨ−１１ＺＮよりもはるかに高
い活性を示した。加えて、ＥＧＦ−ＡＤＭ・コンジュゲ
ート並びにトランスフエリンーＡＤＭ−コンジュケート
は，　本明ｍｔｒにおいて記載されているようにして製
造されることができた。
生体内試験での我々の研究で、本発明のイムノコンジュ
ゲートは遊離の薬剤より非常に強い抗魔瘍活性を有し、
より体内での毒性が減じられていることが示さ札それは
該コンジュゲートがより治療指数が改善されていること
を示している。このように、本発明は、癌及びその他の
腫瘍、殺細胞性でないウイルス感染症またはその他の病
原性感染症、及び免疫疾患のような病気の治療のための
医薬組成物、配合物あるいは治療のための方法にも関す
る。特に、本発明は、医薬として有効な量の少なくとも
一種のアントラサイクリン含有コンジュゲートを、薬学
的に許容される方法で宿主噛乳動物に投与するところの
噛乳動物の病気の治療法を含むものである。
別の本発明の方法の具体的態様としては、組み合わせて
の化学療法において使用するための多くの異々つたフン
ジュゲート（すなわち異ｔｚつたアントラサイクリ／あ
るいは異った抗体またはリガンドを持っているコンジュ
ゲート）の投与（同時または順次いずれかによる投与）
があげられる。例えば、本発明の一つの具体的態様とし
ては、該コンジュゲートの抗体成分の特異活性が異なっ
ているところの種々のアントラサイクリンーイムノコン
ジュゲートを使用すること、すなわちそれぞれのイムノ
コンジュグートが異々つた抗原に特異的に結合する抗体
または問題の細胞群の上に存在する同一の抗原上の異な
ったサイトまたはエビトープに特異的に結合する抗体を
有するところのものを複数用いることを含むことができ
る。これらのイムノコンジュゲートのアントラサイクリ
ン成分は同一であってもよいし、あるいは異なっていて
もよい。例えば、この具体的な態様は、腫瘍の表面上の
各種の抗原の量が未知であったり、腫瘍細胞群がその抗
原の発現性においてへテロジーニアスであったり、また
充分な量の薬剤を腫瘍部位の肺瘍細胞にターゲット化さ
れていることが確実なようにすることが求められる場合
に腫瘍のある種のものを処置するにあたって特に有用で
ある。腫瘍に対して異なった抗原特異性または異ｋつた
エビトープ特異性を有する複数のコンジュゲートの使用
は、腫瘍部位における充分量の薬剤の存在を得る可能性
を高めるものである。さらに、この具体的な態様は、正
常な組織が同一の朦瘍関連抗原を有する可能性は低い〔
参照、Ｉ．Ｅａｌｌａｔｒｏｍ　ａｔ　ａｌ．＊　＠Ｍ
ｏｎｏａｌｏｓｔｘｌ　Ａｓ　−ｔｉｂｏｄｉｇａ　Ｔ
ｏ　Ｔｗｏ　Ｄｇｔｍｒｒｎｉｔｓａｓ＊ａ　Ｏｆ　Ｍ
ａｌａｖｓｏ　−ｍａ　Ａｓｔｉｇｍｓ　ｐ　９７　Ａ
ａｇ　Ｓｙ＊ｍｖｇｉａｔｉａａｌｌｌ　ＩｓＣｏｍｐ
ｌａｍｍｓｔ−Ｄ呻ｍｓｄ＠ｓｔ　Ｃｙｌｏｔｏｓ４ｃ
ｓｔｙ／．　Ｉｔｙ＋相劃ｏ１．　　１　２７　（４１
　）　Ｐｐ　１　５７−６０（１９８１）］ことから高
いレベルの＠瘍特異性を達成しつるので重要である。
さらにまた、複数の異なったイムノコンジュグートは、
該コンジュゲートのアントラサイクリン成分のみが異な
る場合にも使用することができる。例えば、特定の抗体
をアドリアマイシンに結合させて、一方のイムノコンジ
ュゲートとし、その抗体なダウノマイシンに結合させ、
第２番目のイムノコンジュゲートとすることができる。
次に両方のコンジュゲートｋ−３治療を受くべき宿主に
投与されることができ、その抗体の特異性に基づいて、
排除されることが求められる竹定の細胞群の部位に局在
化するよう集められる。次に両薬剤は、該部位で放出さ
れる。
腫瘍のような特定の細胞群の薬剤の抵抗性にはいくらか
のバラツキが存在し、本具体的な態様による方法では稙
々の異なった薬剤をターゲット細胞の部位であるいはタ
ーゲット細胞内に放出させることができるのでこの具体
的ね態様は重要である。更１．る具体的な態様としては
、一種以上のアントラサイクリンを特定の抗体に結合せ
しめて、１３ーケト基のアシルヒドラゾン結合を介して
そのすべてが抗体に結合するところのその表面に多くの
各種異ったアントラサイクリン分子を持つイムノコンジ
ュゲートを形成せしめることがあげられる。この具体的
態様での該イムノコンジュゲートの投与により、ターゲ
ット細胞の部位またはターゲット細胞中で多くの各種異
った薬剤の放出がもたらされる。さらには、アントラサ
イクリンー抗体・コンジュゲート及びアントラサイクリ
ン−リガンド・コンジュゲートの組み合せが、特定の抗
原と共にその表面上に特定のリガンド用のレセプターを
持っている細胞群に該薬剤がターゲット化されることが
できる場合として使用することができる。一種のアント
ラサイクリンと数多くの異った薬剤の配合治療法が再度
使用することができる。
本発明のアントラサイクリンコンジュゲートは、静脈内
、腹腔内、経口またはリンパ腺内投与、または腫瘍のよ
う々特定の細胞群の部位への直接的ｔｇ投与を含むが、
それには限定されない通常行なわれる投与方法を用いて
医薬組成物のかたちで投与されることができる。静脈内
投与は好ましいものである。本発明のイムノコンジュゲ
ートの場合、生体内での処置のためにシＬＦａｈまたは
Ｆ（ａｈ’）ｔのような抗体フラグメントまたはキメラ
抗体から成るコンジュゲートな使用することが有用であ
りうる。
本発明の医薬組成物−アントラサイクリンコンジュゲー
トからなるもの−は、錠剤、ピル剤、粉末斉Ｌ液体溶液
剤または懸濁剤、坐剤、ポリマーを用いたマイクロカプ
セル剤またはマイクロ粒子剤、リポゾーム剤、注射また
は温注することのできる溶液剤のような固体または半固
体または液体の投与剤形があげられるがそれには限定さ
れないところの各棟の投与形態であってよい。その好ま
しい形は、投与法あるいは治療法によって異ｋる。
また医薬組成物は、ヒト血清アルブミンのような血清タ
ンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、水または塩また
は′ｗＬｗ４質のような当該分野で知られた通常の薬学
的に許容される担体を含有していてよい。
本発明のコンジュゲート組成物の投与法及び投与用剤の
摂取法の一番有効た方法は、病状の程度及び進行状態、
患者の身体的状態、その治療に対する厄谷性、そして治
療にあたる医者の判断に応じて変えることができる。し
たがって、該コンジュゲートの用量及びそれに付随する
化合物は、それぞれの患者に応じて決められるべきであ
る。しかしながら、本発明のアントラサイクリンイムノ
コンジュゲートの有効量は、約１〜約’１　０　０η／
一のアント２サイクリンとなるか、または約５　０　０
　−　５　０　０　０ｍｇ／ｓ”の抗体となる範囲であ
ってよい。アント２サイクリンーリガンドコンジュゲー
トの有効量は、約１〜約１００１ｎ９／％２のアントラ
サイクリンと？ｊるか、または約１〜約１　０　０　＊
／　Ｉｌ＆”のリガンドとなる範囲であってよい。
本ＢＡ細書において記載された本発明を丈に允分に理解
するため、次に実施例を示す。これらの実施例は、それ
を具体的に説明するためだけのものであって、いかなる
意味でも本発明の範囲を限定することを意図するもので
はないことは埋解されるべきである。
実施例１． 次なる実施例は、桑剤力丸それの１３−ケト基の位置の
ヒド２ゾン結合を介してモノクローナル抗体に！Ｌ接結
合しているところの本発明に従った新規たアントラサイ
クリンイムノコンジュゲートの製造法を示すためのもの
である。
本実施例に記載された特定の具体的態様としては、ＡＤ
Ｈをモノクローナル抗体にコンジュゲート化し、該イム
ノコンジュグートのＡＤＨ分子への結合部としてアシル
ヒドラゾン結合を持つリンカーアームを有し、該リンカ
ーはさらに該抗体への結合部としてジスルフィド結合を
有しているところのイムノコンジュゲートの形成を含む
ものである。本具体例は、またＡＤＭ（ＡＤＭ−ＭＺＮ
）の新規アシルヒドラゾン酵導体をも提供する。
本具体例のイムノコンジュゲート製造における最初のス
テップとしては、次のようにして最初にＡＤＭ−ヒドラ
ゾン誘専体を合成するものである： イソプロビルアルコール中の０．３−のｌＭヒドラゾン
、（　ＮＭ，ＮＨ＊）溶液を、ＴＥＦ（テトラヒドロフ
ラン）３一中のＳ　Ｐ　ＤＰ　（　７　０１１ｆ　，　
０．２　２　ｓｓａＪ　）の冷却溶液中に加えた。２０
℃で２０分間攪拌した後、生成物をＣＭ，Ｃｌ　ｔで抽
出し、次に塩水で洗い、Ｘ，ＣＯ，上で乾燥した。溶媒
をエバポレーションした後得られた残留物を中性アルミ
ナ（５％ｈｂＯＥ　．９５％ＣＢ，Ｃｌ，　）上でクロ
マトグラフィーにかげ、２ｌワ（４１％）の３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオニル・ヒドラジド（第１図の
化合物２）を得た。
このヒドラジド及びアドリアマイシン・ＨＣｌ　（三＊
（株）から入手）（４８即，０．０８３惰惰＠１）を５
紅のＭｌＯＨ中に溶解し、次に暗室中室温で６日間攪拌
した。反応浪合物を逆相薄層クロマトグラフィー（ＴＬ
Ｃ）（ＭａＯＨ：Ｈ，０．２：　ｌ、３％ｗ／ｔＮＢ４
０Ａａ　　ｔｌｊ）ＫかＩｒｊた０この処理の後、＊＊
をエバポレーションし、残留物をＣ１Ｂ力５　Ａ　（　
Ｍａ　ＯＨ　：　Ｈ＊Ｏ　＝　３　＝２、３％ｗ／　ｗ
　７ＶＨ４　０Ａ（ｌ含有）上のクロマトグラフィーに
かげた。分画な一緒にして、凍結乾燥し、過剰のＮＩＩ
４ＯＡ．を汲比下に除去した。残留物をＭａＯＥ中で浴
解し、アセトニトリルを加えて沈殿させ、４５η（７２
％）のアドリアマイシン・１３−（３−（２−ピリジル
ジチオ）プロビオニル｝−ヒドラゾン塩酸塩（以降ＡＤ
Ｍ−１１ＺＮという）（第１図の化合物４）を得ｆ，，
，ＡＤＭ−ＥＺＮは次なる特性を有する：ｓ　ｐ　＞　
１　２　５°色が暗色化し、明確な値を示さない；１ｉ
ＭＲ（７セト７−’ｄ　，，δ）１．２５（ａ．３Ｂ，
／＝６Ｂ０、１．７７（ｓ，Ｉｆ）、２．０６（ｍ，Ｉ
Ｂ）、２．３０（情，ｌＢ）、２．５　３　（　ｄ　．
　ｌＨ，　／　＝１　５ｊ７ｇ）、２，８９３．１８（
ｓ，６Ｈ）、３．７１（ｓ＋ａ，ＩＨ）、ａ−ｓｓ（ｓ
，ｌＢ）、３．９７（鶴，ＩＨ）、４．０７（ａ，３Ｂ
）、４．７８（ａ．２Ｂ）、５．２１（ＩＩ＆，ｌＢ）
、５．５８（ｔ．ＩＪ，／＝　７１１　ｇ　）、７．１
２（ｓ．ｌＨ）、７．６４（ｄ．ＬＨ，Ｊ＝８Ｂｇ）、
７．７５（ｓ．２Ｂ）、７．９　０　（　ｔ　，　ＩＨ
，　／　＝８Ｈｓ　）、７．９８（ｄ，ＩＢ，ノ＝８Ｂ
０、８．３　７　（　ｄ　，　ＩＢ，　Ｊ＝４Ｈｍ　）
、１０．５０（ａ，１ｊ７）、１０．５２（ｓ．ＩＢ）
、１　４．１　９（６ｇ．　１１１）　；　ＩＲ（ＫＢ
ｒ）　３　４　３　８、１６７４、１６１８、１５７９
、１４１９、ｌ２８６、１０１６、９８８、６　９　８
ａｍ−’　；　ＦＡＢＭＳ　（グリ−４＝ｏ−ル）ｓ／
ｓ　７５５（Ｍ十１）、７３７、６４５、６２５、６０
９。
モノクローナル抗体のチオール化 上記されたようにして製造されたＡＤＭ−Ｅ２！．Ｎ化
合物を当該モノクローナル抗体と反応させる前に、抗体
はチオール化されなげればならない、すなわち、反応性
のスルフヒドリル基を抗体分子中に導入しｔｌければな
ら々い。
使用されるモノクローナル抗体としては：１）５Ｅ９（
分裂するすべてのヒト細胞上のトランスフェリン・レセ
プターに反応性を有し、モして癌細胞の各種の組織タイ
プのものと交差反応性を有しているＩ，Ｇ，抗体）； ２）７’３３，４１（以下、ｒ３，４１Ｊという）Ｃ４
ｏＫｔｔヒトＴ＃８胞抗原と反応性を有し、そしてまた
多くのＴ細胞白血病に見出されるＩ，ＧＭ抗体）：３）
　　Ｇ２　８．５　（　５　（ｌｄ　ヒ｝ｌ？ｆａ胞抗
原と反応性を有し、そしてまたヒｌ細胞リンパ膣とも反
応性を有している１，Ｇ，抗体）； ４）Ｇ２８．１（３９ｆｄヒトＢ細胞抗原と反応性を有
し、そしてまたＢ細胞リンパ腫と反応性を有しているＩ
，Ｇ，抗体）； ５）Ｌ６（ヒト肺癌の小細胞癌でないものの上にあるグ
リコリビツド抗原に反応性を有するＩ，Ｇ，，抗体）５
Ｅ９％／クロ−ｆル抗体及びＴ３３Ａ１モノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ（Ａｍａｒ
ｉ−ｃａｓ　１’ｙｐａ　Ｃｓｌｔｓｒａ　ＣｏｌＬａ
ａｔｉｏｓ）から入ナした４それぞれの抗体は、Ｃ．Ｂ
ｒ＊ａｋ　ａｔ　　ａｌ．ｅ″″υ％＃−Ｓｔｅｐ　Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｓｏ
ａｌｏｓａｌＡ％ｔｉｈｏｄｔａｍ　　Ｆｒｏ情　Ａ１
％Ｌｔａ　　Ｆｌ％ｔｄ　　Ｂｙ　　ＤＥＡＥ−Ａｆｆ
ｔｇｍｌ　Ｂｌｓａ　Ｃｈｒｏ情ａｔｏｇｒａｐｈｙ　
＃　”　／．　ｌ雪ｎｓ．Ｍａｔｋｏｄａｅ　５　６、
ｐｐ．３１３−１９（　１９８２）の方法に従って、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスにおいて製造された腹水からＮ！ｌｌ
ｌされた。＃ＩＩ製されたＧ２８．５、Ｇ２８．１及び
Ｌ６は、Ｄｔａ．　／．　Ｌｍｄｈａｔｔａｒ及びＩ．
Ｉｉｍｌｌａｔｒｏｍ　（０％ａｏ−ｇ開，　Ｓｅａｔ
　ｔ　ｌ　＃　，　ｌｌ’Ａ　）から得られた。Ｌ６モ
／／ｏ−ナル抗体及びＧ２Ｂ−５モノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマは、それぞれＡＴＣＣ受託番号
１１Ｂ８６７７（１９８４年１２月６日に寄託）及びＡ
ＴＣＣ受託査号Ｂ＃９１１０（１９８６！５月２２日に
寄託）のもとにＡＴＣＣに寄託されている。Ｇ２８．１
モノクローナル抗体は，ＣＤ３７抗原の主要エピトープ
と反応性を有しているところの当該分野で知られている
多くの抗体の一つであり、Ａ．Ｊ．Ｍｉａｈａｇｌ　　
（一ｄ．）、Ｌｍ％ｋｏａｙｔｍ　Ｔｙｐｉ％ｙｍｓＯ
ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｕ
Ｊｒ．　１　９　８　７　）においてその特性が示され
ている。これらＣＤ３７抗体の多くは、市販されて入手
することができる。
いずれのこれらの抗体もｓｐｎｐで次のようにしてチオ
ール化された： ＳＰＤＰ（Ｐｉｎデｅｒｓ　　Ｃｈｇｍｉｃａｌ　　Ｃ
ｏ．＋　ＩＬ）（　５　０８１）（エタノールに浴解）
を、ＰＢＳ中で選択したモノクローナル抗体，例えば５
Ｅ９（５−ＩＱＭ９／ｉｕ）に加え、５−１０ｍｍの最
終濃度のものとした。反応混合物を３０分間３０℃でイ
ンキユペーションした。未反応のｓｐｎｐを、ＦＤ−　
１　０カラム（Ｐｈａデ惰ａｃｉａ）を用いたゲルフィ
ルトレーションクロマトグラ７イーにかげてＳＰＤＰｖ
ｊＪ体化された抗体から分離した。過剰なＤＴＴで還元
してチオビリジル保護基を除去しｔも還元された抗体を
ＰＤ−１　０カ？ムに通し、該遊離のチオールを含有す
る抗体は該ＡＤＭ−ＨＺＮ＠導体との縮合に用いられた
（第２図参照）。
反応性のチオール基はまた２−ＪＴを用いて抗体タンパ
ク質上に導入された： 抗体（５０ＩＩＩ＆ｙトリエチルアミン、５　０　ｓＭ
ＮａＣ’ｌ　　及び１ｓ＆　ＥＤＴＡ，ｐＨ　８．０中
ノｓ−１　ｏｑ／ＩＩＬｔ）ヲ最ｉｄ度５１０ｓＪｆの
２　−　ＪＴ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｍｔｍｉｅａｌ　
Ｃｏ．＋ＩＬ）と混合しｔ４反応混合物を９０分間４℃
で処理し、チオール化された抗体を２　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ
　ｌ／Ｐ　Ｂ　Ｓで平衡化したＦＤ−１０カラム上で分
離した。抗体上に導入された反応性テオール基の数は、
Ｇ．Ｌ．ＥＬＬｎ＋ａｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ−ａｋａｍ
．　Ｈｉｏｐｈｙｇ．　８　２、ｐ，．７０−７７（１
９５９）の方法に従って、ＤＴＮＢ　（　５　．　５′
−ジテオビス（２−二トロ安息香酸→（Ｅ４■＝１４１
５０）を用いて決定した。
ジエゲート化する 次に上記のようにしてデオール化されたモノクローナル
抗体をそれぞれＡＤＭ−ＨＺＨに結合せしめるところの
種々のコンジュゲート化法が実施される（第２図参照）
。
ＡＤＭ−１１ＺＮはメタノールに溶解さｔ１．ＰＢｓ中
のｓｐｎｐ−チオール化抗体または２　Ｍ　ＮａＣｌ　
／Ｐ　Ｂ　Ｓ中の’ｊ：−ＪＴ−チオール化抗体に加え
られる。代表的な実験例ニオイテハ、１　０当量（１）
ＡＤＭ−ＨＺＮ１ｋ　１　０−２　０個ノ反応性のテオ
ール基を含有するモノクローナル抗体中に加えられる。
コンジュゲーション化反ふ６は、４℃で１晩インキユベ
ーションしてなされた。反ｒｂ＆金物を１０，０００ｘ
ｙ″′ｃｄｉｔ心し、次にコンジュゲート化したＡＤＭ
ｔｔＰＤ一１０カラムを通して未反応ＡＤＨから分離し
屯抗体に結合したコンジュゲート化されたアントラサイ
クリンの量を４９５％ｍ　（　Ｅ４ｅｓ　＝８　０　３
　０　）の吸光度により測定した。
抗体タンパク質の童は、２８０外情（１η／ｍ＝１．４
０Ｄ単位）の吸光度により測定した。２８０％情におけ
るＡＤＨ吸収の重なりを補正するため、次なる式を使用
した：”ｖａｎ　：　２　８　Ｇ％鴨での吸光度’４ｔ
ｓ：４９５％餌での吸光度 ＥＰＬＣ分析法を用いてイムノコンジュゲートにコンジ
ュゲート化されていないＡＤＭまたはＡＤＭ誘導体が存
在するか否かを分析しｆ−ＥＰＬＣは、５ミクロ／のＩ
Ｂ−ＳＩＬ　Ｃｌ８ビーズをパックしたＰ４同●情−ｎ
ａｇカラムを用いてなされた。コンジュゲート化されて
いないＡＤＭ−ＩＩＣＩＩ，　ＡＤＭ−１１ＺＮ　（　
Ｑ、１／Ｊｍｏｊｍ）、または０．５−５μｖｎｏｌ−
の栗剤当量なｔＶするイムノコンジュケートをそのカラ
ムにかげ，　　ｌ−５１Ｌｔ／ｓｊｓでメタノール及び
ｌＯｍＡ１９７酸７７　モニウＡ、ｐＨ　４．５（７０
：３０）（７）Ｑで溶出しｆ，．ｌＩＰＬＣ分析法によ
り製造されたいずれのイムノコンジュゲートも、何ら有
意な量（＜１％）のコンジュゲート化されていない薬剤
も含有していなかった。
このようにして製造されたイムノコンジュゲートはその
薬剤と各モノクローナル抗体との間にブリッジを形成す
るところのリンカーアームにその１３−ケト基の位置で
コンジュゲート化されたＡＤＭ分子から成るものであっ
た。さらに、遊離のチオール基を持つモノクローナル抗
体を、チオビリジル基で保護されたジスルフィド結合を
持つＡＤＨ−ＥＺＮに加えると、ＡＤＨを該抗体に結合
せしめているリンカー中にジスルフィド結合が形成され
ることになった（第２図参照）。本具体例に従って製造
されたイムノコンジュゲートとしては、５Ｅ９−ＡＬ）
Ｍ−７．５、３Ａ１一ＡＤＭ−７．０、Ｌ６−ＡＤＭ−
９．０及びＧ２Ｂ．１−ＡＤＨ一９．０かあげられるが
、それに限定されるものではない（上記において、最初
の表示記号は、コンジュゲートを製造するにあたり用い
られたモノクローナル抗体を表わしており、その第２番
目の部分は該抗体に結合せしめられたアントラサイクリ
ンを示して釦り、そしてその数字は、特定のイムノコン
ジュゲート中のＡＤＭ／抗体のモル比を示している）。
本具体例で達成されるＡＤＭ／抗体のモル比は、モノク
ローナル抗体上に導入されるチオール基の数及びチオー
ル化された抗体に加えられるＡＩ）Ｍ−Ｂ：ｌＮｆ）菫
によって異なる。第３図及び第４図り分布図は、ＡＤＭ
−１１ｚＮを、おおよそ８個のチオール基を含有してい
る５Ｅ９モノクローナル抗体または３，４１モノクロー
ナル抗体のいずれかと縮合せしめるとＡＤＭ／抗体の比
３−４が達成されることを示している。代表例では、タ
ンパク負に対して１０倍モルだけ過剰な量のＡｌ）Ｍ−
ＭＺｈをこれら反応液中に加えた。１８−２５個のテオ
ール基を持つ抗体力ｊ用いられる場合にはＡＤＭ／抗体
比は８−１０にまで大きくたった。モノクローナル抗体
をチオール化するためにＳＰＤＰまたは２−ＪＴを用い
た場合には、そこにはＡＤＭ／抗体比に有意の差はなか
った（第３凶と第４図を比較）。しかしながら、薬物を
続いて抗体にコンジュゲートしての最終タンパク質収量
については、２−ＩＴでチオール化された抗体に比戦し
て５Ｐ１）Ｐでチオール化された抗体の方か幾分か高い
ものであった（第５図参照）。一般的には５ＰＤＰでチ
オール化された５Ｅ９及び３Ａ１のような抗体において
は５０−８０％のタンパク質の収準が得られたが、一方
２−ＪＴを使用してチオール化された同じ抗体では２０
−５０％の収率であった。加えて、ＳＰＤＰまたは’ｌ
−ＪＴを用いて行なわれるコンジュゲーション化につい
て５Ｅ９及び３Ａ１のようなＩｇＧ，インタイプのモノ
クローナル抗体を使用すると幾分良好なイムノコンジュ
グート収量が祷られた（第６図及び第７図参照）。
本発明のイムノコンジュゲートの結合活性は、ｉｔｉＩ
，−ラベルで標識化された抗体を用いる競合アツセイ法
によって測定した。それぞれ抗原について陽性の細胞及
び抗原について陰性の細胞（ＩＸＩＯ＠）は、２％ＦＢ
Ｓを含有するＲＰＭＩ１６４０のＯ．ｌ―に懸濁化さん
初濃度が５０μｔ／−で、鵬次２倍に希釈されたフンジ
ュゲート化されてないモノクローナル抗体またはイムノ
コンジュゲートの０．１一と温合した。該細胞懸濁液（
２本組）を４℃で１時間況合しながらインキュベーショ
ンしｔム次に細胞を２回洗滌し　ｌ！ｌ　ｌでラベルさ
れた均一な抗体（１−５０Ｘ１　０’　ｏｐｔｙｈ／μ
ｔ抗体タンパク質の比活性）５μｙ　／Ｍを含有する液
ｏ．　ｉ　ＩＬｔ中に懸濁する。サンプルを４℃で１時
間インキエベーションし、次に４℃に冷却されたジブチ
ル：ジノニルフタレートの１＝１搗金物０．１５ＭＡ上
に置いた。
サンプルを１　０．０　０　０　Ｘ　ｔで１分間４℃で
遠心し、細胞に結合しているカウント数（ペレット，　
ｐｍｌｉｍｇ　）をＬＫＢガンマーカウンターを用いて
測定した。
本発明のイムノコンジュゲートによる残留結合活性は、
下記表１に示される。
’Ｃｌｔ〕＝抗体トＶ−サーを５０嘩阻害丁るところの
抗体コンジュゲートのモル濃度 ”ＣＴ，〕＝抗体トレーサー’Ｐ５（ｌ阻害するところ
の抗体のモル濃度 ’Ｋ　　　　・＝次式： ｇｏ％ｊ （　”Ａ＆はＳｅａｔｅｋａｒｄ分析によって決められ
たコンジュゲート化されていない”Ａ６の平衡定数であ
る）娶用いて計算された相対ＣＫ）親和性 該表に示されているように、ｓｐｎｐ　な用いて製造さ
れ、３．５〜８．５０モル此の範囲χ有する５Ｅ９イム
ノコンジュゲートは、コンジュゲート化されていない５
Ｅ９に比べて、そのもともとの結合活性のＳＯｅｓ以上
もの結合活性を保持していた。また２−ＩＴ’ｌ用いて
製造された５Ｅ９イムノコンジュゲートは、非常に高い
結合活性を保持していた。
ＳＰＤＰ　’ｌ用いて製造された３Ａ１イムノコンジュ
ゲートをＬその抗体の結合活性がすこし失なわれていた
。一般的には，ＡＤＨ７ｋこれらの抗体またはその他の
抗体にコンジュゲート化すると、その抗体の結合活性は
、比較的には僅かだが低下する。
第８図は、本発明の２個のイムノコ／ジュゲート、５Ｅ
９−ＡＤＭ−７．５及び３Ａ１−ＡＤＭ−７．０の結合
活性のカーブを、コ／ジュゲート化されていないモノク
ローナル抗体５Ａ７９及び３Ａ１の結合活性のカーブと
比較して示したものである。これらのカーブを得るため
、該イムノコンジュゲートをＩ　Ｘ　１　０’個の抗原
について陽性のＨＳＢ−２ターゲットａ胞を含有丁る完
全生育培地０．１−中で４℃でインキユペーションした
。１時間後に、その細胞をその培地で２回洗い、更に３
０分間ＦＩＴＣでラベルされたヤギの抗マウスＩ　ｇＧ
（Ｂｏ　ａ五ｒｉｍ（Ｈｒ−Ｍａｘｎｈｇｉｔｎ　）の
１；４０希釈物を含有丁る培地０．１ｄ中でインキュペ
ーションしら該細胞をＣＯ％ＥｔａデＥｐ４ａａＶ螢光
細胞アナライザー中で分析した。その細胞表面の螢光は
、同様にして希釈されたコンジュゲート化されていはい
モノクローナル抗体を用いて得られた螢光と比較された
。図に示されているように、それぞれ該イムノコンジュ
ゲートの結合活性が保持されているということは、抗原
について陽性の細胞を飽和するのに必要ＴＬイムノコン
ジュゲートの濃度は、コンジュゲート化されていはい抗
体の場合必要な濃度よりもせいぜいそれが２倍に希釈さ
れている程度に大きいものであるという事実によって示
される。コンジュゲート化されていない抗体と該イムノ
コンジュゲートとの間でのその螢光強度のプラトー値の
違いｋ−ＩＦＩＴｃ−ヤギ抗マウスの第二次試薬が該コ
ンジュゲート化されていない抗体に比して該イムノコン
ジュゲートに対してその結合活性が低下していることに
よることが見出された１、 本具体例のイムノコンジュゲートＣＬ６−ＡＤＭコンジ
ュゲート）の各種のｐＨ領域（４．０〜７，Ｏ）での安
定性が、ＨＰＬＣ分析法を用いて調べられた。Ｌ６−Ａ
ＤＨ−９．０コンジュゲートヲリン酸塩緩衝液中、２４
時間３７℃で、指示されたそれぞれのｐＨでインキユペ
ーションした。次に各溶液をＨＰＬＣカラムにかけ、コ
ンジュゲート化されていない薬剤の量を測定した、第９
図に示すように、異ｒｘつたｐＨ下で２４時間インキユ
ベーションした後に検知された単一生我物は、ＡＤＭ−
ＨＣｔスタンダードのカラム滞留時間と同じ値を示した
。２４時間の後にそのイムノコンジュゲートから放出さ
れるｇｊ質の′ｆは、ｐＨが７から４へと下がるとそれ
につれ増加した。「未処理」コントロールとは、ｐＨ’
１．４のリン酸塩緩衝液中−２０℃で保存されたコンジ
ュゲートについてのクロマトグラフイー値をいう。
したがって、該イムノコンジュゲートは、該抗体タンパ
ク質からＡＤＨを放出することを起こす酸に感受性を有
する結合群を持つことが明らかである。これらの結果は
、第２図に記載されているように該ＡＤＨがリンカーア
ームに結合せしめられるところのヒドラゾン結合を持つ
ことと一致するものである。
本実施例の具体例に従って、ＡＤＭは、ジスルフィド結
合をも含有しているところのリンカーアームを介して抗
体に結合している（第２図参照）。したがって、本具体
例のイムノコンジュゲートはＤＴＴで還元することによ
りＡＤＭ部を放出することができる。それ故に、Ｌ５−
ＡＤＨコンジュゲート、Ｌ６−ＡＤＭ−９．０を、１０
倍過剰な童のＤＴＴで処理し、室温で１５分間インキユ
ベーションし、次にＨＰＬＣカラムにかけてみた。同時
にＡＤＭ−ＨＣｌ及びＡＤＭ−ＥＺＮ標準液をかげた。
クロマトグラフイーにより得られたピークは第１０図に
示す。ＤＴＴを加える前にはＬ６−ＡＤＭ−９．０は、
何ら測定されつるよう々コンジュゲート化されていない
薬剤のピークを示さむかった。
ＥＰＬＣ分析により、ＡＤＭ−ＥＺＮ誘導体よりはむし
ろＡＩ）Ｍ−ＢＣＩＩのカラム涌留時間に類似している
値を有する単一ピークの存仕が示された（第ｌＯ圓参照
）。ＤＴＴ処理の後放出されたＡＤＭの量は抗体に結合
せしめられた出発ＡＤＭ当量のおおよそ９９％であった
。第９図及び弟１０凶の実験データは、ＡＤＭ株部分が
、本発明のイムノコンジュゲートから、「生埋的な（ｐ
ｈｙｓｉｏｔｏｇｉｃ　）　ｊ条件、すなわち、酸性の
条件あるいは還元注り采杆（典型的な細胞環境）下で遊
離（放出）せられることを示している。
本発明のイムノコンジュゲートは、種々のアツセイ系を
用いて試験管内で（ｔ％▼ｉｔｒｏ　）　　その細胞毒
活性かテストされた。軟球天コロニー形成アッセイ法に
従えば、Ｄ．．ｄｉ細胞（バーキットリンパ腫，Ｂ％ｒ
ｋｉｔｔ’ａ　　ｌｇ−ｍｐｈｏｍａ　）　（　７エノ
タイブ：５Ｅ９”．３Ａ１　　）ＣＡＴＣＣよ’）入手
〕’ｊｔ％全培地ＣＲＰＭ１　　１６４０培地＋ｌＯ％
胎児牛血清〕中で生育させた。１−の培地中の１　Ｘ　
１　０”個の細胞を、１．５時間、連続的に希釈された
５Ｅ９−ＡＤＨまたは３Ａｌ−ＡＤＨイムノコンジュゲ
ートまたはコンジュゲート化されてないＡＤＭ液にさら
しｔも各希釈について各三つづつ測定を行々つた。コン
トロールは，栗剤にはさらされていないが同様に処理さ
れた細胞からたるものである。次に細胞を洗滌し，１５
％ＦＢＳ及び０．３％アカロース（Ｍａｒｉｎｇ　Ｃｏ
Ｌｌｏｉｄ）　　を含有するＲＰＭＩ　　１６４０培地
中に懸濁した。次に１鮎の細胞懸濁ａ（ＩＸＩＯ”個細
胞）を、６−ウエルのマイクロタイタープレート（Ｃｏ
０ｃｈデ）中の０．４％寒天層上に重層した。
サンプルを３７℃で７−ｌＯ日間インキユベーションし
、得ラレｔ．：コロニーを４８時間ｌη／ＩＬｌｆ）ｊ
ｌ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（Ｓｊｙ
ｍｇ）０．５１４でもって染色した。コロニー数をＯｐ
ｔｉｍａｍ　４　０　−　１　０イメージアナライザー
を用いて数え、コロニー形成の阻害率を薬剤で処理また
はイムノコンジュゲートで処理した細胞と未処理コント
ロールとを比較して決めた。
第１１図は、５Ｅ９抗原陽性で且つ３，４１抗原陰性の
パーキットリンパ腫細胞Ｄａｓｄｉ細胞において１．５
時間の処埋の後の５Ｅ９−ＡＤＭコンジュゲート、５Ｅ
９−ＡＤＨ一７．５及び３Ａ１−ＡＤＭコンジ為ゲート
、３Ａ１−ＡＤＭ一７．０の細胞毒活性を比較して示す
ものである。このイムノコンジュゲートの両方共２−ノ
Ｔによるテオール化によって製造された。その用量反応
曲線を比較すると、抗原を有しているターゲット細胞に
対するもともとの結合活性の９３％を残して保有する（
第８図参照）ところの５Ｅ９−ＡＤＨ−７．５は、結合
性を有しないコンジュゲートのコントロール、３Ａ１−
ＡＤＭ−７．０よりも著しく強い活性を持つことが示さ
れている。
限１ｆ−８釈アツセイ法（これは、殺偏される細胞のｌ
ｏｇ値の測定法を与える）が、より長期間の処理（２４
時間）を使用し、上記２種のイムノコンジュゲートの細
胞毎性を有する薬剤活性をみるために使用せられた。本
アッセイ法は、本貿的には、Ｍ．　Ｃ”ｏｌｏｍｂａｔ
ｔｔ　　ａｔ　ａｌ．　　＠Ｓａｌａｅｔｉ　−ｖａ　
Ｋｉｌｌｉｎｇ　Ｏｆ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｃａｌｌｓ　Ｂ
ｙ　Ａ％ｔｉｂｏｄｙ−Ｒｊａ＜ｓ　　Ａ　Ｃｈａｉｎ
　　Ｏｒ　　Ａｓｔｉｂｏｄｙ−Ｇａｌｏ怖ｉ＊　Ｈｙ
ｂｒｉｄＭｏｌａｅｓｌｍａ；Ｃｏｍｐａｒｉａｏ％Ｕ
ｆ　Ｃ’ｙｔｏｌｏｍｉａ　Ｐｏｔｓ　−ｎｅｙ　Ａｓ
ｄ　Ｕｓｅ　Ｉｓ　Ｉｒｍｓｓｏａｇｌａｃｔｉｏ鷹Ｐ
ｒｏａｍｄｓ−デーｓ　　、Ｊ．ＩＷ＆鴨誌外ｏＪ．１
３１、　ｐｐ．　　３０９−９５（　１９８３）記載さ
れているようにしてＩＷ６１ｖｎＬｗａ細胞（フエノタ
イプ：　５Ｅ９＋．：Ｍ１−）を用いて行なわれた。Ａ
ＴＣＣから得られた細胞は、２２時間該イムノコンジュ
グートとインキユベーションされ、洗滌さん殺傷された
細胞のｌｏｇ値を測定した。殺傷された細胞のｌｏｇ値
（ｌｏｇ　ａａｌｌ　　ｋｉｌｌ　）は，限界細胞濃度
の生育しないウエルを求めることによって決められる播
種効率に基づいて計算される。
第１２図において示されるように、５Ｅ９−ＡＤＭ−７
．５は、結合性を持たない３Ａ１−ＡＤＨ−７．０コン
ジュゲートと比較して、テストされた濃度では１〜２だ
け大きな殺傷された細胞のｌｏｇ値を与える。最大用量
の５Ｅ９一ＡＤＭ−７．５においては５までの値の殺傷
された細胞の１ｏｇ値が測定された。さらに結合性を持
たない３，４１イムノコンジュゲートにおいて細胞毒活
性が検知されているが、その値は、コンジュゲート化さ
れていないＡＤＨの等しい量のものより劣るものであっ
た。一方、５Ｅ９イムノコンジュゲートの活性は、遊離
のＡＤＨの等しい量よりも２、３の濃度で非常に高いも
のであった。
上述したように、５Ｅ９−ＡＤＨ−７．５及び３Ａ１一
ＡＤＨ−７．０イムノコンジュゲートは、チオール化剤
として２−ＩＴを用いて合成される。チオール化剤とし
てＳＰＤＰを用いて製造されたイムノコンジュゲートの
免疫特異的々細胞毒性活性もまた測定される。第１３図
は、上記した軟寒天コロニー形成アツセイ法を用いて、
テオール化剤としてｓｐｎｐを用いて製造された５Ｅ９
−ＡＤＭ及び３Ａ１−ＡＤＭイムノコンジュゲートのＤ
６ｓｄｉ細胞に対する選択的な細胞毒活性を示すもので
ある。第１４図にはさらにｓｐｎｐを用いて製造された
イムノコンジュゲートの選択的細胞毒活性が示されてい
るが、そこで！Ｉ′Ｋ軟寒天コロニー形成アツセイ法を
用いて２ｔｌ［のＧ２８．１抗原陽？細胞（　Ｄａｎｄ
ｉ細胞及びＮＧｔｎαｌｗα細胞）、及び１種のＧ２８
．１抗原陰性ヒトＴ細胞白血病細胞セルラインＣＨＳＢ
−２）においての０２８．１−ＡＤＭ−９．０イムノコ
ンジュゲートの作用をテストした。該ＥＳＢ−２細胞は
ＡＴＣＣから得られる。該一に示されているように、該
イムノコンジュゲートは２ｍの抗原陽性細胞セルライン
に対しては細胞毒活性を示したが、抗原陰性細胞セルラ
インに対してはそれを示さｋかった。またＤｒ．　Ｍ　
．　Ｂｅａｔ　ｔａｔｎ［Ｂｒｉａｔｏｌ−Ｂａｙｌｏ
ｒ　ＬａｂａｅＨｏｓａｔｏｓｅ　Ｔｚ］　より入手し
た固看依存性（　ａｎｃｈｏｒａｇｅ　−　ｄａｐｇｎ
ｄｍｓｔ　）のヒト結腸癌セルライン（＃（’７’ｌｌ
６）を用いてのコ■二−形成アツセイ法において該イム
ノコンジュゲー｝　（　５Ｅ９−ＡＤＨ−７．５）は選
択的に抗原陽性細胞を殺傷することか示されｔら 該癌細胞の単屑培養物をトリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢ
ＣＯ）で処理し、培養フラスコから取り出し、洗ってか
ら、２２−ゲージの針を通して、単細胞懸濁液を得た。
５Ｅｇ−ＡＤＨ−１．５、３Ａ１−ＡＤＨ−７．０また
はコンジュゲート化されていないＡＤＭを、Ｉ　Ｘ　１
　０”個の該癌細胞を含有する培地０．２−で順次希釈
した。それぞれの希釈液を３本づつ作成した。コントロ
ールとしては未処埋細胞または抗体で処理された細胞が
あげられる。細胞は３時間インキユベーションされた後
培地で１回洗滌さへ次にｌ一の培地中のＩ　Ｘ　１　０
”個の細胞なｌ２−ウエルのマイクロタイターブレー｝
　ＣＣｏａｔａデ）中に播種した。プレートを３７℃で
７−ｌＯ日間インキユベーションし、次に１０分間無水
メタノールで固定化した。コロニーを結晶性バイオレッ
トで染色し、Ｏｐｔｉｍａｚ　４　０−　１　０イメー
ジアナライザーで測定した。第１５図に示されているよ
うに、該癌細胞は５Ｅ９−ＡＤＨ−７．５により処理さ
れた場合にｋ％　３Ａ１−ＡＤＨ−７．０により処理さ
れた場合に比べて非常に強い細胞毒作用を受けることが
示されている。
ＡＤＨのアミノ糖の所で抗体に結合した薬剤は、その薬
剤活性が著しく失なわれていることを示すイムノコンジ
ュゲートをもたらすという数多くの報告が示されている
ので、軟寒天コロニー形成アツセイ系を用いて、ｌ−％
一ａｌＧジペプチドリンカーを介して該薬剤の７ミノ糖
の所でＡＤＭを抗体に結合せしめることにより製造され
たイムノコンジュゲートについてその細胞毒活性を測定
した。第１６図に示されているように、Ｄａ％ｄ｛細胞
において５Ｅ９−ＡＤＭ一４．０及び３Ａ１−ＡＤＭ−
３−９ペプチド結合コンジュゲートはいずれも細胞毒活
性を示さなかった。コンジュゲートな製造するのに用い
られたＡＤＭ−Ｌｍ％−８１祷導体は、コンジュゲート
化されていないＡＤＨの等しい量のものより約２ｌｏｇ
の値以上不活性である。
実施例２． 本実施例は、ＡＤＨ分子への結合部としてアシルヒドラ
ゾン結合を有し、そして更に抗体への結合部としてチオ
エーテル結合を有しているリンカーアームを介してＡＤ
Ｈがモノクローナル抗体に結合しているところの本発明
に従ったアントラサイクリンイムノコンジュゲートの製
造法を説明するものである。また本具体例では新規なＡ
ＤＨのアシルヒド２ジド誘導体が提供される。
モノクローナル抗体５Ｅ９（２．５ｄｌＪン酸塩緩衝化
塩水液中２．５η）をＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４
〜（ｐ−マレイミド７エニル）ブテレート）（１００μ
ｌのテトラヒドロフラン中の５９．５μ？）と、３０℃
で３０分間反応させた。クエン酸ナトリウム緩衝液でｐ
Ｈを６．０に合わせた。混合物をＰＤ−ｌＱゲルフイル
トレーションカラム（Ｐｈａｒｔｔ＊ａｅｉα）に通し
、未反応物質からマレイミド含有抗体を分離しｔラ実施
例１に記載のようにして製造されたＡＤＨ−ＥＺＮ誘導
体（ｌη）を次にｌ　ｗｌ　Ｍａ　ＯＨ／Ｈ，０（９：
１）中に溶解し、０．５ＡｓｏＪ−のＡＤＭ−１１ＺＮ
を４：ｌのアセトン：Ｈ，０中で０．５μｍｏｌ−のト
リー郭一ブチルホスフィンと反応させ、新規な還元され
たＡＤＭ−ＥＺＮを製造した（第１２図参照）。ｌＯ分
後に、トルエン中の０．１Ｍ硫黄を残留ホス７インを分
解するために加えた。還元されたＡＤＨ−ＢＺＮは次に
５Ｅ９マレイミド含有抗体と混合せられる。このように
して製造されたイムノコンジｚ’ｙ’−トはＰＤ−１０
）Ｊルフイルトレーションカラムを通して精製された。
トルエン溶媒の除去が完全になされない場合には、反応
侃合物からタンパク質を浮かべて流し、有機溶媒相を分
離した。空気をおだやかに流し、溶媒？除去し、１６．
０００Ｘｆで２分間混合物を遠心して変性したタンパク
質を除去した。次にイムノコンジュゲートを含有する澄
んだ上溝液をゲルＦ過にかげ、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で
分析しｙ；ＡＤＭ／抗体比は、実施例ｌにおいて記載し
たようにＯＤ■。及びＯＤ，■の吸光度を測定して決め
た。代表的な反応では３〜４のモル比のイムノコンジュ
ゲートを得た。
活性 本実施例の具体例に従って製造された多くのイムノコン
ジュゲートは、ＤＮＡ合成の阻害度を測るところの＆Ｂ
−チミジン取り込みアツセイ法を用い抗原陽性膝瘍細胞
対抗原陰性腫瘍細胞のそれぞれに対する細胞毒活性を調
べてテストした。本アツセイ法に従えば、該イムノコン
ジュゲートあるいはコンジュゲート化されていないＡＤ
Ｈの希釈は完全培地でなされ、各希釈液１００μｌを９
６−ウェルのマイクロタイタープレート中の各ウエルに
加えた。それぞれの釉釈（転三本づつおこなった。腫瘍
細胞を培地に懸濁し、ＩＸＩＯ’個の細胞を含有する１
００μｌを各ウェル中に次に加えた。細胞を５％ＣＯ，
の湿気のある雰囲気中で２４８Ｍ１３７℃でインキエベ
ーションした。１μＣｉ〔６−ｓＨ〕チξジン（Ｎ−ｗ
　Ｅｓｇｌａｎｄ　Ｎ％ａｌｔａｒ．　１　５Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｍ）を言有する５０μｌをそれぞれのウエルに入
札３７℃で４時間インキユベーションした。細胞をＭｉ
ｌｌ−ｉｔｉｔａｒ　　ａｗプレート（Ｍｉ１１ｉｐｏ
デ０に移し、２５％の冷トリクロロ酢酸（７゜ＣＡ）で
沈殿処理した。沈殿を５％の冷ＴＣＡでｌＯ回洗った。
フィルターを乾燥し、パンチで穴をあけてとり、Ｅ６０
％ｏｆＬ％０デ液体シンナレーション液ＣＭ．．Ｅ．，
ｌａ％ｄＮ％ａｌｇａデ）中でカウントした。すべての
カウントはパックグラウンドカウントを差し引き補正し
た。
本具体例に従ったイムノコンジュゲートＣ５Ｅ９−ＡＤ
Ｈ−３．９）Ｇ’！，５Ｅ９抗原陽性のＮａｓａｌｗａ
細胞及びＨＳＢ−２細胞に対して非常に高い細胞毒活性
を示した（第１８図参照）。該イムノコンジュゲートは
、コンジエケート化されていないＡＤＨの等しい濃度の
ものに比べて非常に高い活性を持っていた。別の実験に
おいては、３Ａ１−ＡＤＭ−６．０イムノコンジュゲー
トは、０．１μｙ／ｗｌ　ＡＤＭより低い濃度で、３Ａ
１，一抗原陽性ＥＳＢ−２に対し細胞毒活性を示すが、
３Ａ１−抗原陰性のＮａｔｎａ　ｌ　ｗａ細胞に対して
は活性が見出されなかった。より高い濃度では、該イム
ノコンジュゲートの細胞毒活性は、両方のセルラインに
対してほぼ同じものであった。
実施例３． トの抗腫瘍活性 次に本発明のイムノコンジュゲートの抗腫瘍活性を生体
内←ｓｓ　ｖｓｗｏ→試験でみた。特に、該イムノコン
ジュゲートは、マウス中でのヒトＢリンパ腫瘍の生育阻
害活性を試験されら 組織培養維持されているリンパ系細胞を皮下０１ｃ．）
接種して、一次的なＤ（ｌｓｄｉ及びＲａ情０　（パー
キットリンパ腫）固型腫瘍をＢ　ＡＬＢ／ａヌードマウ
スに作った。
Ｒａｓｏａ細胞セルラインはＡＴＣＣから入手できる。
次にＤａｓｄｉ及びＲａｍａｎ腫瘍は、ＰＢＳ中のＩ　
Ｘ　１　０’　個の腫瘍細胞／０．ｌ一をマウスの側腹
部の皮下に移植し、体重２　０−２　５　ｆ　（　Ｈａ
ｒＪａｓ　　Ｓｐｒａｇｓａ−Ｄａｓｏｌｍｙ　）　　
の４〜６週令の雌のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ａ　（　ｓｓ
／ｓｓ）　マウス中％％　９％１０で順次継代された。
腫瘍セルラインは、共に２００〜４０００ｇ１１”の線
型の増殖率を示した。対数増殖期での平均腫瘍容積を二
倍にする時間はＤａｓｄ４腫瘍では６．９±０．８日で
、ＲＬｆｌＬ＠ａ腫瘍では４．４±０．６日であった。
腫瘍の容積ＣＶ）は次式：２ （上式中Ｌ＝長さ００でＶは幅（１−）である）を用い
て計算される。ＩＩ１１Ｉｇ，の容積がＤａ％ｄ｛腫瘍
で４００−６００１Ｅｌ婁に、Ｒａｓｏａ　朧瘍で２５
０−４００ｆｉ”に達しタ時にマウスをランダムに５−
１０匹の群に分け、ＡＤＨ−ＨＣＩＣすなわち遊離の薬
剤）、本発明のＡＤＭ−イムノ：Ｉ　ｙ　シュク−　｝
　，コンジュグート化されていないモノクローナル抗体
、コンジュゲート化されていないモノクローナル抗体と
ＡＤＨとの混合物のそれぞれで処置した。試験されたイ
ムノコンジエグート（す々わち、その抗体成分は攻撃さ
れるべき魔瘍細胞と反応性を有している）によって得ら
れた抗腫瘍活性を、結合性を持たないコンジュゲート（
すなわち該膳瘍群とは反応性を有さないコンジュゲート
）を用いて得られたものと比較することにより細胞殺傷
性の特異性が示されている。抗体＋遊離の薬剤の混合物
は、薬剤を抗体に共有結合する必要性を示すためのコン
トロールである。
結果は、腫瘍の生育（Ｔ−Ｃ）阻止率または処置群の生
育カーブを、未接種コントロールと比較した時に腫瘍の
容積を倍化するに要する時間（ＴＶＤＴ）における遅れ
から評価されるところの腫瘍倍化遅延率（ＴＤＤ）とし
て表わされる。ＴＤＤは次式によって計算される。
（上式中Ｔ＝処置群における腫瘍量が３０００−に達す
るまでの時間（日数）、Ｃ＝コントロール群における腫
瘍が３０００ｆｆｉｌ”に達するまでの時間（日数）、
そしてＴＶＤＴ（腫瘍の容積を倍化するに要する時間）
＝コントロール（処置されていない）マウスにおける腫
瘍の容積が１５００−３００００”に増大するに要する
時間（日数）である） この実験結果において各群の各点は平均腫瘍容積を示し
ている。
これらの実験において，　Ｄｔｘｓｄｔ　ｌｌｊ瘍及び
Ｒ６情●廖腫瘍におけるＡＤＭ−イムノコンジュゲート
の抗腫瘍活性は：ａ）等しい投与量及び同じ投与方法並
びにスケジュールでの遊離の薬剤で得られたもの、 ｂ）一番最適な投与量、投与方法及びスケジュールで投
与された遊離の楽剤で得られたもの、 と比較された。
本明細書において記載のすべての実験においてはＡＤＨ
−ＨＣＩで処理するための薬剤は、５０−１００λＤＭ
ＳＯをその粉末の薬剤に加え、次に溶解した薬剤をＰＢ
Ｓで希釈して、注射日に”９７ｋｌ／　ｔｓｊの特定用
量とたし、腫瘍を有するマウスにそれを静脈内（　（．
ｗ．　尾部静脈）または腹腔内（　４〜ｐ．）に投与し
た。
この実験で用いられたＡＩ）Ｍ−イムノコンジュゲート
は実施例１に記載されたようにして製造し、それはすべ
てもともとの抗体の結合活性の９０％以上の活性を保持
しているものであった。これらの実験においては、特に
モノクローナル抗体５Ｅ９及びＧ２８．１がイムノコン
ジュゲートの抗体成分として用いられた。ＡＤＭ−イム
ノコンジュゲートは４℃でＰＢＳ中に貯蔵され、その製
造後２週間以内に用いられた。試験されたイムノコンジ
ュゲートのすべて及びコンジュゲート化されてｆｇい抗
体コントロールは１．ｐ．投与された。
本明細書においてｚ転治療スクジュールを表わす記号「
Ｑ７Ｄ×３」とは、薬剤で処理される群のマウスは、３
回注射さ汎そしてその各注射は７日間の間隔でなされる
、すなわち、３週間の間毎週１回注射投与されるような
治療スケジュールを示すものである。同様に、ｒＱ５．
Ｄｘ２」とは、薬剤で処置される群のマウスは５日間の
間隔で全部で２回の薬剤またはコンジュゲートが投与さ
れるような治療スゲジュールを示している。ｒＱＩＤＸ
ＩＪは、唯１回のみの注射投与を示している。かくして
、該治療スケジュールの表示では、その最初の数字は注
射の間隔（日数）を示し、その最後の数字はそのスケジ
ュール当たりの全注射回数を示すように定義されている
。
本発明のＡＤＭ−イムノコンジュゲートの抗朧瘍活性は
、それ故にまず最初に遊離のＡＩ）Ｍ−ＥＣＩＩ　　薬
剤と対応するかまたは等しい用量、投与方法及びスケジ
ュールで比較検肘された。
５Ｅ９−ＡＤＨイムノコンジュグート、５Ｅ９−ＡＤＨ
−１．８（モル比＝ＭＲ−１．ｆ３ＡＤＭ分子／ＭＡＢ
）のＤｔｘ％ｄｉ腫瘍κ対する抗腫瘍活性は、ａ）対応
する薬剤投与量（４．ｌη／鱈／ｊｓｊ）のコンジュゲ
ート化されていないＡＤＭ−ＨＣｉｌ，６）対応する抗
体ｉｉ（６３０１Ｒ９／叔／イ的）の５Ｅ９モノクロー
ナル抗体、ａ）５Ｅ９抗体十ＡＤＭ−ＨＣＩ　（４．１
９ＡＤＨ＋６３０１９　　５１？９）の混合物、及びｄ
）コントロールとしての結合性を有しないイムノコンジ
ュゲート、Ｌ　５　−ＡＤＨ−　８．６　（　４．１η
／＃／ｉｎｊ　ＡＤＭ） の活性と比較されム 一番最初の腫瘍の大きさが８００−１１００ｍ”である
ところの腫瘍の移植後２０日目と２５日目に（すなわち
、Ｑ５Ｄｘ２スケジュール）、マウス（５匹マウス／群
）　ハ、ｉ．ｐ．投与処理された。本実験で用いられた
投与ｉ◆Ｌ遊離の薬剤のｉ．ｐ．での最大許容投与量（
ｍａｓｔｓ％ｔｈｔｏｌ−ａｒａｔａｄ　ｄｏａｍｍＭ
ＴＤ）、すなわちイカなルルートあるいはスケジュール
を介して投与されてもＬＤｚｏ　（　１　０％の動物の
致死量）を来たすところの薬剤の用量を示している（下
表１参照）。
第２１図に示すように、５Ｅ９−ＡＤＨコンジュケート
は有意に優れた抗腫瘍活性を示した。さらにその抗腫瘍
活性は、遊離の薬剤の等しい用量で測定されるものより
も非常に大きなものであった。下記表４に示すように、
該コンジュゲートで処置された５匹のマウスのうちの三
匹をも完全に腫瘍が退行（治癒，　ａｍデー）しており
、それは〉１．５７ＤＤに相当するものであった。これ
に対し、ＡＤＭ−１１Ｃｌｊ及びコンジュゲート化され
ていないＳＥ９並びにＬ６−ＡＤＭの結合性を持たない
コンジュゲートは何らの抗腫瘍活性も示さなかった。Ａ
ＤＨ−ＨＣｌ＋５Ｅ９の混合物を用いた場合にいくらか
の腫瘍生育阻止が観察されたが、その効果は変わり易い
もので、統計的には無意味た０．２ＴＤＤでしかないも
のであった。
本実験において、遊離の薬物は、４〜５１９７ｋ９を超
える用量でｉ．ｐ．投与すると毒性を示すことから４．
　Ｉ　Ｗ／ｋｌ／ｊ％ｊの用量で投与された。このよう
な低い用量では、遊離のＡＤＨもＡＤＭ＋モノクローナ
ル抗体の混合物も共に不活性であった。一方、第２１図
から明らか１．ように、このような低い用量でさえ、該
ＡＤＭ−イムノコンジュゲートは、腫瘍生育阻止活性を
有していヘ 次に、最適化された投与量、投与ルート及びスケジュー
ルで投与されたコンジュゲート化されていない薬剤を用
いて得られた抗Ｍ瘍活性と比較してのＤａｓｄｉ腫瘍に
おける該ＡＤＭ−イムノコンジュゲニトの抗腫瘍活性を
測定することなしｔ４それ故最初に、Ｄ．．ｄｉ細胞に
最高の抗腫瘍活性を誘導するところのＡＤＨ−ＨＣＩＩ
の用量及び投与ルート及びスケジュールを決定した。こ
の最適な条件をみつげるため、マウスに種々の投与量、
投与ルート及びスケジュールを用いてＡＤＨ−ＨＣｌを
投与した。接種の間隔は用いられた処置スケジュールに
よってことなっている。次にＴＤＤ値を上記したように
して決定した。この最適な条件をみつげるための調査の
結果を下記表２に要約する。表２から理解できるように
、１．ｆ．投与さ札Ｑ７Ｄｘ３のスケジュールで投与す
るのが、１１ｗＩｉ／１４／ｓ％ｊの用量において腫瘍
の生育を遅延化すること及び腫瘍の退行化速度の双方で
一番適した抗腫瘍反応性をもたらし、そしてその用量が
４７Ｄ．Ｘ３のスケジュールでｉ．ｗ．投与の際の薬剤
のＭＴＤである。
−１７ ６それぞれの薬剤の群からの結果 するに要丁る時間の遅れを日で表わしたもの的に減少丁
ること 治癒（ｎけ−）：腫瘍が再び生育するという徴候がなん
らないところの完全ｋ退行 ’Ｄ／Ｔ　：ある動物群中の死亡数／全数最終の薬剤投
与の後５５日目まで薬物による死亡数ケ記録した。
Ｄ引ｃｄｉ腫瘍における遊離の薬剤の抗腫瘍活性をさら
に第２２図に示してある。Ｑ７Ｄ×３のスケジュールで
Ｌｖ．投与され、異橿間移植されたＤａ％ｄｓ腫瘍の生
育は、／ｌｆｆｉ−ＨＣｔの処置でそれぞれ９、１０ま
たは１１ＩＩ９／＃／注射（ｉｎｊｍｃｔｉｏ％）でそ
の用量に依存して著しく阻害された。
コントロールのマウスは処理しなかった。ＭＴＤ（　１
　１η／＃／ｉ％ｊ）での腫瘍の生育阻止量は２８日で
、それはＬＩＴＤＤに相当するものであった。
さらＫｉ．ｐ．投与での各種のスケジュールがテストさ
れた。上記”Ｃ［ｄｌｔ．Ｉ，タｘ　５　Ｋ、％．ｐ．
投４でｆ）ＡＤＭ−ＨＣＬのＭＴ　ＤｋＬ　４　−　５
　Ｈｉ／　＃／　ｉ％ｊ　であることがわかる。
表２Ｂからわかるように、遊離の薬物はｉ．ｐ．投与で
のそのＭＴＤではＤａｓｄｉ細胞に不活性であった。か
くして、遊離の薬物の最高の抗腫瘍活性は、ＭＴＤが１
１１Ｉｑ／ｋｇ／４％ｊ　の場合（この投与量で薬剤は
Ｄａｓｄｉ　＠瘍細胞の生育阻害を示丁），　　ｉ．ｗ
．投与でもって得られるということがわかった。
それ故に、これらの試験から、Ｄａ％ｄｉｊｌｉ瘍にお
ける抗１１［瘍活性のための最適ＴＬＡＤＭ−ＨＣｔの
用量はおおよそ１　１　１１’ｉ／　ｋ９／　ｔ　＊り
で、最適の投与スケジュールはＱ７Ｄ×３であり、最適
の投与ルートはｉ．ｇ．であることがわかった。
次に上記したような最適は条件下で投与される遊離のＡ
ＤＨ−ＨＣｔ薬剤の抗Ｉｍ瘍活性と、本発明のＡＤＨ−
イムノコンジュゲートのＤａｓｄｉ腫瘍における抗腫瘍
活性とを比較した。Ｑ５Ｄｘ２のスケジュールで、ｉ．
ｐ．投与されたＧ２８．１−ＡＤＭイムノコンジュゲー
ト、０２８．１一ＡＤＨ−７．６　（ＭＲ＝７．６薬剤
／ＭＡＥ）を、Ｑ７７Ｊｘ３のスケジュールでｉ．ｖ．
投与されたＡＤＨ−ＨＣＬと１０、１１及び１　２１９
／ｋｌ／ｉｓｊで比較しら第２３図及び下記表３に示す
ように、遊離の薬剤は、８匹のマウスのうち２匹におい
て完全な腫瘍の退行（治癒つを示すと共に１１ａ９／＃
（そのＭＴＤ）で腫瘍の生育の遅延化日数２８日を与え
活性を示した。本発明のイムノコンジュゲートは、その
最大の試験用量（　１　Ｂ．７１１９ＡＤＭ，　Ｑ　５
ＤＸ　２、ｉ．ｐ．）でも良好な許容性（死亡はなんら
ないそして何らの体重の減少もはい）を示し、８匹の処
置動物のうち３匹では完全は腫瘍の退行を示すと共に遊
離の薬剤エリも高い抗腫瘍活性を示した。結合性を有し
ないＬ６−イムノコンジュゲート、コンジュゲート化さ
れていない０２８．１及びコンジュゲート化されていな
いＧ　２　８．　１　＋　ＡＤＭ−ＨＣ　ｔの混合物で
は何らの抗腫瘍活性もたかった。本発明のＡＤＭ−イム
ノコンジュゲートは、至適化された用量及び投与スケジ
ュール、モしてＳＶ．またはｉ．ｐ．投与においてコン
ジュゲート化されていたい薬剤により達或することので
きるものよりもはるかに大きな腫瘍生育阻害を示丁こと
がわかった。
５Ｅ９イムノコンジュゲート及びＧ２８．１イムノコン
ジュゲートの檀々の調製物を用いての無胸腺マウスに異
檀間移植されたＤａｓｄｉ腫瘍におげる抗腫瘍活性値を
第４表に要約して示した。抗体用量で５００１１１７４
またはそれ以上で一致して最も高い応答性が得られた。
これらの用量では、１．８〜８．６０モル比ヲ有丁るコ
ンジュゲートを用いて抗腫瘍活性が得られた。モノクロ
ーナル抗体の用量を増加させると、ＴＤＤ（すなわち腫
瘍生育の阻害ノ及び腫瘍退行軍の双方において対応丁る
増大があるという事実からわかるように、コンジュゲー
ト化された薬剤の用量よりもその抗体の用量にエリ抗腫
瘍活性が異なるようである。丁ぺての試験において、平
行して等しい抗体用量で且つ等しいコンジュゲート化さ
れた薬剤用量でなされた結合性を持た取いＬ６−ＡＤＭ
コンジュゲートでは何ら抗腫瘍活性が見出され茂かった
（結果は示されていないノ。本発明のイムノコンジュゲ
ートは、更に、遊離の薬剤（等しい薬物用量では活性が
ない）と比較してもその活性が著しく高められているこ
とかこの表からわかる。
６投与スケジュール：９５ＤＸ２　　　ＭＲ：薬剤分子
／投与法：ｉ．ｐ．　　　　　　　　　　　　　ＭＡＢ
のモル比での日数で示した時間遅延量を表わす。
Ｃ治癒：処置動物における治癒数／全数’　５　Ｅ９　
−Ａ　ＤＨ−４．２　：　３回投与’　Ｇ　２　８．１
−ＡＤＭ　−　７．６　：　３回投与！コントロール群
における死亡例 下記表５には，本発明のＡＤＨ−イムノコンジュゲート
とコンジュゲート化されていｒｔい薬剤を用いて得られ
た毒性の低減性についてか示されている。
それからわかるように、本発明のイムノコンジュゲート
！Ｌ　　ｉ．ｐ．投与で遊離のＡＤＭよつも少なくとも
１０倍以上は毒性が少ない。
最後に．第２６Ａ図及び表６Ｋは，ヒトＲａｍｏａ腫瘍
におけるＧ２＆１−ＡＤＭコンジュゲートの抗腫瘍活性
が示されている。また，　Ｒａｍｏｓ　＠瘍における本
発明のイムノコンジュゲートの抗腫瘍効果を、最適の結
果を与え，そして１６−１８η／ＩＣ９／ｔｎｊの用量
の一回のみの投与であることが前もって決められたとこ
ろの条件下での遊離ＡＤＨ−ＨＣｌ　を使用してのもの
と比較した（第２４図及び第２５図を参照）。試験され
た最も多い本発明のイムノコンジュゲートの用量（１０
．６η／ＩｃｌＩ）では，該コンジュゲートの抗腫瘍活
性は遊離の薬剤の１８１ｎＧ！／＃（２５％の致死性）
を用いて得られるものよりＱ，５ＴＤＤだげ優れており
，ＡＤＭ−ＨＣＩ　Ｉ’）１６１１１９／Ｉｃ９（　１
　２Ｘノ＆死！）ノ４ノＪ．り１．　Ｏ　Ｔ　ｊＪ　Ｄ
だげ優れていた。本投与量における本発明のコンジュゲ
ートは処置された動物すべてにおいて何らの体重の減少
も死亡例ももたらさず良好な許容性を示した。またＧ２
＆１−ＡＤＨの抗腫瘍活性は，第２６Ｅ図に示されてい
るように用量依存性のものであることが見出された。
かくして，核コンジュゲートの投与量を減少させると、
ＴＩＬＬ）及び完全な腫瘍の退行数が減少した。Ｌ６−
ＡＤＨ（結合性を持っていない）コンジュゲートの相当
する用量（１０．６ク／ｌｃｇ）では活性はない。
上記実施例においては、新規な酸に感受性を有するアク
ルヒドラゾン結合を介して細胞毒活性を有するアントラ
サイクリン薬剤を抗体に結合せしめているところの新規
なアントラサイクリンイムノコンジエグートの製造法が
示されている。該イムノコンジュゲートは、抗体結合活
性（すなわちターゲット細胞特異性）及び細胞毒薬剤活
性の両方を保持しており、ターゲット細胞の細胞環境κ
代表される酸性条件または還元性条件下で遊離の修飾の
なされていない薬剤を遊離（放出）することができる。
これらのコンジュグートの抗腫瘍活性は、生体内（　ｉ
ｎ　ｓｉｓａ　）及び試験管内（　ｉｎ　ｎｉｔｒｏ）
の両方で示丁ことができ、遊離のコンジエグート化され
ていないア７トラサイクリンにより得られる活性よりも
はるかに大きなものであることが示された。
さらに、該イムノコンジュグートは，　　ｉｎ　＊ｉ＊
ｏにおいてそのコンジュゲート化されていない薬剤より
もはるかに大きな許容性（　ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）を有
していた。このように本発明のイムノコンジエグートは
、高い改善された治療係数（抗腫瘍活性対毒性の）を有
し、癌またはその他の腫瘍、殺細胞性でないウイルス感
染症またはその他の病原性感染症または自己免疫疾患の
ような病気の治療において、特定の細胞詳の一つを選択
的に殺傷する目的で、細胞毒性を持つ薬剤をその細胞に
デリバー（運搬）するに特に有用である。
実施例４． 次なる実施例は、アトリアマイシンの１３−ケト基の位
置のアシルヒドラゾン結合を介してアドリアマイシンが
ペプチドリガンド、ボムペクンに結合しているところの
新規アントラサイクリンーリガンドコ／ジュグートの製
造法を示すものである。
ボムベ７冫−ＡＤＨコンジュグートノ製造アミノ酸配列
： Ｃｙｇ−Ｇｌｘ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｍｓ−Ｇｔｙ−Ａ
ｓ％−ＧＬｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ　−Ｇｌ　ｙ−
Ｈｉｓ−Ｌｇｓ−Ｍｅ　ｔ　−ＮＨ，を有するｍ製６７
Ｂ−ボムベシンをＶｇｇａ　Ｂｉｏｔａｅルｎｏｌｏｇ
ｉａｓ（Ｔｓｓｃｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）に従って製造
した。
別の方法としては、ＦｍＯＣ保護されたアミノ酸の活性
化ペンタ７ルオロエステルヲ用いてＭｉＮｉｇａｎ　９
０５０ペプシドシンセサイザーでＣν８−ボムベシンを
合成した。
合或されたペプチドを樹脂から離脱させ、側鎖保護基を
２時間２５℃で９　２．　５　Ｘ　｝リ７ルオロ酢酸、
２．５％チオフェノール及び５％７エノール中でインキ
エベーションして除去した。次にＣｙ８−ボムベシンを
Ｃｌ８逆相ＨＰＬＣ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍａｒ　４１
０　　Ｂｉｎ　ＨＰＬＣ）、次いでイオン交換ＨＰＬＣ
にかげて粗製ペプデド混合物から精製した。
代表的な製造例に゛おいては、１０９の粗ベプチドと２
０ｍｇのジチオスレイトール（ＤＴＴ）をＯ．ＯＩＡｆ
酢酸アンモニウム液ｐＨ　６．０中の１０％アセトニト
リル液に溶解し、０．０１１Ｍ酢酸アンモニウム液ｐＨ
　６．０中の１０−５０％アセトニトリル液のグラジエ
ントを用いで分離した。溶出液はＯＤ，，。でモニター
した。分画（　ｌｆｆｌｊ）を集め、反応性のチオール
基を含有している分画な、実施例ｌにおいて記載したよ
うにしてｌ）ＴＮＢを反応させて検知同定した。これら
の反応性のチオール基を含有している分画を、ボムペク
ンレセプターと相互作用することが知られているボムペ
シンベプチドの部位に結合するところの抗ボムペシンモ
ノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ　　アツセイ法に
よりボムペシンの免疫反応性を試験した。該アッセイは
次のようにし行なわれた： ポムベシンペプテド（ｉｏｏｔｔｙ−ｉμＦ）を３７℃
で２時間ノｓｎａｓｌＯｓ　ｆｌ　ＥＬＩ　ＳＡプレー
トに吸着せしめた。そのプレートを３７℃で２時間３％
ゼラチンでもってブロックし、０．０５％トウイーン２
０ｆｔ含有丁るＰＢＳで５回洗い、３７℃でｌ時間マウ
スの抗ポムベシン抗体（Ｂｏ−ルデｉ％ｇ−デＩｄａ九
九ｈバ悄）ト共ニインキユベーションシ、次にＴ切−−
九２０含有ＰＢＳで５回洗滌した。次に該プレートをベ
ルオキシダーセで標識さしたウサギの抗マウスＩｇ（Ｂ
ｏｔｈデｉｎｇｏｔＭａｎｎｈａｉｖｎ　）と共にイン
キユペーションし、次に市販製品の使用指示（Ｋｉｒｋ
ａｇａａデｄ及びＰ−デデｙ）に従ってＴＭＢ基質と共
に展開した。
遊離のスルフヒドリル基を含有し、ポムベシンの免疫反
応性を示す分画な数回のカラム処理から得たものをプー
ルし、さらに１０％アセトニトリル液中の２−５％塩の
グラジエント（５００ｓＡｆ酢酸アンモニウム、ｐＨ６
．０）を用イテイ７Ｆ７交換ＨＰＬＣ”（Ａｑｓａｐｏ
ｒａ　ＣＸ−３００、１０μ惰力ラム、Ｒａｉｎｉｓ　
　より入手）にかけ精製した。溶出液は？Ｄ，．。でモ
ニターし、ｌ一の分画とし、それを上記したよう■して
ＬＪＴＮＢ法により遊離のチオール基について及びＥＬ
ＩＳＡ　アツセイ法によりボムベシンの免疫反応性につ
いて試験した。分画をプールし、Ｓａｔａｎｓ　　ｓｐ
ａａｄ−ｓａｃを用いて濃縮し、上記したようにして再
ｇｌｃ　ｌｓカラムのＨＰＬＣのクロマトグラフイーに
かげた。最終的なｃｙａ−ボムペシン生戚物はＨＰＬＣ
クロマトグラ７イーで単一のピークを示した（第２８図
参照）。次に該精製Ｃν８−ボムベシンを次のようにし
てＡＬ）Ｍ−ＨＺＮとの反応に用いた：精Ｒｃν８−ボ
ムベシンを、ｌη／−の精製Ｌ，，３−ボムペシンκ対
するＡｔ．。の値２．０８を基にｌＯｍ＆酢酸アンモニ
ウム液（　１．２　５−２１ｋｇ／ｌｊ）中の約５−８
η／４紅液となした。７Ｍ　　ＮＨ，ＯＲ液でｐＨ　７
．０に合わせ、次に２．５−４ｍ９ｆ）ＡＤＭ−ＨＺＮ
の４　０　０　ｐｇメタノール液を加えた。溶液を渦巻
かせ、２０℃で１時間置いた。次に断続的に混合しなが
ら４℃で１２時間置いた。アセトニトリル濃度を分離処
理を通して４０％に保持する以外は上記遊離ベプチドに
おいて概説したところの条件を用い該ｅｙｇ−ボムペシ
ン−ＡＩ）Ｍコンジュケートヲイオン交換ＭＰＬＣによ
り遊離の薬剤から分離した。コンジュグー｝ｆ含有する
分画をプールし、Ｓα嘗ａ引　ｓｐｅｅｄ−ｖａｔ上で
濃縮化し、上記したようにして逆相ＨＰＬＣ分離のため
出発緩衝液に溶解した。遊離のペプチドを次に逆相ＨＰ
ＬＣクロマトグラフイーにより（遊離のベプチドの精製
について上記で記載したようにして）該ペプチドー薬剤
コンジュゲートから分離した。カラムは２　８　０　％
溝と４　９　５　ｎｔｎでモニターした。
該コンジュグートを含有する分画をプールし、溶媒を除
去し、その特性を調べるため−２０℃で保存した。
別法としては、ボムペシンーＡＬＣＭコンジエクートハ
、ＡＤＨを該ペプチドのりジン残基ＣＬｗｓ”）の所で
ボムベシ冫ペプチドに結合することにより製造される。
この方法によると、ボムベシン（　Ｌｔａ”−ボムペシ
ンといウ）を２５℃で１時間ｐＭ＆５で３モル過剰量の
ＳＰＬ）Ｐとインキユペーションさせた。該ボムベシン
はＣ１８逆相ＨＰＬＣにより過剰のｓｐｕｐから分離せ
しめられ、過剰量のｉ）ＴＴでもって還元せしめらｈ１
そして次に上記したようにしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによ
って再度クロマトグラフィー処理された。還元さｈたペ
プチドは次に２５℃で１時間２モル過ａｍのＡＤＨ−Ｈ
ＺＮとインキエベーションされ、次に４℃で１４時間イ
ンキエベーションされる。該薬剤からの該ペプチド薬剤
コンジュグートを分離しようとする試みは、二つの理由
から問題が多かった： ｌ）上記ａｙｇ−ボムペシンの製造にあたり記載された
ようなＣｌ８のクロマトグラフィーにおいては、該ペブ
チドー薬剤コンジュグート（上記したようにＥＬＩＳＡ
アッセイ法で検知される）は、疎水性を示し、還元され
たペプチドとは異なるがＡｕＭ−ＭＺＮの単独のものと
非常に似た行動を示す， ２）リジン１残基を介してのボムベシンの修飾は、該ベ
プチド上の電荷を変化させ、遊離の薬剤からイオン交換
クロマトグラ７イーκよって分離することを困難にさせ
る。それ故、ａｙｓ−ボムベシンペプチドを介しての結
合が好ましかった。
ボムベシンーＡＬＣＭコンジュグートの特性上記したよ
うにしてｃｙｅ−ボムペシンから製造されたボムペシン
ーＡＬ）Ｍコンジエグートは、第ｎ図に示されたところ
の構造を有しており、該Ａｔ）Ｍｌ工、アシルヒドラゾ
ン結合を介して１３−ケト基の位置のリンカーアームに
結合している。ペプチドと薬剤とを結ぶリンヵーは、そ
の骨格中にジスルフィド結合を含有している。第２９図
は、該？ν８−ボムベシンーＡｔ）Ｍコンジュゲートの
マススペクトル図を示丁ものである。この分析でｃｙａ
−ボムベ７冫とＡｌ）Ｍのｌ：ｌ付加体に相当する２３
５７０分子イオンが示されている。
該ｃｙｓ−ボムベシン−Ａｌ）Ｍ−ｙ冫ジュグート＆工
、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣから入手しつる正常
マウス繊維芽細胞セルライン）上のボムベシンレセプタ
ーへの結合活性について調べられた。結合性は＋ｌＩｌ
−ラベルで標識されたガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ
）を用いた競合アッセイ法ヲ用いて測定さした。ＧＮＰ
は、ボムベシンのようにＳａｉｅｓ　３７”３ＩＩＢ胞
のようなボムベシンレセプターについて陽性の細胞の表
面上のボムペシンレセプターに結合丁る。
こうして、１１１７−＠識化ＧＲＰは、種々の濃度ｆ）
ｃｙｓ−Ｍムベシン、ＧＲＰ又はａｌｌ−ボムベシンー
Ａｔ）Ｍコンジュゲートと共にインキュベーションさ山
特異的■結合した放射活性を定量的に測定する。こうし
て、１！ｌＩ−ＧＲＰの結合の阻害率が測定される。該
アツセイは次のようにして行なわｈた： Ｓｕｉａａ３Ｔ３細胞１ＩｔｌＯ％胎児牛血清、ペニシ
リン（　１００ユニット／ｌｌｊ）及びストレプトマイ
シン（１００μＰ／ｄ）　で補ｒｇツたＨＥＭ培地（完
全培地）中で１５０ｃｒｎ’のＴＨｉフラスコ内でコン
フルエントにまで（５−７日間）生育させた。細胞がコ
ン７ルエントｒｔ状態に達した後、その培地ヲ、インシ
ュリン（５μＰ／Ｉｊ）、トランス７エリン（５μＰ／
−）及びナトリウムセレナイト（５μＰ／ｌｊｌ’補な
ったＭＥＭ完全培地でもって置き換えた。細胞なさらκ
２４時間インキエベーションして、ラバー製の道具（　
ｐｏｉｉａａｍｎ）でもってＲＰＭＩ／ＨＩＴＳＣＢＳ
Ａ（５η／−）、ＨＥＰＥＳ（４．７η／−）、インク
ュリン（　ｓμＩＰ／ａｊ）、｝　ランス７エリ７　（
　５ｆｉ１！／ＩＩＩ）　＆ヒｔ　｝　！ｊウムセレナ
イド（５外Ｐ／ＩＬＩ）を含有丁るＲＰｈ１１１６４０
培地〕中へかき取って収穫した。細胞を１回洗い、２２
−ゲージの針を３回通して、単一細胞の１！！ｉｌ濁物
な得た。次にｌＯμｌ（ｒ）ａｙｓ−ボムベシン、ＧＲ
Ｐまたハ該ポムベ７冫−ＡＬＣＭコンジュグートを各種
の希釈度で（３組づつ）、５ＸｌＯ’個の細胞を含む試
験管に加え、次に１５０μｅの１１１−ＧＲＰ（２九Ｐ
／Ｌｔ、２０００Ｃ’ｉ／惰惰ｏｊ）を加えた。試験管
を混合処理し、撹拌装置にのせて室温で１時間インキュ
ベーション処理した。細胞に結合したＩｔ５１−ＧＮＰ
をマイクロフユージチューブ中のＭｌのジブチルフタレ
ート：ジオクテル７タＶ一ト層上で１２．ｏｏＯＸＰで
遠心して分離した。該チューブをドラアイス上で凍結し
、細胞ペレットを切断してＩＩＢＬ２７５ガンマーカウ
ンターで計数した。
第３０図に示されているようＫ％ＧＲＰ％Ｃｙ８−ボム
ベ？ン及びｃｙ８−ボムベシンーＡＬＣＭコンジュクー
トによって旧！−ラベル化ＧＲＰの３Ｔ３細胞■対丁る
結合の対丁る特異的競合が存在丁る。より重合なことに
は、それら三つの分子種は、ボムペシンレセブターに対
して類似の親和比を示しその三つの分子橿の競合性のカ
ーブには何ら有意な差異がない。かくして、Ａｌ）Ｍを
ボムペシンに結合しても、該ペプチドの結合活性を妨害
せず、該コンジュゲートは、ボムベシンーレセプターが
陽性である細胞への結合活性が保持されている。我々が
行なった他の実験では、ｇａ一ポムベシン及びボムベタ
ンは該レセプター陽性の細胞に等しい結合活性を持つこ
とが確＆ｉ！された。
ボムベシンーＡＬ）Ｍコンジュゲートの細胞毒活性本発
明のｃｙａ−ボムベシンーＡＬＣＭコンジュゲートの細
胞毒性活性ｖｌＨ−テミジン取り込みアツセイ法を用い
て測定した。このアツ・七イ法に従えば、その細胞表面
にボムベシンレセプターを担持する各楕の細胞が、９６
−ウエルのマイクロタイタープレー｝（５０００個細胞
／ウエル）に加えられ、ＭＥＭ培地中３７℃で２４時間
生肯せしめられる。これらの細胞としては、上記したよ
うなＳｗｉｓｓ　３Ｔ３繊維芽細胞セルライン、ｓｖｒ
２細胞セルライン（ＡＴＣＣから入手しうる形質転換さ
れた繊維芽細胞セルライン）、及びＭＣＴ　ｌ　１　６
細胞セルライン（実施例ｌに記載された結腸癌細胞セル
ライン）があげられる。ａｙｇ−ボムベ７ン−Ａｌ）Ｍ
コンジュゲート、Ａｔ）Ｍ．Ａｌ）Ｍ−ＨＺＮ，または
ｃｙａ−ボムペシンーＡＬ）Ｍ＋２０１１Ｐ／Ｉｌｌ　
ｆ：ｂヘシ７（１）混合物の希釈は、ＲＰＭノ１　６　
４　０Ｘ＠地、牛血清アルブミン（５ｍｇ／ｊ１０、Ｈ
ＥＰＥＳ　Ｃ　０．０　２Ｍ　）、｛　冫シＷ　！Ｊ　
：ｙ（５μＰ／−）、トランス７エリン（５μＰ／ＩＬ
ｔ）及びナトリウムセレナイト（５μＰ／ＩＬｔ）ｔ’
含有するＨＩＴＳ培地中でなされた。コンジュグート、
薬剤あるいは混合物のそれぞれの希釈物の５０μｇ（そ
れぞれ三組づつ）を細胞が入札られたウエル中に加えら
れ、３７℃で最小１時間インキユベーションした。コン
トロールのウエルは、培地のみを加え、保持された。細
胞は次に洗滌され、２００μｇの新鮮な培地を加えられ
、ウエルな、５％ＣＯ，の湿った雰囲気下３７℃でＭＩ
ＴＳ培地中でさらに３８−４４時間インキュペ−７：Ｆ
７Ｌた。”Ｈ−ｆミシ７ｆ）１　ｔｓＣｉ　（Ｎｅｗ　
ＥｎｇＬａｔｓｄＮ％Ｃ１−αデ）の５０μｅ培地液を
それぞれのウエル中に加え、３７℃で４時間インキユペ
ー７ヨンした。Ｅｌ）ＴＡ（０．５３ｎＭ）中のトリプ
シン（０．０５％）液を加えて１５分間処理し、細胞を
マツシュハーベスター（ｍａｓｈ五αｒｖｍｓｔａｒ　
）中に収穫した。フィルターなＲＰＩ３α９０Ｂ’／冫
ｆＶ−ション液に置き、Ｂｍｃｋｍａｎ　ＬＳ５８０１
シンテレーションカウンター中で計数した。細胞毒活性
は次式を用いて決定した： ３Ｈ−ＴｄＨの阻害率％一 かくして、本発明のコンジュゲートの存在下にボムベシ
ンーレセプター陽性細胞セルラインのＤＮＡへの３ｕ−
チミジン取り込みの阻害率を測定し、該細胞上への該コ
ンジュゲートの細胞毒性作用を求めた。第３１図に示す
ように、該ａｙｓ−ボムペシンーＡＬＪＭ−コンジュゲ
ートは、ＳＶＴ２細胞に対して非常に高い細胞ｍ活性を
示し、実際に遊離のＡＬ）ＭあるいはＡｔ）Ｍ−ＭＺＮ
よりも非常に作用が強い。
該ＣＷａ−ボムベ７冫一ＡＬＣＭコンジュグートのａｉ
ｍ性活性の一部は過剰量のボムペシン（″ｆなわち該コ
ンジュグート＋ポムペシンの況合物）Ｋよってブロック
され、それは、該コンジュグートの細胞毒活性は該コン
ジュゲートのボムベシンレセブターへの特異的な結合に
丁くなくとも一部は？因丁ることを示すものである。第
３２図及び第３３図■おいて示されているように、該コ
ンジュゲートＩｉまた＃Ｃ７’ｌ１５細胞及びＳｗｉｓ
ｓ３Ｔ３細胞に対しても特異的な細胞毒性活性（２時間
の処理）を示した。
本笑施例は、１３−ケト基のアシルヒドラゾン結合によ
ってＡｔ）Ｍに結合丁るところのリンヵーを介してＡＬ
）Ｍがポリペブチドリガンド，ＥＧＦに結合していると
ころの本発明の別のアントラサイクリンーリガンド●コ
ンジュゲートの製造を説明丁るものであるＯ ＥＧＦ−ＡＬＣＭ●コンジュグートの製造本発明の具体
例に従えば、ＡＤＭはｌＪｉｏｍａｄｔｃａｌＴａｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｍａ＋Ｉｎｃ（　Ｓｔａｓｇ五ｔｏｎ．Ｍ
Ａ）から購入されたマウスＥＧＦに結合せしめられる。
ｌｌＥＧＦ＋１マウスの下顎腺から得られ、Ｃ’　ｏｈ
ａｎ＋　７　．Ｂ　．Ｃ　−　＋　２　３　７　ｅ　ｐ
ｐ１５５５−６２（１９６２）の方法を修飾した方法で
精製されるし、また無！！凍結乾燥粉末（ｃａｔ＃：Ｂ
Ｔ−２０１）として０．　１　ｍ９／　ａｖＩｌｐのも
の娶購入しうる。またＳαデναｇ−ａｓ　ａｌ．．Ｊ
．Ｂｉｏｌ．ｃｈａｍ．２２　，ｐ．７６６９　（１９
７３）参照。次に該ペプチドは，ＳＰＩ）Ｐ？：用いて
チオール化され、該ペプチド上に反応性チオール基を導
入できる。しかしながら、マウスＥＧＦの場合、ＳＰＤ
Ｐが結合するためのりジン残基がその中にないので、Ｓ
ＰＤＰの結合する唯一の場所は、アミノ末端のアミノ酸
部分であり、それは、＜ｕｒｒによる還元処理の後）Ｅ
ＧＦ分子あたり丁＜ハクとも１個の反応性スル７ヒドリ
ル基を持つ分子を生ずる。
ヒトＥＧＦのチオール化は理論的には、その分子はリジ
ン分子をそのうちに有丁るので、より多くの置換１ｇＩ
：ｃｉＴ能にする。
かくして、ＥＧＦをまず、０．　１　！Ｉ１ｔ（７）　
Ｐ　Ｅ　Ｓに溶解し、１，Ｑａ９／ＩＬｔの最終濃度に
した。この溶液に、Ｑ．ＱｌａｊのＳＰＬ）Ｐ（最終濃
度：ＩＱ，ｐ＆Ａｆ）（抗体のチオール化について実施
例１において記載したようにして購入したものを希釈し
た）を加えた。反応混合物を３０℃で３０分間インキユ
ペーションして、次に０．０２１ＬｔのｖＴＴ（　５０
駕Ｍ）を加え、チオピリジル保護基を除去した。過剰の
υＴＴ及びＳＰＩ）Ｐを３，５　０　０の分子量をカッ
トオ７丁る透析メンプレン（　Ｓｐａｃｔｒｓｖｙ＋　
ＭｅｄｉｃａＬＩｎｄｕｓｓｒｉａｓ　Ｉｎｃ．，ｃａ
＊　＋：１３２７２３）を用いてＰＢＳＴＩＣ対してマ
イクロ透析してテオール化ＥＧＦから取り除いた。
次にチオール化されたマウスＥＧＦは上記実施例ｌに記
載されているようにして製造され希釈された５−６倍過
剰な蝋のＡυＭ−ＨＺＮと反応せしめられた。本実施例
においては、Ｑ，ＱｌａｊのＡｔ）Ｍ−ＭＺＮ（ｌ．２
ＸＩＯ”Ｍ＞’ｔ、最終的な容量が０．２ｄで４℃に冷
却されたＰＢＳ中の０．１ηのＳＰＬ）Ｐでチオール化
されたＥＧＦ中に加えられた〇反応混合物を４℃で１晩
インキユベーションし、上記ｓ　ｐ　ｕｐｆ）除去のと
ころで述べたようにしてＰＢＳに対して透析し、未反応
の薬剤を該コンジュゲートから除云した。
該コンジュゲートの純度をＩＩＰＬｃによって測定した
（第３４図参１１＠）。ＨＰＬＣは５ｉ？ａ冫ｒｙ）Ｒ
Ｐ１ＢビーズゼパツクしたＢｒｏｗαｌ−一カラム上で
行なわれた。ＥＧＦ−ＡＬ）Ｍ−コンジュゲ一トは、コ
ンジュゲート化されてないマウスＥＧＦ（同じ原料及び
ロフト査号のもの）及びコンジュグート化されていない
ＡＬ）Ｍと比較された。サンプルなキ酸アンモニウム０
゜ｐＨ２．８）／アセトニトリルグラジエントでもって
ｌ，Ｑｍ／ｇｔ３で溶出した。第３４図に示丁ように、
該コンジュゲート化されたＥＧＦ（丁なわち本発明の゛
ＥＧｙ−ＡｕＭコンジュゲート）をコンジュゲート化さ
れていないＥＧＦと比較丁ると、該タンパク質はその滞
留時間において新しいタンパク質ピークのところに均一
な程度にシフトしていることがわかる。同様に、該コン
ジュゲート化されていないＡｔ）Ｍと比較丁ると、遊離
のＡＤＨのところからコンジュゲート化された薬剤のピ
ークのところにその滞留時間がシ７トさしていることが
観測された。
本ＨＰＬＣクロマトグラフイー図は、最終のコンジュゲ
ート調製物中には遊離の薬剤（４９５九渦で検知）、ま
たは遊離のリガンド（２８い―で検知）はＦ％以下であ
ることが示さｈでいる。
該コンジュゲートの純度はまた、非還元ＳＬ）Ｓ−ＰＡ
ＧＥゲル（８　　２５′Ａのグラジエントゲル）におけ
るＳＵＳ−ＰＡＧＥ分析で決定された（データは示され
ていない）。
それぞれの夕冫パク質のバンドは、銀染色された（７’
７情ａｃｉａｐｈａｓｔｇａｔ銀染色キット；ｃａｔ　
＃：　１７−０６１７−０１）。該ＥＧＦ−ＡＬ）Ｍコ
ンジュグート（おおよそ０．１Ｍｌｉｌ／ＩＬＬ及び０
．０５η／一）は、コンジュグート化されていｒｘいマ
ウスＥＧＦの三つの希釈液（ｌη／ＩＩＩＡ，　０．１
η／一及びＱ，０１ｍｇ／ａ／ｉ）と比較された。ＥＧ
Ｆ−ＡＬＣＭ調製物中には、コンジュゲート化されてい
ないＥＧＦタンパク質に相当するようないかｔｌるタン
パク質バンドの徴候もなかった。本実験はＥＧＦ−Ａυ
Ｍコンジュゲート調製物中にはコンジュゲート化されて
いｒｌいＥＧＦのいかなる徴候もないという第３４図の
結果を支持するものである。
ＥＧＦ−ＡＬＣＭコンジュゲートの結合活性の保持Ａｔ
）Ｍ−Ｍ；ｌＮｔｔＥＧＦに化学的に結合した後のｇＧ
ｐ結合活性が保持されていることを、／１４３１ＮＡ胞
セルラインを用いて競合ラジオアイントープアツセイ法
馨用いて決定した。本細胞はヒト肺癌由来のもので、ｌ
−４ＸＩＯ’個のＥＧＦ分子を結合できる（結果は示し
ていない）。ｌＯ％ＦＣＳを含有丁るＲＰＭＩＬ６４０
生育培地で希釈された細胞を９６−ウエルのマイクロタ
イタープレートに播種し（５Ｘ１０’個細胞／ウエル）
、アツセイ前に２４時間保持した。アツセイ当日、付涜
性の細胞群として生育しているＡ４３１細胞ｆｔ２％牛
血清アルブミンを含有丁るＤＭＥＭ（以後緩衝液Ａとい
う）で洗った。細胞（三組で行なう）を順次２倍に希釈
されたＥＧＦまたはＥＧＦ−Ａｌ）Ｍの緩衝液，４ｔＯ
．０５１ｊ及び緩衝液Ａで希釈されたｌｆｌ／−ラベル
化ＥＧＦ（５０ｎ９／ｒＲｌ）の０．０５ＩＬｔ（最終
容ｔ：０．ＩＷＬｔ／ウエル）ｌにインキエベーション
した。細胞を４℃で４時間インキエペーションした後、
緩衝液Ａで３回洗った。細胞をｌ，　Ｑ　Ｍ　ＮｃＬＯ
Ｈ液で可溶化して９６一ウェルのプラスチック製プレー
トから除去し、細胞に結合ｔ，Ｃいる””Ｉ−ＥＧｌ？
ｔ）量ｆＬＫＢモデ／Ｉ／１　２　７　２ｔｆ７７−カ
ウンターでもってカウントしてＩＩＩｊ定した。
Ｅａｙ−Ａｔｉｉｔ−コンジュゲートの４４３１細胞上
のレセ？ターへの結合活性は、第３５図に示されており
、それは、ｐ：Ｇｙ−Ａｖｙの濃度ｔ高めると共にｌｆ
ｆｉｌＩ−ラベル化九〇Ｆの結合が阻害されることで示
されている。値は１１ノ一ＥＧＦ結合の阻害’４ＣＨ／
８０）として示されており、Ｂは、各種阻害剤の濃度に
おける細胞に結合した放射活性のカウント数で、ＢＯは
何らの阻害剤のｔＬい場合の細胞に結合した放射活性の
カウント数である。二つの異なったＥＧＦ−ＡＩ）Ｍコ
ンジュゲート調製物がコンジュゲート化されていないＥ
ＧＦと比較された。両方りコンジュゲート調製物は、同
様は結合活性を示した。コンジュグート化されていない
ＥＧＦと比較した時、ＥＧＦ−ＡＬＣＭコンジュグート
はＡ４３１Ｍ瘍ターゲット細胞上ｔｙ）ＥＧＦレセプタ
ー■対丁る結合活性がほんの僅かしか低下していないこ
とを示している。
？発明のコンジュゲート■ついての別の実施例は、１３
−ケト基のアシルヒドラゾン結合を介して粟剤に結合丁
るところのリンカー聖ブｒしておｒ）、Ａｔ）Ｍがタン
パク質リガンド、トランスフエリンに結合しているとこ
ろのアントラサイクリンーリガンドコンジュゲートの製
造法についてのものである。
トランス７エリン−Ａｌ）Ｍコンジュケ−｝１７）製造
５．ｌＩＪ９のヒトホロトランスフエリン（　ｈｏｔｏ
−ｔｒａｎｓ−／＊ｒｒ４ｓ）　（　１　０　０ＬＸＩ
鉄で置換されたもの、Ｓｉｇｍａ）を５０ｍＭのトリエ
タノールアミン、５０ｎＭＮαＣｅ及びｌｍＭ　　Ｅｌ
）ＴＡ　　を含有丁る緩衝液ｐＨ８．０に溶解した。
次Ｋ４　０　ｆｉｇ　１７）２　−　Ｉ　Ｔ　（　５０
ｓａＭ　）’ｔ加え、混合物を３時間３７℃でインキエ
ベーションした。該チオール化されたベプチドを実施例
ｌにおいて記載したようにしてｐｕ−ｌＯカラム（Ｐ４
ａｒｍαｃｉａ　）にかけ分離した。　次に１３５μｊ
のＡＬ）Ｍ−ＭＺＮ（２，ｌ惰Ｍ）をＰＢＳ緩衝液中の
２．７１１４のチオール化トランス７エリン中に加え、
反応混合物を１晩４℃でインキユペーションした。反応
混合物を次に２　０　０　Ｏ　ｒｐｍでｌＯ分間遠心し
、トランスフエリンーＡＤＭコンジュゲートをＦＤ−Ｌ
Ｏカラムを通して未反応のＡＬ）Ｍから分離した。コン
ジュゲートを含むポイド部を集めた。ｌη／−のトラン
スフエリンに対丁るＡ２．。の値ｌを用いて、Ａｌ）Ｍ
／トランス７エリンのモル比は４６であることがわかっ
た。
実施例４〜６は、細胞Ｓ性を持つアントラサイクリン薬
剤が，攻撃されることが求められている特定の細胞詳の
一つκ関連したレセブターと反応性χ有するリガンドに
結合せしめられたところのアントラサイクリンーリガン
ドコンジュグートの製造法を示すものである。該アント
ラサイクリンは新規な酸に感受性のア７ルヒドラゾン結
合を介して？リガンドに結合している。本明細書に開示
されたコンジュクートは、該リガンドのレセプターへの
結合能力と共に該リガンドを介してターゲット化された
細胞群に対しての該アントラサイクリンの細胞毒性活性
の両方を保持している。
本明細書においては本発明の数多くの具体的態様が示さ
れているが、その基本的た構成は変えることができて、
本発明のイムノコンジュゲート及びその方法を用いたそ
の他の具体的態様もなしうろことは明らかである。それ
故本発明の範囲は、実施例でこれまで本明細書において
具体的に説明された具体例に限定されることなく、特許
請求の範囲において定義されたものによることが認めら
れよう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のイムノコンジュゲートの製造■用い
られる新規なＡＬＣＭ−ＨＺＮヒドラゾン誘導体の合成
法を模式的に図示したものである。 第２図は、先ずモノクローナル抗体（ＭＡＲ）がＳＰＬ
）Ｐ（Ｎ−スク７冫イミジル−３−（２−ピリジルジテ
オ）プロビオネート）または２−ＩＴ（２−イミノテオ
ラン）のいずれかを用いてチオール化され、次にそのチ
オール化された抗体をＡＤＨ−１１２Ｎと反応させて、
そのＡＬＣＭの１３−ケト位のヒドラゾン結合及びリン
カーアーム内のジスルフィド結合を持つ本発明のイムノ
コンジュゲートを形或しているところの本発明の一つの
具体的な態様であるイムノコンジュゲートの合生法を模
式的に凶示したものである。 第３図は、モノクローナル抗体上に置換されて存在する
反応注チオール基の数（ＳＨｌＭＡＢ比）と、ｓｐｖｐ
でチオール化されたモノクローナル抗体５Ｅ９及び３，
４１をＡＤＭ−ＨＺＮと縮合せしめて製造されるイムノ
コンジュゲート中で遅或されるところの最終的なＡｔ）
Ｍ／ＭＡＢのモル比とを比較するための分布図である。 第４図は、該ＳＨｙＭＡＢ比と、２−ＩＴでチオール化
された抗体５Ｅ９及び３Ａ１をＡＬＣＭ−ＨＺＮと反応
させて製造さｈたイムノコンジュゲート中で遅或される
ところの最終的なＡｔ）Ｍ／ＭＡＢのモル比とを比較す
るための分布図である。 第５図は、ＳＰυＰでチオール化された抗体または２一
ＩＴでチオール化された抗体のいずれかを用いて製造さ
れた本発明のコンジュグートの夕冫パク質の収率とＡＬ
ＣＭ／ＭＡＢのモル比との間の関係を示すだめの分布図
である。 第６図は、Ｉ　ＱＧ，イソタイプ（例．５Ｅ９及び３，
４１）のモノクローナル抗体またはＩＱＧ，イソタイプ
（例．Ｌ６）のモノクローナル抗体のいずれかを用いて
製造したイムノコンジュグートにおいて得られるタンパ
ク質の収率と、ＡＬ）Ｍ／ＭＡＢのモル比とを比較する
ための分布図である。 各抗体はＳＰＬ）Ｐでチオール化された。 第７図は、各抗体が２−ＩＴでもってチオール化されて
いることを除き、（第６図に示されているように）’ｇ
’＋及びＩＱＧ，のイノタイプのモノクローナル抗体を
有するイムノコンジュゲートのタンパク質の収率と、Ａ
Ｉ）Ｍ／ＭＡＢのモル比とを比較するための分涌図であ
る。 第８図は、それそれコンジュゲート化されてないモノク
ローナル抗体の結合曲線と比較した本発明のイムノコン
ジュグートの結合曲線を示すグラフ図である。 第９図は、ｐＨ４〜７の範囲にわたっての本発明のイム
ノコンジュゲートの安定性を示丁１１ＰＬｃクロマトグ
ラ７イー図である。本クロマトグラフィー図は、そのｐ
Ｈがより酸性となると該イムノコンジュグートから遊離
のＡＬＣＭがより放出されること娶示し、本発明の該ア
シルヒドラゾン結合は酸に纏受注であることを示してい
る。 第ｌＯ図は、本発明のイムノコンジュゲートからＤＴＴ
による処理のｕｋＡｔ）Ｍが放出されろことを示丁とこ
ろのＨＰＬＣクロマトグラフイー図である。 第１１図は、本発明のイムノコンジュグートのｌ）ａ訓
れセルラインに対する選択的は細胞毒性作用を軟寒天コ
ロニー形威アッセイ法を用いてグラフとして描いたもの
である。 第１２図は、本発明のイムノコンジュゲートのＮａ慣Ｇ
Ｌｗα細胞に対する選択的た細ｌ＠４性作用及び遊離の
ＡυＭに比べて該イムノコンジュグートの作用が高めら
れていることｆＪ：限ｌ￥希釈アツセイ法聖用いてグラ
フとして描いたものである。 第ｌ３図は、本発明のイムノコンジュグートのＬ）ａｓ
ｄｉ細胞に対丁る選択的は細ｆ！褥性作用を軟寒天コａ
＝一形戚アツセイ法でもってグラフとして描いたもので
ある。 本例においては、該イムノコンジュゲート（ま、ＳＰｌ
）Ｐでチオール化さｈて製造された。 第１４図は、テオール化剤としてＳＰｌ）Ｐｆ用いて製
造された本発明の別のイムノコンジュゲートの選択的な
細胞毒性作用をグラフとして示したものである。本イム
ノコンジュグートは、抗原について陽性のＺＪａ％ｄｉ
細胞やＮａｍａｌリα細胞に対しては細胞毒作用を示す
が、抗原が陰性のＨＳＨ−２細胞にはそれを示さないこ
とが、軟寒天コロニー形戚アツセイ法２用いて示されて
いる。 第１５図ヲ耘本発明の５Ｅ９イムノコンジュゲート及び
３，４１イムノコンジュグートのヒト結＋＆癌（　ｃ　
ｏ　ｌ　ｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）セルライン（５Ｅ９
　　．３ＡＩ　　）に対して選択的な細胞擲作用を示丁
ことが、コロニー形或アッセイ法を用いて示されている
。 第１６図は、ｇａｓ−αｌａ　　のジペブチドリンカー
を介してＡＬＣＭの１ミノ糖残基においてＡｔ）Ｍをモ
ノクロ−ナル抗体に結合せしめろことにより製造された
イムノコンジェグートのｌ）ａ組ｈ細胞に対する細胞毒
性は、そしがなくなっていることをグラフで示したもの
である。 第１７図は、本発明の新規なＡｔ）Ｍ−ＨＺＮ誘導体を
還元し、次にＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４〜（ｐ−
マレイミド７エニル）プチレート）で処理された抗体と
反応させ、その骨格中にチオエーテル結合を持ったリン
カーを有丁るイムノコンジュグートを形成させたところ
の本発明のイムノコンジュグートの合成法を模式的（示
す図である。 第１８図は、該リンカーアーム中Ｋｌ３−ケト基のアシ
ルヒドラゾン結合に加えて、テオエーテル結合を有丁る
本発明のイムノコンジュゲートの細胞毒活性をグラフに
示したものである。該イムノコンジュゲートは遊離のＡ
ｔ）Ｍに比較してＩＶａｍαｌｗａ細胞に対して非常に
大きｒｚ効力を有することか、１Ｈ−チミジン取り込み
アッセイ法で示されている。 第１９図は、第１８図におけると同じ８ｕ−チミジン取
り込みアツセイ法を用い第１８図のイムノコンジュゲー
トのＨＳＢ−７：細胞に対する細胞毒活性をグラフに示
したものである。 第２０図は、該３Ｈ−テミジン取り込みアッセイ法を用
いて抗原について陽性の細胞及び抗原について＠性の細
胞のそれぞれに対丁る該リンカーアーム中にｌ３−ケト
基のアシルヒドラゾン結合κ加えてチオエーテル結合を
持つ不発明のイムノコンジュグートの選択的な細胞壽活
性をグラフとして示丁ものである。 第２１図は、マウスに異種間移植（　ｚｇｎｏｇｒａｆ
ｔ　　）　ＬたヒトのＵａ％ｄｉ腫瘍Ｋおける本発明の
イムノコンジュゲートの生体内（　ｉｎ　ｖｉ＊ｏ　）
での抗腫瘍活性をグラフで示？ものである。該イムノコ
ンジュグートは、それと等しい量の遊離のＡＬ）Ｍを用
いて得られるよりもはるかに大ぎｒｔ抗腫瘍活性を示し
た。 第２２図は、マウスに異種間移植したヒトのＬ）ａｓｄ
ｉ腫瘍におけるＡｌｌＨの生体内での抗腫瘍活性を、Ｑ
　７　Ｄｘ　３処置スケジュールを用いると共にｉ．ｗ
．投与法を用いＡｔ）Ｍの投与量を変え時間を追ってグ
ラフに図示したものである。 第２３図は、マウスに異種間移植したヒトのＵａ％ｄ１
腫瘍■おける本発明のイムノコンジュゲートの生体内で
の抗腫瘍活性を、最適濾の遊離のＡｕＭ（１０−１１η
／■／注射＜ｉｎｊ）の用量でＱ７ＺＪｘ３の処理スケ
ジュールのもとｓ．ｗ．投与される）の相当する抗腫瘍
活性と比較してグラフに示したものである。該イムノコ
ンジュゲートは非常に大きな抗腫瘍活性を示した。 第２４図は、仁嘗．投与法を用いると共に棟々の処理ス
ケジュール並びに投与ｔを用いてのマウスに異種間移植
したヒトのＲｔＬｔＩ＆Ｏ１１腫瘍におけるＡＬＣＭの
生体内抗腫瘍活性を表にして示した図である。 第２５図は、１回注射処理によるスケジュールと共にｉ
．ｖ．投与法を用いて、マウスに異種間移植されたヒト
のＨａ帽目腫瘍におけるＡＬＪＭの生体内での抗腫瘍活
性を、種々のＡＬＣＭの用量について時間を追ってグラ
フにして示したものである。 第２６Ａ図は、本発明のイムノコンジュゲートの生体内
での抗腫瘍活性をマウスに異種間移植したヒトのＲａｍ
０８Ｍ瘍においてみたものを、最適な形態での遊離のＡ
ｔ）Ｍ（　１　６−１　８Ｗ／ＩＣｆｌ／　ｓｎｊ’ｔ
ＱＩ　ＤＸ　ｌの処置スケジュールでｉ．ｗ．投与され
る）の相当する抗腫瘍活性と比較してグラ７として示し
ている。該イムノコンジュゲートは、遊離のＡＬ）Ｍよ
りもはるρ・に強い抗腫瘍活性を示した。 第２６Ｂ図は、該イムノコンジュゲートの抗腫瘍作用の
用量依存性馨みるため、該イムノコンジュゲートの生体
内での抗腫瘍活性を、該コンジュゲートの種々の投与量
において時間をおって図示したものである。第２６Ａ図
及び第２６Ｂ図において試験なＴＬされたイムノコンジ
ュゲートの投与量は、その欄外に示された抗体を示すの
と同じ記号のコ／ジュゲート化されたアントラサイクリ
ンの所に示されている。 ｉ１！２７図は、α）本発明のポムベシンーＡＤＭコン
ジュグート：ｂ）本発明のＥＧＦ−ＡＬ）Ｍコンジュゲ
ート；及Ｔｉｃ）　本％ｅＡのトランスフエリンーＡＬ
）Ｍコンジエクートの各化学構造式を図示丁るものであ
る。 第２８図は、それぞれｃｙｓ−ボムベクンの逆相Ｃ−ｌ
８カラム及びイオン交換ＣＸ−３００カラム上での二つ
のＨＰＬＣクロマトグラフイー図を示丁ものである。各
クロ？トグラ７イー図は２　２　０　ｎｍ及び２　８　
０　ｎｕにおけるものである。その図形は、本発明のボ
ムペシンーＡｔ）Ａｌコンジュグートを構築するに用い
られたｃｙｓ−ボムベシン調製物の純度を示すものであ
る。 第２９図は、本発明のｃｙｓ−ポムベシンーＡＤＨコン
ジュゲートのマススペクトル図である。 第３０図は、”５１−ＧＲＰを種々の濃度の本発明のａ
ｙｓ−ボムペシンーＡＬＣＭコンジュゲート、Ｃｙ８−
ボムペシン又はＧＲＰと一緒にインキユペーションし、
”Ｉ−ＧＲＰのＳｗｉｓｓ　３Ｔ３細胞への結合の阻害
率を測定丁ることからなるＳｗｉｓｓ　３Ｔ３細胞■お
げる競合結合アッセイ法の結果をグラフとして示丁もの
である。本アッセイ結果は、該細胞上のボムペシンレセ
プターへの該Ｃｖ８−ボムベシン−ＡＤＨコンジュグー
トによる結合活性は保持されていることχ示している。 第３１図は、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ法を用い
てＳＶＴ’ｊ：細胞に対丁る本発明のＣν８−ボムベシ
ンーＡｌ）Ｍコンジュゲートの細胞毒活性をグラフとし
て示丁ものである。該コンジュゲートは、該細胞に対し
遊離のＡＤＭまたはＡＤＭ−ＨＺＮに比較して非常に大
きた活性を示した。 第３２図は、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ法を用い
てのＢＣＴ　１　１　６細胞に対する本発明のｃｙｓ−
ボムペシンーＡＤＨ−コンジュゲートの細胞毒作用をグ
ラフで示すものである。 第３３図は　ｓＨ−チミジン取り込みアッセイ法配用い
てのＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対丁る本発明のＣν８−ボ
ムベシン−ＡＬＣＭコンジュグートの細胞毒作用をグラ
フで示すものである。 第３４図は、本発明のＥＧＦ−ＡＬ）Ｍコンジュゲート
調製物の純度な示丁ＨＰＬＣクロマトグラ７イー図であ
る。 第３５図は、＝Ｉ−ＥＧＦ　を、種々のｄ度の本発明の
ＥＧＦ−ＡＬＣＭコンジュゲートまたはＥＧＦと一緒に
インキユヘーションシ、Ｉ”ｌ−ＥＧＦｆ）Ａ４３　１
細胞ヘノ結合の阻害率を測定することからなるＡ４３１
細胞における競合結合アッセイ法の結果を示すグラフで
ある。本アッセイ結果は、該細胞上のＥＧＦレセプター
へのＥＧＦ−Ａｔ）Ｍコンジュゲートによる結合活性は
保持されていることを示している。 出　　願　　人　　ブリストルーマイヤーズ　スクィフ
カンパニー 代　　理 代　　理 代　　理 人 人 人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、それぞれのアントラサイクリンがＣ−１３位にケト
    基を有し且つリンカーアームを介して攻撃を受けるべき
    特定の細胞群の一つと反応性の抗体に結合しており、該
    リンカーアームは該アントラサイクリンの１３−ケト基
    の位置でアシルヒドラゾン結合によつて該アントラサイ
    クリンに共有結合しているところの該抗体に結合したほ
    ぼ４〜１０個のアントラサイクリン分子を含有すること
    を特徴とするイムノコンジユゲート。 ２、該リンカーアームがさらにジスルフィド結合または
    チオエーテル結合を含有している請求項１に記載のイム
    ノコンジュゲート。 ３、攻撃を受けるべき特定の細胞群の一つと反応性の抗
    体にリンカーアームを介して結合しているＣ−１３位に
    ケト基を有する少なくとも１個のアントラサイクリン分
    子を含有するイムノコンジユゲートにおいて、該リンカ
    ーアームが該アントラサイクリンの１３−ケト基の位置
    でアシルヒドラゾン結合によつて該アントラサイクリン
    に共有結合し且つさらにジスルフィド結合またはチオエ
    ーテル結合を含有していることを特徴とするイムノコン
    ジユゲート。 ４、該アントラサイクリンが、アドリアマイシン、ダウ
    ノマイシン、デトルビシン、カルミノマイシン、イダル
    ビシン、エビルビシン、エソルビシン、４′−ＴＨＰ−
    アドリアマイシン、ＡＤ−３２及び３′−デアミノ−３
    ′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−ドキソルビシ
    ンからなる群から選ばれたものである請求項１に記載の
    イムノコンジユゲート。 ５、該アントラサイクリンが、アドリアマイシンまたは
    ダウノマイシンである請求項１または３に記載のイムノ
    コンジュゲート。 ６、該抗体が、腫瘍細胞に反応性を有するものである請
    求項１または３に記載のイムノコンジュゲート。 ７、該抗体が、カルシノーマ、メラノーマ、リンホーマ
    、骨組織のザルコーマまたは軟組織のザルコーマに関連
    した抗原と反応性を有するものである請求項１または３
    に記載のイムノコンジュゲート。 ８、該抗体が、Ｂ細胞リンホーマに見出されるＣＤ３７
    抗原と反応するものである請求項１または３に記載のイ
    ムノコンジュゲート。 ９、該抗体が、モノクローナル抗体である請求項１に記
    載のイムノコンジュゲート。 １０、該抗体が、モノクローナル抗体５Ｅ９、３Ａ１、
    Ｌ６、Ｇ２８．１またはＧ２８．５であり、該アントラ
    サイクリンがアドリアマイシンである請求項１または３
    に記載のイムノコンジュゲート。 １１、アントラサイクリンが、Ｃ−１３位にケト基を有
    し且つリンカーアームを介して攻撃を受けるべき特定の
    細胞群の一つと反応性のリガンドに結合しており、該リ
    ンカーアームは該アントラサイクリンの１３−ケト基の
    位置でアシルヒドラゾン結合によつて該アントラサイク
    リンに共有結合しているところの該リガンドに結合した
    少なくとも１個のアントラサイクリン分子を含有するこ
    とを特徴とするアントラサイクリン−リガンド・コンジ
    ュゲート。 １２、該リガンドアームがさらにジスルフィド結合また
    はチオエーテル結合を含有している請求項１１に記載の
    コンジュゲート。 １３、該リガンドが、タンパク質、ポリペプチドまたは
    ペプタイド分子である請求項１１に記載のコンジュゲー
    ト。 １４、該リガンドが、ボムベシン、ＥＧＦ、トランスフ
    エリン、ガストリン、ガストリン−放出ペプチド、血小
    板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ−α、Ｖ
    ＧＦ、ＴＧＦ−β、インスリン及びインスリン様増殖因
    子 I 及びIIから成る群から選ばれたものである請求項
    １３に記載のコンジュゲート。 １５、該リガンドが、非ペプチド性のリガンドである請
    求項１１に記載のコンジュゲート。 １６、該リガンドが、炭水化物、ステロイド及びレクチ
    ンから成る群から選ばれたものである請求項１５に記載
    のコンジュゲート。 １７、該アントラサイクリンがアドリアマイシン、ダウ
    ノマイシン、デトルビシン、カルミノマイシン、イドル
    ビシン、エビルビシン、エソルビシン、４′−ＴＨＰ−
    アドリアマイシン、ＡＤ−３２及び３′−デアミノ−３
    ′−（３−シアノ−４−モルホリニル）−ドキソルビシ
    ンからなる群から選ばれたものである請求項１１に記載
    のコンジュゲート。 １８、該リガンドがボムベシンであり、該アントラサイ
    クリンがアドリアマイシンである請求項１１に記載のコ
    ンジュゲート。 １９、該リガンドがＥＧＦであり、該アントラサイクリ
    ンがアドリアマイシンである請求項１１に記載のコンジ
    ュゲート。 ２０、該リガンドがトランスフエリンであり、該アント
    ラサイクリンがアドリアマイシンである請求項１１に記
    載のコンジュゲート。 ２１、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、 Ｒ＾１は、ＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（
    ＣＨ＿２）＿３ＣＨ＿３またはＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（Ｏ
    Ｃ＿２Ｈ＿５）＿２であり：Ｒ＾２は、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
    式、表等があります▼であり、 Ｘ＝Ｈ、ＮＯ＿２またはハロゲン； Ｒ＾３はＯＣＨ＿３、ＯＨまたは水素原子であり；Ｒ＾
    ４はＮＨ＿２、ＮＨＣＯＣＦ＿３、４−モルホリニル、
    ３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４
    −メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベ
    ンジルアミン、シアノメチルアミン、または１−シアノ
    −２−メトキシエチルアミンで： Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素原子であり；Ｒ＾
    ６はＯＨまたは水素原子であり（但し、Ｒ＾５がＯＨま
    たはＯ−ＴＨＰの時Ｒ＾６はＯＨではない）； ｎは１〜１０の整数である） の化合物、または 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、 Ｒ＾１はＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（Ｃ
    Ｈ＿２）＿３ＣＨ＿３またはＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
    ＿２Ｈ＿５）＿２であり；Ｒ＿３はＯＣＨ＿３、ＯＨま
    たは水素原子であり；Ｒ＾４はＮＨ＿２、ＮＨＣＯＣＦ
    ＿３、４−モルホリニル、３−シアノ−４−モルホリニ
    ル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニ
    ル、ベンジルアミン、ジベンジルアミン、シアノメチル
    アミンまたは１−シアノ−２−メトキシエチルアミンで
    あり： Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素原子であり；Ｒ＾
    ６はＯＨ、または水素原子であり（但し、Ｒ＾５がＯＨ
    またはＯ−ＴＨＰである時Ｒ＾６はＯＨではない）；ｎ
    は１〜１０の整数である） の化合物、または 式 ▲数式、化学式、表等があります▼式III （上式中、 Ｒ＾１は、ＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（
    ＣＨ＿２）＿３ＣＨ＿３またはＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（Ｏ
    Ｃ＿２Ｈ＿５）＿２であり；Ｒ＾２は、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
    式、表等があります▼であり、 Ｘ＝Ｈ、ＮＯ＿２またはハロゲン； Ｒ＾３は、ＯＣＨ＿３、ＯＨまたは水素原子であり；Ｒ
    ＾４及びＲ＾７は独立に水素原子、アルキル、置換アル
    キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール
    、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルであ
    り；あるいはＲ＾４及びＲ＾７及びＮは一緒になつて任
    意に置換されていてもよい４〜７員の環を形成し； Ｒ＾５はＯＨ、ＯＴＨＰまたは水素原子であり；Ｒ＾６
    はＯＨまたは水素原子であり（但し、Ｒ＾５がＯＨまた
    はＯ−ＴＨＰの時Ｒ＾６はＯＨではない）； ｎは１〜１０の整数である） の化合物。 ２２、該化合物が、アドリアマイシン１３−｛３−（２
    −ピリジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン・塩酸
    塩（ＡＤＭ−ＨＺＮ）である請求項２１に記載の化合物
    。 ２３、該化合物が、１３−｛３−（メルカプトプロピオ
    ニル）｝アドリアマイシン・ヒドラゾンである請求項２
    １に記載の化合物。 ２４、式 ▲数式、化学式、表等があります▼式III （上式中、 Ｒ＾１は、ＣＨ＿３、ＣＨ＿２ＯＨ、ＣＨ＿２ＯＣＯ（
    ＣＨ＿２）＿３ＣＨ＿３またはＣＨ＿２ＯＣＯＣＨ（Ｏ
    Ｃ＿２Ｈ＿５）＿２であり；Ｒ＾２は、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
    式、表等があります▼であり、 Ｘ＝Ｈ、ＮＯ＿２またはハロゲンであり； Ｒ＾３は、ＯＣＨ＿３、ＯＨまたは水素原子であり；Ｒ
    ＾４及びＲ＾７は独立して水素原子、アルキル、置換ア
    ルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリー
    ル、置換アリール、アラルキル、または置換アラルキル
    であるか、あるいはＲ＾４及びＲ＾７及びＮは一緒にな
    り、任意に置換されていてもよい４〜７員の環を形成し
    ； Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素原子であり；Ｒ＾
    ６はＯＨまたは水素原子であり（但し、Ｒ＾５はＯＨま
    たはＯ−ＴＨＰである時Ｒ＾６はＯＨではない）；ｎは
    １〜１０の整数である） の化合物を製造するにあたり、 ａ）ω−（Ｒ＾２−ジチオ）カルボン酸のＮ−ヒドロキ
    シコハク酸イミドとヒドラジンとを反応させて、ω−（
    Ｒ＾２−ジチオ）カルボン酸ヒドラジド（式中Ｒ＾２は
    上記定義した通りのものである）を形成せしめ、 ｂ）該ヒドラジドと式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中 Ｒ＾１は、ＣＯＣＨ＿３、ＣＯＣＨ＿２ＯＨ、ＣＯＣＨ
    ＿２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ＿２Ｈ＿５）＿２またはＣＯＣＨ
    ＿２ＯＣＯ（ＣＨ＿２）＿３ＣＨ＿３であり；Ｒ＾３は
    、ＯＣＨ＿２、ＯＨまたは水素原子であり；Ｒ＾４は、
    ＮＨ＿２、ＮＨＣＯＣＦ＿３、４−モルホリニル、３−
    シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、４−メ
    トキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジベンジ
    ルアミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ−２−
    メトキシエチルアミンであり； Ｒ＾５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは水素原子であり；Ｒ＾
    ６はＯＨまたは水素原子であり（但し、Ｒ＾５がＯＨま
    たはＯ−ＴＨＰの時Ｒ＾６はＯＨではない） のアントラサイクリンとを反応させること から成ることを特徴とする方法。 ２５、該目的化合物を還元剤で処理して、１３−｛３−
    （メルカプトプロピオニル）｝アントラサイクリン・ヒ
    ドラゾンを形成せしめる付加工程を含んでいる請求項２
    ４に記載の方法。 ２６、ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とヒドラジンを反
    応せしめて、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル
    ・ヒドラジドを形成せしめ、次に ｂ）該ヒドラジドをアドリアマイシン塩酸塩と反応せし
    める工程 を含有し、アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリ
    ジルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤ
    Ｍ−ＨＺＮ）を得ることから成る請求項２４に記載の方
    法。 ２７、請求項１または３に記載のイムノコンジユゲート
    を製造するにあたり、 ａ）該抗体をチオール化剤と反応させ、次にｂ）該チオ
    ール化された抗体を請求項２１に記載のアシルヒドラゾ
    ンと反応させる工程から成ることを特徴とする方法。 ２８、該アシルヒドラゾンが、アドリアマイシン・１３
    −｛３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝ヒドラ
    ゾン塩酸塩（ＡＤＭ−ＨＺＮ）である請求項２７に記載
    の方法。 ２９、該チオール化剤が、Ｎ−スクシンイミジル−３−
    （２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）ま
    たは２−イミノチオラン（２−ＩＴ）である請求項２７
    に記載の方法。 ３０、請求項１または３に記載のイムノコンジユゲート
    を製造するにあたり、 ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ
    ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とヒドラジンとを反応さ
    せて、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル・ヒド
    ラジドを形成せしめ、次に ｂ）該ヒドラジドとアドリアマイシン塩酸塩とを反応せ
    しめて、アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジ
    ルジチオ）プロピオニル｝−ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ
    −ＨＺＮ）を形成せしめ、次に ｃ）アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジルジ
    チオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−ＨＺ
    Ｎ）を、チオール基が結合しており且つ攻撃を受けるべ
    き特定の細胞群の一つと反応性の抗体と反応せしめる工
    程から成ることを特徴とする方法。 ３１、請求項１または３に記載のイムノコンジユゲート
    を製造するにあたり、 ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ
    ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とヒドラジンとを反応さ
    せて、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル・ヒド
    ラジドを形成せしめ、次に ｂ）該ヒドラジドをアドリアマイシン塩酸塩と反応せし
    めて、アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−Ｈ
    ＺＮ）を形成せしめ、次に ｃ）該アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−Ｈ
    ＺＮ）を還元剤と反応せしめて、１３−｛３−（メルカ
    プトプロピオニル）｝アドリアマイシン・ヒドラゾンを
    形成せしめ、次に ｄ）該ヒドラゾンを、マレイミド基が結合しており且つ
    攻撃を受けるべき特定の細胞群のーつと反応性の抗体と
    反応せしめる工程から成る ことを特徴とする方法。 ３２、請求項１１に記載のアントラサイクリン・リガン
    ドコンジユゲートの製造にあたり、 ａ）該リガンドをチオール化剤と反応させ、次にｂ）該
    チオール化されたリガンドを請求項２１のアシルヒドラ
    ゾンと反応させる 工程から成ることを特徴とする方法。 ３３、該アシルヒドラゾンが、アドリアマイシン・１３
    −｛１３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル｝ヒド
    ラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−ＨＺＮ）である請求項３２に記
    載の方法。 ３４、請求項１１に記載のアントラサイクリン・リガン
    ドコンジユゲートを製造するにあたり、 ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ
    ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とヒドラジンとを反応さ
    せて、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラ
    ジドを形成せしめ、次に ｂ）該ヒドラジドとアドリアマイシン塩酸塩とを反応せ
    しめて、アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジ
    ルジチオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−
    ＨＺＮ）を形成せしめ、次に ｃ）該アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−Ｈ
    ＺＮ）を、チオール基が結合しており且つ攻撃を受ける
    べき特定の細胞群の一つと反応性を有するリガンドと反
    応せしめる工程から成ることを特徴とする方法。 ３５、請求項１１に記載のアントラサイクリン・リガン
    ドコンジユゲートを製造するにあたり、 ａ）Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ
    ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とヒドラジンとを反応さ
    せて、３−（２−ピリジルチオ）プロピオニルヒドラジ
    ドを形成せしめ、次に ｂ）該ヒドラジドとアドリアマイシン塩酸塩とを反応せ
    しめて、アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジ
    ルジチオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−
    ＨＺＮ）を形成せしめ、次に ｃ）該アドリアマイシン・１３−｛３−（２−ピリジル
    ジチオ）プロピオニル｝ヒドラゾン塩酸塩（ＡＤＭ−Ｈ
    ＺＮ）を還元剤で処理して、１３−｛３−（メルカプト
    プロピオニル）｝アドリアマイシン・ヒドラゾンを形成
    せしめ、次に ｄ）該ヒドラゾンを、マレイミド基が結合しており且つ
    攻撃を受けるべき特定の細胞群の一つと反応性を有する
    リガンドと反応せしめる 工程から成ることを特徴とする方法。 ３６、請求項１または３に記載のイムノコンジユゲート
    の少なくとも一つを有効成分として含有する特定細胞攻
    撃剤。 ３７、請求項１１に記載のアントラサイクリン・リガン
    ドコンジユゲートの少なくとも一つを有効成分として含
    有する特定細胞攻撃剤。 ３８、アントラサイクリンの１３−ケト基の位置でアシ
    ルヒドラゾン結合によつてアントラサイクリンに結合し
    且つ攻撃を受けるべき特定の細胞群に関連した同一また
    は異なる抗原、エピトープまたはレセプターと反応性を
    有する分子であり、該分子は少なくとも１個のアントラ
    サイクリン分子とリンカーアームを介して結合している
    ものからなる１種以上のコンジユゲートを有効成分とし
    て含有し、そのコンジユゲート各々のアントラサイクリ
    ンは同一または異なることを特徴とする特定細胞攻撃剤
    。 ３９、該薬剤が薬学的に許容しうる担体を含んでいる請
    求項３６に記載の剤。 ４０、該薬剤が薬学的に許容しうる担体を含んでいる請
    求項３７に記載の剤。 ４１、該特定細胞が、癌、悪性でない腫瘍、殺細胞性で
    ないウィルス感染症または病原性感染症のもの及び自己
    免疫疾患のものから成る群から選ばれたものである請求
    項３６に記載の剤。 ４２、該特定細胞が、癌、悪性でない腫瘍、殺細胞性で
    ないウィルス感染症または病原性感染症のもの及び自己
    免疫疾患のものから成る群から選ばれたものである請求
    項３７に記載の剤。
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