JP2004501171A - Ａ）臓器が移植された患者における活性化されたリンパ球への、ｂ）放射線療法を受ける患者における、癌細胞への放射線増感剤としての、ｃ）癌の診断および治療における薬物担体としてのビタミン結合タンパク質中の、細胞毒の標的指向型送達 - Google Patents
Ａ）臓器が移植された患者における活性化されたリンパ球への、ｂ）放射線療法を受ける患者における、癌細胞への放射線増感剤としての、ｃ）癌の診断および治療における薬物担体としてのビタミン結合タンパク質中の、細胞毒の標的指向型送達 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、Ａ）腎臓または心臓または骨髄細胞など、移植された組織の拒絶の原因であるリンパ球への；Ｂ）癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための非毒性の天然に存在する送達システムの使用；ならびにＣ）癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達、細胞毒の標的指向型送達に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願は、米国仮出願第６０／２１４，４２７号および第６０／２１４，３８８号ならびに第６０／２１４，３８９号に基づくものであり、それぞれ、その内容全体を、参照によって本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、Ａ）骨髄、腎臓、または心臓など、移植された組織の拒絶の原因であるリンパ球への、細胞毒の標的指向型送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、Ｂ）癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための、非毒性の天然に存在する送達システムの使用、ならびにＣ）癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達に関する。
【０００３】
【発明の背景】
Ａ）移植−免疫系は、免疫監視細胞（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｃｅｌｌ）として機能するリンパ球の集合体を含むように設計される（Ｃｏｈｎ、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｅｄ ＆ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ １９９８；１９：４７５）。これらの細胞は、細菌、ウイルス、または非自己抗原などの外来性の抗原を探しながら、体中を巡回する警察のように働く。
【０００４】
何千年も前、この監視細胞は、哺乳類の妊娠における問題を提起した。哺乳類の胎児におけるある種の細胞は、母親の血液と接触し、非自己抗原として拒絶された。この問題は、クローン除去、クローン麻痺、およびアポトーシスまたはプログラムされた細胞死などの耐性の特殊化された形式の発達によって解決され（Ｊｉａｎｇ ＆ Ｖａｃｃｈｉｏ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１６０：３０８６）、したがって、哺乳類が有性生殖を通して繁殖できるようになった。
【０００５】
しかし、免疫監視の問題は再び、医療への移植の導入の問題になった（Ｓｔａｒｚｌ ＆ Ｄｅｍｅｔｒｉｓ、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｅｄ ＆ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ １９９８；１９：４４１）。妊娠とは異なり、この問題は耐性の免疫的機序を適合させることによって解決されていない。その代わりに、臓器移植レシピエントに起こる拒絶反応を根絶するために、免疫抑制薬の製薬新時代が開かれた。
【０００６】
今日、免疫系を、非自己組織の移植片を受け入れるように操作または設計することは依然として不可能であるので、よりいっそう強力かつ有毒な免疫抑制薬が、作られるべきである。１９９９年だけで、免疫抑制薬のアメリカ合衆国市場は、総売上高が十億ドルをわずかに上回った（ＭＩＳ Ｈｅａｌｔｈ−ＭＩＤＡＳからのデータ）。実際、臓器の生存時間によって判断されるものとしての移植の結果は、免疫抑制療法の結果として向上し続けていると言えるに違いないが、こうした治療法は、治療が足りないことによる拒絶と、治療が過ぎることによる感染症または悪性病変との間の微妙なバランスである（Ｂｅｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｔｉｄｓ Ｄｅｎ Ｎｏｒｓｋｅ Ｌａｅｇｅｆｏｓｅｎ １９９９；１１９：３６１５）。
【０００７】
リンパ腫は、免疫抑制された移植レシピエントにおいて最もよく見られる腫瘍であり、移植前、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）に対して血清反応陰性であるレシピエントにおいて、その発病率は３０％程にもなる（Ｓｗｉｎｎｅｎ、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ ２０００；１１（ｓｕｐｐｌ １）：４５）。サイトメガロウイルス感染症もまた、腎臓移植レシピエントにおいてよく見られ、ある研究では、移植後６カ月で、３８％の累積感染率に達する（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）Ｐｒｏｃ １９９９；３１：１２５５）。感染症による死亡率は低下しているが、免疫抑制された臓器移植レシピエントにおいて、最初の１年を十分に超えて蔓延する菌類および原生動物を含む主な死因は、残っている（Ｍａｔｔｈｅｗ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ １９９９；３１：１１０２）。最終的に、これらの患者においては、白内障、振戦、歯肉過形成、および体毛の異常成長（ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ）を含めて、薬物毒性による多くの合併症が存在する（Ａｌｍａｎａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒａｃ １９９８；３１：２５１９）。
【０００８】
要約すると、免疫抑制薬は、臓器を移植された患者の死亡率および罹病率の多くの原因であるが、これらの薬物は、慢性拒絶反応および臓器不全の問題を遅らせるので、使用され続けるであろう（Ｈａｓｓｅｌｄｅｒ、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｎｕｒｓｅ １９９９；１４：７７１）。
【０００９】
慢性関節リウマチ、甲状腺疾患、および糖尿病など、自己免疫疾患と考えられている疾患を含めて、免疫疾患は、免疫拒絶の原因である細胞によって引き起こされる。免疫抑制薬は、移植片の非自己抗原に対する免疫拒絶反応を抑えるために使用される（Ｈａｌｌｏｖａｎ、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ １９９７；３１３：２８３）。免疫拒絶反応の原因である細胞が、除去されるならば、患者を免疫抑制薬で治療する必要はなくなる。このことは、免疫疾患の治療のための新しい扉を開く。
【００１０】
Ｂ）放射線療法。化学療法、外科手術、および放射線療法は、３つの主な癌治療の要素である。放射線療法は、すべての癌患者の６０％以上に、疾患の経過の間のいずれかの時点で使用される（Ｄｕｎｎｅ−Ｄａｌｙ、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ．１９９９；１５：２５０）。これは、放射線物理学、コンピュータ断層撮影などにおける知識の発展のおかげで、重要な治療法になってきている。放射線療法における基本的な課題の１つは、正常細胞を残しながら、腫瘍細胞のみ殺すことである（Ｊｏｅｎｓｕｕ ＆ Ｔｅｎｈｕｎｅｎ、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ １９９９；３８（Ｓｕｐｐｌ １３）：７５）。過去２０年の間、非常に様々な薬剤が、癌細胞に放射線を送達する能力について研究されてきた（Ｎｏｒｍａｎ Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ、１９９８；４２：７８７）。こうした薬剤は、放射線増感剤と呼ばれる。放射線療法中に正常な組織を保護する薬剤もある。これらは、放射線防護剤と呼ばれる。
【００１１】
放射線増感剤は、妥当な場所で、妥当な時間、妥当な濃度でなければならない。問題は、ほとんどの有効な放射線増感剤の多くはまた有毒でもあるということである。シスプラチンは、有毒であるが強力な放射線増感剤の例である（Ｍｏｎａｇｈａｍ、Ｌａｎｃｅｔ １９９９；３５３：１２８８）。選択的送達システムがないために、妥当な場所での妥当な量の放射線増感剤の集中が困難になり、そのため、放射線療法の有効性に深刻な制限がもたらされる。
【００１２】
Ｃ）薬物送達。薬物送達システムは、通常、装置（例えばインシュリンポンプなど）、あるいは消化管、尿生殖路、または血液循環などの主な解剖学的区画に薬物を徐々に放出するように設計された様々な担体を使用する。例えば、リポソームは、薬物を血液循環に放出するように設計された送達システムである。こうしたシステムの問題は、それが、薬物を特異的な細胞に送達するように設計されていないことである（Ｓｃｈａｌｌｙ ＆ Ｎａｇｙ、Ｅｕｒｏｐ Ｊ Ｅｎｄｏｃｔｉｎｏｌ １９９９；１４１：１）。その結果、薬物は無差別に送達される。この無差別送達が原因で、より大用量の薬物を使用しなければならない。癌などの疾患では、より多い用量の薬物の使用は、薬物毒性の深刻な臨床上の問題を引き起こす。事実、癌患者はしばしば、薬物治療の副作用よりもむしろ薬物の癌への影響に苦しむ。それにもかかわらず、癌治療において現在考えられていることは、より多くの薬物を使用することである。例えば、「ｔｈｅ ７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９９）ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｐａｇｅ ２７８）」は、「かなりの前臨床データおよび臨床経験では、最大限に有効な治療は、最大限に耐えうる量あるいは致死量を超えるに等しい用量の化学療法剤が投与された場合に実現されるという仮説が支持される」と記載している。最大限に耐えうる量あるいは致死量を超える用量の化学療法剤を与えることの犠牲は、非常な苦痛と許容できない生活の質である。苦痛および許容できない生活の質は、薬物毒性によって引き起こされる。
【００１３】
薬物毒性の問題は、抗癌剤を正常細胞にではなく癌細胞だけに送達する薬物送達システムが、開発されれば解決されるであろう。この課題への１つの手法は、癌細胞だけに存在する抗原を認識し、その抗原と反応する、薬物を載せた抗体の使用を介している。多くのこうした抗原が存在し、そのうちのいくつかは、癌治療の事例において使用されている。
【００１４】
例えば、トランスフェリン受容体抗原は、癌細胞の表面に存在するが、ほとんどの正常細胞の表面には存在しない（Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ１９９５；７６：２０）。したがって、制癌剤を、抗トランスフェリン受容体抗体に結合させ、脳癌を患う患者に薬物を送達するために使用している（Ｌａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １９９７；４１：１０３９）。リンパ腫を患う患者において、同位体で標識した抗体を用いて、同様の研究が行われている（Ｖｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２０００；３８：９１）。抗体が仲介する、薬物送達へのこの手法には、いくつかの深刻な問題がある。例えば、これらの抗体は、実験動物中で産生され、ヒトなどの他の種に与えられた場合、望ましくない反応が起こる可能性がある（Ｍｕｒａｓｚｋｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８３；５３：３７５２）。
【００１５】
癌における薬物送達の課題へのより合理的な手法は、癌細胞上の受容体に対する通常のリガンドでもある薬物担体を設計することである。リガンドは、特定の受容体に独自の適合性を示す分子であり、特定の錠に唯一適合する鍵に例えられる。この手法の必要条件は、その受容体が癌細胞の表面に存在し、正常細胞の表面には存在しないことである。こうしたものの例には、血液中で鉄の輸送を担うタンパク質リガンドを結合するトランスフェリン受容体がある。このタンパク質リガンドは、抗癌剤を担持するように改変され、このリガンド−受容体薬物送達システムの効果は、急性白血病を患う患者において示されている（Ｆａｕｌｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９０；２：５７）。
【００１６】
また、この薬物を担持するリガンドは、いくつかの異なるタイプの化学結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）を介して、いくつかの異なるタイプの抗癌剤（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６、ａｎｄ Ｂｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９８；４１：２７０１）を担持する能力があることが示された。しかし、この手法は、鉄などの重金属の輸送に関与するタンパク質リガンドの使用に限られる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の一目的は、骨髄、腎臓、または心臓などの移植された組織の拒絶の原因であるリンパ球への細胞毒の標的指向型送達を実現することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための非毒性の天然に存在する送達システムの使用を実現することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達を実現することである。
【００２０】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下で述べる好ましい実施形態の詳細な説明に記述する通り、本発明によって実現される。
【００２１】
【課題を解決する手段及び発明の実施の形態】
本発明は、標的細胞への標的指向型送達のためのいくつかの機構を提供する。
【００２２】
Ａ）移植。本発明の一実施形態では、移植レシピエントにおける拒絶反応の原因である免疫細胞は除去される。このことは、非自己認識反応がレシピエントのリンパ球上のＴ細胞受容体、ならびに、ドナー細胞上の抗原と主な組織適合性複合体との組合せによって仲介されるという知見によって支持される（Ｔｕｒｖｅｙ ＆ Ｗｏｏｄ、Ｉｎｔ Ｓｕｒｇ １９９９；８４：２７９）。ドナー細胞とレシピエント細胞が出会うと、この認識反応は、細胞の増殖およびトランスフェリン受容体の上方制御を引き起こす共刺激反応を伴う（Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔ ＆ Ｈｏｙ、Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９１；４７：１４０）。トランスフェリン受容体の上方調節が細胞の増殖と関連する証拠は、トランスフェリン受容体がトランスフェリン受容体に対する抗体によって遮断された場合に、増殖が起こらないことである（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ １９９８；６４：１９）。トランスフェリン受容体に対する抗体はまた、ドナー細胞に対するレシピエント細胞の認識反応も遮断し（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；７：１３１）、遺伝学的に適合しないレシピエントにおける移植された心臓の生存を延長する（Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９９；６８：１３６９）。したがって、トランスフェリン受容体が、移植レシピエントがその移植片を埋め込む免疫拒絶反応において重要であることは明白である。
【００２３】
身体からＴリンパ球を一掃する免疫生物学は、アポトーシスとして知られたプロセスによって、プログラムされた細胞死の経路を開始することである（Ｐｉｎｋｏｓｋｉ ＆ Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆ １９９９；６：１１７４）。これは、胸腺において、あるいは末梢循環において起こすことができる（Ｌｅ Ｂｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１１：３７３）。アポトーシスの機構はいくつかあるが、それらはすべて、選択された細胞を身体から排除するように機能する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＆ Ｋｒａｕｓ、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８：５２７）。本発明は、レシピエントの免疫監視Ｔリンパ球を、それが、移植片のドナー抗原と出会った後、ただしそれが増殖して、移植片を攻撃し、最終的に移植片の拒絶の原因であるＴリンパ球のクローンを産生する前に排除するための新規の方法である。この手法の戦略は、アポトーシスを介するクローン除去によって、ドナーの特異的な免疫監視リンパ球を排除することであり、そうすれば、Ｔリンパ球のクローンの拒絶は起こらず、移植片を保護するための免疫抑制の必要はなくなるであろう。これと同じ戦略は、甲状腺、脳、関節、またはインシュリン産生細胞に対する特異性をもつものなど、自己免疫性のリンパ球の排除に適用することが可能であり、そうすれば、Ｔリンパ球の自己反応性のクローンは存続せず、再び免疫抑制療法を必要とすることなく自己免疫疾患は軽減されるであろう。
【００２４】
本発明は、レシピエントが移植片を受け入れた後、ただし細胞が増殖して細胞のクローンを形成して移植された臓器を拒絶する前の移植レシピエントにおける、免疫監視Ｔリンパ球への細胞毒の標的指向型送達のために使用される薬物−タンパク質複合体である。この薬物−タンパク質複合体中のタンパク質はトランスフェリンであり、また標的細胞上の受容体はトランスフェリン受容体であり、これは患者の免疫監視Ｔリンパ球前駆体の表面に上方調節されるので、本発明において、薬物の標的指向型送達が可能となる。さらに、薬物−トランスフェリン複合体中の薬物は、メトトレキサートであり得るが、これは活性化された末梢Ｔリンパ球のアポトーシスおよびクローン除去を引き起こすことが知られている（Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９８；１０２：３２２）。癌細胞（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ １９８４；４６：２１７）、感染細胞（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７；２３８：３０５）、および抗原により刺激されたＴリンパ球（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｌｅｕｋ ｂｉｏｌ １９９８；６４：１９）の表面に存在するのとは異なり、トランスフェリン受容体は、通常、正常な、成熟した休止細胞の表面には存在しない（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６）。したがって、細胞は、移植された臓器中の細胞には影響を与えず、メトトレキサート−トランスフェリン複合体によって排除されるべきレシピエント細胞のみ、拒絶する細胞のクローンに広がる機会をもつ前に、免疫監視Ｔリンパ球となる。
【００２５】
免疫抑制薬を使用せずに移植片の生存を延長するための標的指向型薬物送達の本発明を実現する方法は、血液中で鉄を担持するトランスフェリンの使用に焦点を当てることである。トランスフェリンは血漿からの分離によって、あるいは供給業者から、あるいは組み換え技術から得ることができる（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：２４０６６）。薬物−タンパク質複合体を形成するために、トランスフェリン分子は、細胞増殖抑制薬と結合されるように調製する方法で改変しなければならない。この薬物は、メトトレキサートなどのアポトーシス・イニシエーター、アドリアマイシンなどの細胞障害性抗生物質、またはタキソールなどのアルキル化剤などであってもよいが、リシンなどの植物毒素、改変されたジフテリア毒素などの細菌性の突然変異毒素を含めて、細胞に対して有毒な任意の化合物も使用できる（Ｌａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９７；４１：１０３９）。トランスフェリンを他の化合物と結合させるために、グルタルアルデヒド結合（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９３、３００：３５６）、ジスルフィド結合 （Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９９３；８４：１９１）、およびベンゾイルヒドラゾン結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）などのいくつかの結合プロセスが使用されており、本発明の実施形態においても使用することができる。腫瘍造影のために同位体をトランスフェリンに結合する架橋として、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）結合も使用することができる。広く様々な結合手順により、広範囲の細胞毒のトランスフェリンへの複合が可能になり、細胞毒のトランスフェリン分子との永久的または分離可能な結合がもたらされる。結合反応の後、薬物−タンパク質複合体は、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析手順を使用することによって、未結合の薬物および遊離のタンパク質から分離することができる。
【００２６】
複合手順の技術の詳細は変わりうるが、いずれの手順にも必要なことは、癌細胞を用いた結合実験および死滅実験において活性であり、それほどの数の正常細胞を結合せず殺しもしない、定義された複合体を調製することである。これらの必要条件に照らすと、適当な手順は、トランスフェリン（０．５ｍＭ）１ミリリットルを１ミリリットルのアドリアマイシン（８．５ｍＭ）（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と４分間混合し、次いで１ミリリットルの２１．５ｍＭ グルタルアルデヒド（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）を加え、４分間混合するものである。前述の反応は結合手順であり、これを、０．８ミリリットルの３７．２ｍＭ エタノールアミン（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）を加えることによって停止させ、４分間ボルテックスする。次いでこの混合物（３．８ミリリットル）を透析管（分子量のカット・オフ１２，０００〜１４，０００）に移し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水０．５リットルに対して、暗中で、５℃で３時間透析する。この透析は、新しいＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水を用いて少なくとも１回繰り返すべきである。次いでこの混合物を４℃で、１６００ｇで１０分間遠心し、上清を、あらかじめＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水中で平衡化し、ブルーデキストラン、トランスフェリン、およびシトクロムＣを用いて５℃で較正したセファロースＣＬ−４Ｂの２．６×３４ｃｍカラムで、流速２２ミリリットル／時間でクロマトグラフィーにかける。カラムからの溶離を、２８０ｎｍでモニターし、３．８ミリリットルの分画を収集する。各分画中のトランスフェリンおよびアドリアマイシンの濃度を、トランスフェリンについては２８０ｎｍ、アドリアマイシンについては２９５ｎｍを用いて求めたトランスフェリンおよびアドリアマイシンについての検量線からの逐次近似法によって算出する。少し改変を加えれば、この結合手順を使用して、例えばメトトレキサートのトランスフェリン複合体、またはシクロスポリンなど免疫抑制薬のトランスフェリン複合体など、他の細胞毒のトランスフェリン複合体を調製することができる。
【００２７】
純粋な薬物−タンパク質複合体を単離したら、それをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特徴付けて分子量を求め、タンパク質１分子あたりの薬物分子の数を求めるべきである。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験は、機能性薬物：タンパク質の比が、タンパク質１分子あたり薬物２〜３分子であることを示している（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６）。しかし、本発明を用いると、タンパク質１分子あたり薬物１分子未満の比が有効であり得る。本発明の実施における次の好ましい２つのステップは、（ａ）複合体が、活性化されたＴリンパ球の表面の受容体と結合し、休止Ｔリンパ球に結合しないかどうか判定すること、および（ｂ）複合体が、活性化されたＴリンパ球を殺し、休止Ｔリンパ球を殺さないかどうか判定することである。結合研究は、フローサイトメトリーを使用することによって行うことができ、殺滅試験は、同じ数の活性化されたＴリンパ球を殺すのに必要な薬物−タンパク質複合体中の薬物の濃度と比較して、活性化されたＴリンパ球の培養株の５０％を殺すのに必要な遊離の薬物の濃度を求めるための微量培養技術を使用することによって行うことができる。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験では、同じ数のＴリンパ球を殺すために、薬物−タンパク質複合体中の薬物と比較して、約１０倍以上の遊離の薬物が必要であるということが示される。しかし、本発明を用いると、遊離の薬物単独に比べて、２０分の１、さらには１００分の１の薬物−タンパク質複合体中の薬物が有効であり得る。複合体が効果的であるためには、ごく最低限の活性化されていないリンパ球が殺されても構わない。
【００２８】
本発明を送達タンパク質であるトランスフェリンに関して述べてきたが、細胞の受容体部位に結合する能力がある他のタンパク質が、体内に存在することが知られている。受容体部位が、腫瘍細胞中で活性化され、正常な休止細胞中で不活性であるならば、こうした受容体部位に結合するいずれのタンパク質または他の化合物も、本発明の細胞増殖抑制薬を送達するために使用できる。こうした他のタンパク質の１つの例は、ヒトの体内の細胞にビタミン類、特にビタミンＢ１２を送達するするトランスコバラミンである。また、ビタミンの葉酸の薬物複合体もこの能力で使用されている（Ｒｅｄｄｙ ＆ Ｌｏｗ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒ Ｓｙｓ．１９９８；１５；５８７）。
【００２９】
薬物−タンパク質複合体を調製し、精製し、特徴付けし、細胞への結合特性および細胞の死滅特性について確認した後、結合実験および死滅実験により、複合体が、活性化されたＴリンパ球と結合し、これを殺すが、休止または活性化されていないリンパ球は結合もしないし死滅もさせないことが示される場合、この複合体を、動物研究のために分取し、滅菌することとなる。滅菌プロセスは、例えばセシウム照射装置を使用するなど、照射にさらすことによって行うことができるし、ミリポア濾過技術を使用することによって行うこともできる。滅菌した複合体が手に入ったら、第１に、これを臨床研究の設計において使用される薬物動態および安全性のパラメータを求めるために、動物研究で使用することとなる。
【００３０】
移植を受けたレシピエントにおける活性化されたＴリンパ球のクローン除去を開始するように設計された第１の薬物−タンパク質複合体の調製方法は、前段に述べている。その概括的な本質は、特に臓器拒絶の原因である細胞への細胞毒の標的指向型送達のために設計された第１の薬物−タンパク質複合体を試験することであり、その目的は、活性化されたＴリンパ球のクローン除去を開始して、患者における免疫抑制の延長の必要をなくすことである。科学および／または社会に対するベネフィットは、移植を、有害かつ有毒な免疫抑制薬の使用を延長せずに行うことができ、移植後に、より許容できる生活の質を保つことができるという情報である。リスクは低く（例えば、毒性なし）、可能なベネフィットは高い（例えば、免疫抑制を延長して使用せずに機能的な移植を保持する）ので、リスク／ベネフィット比は非常に好都合である。したがって、本発明の実施形態は、臓器が移植された患者における、活性化されたＴリンパ球に担持される細胞毒の第１の標的指向型送達を記述する。この手法の目標は、現在の長期の免疫抑制の必要をなくすことである。
【００３１】
Ｂ）放射線療法。本発明の他の実施形態は、癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための非毒性の天然に存在する送達システムの使用に関する。本発明のこれらの実施形態はまた、血液中で循環し、表面にトランスフェリン受容体を発現している細胞に鉄を送達するする糖タンパク質であるトランスフェリンを使用することもできる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＆ Ｐｏｎｋａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７．１３３１：１）。トランスフェリン受容体は、癌細胞の表面で継続的に発現する増殖マーカーである（Ｆａｕｌｋ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ １９８０；２：３９０：Ｋｅｍｐ，Ｈｉｓｔｏｌ ＆ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ １９９７；１２：２９１）。本発明の先の実施形態について上で述べた通り、腫瘍細胞は、その表面に、多数（１０４〜１０６個／細胞）のトランスフェリン受容体を発現しているが、正常細胞は、その表面にこうした受容体をめったに発現しない（Ｋｌａｕｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １９９３；７２：１９）。
【００３２】
放射線増感剤の標的指向型送達のための担体としてのトランスフェリンの使用は、実質上癌細胞のみへの高濃度の放射線増感剤の送達を可能にし、したがって、シスプラチンなどの毒性を有する増感剤の場合に重要であり、より低用量の放射線増感剤の使用が可能になる。放射線増感剤のための標的指向型送達の使用はまた、正常細胞への副次的なダメージも減らし、それによって正常細胞を残し、正常な組織にその生理機能を持続させることができる。本発明の最終的な効果は、放射線療法の結果を向上すること、および、毒性による副作用を減らすことである。これは、副作用を減らし、癌患者の生活の質を向上することとなる。
【００３３】
血管新生、シグナル伝達、アポトーシスなど、細胞の異なるプロセスに作用する広範囲の放射線増感剤がある。放射線増感剤のこうした多様性の理由は、放射線ダメージが、組織に特異的であることである（Ｗｉｔｈｅｒｓ ＆ ＭｃＢｒｉｄｅ ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｅｄ ３）、ｐ．７９、１９９８）。さらに、癌細胞の生物学が変化し、これによりしばしば、放射線および他のタイプの薬物療法に対する耐性の発達がもたらされる。しかし、感受性が高く耐性のある細胞は、その表面に多数のトランスフェリン受容体を発現している（Ｂａｒａｂａｓ ＆ Ｆａｕｌｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ １９９３；１９７：７０２）。トランスフェリンのその受容体への結合は、リガンド−受容体複合体のエンドサイトーシスを引き起こすので、トランスフェリンは、表面にトランスフェリン受容体がある細胞に化合物を送達するための理想的な分子である（Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒｏ Ｊ Ｃａｒｄｉｏ−Ｔｈｏｒ Ｓｕｒｇ １９９８；１３：４６０；Ｂｒｏｏｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒ Ｎｅｕｒｏｌ １９９６；１４２：４７）。
【００３４】
トランスフェリンは、薬物感受性があり薬物耐性がある癌細胞に化合物を送達するためのすばらしい担体であるので、本発明において好ましい標的指向型送達システムは、放射線増感剤を結合させたトランスフェリンからなるものである。ヒト患者において使用するためのトランスフェリンは、（例えばＦｉｎｎｉｓｈ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから）市販品として入手できる。トランスフェリンを他の化合物と結合させるためには、グルタルアルデヒド結合（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９３、３００：３５６）、ジスルフィド結合（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９３；８４：１９１）、およびベンゾイルヒドラゾン結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）などのいくつかの結合プロセスが使用されている。広く様々な結合手順により、トランスフェリンへの広範囲の放射線増感剤の複合が可能になり、放射線増感剤のトランスフェリン分子との永久的または分離可能な結合がもたらされる。結合反応に続いて、集約的（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）透析の後、複合体は、クロマトグラフィーまたは透析手順によって未結合の成分から分離するべきである。シスプラチンは好ましい放射線増感剤であるが、その他の公知の放射線増感剤も、それと置換することができる。
【００３５】
トランスフェリンの放射線増感剤との複合体が調製された後、それを、トランスフェリン複合体を調製するために、使用した放射線増感剤の生理化学特性に応じて、他の方法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによる例のように、分子量について特徴付けることができる。これに続いて、複合体の癌および正常細胞に結合する能力を決定するためのフローサイトメトリーを使用する結合研究を行うことが可能である。癌細胞に結合し、正常細胞に結合しない複合体のみが、薬物感受性があり薬物耐性がある癌細胞を使用する放射性毒性分析のために選択されることが好ましい。
【００３６】
放射性毒性分析には、ＭＴＴテトラゾリウム比色定量分析を利用し（Ｖｉｓｔｉｃａ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９４；５１：２５１５）、これにより、トランスフェリン−放射線増感剤の最も強力な比、および薬物感受性があり薬物耐性がある細胞の最大の放射線増感に対する複合体の最適濃度が示されることとなる。細胞結合研究および死滅研究から選択された複合体は、臨床研究の設計において使用される前に、薬物動態および安全性のパラメータを求めるために、動物研究で使用することができる。これは、ヌードマウスにおいて異種移植されたヒト腫瘍細胞として行うことができる。本発明の目的は、放射線増感剤を癌細胞のみに送達する構想を導入することであり、これは放射線療法の結果の実質上の向上を提供することとなる。
【００３７】
トランスフェリンの放射線増感剤との複合体を、ステージが明確である正確に診断された癌を患う患者に使用することができる。このトランスフェリン−放射線増感剤複合体は、遊離の放射線増感剤のみが与えられた場合に使用される用量の１０分の１、好ましくは２０分の１、さらには１００分の１の用量で静脈内に投与できる。複合体の投与後、通常量の放射線を使用して、患者に放射線治療を施すことができる。放射線治療の後、患者および対照の生化学的パラメータ、細胞のパラメータ、および放射線学的パラメータを解析して本発明の効果を判定することができる。
【００３８】
本発明を、放射線増感剤の標的指向型送達のための担体としてのトランスフェリンに関して述べてきたが、他のタンパク質または化合物、例えば、癌細胞上の受容体に特異的に結合する能力がある任意の他のタンパク質（例えばトランスコバラミン）や他の化合物なども使用できることを理解されたい。受容体は、腫瘍細胞において活性化され、正常な休止細胞においては実質上不活性であるような性質であるものであるべきである。放射線増感剤は、複合された場合、あるいは癌細胞に送達された場合にでもその放射線増感特性を保持しているべきであり、トランスフェリンまたは他のタンパク質または他の化合物は、複合体中でも、上で述べた細胞の受容体に結合する能力を保持していなければならない。
【００３９】
リスクは、放射線増感剤を単独で使用するよりも、担体システムを使用するほうがはるかに小さい。リスク・ベネフィット比は非常に好都合である。投与された、より低濃度の放射線増感剤は、癌細胞においては局所的に、より高濃度の放射線増感剤をもたらすが、正常細胞はそれを免れる（ｓｐａｒｅ）こととなる。この分布は、放射線療法の有効性を増大させることとなる。トランスフェリン放射線増感剤複合体は、腫瘍を放射線に対して増感させるだけでなく、腫瘍の位置およびサイズの決定にも役立つこととなる。本発明は、抗体を使用しないので、アナフィラキシー反応、パッチ−キャップ分泌反応、および抗原変異などの抗体送達システムに存在する問題が存在しない。トランスフェリン標的指向型送達システムを使用することにより、より低い用量の毒性のある放射線増感剤を投与することが可能になり、毒性による副作用が減少する。したがって、本発明は、癌患者の生活の質および生存期間を向上することとなる。
【００４０】
Ｃ）薬物送達。本発明のこの実施形態は、癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達に関する。本発明のこの態様は、薬物の標的指向型送達への新たな手法である。この手法は、葉酸（Ｒｅｄｄｙ ＆ Ｌｏｗ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｔ Ｓｙｓ １９９８；１５：５８７）、ビタミンＢ１２（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ、Ｖｉｔａｍｉｎｓ ＆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ２０００；５９：３３７）などのビタミン類を普通に担持する血液タンパク質を使用する。本発明は、癌細胞上のトランスコバラミン受容体の改変に関する。
【００４１】
トランスコバラミンは、表面にトランスコバラミン受容体がある細胞にビタミンＢ１２（コバラミン）を送達し、そこではビタミンＢ１２は、受容体が仲介するエンドサイトーシスを介して、細胞に移入され、ホモシステインのメチオニンへの転換に利用される（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ １９９９；１９：１７３）。生物学的に活性なこの受容体は、細胞膜中の１２４ｋＤａの非共有結合による二量体として機能し（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｕｔｒ １９９９；１２９：１７６１）、この受容体に対する抗体が、細胞増殖を遮断する（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８；３０：１０１）。
【００４２】
実験研究は、細胞膜内でのトランスコバラミン受容体発現の調節は、受容体が増加する場合細胞増殖と、受容体が減少する場合細胞分化と相関することを示している（Ａｍａｇａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １９９０；７６：１３８０）。トランスコバラミン受容体は、癌細胞に特有である（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＆ Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９９７；３８：７１７、ａｎｄ Ｆｉｓｋｅｒｓｔｒａｎｄ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８；２７３：２０１８０）。したがって、トランスコバラミンの抗癌剤との結合は、薬物に対する標的指向型送達システムを提供することとなる。
【００４３】
葉酸についても同様の受容体機構が報告されているので（Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９９；３６６：１８３、ａｎｄ Ｔｒｉｐｌｅｔｔ ＆ Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９９；１１：３）、癌における標的指向型送達の使用は、ビタミンＢ１２に限定されない。実際、抗癌剤を担持するための、本発明者らによって既に述べたトランスフェリン以外に、腫瘍細胞において活性化され、正常細胞においては不活性あるいは比較的不活性である細胞表面の受容体に結合する任意のタンパク質または他の物質が、腫瘍細胞に任意の腫瘍薬物を送達するための複合手順を介して利用可能である。これらの他のタンパク質または他の化合物は当然、人体において薬理学的に許容され、複合後もこうした受容体に結合する能力を保つ。
【００４４】
当然、腫瘍細胞にこのように送達される抗癌剤または抗癌薬は、こうした細胞を殺す能力を保持していなければならない。好ましい抗癌剤は、腫瘍の治療のために認可されている薬物である。上で述べたアドリアマイシンやタキソールの他に、こうした薬物には、シスプラチンやメトトレキサートなどのこうした別種の化合物が含まれる。
【００４５】
トランスコバラミンを抗癌剤と結合させるためには、いくつかの技術を使用することができる。トランスフェリンを他の化合物と結合させるためには、グルタルアルデヒド結合（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９３、３００：３５６）、ジスルフィド結合（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９３；８４：１９１）、およびベンゾイルヒドラゾン結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）などのいくつかの結合プロセスが使用されている。類似の結合プロセスを使用して、本発明の複合体を生成することができる。広く様々な結合手順により、広範囲の抗腫瘍薬のトランスコバラミンまたは他の輸送薬への複合が可能になる。結合反応に続いて、集約的透析後、クロマトグラフィーまたは透析手順によって、結合した成分から、複合体を分離するべきである。
【００４６】
抗癌剤に結合させた、ビタミンを担持するリガンドの使用は、より低用量の薬物を用いる治療プロトコルを可能にすることとなり、また、正常細胞を残し、より少量の薬物を使用することによる組み合わされた効果により、薬物毒性は低くなり、癌患者の生活の質を向上することとなる。細胞表面上にあるどんな受容体も、癌細胞よりも正常細胞への効果が大きい外来性のビタミンＢ１２の投与によって下方制御されるので、正常細胞および組織は、細胞毒による障害を免れる。トランスコバラミン受容体がコルチゾンによって調節されることを示唆するデータもあり（Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９５；３１０：９２３）、正常細胞によるトランスコバラミン受容体の提示の制御へのおそらく別の手法を提供する。
【００４７】
ビタミンを担持するタンパク質リガンドを用いた標的指向型薬物送達の本発明を実現する最良の方法は、ビタミンＢ１２、すなわちコバラミンを担持するトランスコバラミンＩＩの使用に焦点を当てることである。トランスコバラミンは、血漿からの分離によって、あるいは供給業者から、あるいは組み換え技術から得ることができる（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １９９７；８９：２３５）。トランスコバラミン分子は、抗癌剤と結合されるように調製する方法で改変しなければならない。抗癌剤は、アドリアマイシンまたはタキソールなどのアルキル化剤など、細胞障害性の抗生物質であってもよいが、リシンなどの植物毒素、改変されたジフテリア毒素など細菌性の変異毒素を含めて、細胞に対して有毒な任意の化合物も使用できる（Ｌａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９７；４１：１０３９）。結合反応に続いて、薬物−タンパク質複合体は、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析手順によって、未結合の薬物および遊離のタンパク質から分離できる。
【００４８】
純粋な薬物−タンパク質複合体を単離したら、それをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特徴付けて分子量を求め、タンパク質１分子あたりの薬物分子の数を求めるべきである。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験は、機能性薬物：タンパク質の比が、タンパク質１分子あたり薬物２〜３分子であることを示している（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６）。しかし、本発明の実施形態では、タンパク質１分子あたり薬物１分子未満のタンパク質比を使用することができる。
【００４９】
本発明の実施における次の好ましい２つのステップは、（ａ）複合体が、癌細胞の表面の受容体と結合し、正常細胞に結合しないかどうか判定すること、および（ｂ）複合体が癌細胞を殺し、正常細胞を殺さないかどうか判定することである。結合研究は、フローサイトメトリーを使用することによって行うことができ、死滅研究は、同じ数の癌細胞を殺すのに必要な薬物タンパク質複合体中の薬物の濃度と比較して、癌細胞の培養株の５０％を殺すのに必要な遊離の薬物の濃度を求めるための微量培養技術を使用することによって行うことができる。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験では、同じ数の癌細胞を殺すために、薬物−タンパク質複合体中の薬物と比較して、約１０倍以上の遊離の薬物が必要であるということが示される。本発明の実施形態では、２０倍、さらには１００倍の比を使用することができる。複合体が効果的であるためには、ごく最低限の正常細胞が殺されても構わない。
【００５０】
複合手順の技術の詳細は変わりうるが、いずれの手順にも必要なことは、癌細胞を用いた結合実験および死滅実験において活性であり、それほどの数の正常細胞を結合せず殺しもしない、定義された複合体を調製することである。これらの必要条件に照らすと、適当な手順は、トランスコバラミンＩＩ（．５ｍＭ）１ミリリットルを１ミリリットルのアドリアマイシン（８．５ｍＭ）（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と４分間混合し、次いで１ミリリットルの２１．５ｍＭ グルタルアルデヒド（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）を加え、４分間混合するものである。前述の反応は結合手順であり、これを、０．８ミリリットルの３７．２ｍＭ エタノールアミン（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）を加えることによって停止させ、４分間ボルテックスする。次いでこの混合物（３．８ミリリットル）を透析管（分子量範囲１２，０００〜１４，０００）に移し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水０．５リットルに対して、暗中で、５℃で３時間透析する。この透析は、新しいＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水を用いて１回繰り返すことができる。次いでこの混合物を４℃で、１６００ｇで１０分間遠心し、上清を、あらかじめＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水中で平衡化し、ブルーデキストラン、トランスコバラミンＩＩ、およびシトクロムＣを用いて５℃で較正したセファロースＣＬ−４Ｂの２．６×３４ｃｍカラムで、流速２２ミリリットル／時間でクロマトグラフィーにかける。
【００５１】
カラムからの溶離は、２８０ｎｍでモニターでき、３．８ミリリットルの分画を収集できる。各分画中のトランスコバラミンおよびアドリアマイシンの濃度は、トランスコバラミンおよびアドリアマイシンについての検量線からの逐次近似法によって算出できる。次いで、セファロースＣＬ−４Ｂカラムから収集した分画を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することができる。少しだけ改変を加えれば、この結合手順を他の制癌剤のトランスコバラミン複合体を調製するために使用することができ、この手順はまた、腫瘍イメージング、癌の診断、および治療中の癌塊のモニタリングで使用するための、放射標識したトランスコバラミンの抗癌複合体を調製するために使用することもできる。例えば、質的および量的腫瘍造影は、担体タンパク質（この場合はトランスコバラミン）に結合させた、ＤＴＰＡでキレート化した同位体を用いて行うことができる。
【００５２】
薬物−タンパク質複合体を調製し、精製し、特徴付けし、細胞への結合特性および細胞の死滅特性について確認した後、結合実験および死滅実験により、複合体が癌細胞を結合して殺すが、正常細胞には結合もしないし死滅もさせないことが示される場合、この複合体を、動物研究のために分取し、滅菌することができる。滅菌プロセスは、例えばセシウム照射装置を使用するなど、照射にさらすことによって行うことができるし（Ｙｃｋ ＆ Ｆａｕｌｋ、Ｃｌｉｎ−Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｙ １９８７；３２：１）、ミリポア濾過技術を使用することによって行うこともできる。滅菌した複合体が手に入ると、第１に、これを臨床研究の設計において使用される薬物動態および安全性のパラメータを求めるために動物試験で使用することができる。
【００５３】
この研究全体の目的は、癌治療プロトコルに、薬物の標的指向型送達の構想を導入することであり、この研究の目標は、標的指向型送達を通して薬物毒性をなくすこと、および、癌を患う患者の生活の質を向上することである。ビタミンを担持する血液タンパク質と抗癌剤からなる第１の薬物−タンパク質複合体の調製の方法は、前の段落に述べてきた。その概括的本質は、ビタミンを担持する血液タンパク質と抗癌剤からなる第１の薬物−タンパク質複合体を試験することであり、その目的は、癌患者への薬物の標的指向型送達の構想を発展させることである。得られるベネフィットは、患者の癌が、薬物毒性を加えることなく、癌塊を減少させる可能性を持って、治療されるであろうことである。副次的なダメージなしに、あるいはより軽い副次的ダメージで癌を治療することができ、治療中および治療後、癌患者の、より許容できる生活の質を保つことができる。本発明のリスク／ベネフィット比は低く（例えば、毒性なし）、可能なベネフィットは高い（例えば、寛解）ので、リスク／ベネフィット比は非常に好都合である。
【００５４】
この薬物−タンパク質複合体は、遊離の薬物について使用される用量の１０分の１（好ましくは２０分の１、さらには１００分の１）の用量で静脈内に投与できる。要約すると、本発明は、ビタミンを担持する通常の血液タンパク質によって癌細胞に担持される抗癌薬の標的指向型送達の第１の研究に関する。
【００５５】
本発明の有利な点は、様々な実施形態を、一緒に利用して、併用治療を使用できることであり、これは３つの場合（すなわち移植、放射線増感剤、およびトランスコバラミンの使用）のすべてにおいて適用することができる。ここでの戦略は、組合せおよび順列のプロセスである。例えば、移植において、アドリアマイシンなどの細胞毒のトランスフェリン複合体は、Ｔ細胞を殺すために使用できるが、シクロスポリンなどの免疫抑制薬のトランスコバラミン複合体は、免疫系を選択的に抑制するために同じ患者に同時に使用できる。このように、免疫学的に活性化された、あるいは同種異型的に活性化された細胞、すなわち移植の結果活性化された細胞だけが、その細胞の上方調節されたトランスフェリン受容体のせいで標的にされる。これらの細胞は、トランスフェリン受容体およびトランスコバラミン受容体の両方を通して攻撃する細胞毒と免疫を抑制する薬物の両方を用いて治療することができる。
【００５６】
さらに、一方では細胞毒（例えばアドリアマイシン）、他方では高エネルギーの同位体を用いて、同時に殺し、かつ造影する、あるいは同時に殺すために、担体の１つ（トランスフェリンまたはトランスコバラミン）は、細胞毒で、もう一方は同位体で標識することができる。
【００５７】
したがって、この併用療法は、異なる２種の受容体（すなわちトランスフェリン受容体およびトランスコバラミン受容体）を介して同じ細胞を標的にする。これを下のように数学的に表すことができる：
【００５８】
細胞毒性（薬物Ａ）／細胞毒性（薬物Ｂ）
細胞毒性（薬物Ｃ）／細胞毒性（同位体Ｄ）
細胞毒性（薬物Ｅ）／イメージング（同位体Ｆ）
【００５９】
上のモデルは、次のように展開できる：
トランスフェリン複合体Ａ／トランスフェリン複合体Ｂ
トランスフェリン複合体Ｃ／トランスコバラミン複合体Ｄ
トランスコバラミン複合体Ｅ／トランスコバラミン複合体Ｆ
【００６０】
細胞が活性化、感染症、癌などによって代謝的に攪乱される場合、その応答は、ある種の受容体（例えばトランスフェリン受容体、トランスコバラミン受容体など）を上方調節することであり、そうすると、特異的なリガンド（例えばトランスフェリン、トランスコバラミンなど）の標的となる。このリガンドを治療（例えば癌、感染症、移植、自己免疫病など）または造影（例えば癌）のために、別の分子（例えばアドリアマイシン）または原子（例えば同位体）で標識することができる。
【発明の属する技術分野】
本願は、米国仮出願第６０／２１４，４２７号および第６０／２１４，３８８号ならびに第６０／２１４，３８９号に基づくものであり、それぞれ、その内容全体を、参照によって本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、Ａ）骨髄、腎臓、または心臓など、移植された組織の拒絶の原因であるリンパ球への、細胞毒の標的指向型送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、Ｂ）癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための、非毒性の天然に存在する送達システムの使用、ならびにＣ）癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達に関する。
【０００３】
【発明の背景】
Ａ）移植−免疫系は、免疫監視細胞（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｃｅｌｌ）として機能するリンパ球の集合体を含むように設計される（Ｃｏｈｎ、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｅｄ ＆ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ １９９８；１９：４７５）。これらの細胞は、細菌、ウイルス、または非自己抗原などの外来性の抗原を探しながら、体中を巡回する警察のように働く。
【０００４】
何千年も前、この監視細胞は、哺乳類の妊娠における問題を提起した。哺乳類の胎児におけるある種の細胞は、母親の血液と接触し、非自己抗原として拒絶された。この問題は、クローン除去、クローン麻痺、およびアポトーシスまたはプログラムされた細胞死などの耐性の特殊化された形式の発達によって解決され（Ｊｉａｎｇ ＆ Ｖａｃｃｈｉｏ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１６０：３０８６）、したがって、哺乳類が有性生殖を通して繁殖できるようになった。
【０００５】
しかし、免疫監視の問題は再び、医療への移植の導入の問題になった（Ｓｔａｒｚｌ ＆ Ｄｅｍｅｔｒｉｓ、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｅｄ ＆ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ １９９８；１９：４４１）。妊娠とは異なり、この問題は耐性の免疫的機序を適合させることによって解決されていない。その代わりに、臓器移植レシピエントに起こる拒絶反応を根絶するために、免疫抑制薬の製薬新時代が開かれた。
【０００６】
今日、免疫系を、非自己組織の移植片を受け入れるように操作または設計することは依然として不可能であるので、よりいっそう強力かつ有毒な免疫抑制薬が、作られるべきである。１９９９年だけで、免疫抑制薬のアメリカ合衆国市場は、総売上高が十億ドルをわずかに上回った（ＭＩＳ Ｈｅａｌｔｈ−ＭＩＤＡＳからのデータ）。実際、臓器の生存時間によって判断されるものとしての移植の結果は、免疫抑制療法の結果として向上し続けていると言えるに違いないが、こうした治療法は、治療が足りないことによる拒絶と、治療が過ぎることによる感染症または悪性病変との間の微妙なバランスである（Ｂｅｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｔｉｄｓ Ｄｅｎ Ｎｏｒｓｋｅ Ｌａｅｇｅｆｏｓｅｎ １９９９；１１９：３６１５）。
【０００７】
リンパ腫は、免疫抑制された移植レシピエントにおいて最もよく見られる腫瘍であり、移植前、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）に対して血清反応陰性であるレシピエントにおいて、その発病率は３０％程にもなる（Ｓｗｉｎｎｅｎ、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ ２０００；１１（ｓｕｐｐｌ １）：４５）。サイトメガロウイルス感染症もまた、腎臓移植レシピエントにおいてよく見られ、ある研究では、移植後６カ月で、３８％の累積感染率に達する（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）Ｐｒｏｃ １９９９；３１：１２５５）。感染症による死亡率は低下しているが、免疫抑制された臓器移植レシピエントにおいて、最初の１年を十分に超えて蔓延する菌類および原生動物を含む主な死因は、残っている（Ｍａｔｔｈｅｗ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ １９９９；３１：１１０２）。最終的に、これらの患者においては、白内障、振戦、歯肉過形成、および体毛の異常成長（ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ）を含めて、薬物毒性による多くの合併症が存在する（Ａｌｍａｎａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒａｃ １９９８；３１：２５１９）。
【０００８】
要約すると、免疫抑制薬は、臓器を移植された患者の死亡率および罹病率の多くの原因であるが、これらの薬物は、慢性拒絶反応および臓器不全の問題を遅らせるので、使用され続けるであろう（Ｈａｓｓｅｌｄｅｒ、Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｎｕｒｓｅ １９９９；１４：７７１）。
【０００９】
慢性関節リウマチ、甲状腺疾患、および糖尿病など、自己免疫疾患と考えられている疾患を含めて、免疫疾患は、免疫拒絶の原因である細胞によって引き起こされる。免疫抑制薬は、移植片の非自己抗原に対する免疫拒絶反応を抑えるために使用される（Ｈａｌｌｏｖａｎ、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ １９９７；３１３：２８３）。免疫拒絶反応の原因である細胞が、除去されるならば、患者を免疫抑制薬で治療する必要はなくなる。このことは、免疫疾患の治療のための新しい扉を開く。
【００１０】
Ｂ）放射線療法。化学療法、外科手術、および放射線療法は、３つの主な癌治療の要素である。放射線療法は、すべての癌患者の６０％以上に、疾患の経過の間のいずれかの時点で使用される（Ｄｕｎｎｅ−Ｄａｌｙ、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ．１９９９；１５：２５０）。これは、放射線物理学、コンピュータ断層撮影などにおける知識の発展のおかげで、重要な治療法になってきている。放射線療法における基本的な課題の１つは、正常細胞を残しながら、腫瘍細胞のみ殺すことである（Ｊｏｅｎｓｕｕ ＆ Ｔｅｎｈｕｎｅｎ、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ １９９９；３８（Ｓｕｐｐｌ １３）：７５）。過去２０年の間、非常に様々な薬剤が、癌細胞に放射線を送達する能力について研究されてきた（Ｎｏｒｍａｎ Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ、１９９８；４２：７８７）。こうした薬剤は、放射線増感剤と呼ばれる。放射線療法中に正常な組織を保護する薬剤もある。これらは、放射線防護剤と呼ばれる。
【００１１】
放射線増感剤は、妥当な場所で、妥当な時間、妥当な濃度でなければならない。問題は、ほとんどの有効な放射線増感剤の多くはまた有毒でもあるということである。シスプラチンは、有毒であるが強力な放射線増感剤の例である（Ｍｏｎａｇｈａｍ、Ｌａｎｃｅｔ １９９９；３５３：１２８８）。選択的送達システムがないために、妥当な場所での妥当な量の放射線増感剤の集中が困難になり、そのため、放射線療法の有効性に深刻な制限がもたらされる。
【００１２】
Ｃ）薬物送達。薬物送達システムは、通常、装置（例えばインシュリンポンプなど）、あるいは消化管、尿生殖路、または血液循環などの主な解剖学的区画に薬物を徐々に放出するように設計された様々な担体を使用する。例えば、リポソームは、薬物を血液循環に放出するように設計された送達システムである。こうしたシステムの問題は、それが、薬物を特異的な細胞に送達するように設計されていないことである（Ｓｃｈａｌｌｙ ＆ Ｎａｇｙ、Ｅｕｒｏｐ Ｊ Ｅｎｄｏｃｔｉｎｏｌ １９９９；１４１：１）。その結果、薬物は無差別に送達される。この無差別送達が原因で、より大用量の薬物を使用しなければならない。癌などの疾患では、より多い用量の薬物の使用は、薬物毒性の深刻な臨床上の問題を引き起こす。事実、癌患者はしばしば、薬物治療の副作用よりもむしろ薬物の癌への影響に苦しむ。それにもかかわらず、癌治療において現在考えられていることは、より多くの薬物を使用することである。例えば、「ｔｈｅ ７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９９）ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｐａｇｅ ２７８）」は、「かなりの前臨床データおよび臨床経験では、最大限に有効な治療は、最大限に耐えうる量あるいは致死量を超えるに等しい用量の化学療法剤が投与された場合に実現されるという仮説が支持される」と記載している。最大限に耐えうる量あるいは致死量を超える用量の化学療法剤を与えることの犠牲は、非常な苦痛と許容できない生活の質である。苦痛および許容できない生活の質は、薬物毒性によって引き起こされる。
【００１３】
薬物毒性の問題は、抗癌剤を正常細胞にではなく癌細胞だけに送達する薬物送達システムが、開発されれば解決されるであろう。この課題への１つの手法は、癌細胞だけに存在する抗原を認識し、その抗原と反応する、薬物を載せた抗体の使用を介している。多くのこうした抗原が存在し、そのうちのいくつかは、癌治療の事例において使用されている。
【００１４】
例えば、トランスフェリン受容体抗原は、癌細胞の表面に存在するが、ほとんどの正常細胞の表面には存在しない（Ｗｈｉｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ１９９５；７６：２０）。したがって、制癌剤を、抗トランスフェリン受容体抗体に結合させ、脳癌を患う患者に薬物を送達するために使用している（Ｌａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １９９７；４１：１０３９）。リンパ腫を患う患者において、同位体で標識した抗体を用いて、同様の研究が行われている（Ｖｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２０００；３８：９１）。抗体が仲介する、薬物送達へのこの手法には、いくつかの深刻な問題がある。例えば、これらの抗体は、実験動物中で産生され、ヒトなどの他の種に与えられた場合、望ましくない反応が起こる可能性がある（Ｍｕｒａｓｚｋｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８３；５３：３７５２）。
【００１５】
癌における薬物送達の課題へのより合理的な手法は、癌細胞上の受容体に対する通常のリガンドでもある薬物担体を設計することである。リガンドは、特定の受容体に独自の適合性を示す分子であり、特定の錠に唯一適合する鍵に例えられる。この手法の必要条件は、その受容体が癌細胞の表面に存在し、正常細胞の表面には存在しないことである。こうしたものの例には、血液中で鉄の輸送を担うタンパク質リガンドを結合するトランスフェリン受容体がある。このタンパク質リガンドは、抗癌剤を担持するように改変され、このリガンド−受容体薬物送達システムの効果は、急性白血病を患う患者において示されている（Ｆａｕｌｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９０；２：５７）。
【００１６】
また、この薬物を担持するリガンドは、いくつかの異なるタイプの化学結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）を介して、いくつかの異なるタイプの抗癌剤（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６、ａｎｄ Ｂｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９８；４１：２７０１）を担持する能力があることが示された。しかし、この手法は、鉄などの重金属の輸送に関与するタンパク質リガンドの使用に限られる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の一目的は、骨髄、腎臓、または心臓などの移植された組織の拒絶の原因であるリンパ球への細胞毒の標的指向型送達を実現することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための非毒性の天然に存在する送達システムの使用を実現することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達を実現することである。
【００２０】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下で述べる好ましい実施形態の詳細な説明に記述する通り、本発明によって実現される。
【００２１】
【課題を解決する手段及び発明の実施の形態】
本発明は、標的細胞への標的指向型送達のためのいくつかの機構を提供する。
【００２２】
Ａ）移植。本発明の一実施形態では、移植レシピエントにおける拒絶反応の原因である免疫細胞は除去される。このことは、非自己認識反応がレシピエントのリンパ球上のＴ細胞受容体、ならびに、ドナー細胞上の抗原と主な組織適合性複合体との組合せによって仲介されるという知見によって支持される（Ｔｕｒｖｅｙ ＆ Ｗｏｏｄ、Ｉｎｔ Ｓｕｒｇ １９９９；８４：２７９）。ドナー細胞とレシピエント細胞が出会うと、この認識反応は、細胞の増殖およびトランスフェリン受容体の上方制御を引き起こす共刺激反応を伴う（Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔ ＆ Ｈｏｙ、Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９１；４７：１４０）。トランスフェリン受容体の上方調節が細胞の増殖と関連する証拠は、トランスフェリン受容体がトランスフェリン受容体に対する抗体によって遮断された場合に、増殖が起こらないことである（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｌｅｕｋ Ｂｉｏｌ １９９８；６４：１９）。トランスフェリン受容体に対する抗体はまた、ドナー細胞に対するレシピエント細胞の認識反応も遮断し（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；７：１３１）、遺伝学的に適合しないレシピエントにおける移植された心臓の生存を延長する（Ｗｏｏｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９９；６８：１３６９）。したがって、トランスフェリン受容体が、移植レシピエントがその移植片を埋め込む免疫拒絶反応において重要であることは明白である。
【００２３】
身体からＴリンパ球を一掃する免疫生物学は、アポトーシスとして知られたプロセスによって、プログラムされた細胞死の経路を開始することである（Ｐｉｎｋｏｓｋｉ ＆ Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＆ Ｄｉｆ １９９９；６：１１７４）。これは、胸腺において、あるいは末梢循環において起こすことができる（Ｌｅ Ｂｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１１：３７３）。アポトーシスの機構はいくつかあるが、それらはすべて、選択された細胞を身体から排除するように機能する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＆ Ｋｒａｕｓ、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８：５２７）。本発明は、レシピエントの免疫監視Ｔリンパ球を、それが、移植片のドナー抗原と出会った後、ただしそれが増殖して、移植片を攻撃し、最終的に移植片の拒絶の原因であるＴリンパ球のクローンを産生する前に排除するための新規の方法である。この手法の戦略は、アポトーシスを介するクローン除去によって、ドナーの特異的な免疫監視リンパ球を排除することであり、そうすれば、Ｔリンパ球のクローンの拒絶は起こらず、移植片を保護するための免疫抑制の必要はなくなるであろう。これと同じ戦略は、甲状腺、脳、関節、またはインシュリン産生細胞に対する特異性をもつものなど、自己免疫性のリンパ球の排除に適用することが可能であり、そうすれば、Ｔリンパ球の自己反応性のクローンは存続せず、再び免疫抑制療法を必要とすることなく自己免疫疾患は軽減されるであろう。
【００２４】
本発明は、レシピエントが移植片を受け入れた後、ただし細胞が増殖して細胞のクローンを形成して移植された臓器を拒絶する前の移植レシピエントにおける、免疫監視Ｔリンパ球への細胞毒の標的指向型送達のために使用される薬物−タンパク質複合体である。この薬物−タンパク質複合体中のタンパク質はトランスフェリンであり、また標的細胞上の受容体はトランスフェリン受容体であり、これは患者の免疫監視Ｔリンパ球前駆体の表面に上方調節されるので、本発明において、薬物の標的指向型送達が可能となる。さらに、薬物−トランスフェリン複合体中の薬物は、メトトレキサートであり得るが、これは活性化された末梢Ｔリンパ球のアポトーシスおよびクローン除去を引き起こすことが知られている（Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９８；１０２：３２２）。癌細胞（Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ １９８４；４６：２１７）、感染細胞（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７；２３８：３０５）、および抗原により刺激されたＴリンパ球（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｌｅｕｋ ｂｉｏｌ １９９８；６４：１９）の表面に存在するのとは異なり、トランスフェリン受容体は、通常、正常な、成熟した休止細胞の表面には存在しない（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６）。したがって、細胞は、移植された臓器中の細胞には影響を与えず、メトトレキサート−トランスフェリン複合体によって排除されるべきレシピエント細胞のみ、拒絶する細胞のクローンに広がる機会をもつ前に、免疫監視Ｔリンパ球となる。
【００２５】
免疫抑制薬を使用せずに移植片の生存を延長するための標的指向型薬物送達の本発明を実現する方法は、血液中で鉄を担持するトランスフェリンの使用に焦点を当てることである。トランスフェリンは血漿からの分離によって、あるいは供給業者から、あるいは組み換え技術から得ることができる（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：２４０６６）。薬物−タンパク質複合体を形成するために、トランスフェリン分子は、細胞増殖抑制薬と結合されるように調製する方法で改変しなければならない。この薬物は、メトトレキサートなどのアポトーシス・イニシエーター、アドリアマイシンなどの細胞障害性抗生物質、またはタキソールなどのアルキル化剤などであってもよいが、リシンなどの植物毒素、改変されたジフテリア毒素などの細菌性の突然変異毒素を含めて、細胞に対して有毒な任意の化合物も使用できる（Ｌａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９７；４１：１０３９）。トランスフェリンを他の化合物と結合させるために、グルタルアルデヒド結合（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９３、３００：３５６）、ジスルフィド結合 （Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９９３；８４：１９１）、およびベンゾイルヒドラゾン結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）などのいくつかの結合プロセスが使用されており、本発明の実施形態においても使用することができる。腫瘍造影のために同位体をトランスフェリンに結合する架橋として、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）結合も使用することができる。広く様々な結合手順により、広範囲の細胞毒のトランスフェリンへの複合が可能になり、細胞毒のトランスフェリン分子との永久的または分離可能な結合がもたらされる。結合反応の後、薬物−タンパク質複合体は、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析手順を使用することによって、未結合の薬物および遊離のタンパク質から分離することができる。
【００２６】
複合手順の技術の詳細は変わりうるが、いずれの手順にも必要なことは、癌細胞を用いた結合実験および死滅実験において活性であり、それほどの数の正常細胞を結合せず殺しもしない、定義された複合体を調製することである。これらの必要条件に照らすと、適当な手順は、トランスフェリン（０．５ｍＭ）１ミリリットルを１ミリリットルのアドリアマイシン（８．５ｍＭ）（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と４分間混合し、次いで１ミリリットルの２１．５ｍＭ グルタルアルデヒド（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）を加え、４分間混合するものである。前述の反応は結合手順であり、これを、０．８ミリリットルの３７．２ｍＭ エタノールアミン（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）を加えることによって停止させ、４分間ボルテックスする。次いでこの混合物（３．８ミリリットル）を透析管（分子量のカット・オフ１２，０００〜１４，０００）に移し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水０．５リットルに対して、暗中で、５℃で３時間透析する。この透析は、新しいＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水を用いて少なくとも１回繰り返すべきである。次いでこの混合物を４℃で、１６００ｇで１０分間遠心し、上清を、あらかじめＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水中で平衡化し、ブルーデキストラン、トランスフェリン、およびシトクロムＣを用いて５℃で較正したセファロースＣＬ−４Ｂの２．６×３４ｃｍカラムで、流速２２ミリリットル／時間でクロマトグラフィーにかける。カラムからの溶離を、２８０ｎｍでモニターし、３．８ミリリットルの分画を収集する。各分画中のトランスフェリンおよびアドリアマイシンの濃度を、トランスフェリンについては２８０ｎｍ、アドリアマイシンについては２９５ｎｍを用いて求めたトランスフェリンおよびアドリアマイシンについての検量線からの逐次近似法によって算出する。少し改変を加えれば、この結合手順を使用して、例えばメトトレキサートのトランスフェリン複合体、またはシクロスポリンなど免疫抑制薬のトランスフェリン複合体など、他の細胞毒のトランスフェリン複合体を調製することができる。
【００２７】
純粋な薬物−タンパク質複合体を単離したら、それをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特徴付けて分子量を求め、タンパク質１分子あたりの薬物分子の数を求めるべきである。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験は、機能性薬物：タンパク質の比が、タンパク質１分子あたり薬物２〜３分子であることを示している（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６）。しかし、本発明を用いると、タンパク質１分子あたり薬物１分子未満の比が有効であり得る。本発明の実施における次の好ましい２つのステップは、（ａ）複合体が、活性化されたＴリンパ球の表面の受容体と結合し、休止Ｔリンパ球に結合しないかどうか判定すること、および（ｂ）複合体が、活性化されたＴリンパ球を殺し、休止Ｔリンパ球を殺さないかどうか判定することである。結合研究は、フローサイトメトリーを使用することによって行うことができ、殺滅試験は、同じ数の活性化されたＴリンパ球を殺すのに必要な薬物−タンパク質複合体中の薬物の濃度と比較して、活性化されたＴリンパ球の培養株の５０％を殺すのに必要な遊離の薬物の濃度を求めるための微量培養技術を使用することによって行うことができる。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験では、同じ数のＴリンパ球を殺すために、薬物−タンパク質複合体中の薬物と比較して、約１０倍以上の遊離の薬物が必要であるということが示される。しかし、本発明を用いると、遊離の薬物単独に比べて、２０分の１、さらには１００分の１の薬物−タンパク質複合体中の薬物が有効であり得る。複合体が効果的であるためには、ごく最低限の活性化されていないリンパ球が殺されても構わない。
【００２８】
本発明を送達タンパク質であるトランスフェリンに関して述べてきたが、細胞の受容体部位に結合する能力がある他のタンパク質が、体内に存在することが知られている。受容体部位が、腫瘍細胞中で活性化され、正常な休止細胞中で不活性であるならば、こうした受容体部位に結合するいずれのタンパク質または他の化合物も、本発明の細胞増殖抑制薬を送達するために使用できる。こうした他のタンパク質の１つの例は、ヒトの体内の細胞にビタミン類、特にビタミンＢ１２を送達するするトランスコバラミンである。また、ビタミンの葉酸の薬物複合体もこの能力で使用されている（Ｒｅｄｄｙ ＆ Ｌｏｗ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒ Ｓｙｓ．１９９８；１５；５８７）。
【００２９】
薬物−タンパク質複合体を調製し、精製し、特徴付けし、細胞への結合特性および細胞の死滅特性について確認した後、結合実験および死滅実験により、複合体が、活性化されたＴリンパ球と結合し、これを殺すが、休止または活性化されていないリンパ球は結合もしないし死滅もさせないことが示される場合、この複合体を、動物研究のために分取し、滅菌することとなる。滅菌プロセスは、例えばセシウム照射装置を使用するなど、照射にさらすことによって行うことができるし、ミリポア濾過技術を使用することによって行うこともできる。滅菌した複合体が手に入ったら、第１に、これを臨床研究の設計において使用される薬物動態および安全性のパラメータを求めるために、動物研究で使用することとなる。
【００３０】
移植を受けたレシピエントにおける活性化されたＴリンパ球のクローン除去を開始するように設計された第１の薬物−タンパク質複合体の調製方法は、前段に述べている。その概括的な本質は、特に臓器拒絶の原因である細胞への細胞毒の標的指向型送達のために設計された第１の薬物−タンパク質複合体を試験することであり、その目的は、活性化されたＴリンパ球のクローン除去を開始して、患者における免疫抑制の延長の必要をなくすことである。科学および／または社会に対するベネフィットは、移植を、有害かつ有毒な免疫抑制薬の使用を延長せずに行うことができ、移植後に、より許容できる生活の質を保つことができるという情報である。リスクは低く（例えば、毒性なし）、可能なベネフィットは高い（例えば、免疫抑制を延長して使用せずに機能的な移植を保持する）ので、リスク／ベネフィット比は非常に好都合である。したがって、本発明の実施形態は、臓器が移植された患者における、活性化されたＴリンパ球に担持される細胞毒の第１の標的指向型送達を記述する。この手法の目標は、現在の長期の免疫抑制の必要をなくすことである。
【００３１】
Ｂ）放射線療法。本発明の他の実施形態は、癌細胞に高濃度の放射線増感剤を運ぶための非毒性の天然に存在する送達システムの使用に関する。本発明のこれらの実施形態はまた、血液中で循環し、表面にトランスフェリン受容体を発現している細胞に鉄を送達するする糖タンパク質であるトランスフェリンを使用することもできる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＆ Ｐｏｎｋａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９７．１３３１：１）。トランスフェリン受容体は、癌細胞の表面で継続的に発現する増殖マーカーである（Ｆａｕｌｋ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ １９８０；２：３９０：Ｋｅｍｐ，Ｈｉｓｔｏｌ ＆ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ １９９７；１２：２９１）。本発明の先の実施形態について上で述べた通り、腫瘍細胞は、その表面に、多数（１０４〜１０６個／細胞）のトランスフェリン受容体を発現しているが、正常細胞は、その表面にこうした受容体をめったに発現しない（Ｋｌａｕｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １９９３；７２：１９）。
【００３２】
放射線増感剤の標的指向型送達のための担体としてのトランスフェリンの使用は、実質上癌細胞のみへの高濃度の放射線増感剤の送達を可能にし、したがって、シスプラチンなどの毒性を有する増感剤の場合に重要であり、より低用量の放射線増感剤の使用が可能になる。放射線増感剤のための標的指向型送達の使用はまた、正常細胞への副次的なダメージも減らし、それによって正常細胞を残し、正常な組織にその生理機能を持続させることができる。本発明の最終的な効果は、放射線療法の結果を向上すること、および、毒性による副作用を減らすことである。これは、副作用を減らし、癌患者の生活の質を向上することとなる。
【００３３】
血管新生、シグナル伝達、アポトーシスなど、細胞の異なるプロセスに作用する広範囲の放射線増感剤がある。放射線増感剤のこうした多様性の理由は、放射線ダメージが、組織に特異的であることである（Ｗｉｔｈｅｒｓ ＆ ＭｃＢｒｉｄｅ ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｅｄ ３）、ｐ．７９、１９９８）。さらに、癌細胞の生物学が変化し、これによりしばしば、放射線および他のタイプの薬物療法に対する耐性の発達がもたらされる。しかし、感受性が高く耐性のある細胞は、その表面に多数のトランスフェリン受容体を発現している（Ｂａｒａｂａｓ ＆ Ｆａｕｌｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍ １９９３；１９７：７０２）。トランスフェリンのその受容体への結合は、リガンド−受容体複合体のエンドサイトーシスを引き起こすので、トランスフェリンは、表面にトランスフェリン受容体がある細胞に化合物を送達するための理想的な分子である（Ｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒｏ Ｊ Ｃａｒｄｉｏ−Ｔｈｏｒ Ｓｕｒｇ １９９８；１３：４６０；Ｂｒｏｏｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒ Ｎｅｕｒｏｌ １９９６；１４２：４７）。
【００３４】
トランスフェリンは、薬物感受性があり薬物耐性がある癌細胞に化合物を送達するためのすばらしい担体であるので、本発明において好ましい標的指向型送達システムは、放射線増感剤を結合させたトランスフェリンからなるものである。ヒト患者において使用するためのトランスフェリンは、（例えばＦｉｎｎｉｓｈ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓから）市販品として入手できる。トランスフェリンを他の化合物と結合させるためには、グルタルアルデヒド結合（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９３、３００：３５６）、ジスルフィド結合（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９３；８４：１９１）、およびベンゾイルヒドラゾン結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）などのいくつかの結合プロセスが使用されている。広く様々な結合手順により、トランスフェリンへの広範囲の放射線増感剤の複合が可能になり、放射線増感剤のトランスフェリン分子との永久的または分離可能な結合がもたらされる。結合反応に続いて、集約的（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）透析の後、複合体は、クロマトグラフィーまたは透析手順によって未結合の成分から分離するべきである。シスプラチンは好ましい放射線増感剤であるが、その他の公知の放射線増感剤も、それと置換することができる。
【００３５】
トランスフェリンの放射線増感剤との複合体が調製された後、それを、トランスフェリン複合体を調製するために、使用した放射線増感剤の生理化学特性に応じて、他の方法に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用することによる例のように、分子量について特徴付けることができる。これに続いて、複合体の癌および正常細胞に結合する能力を決定するためのフローサイトメトリーを使用する結合研究を行うことが可能である。癌細胞に結合し、正常細胞に結合しない複合体のみが、薬物感受性があり薬物耐性がある癌細胞を使用する放射性毒性分析のために選択されることが好ましい。
【００３６】
放射性毒性分析には、ＭＴＴテトラゾリウム比色定量分析を利用し（Ｖｉｓｔｉｃａ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９４；５１：２５１５）、これにより、トランスフェリン−放射線増感剤の最も強力な比、および薬物感受性があり薬物耐性がある細胞の最大の放射線増感に対する複合体の最適濃度が示されることとなる。細胞結合研究および死滅研究から選択された複合体は、臨床研究の設計において使用される前に、薬物動態および安全性のパラメータを求めるために、動物研究で使用することができる。これは、ヌードマウスにおいて異種移植されたヒト腫瘍細胞として行うことができる。本発明の目的は、放射線増感剤を癌細胞のみに送達する構想を導入することであり、これは放射線療法の結果の実質上の向上を提供することとなる。
【００３７】
トランスフェリンの放射線増感剤との複合体を、ステージが明確である正確に診断された癌を患う患者に使用することができる。このトランスフェリン−放射線増感剤複合体は、遊離の放射線増感剤のみが与えられた場合に使用される用量の１０分の１、好ましくは２０分の１、さらには１００分の１の用量で静脈内に投与できる。複合体の投与後、通常量の放射線を使用して、患者に放射線治療を施すことができる。放射線治療の後、患者および対照の生化学的パラメータ、細胞のパラメータ、および放射線学的パラメータを解析して本発明の効果を判定することができる。
【００３８】
本発明を、放射線増感剤の標的指向型送達のための担体としてのトランスフェリンに関して述べてきたが、他のタンパク質または化合物、例えば、癌細胞上の受容体に特異的に結合する能力がある任意の他のタンパク質（例えばトランスコバラミン）や他の化合物なども使用できることを理解されたい。受容体は、腫瘍細胞において活性化され、正常な休止細胞においては実質上不活性であるような性質であるものであるべきである。放射線増感剤は、複合された場合、あるいは癌細胞に送達された場合にでもその放射線増感特性を保持しているべきであり、トランスフェリンまたは他のタンパク質または他の化合物は、複合体中でも、上で述べた細胞の受容体に結合する能力を保持していなければならない。
【００３９】
リスクは、放射線増感剤を単独で使用するよりも、担体システムを使用するほうがはるかに小さい。リスク・ベネフィット比は非常に好都合である。投与された、より低濃度の放射線増感剤は、癌細胞においては局所的に、より高濃度の放射線増感剤をもたらすが、正常細胞はそれを免れる（ｓｐａｒｅ）こととなる。この分布は、放射線療法の有効性を増大させることとなる。トランスフェリン放射線増感剤複合体は、腫瘍を放射線に対して増感させるだけでなく、腫瘍の位置およびサイズの決定にも役立つこととなる。本発明は、抗体を使用しないので、アナフィラキシー反応、パッチ−キャップ分泌反応、および抗原変異などの抗体送達システムに存在する問題が存在しない。トランスフェリン標的指向型送達システムを使用することにより、より低い用量の毒性のある放射線増感剤を投与することが可能になり、毒性による副作用が減少する。したがって、本発明は、癌患者の生活の質および生存期間を向上することとなる。
【００４０】
Ｃ）薬物送達。本発明のこの実施形態は、癌の医療診断および治療における薬物の標的指向型送達に関する。本発明のこの態様は、薬物の標的指向型送達への新たな手法である。この手法は、葉酸（Ｒｅｄｄｙ ＆ Ｌｏｗ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｔ Ｓｙｓ １９９８；１５：５８７）、ビタミンＢ１２（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ、Ｖｉｔａｍｉｎｓ ＆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ２０００；５９：３３７）などのビタミン類を普通に担持する血液タンパク質を使用する。本発明は、癌細胞上のトランスコバラミン受容体の改変に関する。
【００４１】
トランスコバラミンは、表面にトランスコバラミン受容体がある細胞にビタミンＢ１２（コバラミン）を送達し、そこではビタミンＢ１２は、受容体が仲介するエンドサイトーシスを介して、細胞に移入され、ホモシステインのメチオニンへの転換に利用される（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ １９９９；１９：１７３）。生物学的に活性なこの受容体は、細胞膜中の１２４ｋＤａの非共有結合による二量体として機能し（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｕｔｒ １９９９；１２９：１７６１）、この受容体に対する抗体が、細胞増殖を遮断する（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＆ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８；３０：１０１）。
【００４２】
実験研究は、細胞膜内でのトランスコバラミン受容体発現の調節は、受容体が増加する場合細胞増殖と、受容体が減少する場合細胞分化と相関することを示している（Ａｍａｇａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １９９０；７６：１３８０）。トランスコバラミン受容体は、癌細胞に特有である（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＆ Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ １９９７；３８：７１７、ａｎｄ Ｆｉｓｋｅｒｓｔｒａｎｄ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８；２７３：２０１８０）。したがって、トランスコバラミンの抗癌剤との結合は、薬物に対する標的指向型送達システムを提供することとなる。
【００４３】
葉酸についても同様の受容体機構が報告されているので（Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９９；３６６：１８３、ａｎｄ Ｔｒｉｐｌｅｔｔ ＆ Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １９９９；１１：３）、癌における標的指向型送達の使用は、ビタミンＢ１２に限定されない。実際、抗癌剤を担持するための、本発明者らによって既に述べたトランスフェリン以外に、腫瘍細胞において活性化され、正常細胞においては不活性あるいは比較的不活性である細胞表面の受容体に結合する任意のタンパク質または他の物質が、腫瘍細胞に任意の腫瘍薬物を送達するための複合手順を介して利用可能である。これらの他のタンパク質または他の化合物は当然、人体において薬理学的に許容され、複合後もこうした受容体に結合する能力を保つ。
【００４４】
当然、腫瘍細胞にこのように送達される抗癌剤または抗癌薬は、こうした細胞を殺す能力を保持していなければならない。好ましい抗癌剤は、腫瘍の治療のために認可されている薬物である。上で述べたアドリアマイシンやタキソールの他に、こうした薬物には、シスプラチンやメトトレキサートなどのこうした別種の化合物が含まれる。
【００４５】
トランスコバラミンを抗癌剤と結合させるためには、いくつかの技術を使用することができる。トランスフェリンを他の化合物と結合させるためには、グルタルアルデヒド結合（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９３、３００：３５６）、ジスルフィド結合（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９３；８４：１９１）、およびベンゾイルヒドラゾン結合（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １９９８；８７：３３８）などのいくつかの結合プロセスが使用されている。類似の結合プロセスを使用して、本発明の複合体を生成することができる。広く様々な結合手順により、広範囲の抗腫瘍薬のトランスコバラミンまたは他の輸送薬への複合が可能になる。結合反応に続いて、集約的透析後、クロマトグラフィーまたは透析手順によって、結合した成分から、複合体を分離するべきである。
【００４６】
抗癌剤に結合させた、ビタミンを担持するリガンドの使用は、より低用量の薬物を用いる治療プロトコルを可能にすることとなり、また、正常細胞を残し、より少量の薬物を使用することによる組み合わされた効果により、薬物毒性は低くなり、癌患者の生活の質を向上することとなる。細胞表面上にあるどんな受容体も、癌細胞よりも正常細胞への効果が大きい外来性のビタミンＢ１２の投与によって下方制御されるので、正常細胞および組織は、細胞毒による障害を免れる。トランスコバラミン受容体がコルチゾンによって調節されることを示唆するデータもあり（Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９５；３１０：９２３）、正常細胞によるトランスコバラミン受容体の提示の制御へのおそらく別の手法を提供する。
【００４７】
ビタミンを担持するタンパク質リガンドを用いた標的指向型薬物送達の本発明を実現する最良の方法は、ビタミンＢ１２、すなわちコバラミンを担持するトランスコバラミンＩＩの使用に焦点を当てることである。トランスコバラミンは、血漿からの分離によって、あるいは供給業者から、あるいは組み換え技術から得ることができる（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １９９７；８９：２３５）。トランスコバラミン分子は、抗癌剤と結合されるように調製する方法で改変しなければならない。抗癌剤は、アドリアマイシンまたはタキソールなどのアルキル化剤など、細胞障害性の抗生物質であってもよいが、リシンなどの植物毒素、改変されたジフテリア毒素など細菌性の変異毒素を含めて、細胞に対して有毒な任意の化合物も使用できる（Ｌａｓｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９７；４１：１０３９）。結合反応に続いて、薬物−タンパク質複合体は、好ましくはクロマトグラフィーまたは透析手順によって、未結合の薬物および遊離のタンパク質から分離できる。
【００４８】
純粋な薬物−タンパク質複合体を単離したら、それをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特徴付けて分子量を求め、タンパク質１分子あたりの薬物分子の数を求めるべきである。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験は、機能性薬物：タンパク質の比が、タンパク質１分子あたり薬物２〜３分子であることを示している（Ｂｅｒｃｚｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ １９９３；３００：３５６）。しかし、本発明の実施形態では、タンパク質１分子あたり薬物１分子未満のタンパク質比を使用することができる。
【００４９】
本発明の実施における次の好ましい２つのステップは、（ａ）複合体が、癌細胞の表面の受容体と結合し、正常細胞に結合しないかどうか判定すること、および（ｂ）複合体が癌細胞を殺し、正常細胞を殺さないかどうか判定することである。結合研究は、フローサイトメトリーを使用することによって行うことができ、死滅研究は、同じ数の癌細胞を殺すのに必要な薬物タンパク質複合体中の薬物の濃度と比較して、癌細胞の培養株の５０％を殺すのに必要な遊離の薬物の濃度を求めるための微量培養技術を使用することによって行うことができる。他のシステムにおける薬物−タンパク質複合体を用いた経験では、同じ数の癌細胞を殺すために、薬物−タンパク質複合体中の薬物と比較して、約１０倍以上の遊離の薬物が必要であるということが示される。本発明の実施形態では、２０倍、さらには１００倍の比を使用することができる。複合体が効果的であるためには、ごく最低限の正常細胞が殺されても構わない。
【００５０】
複合手順の技術の詳細は変わりうるが、いずれの手順にも必要なことは、癌細胞を用いた結合実験および死滅実験において活性であり、それほどの数の正常細胞を結合せず殺しもしない、定義された複合体を調製することである。これらの必要条件に照らすと、適当な手順は、トランスコバラミンＩＩ（．５ｍＭ）１ミリリットルを１ミリリットルのアドリアマイシン（８．５ｍＭ）（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と４分間混合し、次いで１ミリリットルの２１．５ｍＭ グルタルアルデヒド（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）を加え、４分間混合するものである。前述の反応は結合手順であり、これを、０．８ミリリットルの３７．２ｍＭ エタノールアミン（１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中）と１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）を加えることによって停止させ、４分間ボルテックスする。次いでこの混合物（３．８ミリリットル）を透析管（分子量範囲１２，０００〜１４，０００）に移し、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水０．５リットルに対して、暗中で、５℃で３時間透析する。この透析は、新しいＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水を用いて１回繰り返すことができる。次いでこの混合物を４℃で、１６００ｇで１０分間遠心し、上清を、あらかじめＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水中で平衡化し、ブルーデキストラン、トランスコバラミンＩＩ、およびシトクロムＣを用いて５℃で較正したセファロースＣＬ−４Ｂの２．６×３４ｃｍカラムで、流速２２ミリリットル／時間でクロマトグラフィーにかける。
【００５１】
カラムからの溶離は、２８０ｎｍでモニターでき、３．８ミリリットルの分画を収集できる。各分画中のトランスコバラミンおよびアドリアマイシンの濃度は、トランスコバラミンおよびアドリアマイシンについての検量線からの逐次近似法によって算出できる。次いで、セファロースＣＬ−４Ｂカラムから収集した分画を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することができる。少しだけ改変を加えれば、この結合手順を他の制癌剤のトランスコバラミン複合体を調製するために使用することができ、この手順はまた、腫瘍イメージング、癌の診断、および治療中の癌塊のモニタリングで使用するための、放射標識したトランスコバラミンの抗癌複合体を調製するために使用することもできる。例えば、質的および量的腫瘍造影は、担体タンパク質（この場合はトランスコバラミン）に結合させた、ＤＴＰＡでキレート化した同位体を用いて行うことができる。
【００５２】
薬物−タンパク質複合体を調製し、精製し、特徴付けし、細胞への結合特性および細胞の死滅特性について確認した後、結合実験および死滅実験により、複合体が癌細胞を結合して殺すが、正常細胞には結合もしないし死滅もさせないことが示される場合、この複合体を、動物研究のために分取し、滅菌することができる。滅菌プロセスは、例えばセシウム照射装置を使用するなど、照射にさらすことによって行うことができるし（Ｙｃｋ ＆ Ｆａｕｌｋ、Ｃｌｉｎ−Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｙ １９８７；３２：１）、ミリポア濾過技術を使用することによって行うこともできる。滅菌した複合体が手に入ると、第１に、これを臨床研究の設計において使用される薬物動態および安全性のパラメータを求めるために動物試験で使用することができる。
【００５３】
この研究全体の目的は、癌治療プロトコルに、薬物の標的指向型送達の構想を導入することであり、この研究の目標は、標的指向型送達を通して薬物毒性をなくすこと、および、癌を患う患者の生活の質を向上することである。ビタミンを担持する血液タンパク質と抗癌剤からなる第１の薬物−タンパク質複合体の調製の方法は、前の段落に述べてきた。その概括的本質は、ビタミンを担持する血液タンパク質と抗癌剤からなる第１の薬物−タンパク質複合体を試験することであり、その目的は、癌患者への薬物の標的指向型送達の構想を発展させることである。得られるベネフィットは、患者の癌が、薬物毒性を加えることなく、癌塊を減少させる可能性を持って、治療されるであろうことである。副次的なダメージなしに、あるいはより軽い副次的ダメージで癌を治療することができ、治療中および治療後、癌患者の、より許容できる生活の質を保つことができる。本発明のリスク／ベネフィット比は低く（例えば、毒性なし）、可能なベネフィットは高い（例えば、寛解）ので、リスク／ベネフィット比は非常に好都合である。
【００５４】
この薬物−タンパク質複合体は、遊離の薬物について使用される用量の１０分の１（好ましくは２０分の１、さらには１００分の１）の用量で静脈内に投与できる。要約すると、本発明は、ビタミンを担持する通常の血液タンパク質によって癌細胞に担持される抗癌薬の標的指向型送達の第１の研究に関する。
【００５５】
本発明の有利な点は、様々な実施形態を、一緒に利用して、併用治療を使用できることであり、これは３つの場合（すなわち移植、放射線増感剤、およびトランスコバラミンの使用）のすべてにおいて適用することができる。ここでの戦略は、組合せおよび順列のプロセスである。例えば、移植において、アドリアマイシンなどの細胞毒のトランスフェリン複合体は、Ｔ細胞を殺すために使用できるが、シクロスポリンなどの免疫抑制薬のトランスコバラミン複合体は、免疫系を選択的に抑制するために同じ患者に同時に使用できる。このように、免疫学的に活性化された、あるいは同種異型的に活性化された細胞、すなわち移植の結果活性化された細胞だけが、その細胞の上方調節されたトランスフェリン受容体のせいで標的にされる。これらの細胞は、トランスフェリン受容体およびトランスコバラミン受容体の両方を通して攻撃する細胞毒と免疫を抑制する薬物の両方を用いて治療することができる。
【００５６】
さらに、一方では細胞毒（例えばアドリアマイシン）、他方では高エネルギーの同位体を用いて、同時に殺し、かつ造影する、あるいは同時に殺すために、担体の１つ（トランスフェリンまたはトランスコバラミン）は、細胞毒で、もう一方は同位体で標識することができる。
【００５７】
したがって、この併用療法は、異なる２種の受容体（すなわちトランスフェリン受容体およびトランスコバラミン受容体）を介して同じ細胞を標的にする。これを下のように数学的に表すことができる：
【００５８】
細胞毒性（薬物Ａ）／細胞毒性（薬物Ｂ）
細胞毒性（薬物Ｃ）／細胞毒性（同位体Ｄ）
細胞毒性（薬物Ｅ）／イメージング（同位体Ｆ）
【００５９】
上のモデルは、次のように展開できる：
トランスフェリン複合体Ａ／トランスフェリン複合体Ｂ
トランスフェリン複合体Ｃ／トランスコバラミン複合体Ｄ
トランスコバラミン複合体Ｅ／トランスコバラミン複合体Ｆ
【００６０】
細胞が活性化、感染症、癌などによって代謝的に攪乱される場合、その応答は、ある種の受容体（例えばトランスフェリン受容体、トランスコバラミン受容体など）を上方調節することであり、そうすると、特異的なリガンド（例えばトランスフェリン、トランスコバラミンなど）の標的となる。このリガンドを治療（例えば癌、感染症、移植、自己免疫病など）または造影（例えば癌）のために、別の分子（例えばアドリアマイシン）または原子（例えば同位体）で標識することができる。
Claims (33)
- 移植臓器または移植骨髄の拒絶の原因である活性化Ｔリンパ球上の特異的な受容体に結合する結合部分と、移植臓器または移植骨髄の拒絶の原因である該リンパ球へ細胞毒を標的指向型に送達するための細胞毒との複合体の使用。
- 結合部分がトランスフェリンまたはトランスコバラミンである請求項１に記載の使用。
- 細胞毒が、メトトレキサート、抗生物質、アドリアマイシン、アルキル化剤、タキソール、植物毒素、リシン、細菌性突然変異毒素、改変されたジフテリア毒素、免疫抑制薬、およびシクロスポリンからなる群から選択される請求項１に記載の使用
- 移植された臓器が、腎臓または心臓である請求項１に記載の使用。
- トランスフェリンが、グルタルアルデヒド結合、ジスルフィド結合、ベンゾイルヒドラゾン結合、またはＤＴＰＡ結合によって細胞毒と複合される請求項１に記載の使用。
- 患者に臓器または組織を移植する方法であって、臓器または組織を患者に移植し、患者にａ）複合体がない場合に、移植臓器の拒絶の原因となるリンパ球上の特異的受容体に結合する結合部分と、ｂ）細胞毒との複合体を投与することを含み、ただし、この複合体は、患者による移植臓器の拒絶を妨げるのに有効な量で投与される方法。
- 結合部分がトランスフェリンまたはトランスコバラミンである請求項６に記載の方法。
- 細胞毒が、メトトレキサート、抗生物質、アドリアマイシン、アルキル化剤、タキソール、植物毒素、リシン、細菌性突然変異毒素、改変されたジフテリア毒素、免疫抑制薬、およびシクロスポリンからなる群から選択される請求項６に記載の方法。
- 移植された臓器または組織が、腎臓、心臓、または骨髄細胞である請求項６に記載の方法。
- トランスフェリンがグルタルアルデヒド結合、ジスルフィド結合、ベンゾイルヒドラゾン結合、またはＤＴＰＡ結合によって細胞毒と複合される請求項６に記載の方法。
- 癌細胞に高濃度の放射線増感剤を輸送するための、癌細胞上の特異的な受容体に結合する結合部分の放射線増感剤との複合体の使用。
- 結合部分がトランスフェリンである請求項１１に記載の使用。
- 放射線増感剤がシスプラチンである請求項１１に記載の使用。
- トランスフェリンがグルタルアルデヒド結合、ジスルフィド結合、ベンゾイルヒドラゾン結合によって、またはＤＴＰＡ結合によって細胞毒と複合される請求項１１に記載の使用。
- トランスフェリンがＤＴＰＡ結合によって細胞毒または同位体と複合される請求項１４に記載の使用。
- 患者において癌細胞に高濃度の放射線増感剤を輸送する方法であって、癌細胞上の特異的な受容体に結合する結合部分の、放射線増感剤との複合体を患者に投与することを含む方法。
- 結合部分がトランスフェリンである請求項１６に記載の方法。
- 放射線増感剤がシスプラチンまたはアドリアマイシンである請求項１６に記載の方法。
- トランスフェリンがグルタルアルデヒド結合、ジスルフィド結合、ベンゾイルヒドラゾン結合、または同位体キレート化用ＤＴＰＡによって細胞毒と複合される請求項１６に記載の方法。
- トランスフェリンがＤＴＰＡ結合によって細胞毒または同位体と複合される請求項１６に記載の方法。
- 癌の医療診断および／または治療を目的とする抗癌剤の癌細胞への標的指向型送達のための使用であって、患者の細胞上の特異的な受容体と結合するビタミンを担持する結合部分と抗癌剤との複合体の使用。
- 結合部分がトランスコバラミンである請求項２１に記載の使用。
- 抗癌剤が、アドリアマイシン、タキソール、シスプラチン、メトトレキサート、植物毒素、リシン、細菌性突然変異毒素、および改変されたジフテリア毒素からなる群から選択される請求項２１に記載の使用。
- トランスコバラミンがトランスコバラミンＩＩである請求項２２に記載の使用。
- トランスコバラミンがグルタルアルデヒド結合、ジスルフィド結合、ベンゾイルヒドラゾン結合、またはＤＴＰＡ結合によって抗癌剤と複合される請求項２１に記載の使用。
- 患者における癌の医療診断および／または治療の方法であって、癌細胞上の特異的な受容体と結合する結合部分と抗癌剤または同位体との複合体を患者に投与することを含み、複合体が、患者における癌を治療および／または診断するのに有効な量で投与される方法。
- 結合部分がトランスコバラミンである請求項２６に記載の方法。
- 抗癌剤が、アドリアマイシン、タキソール、シスプラチン、メトトレキサート、植物毒素、リシン、細菌性突然変異毒素、および改変されたジフテリア毒素からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
- トランスコバラミンがトランスコバラミンＩＩである請求項２６に記載の方法。
- トランスコバラミンがグルタルアルデヒド結合、ジスルフィド結合、ベンゾイルヒドラゾン結合、またはＤＴＰＡ結合によって抗癌剤と複合される請求項２６に記載の方法。
- ａ）癌細胞、あるいは移植臓器または移植骨髄の拒絶の原因であるＴリンパ球上の特異的な受容体に結合する第１の結合部分と、第１の細胞毒薬物または放射線増感剤または抗癌薬との第１の複合体を、
ｂ）癌細胞、あるいは移植臓器または移植骨髄の拒絶の原因であるＴリンパ球上の他の特異的な受容体に結合する第２の結合部分と、第２の細胞毒薬物または放射線増感剤または抗癌剤との第２の複合体
と組み合わせて含む組成物。 - 第１の結合部分がトランスフェリンであり、第２の結合部分がトランスコバラミンである請求項３１に記載の組成物。
- 自己免疫疾患を患う患者を治療する方法であって、患者に、ａ）複合体がない場合に、自己免疫病による拒絶の原因と思われるリンパ球上の特異的な受容体と結合する結合部分と、ｂ）細胞毒との複合体を投与することを含み、その複合体が、患者の自己免疫病を治療するのに有効な量で投与される方法。
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