JP2004537515A - ウィルス感染症治療用薬物のターゲッティング送達 - Google Patents
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Abstract
トランスフェリンまたはトランスコバラミンと抗ウィルス剤との複合体は、ウィルス感染症の治療に有用である。好適な抗ウィルス剤としては、アポトーシス誘導化合物、ウィルス複製を阻害する化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素および変異細菌毒素が挙げられる。トランスフェリンまたはトランスコバラミンは、グルタルアルデヒドを用いて抗ウィルス剤に結合させることが好ましい。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に生物作用物質の分野、より具体的には、ストレスを受けているヒト細胞、特にウィルス感染の結果ストレスを受けているヒト細胞を含む細胞の治療に好適な生物作用物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物関連治療において、よく見られる２つの問題は、患者を衰弱させる薬物毒性問題と、より多くの薬物を必要とすることから薬物毒性問題を増大させて、しばしば死に至らしめる薬物耐性の問題がある。薬物毒性問題を解決する１つの方法は、疾患細胞のみを標的とするように薬物を送達することである。多くの研究者が、薬物送達のための抗体開発を研究中であり、この手法は有望でもある。しかしながら、抗体には問題がなくもない。例えば、抗体は正常組織と交差反応をすることが多く、また血管を損傷し（例えば、血管漏出症候群）、危険なアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）を引き起こす可能性がある。
【０００３】
悪性細胞に対して毒性である薬物を含む薬物送達による悪性細胞の治療法は、新しいものではない。特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５は、ガン細胞の治療としてまたはガン細胞を造影するために、蛋白質、主にトランスフェリンに複合化された細胞毒性物質または放射性造影物質を記載している。これらの出版物は、このような物質の作製および使用のための有用な方法を開示している。
【０００４】
例えば、ウィルス感染のヒト宿主細胞およびガンにより侵襲されたヒト細胞などのストレスを受けている細胞は、鉄などの栄養物の送達増加を必要とし、その増加は、鉄の場合、トランスフェリンなどの栄養担体に提示する受容体数の増加によってなされることが知られている。ストレスを受けている細胞において栄養担体に対する受容体増加は比較的一定であり、大きさの位数は、間欠的に比較的少数の受容体を示すことが知られているストレスを受けていない細胞よりも大きな数であることが知られている。上記に掲げた出版物およびその他のものは、ストレスを受けた細胞に対し造影物質または薬物またはその双方を送達するために、ガン含有細胞によって提示される、特にトランスフェリンに関する受容体数増加を利用することを開示している。
【０００５】
ストレスを受けた細胞の全てで、トランスフェリン受容体のアップレギュレーションがあるのか、また正常細胞の全てで、トランスフェリン受容体のダウンレギュレーションがあるのかを問うている研究はないが、多くの出所データにより、正常細胞の全てで、トランスフェリン受容体のダウンレギュレーションがあることが示唆されている。例えば、幼若赤血球（すなわち、正常赤芽球および細網赤血球）は、表面にトランスフェリン受容体を有するが、成熟赤血球は有さない（非特許文献１）。循環性単球でもまた、トランスフェリン受容体のアップレギュレーションはなく（非特許文献２）また、クッパー細胞などのマクロファージは、赤血球貪食というトランスフェリン非依存的方法により鉄の大部分を獲得する（非特許文献３）。実際、インビボ研究では、鉄が血漿トランスフェリンから細網内皮系にほとんど入らないことが示されている（非特許文献４）。マクロファージトランスフェリン受容体は、ガンマインターフェロンなどのサイトカイン類によりダウンレギュレートされ（非特許文献５）、細胞内寄生体を死滅させるための鉄制限機構としてダウンレギュレートされると推定されている（非特許文献６）。
【０００６】
休止リンパ球において、トランスフェリン受容体はダウンレギュレートされるのみならず、トランスフェリン受容体の遺伝子は測定不能である（非特許文献７）。対照的に、刺激されたリンパ球は、後期Ｇ１におけるトランスフェリン受容体をアップレギュレートする（非特許文献８）。受容体発現は、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子の発現、次いでＩＬ−２受容体のアップレギュレーションに引き続き起こり（非特許文献９）、それに伴って鉄調節蛋白結合活性の測定可能な増加があり（非特許文献１０）、これによりトランスフェリン受容体ｍＲＮＡが安定化される（非特許文献１１）。これは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の双方に当てはまり（非特許文献１２）、またＩＬ−２依存性の応答である（非特許文献１３）。
【０００７】
上記に掲げた出版物中に記載された物質で、最もよく理解されているものは、トランスフェリンとよく知られた有効な細胞毒性分子であるドキソルビシンとの複合体である。ドキソルビシンはガンに対し有効ではあるが、蓄積性の心臓毒性のためヒトへの最大生涯投与量を有している。前記複合体は、ヒトにおける薬剤耐性ガンを含む種々のガンを死滅させるのに驚くほど低用量で有効であることが示されている。
【０００８】
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による感染などの重篤なウィルス感染治療のために、よく知られて現在使用されている方法としては、ウィルスが細胞に侵入する上で利用する細胞受容体の遮断、融合機構への干渉、および蛋白分解酵素および逆転写酵素などのウィルスにより乗っとられた細胞酵素への干渉が挙げられる。このような方法、およびこれらの方法に使用される薬物は、重篤疾患患者の生命を延長させるのに有効であるが、全面的治癒には至っていない。これらの物質自体は、世界の多くの地域で使用するには法外に高価であることがよく知られている。このような薬物による治療は、複雑な投与計画により患者に負担をかけ、不快な副作用を与えることが多い。
【０００９】
ＨＩＶ感染により生じたエイズのような顕著な病態の治療に使用するための患者に対し、より低コスト、より少ない副作用で、より有効な結果を提供する物質が必要である。また、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルス、単純ヘルペスウィルスなど、社会の負担となっている他の種々のウィルス感染で感染した細胞治療に使用する物質も必要である。また、少量でも細胞毒性物質を使用することなくこのようなウィルスや種々のガンを死滅させる薬物もまた必要である。
【００１０】
関連技術の説明
エイズ患者の治療のためにＦＤＡにより現在承認されている薬物は全て、Ｔリンパ球においてＨＩＶのライフサイクルでの特定段階を攻撃するようにデザインされている（非特許文献１４）。この観点から、エイズへの戦いに勝利するために存在する薬理学的戦略は、現在２つのみである。１つは、ＤＮＡへのＲＮＡ逆転写時にウィルス複製を遮断する逆転写酵素阻害剤（ヌクレオシドおよび非ヌクレオシドの双方）の使用である（非特許文献１５）。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は全て、活性三リン酸類縁体に対する細胞内代謝を必要とするプロドラッグであり（非特許文献１６）、それらの使用により薬物耐性を生じることが多い（非特許文献１７）。
【００１１】
もう１つの方法は、ビリオン熟成時に、ｇａｇおよびｇａｇ−ｐｏｌポリ蛋白の処理を担うＨＩＶ蛋白分解酵素阻害剤を含む（非特許文献１８）。しかし、蛋白分解酵素阻害剤による治療もまた、薬剤耐性になることが多い（非特許文献１９）。薬剤耐性の発現は、抗ウィルス剤使用における主要な問題である（非特許文献２０）。
【００１２】
ウィルスのライフサイクルに基く従来型薬剤デザインのほかに、ウィルス宿主のエイズ患者の細胞であるＴリンパ球の免疫生物学に基く他の方法がある（非特許文献２１）。
【００１３】
最近の２つの研究は、これが有望な方法であることを示唆している。第一に、ＨＩＶの初回抗原刺激を受けたＣＤ８Ｔリンパ球を、エイズ患者に移すと、ウィルス血症を減少させることが示されている（非特許文献２２）。第二に、ＨＩＶ蛋白分解酵素活性部位を有するカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３酵素前駆体は、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球にトランスフェクトされた場合にアポトーシスを活性化することが示されているが、非感染細胞にトランスフェクトされた場合には示されていない（非特許文献２３）。これらの報告は、ウィルスが生存している細胞を選択的に死滅させることによるＨＩＶ感染制御の可能性を示唆する。
【００１４】
エイズ患者についての観察により、彼らの疾患の免疫不全要素は、ＨＩＶが生存するＴリンパ球の亜集団であるＣＤ４リンパ球欠乏のためであることが確証されている（非特許文献２４）。これらの細胞がエイズ患者に欠乏している理由は、アポトーシスとして知られている反応により細胞を除去するプログラム化された細胞死の酵素介在過程をウィルスが開始させるためである（非特許文献２５）。感染細胞がウィルスにより死滅すると、プラズマＨＩＶ ＲＮＡ濃度により測定されるウイルス血症が増加するが（非特許文献２６）、感染細胞が抗レトロウィルス剤により死滅する場合、ウイルス血症は減少し（非特許文献２７）、ウイルス血症の減少は臨床転帰の改善を伴う（非特許文献２８）。
【００１５】
特許文献６は、薬理活性物質をパピローマウイルス感染細胞に送達する方法を開示している。この方法は、薬理活性物質とリガンド認識ＣＤ１６とを含む複合体を使用する。前記リガンドが細胞のＣＤ１６に結合する十分な条件下で前記複合体をパピローマウイルス感染細胞に曝露させる。したがって、前記薬理活性物質が、感染細胞に近接し、送達される。この方法の使用により、薬理活性物質の感染細胞への標的送達が可能になる。これによって、非感染細胞におけるこのような薬剤活性に起因する多くの付随的副作用なしに、感染細胞に送達される多くの薬理活性剤を比較的高濃度に使用することが可能になる。
【００１６】
薬物の標的送達は、有効性を増加させる利点を有する一方、より少量の薬物を用いることにより、毒性を減じ、正常細胞に引き起こす損傷を少なくし、これら全てによって効果的にコストが減少し、患者医療の質も向上する。また標的送達により、薬物が細胞へ非特異的に入り込むことにより活性化される薬剤耐性が避けられる（非特許文献２９）。トランスフェリン−薬物複合体は、受容体特異的な経路を使用することにより特異的に細胞に入り込むため（非特許文献３０；非特許文献３１）、それらは、耐性細胞中の流出ポンプなどの薬物耐性機構の周縁でやりとりされる。
【００１７】
【特許文献１】
米国特許第４，８８６，７８０号
【特許文献２】
米国特許第４，８９５，７１４号
【特許文献３】
米国特許第５，０００，９３５号
【特許文献４】
Ｆａｕｌｋへの米国特許第５，１０８，９８７号
【特許文献５】
Ｓｔｊｅｒｎｈｏｌｍらへの米国特許第４，５９０，００１号
【非特許文献１】
Ｌｅｓｌｅｙ Ｊ、Ｈｙｍａｎ Ｒ、Ｓｃｈｕｌｔｅ ＲおよびＴｒｏｔｔｅｒ Ｊ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；８３：１４〜２５頁
【非特許文献２】
Ｔｅｓｔａ Ｕ、Ｐｅｌｏｓｉ ＥおよびＰｅｓｃｈｌｅ Ｃ、「Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇｅｎ、１９９３年；４：２４１〜２７６頁
【非特許文献３】
Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ＴＡ、Ｃｈａｒｌｔｏｎ ＲＷ、Ｃｏｏｋ ＪＤおよびＦｉｎｃｈ ＣＡ、「Ｉｒｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｍａｎ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７９年
【非特許文献４】
このレビューについて、Ｐｏｎｋａ ＰおよびＬｏｋ ＣＮ、「Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９年；３１：１１１１〜１１３７頁
【非特許文献５】
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＴＡ、Ｇｒａｙ ＰＷおよびＡｄａｍｓ ＤＯ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ」、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；８９：４７８〜４８８頁
【非特許文献６】
Ｂｙｒｄ ＴＦおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ ＭＡ、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｒｏｎ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９８９年；８３：１４５７〜１４６５頁
【非特許文献７】
Ｋｒｏｎｋｅ Ｍ、Ｌｅｏｎａｒｄ Ｗ、Ｄｅｐｐｅｒ ＪＭおよびＧｒｅｅｎｅ ＷＣ、「Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９８５年；１６１：１５９３〜１５９８頁
【非特許文献８】
Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ＲＭおよびＧａｌｂｒａｉｔｈ ＧＭ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｍｉｔｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｅｎｔｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８３年；１３３：７０３〜７１０頁
【非特許文献９】
Ｎｅｃｋｅｒｓ ＬＭおよびＣｏｓｓｍａｎ Ｊ、「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｔｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８３年；８０：３４９４〜３４９８頁
【非特許文献１０】
Ｔｅｓｔａ Ｕ、Ｋｕｈｎ Ｌ、Ｐｅｔｒｉｎｉ Ｍ、Ｑｕａｒａｎｔａ ＭＴ、Ｐｅｌｏｓｉ ＥおよびＰｅｓｈｌｅ Ｃ、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｉｎ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｖｅｒｓｕｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９１年；２６６：３９２５〜３９３０頁
【非特許文献１１】
Ｓｅｉｓｅｒ Ｃ、Ｔｅｘｉｅｉｒａ ＳおよびＫｕｈｎ ＬＣ、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９３年；２６８：１３，０７４〜１３，０８０頁
【非特許文献１２】
Ｎｅｃｋｅｒｓ ＬＭ、Ｙｅｎｏｋｉｄａ ＧおよびＪａｍｅｓ ＳＰ、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；１３３：２４３７〜２４４１頁
【非特許文献１３】
Ｎｅｃｋｅｒｓ ＬＭおよびＴｒｅｐｅｌ ＪＢ、「Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ、１９８６年；４：４６１〜４７０頁
【非特許文献１４】
Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ、１９９５年；８：２００頁
【非特許文献１５】
Ｃｒａｔｌｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８年；２４４：８７頁
【非特許文献１６】
Ｌａｖｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９７年；３：９２２頁
【非特許文献１７】
Ｈａｚｕｄａ＆Ｋｕｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９７年；３：８３６頁
【非特許文献１８】
Ｇｕｌｎｉｋら、「Ｖｉｔ＆Ｈｏｒｍｏｎｅｓ」、２０００年；５８：２１３頁
【非特許文献１９】
Ｏｌｓｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９９年；２７４：２３６９９頁
【非特許文献２０】
Ｃａｌｖｅｚ、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９８年；３（Ｓｕｐｐｌ４）：５頁
【非特許文献２１】
Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年；３７３：１２３頁
【非特許文献２２】
Ｄｒｏｄｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９９年；５：３４頁
【非特許文献２３】
Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９５年；５：２９頁
【非特許文献２４】
Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、１９９８年；１２８：１０５７頁
【非特許文献２５】
Ｃｉｃａｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０００年；９７：１１７８頁
【非特許文献２６】
Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ＮＩＨ Ｐａｎｅｌ、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、１９９８年；１２８（Ｎｏ．１２、ｐｔ２）：１０５７頁
【非特許文献２７】
Ｋａｔｚｅｎｓｔｅｉｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、１９９６年；３３５：１０９１頁
【非特許文献２８】
Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、１９９６年；３３４：４２６頁
【特許文献６】
Ｋａｓｔらへの米国特許第６，２４２，１７６号
【非特許文献２９】
Ｍａｒｂｅｕｆ−Ｇｕｅｙｅ Ｃ、Ｅｔｔｏｒｉ Ｄ、Ｐｒｉｅｂｅ Ｗ、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ＨおよびＧａｒｎｉｅｒ−Ｓｕｉｌｌｅｒｏｔ Ａ、「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｔｈｅ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ａｃｔａ、１９９９年；１４５０：３７４〜３８４頁
【非特許文献３０】
Ｋｌａｕｓｎｅｒ ＲＤ、ｖａｎＲｅｕｓｗｏｕｄｅ Ｊ，Ａｓｈｗｅｌｌ Ｇ、Ｋｅｍｐｆ Ｃ、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ＡＮ、Ｄｅａｎ ＡおよびＢｒｉｄｇｅｓ Ｋ、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｉｎ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８３年；２５８：４７１５〜４７２４頁
【非特許文献３１】
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【非特許文献３２】
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【非特許文献３３】
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【非特許文献３４】
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【非特許文献５７】
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【非特許文献５８】
Ｓｅｅｔｈｅｒａｍ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ、１９９９年；１９：１７３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、ＨＩＶ、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルス、単純ヘルペスウィルス感染などのウィルス感染症を治療する物質を提供する。前記物質は、ターゲッティング剤と受容体とが結合後、複合体の細胞からの脱離を阻害する成分と複合化されたトランスフェリンまたはトランスコバラミンなど、ウィルス感染細胞によりアップレギュレートされた受容体と結合する感染細胞ターゲッティング剤を含む。前記物質は、ウィルス感染細胞におけるアポトーシスを誘導することが見出された。好適な薬物としては、限定しないが、ドキソルビシンおよびメトトレキサートが挙げられる。本発明はまた、ウィルス感染患者の治療法および前記複合体を含有する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の要件は、細胞、特にストレスを受けている細胞を治療する複合体により満たされ、この複合体は、一実施態様において、ある担体を含み、この担体はストレス下の細胞に、より多数またはより頻繁に発現される受容体に引きつけられ、ある物質と複合化されている。この物質は、担体と細胞表面にアップレギュレートされた受容体との間で結合後、細胞からの複合物質の脱離を効果的に防ぐ。
【００２０】
前記担体は、細胞がストレスを受けている時、多数またはより頻繁に存在する細胞上の受容体に引きつけられる任意の有用な物質であり得る。この担体はトランスフェリンであることが好ましい。
【００２１】
薬剤は、受容体への担体の親和性を増大させる目的を達成する任意の薬剤であってよい。前記親和性を増大させる機構は様々であってよく、例えば、機構の効果が、接触後受容体から担体の正常な置換を干渉することであるという条件で細胞表面のリン脂質または担体の立体的再配置に対する薬剤の付加を含むことができる。現在のところ、このような薬剤で最もよく知られているのはドキソルビシンである。しかし、所望の効果を達成する任意の有用な物質を使用することができる。
【００２２】
担体に対する薬剤の付加は、少なくとも担体が親和性増大により対応する受容体に配置された後まで、薬剤と担体との分離を防止する任意の機構であってよい。現在、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体に関し、最もよく知られている付加の機構は、グルタルアルデヒドリンカーであるが、当の担体／薬剤の組合せにとって有用な任意の物質であってもよい。
【００２３】
本発明は、ＤＮＡインターカレーションなどの通常のドキソルビシン毒性機構により細胞を死滅させる目的で、ドキソルビシンを細胞に送達すると考えられていたよく知られているトランスフェリン−ドキソルビシン物質が、実際、その機構により細胞死滅を生じないという驚くべき、予想外の発見に基いている。複合体との接触によって処理された細胞は、ガン細胞がドキソルビシン単独で処理される場合に見られているように、壊死よりもむしろ細胞自滅型細胞死を経験していることが判明している。
【００２４】
本発明の基本的な態様は、感染ＣＤ４Ｔリンパ球総数が血液循環から除去されるためウィルス血症が減少し（非特許文献３２）、ウィルス血症減少と共に患者の健康状態が向上する（非特許文献３３）という観察に基いている。この観点から、ウイルス負荷を低下させる機構の１つは、ＨＩＶ−１−特異的細胞溶解性ＣＤ８Ｔリンパ球によるものである（非特許文献３４）。特定の標的細胞を除去する他の機構は、ガン細胞表面にトランスフェリン受容体を発現するヒトのガン細胞を死滅させるためにヒトトランスフェリンのドキソルビシン複合体を用いることによって示されたように（非特許文献３５）、担体蛋白質の表面受容体を発現する細胞に細胞毒性薬および／または抗レトロウィルス薬の蛋白複合体の標的送達を行うことによるものである。実際、結合反応は非常に特異的であり、トランスフェリンのドキソルビシン複合体は、細胞の不在下でも単離トランスフェリン受容体に結合することが示された（非特許文献３６）。さらに、細胞膜上のトランスフェリン受容体に対するトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の結合は、恐らく複合体と細胞膜構成要素との間のさらなる相互作用のため、細胞膜上のトランスフェリン受容体に対する非複合化トランスフェリンの結合よりも強い（非特許文献３７）。
【００２５】
本発明は、ＨＩＶなどのウィルス感染細胞に対する薬物の標的送達に使用されるヒトトランスフェリンの薬物複合体を利用する。本発明が有効である主要な理由は、ＨＩＶ感染ＣＤ４Ｔリンパ球が、それらの表面にトランスフェリン受容体をアップレギュレートすることである（非特許文献３８）。しかし、トランスフェリンの薬物複合体がＨＩＶ感染Ｔリンパ球に対して有効である理由がさらに幾つかある。第１にドキソルビシンなどの細胞毒性薬（非特許文献３９）の多くはアポトーシスを誘導し（非特許文献４０）、ドキソルビシンのトランスフェリン複合体が、アップレギュレートされたトランスフェリン受容体を有する細胞のアポトーシスを誘導するための有用な複合体であることを示している。第２に、たとえば、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体によるトランスフェリン受容体の活性化は、薬物誘導アポトーシス（非特許文献４１）、並びにアポトーシスのエフェクター経路（非特許文献４２；および非特許文献４３）に関連すると想定されるカルシウムチャネルの制御を伴う（非特許文献４４）。第３に、トランスフェリン受容体およびアポトーシス誘導Ｆａｓ受容体（ＡＰＯ−１／ＣＤ９５）は、細胞表面に配置されているが（非特許文献４５）、トランスフェリン複合体がアップレギュレートされたトランスフェリン受容体を有する細胞に送達されると、前記複合体が結合され、結局は細胞内に取り込まれ（非特許文献４６）、したがって細胞表面並びに細胞内で活性化された機構により死滅させる可能性を与える（非特許文献３５）。
【００２６】
Ｔリンパ球を身体から一掃する免疫生物学は、アポトーシスとして知られている方法によりプログラム化された細胞死の経路を開始することである（非特許文献４７）。これは、胸腺または末梢循環に生じ得る（非特許文献４８）。幾つかのアポトーシス機構があるが、それら全てが働いて、選択された細胞を身体から除去する（非特許文献４９）。本発明は、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球を除外する新規な方法である。本法の戦略は、アポトーシス経由のクローン除去により感染Ｔリンパ球を除外することである。これは、細胞毒性薬および／または抗レトロウィルス薬を感染細胞に標的送達するために薬物−蛋白質複合体を用いることにより達成される。
本発明の複合体の標的送達は、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球の表面にアップレギュレートされる受容体に結合親和性を有する複合体中の蛋白質によりもたらされる（非特許文献３８）。また、薬物−トランスフェリン複合体の薬物は、アポトーシスおよび活性化末梢Ｔリンパ球のクローン除去を引き起こすことが知られているメトトレキサートであってよい（非特許文献５０）。ガン細胞の表面に存在する（非特許文献５１）感染細胞（非特許文献３８）および抗原刺激化Ｔリンパ球（非特許文献５２）以外には、トランスフェリン受容体は、正常な成人休止細胞の表面上に通常存在しない（非特許文献５３）。したがって、正常細胞は影響を受けず、メトトレキサート−トランスフェリン複合体によって除外される細胞は、感染Ｔリンパ球のみとなる。
【００２７】
ＨＩＶ感染細胞への標的薬物送達を実行する本発明の方法は、血中鉄を輸送するトランスフェリンの利用に焦点を当てることである。トランスフェリンは、血漿からの単離、商品提供者、または組換え技術（非特許文献５４）により得ることができる。薬物蛋白質複合体を形成するために、トランスフェリン分子は、細胞増殖抑制薬または抗レトロウィルス薬と結合させて調製するような方法で修飾しなければならない。
【００２８】
薬物は、メトトレキサートなどのアポトーシス開始剤、ドキソルビシンまたはアルキル化剤などの細胞毒性抗生物質であってよいが、リシンなどの植物毒素、修飾ジフテリア毒素などの変異細菌毒素など、任意の化合物を使用することができる（非特許文献５５）。グルタルアルデヒドカップリング（非特許文献５３）、ジスルフィドカップリング（非特許文献５６）およびベンゾイルヒドラジンカップリング（非特許文献５７）などの幾つかのカップリング法が、トランスフェリンと他の化合物とを結合させるために用いられてきた。多様なカップリング法は、広範囲な細胞毒性薬とトランスフェリンとの複合化を可能にし、薬物とトランスフェリン分子との永続的結合または解離可能な結合のいずれかを生じさせる。カップリング反応後、好ましくはクロマトグラフィー法を用いることにより、薬物−蛋白質複合体を未結合薬物と遊離蛋白質から分離できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
複合化法の技術的内容は様々であり得るが、いずれの方法においてもその要件は、（ａ）ウィルス感染細胞との結合実験および死滅実験において活性であり、（ｂ）有意な数の正常細胞とは結合また死滅させない、特定の複合体を調製することである。これらの要件を鑑みて、本発明による複合体の好ましい調製法は、以下の方法である：予め決められた分子比率を有する均質トランスフェリン−アドリアマイシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。このように、第１ステップは、ＤＯＸの食塩水をＤＭＳＯなどの溶媒または他の好適な凍結保存剤を含有するＧＬＵの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
【００３０】
遊離ＤＯＸまたは遊離ＧＬＵのいずれも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生じるように、ＤＯＸとＧＬＵとのモル比は上記反応と同じである。しかし、１個のＧＬＵが２個のＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸを生成する場合は、溶液中に遊離ＧＬＵの可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵ溶液に滴下することにより生じる質量作用速度論によって、この可能性は最少化される。これらの反応物の容量は制限されないので、大量の均質ＤＯＸ−ＧＬＵが調製できる。
【００３１】
複合化反応の第２ステップは、ＤＯＸ−ＧＬＵをトランスフェリン（ＴＲＦ）の食塩水に滴下により加えることである。ＴＲＦは、鉄なし（アポトランスフェリン）または鉄飽和（ホロトランスフェリン）のいずれであってもよい。ＤＯＸ対ＴＲＦの所望のモル比はＴＲＦの容量を適切に調整することにより得られた。得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を暗所で室温下２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵとの反応とは異なって、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分がＴＲＦ分子中のイプシロン−アミノリジン基数個のうち、任意の１個と反応できることから、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦとの反応は１個の結合部位に制限されない。
【００３２】
ＴＲＦに結合したＤＯＸ分子数は第２ステップにて決定された。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５分子のＤＯＸを含んだことになる。しかし、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４分子のＤＯＸを含んだことになる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９分子のＤＯＸを含んだことになる。この方法で、ＤＯＸ対ＴＲＦの予め決められた比率で大量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて提供できる。
【００３３】
複合化反応のさらなるステップは、エタノールアミンまたは任意の過剰リンカーを捕捉するのに好適な他の物質の添加、次いで遠心分離および透析であった。ＤＯＸとＴＲＦとの反応は、理論的にはＧＬＵの全てを消費するが、利用できるＧＬＵのいずれとも結合させるために、エタノールアミンを最終反応混合物に加えた。この反応を暗所で３０分間続けた。最終溶液を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００倍過剰の食塩水で６時間２回かつ同一過剰のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で３回透析し、得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体を使用のために準備した。
【００３４】
複合体の生化学的特性決定：
（３９）に記載されたＨＰＬＣとポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を測定できる。また、分光側光法を用いて、ＤＯＸ対ＴＲＦの分子比を決定できる。これらの方法により、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均質性が繰り返し明らかにされた。さらに、凝集物または断片がないため、これらの複合体を調製する上でクロマトグラフィーを必要としない。このことにより、収量を増大させ、コストを下げる大容量の均質トランスフェリン−薬物複合体の調製が可能となる。
【００３５】
トランスフェリン−薬物複合体の他のタイプにおけるＴＲＦおよびＤＯＸの損失により生じる費用が、使用の際の障害となっている。例えば、ＤＯＸおよびＴＲＦの収量は、薬物および／または蛋白質を変化させるチオール化などの方法を用いることにより減少する。収量はまた、溶媒系を用いることにより、および酸安定性結合および酸不安定性結合を調製するために使用されるクロマトグラフィーにより減少する。ＤＯＸとＴＲＦとの間のＧＬＵ結合は酸安定性であり、本発明に従って調製された有用な複合体の収量は高い。実際、他の方法と比較して、有用な複合体の収量は５倍増大する。
【００３６】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の調製に対する以前知られた手法はいずれも、トランスフェリン１分子当たりの薬物分子数の比率を予め決めた上で大量の均質複合体を生産することができない。さらに、他の手法では、凝集物を除外し、均質複合体に富む分画を獲得するためにクロマトグラフィーが使用される。これらの方法は、収量を減少し、コストを増加させ、分子比率を予め決定する能力を欠く。
【００３７】
他の手順は、トランスフェリン１ミリリットル（０．５ｍＭ）と１５０ｍＭ塩化ナトリウム中ドキソルビシン１ミリリットル（８．５ｍＭ）とを４分間混合してから、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中２１．５ｍＭグルタルアルデヒド１ミリリットルを加えて４分間混合することである。前記反応はカップリング法であるが、これを１５０ｍＭ塩化ナトリウム中３７．２ｍＭエタノールアミン０．８ミリリットルと１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）とを添加することにより中止し、４分間渦巻き回転させる。次にこの混合物を、Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水０．５リットルに対して暗所で５℃３時間透析する透析管（分子量１２，０００〜１４，０００の分離）に移す。透析は、新鮮なＨｅｐｅｓ緩衝食塩水により少なくとも１回繰り返す必要がある。次いで混合物を１６００ｇで４℃１０分間遠心分離し、上澄液を、前もってＨｅｐｅｓ緩衝食塩水中で平衡にし、ブルーデキストラン、トランスフェリンおよびチトクロームＣにより５℃で較正したセファロースＣＬ−４Ｂの２．６ｘ３４ｃｍカラム上、１時間当たり２２ミリリットルの流速でクロマトグラフする。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターし、３．８ミリリットルの分画を集める。各分画中のトランスフェリンおよびドキソルビシンの濃度を、トランスフェリンでは２８０ｎｍ、ドキソルビシンでは２９５ｎｍを用いることにより測定されるトランスフェリン並びにドキソルビシンの検量線から漸次接近法により計算する。このカップリング法を修飾することにより、メトトレキサートおよび／または抗レトロウィルス薬のトランスフェリン複合体など、他の薬物のトランスフェリン複合体を調製するために使用できる。好適な抗レトロウィルス薬は、限定しないが、ジダノシン（ｄｄＩ、Ｖｉｄｅｘ）、ラミブジン（３ＴＣ、Ｅｐｉｖｉｒ）、スタブジン（ｄ４Ｔ、Ｚｅｒｉｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ、Ｈｉｖｉｄ）、およびジドブジン（ＡＺＴ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）などのヌクレオシド類縁体またはヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）およびネビラピン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）などの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、ネルフィナビル（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）およびサキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）などの蛋白分解酵素阻害剤が挙げられる。
【００３８】
純粋な薬物−蛋白質複合体が単離されると、それらは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により特性決定できることから分子量が測定され、蛋白質１分子当たりの薬物分子数を決定できる。他のシステムにおける薬物−蛋白質複合体を用いた経験により、機能的薬物−蛋白質比（非特許文献５３）は、蛋白質１分子当たり０．１〜４．０薬物分子であることが示されている。複合化の後、複合体特性決定における重要なステップは、（ａ）複合体が感染細胞表面の受容体に結合し、非感染細胞には結合しないかどうかを測定すること、および（ｂ）複合体が感染細胞を死滅させ、非感染細胞を死滅させないかどうかを測定することである。結合試験は、フローサイトメトリーを用いることより行うことができ、また死滅試験は、微量培養法を用いて行うことができ、感染細胞数を５０％死滅させるのに必要な薬物−蛋白質複合体中の薬物濃度と比較して、同数の感染細胞培養を死滅させるのに必要な遊離薬物濃度を決定する。他のシステムにおける薬物−蛋白質複合体を用いた経験により、薬物−蛋白質複合体中の薬物と比較して約１０倍以上の遊離薬物が、同数の感染細胞を死滅させるのに必要であることが示されている。複合体が有効であるためには、それが、最少の非感染細胞だけを死滅させるということも必要である。
【００３９】
本発明は、送達蛋白質であるトランスフェリンに関して記載したが、感染細胞の受容体部位に結合できる他の蛋白質が体内に存在することが知られている。受容体部位が感染細胞で活性化され、非感染細胞では不活性である場合、このような受容体部位に結合する任意の蛋白質または他の化合物を、本発明に使用される薬物を送達するために使用できる。このような結合蛋白質の１つの例としては、ビタミン、特にビタミンＢ１２をヒト体内細胞のトランスコバラミン受容体に送達するトランスコバラミンがある（非特許文献５８）。他の例としては、限定しないが、ソマトスタチン、上皮細胞成長因子様分子および葉酸様分子などの非蛋白ターゲッティング剤が挙げられる。
【００４０】
薬物−蛋白質複合体の調製後、それを精製し、特性決定し、細胞結合性と死滅性を確認でき、また、結合実験と死滅実験により、複合体が感染細胞に結合し、死滅させるが、非感染細胞ではそうでないことを示したら、複合体を分割して滅菌できる。滅菌法は、セシウム照射装置を用いることなどによる放射線曝露により行うことができ、またはミリポアろ過法を用いることにより行うことができる。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、鉄担持トランスフェリンおよびトランスフェリンと抗ウィルス剤との複合体を含む腫瘍治療用試薬キットが提供される。トランスフェリン受容体を有する患者の正常細胞は、抗ウィルス剤の投与前に、これらの受容体を鉄担持トランスフェリンで飽和することにより、複合体の効果に対して保護できる。
【００４２】
本発明はまた、トランスフェリンと多種類の抗ウィルス剤との複合体を感染細胞部位に個々に投与することを含む、抗ウィルス剤に対する腫瘍細胞の感受性測定方法を提供する。このような多種類の複合体を含む試薬キットが、この目的のために提供できる。
【００４３】
本発明はまた、複合体が少なくとも１種の遊離（非複合化）抗ウィルス剤をも含有する「カクテル」に含まれる組成物と、この組成物の使用法を提供する。
本発明による複合体は、有効量で動物に投与される。ウィルス感染症治療において、有効量は、ウィルス力価を減じるための有効量を含む。複合体の投与量は、患者の年令、体重および病状、および抗ウィルス剤の薬物動態を考慮して決定できる。有効な治療に要する複合体量は、抗ウィルス剤単独使用に要する量よりも少量となり、用いられる抗ウィルス剤に依存する。例えば、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の投与量は、１５０ポンド（６８ｋｇ）の人に対し２８日間当たり０．５ｍｇから５０ｍｇの間であることが予想される。投与量は、２８日の間に間隔を変えてより少用量として投与できる。
【００４４】
本発明の薬剤組成物は、限定しないが、経口、局所、直腸、眼、膣などの多くの経路、例えばエアゾールの使用による肺経路、または、限定しないが、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、静脈内などの非経口的経路により投与できる。前記組成物は、単独で投与できるか、または標準的な製剤実施に従って製剤的に許容できる担体または賦形剤と組合せることができる。経口投与様式では、組成物を錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液剤、懸濁液剤などの形態で使用できる。非経口投与では通常、複合体の滅菌溶液を調製し、溶液のｐＨを好適に調整し、緩衝化する。静脈内使用では、溶質の総濃度を制御して、製剤を等張にする必要がある。眼投与では、軟膏または点眼液を、アプリケータまたは点眼びんなどの当業界に知られた眼送達系により送達できる。肺投与では、希釈剤および／または担体が、エアゾールの形成を可能にするため適切であるように選ばれる。本発明の複合体は、輸液または注射液により非経口的、すなわち静脈内または腹腔内に投与されることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様を以下に記載する。修飾および変更が可能であり、それらの全ては特許請求の範囲内に入ることを意図していることは、以下の記載を読めば、通常の当業者にとって明らかとなろう。
【実施例１】
【００４５】
均質複合体の調製
予め分子比率で決められた均質トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。第１ステップは、氷冷水浴中でＧＬＵをＤＭＳＯに滴下により加えることであった。次に、ＤＯＸの食塩水をＧＬＵ＋ＤＭＳＯの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
遊離ＤＯＸも遊離ＧＬＵも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生じさせるように、ＤＯＸとＧＬＵとのモル比は上記反応と同じである。しかし、１個のＧＬＵが２個のＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸを生成する場合は、溶液中に遊離ＧＬＵの可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵ溶液に滴下して加えることによって生じる質量作用速度論によって、この可能性は最少化される。これらの反応物の容量は制限されないので、大量の均質ＤＯＸ−ＧＬＵが調製できる。
【００４６】
複合化反応の第２ステップは、ＤＯＸ−ＧＬＵをトランスフェリン（ＴＲＦ）の食塩水に滴下により加えることであった。ＴＲＦは、鉄なし（アポトランスフェリン）または鉄飽和（ホロトランスフェリン）のいずれであってもよい。ＤＯＸ対ＴＲＦの所望のモル比はＴＲＦの容量を適切に調整することにより得られた。得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を暗所で室温下２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵとの反応とは異なって、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分がＴＲＦ分子中のイプシロン−アミノリジン基数個のうち、任意の１個と反応できることから、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦとの反応は１個の結合部位に制限されない。
【００４７】
ＴＲＦに結合したＤＯＸ分子数は第２ステップにて決定された。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５分子のＤＯＸを含んだことになる。しかし、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４分子のＤＯＸを含んだことになる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９分子のＤＯＸを含んだことになる。この方法で、ＤＯＸ対ＴＲＦの予め決められた比率で大量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて提供できる。
【００４８】
複合化反応のさらなるステップは、エタノールアミンの添加、次いで遠心分離および透析であった。ＤＯＸとＴＲＦとの反応は、理論的にはＧＬＵの全てを消費するが、利用できるＧＬＵのいずれとも結合させるために、エタノールアミンを最終反応混合物に加えた。この反応を暗所で３０分間続けた。最終溶液を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００倍過剰の食塩水で６時間２回、かつ同一過剰のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で３回透析し、得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体を使用のために準備した。
【００４９】
複合体の生化学的特性決定：
ＨＰＬＣとポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を測定できる。また、分光側光法を用いることによって、ＤＯＸ対ＴＲＦの分子比を決定できる。これらの方法により、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均質性が繰り返し明らかになった。さらに、凝集物または断片がないため、これらの複合体を調製する上でクロマトグラフィーを必要としない。このことにより、収量を増大し、コストを下げる大容量の均質トランスフェリン−薬物複合体の調製が可能になる。
【００５０】
トランスフェリン−薬物複合体の他のタイプにおけるＴＲＦおよびＤＯＸの損失により生じる費用が、使用の際の障害となっている。例えば、ＤＯＸおよびＴＲＦの収量は、薬物および／または蛋白質を変化させるチオール化などの方法を用いることにより減少する。収量はまた、溶媒系を用いることにより、および酸安定性結合および酸不安定性結合を調製するために使用されるクロマトグラフィーにより減少する。ＤＯＸとＴＲＦとの間のＧＬＵ結合は酸安定性であり、本発明に従って調製されたＴＲＦ−ＤＯＸ複合体中のＤＯＸとＴＲＦの収量は高い。実際、他の知られた方法と比較して、ＴＲＦの収量は２倍近くあり（９０％対５０％）、ＤＯＸの収量は５倍増大する。
【００５１】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の調製に対する以前から知られた手法はいずれも、トランスフェリン１分子当たりの薬物分子数比率を予め決めた上で大量の均質複合体を生産することができない。さらに、他の手法では、凝集物を除外し、均質複合体に富む分画を獲得するためにクロマトグラフィーが使用される。これらの方法は、収量を減少し、コストを増加させ、分子比率を予め決定する能力を欠く。
【実施例２】
【００５２】
抗ウィルス活性
種々のウィルスに対する有効性が試験された。これらは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびＨＩＶであった。ＨＩＶに対する結果が特に良好であった。
【００５３】
例えば、ヒト血液細胞に生存するＨＩＶ−１ウィルスＲＯＪＯ株の阻害に関してＴＲ−ＤＯＸにより得られた用量反応曲線を図１に示す。この実験室試験系において、ＴＲ−ＤＯＸはヒトエイズ患者のＨＩＶを治療するために有効な薬物として使用できることを示唆する濃度で、エイズウィルスに対して強力な効果を有した。
【００５４】
同様に図２は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に感染したヒト肝細胞をＴＲ−ＤＯＸの増加濃度に曝露することにより得られた用量反応曲線を示す。ここでもまた、ＴＲ−ＤＯＸの極低濃度は、ＨＢＶのほぼ完全阻害をもたらすことが判明した。
【００５５】
最後に、ヒト肺細胞に生存するサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対するＴＲ−ＤＯＸの効果を試験したが、ここでもデータは、ＣＭＶに対するＴＲ−ＤＯＸの強力な効果を明らかにした。ＣＭＶに対するＴＲ−ＤＯＸの用量反応曲線を図３に示す。
【００５６】
ＣＭＶに対するＴＲ−ＤＯＸの相対的効力を、ガンシクロビル（広く使用されている抗ウィルス化合物）の効力と直接比較すると、ＣＭＶの５０％阻害に要する濃度に関して、ＴＲ−ＤＯＸはガンシクロビルよりも２００倍以上強力であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】トランスフェリン−ドキソルビシン（ＴＲ−ＤＯＸ）複合体によるヒト血液細胞に生存するＨＩＶ−１ウィルスＲＯＪＯ株の阻害に関して得られた用量反応曲線を示す図である。
【図２】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に感染したヒト肝細胞をトランスフェリン−ドキソルビシン（ＴＲ−ＤＯＸ）複合体に濃度を増加させながら曝露することにより得られた用量反応曲線を示す図である。
【図３】ヒト肺細胞に生存するサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対するトランスフェリン−ドキソルビシン（ＴＲ−ＤＯＸ）複合体の効果を示す図である。
【０００１】
本発明は、一般に生物作用物質の分野、より具体的には、ストレスを受けているヒト細胞、特にウィルス感染の結果ストレスを受けているヒト細胞を含む細胞の治療に好適な生物作用物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物関連治療において、よく見られる２つの問題は、患者を衰弱させる薬物毒性問題と、より多くの薬物を必要とすることから薬物毒性問題を増大させて、しばしば死に至らしめる薬物耐性の問題がある。薬物毒性問題を解決する１つの方法は、疾患細胞のみを標的とするように薬物を送達することである。多くの研究者が、薬物送達のための抗体開発を研究中であり、この手法は有望でもある。しかしながら、抗体には問題がなくもない。例えば、抗体は正常組織と交差反応をすることが多く、また血管を損傷し（例えば、血管漏出症候群）、危険なアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー）を引き起こす可能性がある。
【０００３】
悪性細胞に対して毒性である薬物を含む薬物送達による悪性細胞の治療法は、新しいものではない。特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５は、ガン細胞の治療としてまたはガン細胞を造影するために、蛋白質、主にトランスフェリンに複合化された細胞毒性物質または放射性造影物質を記載している。これらの出版物は、このような物質の作製および使用のための有用な方法を開示している。
【０００４】
例えば、ウィルス感染のヒト宿主細胞およびガンにより侵襲されたヒト細胞などのストレスを受けている細胞は、鉄などの栄養物の送達増加を必要とし、その増加は、鉄の場合、トランスフェリンなどの栄養担体に提示する受容体数の増加によってなされることが知られている。ストレスを受けている細胞において栄養担体に対する受容体増加は比較的一定であり、大きさの位数は、間欠的に比較的少数の受容体を示すことが知られているストレスを受けていない細胞よりも大きな数であることが知られている。上記に掲げた出版物およびその他のものは、ストレスを受けた細胞に対し造影物質または薬物またはその双方を送達するために、ガン含有細胞によって提示される、特にトランスフェリンに関する受容体数増加を利用することを開示している。
【０００５】
ストレスを受けた細胞の全てで、トランスフェリン受容体のアップレギュレーションがあるのか、また正常細胞の全てで、トランスフェリン受容体のダウンレギュレーションがあるのかを問うている研究はないが、多くの出所データにより、正常細胞の全てで、トランスフェリン受容体のダウンレギュレーションがあることが示唆されている。例えば、幼若赤血球（すなわち、正常赤芽球および細網赤血球）は、表面にトランスフェリン受容体を有するが、成熟赤血球は有さない（非特許文献１）。循環性単球でもまた、トランスフェリン受容体のアップレギュレーションはなく（非特許文献２）また、クッパー細胞などのマクロファージは、赤血球貪食というトランスフェリン非依存的方法により鉄の大部分を獲得する（非特許文献３）。実際、インビボ研究では、鉄が血漿トランスフェリンから細網内皮系にほとんど入らないことが示されている（非特許文献４）。マクロファージトランスフェリン受容体は、ガンマインターフェロンなどのサイトカイン類によりダウンレギュレートされ（非特許文献５）、細胞内寄生体を死滅させるための鉄制限機構としてダウンレギュレートされると推定されている（非特許文献６）。
【０００６】
休止リンパ球において、トランスフェリン受容体はダウンレギュレートされるのみならず、トランスフェリン受容体の遺伝子は測定不能である（非特許文献７）。対照的に、刺激されたリンパ球は、後期Ｇ１におけるトランスフェリン受容体をアップレギュレートする（非特許文献８）。受容体発現は、ｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子の発現、次いでＩＬ−２受容体のアップレギュレーションに引き続き起こり（非特許文献９）、それに伴って鉄調節蛋白結合活性の測定可能な増加があり（非特許文献１０）、これによりトランスフェリン受容体ｍＲＮＡが安定化される（非特許文献１１）。これは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の双方に当てはまり（非特許文献１２）、またＩＬ−２依存性の応答である（非特許文献１３）。
【０００７】
上記に掲げた出版物中に記載された物質で、最もよく理解されているものは、トランスフェリンとよく知られた有効な細胞毒性分子であるドキソルビシンとの複合体である。ドキソルビシンはガンに対し有効ではあるが、蓄積性の心臓毒性のためヒトへの最大生涯投与量を有している。前記複合体は、ヒトにおける薬剤耐性ガンを含む種々のガンを死滅させるのに驚くほど低用量で有効であることが示されている。
【０００８】
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）による感染などの重篤なウィルス感染治療のために、よく知られて現在使用されている方法としては、ウィルスが細胞に侵入する上で利用する細胞受容体の遮断、融合機構への干渉、および蛋白分解酵素および逆転写酵素などのウィルスにより乗っとられた細胞酵素への干渉が挙げられる。このような方法、およびこれらの方法に使用される薬物は、重篤疾患患者の生命を延長させるのに有効であるが、全面的治癒には至っていない。これらの物質自体は、世界の多くの地域で使用するには法外に高価であることがよく知られている。このような薬物による治療は、複雑な投与計画により患者に負担をかけ、不快な副作用を与えることが多い。
【０００９】
ＨＩＶ感染により生じたエイズのような顕著な病態の治療に使用するための患者に対し、より低コスト、より少ない副作用で、より有効な結果を提供する物質が必要である。また、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルス、単純ヘルペスウィルスなど、社会の負担となっている他の種々のウィルス感染で感染した細胞治療に使用する物質も必要である。また、少量でも細胞毒性物質を使用することなくこのようなウィルスや種々のガンを死滅させる薬物もまた必要である。
【００１０】
関連技術の説明
エイズ患者の治療のためにＦＤＡにより現在承認されている薬物は全て、Ｔリンパ球においてＨＩＶのライフサイクルでの特定段階を攻撃するようにデザインされている（非特許文献１４）。この観点から、エイズへの戦いに勝利するために存在する薬理学的戦略は、現在２つのみである。１つは、ＤＮＡへのＲＮＡ逆転写時にウィルス複製を遮断する逆転写酵素阻害剤（ヌクレオシドおよび非ヌクレオシドの双方）の使用である（非特許文献１５）。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は全て、活性三リン酸類縁体に対する細胞内代謝を必要とするプロドラッグであり（非特許文献１６）、それらの使用により薬物耐性を生じることが多い（非特許文献１７）。
【００１１】
もう１つの方法は、ビリオン熟成時に、ｇａｇおよびｇａｇ−ｐｏｌポリ蛋白の処理を担うＨＩＶ蛋白分解酵素阻害剤を含む（非特許文献１８）。しかし、蛋白分解酵素阻害剤による治療もまた、薬剤耐性になることが多い（非特許文献１９）。薬剤耐性の発現は、抗ウィルス剤使用における主要な問題である（非特許文献２０）。
【００１２】
ウィルスのライフサイクルに基く従来型薬剤デザインのほかに、ウィルス宿主のエイズ患者の細胞であるＴリンパ球の免疫生物学に基く他の方法がある（非特許文献２１）。
【００１３】
最近の２つの研究は、これが有望な方法であることを示唆している。第一に、ＨＩＶの初回抗原刺激を受けたＣＤ８Ｔリンパ球を、エイズ患者に移すと、ウィルス血症を減少させることが示されている（非特許文献２２）。第二に、ＨＩＶ蛋白分解酵素活性部位を有するカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３酵素前駆体は、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球にトランスフェクトされた場合にアポトーシスを活性化することが示されているが、非感染細胞にトランスフェクトされた場合には示されていない（非特許文献２３）。これらの報告は、ウィルスが生存している細胞を選択的に死滅させることによるＨＩＶ感染制御の可能性を示唆する。
【００１４】
エイズ患者についての観察により、彼らの疾患の免疫不全要素は、ＨＩＶが生存するＴリンパ球の亜集団であるＣＤ４リンパ球欠乏のためであることが確証されている（非特許文献２４）。これらの細胞がエイズ患者に欠乏している理由は、アポトーシスとして知られている反応により細胞を除去するプログラム化された細胞死の酵素介在過程をウィルスが開始させるためである（非特許文献２５）。感染細胞がウィルスにより死滅すると、プラズマＨＩＶ ＲＮＡ濃度により測定されるウイルス血症が増加するが（非特許文献２６）、感染細胞が抗レトロウィルス剤により死滅する場合、ウイルス血症は減少し（非特許文献２７）、ウイルス血症の減少は臨床転帰の改善を伴う（非特許文献２８）。
【００１５】
特許文献６は、薬理活性物質をパピローマウイルス感染細胞に送達する方法を開示している。この方法は、薬理活性物質とリガンド認識ＣＤ１６とを含む複合体を使用する。前記リガンドが細胞のＣＤ１６に結合する十分な条件下で前記複合体をパピローマウイルス感染細胞に曝露させる。したがって、前記薬理活性物質が、感染細胞に近接し、送達される。この方法の使用により、薬理活性物質の感染細胞への標的送達が可能になる。これによって、非感染細胞におけるこのような薬剤活性に起因する多くの付随的副作用なしに、感染細胞に送達される多くの薬理活性剤を比較的高濃度に使用することが可能になる。
【００１６】
薬物の標的送達は、有効性を増加させる利点を有する一方、より少量の薬物を用いることにより、毒性を減じ、正常細胞に引き起こす損傷を少なくし、これら全てによって効果的にコストが減少し、患者医療の質も向上する。また標的送達により、薬物が細胞へ非特異的に入り込むことにより活性化される薬剤耐性が避けられる（非特許文献２９）。トランスフェリン−薬物複合体は、受容体特異的な経路を使用することにより特異的に細胞に入り込むため（非特許文献３０；非特許文献３１）、それらは、耐性細胞中の流出ポンプなどの薬物耐性機構の周縁でやりとりされる。
【００１７】
【特許文献１】
米国特許第４，８８６，７８０号
【特許文献２】
米国特許第４，８９５，７１４号
【特許文献３】
米国特許第５，０００，９３５号
【特許文献４】
Ｆａｕｌｋへの米国特許第５，１０８，９８７号
【特許文献５】
Ｓｔｊｅｒｎｈｏｌｍらへの米国特許第４，５９０，００１号
【非特許文献１】
Ｌｅｓｌｅｙ Ｊ、Ｈｙｍａｎ Ｒ、Ｓｃｈｕｌｔｅ ＲおよびＴｒｏｔｔｅｒ Ｊ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；８３：１４〜２５頁
【非特許文献２】
Ｔｅｓｔａ Ｕ、Ｐｅｌｏｓｉ ＥおよびＰｅｓｃｈｌｅ Ｃ、「Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇｅｎ、１９９３年；４：２４１〜２７６頁
【非特許文献３】
Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ＴＡ、Ｃｈａｒｌｔｏｎ ＲＷ、Ｃｏｏｋ ＪＤおよびＦｉｎｃｈ ＣＡ、「Ｉｒｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｍａｎ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７９年
【非特許文献４】
このレビューについて、Ｐｏｎｋａ ＰおよびＬｏｋ ＣＮ、「Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｒｏｌｅ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９年；３１：１１１１〜１１３７頁
【非特許文献５】
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＴＡ、Ｇｒａｙ ＰＷおよびＡｄａｍｓ ＤＯ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｓ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ」、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８４年；８９：４７８〜４８８頁
【非特許文献６】
Ｂｙｒｄ ＴＦおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ ＭＡ、「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｂｙ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｒｏｎ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９８９年；８３：１４５７〜１４６５頁
【非特許文献７】
Ｋｒｏｎｋｅ Ｍ、Ｌｅｏｎａｒｄ Ｗ、Ｄｅｐｐｅｒ ＪＭおよびＧｒｅｅｎｅ ＷＣ、「Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９８５年；１６１：１５９３〜１５９８頁
【非特許文献８】
Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ＲＭおよびＧａｌｂｒａｉｔｈ ＧＭ、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｎ ｍｉｔｏｇｅｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｖｅｎｔｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８３年；１３３：７０３〜７１０頁
【非特許文献９】
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【非特許文献１０】
Ｔｅｓｔａ Ｕ、Ｋｕｈｎ Ｌ、Ｐｅｔｒｉｎｉ Ｍ、Ｑｕａｒａｎｔａ ＭＴ、Ｐｅｌｏｓｉ ＥおよびＰｅｓｈｌｅ Ｃ、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ）ｉｎ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｖｅｒｓｕｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９１年；２６６：３９２５〜３９３０頁
【非特許文献１１】
Ｓｅｉｓｅｒ Ｃ、Ｔｅｘｉｅｉｒａ ＳおよびＫｕｈｎ ＬＣ、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍＲＮＡ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９３年；２６８：１３，０７４〜１３，０８０頁
【非特許文献１２】
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【非特許文献１５】
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【非特許文献１６】
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【非特許文献１７】
Ｈａｚｕｄａ＆Ｋｕｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９７年；３：８３６頁
【非特許文献１８】
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【非特許文献１９】
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【非特許文献２０】
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【非特許文献２１】
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【非特許文献２２】
Ｄｒｏｄｉｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９９年；５：３４頁
【非特許文献２３】
Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９５年；５：２９頁
【非特許文献２４】
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【非特許文献２５】
Ｃｉｃａｌａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、２０００年；９７：１１７８頁
【非特許文献２６】
Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ＮＩＨ Ｐａｎｅｌ、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ、１９９８年；１２８（Ｎｏ．１２、ｐｔ２）：１０５７頁
【非特許文献２７】
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【非特許文献２８】
Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、１９９６年；３３４：４２６頁
【特許文献６】
Ｋａｓｔらへの米国特許第６，２４２，１７６号
【非特許文献２９】
Ｍａｒｂｅｕｆ−Ｇｕｅｙｅ Ｃ、Ｅｔｔｏｒｉ Ｄ、Ｐｒｉｅｂｅ Ｗ、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ＨおよびＧａｒｎｉｅｒ−Ｓｕｉｌｌｅｒｏｔ Ａ、「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｔｈｅ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ Ａｃｔａ、１９９９年；１４５０：３７４〜３８４頁
【非特許文献３０】
Ｋｌａｕｓｎｅｒ ＲＤ、ｖａｎＲｅｕｓｗｏｕｄｅ Ｊ，Ａｓｈｗｅｌｌ Ｇ、Ｋｅｍｐｆ Ｃ、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ ＡＮ、Ｄｅａｎ ＡおよびＢｒｉｄｇｅｓ Ｋ、「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｉｎ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９８３年；２５８：４７１５〜４７２４頁
【非特許文献３１】
Ｂｅｒｃｚｉ Ａ、Ｒｕｔｈｎｅｒ Ｍ、Ｓｚｕｔｓ Ｖ、Ｆｒｉｔｚｅｒ Ｍ、Ｓｃｈｗｅｉｎｚｅｒ ＥおよびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ Ｈ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｒｏｎ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ」、Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９３年；２１３：４２７〜４３６頁
【非特許文献３２】
Ｂｅｔｔｓら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ、１９９９年；１５：１２１９頁
【非特許文献３３】
Ｗｅｎｆｕｒｔら、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｒｅ、２０００年；３８：４０４頁
【非特許文献３４】
Ｌｕｂａｋｉら、Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍ Ｄｅｆ Ｓｙｎｄ、１９９９年；２２：１９頁
【非特許文献３５】
Ｂａｒａｂａｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９２年；２６７：９４３７頁
【非特許文献３６】
Ｒｕｔｈｎｅｒら、１９９３年；５４：３５頁
【非特許文献３７】
Ｓｚｕｔｓら、Ｊ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｓ、１９９３年；１３：１０４１頁
【非特許文献３８】
Ｏｈｎｏら、Ｖｉｒｏｌｇｙ、１９９７年；２３８：３０５頁
【非特許文献３９】
Ｆｅｒｒａｒｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０００年；６０：１９０１頁
【非特許文献４０】
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【非特許文献４１】
Ｌｅａｒｄｉら、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、１９９８年；１０２：７４６頁
【非特許文献４２】
Ｌｅｐｐｌｅ−Ｗｉｅｎｈｕｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９９年；９６：１３７９５頁
【非特許文献４３】
Ｈｕｅｂｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２０００年；２：Ｅ２３頁
【非特許文献４４】
Ｓａｉｎｔｅ−Ｍａｒｉｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９７年；２５０：６８９〜９７頁
【非特許文献４５】
Ｆｉｎｄｌｅｙ＆Ｚｈｏｕ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１９９９年；１３：１４７頁
【非特許文献４６】
Ｂｅｒｃｚｉら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９３年；２１３：４２７頁
【非特許文献４７】
Ｐｉｎｋｏｓｋｉ＆Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｆ、１９９９年；６：１１７４〜１１８１頁
【非特許文献４８】
Ｌｅ Ｂｏｎら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年；１１：３７３頁
【非特許文献４９】
Ｍａｒｔｉｎｅｚ＆Ｋｒａｕｓ、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年；１８：５２７頁
【非特許文献５０】
Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１９９８年；１０２：３２２頁
【非特許文献５１】
Ｙｅｈら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、１９８４年；４６：２１７〜２２３頁
【非特許文献５２】
Ｂａｙｅｒら、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ、１９９８年；６４：１９頁
【非特許文献５３】
Ｂｅｒｃｚｉら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ、１９９３年；３００：３５６頁
【非特許文献５４】
Ａｌｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９９年；２７４：２４０６６頁
【非特許文献５５】
Ｌａｓｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ、１９９７年；４１：１０３９頁
【非特許文献５６】
Ｓａｓａｋｉら、Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎ Ｒｅｓ、１９９３年；８４：１９１頁
【非特許文献５７】
Ｋｒａｔｚら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、１９９８年；８７：３３８頁
【非特許文献５８】
Ｓｅｅｔｈｅｒａｍ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ、１９９９年；１９：１７３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、ＨＩＶ、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、肝炎ウィルス、単純ヘルペスウィルス感染などのウィルス感染症を治療する物質を提供する。前記物質は、ターゲッティング剤と受容体とが結合後、複合体の細胞からの脱離を阻害する成分と複合化されたトランスフェリンまたはトランスコバラミンなど、ウィルス感染細胞によりアップレギュレートされた受容体と結合する感染細胞ターゲッティング剤を含む。前記物質は、ウィルス感染細胞におけるアポトーシスを誘導することが見出された。好適な薬物としては、限定しないが、ドキソルビシンおよびメトトレキサートが挙げられる。本発明はまた、ウィルス感染患者の治療法および前記複合体を含有する組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記の要件は、細胞、特にストレスを受けている細胞を治療する複合体により満たされ、この複合体は、一実施態様において、ある担体を含み、この担体はストレス下の細胞に、より多数またはより頻繁に発現される受容体に引きつけられ、ある物質と複合化されている。この物質は、担体と細胞表面にアップレギュレートされた受容体との間で結合後、細胞からの複合物質の脱離を効果的に防ぐ。
【００２０】
前記担体は、細胞がストレスを受けている時、多数またはより頻繁に存在する細胞上の受容体に引きつけられる任意の有用な物質であり得る。この担体はトランスフェリンであることが好ましい。
【００２１】
薬剤は、受容体への担体の親和性を増大させる目的を達成する任意の薬剤であってよい。前記親和性を増大させる機構は様々であってよく、例えば、機構の効果が、接触後受容体から担体の正常な置換を干渉することであるという条件で細胞表面のリン脂質または担体の立体的再配置に対する薬剤の付加を含むことができる。現在のところ、このような薬剤で最もよく知られているのはドキソルビシンである。しかし、所望の効果を達成する任意の有用な物質を使用することができる。
【００２２】
担体に対する薬剤の付加は、少なくとも担体が親和性増大により対応する受容体に配置された後まで、薬剤と担体との分離を防止する任意の機構であってよい。現在、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体に関し、最もよく知られている付加の機構は、グルタルアルデヒドリンカーであるが、当の担体／薬剤の組合せにとって有用な任意の物質であってもよい。
【００２３】
本発明は、ＤＮＡインターカレーションなどの通常のドキソルビシン毒性機構により細胞を死滅させる目的で、ドキソルビシンを細胞に送達すると考えられていたよく知られているトランスフェリン−ドキソルビシン物質が、実際、その機構により細胞死滅を生じないという驚くべき、予想外の発見に基いている。複合体との接触によって処理された細胞は、ガン細胞がドキソルビシン単独で処理される場合に見られているように、壊死よりもむしろ細胞自滅型細胞死を経験していることが判明している。
【００２４】
本発明の基本的な態様は、感染ＣＤ４Ｔリンパ球総数が血液循環から除去されるためウィルス血症が減少し（非特許文献３２）、ウィルス血症減少と共に患者の健康状態が向上する（非特許文献３３）という観察に基いている。この観点から、ウイルス負荷を低下させる機構の１つは、ＨＩＶ−１−特異的細胞溶解性ＣＤ８Ｔリンパ球によるものである（非特許文献３４）。特定の標的細胞を除去する他の機構は、ガン細胞表面にトランスフェリン受容体を発現するヒトのガン細胞を死滅させるためにヒトトランスフェリンのドキソルビシン複合体を用いることによって示されたように（非特許文献３５）、担体蛋白質の表面受容体を発現する細胞に細胞毒性薬および／または抗レトロウィルス薬の蛋白複合体の標的送達を行うことによるものである。実際、結合反応は非常に特異的であり、トランスフェリンのドキソルビシン複合体は、細胞の不在下でも単離トランスフェリン受容体に結合することが示された（非特許文献３６）。さらに、細胞膜上のトランスフェリン受容体に対するトランスフェリン−ドキソルビシン複合体の結合は、恐らく複合体と細胞膜構成要素との間のさらなる相互作用のため、細胞膜上のトランスフェリン受容体に対する非複合化トランスフェリンの結合よりも強い（非特許文献３７）。
【００２５】
本発明は、ＨＩＶなどのウィルス感染細胞に対する薬物の標的送達に使用されるヒトトランスフェリンの薬物複合体を利用する。本発明が有効である主要な理由は、ＨＩＶ感染ＣＤ４Ｔリンパ球が、それらの表面にトランスフェリン受容体をアップレギュレートすることである（非特許文献３８）。しかし、トランスフェリンの薬物複合体がＨＩＶ感染Ｔリンパ球に対して有効である理由がさらに幾つかある。第１にドキソルビシンなどの細胞毒性薬（非特許文献３９）の多くはアポトーシスを誘導し（非特許文献４０）、ドキソルビシンのトランスフェリン複合体が、アップレギュレートされたトランスフェリン受容体を有する細胞のアポトーシスを誘導するための有用な複合体であることを示している。第２に、たとえば、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体によるトランスフェリン受容体の活性化は、薬物誘導アポトーシス（非特許文献４１）、並びにアポトーシスのエフェクター経路（非特許文献４２；および非特許文献４３）に関連すると想定されるカルシウムチャネルの制御を伴う（非特許文献４４）。第３に、トランスフェリン受容体およびアポトーシス誘導Ｆａｓ受容体（ＡＰＯ−１／ＣＤ９５）は、細胞表面に配置されているが（非特許文献４５）、トランスフェリン複合体がアップレギュレートされたトランスフェリン受容体を有する細胞に送達されると、前記複合体が結合され、結局は細胞内に取り込まれ（非特許文献４６）、したがって細胞表面並びに細胞内で活性化された機構により死滅させる可能性を与える（非特許文献３５）。
【００２６】
Ｔリンパ球を身体から一掃する免疫生物学は、アポトーシスとして知られている方法によりプログラム化された細胞死の経路を開始することである（非特許文献４７）。これは、胸腺または末梢循環に生じ得る（非特許文献４８）。幾つかのアポトーシス機構があるが、それら全てが働いて、選択された細胞を身体から除去する（非特許文献４９）。本発明は、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球を除外する新規な方法である。本法の戦略は、アポトーシス経由のクローン除去により感染Ｔリンパ球を除外することである。これは、細胞毒性薬および／または抗レトロウィルス薬を感染細胞に標的送達するために薬物−蛋白質複合体を用いることにより達成される。
本発明の複合体の標的送達は、ＨＩＶ感染Ｔリンパ球の表面にアップレギュレートされる受容体に結合親和性を有する複合体中の蛋白質によりもたらされる（非特許文献３８）。また、薬物−トランスフェリン複合体の薬物は、アポトーシスおよび活性化末梢Ｔリンパ球のクローン除去を引き起こすことが知られているメトトレキサートであってよい（非特許文献５０）。ガン細胞の表面に存在する（非特許文献５１）感染細胞（非特許文献３８）および抗原刺激化Ｔリンパ球（非特許文献５２）以外には、トランスフェリン受容体は、正常な成人休止細胞の表面上に通常存在しない（非特許文献５３）。したがって、正常細胞は影響を受けず、メトトレキサート−トランスフェリン複合体によって除外される細胞は、感染Ｔリンパ球のみとなる。
【００２７】
ＨＩＶ感染細胞への標的薬物送達を実行する本発明の方法は、血中鉄を輸送するトランスフェリンの利用に焦点を当てることである。トランスフェリンは、血漿からの単離、商品提供者、または組換え技術（非特許文献５４）により得ることができる。薬物蛋白質複合体を形成するために、トランスフェリン分子は、細胞増殖抑制薬または抗レトロウィルス薬と結合させて調製するような方法で修飾しなければならない。
【００２８】
薬物は、メトトレキサートなどのアポトーシス開始剤、ドキソルビシンまたはアルキル化剤などの細胞毒性抗生物質であってよいが、リシンなどの植物毒素、修飾ジフテリア毒素などの変異細菌毒素など、任意の化合物を使用することができる（非特許文献５５）。グルタルアルデヒドカップリング（非特許文献５３）、ジスルフィドカップリング（非特許文献５６）およびベンゾイルヒドラジンカップリング（非特許文献５７）などの幾つかのカップリング法が、トランスフェリンと他の化合物とを結合させるために用いられてきた。多様なカップリング法は、広範囲な細胞毒性薬とトランスフェリンとの複合化を可能にし、薬物とトランスフェリン分子との永続的結合または解離可能な結合のいずれかを生じさせる。カップリング反応後、好ましくはクロマトグラフィー法を用いることにより、薬物−蛋白質複合体を未結合薬物と遊離蛋白質から分離できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
複合化法の技術的内容は様々であり得るが、いずれの方法においてもその要件は、（ａ）ウィルス感染細胞との結合実験および死滅実験において活性であり、（ｂ）有意な数の正常細胞とは結合また死滅させない、特定の複合体を調製することである。これらの要件を鑑みて、本発明による複合体の好ましい調製法は、以下の方法である：予め決められた分子比率を有する均質トランスフェリン−アドリアマイシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。このように、第１ステップは、ＤＯＸの食塩水をＤＭＳＯなどの溶媒または他の好適な凍結保存剤を含有するＧＬＵの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
【００３０】
遊離ＤＯＸまたは遊離ＧＬＵのいずれも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生じるように、ＤＯＸとＧＬＵとのモル比は上記反応と同じである。しかし、１個のＧＬＵが２個のＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸを生成する場合は、溶液中に遊離ＧＬＵの可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵ溶液に滴下することにより生じる質量作用速度論によって、この可能性は最少化される。これらの反応物の容量は制限されないので、大量の均質ＤＯＸ−ＧＬＵが調製できる。
【００３１】
複合化反応の第２ステップは、ＤＯＸ−ＧＬＵをトランスフェリン（ＴＲＦ）の食塩水に滴下により加えることである。ＴＲＦは、鉄なし（アポトランスフェリン）または鉄飽和（ホロトランスフェリン）のいずれであってもよい。ＤＯＸ対ＴＲＦの所望のモル比はＴＲＦの容量を適切に調整することにより得られた。得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を暗所で室温下２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵとの反応とは異なって、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分がＴＲＦ分子中のイプシロン−アミノリジン基数個のうち、任意の１個と反応できることから、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦとの反応は１個の結合部位に制限されない。
【００３２】
ＴＲＦに結合したＤＯＸ分子数は第２ステップにて決定された。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５分子のＤＯＸを含んだことになる。しかし、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４分子のＤＯＸを含んだことになる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９分子のＤＯＸを含んだことになる。この方法で、ＤＯＸ対ＴＲＦの予め決められた比率で大量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて提供できる。
【００３３】
複合化反応のさらなるステップは、エタノールアミンまたは任意の過剰リンカーを捕捉するのに好適な他の物質の添加、次いで遠心分離および透析であった。ＤＯＸとＴＲＦとの反応は、理論的にはＧＬＵの全てを消費するが、利用できるＧＬＵのいずれとも結合させるために、エタノールアミンを最終反応混合物に加えた。この反応を暗所で３０分間続けた。最終溶液を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００倍過剰の食塩水で６時間２回かつ同一過剰のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で３回透析し、得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体を使用のために準備した。
【００３４】
複合体の生化学的特性決定：
（３９）に記載されたＨＰＬＣとポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を測定できる。また、分光側光法を用いて、ＤＯＸ対ＴＲＦの分子比を決定できる。これらの方法により、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均質性が繰り返し明らかにされた。さらに、凝集物または断片がないため、これらの複合体を調製する上でクロマトグラフィーを必要としない。このことにより、収量を増大させ、コストを下げる大容量の均質トランスフェリン−薬物複合体の調製が可能となる。
【００３５】
トランスフェリン−薬物複合体の他のタイプにおけるＴＲＦおよびＤＯＸの損失により生じる費用が、使用の際の障害となっている。例えば、ＤＯＸおよびＴＲＦの収量は、薬物および／または蛋白質を変化させるチオール化などの方法を用いることにより減少する。収量はまた、溶媒系を用いることにより、および酸安定性結合および酸不安定性結合を調製するために使用されるクロマトグラフィーにより減少する。ＤＯＸとＴＲＦとの間のＧＬＵ結合は酸安定性であり、本発明に従って調製された有用な複合体の収量は高い。実際、他の方法と比較して、有用な複合体の収量は５倍増大する。
【００３６】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の調製に対する以前知られた手法はいずれも、トランスフェリン１分子当たりの薬物分子数の比率を予め決めた上で大量の均質複合体を生産することができない。さらに、他の手法では、凝集物を除外し、均質複合体に富む分画を獲得するためにクロマトグラフィーが使用される。これらの方法は、収量を減少し、コストを増加させ、分子比率を予め決定する能力を欠く。
【００３７】
他の手順は、トランスフェリン１ミリリットル（０．５ｍＭ）と１５０ｍＭ塩化ナトリウム中ドキソルビシン１ミリリットル（８．５ｍＭ）とを４分間混合してから、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中２１．５ｍＭグルタルアルデヒド１ミリリットルを加えて４分間混合することである。前記反応はカップリング法であるが、これを１５０ｍＭ塩化ナトリウム中３７．２ｍＭエタノールアミン０．８ミリリットルと１０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８）とを添加することにより中止し、４分間渦巻き回転させる。次にこの混合物を、Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水０．５リットルに対して暗所で５℃３時間透析する透析管（分子量１２，０００〜１４，０００の分離）に移す。透析は、新鮮なＨｅｐｅｓ緩衝食塩水により少なくとも１回繰り返す必要がある。次いで混合物を１６００ｇで４℃１０分間遠心分離し、上澄液を、前もってＨｅｐｅｓ緩衝食塩水中で平衡にし、ブルーデキストラン、トランスフェリンおよびチトクロームＣにより５℃で較正したセファロースＣＬ−４Ｂの２．６ｘ３４ｃｍカラム上、１時間当たり２２ミリリットルの流速でクロマトグラフする。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターし、３．８ミリリットルの分画を集める。各分画中のトランスフェリンおよびドキソルビシンの濃度を、トランスフェリンでは２８０ｎｍ、ドキソルビシンでは２９５ｎｍを用いることにより測定されるトランスフェリン並びにドキソルビシンの検量線から漸次接近法により計算する。このカップリング法を修飾することにより、メトトレキサートおよび／または抗レトロウィルス薬のトランスフェリン複合体など、他の薬物のトランスフェリン複合体を調製するために使用できる。好適な抗レトロウィルス薬は、限定しないが、ジダノシン（ｄｄＩ、Ｖｉｄｅｘ）、ラミブジン（３ＴＣ、Ｅｐｉｖｉｒ）、スタブジン（ｄ４Ｔ、Ｚｅｒｉｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ、Ｈｉｖｉｄ）、およびジドブジン（ＡＺＴ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ）などのヌクレオシド類縁体またはヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）およびネビラピン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ）などの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ）、ネルフィナビル（Ｖｉｒａｃｅｐｔ）、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）およびサキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）などの蛋白分解酵素阻害剤が挙げられる。
【００３８】
純粋な薬物−蛋白質複合体が単離されると、それらは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により特性決定できることから分子量が測定され、蛋白質１分子当たりの薬物分子数を決定できる。他のシステムにおける薬物−蛋白質複合体を用いた経験により、機能的薬物−蛋白質比（非特許文献５３）は、蛋白質１分子当たり０．１〜４．０薬物分子であることが示されている。複合化の後、複合体特性決定における重要なステップは、（ａ）複合体が感染細胞表面の受容体に結合し、非感染細胞には結合しないかどうかを測定すること、および（ｂ）複合体が感染細胞を死滅させ、非感染細胞を死滅させないかどうかを測定することである。結合試験は、フローサイトメトリーを用いることより行うことができ、また死滅試験は、微量培養法を用いて行うことができ、感染細胞数を５０％死滅させるのに必要な薬物−蛋白質複合体中の薬物濃度と比較して、同数の感染細胞培養を死滅させるのに必要な遊離薬物濃度を決定する。他のシステムにおける薬物−蛋白質複合体を用いた経験により、薬物−蛋白質複合体中の薬物と比較して約１０倍以上の遊離薬物が、同数の感染細胞を死滅させるのに必要であることが示されている。複合体が有効であるためには、それが、最少の非感染細胞だけを死滅させるということも必要である。
【００３９】
本発明は、送達蛋白質であるトランスフェリンに関して記載したが、感染細胞の受容体部位に結合できる他の蛋白質が体内に存在することが知られている。受容体部位が感染細胞で活性化され、非感染細胞では不活性である場合、このような受容体部位に結合する任意の蛋白質または他の化合物を、本発明に使用される薬物を送達するために使用できる。このような結合蛋白質の１つの例としては、ビタミン、特にビタミンＢ１２をヒト体内細胞のトランスコバラミン受容体に送達するトランスコバラミンがある（非特許文献５８）。他の例としては、限定しないが、ソマトスタチン、上皮細胞成長因子様分子および葉酸様分子などの非蛋白ターゲッティング剤が挙げられる。
【００４０】
薬物−蛋白質複合体の調製後、それを精製し、特性決定し、細胞結合性と死滅性を確認でき、また、結合実験と死滅実験により、複合体が感染細胞に結合し、死滅させるが、非感染細胞ではそうでないことを示したら、複合体を分割して滅菌できる。滅菌法は、セシウム照射装置を用いることなどによる放射線曝露により行うことができ、またはミリポアろ過法を用いることにより行うことができる。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば、鉄担持トランスフェリンおよびトランスフェリンと抗ウィルス剤との複合体を含む腫瘍治療用試薬キットが提供される。トランスフェリン受容体を有する患者の正常細胞は、抗ウィルス剤の投与前に、これらの受容体を鉄担持トランスフェリンで飽和することにより、複合体の効果に対して保護できる。
【００４２】
本発明はまた、トランスフェリンと多種類の抗ウィルス剤との複合体を感染細胞部位に個々に投与することを含む、抗ウィルス剤に対する腫瘍細胞の感受性測定方法を提供する。このような多種類の複合体を含む試薬キットが、この目的のために提供できる。
【００４３】
本発明はまた、複合体が少なくとも１種の遊離（非複合化）抗ウィルス剤をも含有する「カクテル」に含まれる組成物と、この組成物の使用法を提供する。
本発明による複合体は、有効量で動物に投与される。ウィルス感染症治療において、有効量は、ウィルス力価を減じるための有効量を含む。複合体の投与量は、患者の年令、体重および病状、および抗ウィルス剤の薬物動態を考慮して決定できる。有効な治療に要する複合体量は、抗ウィルス剤単独使用に要する量よりも少量となり、用いられる抗ウィルス剤に依存する。例えば、トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の投与量は、１５０ポンド（６８ｋｇ）の人に対し２８日間当たり０．５ｍｇから５０ｍｇの間であることが予想される。投与量は、２８日の間に間隔を変えてより少用量として投与できる。
【００４４】
本発明の薬剤組成物は、限定しないが、経口、局所、直腸、眼、膣などの多くの経路、例えばエアゾールの使用による肺経路、または、限定しないが、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、静脈内などの非経口的経路により投与できる。前記組成物は、単独で投与できるか、または標準的な製剤実施に従って製剤的に許容できる担体または賦形剤と組合せることができる。経口投与様式では、組成物を錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、散剤、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液剤、懸濁液剤などの形態で使用できる。非経口投与では通常、複合体の滅菌溶液を調製し、溶液のｐＨを好適に調整し、緩衝化する。静脈内使用では、溶質の総濃度を制御して、製剤を等張にする必要がある。眼投与では、軟膏または点眼液を、アプリケータまたは点眼びんなどの当業界に知られた眼送達系により送達できる。肺投与では、希釈剤および／または担体が、エアゾールの形成を可能にするため適切であるように選ばれる。本発明の複合体は、輸液または注射液により非経口的、すなわち静脈内または腹腔内に投与されることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様を以下に記載する。修飾および変更が可能であり、それらの全ては特許請求の範囲内に入ることを意図していることは、以下の記載を読めば、通常の当業者にとって明らかとなろう。
【実施例１】
【００４５】
均質複合体の調製
予め分子比率で決められた均質トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の大量合成は、グルタルアルデヒド（ＧＬＵ）の反応性基２個のうちの１個と反応させるために、３’アミノ位にあるドキソルビシン（ＤＯＸ）のアミノ基のみを用いることにより量論的になされた。第１ステップは、氷冷水浴中でＧＬＵをＤＭＳＯに滴下により加えることであった。次に、ＤＯＸの食塩水をＧＬＵ＋ＤＭＳＯの食塩水に、ＤＯＸ対ＧＬＵが１：１モル比の最終濃度になるまで滴下により加えた。得られたＤＯＸ−ＧＬＵの溶液を暗所で室温下３時間攪拌した。
遊離ＤＯＸも遊離ＧＬＵも含まないＤＯＸ−ＧＬＵの最終溶液を生じさせるように、ＤＯＸとＧＬＵとのモル比は上記反応と同じである。しかし、１個のＧＬＵが２個のＤＯＸと反応してＤＯＸ−ＧＬＵ−ＤＯＸを生成する場合は、溶液中に遊離ＧＬＵの可能性があるが、一価のＤＯＸを二価のＧＬＵ溶液に滴下して加えることによって生じる質量作用速度論によって、この可能性は最少化される。これらの反応物の容量は制限されないので、大量の均質ＤＯＸ−ＧＬＵが調製できる。
【００４６】
複合化反応の第２ステップは、ＤＯＸ−ＧＬＵをトランスフェリン（ＴＲＦ）の食塩水に滴下により加えることであった。ＴＲＦは、鉄なし（アポトランスフェリン）または鉄飽和（ホロトランスフェリン）のいずれであってもよい。ＤＯＸ対ＴＲＦの所望のモル比はＴＲＦの容量を適切に調整することにより得られた。得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの溶液を暗所で室温下２０時間攪拌した。ＤＯＸとＧＬＵとの反応とは異なって、ＤＯＸ−ＧＬＵのＧＬＵ成分がＴＲＦ分子中のイプシロン−アミノリジン基数個のうち、任意の１個と反応できることから、ＤＯＸ−ＧＬＵとＴＲＦとの反応は１個の結合部位に制限されない。
【００４７】
ＴＲＦに結合したＤＯＸ分子数は第２ステップにて決定された。例えば、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が７．２：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり２．５分子のＤＯＸを含んだことになる。しかし、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が４．０：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり１．４分子のＤＯＸを含んだことになる。同様に、ＤＯＸ−ＧＬＵ対ＴＲＦの出発比が２．５：１．０であった場合、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸの最終溶液は、ＴＲＦ１分子当たり０．９分子のＤＯＸを含んだことになる。この方法で、ＤＯＸ対ＴＲＦの予め決められた比率で大量のＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸを必要に応じて提供できる。
【００４８】
複合化反応のさらなるステップは、エタノールアミンの添加、次いで遠心分離および透析であった。ＤＯＸとＴＲＦとの反応は、理論的にはＧＬＵの全てを消費するが、利用できるＧＬＵのいずれとも結合させるために、エタノールアミンを最終反応混合物に加えた。この反応を暗所で３０分間続けた。最終溶液を、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００倍過剰の食塩水で６時間２回、かつ同一過剰のＨｅｐｅｓ緩衝食塩水で３回透析し、得られたＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体を使用のために準備した。
【００４９】
複合体の生化学的特性決定：
ＨＰＬＣとポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の均質性を測定できる。また、分光側光法を用いることによって、ＤＯＸ対ＴＲＦの分子比を決定できる。これらの方法により、ＴＲＦ−ＧＬＵ−ＤＯＸ複合体の一貫した均質性が繰り返し明らかになった。さらに、凝集物または断片がないため、これらの複合体を調製する上でクロマトグラフィーを必要としない。このことにより、収量を増大し、コストを下げる大容量の均質トランスフェリン−薬物複合体の調製が可能になる。
【００５０】
トランスフェリン−薬物複合体の他のタイプにおけるＴＲＦおよびＤＯＸの損失により生じる費用が、使用の際の障害となっている。例えば、ＤＯＸおよびＴＲＦの収量は、薬物および／または蛋白質を変化させるチオール化などの方法を用いることにより減少する。収量はまた、溶媒系を用いることにより、および酸安定性結合および酸不安定性結合を調製するために使用されるクロマトグラフィーにより減少する。ＤＯＸとＴＲＦとの間のＧＬＵ結合は酸安定性であり、本発明に従って調製されたＴＲＦ−ＤＯＸ複合体中のＤＯＸとＴＲＦの収量は高い。実際、他の知られた方法と比較して、ＴＲＦの収量は２倍近くあり（９０％対５０％）、ＤＯＸの収量は５倍増大する。
【００５１】
トランスフェリン−ドキソルビシン複合体の調製に対する以前から知られた手法はいずれも、トランスフェリン１分子当たりの薬物分子数比率を予め決めた上で大量の均質複合体を生産することができない。さらに、他の手法では、凝集物を除外し、均質複合体に富む分画を獲得するためにクロマトグラフィーが使用される。これらの方法は、収量を減少し、コストを増加させ、分子比率を予め決定する能力を欠く。
【実施例２】
【００５２】
抗ウィルス活性
種々のウィルスに対する有効性が試験された。これらは、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびＨＩＶであった。ＨＩＶに対する結果が特に良好であった。
【００５３】
例えば、ヒト血液細胞に生存するＨＩＶ−１ウィルスＲＯＪＯ株の阻害に関してＴＲ−ＤＯＸにより得られた用量反応曲線を図１に示す。この実験室試験系において、ＴＲ−ＤＯＸはヒトエイズ患者のＨＩＶを治療するために有効な薬物として使用できることを示唆する濃度で、エイズウィルスに対して強力な効果を有した。
【００５４】
同様に図２は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に感染したヒト肝細胞をＴＲ−ＤＯＸの増加濃度に曝露することにより得られた用量反応曲線を示す。ここでもまた、ＴＲ−ＤＯＸの極低濃度は、ＨＢＶのほぼ完全阻害をもたらすことが判明した。
【００５５】
最後に、ヒト肺細胞に生存するサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対するＴＲ−ＤＯＸの効果を試験したが、ここでもデータは、ＣＭＶに対するＴＲ−ＤＯＸの強力な効果を明らかにした。ＣＭＶに対するＴＲ−ＤＯＸの用量反応曲線を図３に示す。
【００５６】
ＣＭＶに対するＴＲ−ＤＯＸの相対的効力を、ガンシクロビル（広く使用されている抗ウィルス化合物）の効力と直接比較すると、ＣＭＶの５０％阻害に要する濃度に関して、ＴＲ−ＤＯＸはガンシクロビルよりも２００倍以上強力であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】トランスフェリン−ドキソルビシン（ＴＲ−ＤＯＸ）複合体によるヒト血液細胞に生存するＨＩＶ−１ウィルスＲＯＪＯ株の阻害に関して得られた用量反応曲線を示す図である。
【図２】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に感染したヒト肝細胞をトランスフェリン−ドキソルビシン（ＴＲ−ＤＯＸ）複合体に濃度を増加させながら曝露することにより得られた用量反応曲線を示す図である。
【図３】ヒト肺細胞に生存するサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）に対するトランスフェリン−ドキソルビシン（ＴＲ−ＤＯＸ）複合体の効果を示す図である。
Claims (22)
- ウィルス感染細胞を治療する方法であって、
前記細胞にトランスフェリンおよび抗ウィルス剤を含有する複合体の有効量を投与することを含み、かつ前記抗ウィルス剤は、アポトーシス誘導化合物、ウィルス複製を阻害する化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素および変異細菌毒素からなる群から選ばれる方法。 - 前記抗ウィルス剤は、ドキソルビシン、メトトレキサート、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、蛋白分解酵素阻害剤、リシンおよび修飾ジフテリア毒素からなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
- 前記ウィルスは、ヒト免疫不全ウィルス、サイトメガロウィルスおよび肝炎ウィルスからなる群から選ばれる請求項２に記載の方法。
- 前記ウィルスは、ヒト免疫不全ウィルスである請求項３に記載の方法。
- ウィルス感染患者を治療する方法であって、
前記患者にターゲッティング剤および抗ウィルス剤を含有する複合体を投与することを含み、かつ前記抗ウィルス剤は、アポトーシス誘導化合物、ウィルス複製を阻害する化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素および変異細菌毒素からなる群から選ばれ、かつ前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンおよびトランスコバラミンからなる群から選ばれる方法。 - 前記複合体を投与する前にさらに鉄結合トランスフェリンを投与することを含む請求項５に記載の方法。
- 前記抗ウィルス剤は、ドキソルビシン、メトトレキサート、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および蛋白分解酵素阻害剤からなる群から選ばれる請求項５に記載の方法。
- 前記ウィルスは、ヒト免疫不全ウィルス、サイトメガロウィルスおよび肝炎ウィルスからなる群から選ばれる請求項５に記載の方法。
- 前記ウィルスは、ヒト免疫不全ウィルスである請求項８に記載の方法。
- 遊離抗ウィルス剤をさらに投与することを含む請求項５に記載の方法。
- 均質複合体および担体を含む組成物であって、
前記複合体は、ウィルス感染細胞ターゲッティング剤および抗ウィルス剤を含有し、かつ前記抗ウィルス剤は、ウィルス複製を阻害する化合物、アルキル化剤、植物毒素および変異細菌毒素からなる群から選ばれ、かつ前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンおよびトランスコバラミンからなる群から選ばれる組成物。 - 遊離抗ウィルス剤をさらに含む請求項１１に記載の組成物。
- 前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンである請求項１１に記載の組成物。
- 前記抗ウィルス剤は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および蛋白分解酵素阻害剤からなる群から選ばれる請求項１１に記載の組成物。
- 均質複合体、非複合抗ウィルス剤および担体を含む組成物であって、
前記複合体は、ウィルス感染細胞ターゲッティング剤および抗ウィルス剤を含有し、かつ前記抗ウィルス剤は、アポトーシス誘導化合物であり、また前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンおよびトランスコバラミンからなる群から選ばれる組成物。 - ターゲッティング剤および抗ウィルス剤を含む複合体であって、
前記抗ウィルス剤は、ウィルス複製を阻害する化合物であり、かつ前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンおよびトランスコバラミンからなる群から選ばれる複合体。 - 前記ターゲッティング剤は、トランスフェリンである請求項１６に記載の複合体。
- 前記抗ウィルス剤は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤および蛋白分解酵素阻害剤からなる群から選ばれる請求項１６に記載の複合体。
- ａ）各薬物分子を薬物／リンカー組合せ中の１個のリンカー分子に結合させるために、薬物溶液を過剰モルのリンカー分子溶液に滴下して加えること、
および
ｂ）予め決められた薬物：蛋白質比を生成させるために、前記薬物／リンカー組合せを蛋白質に加えること、
を含み、前記薬物が抗ウィルス剤である予め決められた薬物：蛋白質比を有する複合体を製造する方法。 - 任意の過剰リンカーを捕捉することをさらに含む請求項１９に記載の方法。
- 前記リンカーは、グルタルアルデヒド、ベンゾイルヒドラゾン、マレインイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドからなる群から選ばれる請求項１９に記載の方法。
- 蛋白ターゲッティング剤および抗ウィルス剤をそれぞれ含有する２種以上の複合体を含み、前記抗ウィルス剤は、アポトーシス誘導化合物、ウィルス複製を阻害する化合物、細胞毒性抗生物質、アルキル化剤、植物毒素および変異細菌毒素からなる群から選ばれ、かつ前記各複合体は、異なる抗ウィルス剤を有する、抗ウィルス剤に対する感染細胞の感受性を測定する試薬キット。
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