PT94789B - Metodo para inibicao da replicacao viral em celulas de mamifero usando conjugados da proteina antiviral da erva-dos-cancros-anticorpos monoclonais - Google Patents

Description

RE3EMTS OF THE UWIVERSITY OF MINNESOTA e ONCCGEN LIMITED PARTNERSHIP

MÉTODO PARA INIBIçLO DA REPLICAÇSO VIRAL EM CÉLULAS DE MAMÍFERO USANDO CONJUGADOS DA PROTEÍNA ANTIVIRAL DA ERVA-DOS-CANCROS -ANTICORPOS MONOCLONAIS

MEMÓRIA DESCRIΤIVA .esuffio

O presente inventa diz respeito a um método para ou de inibição da; replicação do HIV em células de mamífero caracterizado por tratamento de uraa cultura celular incluindo células infectadas com HIV com uma quantidade de uma. composição de conjugado de anticorpo e proteína antiviral da erva-dos-cancros para inibir a replicação do referido HIV; e a um processo para a preparação das referidas composições por combinação de um conjugado ds anticorpo monoclonal e proteína antiviral de erva-dosdade detectável, sendo referido anticorpo do referido conjuqado :om um ar;· mamífero infectadas

H' = ==’) suρ*= r t χ ι- x e de células de

CAMPO TéCNICO

O presente invento está relacionado com a inibição de vírus em células T e mronócitos humanos usando conjugados de proteína antiviral da erva dos cancros («pokeweed») (PAP)-anticorpo monoclonal. Encontrou-se qus? os conjugados de F'AF'-an ticorpo mcnoc1onalinibem eficazmente a replicação de HIV em células T CD4+ humanas sem citotoxicidade detestável .

FUNDAMENTO síndroma da imunodeficiência adquirida (AIDS) e infecção com o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1> constitui um problema de saúde pública a nível mundial. (A. Venkatesan, Science 241: 1481-1485 (1938). Presentemente, não existe cura para a SIDA e as modalidades de tratamento existentes para reduzir a produção de HIV in vivo como seja a utilização de AZT provocam efeitos secundários tóxicos.

HIV é um retrovírus de RNA que foi originalmente designado vírus 1 in f crcrópico T humane; (KTLV)-III, vírus associado a 1infadenopatias CLAV) ou retrovírus associado a AIDS (ARV). Fauci, Sc ience 25?s 617-622 (1983). Ovírus possui muitas propriedades comuns a outros membros da família dos lentivírus não transformantes e citopáticos dos retrovírus. HIV é referido como HIV-1 para o diferenciar do HIV-2 que foi isolad de pacientes da África Ocidental com um síndroma clínico indistinto da AIDS induz ida por HIV. A base crítica da imunopatogénase da infecção pelo HIV é eliminação da sub-série auxiliar («helper»)/indutora ’ã rduoer» 1 uD4-*- das células prefundã. Ver Dahlgleish et rauci d I i ~ _Res . 52: 491—496

517: 273- 281. (1987)., 0 HIS

T, resultando a 1 Nature 5j e m imuno-su ρ r es são 1: 765-767 (1984);

( 1985) , Ho et al . n .. Enql. J. Med., tem um tropismo selectivo para

células Τ C;D4 + e macrófagos e o antigénio CD4 é um componente eããsricial do rscsptzir da superfície celular para o HIV-l, HIV-2, assim como para o SIV. Lasky et al._s 5cience 255: 209-212 (1986);

?11 ipo!

do HIV molécula, de CD4 via g 1 icoproteina do invólucro externo gp 120,

617-622 (1988) ; Ste.in et al., Ce 1 1 49: 659-669 (1937). Uma ve: internaiizado, o RNA genómico é transcrito para DNA pela enzima transcriptase reversa. 0 DNA proviral é então integrado no DNA cromossomico hospedei

Após integração do provirus, infecção pode assumir uma fase latente ou o DNA proviral pode ser transcrito em RNA genómico virai e RNA mensageiro. A síntese proteica, processamento e montagem do vírus ocorrem com gemulação do virião maduro através da superfície celular. Presentemente., nao existe cura, para a AIDS, e AZT, a única droga antiviral aprovada para reduzir a. produção de HIV in vivo, pode provocar efeitos secundários; tóxicos importantes e pode resultar no aparecimento de mutantes resistentes à A2T. □ tratamento a longo ;razo das infecções por HIV pode requerer a administração sequen:iada ou em combinação de múltiplas drogas semelhante à quimioterapia de combinação necessária para muitos cancros.

Os conjugados de anticorpos compostos por anticorpo monoclonal hibridadet ou conjuqado e toxina t'ê'm sido usados para erradicar populaçóes específicas de células alvo por alojamento e destruição de célu.la.s alvo «indesejáveis» portadoras de ant.iqénios de superfície alvos. Ver, e.g., Jansen et al . , Immu.noI Rev . . 62 s 185 ( 1932) , Leorsard et al., Cancer Resea.!·ch 45 ; 5263 ’195o>: Uckun, Journal of ixperimental Medicine,, 165,, 347-36?

Uckun et a 1 ..

Canc er Resea rc h . 45 , 69—75 i 1 ORS va» ieda.de de toxinas qu.e tem sido empregue por vários

= +ai.

• ’ O l · ΓΉ ·’^ ’

Immúnoloqy, 155, (1985)

TC -i 2__7tr n·

Γ U p ο -, > 0 jj Ό 1 ÍT: fc’ 1 Γ ί_· q Ρ U ρ Οί — =~J > ί fc, 1. ζ: t U fc.’ ΐ ι t ', j ’ .ϊ. Π a fc> 1<Ί f. ΰ ο t U fc· , t fc 1 fc· O ...· if l O rícino intacto. Ver,_e.g. ., Leonsrd et al . , supra Estas toxinas

r.ão podem ser aplicadas com segurança in vivo devido á sua toxicidade letal. D sequndo grupo de toxinas são referidas como lemitcx 1 nas

Oc-r is hemi. toxina fc fcJCifcJ proteínas de cadeia simples que inactivam os ribosomas actuando cataiíticamente nos ribossomas eucarióticos e inactivando a subunidade óõ-S, resultando numa inibição dependente da dose da. síntese proteica celular ao nível da elongação dos peptideos. Ver Barbieri?< Stirpe, Cancer Surve γ s, 1: 489 (1982) .

Uma hemotoxina com interesse ê a proteína antiviral da erva dos cancros <F'AP) que foi isolada a partir das folhas da

Hrimavera americana Durante muitos anos PAF' foi e sementes de Phytolacca reconhecida como tendo antiviral,. Ve Chemother. 17: 1Θ32 (19S0) ;n

Irvin, Antimicrob. Aosnts

Barbieri et al., supra. Encontrou-se que PAP bloqueia a transmissão de vírus de RNA em plantas tais como o vírus do mosaico do tabaco, E Irvin, A r c h. B i o chem. E: i o p h y s 20-3: 418 C19S0)le vírus do mosaico do pepineiro. [Tomlinson et al , 3. Gen. Vi rol „ 25: 225 (1974)1. Também foi descrito que

5015

v.iru;

.mais contendo RNA:

poliovírus Cllssery et al., Ann. Ν. V. ftcad. Sei.., 284: 431-44Θ (1977)1 e vírus da influenza. Tomlinson et al. supra. Também foi descrito que RAF' inibe: a multiplicação de vírus herptes simplex tipo I (firon, supra) e tipo II (Patente dos

4,672,053 de Obrig). No entanto, até à data

Estados Unidos t!2 não foi descrita a como seja HIV por PAP e .rioiçSo d« replicai cs oon i ua-aoos o* de um gados de anticorpos com PAP não foram usados para inibir uaisquer vírus,,

Os conjugados cie anticorpos contendo bemitoxirta têm uma a 1 tamente especifioa resultante da d o

IQâÇãO áts uÉl Lí 1 âs c*. i v li a _rOXa'—- a. tr 2\é

i., Sl u ís p e L í f 2. C cf anticorpo mcnoclona1 do conjugado. Os conjugados de anticorpo contendo PAP foram estudados e encontrou-se serem o i totó ricas para as células malignas em concentrações suficientemente elevadas por inibição da sintese proteica, A ligação covalente do PAP a uma imunog 1 obu 1 ina que seja capaz de se ligar especificamente a um antigénio específico de uma célula a ser morta foi descrito na Patente dos Estados Unidos N2 4,363,756 de Masuho. No entanto, a ligação de PAP a um anticorpo monoclonal dirigido contra células infectadas com vírus para inibir a replicação virai sem citotosíicidade não foi anteriormente descrito ou discutido. De facto, concentrações estacionèrias de PAP que se demonstrou terem actividade não podem ser atingidas in vivo devido a: 1) serem tóxicas; e 2) a semi-vida do PAP in vivo ser de aproximadamente 5-1Θ minutos.

Assim, existe a necessidade de conjugados de anticorpos compostos por anticorpos- monoclonais conjugados com proteína antivial da erva dos cancros os- quais podem direccionar o PAP para inibir a replicação virai em células infectadas sem resultar na morte das células nao infectadas.

jr Ar’ i ι

INVENTO presente invento é dirigido c on j u.Qades d e an t i v i — ral-auticcrpo compostos por um anticorpo monoclonal antiviral da erva dos cancros (PAP) isolada a i-· h y to; ac c a a as r i c a rι a . 0 presente invento proporciona e proteína partir de c o m ρ o s i ç Ss de anticorpo monoclonal—antiviral PAPúteis para inibir a replica— ção intracelular de vírus associada a doenças tais como AIDS induzida poi^- retrovírus ou leucémias de células T induzidas por retrovírus. 0 presente invento emprega anticorpos monoclonais ou seus f r aqmcan tos reactivos com um antigénio presente na superfície

de células de mamífero infectadas cont vírus. Os conjuoados de anticorpos .wnxlcnais do prssents invento mantêm a capacidade do PAF’ não conjugado para inibir a síntese proteica celular.

Descobrimos que os conjugados de anticorpo aionoclonal—PAP podem inibir eficasmente a repl .icação virai sem citot.oxic.ida.de detectével . 'Jsando o presente invento, no caso do HIV, os conjugados de -anticorpo mon oc lona 1-PAF' em quantidades inferiores a .ío pico molar í pM) podem inibir a menos 50*4 sem citotoxicidade celular.

'Spi 1C 5.1,30

HIV em pelo □s conjugados de anticorpo munoclonal-PAP do presente invento inibem a repl icação de HIV em células T CD4+ e moriécitos em pelo menos em níveis cerca de 25 vezes inferiores aos níveis de PAP necessários para inibir a replicação virai em 50%. De preferência, os conjugados de anticorpo monoclonal-PAP do presente invento inibem a. replicaçSo de HIV em células CD4+ e monócitos em cerca de 502 em níveis cerca de 10ô vezes inferiores aos necessários no caso de pAP não conjugado (e mais preferericialmente 2ôv vezes menos do que o necessário no caso de PAP conjugado). Numa realização do presente invento, o conjugado PAP com um anticorpo monoclonal contra o antigénio CD14 superfície celular tíe monócitos inibe eficazmente a produção HIV em monócitos humanos numa concentra:

15Θ O!’1.

n a o de da.

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- _r□ e an ti c or po-PAP de acor::

-I jír irp^pr, r fz:· invento inclu.i conj uçados de RAF' de unt anticarpct entra o antigénio de superfície CD7 das células T; um mticorpo monoclonal contra o antigénio de superfície CD4 de s T; e um anticorpo monocionalcsntra o antigénio de ;uperficie CD:;.; do células T„ Também, replicação de HlVem células T nnr! ;

bida em pe 1 o menos

007.

empregando

car.jLigados» de PAP das anticorpos:· monoclonais contra os antigénios CE’4 , C-E<7 ou CD5 de células Tem concentrações abaixo de 35 pM sem inibir a. replicação celular. Ainda, a produção de HIV-1 em células T CD4-+- activadas de doentes infectados com HIV-1 pode ser inibida em peio menos 5-0/. empregando PAP conjugado, com um anticorpo monoclonal contra CE»4 em concentrações abaixo de aproximadamente 10 pM sem inibir a proliferação de células T CD4+.

presente invento também proporciona um método para inactivação ou inibição da replicação do HIV em células de mamífero o qual envolve o tratamento de uma. cultura de células uma composição de incluindo células infectadas com HIV com conjugado de anticorpo monocl. ona 1—PAP. Usando o· método do presente invento a replicação de HlVpode ser eficazmente inibida em 50% sem inibição da replicação celular. Ainda, osde PAP-anticorpo monoclonal do presente invento não pelo menos conj uoados sao tó:<icos para as células progenitoras da medula óssea CFU-GM mieióide=unidade formadora de colónias ds os), BFU-E (célula progenitora eritróide=srisadora de rebentos-eritróide), ou CFU-GEMM (célula progenitora pluripotente=unidade formadora de colónias de granulóci tos-eri tróci tos-mac rófagos-megac arióci tos) em concen trações de 5-15 nKas quais são muito mais elevadas do que as que inibem a replicação do HIV em 50%Os conjugados de PAP-an ticorpo monoclona! do presente invento podem inibir a replicação virai em pelo iceiuia progenitora

i. iudjtí menus 5o% em níveis pelu menus 25 vezes inferiores e d e preferência em. pelo menos 50% em níveis pelo menos 100 vezes aos níveis do conjugado necessário para inibir em 50% çao celular,, Ainda, os conjugados de PAP-an ticorpo podem inibir substãncialmente toda a replicação virai numa concentração de conjugado que inibe a replicação celular em menos inferiores a replicamonoc1ona 1

50%, &· -.4 ·- ·—¹ —· ⁱ— ·. J y c. U Z :£j Cí £ ο Γ· u i. VJ r'~ p t_' ÍFí Ο ι ι (_··__ i S“i cã I base para um processe altamente eficaz para α ds HIV em oonóc i tos de mamífero e células T

--pKFproporc ione s i n i b .i. r a s £· i m , pro ρ o rc i on a-s e u m m é t o d o p tratar doentes com AIDS ou nfeotados c a i r. d a q u e a base de

-1 , etc.) e stando lim , vírus da poru iu ifc'm rus (HTLVmas r.So e CMV, EEV) om HIV-1 que não tenham desenvolvido AIDS, os conjugados de anticorpo monoclonal-PAPprouat método efioas para inibir outros retrovíoutros vírus além dos retrovírus tais como, itado a₅ membros dc· grupo herpesvírus ÍHSV, influenza, rinovírus, papovavírus (papiloma humano), adenovirus, vírus da hepatite, etc.

3Ξ3ΕΗΗ03 ilustre o processo de conjugação de PAPe pijs ÍPC lj ZZ j. O j ι S. .1

A Fiqura mostra

COÍBO ç= purificado o conjugado d«

P A P - a n t i c o r ρ α σι ο π o c 1 o nal;

A Figura, 3 demonstra dois exemplos representativos dos

HPLC (a) conjugados PAP-mAb (b) conjugados purificados de PAP-mAb:

As Figuras 4 e 5 mostram a análise por SDS-PAGE dos anticorpos monoclonais e conjugados de PAP-mAb. SDS-PAGE do mAb F13 dirigido contra o antigénio CD4 e conjugada FÍ3-PAP (antes e contra o antigénio CD7 e purificação), e mAb TI01 conjugado T1O1-PAP (após contra ~ ------ após purificação), mAb G3.7 dirigido conjugado G3.7-PAP (antes e depois d dirigido contra o antigénio CD5, e purifisação) e o mAb G17-2 dirigido contra o antigénio CD4 e o conjugado G17—2-PAP (após puri f icação) num qel de 57. SDS . Ds géis foram corados com Coomassie Slue e as dos marcadores de peso molecular estão indicadas à esnuerda.

A Figura 6 mostra o efeito do PAP não conjugado sobre a replicação do HIV (produção de p24), em células T CD4+ humanas eprol iferação destas células (incorporação de ''H-TdR>.

TI 01 «ostra o efeito do conjugado PAP-anti-CD5 replicação de HIV (pirodução de p24) , em células T CD4+ íumanas e proliferação destas células (incorporação de ''H-TdR).

--anti-CDl

F r içu.r , τ • κ . _JZ» T C X .

mostra o ú/tLÍo μ, μτυ / . ..· μ ...

ro i i ter-sçao destí.s células óo corijuoado ir. -•'/Δ Z* pA.. < » j c

Him células 7 Cl incorporação de 'H-TdR)

A Figura 9 mostra c efeito de PAP-anti-CD19 (B43) na -aplicação de HIV (produção de p24)em células T CD4+ humanas que i§o reaqem com anti—CD 19.

igura 10 mostra. o efeito do conjugado PAP-anti-CD4 rt ii (517--2) na replicação de HIV (produção de p24), em células T CD4+ humanas e proliferação destas células (incorporação de “'H-TdR).

A Figura. 11 mostra o efeito do conjugado F'AF'-anti-CD4 (517.2) na replicação de HIV (produção de p24), ent linfócitos do sangue periférico (PBL) de dois doentes infectados com HIV-1, que foram activados com o mAb contra. CD3 para, induzir a. produção de HIV-1 e os efeitos de PAP-anti-CD4 na. proliferação destas células

A Fiou ra durante 22 dias e produção oe HIV—1 mAb contra CD3 car mostra o efeito do tratamento contínuo o tratamento de 5 dias com PAP-anti-CD4 (produção de p24) durante 22 dias em PBL fidos com HIV-1 após estimulação de PBL com i n d u 2.;. r a κ ;> r o d υ. ç ã o de ΗIV—1 .

na d e o

A Figura 13 mostra um gráfico composto da actividade anti-HIV em células CD4+ por PAP, PAP-anti-CD5 e FAP~an tÍ-CD7.

A Figura 14 mostra gue (a) os conjugados de PAP-mAb são c i totó;.'icos para, as células alvo em concentrações muito superiores do gue aquelas gue inibem a replicação de HIV—1 e íb) nao são rι r rt;:

para as células normais de medula, óssea (CFU—GM, BFU-E, u até concentrações de 5 x Iv'^-' nl*l.

- li DESCR

DETALHADA dd invento

O presente invento e dirigido a conjugados de F'AF'-mAb úteis para inibir a rep 1 icação intracelular de vírus de mamíferos, incluindo numa realização preferida retrovírus tais como HTLV-1 , HTLV-li, SIV., HIV-1 e HIV-2 ou similares em célúlas de mamífero. Os conjugados de PAP-mAb do presente invento são mais especificamente dirigidos é inibição da replicação do HIV em tos e u las T h u m an a s presente invento proporciona rai:

células de mamífero sem citotoxicidade detectâvel. Para fins do presente invento citotoxicidade detectâvel refere-se aos níveis deinibição do crescimento celular mensuráveis ou observados em ou os conjugados de antivianticorpo que são capazes de inibir a replicação do vírus em ensaios de incorpora de Ή-leucina, ensaio clonoqénicos incorporação de H-timidina (^_H-TdR>. Conforme aqui descrita con j u:

an tivirais-anticor

H'rsfêrem· em geral aco ce i- +· -t r- r-, -- T um em .icorpo monoclonal (mAb) ε proteína antiviral }ue o anticorpo é ccvalentemente ligado a uma proteína antiviral., Mais especificamente, os conjugados de anticorpo do presente invento incluem anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antigénio reactivos com antigénios activos de superfíanticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antigénio é ligado ccvalentemente à proteína, antiviral □ Ç? 5 Γ 'ν H Ci Cj S c d. Π u Γ C- — partir de Phvtolacca unia iroteína purificada extraída americana capas de inibir a síntese protei·

SiO menos rí usar-se conjugados de F‘AF’-mAb do presente invento

0X da replicação do vírus pode ser inibida sem inibição tía. replicação celular. Os conjugados de F‘AF'—mAb do •esente invento podem inibir a replicação do vírus em pelo menos

502usanda o	conj ugado
i5ú pN sem j.	n i b i r a
de inibição	d a r e p* 11. c
inibição da	replicaçã
pN usando o	conj ugado
realisação é	; necessár

conjugado para causar

PAP-mAb em cor.centraçaes abaixo de cerca de •epl icação celular. Observámos cerca de 507. ição do HIV em células T CD4+ humanas sem 5 celular em concentrações inferiores a 35 de PAPe mAb contra CD5, CD7 ou CD4. Numa io aproximadamente 20Ό vezes mais PAP não

507, de inibição da replicaçâo do HIV.

No presente invento, o conjugado PAP-mAb é reactivo com um antigénio na superfície de células de mamífero, tais como monócitos, células T humanas, células epiteliais, células do cérebro e similares. Conforme aqui descrita «antigénio de superfície» de células infectadas com vírus refere-se a antigénios associados a células infectadas com virus constituindo, por exemplo, antigénios de diferenciação normais naquelas células que são expressos independentemente da infecção viral assim como antigénios expressos ou associados àquelas células apenas quando tais células ficam infectadas com um virus particular.

Fonte de PAP & Purificação uma proteína obtida a partir de Phytolacca

Θ ΓΓι ©Cl ma capas de inibir a síntese proteica. A proteína, tem um peso molecular de aproximadamente pode americana e pu r i f i c a d a cadeia polipeptídica. PA;

3§ 0.00 e compreende uma única ser extraída a. partir de de acordo com um método conhecido, como seja, o método descrito por J.D. Irvin, Pharmac. Ther

LIS 371-387 (3.983); Uckun, ANTJBODY

247-262 (1983); PAP tem uma actividade forte na inibição da síntese de polifeni1alanina t icu 1 óc i to. PAP pode com a uti1isação de ribossoma do extraída não só das folhas de Phytolacca americana como também das suas sementes.

ser

Mr

As técnicas gerais para a produção de anticorpos mon oc ]. orais baseiam-se na fusão de linfócitos do baço com células malignas (miei ornas-1 de tumores primários da medula, óssea CC. Milstein, Sc i. Am , 243, 66 (1930 3. Os métodos dão uma linha celular híbrida, surgindo de um único híbrido de células fundidas ou clone, o qual possui caracteristicas comuns aos linfócitos e à linha de células de mieloma. Tal como os linfócitos (retirados de animais sensibilizados com eritrócitos de carneiro como antigénios), os híbridos fundidos ou hibridomas secretam anticorpos (imunoglobulinas) reactivos com o antigénio. Ainda, tal como as linhas celulares de mieloma, as linhas celulares híbridas são imortais. Especificamente, enquanto os anti-soros derivadas de animais vacinados são misturas variáveis de anticorpos que não podem ser reproduzidos de modo idêntico, α único tipo de imunaglobulina secretado por um hibridoma é especifico de um e apenas um determinante antigénica no antigénio, numa molécula complexa tendo uma multiplicidade de substruturas moleculares antigénicas ou determinantes (epítopos). Por exmplo, se o antigénio fôr uma proteína, um determinante antigénico pode ser uma de muitas sequências peptídicas dentro da molécula proteica total. Portanto, os anticorpos monoclonais induzidos contra, um único antigénio podem ser distintos uns dos outros dependendo do determinante que induziu a. sua formação. No entanto, todos os anticorpos produzidos por um determinado clone são idênticas. Ainda, as linhas celulares de hibridoma preferidas podem ser reproduzidas indefin idsiKt-jn te , são fác cimente propaoaoas i rι ν 11 r o ou c. η ν ζ ν o e produzem anticorpos monoclonais em quantidades extremamente elevadas. Os anticorpos monoclonais destinados a usar no presente invento podem derivar de ratinho, podem ser de origem humana ou serem anticorpos quiméricos «metade? ratinho» e «metade humano».

Conforme indicado atrás, o presente inventa utiliza anticorpos monoclonais reactivos com um antigénio presente na. superfície de células de mamífero infectadas com vírus tais como mcnócítos e células 7 humanas, células epiteliais e similares. Ds anticorpos monoclonais úteis no presente invento são produzidos } usando técnicas de fusão de hibridomas bem conhecidas CG. ' Kohler e 8. Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); M. Shulman et al.,

Nature, 276: 269 (1978)3. Ds anticorpos monoclonais que podem ser usados no presente invento incluem os dirigidos contra antigénios de superfície de células de primatas, CD2, CEi3, CD4, CE>5, CD7, ) CD8, CD14, CD45 e BP-50. Anticorpos exemplificativos incluem Mab F13 contra CB14; 83.7 contra CD7 e T101 contra CEf5; mAb 817-2 contra CD4 como descrito em Ledbetter et al., Molecular Immitno 1 oq y, 26 , 137-145 (1989); Uckun et al . , J. of Immunoloqy , 140: 2103-2111 (1983); B1 ood, 66.: 627-635 (1985); Ledbetter et al., Molecular Immunoloqy, 24: 1255-1267 (1987).

Preparação_e Características de Imunctoxinas ( a ) Teste da. ssoec i f í c. i d a d e

A reactividade da ligaçãode F13, 83.7, T101 e 817-2 e dos outros anticorpos monoclonais empregues no presente invento | pode ser avaliada pelo ensaia de imunofluorescência indirecta. Neste ensaio, as células a sertem testadas sS postas em contacto com numa suspensão ou numa lâmina com um excesso do mAb. Após um período de incubação adequado, as células foram lavadas para remover o mAb não ligado e o anticorpo liqado foi detectado com ' um anticorpo anti. ratinho ligado a uma marca fluorescente como seja isotiocianato de fluoresceína (PITO.

A ligação do conjuqado PAP-anticorpo monoclonal a células T e monócitos pode ser determinada por um ensaio de imunof 1 uore5Cência tipo «sanduíche dupla» eni que as células a serem testadas são incubadas sequenciadamente com (a) o conjugado de PAP-anticorpo monoclonal, (b) um anti-soro contra a proteína antiviral da erva dos cancros e (c) um anticorpo marcado com fluorescência contra o anti-soro., As células marcadas podem ser analisadas por técnicas de citofluorometria usando técnicas adequadas para subtracção do fundo.

(b) Avaliação da Citotoxicidade do Conjugado PAP-Anticorpo

Monoc1ona1

As células podem ser colocadas em contacto com o conjugado anticorpo monoc1ona1-PAP ressuspendendo as células num meio fisiológico adequado e adicionando o conjugado PAP-anticorpo na concentração pretendida. Após anticorpo-PAP, a sobrevivência tratamento com com o conjugado das células pode ser medida usando: a) ensaios de inbição da síntese proteica; b) ensaios de viabilidade com azul tripano; c) ensaios clonogénicos por diluição limite como descrito por Uckun et al., Câncer Res. 45: 69-75 (1985); Uckun et a. 1 . , Autoloqous Bone Marrow Transp1ant. Proc, First IntI. 5ymp., 449-453 (1985); Uckun et al . , J. Immunol. 1-54: 2010-2016 (1985); e d) incorporação de Ή-timidina para medir a síntese de DNA celular. Também, o efeito na sobrevivência das células pode ser medido ressuspendendo as células em meio alfa-MEM ou RPMI 1640 (Gran Ble. NY)que pode ser suplementado com meio condicionado de linfócitos estimulados com fitoeaglutinina (PHA-LCM)ou PHA com ou sem interleuquina—2. Amostras da suspensão celular foram então cultivadas urante duas semanas-e quaisquer células viáveis foram detectadas por microscopie. usando o ensaio de excluysão com azul tripano descrito em Uckun et al., J. Immunol., 134: 2010-2016 (1985) ou as células foram marcadas -Ή-timidina como medição da replicação celular.

com (c) Avaliação dos Conjugados de

Replicação Virai

FAP-Anticorpo Monoclonal na

Células não infectadas tais como monócitos- e células T CD4+ frescas foram tratadas com os conjugados de anticorpo monocl ona 1-PAP. As amostras de células tratadas foram então expostas a HIV. Após aproximadamente 2 horas de adsorção com o virus, removeu-se o virus não adsorvido e adicionou-se novo meio contendo conjugado de anticorpo monoc lonal-PAF’. Amostras da suspensão de células foram cultivadas durante cinco a oito dias altura em que se removeu o sobrenadante e testou-se quanto á presença de actividade de p24 do HIV em ensaios de ELISA para captura de antigénio. Como alternativa, PBL de doentes infectados com HIV-1 foram tratados com conjugados de anticorpo monoclonal-PAP e activados com um agente eficaz para a indução da proliferação celular e replicação de HIV como seja um anticorpo monoclonal contra CD3 ou um mitogénio coroo seja fito-hemaglutininaau similares. A quantidade de agente necessário para activar a replicação de HIV variará entre cerca de 0,1 e 1,0 pg/ml dependendo do tipo de agente. No caso do mAb contra CB3 é necessário cerca de 0,5 a cerca de 2,0 pg/ml. Como aqui descrito, mAb contra CB3 (G19-4) foi usado para activar as células para se replicar e produzir HIV-1. Amostras da suspensão celular foram cultivadas durante cinco dias a várias semanas altura em que se removeu o sobrenadante e testou quanta à presença de actividade de p—42 do HIV em ensaios de ELISA para captura de antigénios.

Utilização Terapêutica tratamento de doentes usando o método do presente invento envolve a administração de quantidades terapêuticas da composição do conjugado de anticorpo monoclonal e PAP. No contexto do presente invento, os termos «tratamento» e «terapia» e similares referem-se à profiláxia ou atenuação de doenças existentes. A composição do anticorpo-PAP pode ser formulada com veículos parenterais convencionais farmacêuticamente aceitáveis para injecção. Estes veículos compreendem substancias que são essencialmente não tóxicas e não terapêuticas tais como água, soro fisiológico, solução de Rinqer, solução de dextrose, solução de Hank ou similares. Deve-se entender que as formulações do conjugado de anticorpo-F'AF' podem também incluir pequenas quantidades de adjuvantes tais como tampSes e preservantes para manter a isotonicida.de, estabilidade fisiológica e pH. De preferência, o conjugado de anticorpo-PAP é formulado na forma purificada substâncialmente livre de agregados e outras proteínas numa concentração que varia entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/ml.

Conforme indicado pela formulação acima, os conjugados de PAP-anticorpo monoclonal podem ser administrados parenteralmente. No caso de algumas doenças virais, os conjugados de PAP-anticorpo monoclonal podem ser libertados ou administrados tópicamente, intravenosamente ou na forma de aerossol. Quando os conjugados de PAP-anticorpo monoclonal são administrados intravenosamente eles podem ser libertados como um bolus ou numa base de continuidade.

A dose da formulação de conjugado de anticorpo-PAP a ser administrado dependerá do doente e da história médica do doente. No entanto a. dose deverá ser suficiente para inibir uma fracção substancial, geralmente mais de aproximadamente 907., da replicação virai nas células infectadas do paciente. Por exemplo: F'AP-ant.i-CD7 ou F'AP-anti-CD4 deverá inibir a replicação de HIV em >90% se usado na gama de 10-1ΘΘ pM, o que é igual a 2,0-20 ng/ml. A dose necessário para conseguir esta concentração pode ser calculada usando a fórmula: Dose em microgramas = 70 x 2(20) x peso (em Kg ) /1 000. Para um doente com 70 Kg, isto daria 10-100

IB ísicrogramas. Notávelfliente, estas doses são 50-500 vezes inferiores do que as toleradas por primatas não humanos sem toxicidade detectável. As dosagens para humanos adultos com infecção por HIV abrangidos pelo presente inventoe consideradas como sendo terapêuticamente eficazes variarão entre cerca de 10 e 100 micrograΛ mas e serão administradas com uma frequência baseada na sèmi-vida no plasma dos conjugados F'AP-mAb num determinado paciente determinada por ELISA em fase sólida. As doses podem ser fácilmente ajustadas para proporcionar quantidades adequadas do conjugado anticorpo~F‘AF‘ a crianças usando a fórmula acima.

j invento será ainda descrito por referência aos exemplos detalhados; que se seguem.

EXEMPLOS

I. Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos monoclonais que se sequem foram empregues em conjugados com PAP.

O anticorpo monoclonal F-13 descrito em Andews et al . , «Leucocyte Typing: Human Leucocyte Differentiation Antigens Detected by Monoclonal Antibodies», pp. 398-404 (editado por A. Bernard et al., 1984).

anticorpo monoclonal G3.7 descrito em Uckun et al.,

J. of Immunoloqy 140, 2103-2111 (1985) e Uckun et al., 3. Immunol 135.. 3516-3522 (1985) e depositado na ATCC em 20 de Julho de 1989 com o N° ATCC HB10182.

anticorpo mencionai T101 descrito em Royston et al., Transpl. Proc. 13, 761-766 (1981); Uckun et al., B1ood 69,

301-366 (19S7).

anticorpo monoclonal B43 descrito em Uckunet al., Immunoloqy 134, 2010-2016 /1985) (ATCC N3 HB8903).

O anticorpo monoclonal 817—2 descrito em Ledbetter et al . , Molecular Imfiiu.noloqv 24, 1255-1261 (1987) e depositado na ATCC em 29 de Março, 1990.

II. Síntese de Conjugados PAP-Anticorpo Monoclonal A proteína antiviral da erva dos cancros (PAP) s uma. toxina de uma única, cadeia polipeptídica (p.m. 30 000) que inactiva catai í t. icamen te a subunidade 60 S dos ribossomas euca··· rióticos e pode ser isolada a partir de folhas da Primavera da erva dos cancros (Phytolacca americana) como descrita por L.L. Houston et al . em J. Biol Chem , 25 9601 (1933). PAP é purificapor Irvin, Pharmac. Ther. 21: 371-383 (1933);

do como descrito Uckun, ANTIBODY, 1 , 247-262 incluída como referência.; -2016 (1935).

(1988) a divulgação do qualé aqui Uckun, J. of Immunoloqy, 134, 2010Na Figura 1 está apresentada a preparação dos conjugados de PAP-mAb. Os anticorpos monoclonais F13 (IgG^, anti-CD14), G3.7 (IgGj, pan-T, anti-p41 CD7) , T101 (IgG^, pan-T, anti-CD5) LI. Royston et al., J. Immunol., 125. 725 <1980)3 e G17-2 (IgG, anti—CD4) CJ. Ledbetter et al., Mol. Immunol., 24, 1255 (1987)3 foram ligados à proteína antiviral da erva dos cancros (PAP) por uma ponte dissulfureto usando N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) como descrito par Uckun, ANTIBODY. supra. Os conjugados de PAP foram purificados por cromatografia de exclusão de tamanho em HPLC usando cromatografia de permuta catiõnica (Uckun, ANTIBODV. supra. PAP purificado reagiu com um excesso molar de 3 vezes de 2-iminotiolano durante 30 minutos para introduzir gu.pos reactivos sulfidrilo nas fracçSes de toxina seguido de reacção com os grupos amina primários conforme descrito por Uckun, Antibody, supra; Ver Uckun et al., Human Tumor Antigens and Specific Tumor Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, vol. 99 (Ed. Metzgar e Mitchell, Alan R. Liss, Inc., M.Y., N-Y. 1983). 0 mAb (5 mg/ml) reagiu primeiro com um excesso molar de 3 vezes de SF‘DF' (uma solução preparada fresco com uma concentração 64 mM em DNSO tampão fosfato de sódio 40 mM contendo 150 durante 30 minutos à temperatura ambiente, contendo grupos ditiopiridilo foi misturado contendo grupos sulfidrilo livres numa proporção de diluida a 1:10 em mM NaCl, pH 7,5) 0 mAb modificado com PAP modificado molar de •‘Ar/mAo~3/1 e incubado durante a noite a 4 C. Após esta reacção cnjugados de PAP-mAb foram purificados como descrito em

Ucrun et

E;<p. Med. 163, 347-368 (1986);

Uckun, An ti body< supra; e Kckun, HumanTumor Antiqens and Speoifio T u m o r Ther a p y UCLA Symposia on Molecular and Cellular Bio. supra , por crornatografia de exclusão de tamanho e de permuta iénica usando um sistema de HPLC controlado por computador (System Gold Beckman). Os conjugados de PAP-mAb, F13-PAP, G3.7-PAP, Τ1Θ1-ΡΑΡ e (317-2-PAP foram separados de PAP não conjugado por cromatograf ia de exclusão de tamanho em HPLC e do anticorpo monoclonal não conjugado por cromatografia de permuta catiónica, como descrito por u.cl<uη , Antibody Immunoconjuqates and Radiopharmaceuticals V 1I pp 247-262 (1988).

□s conjugados purificados de PAP-mAb foram analisados in vitro relativamente à pureza e composição por SDS-PAGE (Fig. 4) e HPLC quantitativa (FIGS2 e 3). Não se detectou PAP livre por electroforese em gel de poliacrilamida em condiçSes não redutoras . A contaminação com anticorpo livre foi calculada como sendo inferior a IV. por varrimento do gel. As preparações do conjugado PAP-mAb deram origem a bandas de proteína de 180KDa e 21©KDa, correspondendo a espécies de conjuqados contendo 1 ou 2 moléculas de PAP ligadas a 1 molécula de anticorpo monoclonal. Um peso molecular médio de 210 KDa para o conjugado PAP-mAb foi usado para calcular a concentração molar pois os conjugados de PAP consistem principalmente em duas moléculas de PAP ligadas a. uma , Células Alvo

0= cunjugacbs purificados de PAP-mAb foram analis e 1 a 11 vamen te a actividade de inibição dos ri bossoma ados s em se proteica celular.

ensaios de prol iteração clonoçénicos, incorcoração de eni

H—timidin;

células e efeito inibidor na produção usando células alvo expressando os respectivos antigénios. Como alvos usaram—se monócitos b'937 s células T CD4+ do sangue infectadas com HIV. As testemunhas incluíram (a) células alvo não infectadas (U937, células T . jcíluiaS- da Híedu*a ussea Naim .

assim como células alvo tratadas com conjugados de anticorpo testemunha ou PAP não conjugado.. Usou-se a linha celular de monócitos U937 (ATCC N2 CRU 1593).

-ílyM·.·

JA □TOXICIDADE DOS CONJUGADOS DE PAP-ANTICORPO

MONOCLONAL

Os conjugados de PAP-mAb foram avaliados quanto à sua capacidade para. inactivar a. síntese proteica num sistema. de tradução acelular em que foram empregues ribossomas. de fígado de rato e ácido poliuridi1ico pelo método de D.B. Cawlev et al-, Biochsmistry< 17 , 2643 (1979) (Tabela 1). Os resultados na Tabela 1 mostram que PAP inibe a tradução num sistema acelular e que os conjugados de PAP-anticorpos monoclonais contendo mAb contra CD19, CD14 ou CD7 retêm a capacidade para inibir a tradução acelular. A citctoxicidade específica do tipo celular destes conjugados FAP—mAb contra CEM, LÍ937 e células da. medula óssea foi ans li cada usando ensaios clonogénicos ou ensaios clonogénicos com diluições seriadas coma descrito em Uckun, Câncer Res., 45; 69—75, (Í9S5); Uckun, J .. of Immunoloqy, 135:: 3516-3522, (1935).

Usámos dois sistemas de ensaios diferentes complementares para medir a replicação celular de modo a determinar os efeitos citotóxicos dos conjugados PAP-mAb. Primeira, os ensaios de incorporação de t.imidina triciada. (“H—TdR) que mede a síntese de DNA e replicação a curto prazo foram usados para determinar a citcstaxicidade das células alvo. Este sistema de ensaio é muito

sensível para detectar os efeitos inibidores sobre as células, inibição transitória s inibição permanente (i.e., morte celular)» Portanto, u.saram-se os ensaios .· Zq ri?Π .1. C .:· A ί ΟΠ Γ μ; Γ S2 u pA. Γ A determinar a morte célula tratamento com os conjugados de FAP-mAb.

sistemas de

Ambos ensaios deram resultados complementares demonstrando um «indíce terapêutico» significativo rslativamente à inibição da replicação de HIV pelos conjugados de FAP-mAb Co indíce terapêutico é definido como a proporção da concentração de conjugado de FAP-mAb qus inibe 907. (ou 507.) da replicação de HIV versus concentração do conjugado F'AF'-mAb que inibe 90% (ou 50%) da replicação celular (ver Tabela 3)3.

A Tabela. 3 e Figuras 7, 8 e 10 mostram que 650 pM de FAr-anti-CD5, 600 pd de F‘AF’-anti-CD7 e 2 000 pM de F’AF'-anti-CD4 foram necessárias para inibir em 50% a replicação de células T rnamostra quç ;entraç3es até 1 100 pM dt

F'AF’arrti-CDiv, que não reage com células í UD4+, não causa mais do ini biçãc replicação de células T CD4+. Como se mostrará a sguir (secção V), guando comparado com a quantidade de

FAiF'-an ticorpo monoclonal ne;

íssária inibir replicação do vírus em 50%, foram observados níveis do conjugado FAP-enticorpo monoclonal pelo menos 25 vezes inferiores e de preferência 100 vezes inferiores aos necessários para inibir a. replicação celular em 507.. Ainda, comparando os estudos clonogénicos de inibição celular, como se pode ver na Figura 14, com a pelos conjugados de FAiF’-an ticorpo monoclonal, a Tabela 3 e Figuras 7, 8 e 10, os conjuqados rpo monoclonal apresentam inibição de substancialrep 1 i c ação virai em níveis de pelo menos; 100 vezes como se oode ver replicação celular mostra a selectivida.de dos

conjugados PAP-mAb. For exemplei FAP-anti-CD5 inibe o crescimento clonogénico de células CD5 CEM (uma linha de célu.las T CD4+), gMAC 28 (um clone normal de células T CD4+) e F65 (um clone de células T CD4+ normais) mas não inibe as células CD5-tais como monócitos U937 ou células progenitoras normais da medula óssea BFU-E, CFU-GM ou CFU-GEMM. Assim, estes resultados mostram que os conjugados de FAP-mAh são especificamente citotóxicos para células alvo expressando antigénio para o qual é dirigido o mAb. No entanto, as concentrações de PAP-mAb necessárias para inibir selectivamente a. replicação de células alvo são muito superiores ) às concentrações necessárias para inibir a replicação do HIV (Tabela 2,3, Figs. 7,8).

Espera-se que os conjugados de PAP-mAb nas doses necessárias para a inibição da replicação de HIV em células alvo induzam uma. toxicidade mínima ou nenhuma toxicidad células não alvo (conforme definido pela ausência de alvo importante reconhecido pela. fracção de mAb do é1ulas progenitoras para as an tigén io conjugado n u r ι i ι a i s da medula óssea, uma vez que (1) menos de 4Θ7 de inibição das células U937, CFU-GM, BFU-E ou CFU-GEMM que são negativas para para o antigénio CD5 foi observada nas concentrações mais elevadas do conjugado PAP-anti-CD5 e (2) menos de 207. de inibição de células U937 ou BFU-E que são negativas para o antigénio CD7 foi observada nas concentrações mais elevadas do conjugado PAP-«CD7 (ver Fig.. 14). Um nível de inibição que é inferior a 50% não é siqni— ficativamente diferente da «não inibição» neste sistema de ensaio LUckun et al „ , Câncer Research 45, 69-75 (1985)3. Notávelmente, a E5 ou PAP-an ti—CD' concentração mais vada de PAP-anti testada. i.e. , 5 x IO prl, é 50-500 vezes mais elevadas do que as concentrações de PAP—c?CD5 ou PAF'—<xCD7 que são necessárias para >907 cie ;içâo da replicação de HIV, conforme determinado por inibição da produção de p24 em células T CD4+ (ver Fiqs. 7,8,13).

Assim, a Fig. 14 indica que os conjuoados de FAF — mAb são citotóxicos para as células alvo expressando os antigénios de superfície importantes quando usados em concen trações mais elevadas. F'or exemplo, F'AF’-uCD5 inibiu a proliferação de células CEM, SMAC2S e 4

F65 positivas para o antigénio UD5 em i967 a 5 19 pM e

F'AF' —cíCE'7 inibiu, a roliferação de células CEM, CFU-GEMM e C-FU-GM 56-767 a 5 :

6-560 vezes superior à concentração de qualquer positivas para o antigénio CD7 em concentração e

u.m dos conjugados necessáriapara inibir >967. da replicação de HIV ?íis células T CD4+ (ver Figs. 7, 3, 13)., F’AF'-anti-CD4 a 15 666 pM :ausou apenas 27., 5,87 e 67 de inibição da formação de colónias zéllas progen.

da medula óssea BFU-E, CFU-GM e GEMM respectivamente (resultados não apresentados). Esta concentração é cerca de o 066 vezes superi:

à concentração do conjugado de

FAF-anti-CD4 necessária para inibir 967 da replicação! de HIV-1 em c é 1 u las i C ι.-* 4 e *, F m » 10) .

A Fig. 7 demonstra qu.e o conjugado de FAF'-«CD5 inibe ry >967 a replicação de HIV em células T CD4+· a 3 x W pM. Nesta concent ração, F' AP - u2D5 inibiu a replicação a curto prazo (conforpeia incorporação de '‘H-timidina) das células 7 CD4-+ f-‘^r.

o li a ren í 1 c ac:

ongo azo (conforme medido por ensaios c1onogénicos) de células CEM, GMAC23 e F65, que expressam todas o antigénio de superfície CD5, em 467 ou menos.

De um modo semelhante, a Fig,. 3 demonstra que o conjugado F'AF'-uCD7 inibe >967 da replicação de H1'V em células T CD4+- a 3 x 10 pMNesta concentração, inibiu 467. da replicação acurto prazo das células T CD4+ e <26: células CEM, CFU-GM ou CFU-GEMM 14).

?e I- I

LU / u-iq.

da repl. icação a loncgo prazo das que expressam todas o antigénio )e modo seme1hante,

Fíj demonsti = que F‘AF‘—an ti — CD4 .inibe >967 da replicação do HIV—1 em ílulas

ED4+

Nesta concentração, é inibida em 267

CÀ

replicação a curto prazo de célulac T CD4+. A 30 pM, PAP_anti~CD4 nãc houve inibição de CFU-GM, BFU-E ou GEMM. Estes resultados ilustram que os conjugados podem inibir a replicação do HIV em células T CD4+ sem inibir a replicação de células T CD4+ não infectadas ou a formação de colónias por células de medula óssea.

i

Efeitos Inibidores dos Conjugados de F'AF-An ticorpo

MonocI oral em a d uc ão A célular s

Β43-ΡΑΡ (anti-CDl?) 21 F13-PAP Íanti-CD14? 14 G3.7-PAP (anti~CD7> 39 ) SI7-2-PAP (anti-CD4) 25 pap e

D efeito dos conjugados de ΡΑΡ-anticorpo na tradução acelular foi analisado em condições não redutoras num sistema de tradução acelular que consiste num lisado de reticu1ócitos de coelho tratado com nuclease com capacidade para traduzir RNA mensageiro em proteína» A síntese proteica foi medida como a iricotporação de 'Ή-leucina em material precipitável com TCA resistente ao tratamento com bases. ICe·,. = concentração que inibe £?fT· 5*’*/· 3. S· ί. Π t C? S *£M”C’llG? i C-Ά. «

na Produção de HIV em	Monóci tos	'“ · ·=! o	Células	T	Infectadas	in vitro
” 3ÍTi Η I V~~ 1 E? Π cd F'Γ T)d LÁÇ	o ds VIV	em	Células	T	de Doentes	Infecta-

dos, tratamento com os controlados quanto sobrenadartes de ci

?.s T e os monócitos U937 expostos a HIV-1 após conj u□a d os d e FAP-an t i corpo monoclonal f o ram à produção do antigênio p24 de HIV ígag) em .iltura usando um ensaio imuno-sorvente ligado a s s. captura de antigênios dD HIV-1,, (Benetic i

lem;

Lorp.) Os

tjugâdos de PAP~mA £» furam analisadus quan tu á actividade anti-HIV numa gama de doses de .og

Foram iletais que inibem eficazmente a replicação virai em células T CD4+ sem matar as células T CE»4+ não infectadas .

As células U937, cultivadas em RPMI contendo 107. FCS, foram sedimentadas e depois ressuspensas em RPMI fresco contendo 107 de FCS numa densidade de 1 >; 10^J células/ml. PAP ou o conjugado de PAP-mAb preparado de fresco numa concentração igual a 4 vezes a. concen tração final no mesmo meio. 0,1 ml da suspensão celular e 0,,05 ml de droga ou meio foram adicionados a cada uma de 8 cavidades de placas de microtitulação de 96 cavidades com o fundo plano. No dia seguinte, adicionou-se a cada, cavidade 0,05 ml do isolado LAV-1 do HIV-l diluído seriadamente. Um dia após a lavadas duas vezes para remover o uma das cavidades adicionou-se novo infecção, as células foram vírus não adsorvido. A cada meio contenda determinadas concen trações de RAF' ou dos conjugados ‘ -Jidh· ct cada liím antigénio p24 do HIV (gag) por ELISA de captura de antigénios (Genetic Systems Inc.). As células ratadas em várias concentrações estão descritas na Tabela 2. A Tabela 2 mostra que tanto PAP como RAR-anti-CD14 inibem a produção de HIV-p24 em células monócitos U937 e que o conjugado PAP-anti-CD14 ê o mais eficaz inibindo completamente o HIV em concentrações tão baixas como 150 s o b r en a d a n t e d e — a. infeCçãu removeu-se y,l ml do das cavidades e testou-se quanto ao

Para, estudar os efeitos de PAP e dos conjugados de

-‘Ar—mAb n·-;. r—pl i^s^ãu do humanos normais, 25 >·: 10^ 1 in f óc i tos do sangue periférico (F'BL) , isc.'lados a partir de sangue humano fresco por centrifugação em em células T CD4+ obtidas tes de densidade em Ficoll, foram ressuspensos em ml de meio RPI1I lé>40 contendo 10% de soro humano normal (NHS) e foram incubados durante uma hora a 37°C num frasco de cultura de tecidos para remover os monócitos não aderentes.

Os PBL não aderentes foramentão incubados durante 30 min. em gelo em meio contendo 10% NHS e uma combinação dos anticorpos monoclonais que se seguem, cada um a IVpg/ml: G10.1 uCDS), FC-1 (aCDlfc) e 1F5 (<xCD20> . Às células tratadas com anticorpo adicionou-se complemento de coelho de 3-4 semanas Pel Freeze numa diluição final de 1:4. As células foramincubadas com complemento durante 1 hora. a. 37°C e depois as células mortas foram eliminadas em Ficoll. As células viáveis foram incubadas durante a. noite em meio RPNI contendo 10% de NHS e 3pg/ml de fito-hemaglutinina íPHA).

PHA foi então removido lavando as células com meio e 2 < 10^1J células foram ressuspensas com 0,5 ml de meio contendo várias concentrações de PAP ou conjugados de PAP-mAb ou i i I ·± .i. U tubo* t-i E'pul·' inuu b aJ as d ura 1ι1e χ 10⁴ adicionou-se então

Tecidos.

(TCID' . do isolado LAV-1 do HIV-1.

apenas em 4 horas a 37^0. A cada um dos Doses Infecciosas de Cu.ltura de

Após 2 horas por lavagem das células ressuspensas em 0,2 ml cr

IxlO'^- células em O.. 1 ml o vírus não ligado às células foi removido em pE<S quatro vezes e as células foram de meio Clxl0^to células/ml). Em seguida foram adicionadas a cada uma de 4 cavidades de palcas de ?ó cavidades de fundo redondo contendo 0,1 ml de várias concentrsçoes de PAP, conjugados de PAiP—mAb ou apenas meio e 4 unidades/ml de? IL-2 (Lymphocult-T).

No dia 7 removeu-se o sobrenadante das paredes de uma placa de duplicado e testou.-se quanto a p24 de HIV <gaq) numa

ELISA quantitativa, de captura dc antigénio p24 (GSC). A percentagem de inibição da produção ds p24 foi calculada como se segue;

- ng/ml de? p24 produzido por células tratadas χ 1 &Q ng/ml de p24 produzido por células não tratadas

Os sotirenadantes de células T CD4+ não tratadas continham 1.255 ng/ml de p24. Ds resultados da actividade anti-HIV dos conjugados de FAF’ com o mAb contra CD5, CD7 ou CD4 e com o conjugado de PAP para um mAb negativo testemunha contra CD19 estão apresentados na Tabela 3 e Figuras 7-10, 13.

D pré-tratamento de células T CD4+ com PAF não conjugado em concentrações de aproximadamente 5 000 pM inibiu a produção de HIV-1 em aproximadamente 50% nestas células que foram infectadas com o isolado L.AV—1 do HIV-1, oferecendo evidência de que o espectro antiviral de PAP inclui HIV-1. (Tabela 3, Fig. ó) PAP-anti.-CD5 (T101), PAP-anti-CD7 (G3.7) que reagem com células T e PAP-an ti-CD4 (S17--2) que reage especif icamente com células T CD4+ foram altamente eficazes na inibição da. replicação do vírus em células T CD4+ (Figs. 7, 8 e 10 e Tabela 3). D conjugado PAP testemunha contendo B43/CD19 qu.e reage com células B testemunha mas não com células

50% de hi ção da replicação do HI >. I em células TCd4+ mesmo a 1 375 pM (Fiq„ 9, Tabela 3) o que é cerca de 220 mais alto do que a concen tração de F'AF‘-anti-CD7 e cerca de 1000 vezes superior à concentração de F'AP-anti-CD4 necessária para miou (Figuras 8, produção de

224 do HIV em

CD4+

1€? e Tabela 3). Notável mente as concen trações de PAP conjugado com anti--CD5, anti-CD7 ou anti-CD4 inibidoras da replicação do HIV são muito mais inferiores do que as necessárias para a inibição da replicação celular (Fig. 7, 8, 10, 13 e T a be 1 a

Para o estudo do efeito do conjugado PAP-anti-CD4 na produção de p-24 ds HIV nos linfócitos do sangue periférico (PBL) de humanos infectados com HIV-1, PEiL foram isolados a partir de sangua Tresco per gradientes de densidade em ncoll e ressuspengradientes de densidade em Ficoll sos a 1 X 10células/ml em humano normal (NHS). Em seguida 1 10^w células em 1,0 ml foi adicionado a cada uma de duas cavidades de placas ce 24 cavidades contendo 1 ml de várias concentrações de conjugado de PAP-anti-CD4juntamente com l.pg/ml do anticorpo monoclonal contra CD3 UgGl, S19.4 ATCC NS HB9536 depositado em 15 de Setembro de 1987) para induzir a replicação do PBL e activação da produção de HIV-1 e 4 unidades/ml de IL-2 (EIectro-NuoIeonies)„ meio RPMI 1640 contendo 10% de soro

No dia 5, amostras de 0,1 ml de suspensões celulares de irara transferidas para placas de 96 cavidades de •fundo redondo e marcadas com 1,0 pt;i em 0,1 ml por cavidade timidina triciada (New England Nuclear) colector de células 6 horas mais tarde.

e colhi:

usando de um íia sobrenadante foi removido das células testado quanto aos níveis de p24 do HIV numa ELISA quantitativa de captura do antigénio p24 (Genetic Systems). A percentagem de inibição da produção de p24 foi calculada como se segue:

1- nd/mí de jroduzido per células tratadas

00 nq/ml de p24 produzido por células não tratadas

Os resultados dos efeitos de PAP conjugado com o mAb contra. CD4 na inibição da produção de HIV-1 em PBL de dois estão apresentados na Fig. 11.

)

A Figura 11 mostra que o tratamento de PBL de doentes infectados com HIV-1 com o mAb GIF.4 contra CD3 induz a produção de HIV-1. As concentrações de p24 nos sobrenadantes de PBL activados com anti-CB3, não tratados com F‘AF‘-mAb CD4, dos dadores 26 e 23, foram de 0,4 e 6,6 ng/ml, respectivamente. No entanto.

um_: :oncentração de aproximadamente 0,5 pM de F'AF'-anti-CD4 inibiu

a. replicaqão de HIV (p24) em 5Θ71. Uma concentração de aproximadamente 5 pM de PAP-anti~CD4 inibiu a produção de p24 em quase 1007. mas não inibiu a repl icação celular dos- PBL do doente.

-CD4

A Figura 12 mostra que o efeito anti-HlV do PAP-anti(5,0 pM) em PBL de dois doentes activados com anti.-CD3 durou pelo menos- 22 dias mesmo remoção de PAP-anti~CD4 no quando as -células foram lavadas para dia 5.

Estes resultados- indicam que os- conjugados de anticorpos- monoclonais da proteína antiviral da erva dos cancros podem ser usados na. inibição selectiva. da. produção de HIV em células portadoras de antigénios de superfície alvo importantes contra os quais ê dirigido o anticorpo monoclonal sem que os conjugados inibam a replicação celular. Notávelmente, PAP-anti-CD4 não só é ol.! ;

:o pctento na.

inibição da. replicaçSo do HIV-1 em células normais infectadas in potente na. inibição da. efeito dura pelo menos vitro com HIV-1, como também é muito produção de HIV-1 em PBL de doentes e o 'árias semanas (Figs. 11 e 125. Os conjuaproximadamente gados de PAP-mAb têm u.ma. semi-vida in vivo de 16-13 horas em ratinhos e 6-I0 horas em primatas- não humanos comparado com 5-10 minutos de semi-vida. de PAPe são eficazes na inibição da. produção de HIV—1 em concen trações não—tóxicas que são pelo menos 200 vezes inferiores à concentração de PAP eficaz.

tara provocar . ulas monócitos UP32 inibição da replicação do HIV

PAP-ant i-CD 14 em foi eficaz abaixo de 15Θ pM )

en quanto que foi necessário 3 IO”' pM de PAP não conjugado (Tabela 2). Para causar 50% de inibição da replicação_do HIV em células T CD4+ com o conjugado de PAP e anti-CD5, foi necessário uma concentração de 32 pM (Figura 7) ; com PAP ariti-CD7 (^rigura S)

ι .jí necessário '..tina con cen tração necessário uma. concentração de 1 ó pM e oom FAP-ar,ti-CD4 foi ρίΊ (Fig. 10 e Tabela 3). Pelo contrário, foi uma concentração de 5 000 pM de PAP não conjugado para inibir em 50% a replicação de HIV (ver Fig,

Tabela 3). Assim, com os conjugados de PAP-mAb é 25-5000 veces menos do que com PAP sózinbcj para, inibir a replicação do HIV (Figs. 3, 10 e Tabela 3). Por comparação, o conjugado de F^rAF'-mAb testemunha FAF-a.nti-CDÍ? que não reage com células T CD4 + uma vez que é específico de células B, não inibe a proliferação de células T CD4+, nem inibe a replicação de HIV em concentrações tão altas como 1 375 pM (Tabela 3, Fig.9). Estes resultados mostram que PAP pode ser selectivamente direcoionado para necessário nr

HIV em células

CD4+ po:

;njugaçáo de

PAP com o mAb reactivo com células CD4+. Os resultados apresentados nas Figs. 11 e 12 mostram que o conjugado de PAP-anti-Cd4 é também muito potente e de acção prolongada na. inibição da produção de HIV-1 em PBL de doentes infectados com HIV-1.

INIBIÇÃO DA PRODUÇÃO DE HlV-i EM CÉLULAS DE MONéCITOS HUMANOS TRATADOS COM PAP-ANTI-CD14 OU COM

PAP NÃO CONJUGADO

Células U937 Tratadas com

Conjugado PAP-«CD14

Cori can tração (pM) )

Número de

Cavidades HIV p24+

Incorporação em

Nenhum

14/16

4/16

0/S

0/8 in ho

Nen hum

Í'K >·; 10'!·: lõ^H ;;10⁵

4/8

4/8

3/8

3/8

1/8

Actividade Melhorê

1IV ds PAP apôs

Conjugação com mAb Centra CD5„ CD7 ou CD14 ] _Ά·=., ΓΠ4+ ‘ratadas

Anti-HIV

Concentração (pil)

Dose Inibidora An ti-Prol i ferativat Concentração (pM)

PA!

0Η(·ί

PAP CD5 a

PAP CD7

PttP CD4 a

PAP CD19 ,-/ •2C0 000 650 600

000

Dosa Inibidora, τη _?0 50 proliferação celular (incorporação de concentração necessária para inibir a H-TdR) das células T CD4+ para inibir etn 507, a replicação de HIV (produção cio antigénio p2'4) era células T CD4+ mais alta :onjuqado PAP ctCD19 testada ter sido de 1 3/5 ρ!Ί, a ID_C..-. deste conjugado testemunha não pode ser determinada. A IDc,_t._>( anti-proliferação de FAP também excede a dose roais alta testada <2xl0~ pM>. PAP.aCD19 não

CD4+- e foi esseolhido coroo testemunha neoativa

Claims (4)

1. iê - Processo para a preparação de uma composição antiviral, caracterizado por comi:ireentíer a combinação de: um conjugado de anticorpo monoclonal e proteína antiviral de erva-dos-cancros eficaz para inibir a replicação de vírus sem citotoxicidade detsctável, sendo referida anticorpo do referido conjugado reactivo com um antigénio presente na superfície de células de mamífero infectadas.
2. 2ã - Processei de acordo com a rei vindicação 1 caracterizado por o referido conjugado inibir a replicação de vírus em pelo menos 507. usando uma concentração do conjugado de anticorpo-proteína antiviral da erva-dos-cancros abaixo de aproximadamente 150pM.
3. 3â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido conjugado inibir subs-tancialmente a replicação ds todos os vírus numa concentração de conjugado que inibe a reclicsção celular em menos de 507.
4. 4â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido conjugado inibir a replicação do vírus em ) pelo menos 507. em níveis pelo menos 25 vezes inferiores aos níveis do referido conjugado necessários para inibir 507. da replicação celular., \ 52 - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por σ referido conjugado iinibir a replicação do vírus em pelo menos 507 em níveis pelo menos 25 vezes inferiores aos níveis de PAP não conjugado necessários para inibir a replicação do vírus em 507.

   — Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado per células infectadas cont vi rus serem c é 1 u. 1 a s T h lí m a π a. s.

   /a _ processo de acordo com a reivindicação irac tf ado por as referidas células T serem células T CD4 .

   Rfi

   Processo de acordo coma, reivindicação 6 caracterizado por o referido G3.7/CD7.

   anticorpo ser o anticorpo monoclonal

   - Processo de acordo com a reivindicação riazdo por a.s referidas células T incluírem células T caractein fec tadas o m li m r etr ο ν i rus

   10a - Processo de acordo com a. reivindicação 9 caracterizado por o referido retrovírus ser HIV ou HTLV,.

   iiê — Processo rizado por α referido TÍ01/CD5 ou 10.2/CD5.

   de acordo com a reivindicação 7 caracteanticorpo ser α anticorpo monoclonal rizado por

   Í2â - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracteo referido anticorpo ser α anticorpo monoclonal

   13ã - Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a referida composição inibir a replicação de HIV em pelo menos 5Θ7 numa concentração de conjugado anticorpo—proteína antiviral da erva-dos-cancros abaixo de aproximadamente 35 pM.

   1 ·4·2

   Processo para preparação de uma composição antiviral, caracteri

   Li Lj pU incluir na referida composição:

   um conjugado de anticorpo monoclonal & proteína antiviral de erva-dos-cancros eficaz para inibir a replicação de vírus em lífero infectadas com retrovírus, o referido anticé1u.1 as de mamí corpo do ρresente referido conjugado sendo reactivo com um antigénio na superfície de tais células de mamífero infectadas.

   151. - Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por as referidas células de mamífero serem células T nu.manas,

   161 - Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por as referidas células de mamífero serem monócitos humanos.

   171 - Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado per o referido antigénio de superfície celular ser CD14 e o referido anticorpo ser o anticorpo monoclonal contra. CD14.

   1 SI - Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por os referidos monócitos incluírem monócitos infectados com um vírus gue causa desregulação imunológica.

   191 - Processo de acordo com a reivindicação 18 caracj terizado por a. referida doença ser HIV.

   201 - Processo de acordo com a. reivindicação 1? caracterizado por o referido conjugado de anticorpo e proteína antiviral da erva-dcs-cancros liquidar eficazmente HIV sem inibir a replicação celular numa concentração inferior a cerca de 15Ôpl*l.

   211 - Processo de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por as referidas células T serem células T humanas CD4+.

   222 - Processo de aocroo c om a reivindiceçeo tericàdo por as referidas células ~ incluírem células com um retrovírus.

   c’. 1 <:V_. ·

   Íníectatías

   23â - Processo de acordo com a reivindicação ter· i sado p_{Qr σ} referido retrovíros ser HIV ou HTLV.

   x-.c carac242 - Processo de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por a referida composição inibir a replicação de HIV em pelo menos 50,' numa concentração do conjugado anticorpo -antiviral da erva-dos-cancros abaixo de de aproximadamente 35

   P^k1,

   252 - Método para ou de inibição da replicação do HIV em células de mamífero caracterizado por:

   tratamento de rr:::?Í5? com HIV o cc. j uç ad o de anticorpo e coibir a renlicação uma cultura celular incluindo células uma quantidade de uma composição de proteína antiviral da erva-dos-cancros do referido HIV.

   2cé - método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por compreender ainda o passo de:

   estimulação das referidas células com uma quantidade de um agente eficaz para induzir a prol if ereção celular e a replica— ção de HIV para o tratamento das referidas células com o referido corçuç&oo de anticorpo e nroteina antiviral ds erva-dos-cancros.

   2/2 - Método de acordo com a reivindicação 2m rcvor cor o referido aoente ser ênticorno contra CD3.

   carac te- rga — Método de &corõc co reivindicação 25 caracte· rizado por o referido anticorpo ser um anticorpo monoclonal contra CD14, CD7, CD5 ou C.D4 ou. unis mistura deles.

   29é - Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por a referida cultura celular ser monócitos de mamífero.

   30é - Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por a. referida cultura de células ser células T de mamífero .

   .cedo _Pf

   31ã — Método de acordo com a reivindicação 25 caracte—

   O C Oh j U.Cj ct\_·' uâ© inibir a replicaçâo do vírus HIV em icida.de detectável usando uma concen— conjugado anticorpo-proteína antiviral da erva-dosviral de erva—dos—cancros i _ ----- c-,·-*./ — ; x. 4p‘-‘ j. çj .Jrtx'= . >_j :r- Jty/r. 'ρρΙχΊΤ -i.

   tra.çêío ds

   ΓΙ A r n n. £ .3. r ?rdo com a reivindicação 20 caracteanficorpC' e proteína anti.viral oa erva-dos-cancros inibir substancialmente toda, a replicaçâo de HIV s a concentração c inferior a 15Θ nM.

   ido conjugada de proteína antiviral :-er

   33ã - Método de acordo oom a reivindicação 25 carac — rizado por o referido anticorpo ser o anticorpo monoclonal S3.7/CD7 ou um outro anticorpo cuja ligação seja substancialmente blooueada por B3.7/CD7 e ciue bloqueia a 1ioação de G3.7/CD7,, referido anticoroo se;

   o anticorpo monoclonal

   ;r po . 1q açSo

   j ·=χ ict J. i7i£ ?nte bloqueada per Ί01/225 ou 10.2/CDb e que bloqueia a ligaçãc : de T101/GD5 ou 1Õ.2/2D5.

   35â - Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por o referido anticorpo ser o anticorpo monoclonal S17-2/CD4 ou um outro anticorpo em que a ligação seja substancialmente bloqueada por G17-2 e que bloqueia a ligação de G17-2/CD4.

   3óé - Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por o referido anticorpo ser o anticorpo monoclonal· <r.AbF13 cu. um outro anticorpo em que a ligação é substancialmente bloqueada por mfibF13 e gue bloqueia a ligação de mAbF13.

   37ê - Método para o tratamento de um doente infectado com HIV, caracterizado por:

   admin is f iracão ao rpfpfirln pgHpnte d<= uma. qua.nt ’ dade terapeuticamente e 5fiCãZ □.£* UíTici íjU íTiéri IS C OíTtpQS Ϊ-Ç O&S dtc- Cõn J UÇSCÍÍjS

   de anticorpos monoclonais e proteína. antiviral da erva-dos-cancros, de preferência com um a dosagem de IC-ICO microgramas (para um paciente de 7Θ Kq).

   •-•ucc 1 Μ: btodo de acordo oom a reivindicação 37 caracte- ! “ λ Z ú-. ti C? p o r i n C 1 U i 1^: amda a. estimulação dos linfócitos do referido com uma c quantidade de um agente eficaz para induzir a prediferação celul· lar e replicação de HIV para o tratamento das ?‘'?fsridas célul as *—um a γ e ι er j.ua composiçao de con j uqado 0e enticorpo e prote: ί n a a n t i v i r a 1 d a. e r v a—d o s—c a n c r o s . 39 a - h-|d íf.odo de acorde com -a reivindicação 3S csracte- rizado por o refe»' “ido agente de proliferação celular e de repli- ceção do HIV ser ι .im anticorpo CD3.

   401 - Método de acordo com a reivindicação 37 caracterizado por ao referido doente ser administrada uma quantidade terapâuticamente eficaz do conjugado do anticorpo monoclonal mAb F 13/CD14-proteína antiviral da. erva-dos-cancros ou conjugado do anticorpo monoclonal G3..7/CD7—proteína antiviral da erva-dos-cancros ou do conjugado de mAb T101/CB5-PAP ou do conjugado de mAb G17-2 - proteína antiviral da erva-dos-cancros ou suas misturas.

   411 - Método para a inibição da replicação do HIV em células de mamífero caracterizado por:

   estimulação dos linfócitos periféricos do sangue de doentes infectados com HIV com uma quantidade de um agente eficaz para induzir a proliferação celular e replicação de HIV; e tratamento dos referidos. linfócitos periféricos do sangue oom uma quantidade de uma composição de conjugado de anticorpo e proteína. antiviral da erva-dos-cancros eficaz para inibir a replicação do referido HIV.

   421 - Método de acordo com a reivindicação 41 caracterizado por o referido agente de proliferação celular e de replicação do HIV ser um anticorpo contra CD3.

   431 - Método de acordo com a reivindicação 41 caracterizado por o referido agente de proliferação celular e de replicação do HIV ser fito-hemaqlutinina.

   do HIV ser

   43 442

   - Método de acordo com a reivindicação 42 rizado por o referido anticorpo contra CD3 ser 519—4/CIF