DE69026812T2 - Konjugate von "pokeweed" antiviralem protein und monoklonalen antikörpern - Google Patents

Konjugate von "pokeweed" antiviralem protein und monoklonalen antikörpern

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine antivirale Zusammensetzung, wie sie im Oberbegriff des Anspruches 1 definiert ist; sie bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zum Unterdrücken von HIV-Replikation in Säugetierzellen.
  • Das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) und die Infektion mit dem menschlichen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) stellen ein weltweites Problem für die öffentliche Gesundheit dar (A. Venkatesan, Science 241: 1481-1485 (1988)). Zur Zeit gibt es keine Heilung für AIDS und verfügbare Therapiearten, um die HIV-Produktion in vivo zu reduzieren, wie etwa der Gebrauch von AZT, verursachen toxische Nebenwirkungen.
  • HIV ist ein RNA-Retrovirus, ursprünglich bezeichnet als humaner T-lymphotrophischer Virus (HTLV)-III, lymphadenopathie-assoziierter Virus (LAV), oder als AIDS- assoziierter Retrovirus (ARV). Fauci, Science 239: 617-622 (1988). Der Virus teilt Eigenschaften mit anderen Mitgliedern der nicht-transformierenden und zytopathischen Lentivirus-Famihe der Retroviren. HIV wird als HIV-1 bezeichnet, um es von HIV-2 zu unterscheiden, welcher bei westafrikanischen Patienten isoliert wurde, die ein klinisches Syndrom aufwiesen, welches von HIV-induziertem AIDS ununterscheidbar ist. Die kritische Basis für die Immunopathogenese der HIV-Infektion ist die Verarmung der CD4&spplus; Helfer/Induktor-Teilmenge der T- Zellen, woraus sich eine profunde Immunsupression ergibt. Siehe Dahlgleish et al., Nature 312: 763-767 (1984); Fauci, Clin. Res. 32: 491-496 (1985), Ho et al. N. Engl. J. Med. 317: 278-281 (1987). HIV besitzt einen selektiven Tropismus für CD4&spplus; T-Zellen und Makrophagen und das CD4-Antigen ist ein wesentlicher Bestandteil des Zelloberflächenrezeptors für HIV-1, HIV-2 sowie für SIV. Lasky et al., Science 233: 209-212 (1986); Lasky et al., Cell 50: 977-985 (1987).
  • Nachdem sich HIV an das CD4-Molekül über das externe Hüllen-Glykoprotein gp 120 bindet, wird der Virus aufgenommen und freigesetzt. Fauci, Science 239: 617-622 (1988); Stein et al. Cell 49: 659-669 (1987). Einmal aufgenommen, wird die genomische RNA durch das Enzym Reverse-Transkriptase in DNA transkribiert. Die provirale DNA wird dann in die chromosomale Wirts-DNA integriert. Nach der Integration des Provirus kann die Infektion in eine latente Phase treten oder es kann die provirale DNA virale genomische RNA und Messenger-RNA transkribieren. Proteinsynthese, Processing und Viruszusammenbau treten zusammen mit der Ausschleusung des reifen Virus aus der Zelloberfläche auf. Zur Zeit existiert keine Heilung für AIDS, und AZT, das einzige zugelassene antivirale Medikament, um die HIV-Produktion in vivo zu reduzieren, kann größere toxische Nebenwirkungen verursachen und kann die Entstehung von AZT-resistenten Mutanten zur Folge haben. Langzeitbehandlung von HIV-Infektionen dürfte vielerlei Medikamente benötigen, die nacheinander oder in Kombination gegeben werden, ähnlich der kombinierten Chemotherapie, die für viele Krebsarten benötigt wird.
  • Konjugate von Antikörpern, welche aus hybritisierten oder konjugierten, monoklonalen Antikörpern gebildet sind und Toxin wurden dazu verwendet, spezifische Populationen von Zielzellen zu vernichten, durch Einschleusen und Zerstören "unerwünschter" Zielzellen, welche die Zieloberflächenantigene tragen. Siehe z.B. Jansen et al., Immunol. Rev., 62:185 (1982), Leonard et al., Cancer Research 45: 5263 (1985); Uckun, Journal of Experimental Medicine, 163, 347- 368 (1986), Uckun et al., Cancer Research, 45, 69-75 (1985); Ramakrishnan et al., Journal of Immunology, 135, 3516-3522 (1985). Die Vielzahl der Toxine, die durch verschiedene Forscher verwendet wurden, kann grob in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe besteht aus intakten Toxinen, wie etwa intaktes Rizin. Siehe z.B. Leonard et al., a.a.O. Diese Toxine können aufgrund ihrer letalen Toxizität in vivo nicht sicher angewendet werden. Die zweite Gruppe der Toxine wird als Hemitoxine bezeichnet. Hemitoxine sind einsträngige Ribosom-inaktivierende Proteine, welche katalytisch auf eukaryotische Ribosomen einwirken und die 60-S-Untereinheit inaktivieren, was eine dosisabhängige Hemmung der zellulären Proteinsynthese im Stadium der Peptid-Elongation zur Folge hat. Siehe Barbieri & Stirpe, Cancer Surveys, 1: 489 (1982).
  • Ein Hemotoxin von Interesse ist das antivirale Pokeweed-Protein (PAP), welches aus den sprießenden Blättern der Spätsommerblätter und aus dem Samen von Phytolacca Americana isoliert wird. Die antivirale Aktivität von PAP ist seit vielen Jahren bekannt. Siehe Aron & Irvin, Antimicrob. Agents Chemother. 17: 1032 (1980); Barbien et al., a. a. O. Es wurde gezeigt, daß PAP die Transmission von RNA-enthaltenen Viren, wie etwa dem Tabakmosaikvirus (Irvin, Arch. Biochem. Biophys 200: 418 (1980)) und dem Gurkenmosaikvirus (Tomlison et al., J. Gen. Virol.,22: 225 (1974)) in Pflanzen blockiert. Es ist ebenfalls bekannt, daß PAP die Replikation von tierischen Viren hemmt, welche zwei RNA enthalten: Poliovirus (Ussery et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 284; 431-440 (1977)) und Influenza- Virus (Tomlinson et al., a. a. O.). Es ist ebenfalls bekannt, daß PAP die Vermehrung des Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (Aron, a. a. O.) und Typ II (United States Patent No. 4,672,053 für Obrig.) hemmt. Obwohl bekannt ist, daß PAP- Konjugate von monoklonalen G3.7/CD7, F1 3/CD14 und B43/CD19-Antikörpern die Replikation von HIV-1 hemmen, sind diese Konjugate in ihrer Fähigkeit die Virusreplikation zu hemmen inkonsistent (Uckun et al., Mtg. Human Retrov., 18th Ann. Mtg. UCLA Symp. Molec. Cell. Biol., Feb. 4-11, 1989, J. Cell Biochem. Suppl. O (13 Teil B) (1989)).
  • Chemische Mittel wurden dazu verwendet, die Mitose in peripheren, menschlichen T-Lymphozyten zu stimulieren. Derartige mitogene Mittel schließen Natriumperiodate, Phorbol-Myristin-Azetate und Galaktose-Oxidase ein. Es wird davon ausgegangen, daß T-Zellen-Phytomitogene die Lymphozyten-Mitose auslösen, indem sie an spezifische Stellen auf der Lymphozyten-Membran binden. Es wurde ebenfalls beschrieben, daß OKT3, ein Antikörper gegen menschliche T-Zellen, welcher an ungelöste T-Zell-Oberflächendeterminanten bindet, mitogen für menschliche, periphere, einkernige Zellen ist (van Wauwe et al., J. Immunol. 124: 2708-2713 (1980)).
  • Antikörper-Konjugate, welche Hemitoxin enthalten, weisen hochspezifische, ortsgerichtete Zytotoxizität auf, resultierend aus der Tatsache, daß sie Zielzellen nur über den spezifischen, monoklonalen Antikörperteil des Konjugats binden. Antikörper-Konjugate, welche PAP enthalten, wurden studiert und es wurde gezeigt, daß sie bei ausreichend hohen Konzentrationen durch Hemmung der Proteinsynthese zytotoxisch für bösartige Zellen sind. Die kovalente Bindung von PAP an ein Immunglobulin, welche in der Lage ist, selektiv an ein für die zu tötende Zelle spezifisches Antigen zu binden, wurde in dem US-Patent 4,363,758 von Masuho beschrieben. Die Bindung von PAP an ein gegen virusinfizierte Zellen gerichteten monoklonalen Antikörper, um die virale Replikation ohne Zytotoxizität zu hemmen, wurde jedoch zuvor nicht beschrieben oder diskutiert. Tatsächlich können stabile Konzentrationen von PAP antivirale Aktivität in vivo nicht erreicht werden, da: 1) sie würden toxisch sein; und 2) die Halbwertszeit von PAP in vivo beträgt etwa 5 bis 10 Minuten.
  • Es ist das Ziel der Erfindung, Antikörper-Konjugate zur Verfügung zu stellen, welche aus mit antiviralem Pokeweed-Protein, welches PAP derart ins Ziel führen kann, daß es die Virusreplikation in infizierten Zellen verhindert, ohne den Tot von nichtinfizierten Zellen zu verursachen, konjugierten monoklonalen Antikörpern gebildet sind.
  • Dieses Ziel wird erreicht durch eine antivirale Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 und durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 7. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf antivirale Antikörper-Konjugate, welche aus einem monoklonalen CD4 oder CD5-Antigen-Antikörper und aus von Phytolacca Americana isoliertem, antiviralem Pokeweed-Protein (PAP) gebildet sind. Die vorliegende Erfindung liefert antivirale, monoklonale Antikörper-PAP- Zusammensetzungen, welche für die Unterdrückung von intrazellulärer Virusreplikation, verbunden mit Krankheiten, wie etwa HIV-induziertem AIDS oder durch Retroviren induzierten T-Zellen-Leukämien, nützlich sind. Die vorliegende Erfindung verwendet monoklonale Antikörper oder Fragmente derselben, die mit einem an der Oberfläche der virusinfizierten Säugetierzellen vorhandenen Antigen reaktionsfähig sind. Die monoklonalen Antikörper-Konjugate der vorliegenden Erfindung behalten die Fähigkeit von nicht-konjugiertem PAP bei, die zelluläre Proteinsynthese zu hemmen.
  • Wir haben herausgefunden, daß monoklonale Antikörper-PAP-Konjugate effektiv die Virusreplikation ohne feststellbare Zytotoxizität unterdrücken. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können, im Falle von HIV, monoklonale Antikörper-PAP-Konjugate in Mengen kleiner als etwa 35 Pikomol (pM) die HIV- Replikation um mindestens 50% ohne feststellbare Zytotoxizität hemmen.
  • Monoklonale Antikörper-PAP-Konjugate der vorliegenden Erfindung hemmen die HIV-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen und Monozyten um mindestens 50%, bei Dosen, die etwa 25mal niedriger sind als die Dosen, die bei PAP benötigt werden, um die virale Replikation um 50%, zu hemmen. Vorzugsweise hemmen monoklonale Antikörper-PAP-Konjugate der vorliegenden Erfindung die HIV- Replikation in CD4&spplus;Zellen und Monozyten um etwa 50%, bei Dosen, die etwa 100mal niedriger sind als die im Falle des nicht-konjugierten PAP benötigten (und besonders bevorzugt 200mal niedriger als die im Falle des nicht-konjugierten PAP benötigten). In einer Ausführungsform der Erfindung beseitigt ein PAP- Konjugat eines monoklonalen Antikörpers des Monozytenzelloberflächenantigens CD14 effektiv die HIV-Produktion in menschlichen Monozyten bei einer Konzentration von weniger als etwa 150 pM.
  • Die Antikörper-PAP-Konjugate der vorliegenden Erfindung sind PAP-Konjugate eines monoklonalen Antikörpers des P-Zelloberflächenantigens CD4 und eines monoklonalen Antikörpers des T-Zellenoberflächenantigens CD5. Die HIV- Replikation im menschlichen CD4&spplus;T-Zellen kann ebenfalls um mindestens 50% unterdrückt werden durch Verwendung von PAP-Konjugaten von monoklonalen Antikörpern von CD4 oder CD5-T-Zellantigenen bei Konzentrationen unterhalb von etwa 35pm, ohne daß die Zellreplikation unterdrückt wird. Darüber hinaus kann die Produktion von HIV-1 in aktivierten CD4&spplus;T-Zellen von HIV-1-infizierten Patienten um mindestens 50% unterdrückt werden, durch Verwendung von PAP, konjugiert zu einem monoklonalen Antikörper von CD4, bei Konzentrationen unterhalb von etwa 10 pM, ohne die Proliferation von CD4&spplus;T-Zellen zu unterdrücken.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Inaktivierung oder Unterdrückung der HIV-Replikation in Säugetierzellen zur Verfügung, welches die Behandlung einer Zellkultur, welche HIV-infizierte Zellen einschließt, mit einer Zusammensetzung eines monoklonalen Antikörpers und eines PAP-Konjugates beinhaltet. Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die HIV-Replikation effektiv um mindestens 50% gehemmt werden, ohne die Zellreplikation zu hemmen. Weiterhin sind die PAP-monoklonalen Antikörper- Konjugate der vorliegenden Erfindung bei Konzentrationen von 5 bis 15 nM, welche wesentlich höher sind, als die zur Unterdrückung der HIV-Replikation um 50%, nicht-toxisch für normale Knochenmarks-Vorläuferzellen CFU-GM (myeloide Vorläuferzellen = Kolonie, die eine Granulozyten-Makrophageneinheit bildet), BFU-E (erythroide Vorläuferzelle = Ausbruch, der eine Erythroideneinheit bildet) oder CFU-GEMM (pluripotente Vorläuferzelle = Kolonie, die eine Granulozyten-Erythroiden-Makrophagen-Megakaryozyten-Einheit bildet). PAP-monoklonale Antikörper-Konjugate der vorliegenden Erfindung können die Virus-Replikation um mindestens 50%, bei um mindestens 25mal geringeren Dosen, und vorzugsweise um 50%, bei um mindestens 100mal geringeren Dosen, unterbinden, als die Dosen des Konjugats, die benötigt werden, um die Zellreplikation um 50% zu unterdrücken. Weiterhin können PAP-monoklonale Antikörper-Konjugate bei einer Konzentration des Konjugats, die die Zellreplikation um weniger als 50% unterdrückt, im wesentlichen die gesamte Virusreplikation unterbinden.
  • Es wird erwartet, daß monoklonale Antikörper-PAP-Konjugate die Basis für eine hocheffektive Prozedur zur Unterdrückung von HIV-Replikation in Säugetiermonozyten und T-Zellen liefern werden; somit ein Verfahren liefern, zur Behandlung von Patienten mit AIDS oder Patienten, die HIV-1-infiziert sind und bisher kein AIDS entwickelt haben. Es wird weiterhin erwartet, daß monoklonale Antikörper-PAP-Konjugate die Basis liefern, für ein effektives Verfahren zum Unterdrücken von anderen Retroviren (HTLV-1 etc) und von anderen Viren, wie etwa, aber nicht auf diese beschränkt, Mitgliedern der Herpes-Virusgruppe (HSV, CMV, EBV), Influenzaviren, Rhinoviren, Papovaviren (menschliches Papillom), Adenoviren, Hepatitisviren etc.
  • Fig. 1 stellt die Prozedur der PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugation dar;
  • Fig. 2 stellt dar, wie das PAP-monoklonale Antikörper-Konjugat gereinigt wird;
  • Fig. 3A und 38 zeigen zwei repräsentative Beispiele für HPLC-Profile von: (a) PAP- mAb-Konjugaten und (b) gereinigten PAP-mAb-Konjugaten;
  • Fig. 4 und 5 zeigen die SDS-PAGE-Analyse von monoklonalen Antikörpern und PAP-mAb-Konjugaten. SDS-PAGE von CD14-Antigen ausgerichteten F13 mAb und F13-PAP-Konjugat (vor und nach Reinigung), von CD7 Antigen ausgerichteten G3.7-mAb und G3.7-PAP mAb- Konjugat (vor und nach Reinigung), von CD5 Antigen ausgerichteten T101 mAb und T101-PAP-Konjugat (nach Reinigung) und von CD4 Antigen ausgerichteten G 17-2 mAb und G 17-2 mAb-Konjugat (nach Reinigung) auf einem 5%igen SDS-Gel. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt und es sind die Positionen der Marker für das molekulare Gewicht auf der linken Seite angedeutet;
  • Fig. 6 zeigt den Effekt von nicht-konjugiertem PAP auf die HIV-Replikation (p24-Produktion) in menschlichen CD4&spplus;T-Zellen und die Proliferation dieser Zellen (³H-TdR-Inkorporation);
  • Fig. 7 zeigt den Effekt von PAP-Anti-CD5 (T101)-Konjugat auf die HIV- Replikation (p24-Produktion) in menschlichen CD4&spplus;T-Zellen und die Proliferation dieser Zellen (³H-TdR-Inkorporation);
  • Fig. 8 zeigt den Effekt von PAP-Anti-CD7 (G3.7)-Konjugat auf die HIV- Replikation (p24-Produktion) in menschlichen CD4&spplus;T-Zellen und die Proliferation dieser Zellen (³H-TdR-Inkorporation);
  • Fig. 9 zeigt den Effekt von PAP-Anti-CD19 (B43) auf die HIV-Replikation (p24-Produktion) in menschlichen CD4&spplus;T-Zellen, die nicht mit Anti-CD19 reagieren;
  • Fig. 10 zeigt den Effekt von PAP-Anti-CD4 (G17-2)-Konjugat auf die HIV- Replikation (p24-Produktion) in menschlichen CD4&spplus;T-Zellen und die Proliferation dieser Zellen (³H-TdR-Inkorporation);
  • Fig. 11A und 11B zeigen den Effekt von PAP-Anti-CD4 (G17-2)-Kojugat auf die HIV-Replikation (p24-Produktion) zweier HIV-1-infizierter Patienten in deren peripheren Blutlymphozyten (PBL), die mit mAb auf CD3 aktiviert wurden, um die HIV-1-Produktion zu induzieren, und die Effekte von PAP-Anti-CD4 auf die Proliferation dieser Zellen (³H- TdR-Inkorporation);
  • Fig. 12A und 12B zeigen den Effekt einer kontinuierlichen 22-Tage-Behandlung und einer 5-Tage-Behandlung mit PAP-Anti-CD4 auf die HIV-1-Produktion (p24-Produktion) für 22 Tage in PBL von zwei HIV-1-infizierten Patienten nach Stimulierung der PBL mit mAb auf CD3, um die HIV-1-Produktion zu induzieren;
  • Fig. 13 zeigt einen zusammengesetzten Graph der Anti-HIV-Aktivität in CD4&spplus;Zellen von PAP, PAP-Anti-CD5 und PAP-Anti-CD7; und Fig. 14 zeigt, daß (a) die PAP-mAb-Konjugate bei viel höheren Konzentration, als die, die die HIV-1-Replikation hemmen, zytotoxisch sind und (b) sie bis zu Konzentrationen von 5 x 10³ pM nicht toxisch für normale Knochenmark-Stammzellen (CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM) sind.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf PAP-mAb-Konjugate, die nützlich sind für die Unterdrückung intrazellulärer Replikation von Säugetierviren einschließlich, in einer bevorzugten Ausführungsform, Retroviren, wie etwa HTLV-1, HTLV-11, SIV, HIV-1 und HIV-2 o.dgl. in Säugetierzellen. Die PAP-mAb-Konjugate der vorliegenden Erfindung sind höchst spezifisch darauf ausgerichtet, die HIV-Replikation in menschlichen Monozyten und T-Zellen zu unterbinden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt antivirale Antikörper-Konjugate zur Verfügung, die in der Lage sind, die Virusreplikation in Säugetierzellen ohne meßbare Zytotoxizität zu unterbinden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich die meßbare Zytotoxizität auf die Stärke der Zellwachstumshemmung, meßbar oder beobachtbar durch ³H-Leucin-Inkorporationstest, clonogenische Tests oder durch ³H-Thymidin (H-TdR)-Inkorporation. Wie hierin beschrieben, beziehen sich antivirale Antikörper-Konjugate im allgemeinen auf monoklonale Antikörper (mAb) und antivirale Protein-Konjugate, in denen der Antikörper kovalent gebunden oder mit dem antiviralen Protein quervernetzt ist. Genauer gesagt schließen die Antikörper-Konjugate der vorliegenden Erfindung monoklonale Antikörper oder Antigen-Bindungsfragmente derselben ein, welche mit oberflächenaktiven Antigenen auf Zielzellen reaktionsfähig sind. Der monoklonale Antikörper oder sein Antigenbindungsfragment ist kovalent gebunden mit dem antiviralen Pokeweed-Protein (PAP); einem gereinigten Protein, extrahiert von Phytolacca Americana, welches in der Lage ist, die Proteinsynthese zu hemmen.
  • Durch die Verwendung der PAP-mAb-Konjugate der vorliegenden Erfindung kann mindestens 50% der Virus-Replikation gehemmt werden, ohne daß die Zellreplikation gehemmt wird. PAP-mAb-Konjugate der vorliegenden Erfindung können die Virusreplikation um mindestens 50% unter Verwendung von PAP- mAb-Konjugat in Konzentrationen unterhalb von etwa 150 pM ohne Hemmung der Zellreplikation unterdrücken. Wir haben etwa 50% Hemmung der HIV- Replikation in menschlichen CD4&spplus;T-Zellen ohne Hemmung der Zellreplikation bei Konzentrationen weniger als 35 pM, unter Verwendung von PAP konjugiert mit mAb gegen CD5 oder CD4, beobachtet. Bei einer Ausführungsform wird etwa 200mal mehr nicht-konjugiertes PAP benötigt, um eine 50%ige Hemmung der HIV-Replikation zu verursachen.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das PAP-mAb-Konjugat reaktionsfähig mit einem Antigen an oder auf der Oberfläche von Säugetierzellen, wie etwa Monozyten, menschlichen T-Zellen, Epithel-Zellen, Gehirn-Zellen o.dgl. Wie hierin beschrieben, bezieht sich "Oberflächenantigen" von virusinfizierten Zellen auf Antigene, welche mit virusinfizierten Zellen assoziiert sind, welche z.B. normale Differenzierungsantigene auf solchen Zellen darstellen, welche unabhängig von der Virusinfektion exprimiert werden, sowie Antigene, welche nur dann exprimiert oder von Zellen assoziiert werden, wenn derartige Zellen mit einem speziellen Virus infiziert werden.
    • PAP-Quelle und -Reinigung
  • PAP ist ein von Phytolacca Americana erhaltenes Protein, welches in der Lage ist, die Proteinsynthese zu hemmen. Das Protein weist ein Molekulargewicht von etwa 30.000 auf und enthält eine einzelne Polypeptid-Kett. PAP kann aus Phytolacca Americana extrahiert werden und gemäß einem öffentlich bekannten Verfahren gereinigt werden, wie etwa nach dem von J.D. Irvin, Pharmac. Ther.
  • 21: 371-387 (1983) und Uckun, ANTIBODY, 1, 247-262 (1988) beschriebenen Verfahren; PAP weist eine starke Aktivität auf, die Synthese von Polyphenylalanin unter Verwendung von Ribosomen von Retikulozyten zu hemmen. PAP kann nicht nur aus den Blättern von Phytolacca Americana gewonnen werden, sondern auch aus deren Samen.
    • Monoklonale Antikörper
  • Die allgemeinen Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern basieren auf der Fusion von Milzlymphozyten mit bösartigen Zellen (Myelomen) von Knochenmarksmuttergeschwulsten (C. Milstein, Sci. Am., 243, 66 (1980)). Die Verfahren ergeben eine Hybrid-Zell-Linie, ausgehend von einem einzigen fusionierten Zellhybrid oder Klon, welcher sowohl Eigenschaften der Lymphozyten als auch der bösartigen Zell-Linien aufweist. Ebenso wie die Lymphozyten (genommen von Tieren, die mit, als Antigene, roten Blutkörperchen von Schafen geimpft wurden) sind die fusionierten Hybride oder die Hybridom-Sekretantikörper (Immunglobuline) reaktionsfähig mit dem Antigen. Weiterhin sind die bösartigen Zell-Linien, ebenso wie die Hybrid-Zell-Linien, unsterblich. Während Antiseren, die von geimpften Tieren erhalten wurden, variable Mischungen von Antikörpern sind, welche nicht identisch reproduziert werden können, ist insbesondere der eine von einem Hybridom abgeschiedene Immunglobulin-Typ spezifisch für eine und nur eine antigenische Determinante auf dem Antigen, einem komplexen Molekül mit einer Vielfalt von antigenischen molekularen Substrukturen oder Determinanten (Epitopen). Wenn das Antigen ein Protein ist, kann z.B. eine antigenische Determinante eine von vielen Peptid-Sequenzen innerhalb des gesamten Proteinmoleküls sein. Es können daher gegen ein einziges Antigen entwickelte monoklonale Antikörper voneinander unterschieden werden, abhängig von der Determinante, welche ihre Formation induziert hat. Es sind jedoch alle von einem gegebenen Clon produzierte Antikörper identisch. Darüber hinaus können bevorzugte Hybridom-Zell-Linien unbegrenzt reproduziert, leicht in vitro oder in vivo propagiert werden und monoklonale Antikörper in extrem hohen Konzentration ergeben. Die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßten, monoklonalen Antikörper können ihren Ursprung in der Maus haben, können menschliche Antikörper sein oder chimerische Antikörper "halb Maus" und "halb Mensch".
  • Die vorliegende Erfindung verwendet, wie oben angedeutet, monoklonale Antikörper, welche mit einem an einer Oberfläche einer virusinfizierten Säugetierzelle, wie etwa Monozyten oder menschliche T-Zellen, Epithelzellen und dergleichen, vorhandenen Antigen reaktionsfähig sind. Nützliche, monoklonale Antikörper werden unter Verwendung von wohlbekannten Hybridom-Fusionstechniken hergestellt (G. Kohler und C. Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976); M. Shulman et al., Nature, 276: 269 (1978)). Monoklonale Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind solche, die gerichtet sind gegen primate Zelloberflächenantigene, nämlich CD4 und CD5, von denen insbesondere G17-2/CD4, T101/CD5, 10.2/CD5 und G19-4/CD3 bevorzugt sind. Beispielhafte Antikörper - welche für vergleichende Zwecke teilweise beschrieben sind - schließen mAb F13 gegen CD14; G3.7 gegen CD7; T101 gegen CD5; und mAb G17-2 gegen CD4 ein. Alle Antikörper sind beschrieben in Ledbetter et al., Molecular Immunology, 26. 137-145 (1989); Uckun et al., J. of Immunology, 140. 2103-2111 (1988); Blood, 66: 627-635 (1985); Ledbetter et al., Molecular Immunology, 24: 1255-1267 (1987); siehe auch die unter I der Beispiele angegebenen Literaturstellen.
    • Präparation und Eigenschaften von Immunotoxinen (a) Spezifitätstest
  • Die Bindungsreaktivität von F13, G3.7, T101 und G17-2 und von anderen monoklonalen Antikörpern, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, kann durch den indirekten Immunfluoreszenztest ermittelt werden. In diesem Test werden die zu testenden Zellen in einer Suspension oder auf einem Objektträger mit einem Überschuß von mAb kontaktiert. Nach einer angemessenen Inkubationszeit werden die Zellen gewaschen, um sie von ungebundenem mAb zu befreien, und es werden die gebundenen Antikörper mit einem Antimaus-Antikörper, gebunden an ein fluoreszenten Marker, wie etwa Resorcinol- Phthalein-Isothiocyanat (FITC) detektiert.
  • Die Bindung des monoklonalen Antikörper-PAP-Konjugats an T-Zellen und Monozyten kann bestimmt werden durch einen "double Sandwich"-Typ eines Immunfluoreszenz-Tests, in dem die zu testenden Zellen sequentiell inkubiert werden mit (a) dem PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugat, (b) einem Antiserum zum antiviralen Pokeweed-Protein und (c) einem fluoreszentrnarkierten Antikörper zum Antiserum. Die markierten Zellen können durch zytofluormetrische Techniken unter Verwendung von angemessenen Hintergrundsubstraktionstechniken analysiert werden.
    • (b) Bestimmung der Zytotoxizität von PAP-monoklonalem Antikörper-Konjugat
  • Zellen können mit dem monoklonalen Antikörper-PAP-Konjugat kontaktiert werden durch Suspendieren der Zellen in einem angemessenen, physiologischen Medium und Hinzufügen des Antikörper-PAP-Konjugates zu der gewünschten Konzentration. Nach der Antikörper-PAP-Konjugat-Behandlung kann das Überleben der Zellen gemessen werden durch: (a) Tests auf Proteinsynthesehemmung; (b) Trypanblau-Lebensfähigkeitstests; (c) klonogenische Tests durch Begrenzen der Verdünnung, wie beschrieben durch Uckun et al., Cancer Res., 45: 69-75 (1985); Uckun et al., Autologous Bone Marrow Transplant. Proc. First Intl. Symp., 449-453 (1985); Uckun et al., J. of Immunol. 134: 2010-2016 (1985); und (d) ³H-Thymidin-Inkorporation, um die zelluläre DNA-Synthese zu messen. Es kann ebenfalls der Effekt auf das Überleben der Zellen gemessen werden, durch Suspendieren der Zellen in Alpha-MEM oder RPMI 11640-Medium (Grand Ble. NY), welches ergänzt werden kann mit Phytohämagglutinin-stimuliertem, Lymphozyten-konditioniertem Medium (PHA-LCM) oder durch PHA mit oder ohne Interleukin-2. Proben der Zell-Suspension werden dann für zwei Wochen gezüchtet und jegliche lebensfähige Zellen werden mittels Mikroskopie unter Verwendung des Trypanblau-Farbstoffausschließungstests, beschrieben in Uckun et al., J. of Immunol., 134: 2010-2016, (1985), detektiert oder die Zellen werden zur Messung der Zell-Replikation mit H-Thymidin markiert.
    • (c) Bestimmung der Wirkung von PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugaten auf die Virus-Replikation
  • Nicht-infizierte Zellen, wie etwa Monozyten und frische CD4&spplus;T-Zellen werden mit monoklonalen Antikörper-PAP-Konjugaten behandelt. Proben der behandelten Zellen werden dann HIV ausgesetzt. Nach etwa 2 Stunden Absorption des Virus wird der zellfreie Virus entfernt und neues, monoklonales Antikörper-PAP- Konjugat enthaltenes Medium hinzugefügt. Proben der Zell-Suspension werden für fünf bis acht Tage gezüchtet und zu diesem Zeitpunkt dann der Überstand entfernt und auf das Vorhandensein von HIV-p24-Aktivität in Antigenfang- ELISA-Tests getestet. Alternativ werden PBL von HIV-1-infizierten Patienten mit monoklonalen Antikörper-PAP-Konjugaten behandelt und mit einem Mittel aktiviert, welches effektiv ist, die Zell-Proliferation und die HIV-Replikation zu induzieren, wie etwa ein monoklonaler Antikörper für CD3 oder ein Mitogen, wie etwa Phytohämagglutinin o.dgl. Die Menge des Mittels, welches benötigt wird, um die HIV-Replikation zu aktivieren, wird von etwa 0.1 bis 1.0 µg/ml, abhängig vom Typ des Mittels, variieren. Im Falle von mAb auf CD3 wird etwa 0.5 bis 2. µg/ml benötigt. Hierin beschrieben wurde mAb auf CD3 (G1 9-4) verwendet, um die Zellen zur Replikation und Produktion von HIV-1 zu aktivieren. Proben der Zell-Suspension wurden für fünf Tage bis einige Wochen gezüchtet und anschließend wurde der Überstand entfernt und auf das Vorhandensein von HIV p24-Aktivität in Antigenfang-ELISA-Tests getestet.
    • Therapeutische Verwendung
  • Die Patientenbehandlung mittels der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bringt die Verabreichung von therapeutischen Mengen der Zusammensetzung des monoklonalen Antikörpers und des PAP-Konjugates mit sich. Im Kontext der vorliegenden Erfindung beziehen sich die Ausdrücke "Behandlung" und "Therapie" o.dgl. auf die Prophylaxe oder die Abschwächung einer vorhandenen Krankheit. Die Antikörper-PAP-Zusammensetzung kann mittels konventionellen, pharmazeutisch akzeptablen, parenteralen Vehikeln zur Verabreichung mittels Injektion formuliert sein. Diese Vehikel enthalten Substanzen, welche im wesentlichen nicht-toxisch und nicht-therapeutisch sind, wie etwa Wasser, Salzlösung, Ringer's Lösung, Dextroselösung, Hank's Lösung o.dgl. Es ist verständlich, daß Formulierungen von Antikörper-PAP-Konjugaten ebenfalls kleine Mengen von Zusatzstoffen, wie etwa Puffer und Konservierungsmitteln enthalten können, um die Isotonie, die physiologische Stabilität und die pH- Stabilität zu erhalten. Vorzugsweise wird Antikörper-PAP-Konjugat in gereinigter Form formuliert, d.h. im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen, bei Konzentrationen zwischen etwa 0.1 bis etwa 10 mg/ml.
  • Wie durch die obige Formulierung angedeutet, können die PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugate parenteral verabreicht werden. Im Falle einiger Viruskrankheiten können PAP-monoklonale Antikörper-Konjugate topisch, intravenös oder in Aerosolform zugeführt oder verabreicht werden. Wenn PAP-monoklonale Anitkörper-Konjugate intravenös verabreicht werden, können sie als Bolus oder auf kontinuierlicher Basis zugeführt werden.
  • Die Dosis der zu verabreichenden Formulierung des Antikörper-PAP-Konjugats wird von dem Patienten und der medizinischen Vorgeschichte des Patienten abhängen. Die Dosis sollte jedoch ausreichend sein, einen wesentlichen Teil, üblicherweise mehr als etwa 90%, der Virus-Replikation in den infizierten Zellen des Patienten zu hemmen. Z.B.: PAP-Anti-CD7 oder PAP-Anti-CD4 würde die HIV-Replikation um mehr als 90% hemmen, wenn es in einen Bereich von 10 bis 100 pM verwendet werden würde, welcher 2.0-20 ng/ml entspricht. Die zum Erreichen dieser Konzentration benötigte Dosis kann mit der Formel: Dosis in Mikrogramm = 70 x 2(20) x wt (in kg)/1.000 berechnet werden. Für einen 70 kg-Patienten würde dies 10-100 mg ergeben. Bemerkenswert ist, daß diese Dosen 50-500mal kleiner sind, als jene, die von nicht-menschlichen Primaten ohne meßbare Toxizität toleriert werden. Die von der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßten und als therapeutisch effektiv betrachteten Dosen für erwachsene Menschen mit HIV-Infektion werden daher zwischen etwa 10 und 100 mg liegen und werden mit einer Frequenz verabreicht, die auf der Plasma-Halbwertszeit von PAP-rnab-Konjugaten in einem gegebenen Patienten liegt, wie sie durch Festphasen-ELISA bestimmt wurde. Die Dosen können ohne weiteres unter Verwendung der obigen Formel angepaßt werden, um angemessene Mengen des Antikörper-PAP-Konjugats für Kinder zur Verfügung zu stellen.
  • Die Erfindung wird weiter beschrieben mit Bezug auf die folgenden detaillierten Beispiele, in denen die Antikörper, die sich nicht auf die Ansprüche beziehen (wie etwa F1 3-PAP, G3.7-PAP oder CD7-, CD14- oder CD19-Konjugate), vergleichenden Zwecken dienen.
    • BEISPIELE 1. Monoklonale Antikörper
  • Die folgenden monoklonalen Antikörper wurden in Konjugaten mit PAP verwendet.
  • Der monoklonale Antikörper F-13, beschrieben in Andrews et al. "Leucocyte Typing: Human Leucocyte Differentiation Antigens Detected by Monoclonal Antibodies, Vuseiten 398-404 (herausgegeben durch A. Bernard et al. 1984).
  • Der monoklonale Antikörper G3.7, beschrieben in Uckun et al, J. of Immunology, 140. 2103-2111(1985) und Uckun et al, J. of Immunology, 135,3516-3522 (1985) und hinterlegt mit ATCC am 20. Juli 1989 unter ATCC Nr. HB10182. Der monoklonale Antikörper T101, beschrieben in Royston et al., Transpl. Proc. 13, 761-766 (1981); Uckun et al., Blood. 69.361-366 (1987).
  • Der monoklonale Antikörper B43, beschrieben in Uckun et al., Immunology, 134, 2010-2016 (1985) (ATCC Nr. HB8903).
  • Der monoklonale Antikörper G1 7-2, beschrieben in Ledbetter et al., Molecular Immunology, 24. 1255-1261 (1987) und hinterlegt mit ATCC am 29. März 1990 unter ATTC Nr. HB10402.
    • II. Synthese von PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugaten
  • Das antivirale Pokeweed-Protein (PAP) ist ein einsträngiges Polypeptid-Toxin (Molekulargewicht 30.000), welches katalytisch die 605-Untereinheit der eukaryotischen Ribosomen inaktiviert und welches von den sprießenden Blättern von Pokeweed (Phytolacca Americana), wie beschrieben von L.L. Houston et al., in J. Biol. Chem., 25 9601 (1983) isoliert werden kann. PAP wird, wie von Irvin, Pharmac. Ther. 21: 371-383 (1983); Uckun ANTIBODY, 1, 247-262 (1988), dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird; Uckun, J. of Immunology, 134, 2010-2016 (1985), beschrieben, gereinigt.
  • Die Präparation von PAP-mAb-Konjugaten ist in Fig. 1 gezeigt. Monoklonale Antikörper F13 (IgG&sub1;, anti-CD14), G3.7 (IgG&sub1;, pan-T, anti-p41 CD7), T101 (IgG&sub2;a, pan-T, anti-CD5) (I. Royston et al, J. Immunol., 125. 725 (1980)) und G17-2 (IgG&sub1; anti-CD4) (J. Ledbetter et al., Mol. Immunol., 24, 1255 (1987)) wurden wie bei Uckun, Antibody, a. a. O., beschrieben, durch eine Disulfid- Verbindung unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio)Propionat (SPDP) mit antiviralern Pokeweed-Protein (PAP) verbunden. PAP-mAb-Konjugate wurden durch größenausschließende Chromatographie auf HPLC unter Verwendung der Kationenaustauschchromatographie (Uckun, Antibody, a. a. O.) gereinigt. Gereinigtes PAP wurde mit einem dreifachen molaren Überschuß von 2-Iminothiolan für 30 Minuten zur Reaktion gebracht, um reaktionsfähige Sulfhydryl-Gruppen in die toxischen Teile einzuführen, gefolgt von einer Reaktion mit primären Aminogruppen, wie bei Uckun, Antibody, a. a. O., beschrieben; siehe Uckun et al., Human Tumor Antigens and Specific Tumor Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Celluar Biology, Vol 99 (Ed. Metzgar und Mitchell, Alan R. Liss, Inc., N.Y., N.Y. 1 988). mAb (5 mg/ml) wurde zuerst mit einem dreifachen molaren Überschuß von SPDP (einer frisch hergestellten Lösung einer 64mm-Konzentration in DMSO, 1:10 verdünnt in 40mM Natrium phosphatpuffer mit 150mM NaCl, pH7.5) für 30 Minuten bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Modifiziertes mab, welches Dithiopyridyl-Gruppen enthält, wurde gemischt mit modifiziertem PAP, welches freie Sulfhydryl-Gruppen enthält, bei einem molaren Verhältnis von PAP/mAb = 3/1 und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach dieser Konjugationsreaktion wurden PAP-mAb-Konjugate gereinigt, wie in Uckun et al., J. of Exp. Med.: 163, 347-368 (1986); Uckun, Antibody, a. a. O.; und Uckun, Human Tumor Antigens and Specific Tumor Theradv UCLA symposia on Molecular and Cellular Bio. a. a. O. beschrieben, durch Größenexklusions- und Kationenaustauschchromatographie mittels eine computergesteuerten HPLC-Systems (System Gold Beckman) gereinigt. PAP-mAb-Konjugate, F13- PAP, G3.7-PAP, T101-PAP und G17-2-PAP wurden von unkonjugiertem PAP durch größenausschließende Chromatographie auf HPLC und von unkonjugierten monoklonalen Antikörpern durch Kationenaustauschchromatographie getrennt, wie beschrieben bei Uckun, Antibody Immunoconjugates and Radiodharmaceuticals,V 1:, Seiten 247-262 (1988).
  • Die gereinigten PAP-mAb-Konjugate wurden in vitro bezüglich Reinheit und Zusammensetzung durch SDS-PAGE (Fig. 4) und quantitative HPLC (Fig. 2 und 3) evaluiert. Kein freies PAP wurde bei Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen detektiert. Die Kontamination mit freien Antikörpern wurde durch Gelabtastung auf kleiner als 1 % abgeschätzt. Die Präparationen der PAP-mAb-Konjugate erzeugten Protein bänder von 180kDA und 210kDa, entsprechend den Konjugatenspezies, die 1 oder 2 Moleküle von PAP gebunden an ein Molekül des monoklonalen Antikörpers trugen. Für die PAP-mAb-Konjugate wurde ein durchschnittliches Molekulargewicht von 210kDa verwendet, um die molare Konzentration zu berechnen, da die PAP-Konjugate aus zwei, mit einem Molekül mAb verbundenen Molekülen von PAP bestanden.
    • III. Zielzellen
  • Gereinigte PAP-mAb-Konjugate wurden in vitro bezüglich ihrer Ribosomenhemmenden Aktivität evaluiert, durch zellfreie Translationstests, zelluläre Proteinsynthese, klonogenische Proliferationstests, ³H-Thymidin-Inkorporation in die Zellen und den hemmenden Effekt auf die HIV-Produktion unter Verwendung von Zielzellen, die die entsprechenden Antigene exprimieren. Als Ziele wurden HIV-infizierte U937-Monozyten und CD4&spplus;T-Zellen aus Blut verwendet. Die Kontrollen schlossen ein (a) nicht-infizierte Zielzellen (U937, CD4&spplus;T-Zellen, Nalm-6, Knochenmarkszellen etc.) sowie (2) Zielzellen, die mit Kontroll-Antikörper-Konjugaten oder unkonjugiertem PAP behandelt wurde. Es wurde die menschliche Monozytenzell-Linie U937 (ATCC Nr. CRL 1593) verwendet.
    • IV. Bestimmung der Zytotoxizität von PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugaten
  • In einem zellfreien Translationssystem, in welchem Rattenleberribosomen und Polyuridylsäure nach dem Verfahren von D. B. Cawley et al., Biochemistry. 17, 2648 (1979) (Tabelle 1) verwendet wurden, wurde die Fähigkeit von PAP-mAb- Konjugaten bestimmt, die Proteinsynthese zu hemmen. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß PAP die zellfreie Translation hemmt und daß PAP-monoklonale Antikörper-Konjugate, die mAb auf CD19, CD14 oder CD17 enthalten, die Fähigkeit beibehalten haben, die zellfreie Translation zu hemmen. Unter Verwendung der in Uckun, Cancer Res. 45: 69-75 (1985); Uckun J. of Immunology, 135: 3516-3522, (1985) beschriebenen klonogenischen Tests oder klonogenischen Serienverdünnungstests wurde die zelltypspezifische Zytotoxizität dieser PAP-mAb-Konjugate gegen CEM, U937 und Knochenmarkstammzellen analysiert.
  • Wir haben zwei verschiedene komplementäre Testsysteme zur Messung der Zell- Replikation verwendet, um die zytotoxischen Effekte auf die PAP-mAb-Konjugate zu bestimmen. Als erstes wurden, um die Zytotoxizität der Zielzellen zu bestimmen, Inkorporationstests für tritiiertes Thymidin (³H-TdR) verwendet, die die DNA-Synthese und die Kurzzeit-Replikation von Zellen messen. Dieses Testsystem ist sehr empfindlich auf die Messung von zellhemmenden Effekten, aber es unterscheidet nicht zwischen vorübergehender Hemmung und permanenter Hemmung (d.h. dem Zelltod). Daher wurden klonogenische Langzeittests verwendet, um die tatsächliche Zelltodesrate nach Behandlung mit PAP-mAb- Konjugaten festzustellen.
  • Beide Testsysteme ergaben komplementäre Daten, die einen signifikanten "therapeutischen Index" für die Hemmung der HIV-Replikation durch PAP-mAb- Konjugate zeigten (der therapeutische Index ist definiert als das Verhältnis der Konzentration von PAP-mAb-Konjugat, welches 90% (oder 50%) der HIV- Replikation hemmt gegenüber der Konzentration von PAP-mAb-Konjugat, welches 90% (oder 50%) der Zell-Replikation hemmt (siehe Tabelle 3)).
  • Die Tabelle 3 und die Fig. 7, 8 und 10 zeigen, daß 650pM von PAP-Anti-CD5, 600pM von PAP-Anti-CD7 und 2000pM von PAP-Anti-CD4 benötigt wurden, um die Replikation von CD4&spplus;T-Zellen um 50% zu hemmen. Fig. 9 zeigt, daß Konzentrationen bis zu 1100pM PAP-Anti-CD 19, welches nicht mit CD4&spplus;T- Zellen reagiert, nicht mehr als 20% Hemmung der Replikation von CD4&spplus;T-Zellen verursachten. Wie im folgenden (Sektion V) gezeigt werden wird, wurden Pegel des PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugats beobachtet, wenn sie mit der Menge des PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugats verglichen wurden, welches benötigt wird, um die Virus-Replikation um 50% zu hemmen, die um mindestens 25mal niedriger und bevorzugterweise um mindestens 100mal niedriger lagen, als jene, die benötigt wurden, um die Zell-Replikation um 50% zu hemmen. Beim Vergleichen der in Fig. 14 gezeigten, klonogenischen Zellhemmstudien mit der in Tabelle 3 und den Fig. 7, 8 und 10 gezeigten Virushemmung durch PAP-monoklonale Antikörper-Konjugate zeigten die PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugate Hemmung von im wesentlichen der gesamten Virus-Replikation bei Pegeln, die mindestens 100mal niedriger lagen, als die Pegel des Konjugats, die für eine 90%ige Hemmung der Zell-Replikation benötigt wurden.
  • Fig. 14 zeigt die Selektivität von PAP-mAb-Konjugaten. Z.B.: PAP-Anti-CD5 hemmt das klonogenische Wachstum von CD5&spplus; CEM (einer CD4&spplus;T-Zell-Linie), gMAC 28 (einem normalen CD4&spplus;T-Zell-Klon) und F65 (einem normalen CD4&spplus;T- Zell-Kion)-Zellen, aber es hemmt nicht CD5&supmin;-Zellen, wie etwa U937-Monozyten oder normale Knochenmarks-Vorläuferzellen BFU-E, CFU-GM oder CFU-GEMM. Diese Ergebnisse zeigen daher, daß PAP-mAb-Konjugate spezifisch für Zielzellen zytotoxisch sind, die das Antigen exprimieren, auf welches mAb ausgerichtet ist. Die zur selektiven Hemmung der Zielzell-Replikation benötigen PAP-mAb-Konzentrationen sind jedoch wesentlich höher als die zur Hemmung der HIV-Replikation benötigten Konzentrationen (Tabelle 2, 3, Fig. 7, 8).
  • Von den zur Hemmung der HIV-Replikation in den Zielzellen benötigten Dosen des PAP-mAb-Konjugats wird angenommen, daß sie nur eine minimale oder keine Toxizität für Nicht-Zielzellen (definiert durch das Fehlen des relevanten Zielantigens, welches von dem mAb-Teil des PAP-mAb-Konjugats erkannt wird) darstellen, einschließlich Populationen von normalen Knochenmarksvorläuferzellen, da (1) weniger als 40% Hemmung von U937, CFU-GM, BFU-E oder CFU- GEMM-Zellen, welche CD5-Antigen-negativ sind, bei den höchsten Konzentrationen von PAP-Anti-CD5-Konjugat beobachtet wurde, und (2) weniger als 20% Hemmung von U937 oder BFU-E-Zellen, welche CD7-Antigen-negativ sind, bei den höchsten Konzentrationen von PAP-αCD7-Konjugat beobachtet wurde (siehe Fig. 14). Eine Stärke der Hemmung, die weniger als 50% beträgt, unterscheidet sich nicht wesentlich von "keiner Hemmung" in diesem Testsystem (Uckun et al., Cancer Research 45, 69-75 (1985)). Bemerkenswert ist, daß die höchste Konzentration von PAP-Anti-CD5 oder PAP-Anti-CD7, die getestet wurde, d.h. 5 x 10&sup4; pM, 50-500mal größer ist als die Konzentrationen von PAP- αCD5 oder PAP-αCD7, die für eine 90%ige Hemmung der HIV-Replikation, bestimmt durch Hemmung der p24-Produktion in CD4&spplus;T-Zellen (s. Fig. 7, 8, 13), benötigt werden. Daher deutet Fig. 14 an, daß PAP-mAb-Konjugate für Zielzellen, die die relevanten Oberflächenantigene exprimieren, zytotoxisch sind, wenn sie bei höheren Konzentrationen verwendet werden. Beispielsweise hemmte PAP-αCD5 die Proliferation von CD5-Antigen-Positiv-CEM, von GMAC28 und von F65-Zellen um mehr als 90% bei 5 x 10&sup4; pM und PAP-αCD7 hemmte die Proliferation von CD7-Antigen-positiv-CEM, von CFU-GEMM und von CFU-GM-Zellen um 50-70% bei 5 x 10&sup4; pM. Diese Konzentration liegt 50- 500mal höher als die Konzentration irgendeines Konjugats, welches benötigt wird, um die HIV-Replikation im CD4&spplus;T-Zellen um mehr als 90% zu hemmen (s. Fig. 7, 8, 13). 15000 pM PAP-Anti-CD4 verursachte bei der Kolonienbildung der Knochenmarksvorläuferzellen BFU-E, CFU-GN und GEMM nur 2%, 5.5% bzw. 6% Hemmung. Diese Konzentration liegt etwa 3000mal höher als die Konzentration von PAP-Anti-CD4-Konjugat, welches benötigt wird, um die HIV-1- Replikation in CD4&spplus;T-Zellen um 90% zu hemmen (Fig. 10).
  • Fig. 7 zeigt, daß PAP-αCD5-Konjugat bei 3 x 10² pM die HIV-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen um mehr als 90% hemmt. Bei dieser Konzentration hemmt PAP-α- CD5 die Kurzzeit-Replikation (durch ³H-Thymidin-Inkorporation gemessen) von CD4&spplus;T-Zellen (Fig. 7) oder die Langzeit-Replikation (durch klonogenische Tests gemessen) von CEM, GMAC28 und F65-Zellen, die alle das CD5-Oberflächenantigen exprimieren, um 40% oder weniger.
  • Ebenso zeigt Fig. 8, daß PAP-α-CD7-Konjugat die HIV-Replikation in CD4&spplus;T- Zellen bei 3 x 10² pM um mehr als 90% hemmt. Bei dieser Konzentration hemmte es 40% der Kurzzeit-Replikation von CD4&spplus;T-Zellen und weniger als 20% der Langzeit-Replikation von CEM, CFU-GEMM oder CFU-GM-Zellen, die alle das CD7-Oberflächenantigen exprimieren (Fig. 14). Ebenso zeigt Fig. 10, daß PAP-Anti-CD4 bei 30 pM mehr als 90% der HIV-1-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen hemmt. Bei dieser Konzentration hemmte es 20% der Kurzzeit-Replikation von CD4&spplus;T-Zellen. Bei 30 pM PAP-Anti-CD4 trat keine Hemmung von CFU-GM, BFU-E oder GEMM auf. Diese Ergebnisse illustrieren, daß PAP-mAb-Konjugate die HIV-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen ohne Hemmung der Replikation von nichtinfizierten CD4&spplus;T-Zellen oder der Kolonienbildung von Knochenmarkszellen hemmen. TABELLE 1 Hemmende Effekte von PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugaten auf die zellfreie Translation
  • Der Effekt von PAP-Antikörper-Konjugaten auf die zellfreie Translation wurde unter reduzierten Bedingungen in einem zellfreien Translationssystem analysiert, welches aus einem nukleasebehandelten Hasenretikulozyten-Lysat besteht, mit der Fähigkeit, die Messenger-RNA in Protein zu translatieren. Die Proteinsynthese wurde als ³H-Leuzin-lncorporation in alkaliresistentes TCA-fällbares Material gemessen. IC&sub5;&sub0; = Konzentration, die 50% der Proteinsynthese hemmt.
    • V. Bestimmung der Wirkungen von PAP-monoklonalen Antikörper-Konjugaten auf die HIV-Produktion von in vitro mit HIV-1-infizierten Monozyten und T-Zellen und auf die HIV-Produktion in T-Zellen infizierter Patienten
  • T-Zellen und U937-Monozyten, die HIV-1 ausgesetzt und anschließend mit PAP- monoklonalen Antikörper-Konjugaten behandelt wurden, wurden unter Verwendung eines enzymgebundenen HIV- 1 -Antigen-Fang-Immunosorbenztests (ELISA) auf die Produktion von HIV p24 (gag)-Antigen im Überstand der Kultur hin beobachtet. (Genetic Systems Corp.) PAP-mAb-Konjugate wurden auf ihre Anti-HIV-Aktivität über einen 5-log-Dosisbereich hin analysiert. Subletale Dosen, die die virale Replikation in CD4&spplus;T-Zellen effektiv beseitigen, ohne die nichtinfizierten CD&spplus; T-Zellen zu töten, wurden studiert.
  • U937-Zellen, gezüchtet in 10% FCS enthaltenem RPMI, wurden pelletiert und dann in frisches, 10% FCS enthaltenes RPMI resuspendiert, bei einer Dichte von 1 x 10&sup5; Zellen/ml. PAP- oder PAP-mAb-Konjugate wurden mit der gegenüber der gewünschten End-Konzentration vierfachen Konzentration im gleichen Medium präpariert. Jedem der 8 Replikationsschächte der 96-Schacht-Platten mit flachem Boden wurde 0.1 ml der Zell-Suspension und 0.05 ml des Wirkstoffes oder des Mediums hinzugefügt. Am folgenden Tag wurden 0.05 ml des seriell verdünnten LAV-1, isoliert von HIV-1, jedem Schacht hinzugefügt. Einen Tag nach der Infektion wurden die Zellen zweimal gewaschen, um nicht-adsorbierte Viren zu entfernen. Ein neues Medium mit den gewünschten Wirkstoffkonzentrationen von PAP- oder PAP-mAb-Konjugat wurden jedem Schacht hinzugefügt. 7 Tage nach der Infektion wurden 0.1 ml des Überstandes von jedem Schacht entfernt und mittels Antigen-Fang-ELISA (Genetic Systems Inc.) auf HIV-p24 (gag)- Antigen hin getestet. Bei verschiedenen Konzentrationen behandelte Zellen sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 2 zeigt, daß bei bis zu 150 pM niedrigen Konzentrationen sowohl PAP als auch PAP-Anti-CD14 die HIV-p24-Produktion in den HIV-infizierten U937-Monozytenzellen hemmt und daß das PAP-Anti-CD14- Konjugat effektiver bei der kompletten Beseitigung des replizierten HIV ist.
  • Zum Studium der Wirkungen von PAP und PAP-mAb-Konjugaten auf die HIV- Anti-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen, die von normalen Menschen erhalten wurden, wurden 24 x 10&sup6; periphere Blutlymphozyten (PBL), isoliert von frischem menschlichen Blut durch die Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, resuspendiert in 25 ml RPMI-1640-Medium, welches 10% normales menschliches Serum (NHS) enthielt, und für eine Stunde bei 37ºC in einem 150 cm² Zellkulturkolben inkubiert, um anhaftende Monozyten zu entfernen.
  • Die nicht-anhaftenden PBL wurden dann für 30 Sekunden in einem 10% NHS und eine Kombination der folgenden monoklonalen Antikörper: G10.1 (ACDB), FC-1 (αCD16) und 1F5 (αCD20), jeder bei 10 µg/ml, enthaltenen Medium für 30 Sekunden auf Eis inkubiert. Den antikörperbehandelten Zellen wurde in einer Endverdünnung von 1:4 ein 3-4 Wochen altes "Pel Freeze"-Hasenkomplement hinzugefügt. Die Zellen wurden mit dem Komplement für eine Stunde bei 37ºC inkubiert und anschließend wurden die toten Zellen mittels Ficoll eliminiert. Die lebensfähigen Zellen wurden über Nacht in einem 10% NHS und 3 µg/ml Phytohämagglutinin (PHA) enthaltenes RPMI-Medium inkubiert.
  • PHA wurde anschließend durch Waschen der Zellen mit Medium entfernt und es wurden zweimal 10&sup6;-Zellen mit 0.5 ml Medium resuspendiert, welches verschiedene Konzentrationen von PAP oder PAP-mAb-Konjugaten enthielt, oder in Medium alleine und dann für vier Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurden jeder Röhre 5 x 10 Zellkulturinfektionsdosen&sub5;&sub0; (TCID&sub5;&sub0;) des LAV-1-Isolats von HIV-1 hinzugefügt.
  • Nach 2 Stunden wurden nicht-zellgebundene Viren durch viermaliges Waschen der Zellen in PBS entfernt und die Zellen wurden in 2.0 ml Medium (1 x 10&sup6; Zellen/ml) resuspendiert. Dann wurden jedem der vier Replikationsschächte der 96-Schacht-Platten, die 0.1 ml verschiedener Konzentrationen von PAP, PAP- mAb-Konjugaten oder Medium alleine und vier Einheiten/ml IL-2 (Lymphokult-T) enthielten, 1 x 10&sup5; Zellen in 0.1 ml hinzugefügt.
  • Es wurde ein Tag 7-Überstand von den Wänden einer Duplikationsplatte entfernt und in einem quantitativen p24-Antigen-Fang-ELISA (GSC) auf HIV-p24-(gag) getestet. Die prozentuale Hemmung der p24-Produktion wurde wie folgt berechnet:
  • 1 - ng/ml p24, von behandelten Zellen produziert/ng/ml p24, von unbehandelten Zellen produziert x 100
  • Überstände unbehandelter CD4&spplus;T-Zellen enthielten 1255 ng/ml p24. Die Ergebnisse der Anti-HIV-Aktivität der PAP-Konjugate mit mAb für CD5, CD7 oder CD4 und mit PAP-Konjugaten für die negative Kontrolle von mAb für CD19 sind in Tabelle 3 und den Fig. 7 - 10, 13 gezeigt.
  • Die Vorbehandlung von CD4&spplus;T-Zellen mit unkonjugiertem PAP bei Konzentrationen von etwa 5000 pM hemmte die HIV-1-Produktion um etwa 50% in diesen Zellen, die mit dem LAV-1-Isolat von HIV-1-infiziert waren, und lieferte somit den einheitlichen Beweis, daß das anitvirale Spektrum von PAP HIV-1 einschließt (Tabelle 3, Fig. 6) PAP-Anti-CD5 (T101), PAP-Anti-CD7 (G3.7), reaktionsfähig mit T-Zellen, und PAP-Anti-CD4 (G17-2), spezifisch reaktionsfähig mit CD4&spplus;T-Zellen waren hocheffektiv in der Hemmung der Virus-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen (Fig. 7, 8 und 10 und Tabelle 3). B43/CD19-enthaltenes Kontroll- PAP-Konjugat, welches mit Kontroll-B-Zellen aber nicht mit T-Zellen reagiert, zeigte sogar bei 1375 pM (Fig. 9, Tabelle 3), was etwa 220mal höher ist, als die Konzentration von PAP-Anti-CD7 und etwa 1000mal höher ist als die Konzentratin von PAP-Anti-CD4, die benötigt wird, um die HIV-p24-Produktion in CD4&spplus;T-Zellen um 50% zu hemmen (Fig. 8, 10 und Tabelle 3), nicht die 50%- Hemmung der HIV-Replikation in CD4&spplus;T-Zellen. Bemerkenswert ist, daß die Konzentrationen von PAP konjugiert mit Anti-CD5, Anti-CD7 oder Anti-CD4, die die HIV-Replikation hemmen, wesentlich niedriger sind, als solche, die für die Hemmung der Zell-Replikation benötigt werden (Fig. 7, 8, 10, 13 und Tabelle 3).
  • Für das Studium des Effekts des PAP-Anti-CD4-Konjugats auf die HIV-1-p24- Produktion in peripheren Blutlymphozyten (PBL) HIV-1-infizierter Menschen wurde PBL von frischem Blut mittels der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert und bei 1 x 10&sup6; Zellen/ml in 10% normales menschliches Serum (NHS) enthaltenes RPMI-1 640-Medium resuspendiert. Dann wurden 1 x 10&sup6; Zellen in 1.0 ml jedem der zwei Replikationsschächte der 24-Schacht-Platten hinzugefügt, die 1 ml verschiedener Konzentrationen von PAP-Anti-CD4-Konjugat zusammen mit 1 µg/ml monoklonaler Antikörper gegen CD3 (IgG1, G19.4 ATCC Nr. HB9536, hinterlegt am 1 5. September 1987) enthielten, um die Replikation des PBL und die Aktivierung der HIV-1-Produktion zu induzieren und 4 Einheiten/ml IL-2 (Electro-Nukleonics) enthielten.
  • Am Tag 5 wurden 0.1 ml Aliquot Zellsuspension von jeder Behandlung in 96- Schacht-Platten mit rundem Boden transferiert und mit 1.0 µCi in 0.1 ml pro Schacht von tritiiertem Thymidin (New England Nudlear) markiert und mittels eines Zellsammlers sechs Stunden später gesammelt.
  • Am Tag 7 wurde der Überstand von den Schächten entfernt und in einem quantitativen p24-Antigen-Fang-ELISA (Genetic Systems) auf HIV-1-p24-Pegel getestet. Die prozentuale Hemmung der p24-Produktion wurde wie folgt berechnet:
  • 1 - ng/ml p24, von behandelten Zellen produziert/ng/ml p24, von unbehandelten Zellen produziert x 100
  • Die Ergebnisse von mit CD4-konjugiertem PAP auf die Hemmung der HIV-1- Produktion in PBL zweier infizierter Patienten sind in Fig. 11 gezeigt.
  • Fig. 11 zeigt, daß die Behandlung von PBL von HIV-1-infizierten Patienten mit mAb G19.4 für CD3 die HIV-1-Produktion induziert. Die p24-Konzentrationen in den Überständen des Anti-CD3-aktivierten, nicht mit PAP-mAb-CD4 behandelten, von den Spendern Z6 und Z8 entnommenen PBL betrugen 0.4 bzw. 6.6 ng/ml. Eine Konzentration von etwa 0.5 pM PAP-Anti-CD4 hemmte die HIV-1- Replikation (p24) um 50%. Eine Konzentration von etwa 5 pM PAP-Anti-CD4 hemmte die p24-Produktion um faßt 100%, hemmte aber nicht die Zell-Replikation der PBL der Patienten.
  • Fig. 12 zeigt, daß der Anti-HIV-Effekt von PAP-Anti-CD4 (5.0 pM) auf die Anti- CD3-aktivierte PBL zweier Patienten mindestens 22 Tage dauerte, sogar wenn die Zellen am Tag 5 von PAP-Anti-CD4 gereinigt wurden.
  • Diese Ergebnisse deuten an, daß monoklonale Antikörper-Konjugate des antiviralen Pokeweed-Proteins zur selektiven Hemmung der HIV-Produktion in Zellen verwendet werden können, die die relevanten Zieloberflächen-Antigene tragen, gegen die der monoklonale Antikörper gerichtet ist, ohne daß die Konjugate die Zellreplikation hemmen. Bemerkenswert ist, daß PAP-Anti-CD4 nicht nur bei der Hemmung von HIV-1-Replikation in normalen, in vitro mit HIV-1-infizierten Zellen sehr potent ist, sondern ebenfalls in der Hemmung der HIV-1-Produktion in der PBL der Patienten sehr potent ist und der Effekt mindestens mehrere Wochen andauert (Fig. 11 und 12). PAP-mAb-Konjugate weisen in vivo in Mäusen eine Halbwertszeit von etwa 16-18 Stunden und in nicht-menschlichen Primaten von 6-10 Stunden auf, verglichen mit der 5-10 minütigen Halbwertszeit von PAP und sie sind bei nicht-toxischen Konzentrationen, welche mindestens 200mal niedriger sind, als die effektive Konzentration von PAP, wirksam, die HIV-1- Produktion zu hemmen.
  • Um die Hemmung der HIV-Replikation in U937-Monozytenzellen zu verursachen, war PAP-Anti-CD14 unterhalb von 150 pM wirksam, während 3 x 10&sup5; pM nicht- konjugiertes PAP benötigt wurde (Tabelle 2). Um 50% Hemmung der HIV- Replikation in CD4&spplus;T-Zellen mit Anti-CD5-konjugiertem PAP zu verursachen, wurde eine Konzentration von 32 pM benötigt (Fig. 7); mit PAP-Anti-CD7 (Fig. 8) wurde eine Konzentration von 6pm benötigt und mit PAP-Anti-CD4 wurde eine Konzentration von 1 pM benötigt (Fig. 10 und Tabelle 3). Im Kontrast dazu wurde eine Konzentration von 5000 pM von nicht-konjugiertem PAP benötigt, um die HIV-Replikation um 50% zu hemmen (5. Fig. 6 und Tabelle 3). Es ist daher mit PAP-mAb-Konjugaten 25-5000mal weniger notwendig, um die HIV- Replikation zu hemmen, als mit PAP alleine (Fig. 8, 10 und Tabelle 3). Im Vergleich hemmte das Kontroll-PAP-mAb-Konjugat PAP-Anti-CD19, welches nicht mit CD4&spplus;T-Zellen reagiert, da es für B-Zellen spezifisch ist, weder die Proliferation von CD4&spplus;T-Zellen noch die HIV-Replikation bei Konzentrationen bis zu einer Höhe von 1375 pM (Tabelle 3, Fig. 9). Diese Ergebnisse zeigen, daß PAP selektiv zielgerichtet eingesetzt werden kann, um die HIV-Replikation in CD4&spplus;Zellen durch Konjugation von PAP mit mab, welches reaktionsfähig mit CD&spplus;-Zellen ist, zu hemmen. Die in Fig. 11 und 12 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß PAP-Anti-CD4-Konjugat ebenfalls sehr potent und langlebig ist bei der Hemmung der HIV-1-Produktion in PBL vom mit HIV-1-infizierten Patienten. TABELLE 2 Hemmung der HIV-1-Produktion in menschlichen U-937-Monozyten-Zellen, behandelt mit PAP-Anti-CD 14 oder mit nicht-konjugiertem PAP U937-Zellen, behandelt mit: PAP-αCD14-Konjugat Konzentration (pM) Anzahl der HIV p24+-Schächte Einbau in diese Keine PAP (alleine) Konzentration (pM) +Verbesserte Anti-HIV-Aktivität von PAP nach Konjugation mit mAb für CD5, CD7 oder CD4 CD4&spplus; T-Zellen behandelt mit Anti-HIV-Hemmungs-Dosis&sub5;&sub0; Konzentration (pM) Anti-Proliferations-Hemmungsdosis&sub5;&sub0; Konzentration (pM)
  • Hemmungsdosis&sub5;&sub0; (ID&sub5;&sub0;) = Konzentration, die benötigt wird, um die Zellproliferation (³H-TdR-Inkorporation) von CD4&spplus;T-Zellen um 50% zu hemmen und die Konzentration, die benötigt wird, um die HIV-Replikation (p24-Antigen- Produktion) in CD4&spplus;T-Zellen um 50% zu hemmen.
  • Da die höchste PAP αCD19-Konjugat-Dosis, die getestet wurde, 1375 pM betrug, konnte die ID&sub5;&sub0; dieses Kontrollkonjugats nicht bestimmt werden. Die Anti-Proliferations-ID&sub5;&sub0; von PAP übersteigt ebenfalls die höchste getestete Dosis (2 x 10&sup5; pM). PAPαCD19 reagiert nicht mit CD4&spplus;T-Zellen und wurde als negative Kontrolle gewählt.

Claims (10)

1. Antivirale Zusammensetzung, mit einem Konjugat von antiviralem pokeweed(Phytolacca Americana)-Protein (PAP), wirksam, die Virusreplikation in virusinfizierten Säugetierzellen ohne meßbare Zytotoxizität zu unterdrücken und einem menschlichen monoklonalen Antikörper, reaktionsfähig mit einem nicht- viralen assoziierten, an der Oberfläche derartiger Säugetierzellen vorhandenen Antigen,
dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper ein monoklonaler CD4 oder CD5 Antigen-Antikörper ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler T101/CD5, 10.2/CD5 oder G17-2/CD4 Antikörper ist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat von monoklonalen T101/CD5, 1 0.2/CD5 oder G 1 7-21CD4 Antikörpern und PAP wirksam ist, die HIV- oder HTLV-Replikation in HIV- oder HTLV-infizierten Säugetierzellen zu unterdrücken.
4. Verfahren zur Unterdrückung der Replikation von HIV in Säugetierzellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellkultur einschließlich HIV-infizierten menschlichen T-Zellen mit einer Menge einer Zusammensetzung eines Konjugats menschlicher CD4-Antigen-Antikörper und PAP oder einer Zusammensetzung eines Konjugats menschlicher CD5-Antigen-Antikörper und PAP oder einer Mischung davon behandelt wird, wirksam, die Replikation des HIV ohne meßbare Zytotoxizität zu unterdrücken, wobei der Antikörper des Konjugats mit einem nicht-viralen, assoziierten, an der Oberfläche der HIV-infizierten Zellen vorhandenen Antigen reaktionsfähig ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper der monoklonale Antikörper G17- 2/CD4 oder ein anderer Antikörper ist, bei dem Bindungen im wesentlichen durch G -2 blockiert werden und welcher die Bindung von G17-21CD4 blokkiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper der monoklonale Antikörper 10.2/CD5 oder ein anderer Antikörper ist, bei welchem die Bindung im wesentlichen durch 10.2 blockiert wird und welcher die Bindung von 10.2/CD5 blockiert.
7. Verfahren zum Unterdrücken der Replikation von HIV in Säugetierzelen, dadurch gekennzeichnet, daß periphere, von HIV-1 infizierten Patienten erhaltene Blut-Lymphozyten mit einer Menge eines Wirkstoffes stimuliert werden, wirksam, die Zell-Proliferation und die HIV-Replikation zu induzieren; und daß die peripheren Blutlymphozyten mit einer Menge einer Zusammensetzung eines Konjugats von Antikörpern und PAP behandelt werden, wirksam, die Replikation des HIV zu unterdrücken, in der der Antikörper ein monoklonaler CD4 oder CD5-Antigen-Antikörper ist, welcher mit einem nicht-viralen, assoziierten, an der Oberfläche derartiger Säugetierzelen vorhandenen Antigen reaktionsfähig ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellproliferations- und HIV-Replikations-Wirkstoff ein CD3-Antikörper ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellproliferations- und HIV-Replikations-Wirkstoff Phytohämagglutinin ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der CD3-Antikörper G19-4/CD3 ist.
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