JPH04502625A - アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白質―モノクローナル抗体コンジュゲート - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白質−モノクローナル抗体コンジュゲート 技術分野 本発明は、アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白質（ＰＡＰ）−モノクローナル抗 体（ｍＡｂ）コンジュゲートを用いたヒトＴ細胞および単核白血球におけるウィ ルス阻害に関するものである。ＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートは、 ヒトＣＤ　４　＋Ｔ−細胞におけるＨＩＶ複製を効果的に阻害し、検出可能な細 胞毒性を伴わないことが見出された。

背景 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）およびヒト免疫不全ウィルス１型（ ＨＩＶ−１）による感染症は、世界的な公衆衛生問題を引き起こしている。（Ａ 、ベンカテサン、「サイエンスＪ２４ｉ：１４８１−１４８５（１９８８））。

現時点で、エイズの治療法は無く、ＨＩＶインビボ生成を減少させる利用可能な 治療モダリティ−１例えばＡＺＴの使用は、毒性副作用を誘発する。

ＨＩＶは、元来、ヒトＴリンホトロビックウィルス（ＨＴＬＶ）−ＩＩＩ、リン ホアデノバシー関連ウィルス（ＬＡＶ）またはエイズ関連レトロウィルス（ＡＲ Ｖ）と命名されたＲＮＡレトロウィルスである。ファウチ、「サイエンスＪ２３ ９：６１７−６２２（１９８８）。これらのウィルスは、レトロウィルスの非形 質転換性および細胞変性レンチウィルス群の他の構成員と多くの特徴を共有して いる。ＨＩＶはＨＩＶ−１と呼ばれ、ＨＩＶ誘発性エイズとは区別がつかない臨 床的症候群を患う西アフリカの患者から単離されたＨＴＶ−２とは区別される。

ＨＩＶ感染の免疫病原に関する決定的な根本原理は、結果的に根深い免疫抑制を 生じる、Ｔ細胞のＣＤ４＋ヘルパー／誘導物質サブセツトの消耗である。ダール グレイシュ等、「ネイチャーＪ３１２ニア６３−７６７（１９８４）、ファウチ 、Ｃ１１ｎ、　Ｒｅｓ、３２：４９１　４９６（ｉ９８５）、ホー等、「ニュー イングランド・ジャーナル・オブ・メディシンＪ３１７：２７８−２８１（１９ ８７）参照。ＨＩＶは、ＣＤ、４＋Ｔ細胞およびマクロファージに対す１！Ｍ性 を有し、ＣＤ４抗原は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶに関する細胞表面 レセプターの本質的成分である。ラスキー等、「サイエンスＪ２３３：２０９− ２１２（１９８６）、ラスキー等、「セルＪ５０：９７７−９８５（１９８７） 。ＨＩＶが外部ｘンベ。

−プ糖蛋白質ｇｐ１２０を介してＣＤ４分子に結合した後、ウィルスは内面化さ れ、非被覆状態になる。ファウチ、「サイエンス」２３９：６１７−６２２（１ ９８８）、スタイン等、「セルＪ４９：６５９−６６９（１９８７）。一旦内面 化されると、ゲノムＲＮＡは、（酵素の）逆転写酵素によりＤＮＡに転写される 。次いで、プロウィルスＤＮＡは、宿主染色体ＤＮＡに組み込まれる。プロウィ ルスが組み込まれた後、感染は潜在的様相を呈し得るか、またはプロウィルスＤ ＮＡは、ウィルスゲノムＲＮＡおよびメツセンジャーＲＮＡを転写し得る。蛋白 合成、プロセシングおよびウィルス組立は、細胞表面からの成熟ヴイリオン（ｖ ｉｒｏｎ）の発芽により行なわれる。現時点で、エイズの治療法は無く、ＨＪＶ のインビボ生成を低減化する唯一承認された抗ウィルス剤のＡＺＴは、重い毒性 副作用を誘発し得、ＡＺＴ耐性突然変異体の発生を誘発し得る。ＨＩＶ感染の長 期治療は、多くの癌に必要とされる組み合わせ化学療法と同様に組み合わせた形 または逐次的に与えられる多数の薬剤を必要とし得る。

ハイブリダイゼーションまたはコンジュゲートしたモノクローナル抗体および毒 素により構成される抗体コンジュゲートを用いて、標的表面抗原をもつ「望まし くない」標的細胞に的を絞り、それを破壊することにより、標的細胞の特異的集 団を根絶する。例えば、ジャンセン等、イムノロジカル・レビューズ、６２：１ ８５（１９８２）、レオナード等、「キャンサー・リサーチＪ４５：５２６３（ １９８５）、ウラクン等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシ ン」、１６３．３４７−３６８（１９８６）、ウラクン等、「キャンサー・リサ ーチ」、４５．６９−７５（１９８５）、ラマクリシュナン等、「ジャーナル・ オブ・イミュノロジーＪ、１３５．３５１６−３５２２（１９８５）参照。様々 な研究者らにより使用されている毒素の種類は、２つの群に大きく類別され得る 。第１の群は、無傷毒素、例えば無傷リジンにより構成される。例えば、レオナ ード（前出）参照。これらの毒素は致死毒性をもつため、インビボで安全には適 用され得ない。第２群の毒素はヘミトキシン類と呼ばれる。ヘミトキシン（ｈｅ ｍｉｔｏｘｉｎ）は、真核生物リポソームに対して触媒的に作用し、６０−Ｓサ ブユニットを不活化することにより、ペプチド伸長レベルで細胞蛋白質合成を用 量依存的に阻害する１本鎖リポソーム不活化蛋白質である。バルビエリおよびス ターブ、「キャンサー・サーベイズＪ１：４８９（１９８２）参照。

興味の対象であるーヘモトキシンは、フィトラッカ・アメリカーナの晩夏葉の春 葉および種子から単離されるアメリカやまごぼう抗ウイルス性蛋白！（Ｐ　Ａ　 Ｐ）である。ＰＡＰは、何年も前から抗ウィルス活性を有するものとして認めら れている。エイロンおよびアービン、「アンティマイクロバイアル・エージエン ツ・アンド・ケモセラピー」、１７：１０３２（１９８０）、バルビエリ等（前 出）参照。

ＰＡＰは、植物におけるＲＮＡ含有ウィルス、例えばタバコモザイクウィルス［ アービン、「アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジ ックスＪ２００：４１８（１９８０）］およびキュウリモザイクウィルスの伝染 を遮断することが示されている。

［トムリソン等、「ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジー」２２：２２ ５（１９７４）］。また、ＰＡＰは、２種のＲＮＡ含有動物ウィルス：ポリオウ ィルス［ウラセリ−等、「アナルス・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オ ブ・サイエンス」２８４・４３１−４４０（１９７７）］およびインフルエンザ ウィルスの複製を阻害することが報告されている。トムリソン等（前出）。ＰＡ Ｐはまた、単純性はう疹つィルス■型（エイロン、前出）およびＨ型（オブリー クのアメリカ合衆国特許第４６７２０５３号）の増殖を阻害することが報告され ている。しかしながら、現在まで、ＰＡＰがレトロウィルス、例えばＨＩＶの複 製を阻害することは報告されておらず、ＰＡＰ含有抗体コンジュゲートを用いる ことにより、ウィルスの複製が有効に阻害されたこともない。

ヘミトキシン含有抗体コンジュゲートは、単にフンシュゲートの特異的モノクロ ーナル抗体部分を介して標的細胞に結合することによる高い特異的部位指向細胞 毒性を有する。ＰＡＰ含有抗体コンジュゲートを試験した結果、蛋白質合成阻害 により充分に高い濃度で悪性細胞に対する細胞毒性を有することが示されている 。殺される細胞に特異的な抗原へ選択的に結合し得る免疫グロブリンへのＰＡＰ の共有結合は、マスホのアメリカ合衆国特許第４３６３７５８号に記載されてい る。しかしながら、ウィルス感染細胞に指向したモノクローナル抗体へＰＡＰを 結合させて、細胞毒性を伴わずにウィルス複製を阻害する方法は、以前に記載も 検討も為されていない。

事実、抗ウィルス活性を有することが示された定常濃度のＰＡＰは、１）それら が毒性であり、２）ＰＡＰのインビボ半減期が約５−１０分であるため、インビ ボでは達成され得ない。

従って、ＰＡＰを標的として、非感染細胞は殺さずに感染細胞におけるウィルス 複製を阻害し得るアメリカやまごぼう抗ウイルス性蛋白質にコンジュゲートした モノクローナル抗体により構成される抗体コンジュゲートが要望されている。

発明の要旨 本発明は、モノクローナル抗体およびフィトラッカ・アメリカーナから単離され たアメリカやまごぼう抗ウイルス性蛋白質（ＰＡＰ）により構成される抗ウイル ス抗体コンジュゲートに関するものである。本発明は、疾患、例えばＨＩＶ誘発 性エイズまたはレトロウィルス誘発性Ｔ細胞白血病に関与する細胞内ウィルス複 製の阻害に有用なモノクローナル抗体−ＰＡＰ抗ウィつス組成物を提供する。本 発明は、ウィルス感染は乳類細胞の表面に存在する抗原と反応するモノクローナ ル抗体またはそのフラグメントを使用する。本発明のモノクローナル抗体フンシ ュゲートは、非コンジュゲートＰＡＰ（７）細胞蛋白質合成阻害能力を保持して いる。

我々は、モノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲートが、検出可能な細胞毒性を 伴わずにウィルス複製を有効に阻害し得ることを発見した。ＨＩＶの場合に本発 明を用いると、約３５ピコモル（ｐＭ）未満の量のモノクローナル抗体−ＰＡＰ コンジュゲートは、検出可能な細胞毒性を伴わずにＨＩＶ複製を少なくとも５０ ％阻害し得る本発明のモノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲートは、ウィルス 複製５０％阻害に必要とされるＰＡＰレベルよりも約２５倍低いレベルでＣＤ４ ＋Ｔ細胞および単核白血球におけるＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害する。好 ましくは、本発明のモノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲートは、非コンジュ ゲーｈＰＡＰの場合に必要とされるレベルよりも約１００倍低いレベルで（さら に好ましくは、非コンジュゲートＰＡＰの場合に必要とされるレベルよりも２０ ０倍低いレベルで）ＣＤ４＋細胞および単核白血球においてＨＩＶ複製を約５０ ％阻害する。本発明の一実施態様では、単核細胞表面抗原ＣＤ１４に対するモノ クローナル抗体のＰＡＰコンジュゲートは、約１５０ｐＭ未滴の濃度でヒト単核 細胞におけるＨＩＶ生成を効果的に破壊する。

本発明による好ましい抗体−ＰＡＰコンジュゲートには、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ７ に対するモノクローナル抗体、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ４に対するモノクローナル抗 体およびＴ細胞表面抗原ＣＤ５に対するモノクローナル抗体のＰＡＰコンジュゲ ートがある。また、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製は、細胞複製を阻害 せずに約３５ｐＭ未満の濃度でＣＤ４、ＣＤ７またはＣＤ５Ｔ細胞抗原に対する モノクローナル抗体のＰＡＰコンジュゲートを用いることにより少なくとも５０ ％阻害され得る。さらに、ＨＩＶ−１ｔｓ染患者からの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に おけるＨＩＶ−１の生成は、約１０ｐＭ未満の濃度でＣＤ４に対するモノクロー ナル抗体にコンジュゲートしたＰＡＰを用いることにより、少なくとも５０％阻 害され得、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖阻害は伴わない。

本発明はまた、は乳類細胞におけるＨＩＶ複製の不活化または阻害方法であって 、ＨＩＶ感染細胞を含む細胞培養物をモノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲー ト組成物で処理することを含む方法を提供する。本発明方法を用いると、ＨＩＶ 複製は、細胞複製を阻害することなく少なくとも５０％有効に阻害され得る。さ らに、本発明のＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートは、ＨＩＶ複製複製 ５駆 原細胞ＣＦＵ−ＧＭ（骨髄始原細胞＝コロニー形成単位−か粗球ーマクロファー ジ）、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球始原細胞＝バースト形成単位−赤血球）またはＣＦＵ −ＧＥＭＭ（多能性始原細胞＝コロニー形成単位−か粗球−赤血球−マクロファ ージー血小板生成細胞）に対しては毒性を示さない。本発明のＰＡＰモノクロー ナル抗体コンジュゲートは、少なくとも２５倍低いレベルで、好ましくは細胞複 製の５０％阻害に必要とされるコンジュゲートのレベルよりも少なくとも１００ 倍低いレベルでウィルス複製を少なくとも５０％阻害し得る。さらに、ＰＡＰ− モノクローナル抗体コンジュゲートは、細胞複製を５０％未満まで阻害するコン ジュゲート濃度で実質的に全てのウィルス複製を阻害し得る。

モノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲートは、は乳類単核細胞およびＴ細胞に おけるＨＩ■複製の非常に有効な阻害方法の基礎を提供し、従って、エイズ患者 またはまだエイズの症状を発現していないＨＩＶ−１感染患者の処置方法を提供 することが予想される。

さらに、モノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲートは、他のレトロウィルス類 （ＨＴＬＶ−１等）およびレトロウィルス以外のウィルス類、例えばヘルペスウ ィルス群の構成員（Ｈ３Ｖ、ＣＭＶ、ＥＢ■）、インフルエンザウィルス、リノ ウイルス、バポバウイルス（ヒト・パピローマ）、アデノウィルス、肝炎ウィル ス等（これらに限定されない）の有効な阻害方法の基礎を提供することが予想さ れる。

図面の簡単な記載 図１は、ＰＡＰモノクローナル抗体コンジ二ゲーション方法を示す。

図２は、ＰＡＰモノクローナル抗体コンジュゲートの精製状況を示す。

図３Ａおよび３Ｂは、（ａ）　Ｐ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートおよび（ｂ） 精製Ｐ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートのＨＰＬＣプロフィールに関する２つの 代表例を示す。

図４および図５は、モノクローナル抗体およびＰ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲー トの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。５％ＳＤＳゲルにおけるＣＤ１４抗原指向Ｆ 　１３ｍＡｂ、およびＦ１３−ＰＡＰコンジュゲート（精製の前後）、ＣＤ７抗 原指向Ｇ３．７−＋ｎＡｂ、　Ｇ３．７−ＰＡＰｍＡｂコンジュゲート（精製の 前後）、およびＣＤ５抗原指向ＴＩＯ１ｍＡｂ、Ｔｌ０Ｉ−ＰＡＰコンジュゲー ト（精製後）およびＣＤ４抗原指向Ｇ１７−２ｍＡｂＳＧ１７−２ｍＡｂ：＋ン ジュゲート（精製後）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルをクーマシー・ブルーで染色し た。分子量マーカーの位置を左方に示す。

図６は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製（ｐ２４生成）およびこれらの 細胞の増殖（３Ｈ−ＴｄＲ取り込み）に対する非コンジュゲートＰＡＰの効果を 示す。

図７は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製（ｐ２４生成）およびこれらの 細胞の増殖（’Ｈ−ＴｄＲ取り込み）に対するＰＡＰ抗−ＣＤ５（ＴＩＯＩ）コ ンジュゲートの効果を示す。

図８は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製（ｐ２４生成）およびこれらの 細胞の増殖（”Ｈ−ＴｄＲ取り込み）に対するＰＡＰ抗−ＣＤ７（Ｇ３．７）コ ンジュゲートの効果を示す。

図９は、抗ＣＤ１９とは反応しないヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製（ｐ ２４生成）ｉ：：対するＰＡＰ−抗ＣＤ１９（Ｂ４３）（７）効果を示す。

図１０は、ヒ）ＣＤ４＋ＴＩ［ＢＩ］！１ニオケルＨＩ　Ｖ複製（ｐ２４生成） およびこれらの細胞の増殖（”Ｈ−ＴｄＲ取り込み）に対するＰＡＰ抗−ＣＤ４ （Ｇ１７−２）コンジュゲートの効果を示す。

図１１Ａおよび１１Ｂは、ＣＤ３に対するｍＡｂにより活性化してＨＩＶ−１Ｈ 生を誘発した、２名のＨＩ　Ｖ−１感染患者から得られた末梢血液リンパ球（Ｐ 　Ｂ　Ｌ）におけるＨＩＶ複製（ｐ２４生成）に対するＰＡＰ抗−ＣＤ４（Ｇ１ ７−２）コンジュゲートの効果、およびこれらの細胞の増殖（”Ｈ−ＴｄＲ取り 込み）に対するＰＡＰ−抗ＣＤ４の効果を示す。

図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＤ３に対するｍＡｂでＰＢＬを刺激してＨＩＶ−１ 生成を誘発させた後、２名のＨＩＶ−１感染患者から得られたＰＢＬ中２２日間 におけるＨＩＶ−１生成（ｐ２４生成）に対するＰＡＰ−抗ＣＤ４による連続２ ２日の処置および５日の処置の効果を示す。

図１３は、ＰＡＰ、ＰＡＰ−抗ＣＤ５およびＰＡＰ−抗ＣＤ７によるＣＤ４＋Ｔ 細胞での抗ＨＩＶ活性の合成グラフを示す。

図１４は、（ａ）ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートが、ＨＩＶ−１複製阻害濃度よ りもかなり高い濃度で標的細胞に対して細胞毒性を示すこと、および（ｂ）それ らは、５　ｘ　１０　’ｐＭ以下の濃度では正常な骨髄幹細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、 ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）に対し毒性を示さないことを示す。

発明の詳細な記載 本発明は、好ましい態様におけるは乳類細胞でのＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−１１ ，５ＴＶＳＨＩＶ−１お）びＨＩＶ−２などのＬｉＦロウイルスを含む、は乳類 ウィルスの細胞内複製の阻害に有用なＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートに関するも のである。本発明のＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートは、ヒト単核細胞およびＴ細 胞におけるＨＩＶ複製の阻害を非常に特異的に指向する。

本発明は、検出可能な細胞毒性を伴わずには乳類細胞においてウィルス複製を阻 害し得る抗ウイルス抗体コンジュゲートを提供する。本発明の目的に関して、検 出可能な毒性とは、３Ｈ−ロイシン取り込み検定、クロノジニニック（ｃｌｏｎ ｏｇｅｎｉｃ）検定または３Ｈ−チミジン（”Ｈ−ＴｄＲ）取り込み検定により 測定され得るかまたは観察される細胞生長阻害レベルを指す。この明細書に記載 されている抗ウイルス抗体コンジュゲートは、一般に、抗体が抗ウイルス性蛋白 質に共有結合または架橋結合しているモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および抗ウ イルス性蛋白質コンジュゲートを意味する。さらに具体的には、本発明の抗体コ ンジュゲートは、標的細胞上の表面活性抗原と反応するモノクローナル抗体また はその抗原結合性フラグメントを包含する。モノクローナル抗体またはその抗原 結合性フラグメントは、蛋白質合成を阻害し得るフィトラッカ・アメリカーナか ら抽出された精製蛋白質である、アメリカやまごぼう抗ウイルス性蛋白質（ＰＡ Ｐ）に共有結合している。

本発明のＰ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートを用いることにより、ウィルス複製 の少なくとも５０％は、細胞複製の阻害を伴わずに阻害され得る。本発明のＰＡ Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートは、細胞複製の阻害を伴わずに約１５０ｐＭ未渦の濃 度でのＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートの使用によりウィルス複製を少なくとも５ ０％阻害し得る。我々は、ＣＤ５、ＣＤ７またはＣＤ４に対するｍＡｂにコンシ ュゲートしたＰＡＰを用いて、３５ｐＭ未滴の濃度で細胞複製の阻害を伴わずに ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製の約５０％阻害を観察した。一実施態様 では、ＨＩＶ複製の５０％阻害の誘発に約２００倍多い非コンジュゲートＰＡＰ が必要とされる。

本発明において、Ｐ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートは、は乳類細胞、例えば単 核細胞、ヒトＴ細胞、上皮細胞、脳細胞などの表面または表皮上の抗原との反応 性を示す。ここに記載されているウィルス感染細胞の「表面抗原」は、例えば、 ウィルス感染とは無関係に発現される細胞上の正常な分化抗原、および細胞が特 定ウィルスに感染したときのみ、上記細胞により発現またはそれらに随伴する抗 原を構成する、ウィルス感染細胞に伴う抗原を指す。

ＰＡＰ供給源および精製 ＰＡＰは、フィトラッカ・アメリカーナから得られる蛋白質合成を阻害し得る蛋 白質である。この蛋白質は、約３００００の分子量を有し、単一ポリペプチド鎖 を含む。ＰＡＰは、フィトラッカ・アメリカーナから抽出され、公知方法、例え ばＪ、Ｄ、アービン、ファーマコロノー・アンド・セラビューティックス　２１ ：３７１−３８７（１９８３）、ウラクン、「アンティボディー」、ｌ、２４７ −２６２（１９８８）に記載された方法に従い精製され得る。ＰＡＰは、網状赤 血球のりホソームの使用によりポリフェニルアラニン合成に対する強い阻害活性 を有する。ＰＡＰは、フィトラッカ・アメリカーナの葉からだけでなく、その種 子からも抽出され得る。

モノクローナル抗体 モノクローナル抗体の一般的な製造技術は、ひ臓リンパ球と骨髄−次層ようの悪 性細胞（ミエローマ）との融合に基づ＜［Ｃ，ミルスタイン、サイエンティフィ ック・アメリカン、２４３．６６（１９８０）］。この方法により、リンパ球お よびミエローマ・セルラインの両方の特徴を有する単一融合細胞ハイブリッドま たはクローンから生じるハイブリッド・セルラインが得られる。リンパ球（抗原 としてヒツジ赤血球によりプライム（ｐｒｉｍｅ）された動物から採取された） と同様、融合ハイブリッドまたはハイブリドーマは、抗原と反応する抗体（免疫 グロブリン）を分泌する。さらに、ミエローマ・セルラインと同様、ハイブリッ ド・セルラインは不死である。具体的には、接種動物に由来する抗血清が、同一 状態では再生され得ない抗体の変化しやすい混合物である場合、ハイブリドーマ により分泌された単一タイプの免疫グロブリンは、抗原、多数の抗原性分子基礎 構造または決定部分（エピトープ）を有する複合分子上の唯一の抗原決定基に特 異的である。例えば、抗原が蛋白質である場合、抗原決定基は、全蛋白質分子内 の多くのペプチド配列の一つであり得る。それ故、単一抗原に対して産生された モノクローナル抗体は、それらの形成を誘導した決定基により互いに区別され得 る。しかしながら、所定のクローンにより産生された抗体は全て等しい。さらに 、好ましいハイブリドーマ・セルラインは同一状態で再生され得、インビトロま たはインビボで容易に伸長され、非常に高濃度でモノクローナル抗体を製造する 。本発明で使用される構想されたモノクローナル抗体は、マウスに由来し、ヒト 抗体またはキメラ抗体「半分マウス」および「半分ヒト」であり得る。

上記で示した通り、本発明は、ウィルス感染は乳類細胞、例えば単核細胞および ヒトＴ細胞、上皮細胞などの表面に存在する抗原との反応性を示すモノクローナ ル抗体を使用する。本発明に有用なモノクローナル抗体は、よく知られているハ イブリドーマ融合技術を用いて製造される［Ｇ、コーラ−およびＣ，ミルスタイ ン、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー」、６：５１１（１９ ７６）、Ｍ、シュルマン等、［ネイチャーＪ２７６　：２６９（１９７８）］。

本発明で使用され得るモノクローナル抗体には、霊長動物細胞表面抗原、ＣＤ２ 、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ４５およびＢＰ− ５０に対して指向したものがある。抗体の例としては、レドベター等、「モレキ ュラー・イミュノロジー」、２６．１３７−１４５（１９８９）、ウラクン等、 「ジャーナル・オブ・イミュノロジー」、１４０．２１０３−２１１１（１９８ ８）、「ブラッド」、６６：６２７−６３５（１９８５）、レドベター等、「モ レキュラー・イミュノロジー」、２４：１２５５−１２６７（１９８７）に記載 された、ＣＤ１４に対するＭａｂ　Ｆ　１３、ＣＤ７に対する６３．７およびＣ Ｄ５に対するＴ１０１、ＣＤ４に対するｍ、ＡｂＧ１７−２がある。

イムノトキシンの製法および特徴 （ａ）特異性試験 Ｆ１ａ、Ｇ３，７、Ｔ１０１およびＧ１７−２並びに本発明で使用される他のモ ノクローナル抗体の結合反応性は、間接的免疫蛍光検定法により評価され得る。

この検定では、試験される細胞を、懸濁液中またはスライド上で過剰のｍＡｂと 接触させる。適当なインキュベーション期間後、細胞を洗浄して、それらから非 結合ｍＡｂを除去し、結合抗体を、蛍光性標識、例えばフルオレセイン・イソチ オシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させた抗マウス抗体により検出した。

Ｔ細胞および単核白血球へのモノクローナル抗体ＰＡＰコンジュゲートの結合は 、「ダブル・サンドイッチ」型免疫蛍光検定法により測定され得る。この検定法 では、検定される細胞を（ａ）　Ｐ　Ａ　Ｐ−モノクローナル抗体コンジュゲー ト、（ｂ）アメリカやまごぼう抗ウイルス性蛋白質に対する抗血清、および（Ｃ ）抗血清に対する蛍光性標識抗体と連続的にインキュベーションする。標識細胞 は、適当な基底値控除（ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）技術を用いた細胞蛍光測定 技術により分析され得る。

（ｂ）　Ｐ　Ａ　Ｐ−モノクローナル抗体コンジュゲートの細胞毒性の評価。

細胞を適当な生理学的培地に懸濁し、抗体−ＰＡＰコンジュゲートを所望の濃度 になるまで加えることにより、細胞はモノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲー トと接触し得る。抗体−ＰＡＰコンジュゲート処理の後、ａ）蛋白質合成阻害検 定、ｂ）トリパン・ブルー生存能力検定、Ｃ）ウラクン等、「キャンサー・リサ ーチＪ４５：６９−７５（１９８５）、ウラクン等、オートロガス・ボーン・マ ロー・トランスプランテーンヨン・ブロシーデインダス・ファースト・インター ナショナル・シンポジウム、４４９−４５３（１９８５）、ウラクン等、「ジャ ーナル・オブ・イミュノロジーＪ１３４：２０１０−２０１６（１９８５）に記 載された制限希釈によるクロノジエニック検定、およびｄ）”Ｈ−チミジン取り 込みによる細胞ＤＮＡ合成の測定法を用いることにより、細胞の生存率が測定さ れ得る。また、細胞の生存率に対する効果は、フィトヘマグルチニン刺激リンパ 球条件培地（ＰＨＡ−ＬＣＭ）またはインターロイキン−２含をもしくは不含有 ＰＨＡにより補足され得るアルファーＭＥＭまたはＲＰＭ１１１６４０培地（グ ランド・ブレ、ニューヨーク）に細胞を懸濁することにより測定され得る。次い で、細胞懸濁液の試料を２週間培養し、ウラクン等、「ジャーナル・オブ・イミ ュノロジーＪ、１３４：２０１０−２０１６（１，９８５）に記載されたトリパ ン・ブルー染料排除検定法を用いた顕微鏡により生存し得る細胞を全て検出する か、または細胞複製の尺度として細胞を３Ｈ−チミジンで標識する。

（Ｃ）ウィルス複製に関するＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートの評価 。

非感染細胞、例えば単核白血球および新鮮なＣＤ４＋Ｔ細胞を、モノクローナル 抗体−ＰＡＰコンジュゲートで処理する。次いで、処理した細胞の試料をＨＩＶ に暴露する。ウィルスを約２時間吸収させた後、ウィルス不含有細胞を除去し、 モノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲートを含む新しい培地を加える。細胞懸 濁液の試料を５〜８日間培養した時点で、上清を除去し、抗原捕獲ＥＬＩＳＡ検 定においてＨＩＶｐ−２４活性の存在について検定する。別法として、ＨＩＶ− １感染患者から得られたＰＢＬを、モノクローナル抗体−ＰＡＰコンジュゲート で処理し、細胞増殖およびＨＩＶ複製の誘発に有効な薬剤、例えばＣＤ３に対す るモノクローナル抗体またはミトゲン、例えばフィトヘマグルチニンなどで活性 化する。ＨＩＶ複製の活性化に必要とされる薬剤の量は、薬剤のタイプにより約 ０．１〜１．　Ｏｕｇ／ｍｌの範囲で変化する。ＣＤ３に対するｍＡｂの場合、 約０．５〜２．０Ｈｇ／ｍｌが要求される。ここに記載されている通り、ＣＤ３ に対するｍＡｂ（Ｇ　１９−４）を用いることにより、細胞を活性化し、ＨＩＶ −１を複製および産生させた。細胞懸濁液の試料を５日間ないし数週間培養した 時点で、上清を除去し、抗原捕獲ＥＬＩ　ＳＡ検定においてＨＩＶｐ−２４活性 の存在について検定する。

治療用途 本発明方法を用いた患者の処置では、治療有効量のモノクローナル抗体およびＰ ＡＰコンジュゲート組成物を投与する。本発明の明細書において、「処置」およ び「治療」などの語は、既存疾患の予防または減毒を指す。抗体−Ｐ　Ａ　Ｐ組 成物は、常用の医薬的に許容し得る注射投与用非経口的賦形剤により製剤化され 得る。これらの賦形剤は、本質的に非毒性および非治療的物質、例えば水、食塩 水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、バンク溶液などを含む。また、抗体− ＰＡＰコンジュゲート製剤は、少量のアジュバント、例えば等強性、生理学的お よびｐＨ安定性を維持するための緩衝剤および保存剤を含み得るものと理解され る。好ましくは、抗体−ＰＡＰコンジュゲートは、約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌ の範囲の濃度でアグリゲートおよび他の蛋白質を実質的に含まない精製形態で製 剤化される上記製剤により示されている通り、Ｐ　、Ａ　Ｐ−モノクローナル抗 体コンジュゲートは非経口投与され得る。ウィルス疾患の症例によっては、ＰＡ Ｐ−モノクローナル抗体コンジュゲートは、局所的、静脈内的またはエーロゾル 形態で送達または投与され得る。ＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートを 静脈内投与する場合、それらはポーラスとして、または連続法で送達され得る。

投与される抗体−ＰＡＰコンジュゲート製剤の用量は、患者および患者の病歴に より異なる。しかしながら、用量は、患者の感染細胞におけるウィルス複製のか なりの部分、通常は約９０％より高い割合でこれを阻害するのに充分な量とすべ きである。例えば、ＰＡＰ−抗ＣＤ７またはＰＡＰ−抗ＣＤ４は、２．０−２０ Ｈｇ／ｍｌに相当する１１０−１Ｏ０ｐ範囲で使用された場合、ＨＩＶ複製を９ ０％より高い率で阻害する。この濃度の達成に必要とされる用量は、次式により 計算され得る。用量（マイクログラム）＝７０Ｘ２（２０）Ｘ重量（ｋｇ）／　 １００００７０ｋｇの患者の場合、これは１０−１００マイクログラムになる。

特に、これらの用量は、検出可能な毒性を伴わずにヒト以外の霊長動物により耐 容される量よりも５０−５００倍小占い。従って、本発明の構想による治療上有 効であると考えられるＨＩＶ感染した成人の場合の用量は、約１０ないし１００ マイクログラムの範囲であり、固相ＥＬＩＳＡにより測定された、所定の患者に おけるＰ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートの血しょう半減期に基づく頻度で投与 される。用量は、上式を用いることにより、子供に対して適量の抗体−ＰＡＰコ ンジュゲートを提供すべく容易に調節され得る。

以下、詳細な実施例により本発明をさらに説明する。

実施例 ■、モノクローナル抗体 ＰＡＰとのコンジュゲートにおいて下記モノクローナル抗体を使用した。

アンドリュー等、「ロイコサイト・タイピング：ヒユーマン・ロイコサイト・デ ィフエレンシエーション・アンティゲンズ・ディチクテッド・パイ・モノクロー ナル・アンティボディーズＪ、３９ｇ−４０４頁（パーナート等編集、１９８４ 年）に記載されたモノクローナル抗体Ｆ−１３゜ ウラクン等、「ジャーナル・オン・イミュノロジー」１４０．２１０３−２１１ ０１９８５）およびウラクン等、「ジャーナル・オン・イミュノロジー」、１３ ５．３５１６−３５２２（１９８５）に記載され、１９８９年７月２０日付けで ＡＴＣＣ第ＨＢ１０１８２号としてＡＴＣＣに寄託されたモノクローナル抗体Ｇ ３，７゜ロイストン等、「トランスプランテーション・プロシーディンゲス」、 １３．７６１−７６６（１９８１）、ウラクン等、「ブラッド」、６９．３６１ −３６６（１９８７）に記載されたモノクローナル抗体Ｔ１０１゜ ウラクン等、「イミュノロジー」、１３４．２０１０−２０１６（１９８５ＸＡ ＴＣＣ第ＨＢ８９０３号）に記載されたモノクローナル抗体Ｂ４３゜ レドベター等、「モレキュラー・イミュノロジー」、２４．１２５５−１２６１ （１９８７）に記載され、１９９０年３月２９日付けでＡＴＣＣに寄託されたモ ノクローナル抗体Ｇ１７−２゜Ｉｆ、ＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲー トの合成。

アメリカやまごぼう抗ウイルス性蛋白質（ＰＡＰ）は、ハウストン等による「ジ ャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー」、２５．９６０Ｈ１９８３） に記載されている通り、真核生物リポソームの６ＯＳサブユニツトを触媒的に不 活化し、アメリカやまごぼう（フィトラッカ・アメリカーナ）の春葉から単離さ れ得る１本鎖ポリペプチド毒素（分子量３００００）である。ＰＡＰは、アービ ン、ファーマコロジー・アンド・セラビューティックス　２１：３７１−３８３ （１９８３）、ウラクン、「アンティボディー」、１．２４７−２６２（１９８ ８Ｘこの開示を引用して説明の一部とする）、ウラクン、「ジャーナル・オン・ イミュノロジー」、１３４．２０１０−２０１６（１９８５）の記載に従い精製 される。

ＰＡＰ−ｍＡｂコンジニゲートの製法を図１に示す。モノクローナル抗体Ｆ１３ （ＩｇＧ＋、抗ＣＤ　１４）、Ｇ３．７（ＩｇＧ＋、パン−Ｔ、抗ｐ４１　ＣＤ ７）、Ｔ　１０１　（ＩｇＧ２ａ、パンーＴ１抗ＣＤ５）［Ｉ。

ロイストン等、「ジャーナル・オン・イミュノロジー」、１２５．７２５（１９ ８０）］および］Ｇ１Ｇ１７−２Ｉ、抗ＣＤ４）［Ｊ、レドベター等、「モレキ ュラー・イミュノロジー」、２４．１２５５（１９８７）〕を、ウウラクン「ア ンティボディー」（前出）による記載に従い、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２ −ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いたジスルフィド結合によ りアメリカやまごぼう抗ウィルス、性蛋白質（ＰＡＰ）！：結合させた。カチオ ン交換クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣにおけるサイズ排除クロマトグラフ ィーにより（ウィルス、「アンティボディー」、前出）、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジ ュゲートを精製した。精製されたＰＡＰを、３０分間３倍モル過剰の２−イミノ チオランと反応させることにより、ウラクン、「アンティボディー」（前出）に より報告された通り第１級アミノ基と反応後、反応性水硫基を毒素部分へ導入し た。ウラクン等、ヒユーマン・チューマー・アンティゲンズ・アンド・スペシフ ィック・チューマー・セラビー、ＵＣＬＡシンボジア・オン・モレキュラー・ア ンド・セルラー・バイオロジー、９９巻（メツガーおよびミッチェル編集、アラ ンＲ，リス、インコーホレイテッド、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８８） 参照。まず、ｍＡ　ｂ（５ｍｇ／　ｍｌ）を３倍モル過剰のＳＰＤＰ（ＤＭＳＯ 中６４ミリモル濃度の新たに調製された溶液、１５０ミリモルＮａＣ１を含む４ ０ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中１＝１０に希釈）と３０分間 室温で反応させた。ジチオピリジル基を含む修飾ｍＡｂを、ＰＡＰ／ｍＡｂ＝３ ／１のモル比で遊離水硫基を含む修飾ＰＡＰと混合し、−夜４℃でインキュベー ションした。このコンシュゲージタン反応後、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートを 、ウラクン等、「ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メディシンＪ：１６ ３．３４７−３６８（１９８６）、ウラクン、「アンティボディー」、前出、お よびウラクン、「ヒニーマン・チューマー・アンティゲンズ・アンド・スペシフ ィック・チューマー・セラピーＪＴＪＣＬＡシンポジア・オン・モレキュラー・ アンド・セルラー・バイオロ゛ジー（前出）における記載に従い、コンピュータ ー制御式ＨＰＬＣシステム（システム・ゴールド・ベックマン）を用いたサイズ 排除およびカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ＰＡＰ−ｍＡｂコ ンジュゲート、Ｆ１３−ＰＡＰ、Ｇ３．７−ＰＡＰＳＴＩＯＩ−ＰＡＰおよびＧ １７−２−ＰＡＰを、ウラクン、「アンティボディー・イミュノコンジュゲーツ ・アンド・ラジオファーマシューティカルズ、ＶＩＪ、２４７−２６２頁（１９ ８８）による記載に従い、ＨＰＬＣにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによ り非コンジュゲー）ＰＡＰから分離し、カチオン交換クロマトグラフィーにより 非コンジュゲート・モノクローナル抗体から分離した。

精製されたＰ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（図４）お よび定量的ＨＰＬＣ（図２および３）により純度および組成についてインビトロ 評価した。非還元的条件下でのポリアクリルアミド・ゲル電気泳動において遊離 ＰＡＰは検出されなかった。遊離抗体汚染をゲル走査により評価すると、１％未 満であった。ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲート製品は、１分子のモノクローナル抗 体に結合した１個または２個のＰＡＰ分子を含む種類のコンジュゲートに対応す る、１ｇＱｋＤａおよび２１０ｋＤａの蛋白質バンドを生じた。ＰＡＰコンジュ ゲートは主として１分子のｍＡｂに結合した２分子のＰＡＰにより構成されるた め、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートにおける２　１０　Ｋｄａの平均分子量を用 いてモル濃度を計算した。

■、標的細胞。

無細胞翻訳系定、細胞蛋白質合成、クロノジェニック増殖検定、細胞への３Ｈ− チミジン取り込み、および各抗原を発現する標的細胞を用いたＨＩＶ生産に対す る阻害作用により、精製ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートをリポソーム阻害活性に 関してインビトロ評価した。標的として、血液から得られたＨＩＶ感染Ｕ９３７ 単核白血球およびＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した。対照には、（ａ）非感染標的細胞 （Ｕ９３７、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｎａ１ｍ−５、骨髄細胞等）および（２）対照抗 体コンジュゲートまたは非コンジュゲートＰＡＰで処理された標的細胞が含まれ た。ヒト単核白血球セルラインＵ９３７（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ１５９３号）を使用 した。

１Ｖ、ＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートの細胞毒性の評価。

Ｄ、Ｂ、カウリー等、「バイオケミストリー」、１７．２６４８（１９７９）の 方法によりラット肝臓リポソームおよびポリウリジル酸を使用する無細胞翻訳系 での蛋白質合成不活化能力について、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートを評価した （表１）。表１の結果は、ＰＡＰが無細胞翻訳を阻害すること、およびＣＤ１９ 、ＣＤ１４またはＣＤ７に対するｍＡｂを含むＰＡＰ−モノクローナル抗体コン ジュゲートが無細胞翻訳の阻害能力を保持していることを示す。ＣＥＭ、Ｕ９３ ７および骨髄幹細胞に対するこれらのＰ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートの細胞 型特異的細胞毒性を、ウラクン、「キャンサー・リサーチ」、４５：６９−７５ （１９８５）、ウラクン、「ジャーナル・オン・イミュノロジー」、１３５：３ ５１６−３５２２（１９８５）に記載されたクロノジェニック検定または系列希 釈クロノジェニック検定を用いて分析した。

我々は、２つの相異なる相補的検定システムを用いて細胞複製を測定することに より、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートの細胞毒性作用を測定した。まず、ＤＮＡ 合成および細胞の短期複製を測定するトリチウム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）取 り込み検定を用いて、標的細胞の細胞毒性を測定した。この検定システムは、細 胞阻害作用の検出に対して非常に高感度であるが、一時的阻害対永続的阻害（す なわち、殺細胞）間の区別はできない。従って、長期クロノジェニック検定を用 いて、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートによる処理後の実際の細胞死を測定した。

両検定システムにより、ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートによるＨＩＶ複製阻害に 関する顕著な「治療指数」を立証する相補的データが得られた［治療指数は、Ｈ ＩＶ複製を９０％（または５０％）阻害するＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートの濃 度対細胞複製を９０％（または５０％）阻害するＰ　Ａ　Ｐ−ｃＡｂコンジュゲ ートの濃度の割合として定義される］（表３参照）。

表３および図７．８および１０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞複製の５０％阻害に６５０ｐ ＭのＰＡＰ−抗ＣＤ５．６００ｐＭのＰＡＰ−抗ＣＤ７および２０００ｐＭのＰ ＡＰ−抗ＣＤ４が必要とされたことを示す。図９は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とは反応し ない、１ｌ１００ｐ以下の濃度のＰＡＰ−抗ＣＤ１９が、ＣＤ４＋Ｔ細胞複製の ２０％を越える阻害を誘発しなかったことを示す。下記に示されている通り（７ 項）、ウィルス複製の５０％阻害に必要とされるＰＡＰ−モノクローナル抗体コ ンジュゲートの量と比較すると、細胞複製の５０％阻害に必要とされるレベルよ りも、少なくとも２５倍、好ましくは少な（とも１００倍低いＰＡＰ−モノクロ ーナル抗体コンジュゲートのレベルが観察された。さらに、図１４に示されてい るクロノジェニック細胞阻害試験を、表３および図７．８および１０に示されて いるＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートによるウィルス阻害と比較する と、ＰＡＰ−モノクローナル抗体コンジュゲートは、細胞複製の９０％阻害に必 要とされるコンジュゲートのレベルよりも少な（とも１００倍低いレベルで実質 的にすべてウィルス複製の阻害を呈した。

図１４は、ＰＡＰ−ｖｎＡｂコンジュゲートの選択性を示す。例えば、ＰＡＰ− 抗ＣＤ５は、ＣＤ５＋　ＣＥＭ（ＣＤ４＋Ｔセルライン）、ｇＭＡＣ２８（正常 なＣＤ４＋Ｔ細胞クローン）およびＦ６５（正常なＣＤＪ＋Ｔ細胞クローン）細 胞のクロノジェニック生長を阻害するが、ＣＤ５−細胞、例えばＵ９３７単核白 血球または正常骨髄始原細胞ＢＦＵ−ＥＳＣＦＵ−ＧＭまたはＣＦＵ−ＧＥＭＭ は阻害しない。すなわち、これらの結果は、ＰＡＰ−ｍＡｂコンンユケートが、 ｍＡｂの指向する抗原を発現する標的細胞に対して特異的な細胞毒性を有するこ とを示す。しかしながら、標的細胞複製の選択的阻害に必要とされるＰＡＰ−ｍ Ａｂ濃度は、ＨＴＶ複製の阻害に必要とされる濃度よりもかなり高い（表２．３ 、図７．８）。

標的細胞におけるＨ　Ｉ　Ｖ複製の阻害に必要とされる用量でのＰＡＰ−ｍＡｂ コンジュゲートは、正常骨髄始原細胞集団を含む非標的細胞に対して最小限の毒 性しか示さないか、または無毒性である（ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートのｍＡ ｂ部分により認識される関連した標的抗原の欠如により定義される）ことが予想 される。それは、（１）ＣＤ５抗原陰性であるＣＤ３７、ＣＦＵ　ＧＭ、ＢＦＵ −ＥまたはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞の４０％未満の阻害が、最高濃度のＰＡＰ−抗 ＣＤ５コンジュゲートにより観察され、（２）ＣＤ７抗原陰性であるＣＤ３７ま たはＢＦＴ、’−Ｅ細胞の２０％未満の阻害が最高濃度のＰ、ＡＰ−αＣＤ７コ ンジニゲートにより観察されたためである（図１４参照）。５０％未満の阻害レ ベルは、この検定システムでは「阻害無し」とあまり異ならない［ウラクン等、 「キャンサー・リサーチ」４５．６９−７５（１９８５）］。特に、試験された 最高濃度、すなわち５　Ｘ　１０　’ｐＭのＰＡＰ−抗ＣＤ５またはＰＡＰ−抗 ＣＤ７は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｐ２４生成の阻害により測定された、ＨＩ■ 複製の＞９０％阻害に必要とされるＰＡＰ−αＣＤ５またはＰＡＰ−αＣＤ７の 濃度よりも５０−５００倍高い（図７．８．１３参照）。すなわち、図１４は、 Ｐ　Ａ　Ｐ−ｍＡｂコンジュゲートが、高い濃度で使用された場合、関連した表 面抗原を発現する標的細胞に対して細胞毒性を有することを示している。例えば 、ＰＡＰ−αＣＤ５は、５ｘ１０’ｐＭ７−ＣＤ５抗原陽性ＣＥＭ、ＧＭＡＣ２ ８およびＦ６５細胞の増殖を≧９０％阻害し、ＰＡＰ−αＣＤ７は、５×１０’ ｐＭでｃＤ７抗原陽性ＣＥＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭおよびＣＦＵ−ＧＭ細胞の増殖 を５０−７０％阻害した。この濃度は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製の＞ ９０％阻害に必要とされるコンジュゲートの濃度よりも５０−５００倍高い（図 ７．８．１３参照）。１５０００ｐＭ（７）ＰＡＰ−抗ＣＤ４は、骨髄始！細胞 ＢＦｔＪ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭおよびＧＥＭＭによるコロニー形成の各々２％、５ ．５％および６％阻害しか誘発しなかった（データは示さず）。この濃度は、Ｃ Ｄ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１複製の９０％阻害に必要とされるＰＡＰ−抗Ｃ Ｄ４コンジュゲートの濃度よりも約３０００倍高い（図１０）。

図７は、ＰＡＰ−αＣＤ５コンジユゲートが、３　Ｘ　１０　”ｐＭでＣＤ４＋ Ｔ細胞における）（ＩＶ？Ｊ！製を＞９０％阻害することを立証している。この 濃度において、ＰＡＰ−αＣＤ５は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の短期複製（”Ｈ−チミジ ン取り込みにより測定された）（図７）、または全てＣＤ５表面抗原を発現する ＣＥＭ、ＧＭＡＣ２８およびＦ６５細胞の長期複製（クロノジェニック検定によ り測定された）を４Ｏ％またはそれ未満の割合で阻害した。

同様に、図８は、ＰＡＰ−αＣＤ７コンジユゲートが、３×１０２　ｐ　ＭでＣ Ｄ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製を９０％より高い割合で阻害することを示す。

この濃度において、それは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の短期複製の４０％を阻害し、全て ＣＤ７表面抗原を発現するＣＥＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭまたはＣＦＵ−ＧＭ細胞の 長期複製のく２０％を阻害した（図１４）。同様に、図１０は、ＰＡＰ−抗ＣＤ ４が、３０ｐＭでＣＤ４＋Ｔ［Ｈｌａｉ：おけるＨＩＶ−１複製（７）９０％＞ を阻害することを示している。この濃度において、それは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の短 期複製の２０％を阻害した。３０ｐＭのＰＡＰ−抗ＣＤ４では、ＣＦＵ−ＧＭ、 ＢＦＵ−ＥまたはＧＥＭＭの阻害は観察されなかった。これらの発見は、ＰＡＰ −ｍＡｂコンジュゲートが、非感染ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ複製または骨髄細胞 によるコロニー形成を阻害し得ることを説明している。

表１ 無細胞翻訳に対するＰＡＰ モノクローナル抗体コンジュゲート の阻害効果　ＩＣ，。（ｐＭ） Ｂ４３−ＰＡＰ　（抗ＣＤ１９）　２１Ｆ１３−ＰＡＰ　（抗ＣＤ１４）　１４ Ｇ３，７−ＰＡＰ　（抗ＣＤ７）　３９Ｇ１７−２−ＰＡＰ　（抗ＣＤ４）　２ ５無細胞翻訳に対するＰＡＰ抗体コンジュゲートの効果は、メツセンジャーＲＮ Ａを蛋白に翻訳する能力をもつヌクレアーゼ処理うさぎ網状赤血球溶解物からな る無細胞翻訳系中で還元条件下に分析した。蛋白合成はアルカリ抵抗性ＴＣＡ沈 澱物質への３Ｈ−ロイシンとり込みとして測定した。Ｉ　Ｃ５，＝蛋白合成を５ ０％阻害する濃度である。

Ｖ、Ｈｌ−１でインビトロ感染した単球およびＴ細胞中でのＨＩＶ産土に対する 、および感染患者から得たＴ細胞中でのＨＩＶ産止に対する、ＰＡＰ・モノクロ ーナル抗体コンジュゲート効果の評価。

ＨＩＶ−１にさらした後ＰＡＰモノクローナル抗体コンジュゲートで処理したＴ 細胞およびＵ９７単球を、ＨＩＶ−１抗原捕獲酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩ ＳＡ）を用いて培養上清中のＨＩＶｐ２４（ｇａｇ）抗原の産主についてモニタ ーした。（ゼネティック・システムズ・コーポレーション）ＰＡＰ−ｍＡｂコン ジュゲートを抗ＨＩＶ活性について５１ｏｇ用量範囲にわたり分析した。非感染 ＣＤ４”Ｔ細胞を殺さずにＣＤ４’″Ｔ細胞中のウィルス複製を有効に中止させ る亜致死性用量を研究した。

１０％ＦＣ３含有ＲＰＭＩ中で培養したＵ９３７細胞をベレット化し、ついで新 鮮な１０％ＦＣ５含有ＲＰＭＩ中にＩ×１０５細胞／ｍ細胞７変ｌ再けんだくし だ。ＰＡＰまたはＰＡＰ−ｍＡｂを、同じ培地中で目的最終濃度の４倍濃度に新 製した。細胞けんだく液０．１ｍｆおよび薬剤または培地０．０５ｍ１を、９６ ウエル平底プレートの８複製ウエルの各々に加えた。翌日、ＨＩＶ−１を系列希 釈ＬＡｖ−１として０．０５ｍＡ’を各ウェルに加えた。感染１日後、細胞を２ 回洗浄し未吸着ウィルスを除去した。指示薬剤濃度でＰＡＰまたはＰＡＰ−ｍＡ ｂコンジュゲートを含む新鮮培地を各ウェルに加えた。感染７日後、各ウェルか ら上清Ｑ、１ｍＡをとり、抗原捕獲ＥＬＩＳＡ（ゼネティック・システムズ・イ ンコーホレイテッド）によりＨＩＶｐ２４　（ｇａｇ）抗原について分析した。

種々の濃度で処理した細胞を表２に示す。表２はＰＡＰおよびＰＡＰ−抗ＣＤ１ ４の両者ともＨＩＶ感染Ｕ９３７単球細胞中でのＨＩＶ−Ｄ２４産生を阻害する こと、およびＰＡＰ−抗ＣＤ１４コンジュゲートはより有効で１５０ｐＭという 低濃度でＨＩ　Ｖ複製を完全抑止することを示す。

正常人から得たＣＤ４−Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１複製に対するＰＡＰおよびＰＡ Ｐ−ｍＡｂの効果の研究の場合、フィコール密度勾配遠心により新鮮な人血から 分離した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）２５ｘ１０’を１０％正常ひと血清（ＮＨ３ ）含有ＲＰＭ１１６４０培地２５ｍＡ中培地２元 ７℃で１時間インキュベートして付着単球を除いた。

ついで、非付着ＰＢＬを、１０％ＮＨＳおよび下記モノクローナル抗体の組合わ せ（各１０　ｕｇ／ｍＡ）含有培地中、氷上で３０分間インキュベートした。Ｇ １０．１（αＣＤ８）　、ＦＣ−１　（αＣＤｌ６）およびＩＦ５（αＣＤ２０ ）。抗体処理細胞にベル・フリーズ３−４週うさぎ補体を最終希釈率１：４で加 えた。細胞を補体と３７℃で１時間インキュベートし、フィコール上で死亡細胞 を除去した。生存細胞を１０％ＮＨ８および３μｇ／ｍＡフィトヘマグルチニン （ＰＨＡ）含有ＲＰＭＩ培地中で一夜インキユベートした。

ついで、細胞を培地で洗浄してＰＨＡを除き、２Ｘ１０’細胞を種々の濃度のＰ ＡＰまたはＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲート含有培地または培地単独Ｑ．５ｍＡに 再けんだ（し、３７℃で４時間インキュベートした。ついで、ＨＩＶ−１のＬＡ Ｖ−１分離株５ｘｌＯ’組織培養感染容量．。（Ｔｃ　Ｉ　Ｄ，）を容管に加え た。

２時間後、細胞をＰＢＳ中で４回洗浄して非細胞ウィルスを除き、細胞を培地２ ．ＯｍＪに再けんだ＜　（ＩＸＩＯ’細胞／ｍ細胞７九Ｏついで、Ｑ．１ｍＡ’ 中Ｉ×１０５細胞を、種々のｆｉ度のＰＡＰ，ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートま たは培地単独０．１ｍＡおよびＩＬ−２　（リンホカルトーＴ）４単位／ｍＡを 含む９６ウエル丸底プレートの４複製ウエルの各々に加えた。

７日目に上清を２複製プレートの壁からとり、定量的ｐ２４抗原捕獲ＥＬＩ　Ｓ Ａ　（ＧＳＣ）でＨＩＶｐ２４　（ｇａｇ）を分析した。

ｐ２４産生阻害率％を下式により計算した。

非処理ＣＤ４”Ｔ細胞からの上清はｐ２４を１　２　５　５ｎｇ／ｍ７含有して いた。ＰＡＰコンジュゲートとＣＤ５、ＣＤ７またはＣＤ４に対するｍＡｂ，お よび陰性対照であるＣＤ１９に対するｍＡｂへのＰＡＰコンジュゲートの抗ＨＩ Ｖ活性測定結果を表３および図７−１０、１３に示す。

約５０００ｐＭ濃度の非コンジュゲートＰＡＰによるＣＤ，４”Ｔ細胞の前処理 では、ＨＩＶ−１のＬＡＶ−１分離株で感染した細胞中でのＨＩＶ−１産生を約 ５０％阻害したが、このことはＰＡＰの抗ウイルススペクトルがＨＩＶ−１を含 むことの１つの延拠となった。（表３、図６）Ｔ細胞に反応性をもつＰＡＰ・抗 ＣＤ５　（Ｔ１０１）、ＰＡＰ・抗ＣＤ７　（Ｇ３．７）およびＣＤ４”Ｔ細胞 に特異的反応性をもつＰＡＰ・抗ＣＤ４　（Ｇ１７−２）はＣＤ４”Ｔ細胞中で のウィルス複製阻害に高活性であった（図７、８および１０、並びに表３）。対 照のＢ細胞と反応するがＴ細胞とは反応しない対照Ｂ４３／ＣＤ１９含有ＰＡＰ は、ＣＤ４”Ｔ細胞中でのＨＩＶｐ２４産生阻害に要するＰＡＰ・抗ＣＤ７濃度 より約５０％阻害度でＰＡＰ・抗ＣＤ４濃度より約５０００倍高濃度である（図 ８、１０および表３）１３７５ｐＭ　（図９、表３）でもＣＤ４″丁細胞中での Ｈ１〜′複製の５０％阻害を示さなかった。注目すべきことに、抗ＣＤ５、抗Ｃ Ｄ７または抗ＣＤ４とコンジュゲートしたＰＡＰのＨＩＶ複製阻害濃度は、細胞 複製阻害に要する濃度より著しく低かった（図７、８、１０，１３および表３） 。

ＨＩＶ−１感染したひとの末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）中でのＨＩＶ−１ｐ２ ４産生に対するＰＡＰ・抗ＣＤ４コンジニゲートの効果の研究の場合、ＰＢＬを 新鮮面からフィコール密度勾配遠心で分離し、１０％正常ひと血清（ＮＨＳ）含 有ＲＰＭ１１６４０培地中にｌＸｌ０’細胞／ｍｌで再けんだくした。ついで、 種々の濃度のＰＡＰ・抗ＣＤ４コンジュゲート１ｍＩをＰＢＬの複製誘発とＨＩ Ｖ−１産生活性化のためＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ＩｇＧ１、Ｇ１９ ．４、ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ９５３６．１９８７年９月１５日寄託）１μｇ／ｒｎ ｌおよびＩＬ−２（エレクトロ・ヌクレオエックス）４単位／ｍｌと共に含むウ ェルプレートの２複製ウエルの各々に、１、ＱｍＡ中ｌＸｌ０’細胞を加えた。

５日目に、各処理綿゛胞けんだ（液０．７ｍＡを丸底９６ウエルプレートに移し 、Ｑ、１ｍｌｍｌジトリチル化チミジンュー・イングランド・ヌクレア）１．０ μＣ４／ウエルでラベルし、６時間後セルノ１−ベスターで収集した。

７日目に、ウェルから上清をとり、定量的ｐ２４抗原捕獲ＥＬＩＳＡ（ゼネティ ック・システムズ）でＨＩＶ−１ｐ２４濃度を分析した。ｐ２４産主の阻害率％ は下式により計算した。

２人の感染患者からのＰＢＬ中でのＨＩＶ−１産生阻害に対する抗ＣＤ４ｍＡｂ とコンジュゲートしたＰＡＰの効果を図１１に示す。

図１１は、ＣＤ３に対するｍＡｂＧ１９．４によるＨＩＶ感染患者ＰＢＬの処理 ではＨＩＶ−１産生を誘発することを示す。ドナーＺ６およびＺ８からの抗ＣＤ ３活性化ＰＢＬ　（ＰＡＰ−ｍＡｂＣＤ４非処理）の上清中のｐ２４濃度はそれ ぞれ０．４と６．６ｎｇ／ｍｌであった。しかし、約０．５　ｐＭ濃度のＰＡＰ ・抗ＣＤ４はＨＩＶ−１複製（ｐ　２４）を５０％阻害した。約５ｐＭ濃度のＰ ＡＰ・抗ＣＤ４はｐ２４産生をほぼ１００％阻害したが患者ＰＢＬの細胞複製を 阻害しなかった。

図１２は、２人の患者の抗ＣＤ３活性化ＰＢＬに対するＰＡＰ・抗ＣＤ４　（５ ，ＯｐＭ）の抗ＨＩＶ効果は、第５日に細胞からＰＡＰ・抗ＣＤ４を洗い出した 場合でも少な（とも２２日続くことを示す。

これらの知見は、アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白のモノクローナル抗体コン ジュゲートが、細胞複製の阻害を伴わずに、モノクローナル抗体が指向する対応 標的表面抗原をもつ細胞中でのＨＩＶ産生の選択的阻害に使用できることを示す 。注目すべきことに、ＰＡＰ・抗ＣＤ４はＨＩＶ−１でインビトロ感染した正常 細胞中でのＨＩＶ−１複製阻害が強力であるだけでなく、患者ＰＢＬ中でのＨＩ Ｖ−１産生阻害も強力であり、効果は少なくとも数週間続（（図１１および１２ ）。ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートはマウスで約１６−１８時間、ひと以外の霊 長類で６−１０時間のインビボ半減期をもつが、これに対してＰＡＰの半減期は ５−１０分であり、またＰＡＰの有効濃度の少なくとも２００倍低い非毒性濃度 でＨＩＶ−１産生阻害に有効である。

Ｕ９３７単球細胞中でのＨＩＶ複製阻害を起すには、非コンジュゲートＰＡＰが ３ｘｌＯ’ｐＭ必要なのに対しＰＡＰ・抗ＣＤ１４は１５０ｐＭ以下で有効であ った（表２）。ＣＤ４“Ｔ細胞中でのＨＩＶ複製の５０％阻害には、抗ＣＤ５に コンジュゲートしたＰＡＰでは３２ｐＭが必要であり（図７）　、ＰＡＰ・抗Ｃ Ｄ７では６ｐＭの濃度が必要であり（図８）　、ＰＡＰ・抗ＣＤ４では１ｐＭの 濃度が必要であった（図１０および表３）。対照的に、ＨＩＶ複製の５０％阻害 に非コンジュゲートＰＡＰでは５０００ｐＭの濃度が必要であった（図６および 表３参照）。すなわち、ＨＩＶ複製阻害にＰＡＰ単独より２５−５０００倍低い ＰＡＰ−ｍＡｂコンジュゲートしか必要でない（図８．１０および表３）。比較 として、Ｂ細胞に特異的であるためＣＤ４”Ｔ細胞と反応しない対照Ｐ　Ａ　Ｐ 　−ｍＡｂコンジュゲートであるＰＡＰ・抗ＣＤ１９は、１３７５ｐＭの高濃度 でＣＤ４”Ｔ細胞の増殖も阻害せず、ＨＩＶ複製も阻害しなかった（表３、図９ ）。これらの結果は、ＣＤ４”ｉＢ胞と反応するｍＡ　ｂ　ｉ：　Ｐ　Ａ　Ｐを コンジュゲートすることにより、ＰＡＰはＣＤ４′″細胞中でのＨＩＶ複製阻害 を選択的に標的化することができることを示す。図１１および１２の結果は、Ｐ ＡＰ・抗ＣＤ４コンジュゲートがＨＩＶ−１感染患者からのＰＢＬ中でのＨＩＶ −１産生阻害にも極めて強力で持続性であることを示す。

表２ ＰＡＰ・抗ＣＤ１４または非コンジュゲートＰＡＰで処理したひとＵ−９３７単 球細胞中でのＨＩＶ−１産生阻害 ＰＡＰ−αＣＤ１４コンジユゲート　ＨＩ　Ｖ　ｐ　２４＋ウエル数処理したＵ ９３７細胞　混入 濃度（ｐＭ） ＰＡＰ単独 濃度（ｐＭ） なし　４／８ ３、３　Ｘ　１０３３／８ 表３ ＣＤ５、ＣＤ７またはＣＤ４に対するＡｂとコンジュゲート後のＰＡＰの抗ＨＩ Ｖ活性の向上 ＣＤ４＋Ｔ細胞　抗ＨＩＶ阻害用量５゜抗増殖阻害用量５゜処理　濃度（ｐＭ） 　８度（ｐＭ） ＰＡＰ　５，０００　＞２００．０００ＰＡＰαＣＤ５　３２　６５０ ＰＡＰａＣＤ７　６　６００ ＰＡＰαＣＤ４　１　２．０００ ＰＡＰαＣＤ１９　＞１．３７５　＞１．３７５阻害用量、。＝ＣＤ４＋Ｔ細胞 増殖（３Ｈ−ＴｄＲとりこみ）を５０％阻害するに要する濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞 中でのＨＩ　Ｖ複製（ｐ２４抗原産生）を５０％阻害するに要する濃度。

試験した中で最高のＰＡＰのＣＤ１９コンジユゲート用量は１゜３７５ｐＭであ ったため、この対照コンジュゲートのＩＤ５ｏは測定できなかった。ＰＡＰの抗 増殖ＩＤ、ｏもまた試験最高用量（２×１０１０５ｐを超える。ＰＡＰαＣＤ１ ９はＣＤ４＋Ｔ細胞と反応しないので陰性対照として選んだ。

−工 先（知時閏（勾 ＦＩＧ、　３Ａ ）Ｉ〕〉＼イ夛のＥ縛ｒｔ％ｎ（づウ−）ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　１０ ＰＡＰ−αＣＤ４　（９Ｍ） ＦＩＧ、１１＾ ＰＡＰ−αＣＤ４　（９Ｍ） ＦＩＧ、ＩＴＢ 朝ト慢日婁女 ＦＩＧ、　１２Ａ 培養ｅ％ 口Ｇ１４ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）検出可能な細胞毒性を伴わずにウイルス複製を阻害する効力がある、モノ クローナル抗体とアメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白のコンジュゲートを含み、 上記コンジュゲートの抗体がウイルス感染ほ乳類細胞の表面に存在する抗原に対 して反応性を有するものである、抗ウイルス組成物。 （２）上記コンジュゲートが、約１５０ｐＭ未満の抗体・アメリカやまごぼう抗 ウイルス蛋白コンジュゲート濃度を用いてウイルス複製を少なくとも５０％阻害 するものである、請求項１記載の組成物（３）上記コンジュゲートが、細胞複製 を５０％未満しか阻害しないコンジュゲート濃度で実質的に全ウイルス複製を阻 害する、請求項１記載の組成物。 （４）上記コンジュゲートが、細胞複製の５０％阻害に必要なコンジュゲート濃 度より少なくとも２５倍低い濃度で、ウイルス複製を少なくとも５０％阻害する 、請求項１記載の組成物。 （５）上記コンジュゲートが、ウイルス複製を５０％阻害するに必要な非コンジ ュゲートＰＡＰ濃度より少なくとも２５倍低い濃度でウイルス複製を少なくとも ５０％阻害する、請求項１記載の組成物（６）ウイルス感染細胞がひとＴ細胞で ある、請求項１記載の組成物。 （７）Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項６記載の組成物。 （８）抗体がモノクローナル抗体Ｇ３．７／ＣＤ７である、請求項６記載の組成 物。 （９）Ｔ細胞がレトロウイルス感染Ｔ細胞を含む、請求項７記載の組成物。 （１０）レトロウイルスがＨＩＶまたはＨＴＬＶである、請求項９記載の組成物 。 （１１）抗体がモノクローナル抗体Ｔ１０１／ＣＤ５または１０．２／ＣＤ５で ある、請求項７記載の組成物。 （１２）抗体がモノクローナル抗体Ｇ１７−２／ＣＤ４である、請求項７記載の 組成物。 （１３）組成物が、約３５ｐＭ未満の抗体・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白 コンジュゲート濃度でＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害する、請求項６記載の 組成物。 （１４）レトロウイルス感染ほ乳類細胞中でのウイルス複製を阻害する効力があ る、モノクローナル抗体とアメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白のコンジュゲート を含み、上記コンジュゲートの抗体がウイルス感染ほ乳類細胞の表面に存在する 抗原に対して反応性を有するものである、抗ウイルス組成物。 （１５）ほ乳類細胞がひとＴ細胞である、請求項１４記載の組成物。 （１６）ほ乳類細胞がひと単球である、請求項１４記載の組成物。 （１７）細胞表面抗原がＣＤ１４であり、ＣＤ１４に対する抗体がモノクローナ ル抗体である、請求項１６記載の組成物。 （１８）単球が免疫機能障害疾患原因ウイルス感染単球を含む、請求項１６記載 の組成物。 （１９）疾患がＨＩＶによる、請求項１８記載の組成物。 （２０）抗体・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートが約１５０ｐ Ｍ未満の濃度で細胞複製の阻害を伴なわずにＨＩＶを有効に終息させる、請求項 １９記載の組成物。 （２１）Ｔ細胞がひとＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項１５記載の方法（２２）Ｔ 細胞がレトロウイルス感染細胞を含む、請求項２１記載の組成物。 （２３）レトロウイルスがＨＩＶまたはＨＴＬＶである、請求項２２記載の組成 物。 （２４）組成物が約３５ｐＭ未満の抗体・アメリカやまごぼう抗ウイルスコンジ ュゲート濃度でＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害する、請求項２３記載の組成 物。 （２５）ＨＩＶ感染細胞を含む細胞培養物を、上記ＨＩＶ複製の阻害に有効な量 の抗体とアメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートの組成物で処理する ことを含む、ほ乳類細胞中でのＨＩＶ複製阻害法。 （２６）さらに、細胞を抗体とアメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白のコンジュゲ ートで処理するため細胞増殖とウイルス複製を誘発するに有効な剤の一定量で刺 激する段階を含む、請求項２５記載の方法。 （２７）剤がＣＤ３抗体である、請求項２６記載の方法。 （２８）抗体がＣＤ１４、ＣＤ７、ＣＤ５もしくはＣＤ４またはこれらの混合物 に対するモノクローナル抗体である、請求項２５記載の方法。 （２９）細胞培養物がほ乳類Ｔ細胞のものである、請求項２５記載の方法。 （３０）細胞培養物がほ乳類Ｔ細胞のものである、請求項２５記載の方法。 （３１）抗体・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートが、約１５０ ｐＭ未満の抗・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白濃度を用いて検出可能な細胞 毒性を伴なわずにＨＩＶ複製を少なくとも５０％阻害する、請求項２５記載の方 法。 （３２）抗体・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートが、実質的に 全ウイルス複製を阻害し、上記抗ウイルス蛋白コンジュゲート濃度が１５０ｐＭ 未満である、請求項２５記載の方法。 （３３）抗体がモノクローナル抗体Ｇ３．７／ＣＤ７または結合がＧ３．７／Ｃ Ｄ７で実質的にブロックされまたＧ．３．７／ＣＤ７の結合をブロックする他の 抗体である、請求項２５記載の方法。 （３４）抗体がモノクローナル抗体Ｔ１０１／ＣＤ５または１０．２／ＣＤ５ま たは結合がＴ１０１／ＣＤ５もしくは１０．２／ＣＤ５で実質的にブロックされ またＴ１０１／ＣＤ５もしくは１０．２／ＣＤ５の結合をブロックする他の抗体 である、請求項２５記載の方法。 （３５）抗体がモノクローナル抗体Ｇ１７−２／ＣＤ４または結合が１７−２で 実質的にブロックされまたＧ１７−２／ＣＤ４の結合をブロックする他の抗体で ある、請求項２５記載の方法。 （３６）抗体がモノクローナル抗体ｍＡｂＦ１３または結合がｍＡｂＦ１３で実 質的にブロックされまたｍＡｂＦ１３の結合をブロックする他の抗体である、請 求項２５記載の方法。 （３７）患者に１種またはそれ以上のモノクローナル抗体・アメリやまごぼう抗 ウイルス蛋白コンジュゲート組成物の治療有効量を投与することからなる、ＨＩ Ｖ感染患者の処置法。 （３８）さらに、細胞を抗体・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲー ト組成物で処理するため細胞増殖とＨＩＶ複製を誘発するに有効な剤の一定量で 患者のリンパ球を刺激する段階を含む、請求項３７記載の方法。 （３９）細胞増殖・ＨＩＶ複製剤がＣＤ３抗体である、請求項３８記載の方法。 （４０）患者が、治療有効量のモノクローナル抗体ｍＡｂＦ１３／ＣＤ１４・ア メリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートもしくはモノクローナル抗体Ｇ ３．７／ＣＤ７・アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートもしくはｍ ＡｂＴ１０１／ＣＤ５−ＰＡＰコンジュゲートもしくはｍＡｂＧ１７−２アメリ カやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲートまたはそれらの混合物を投与される 、請求項３７記載の方法。 （４１）ＨＩＶ−１感染患者の末梢血リンパ球を細胞増殖およびＨＩＶ複製の誘 発に有効な剤の一定量で刺激すること、および上記末梢血リンパ球を上記ＨＩＶ 複製を阻害するに有効な量の抗体アメリカやまごぼう抗ウイルス蛋白コンジュゲ ートを含む、ほ乳類細胞中でのＨＩＶ複製阻害法。 （４２）細胞増殖・ＨＩＶ複製剤がＣＤ３抗体である、請求項４１記載の方法。 （４３）細胞増殖・ＨＩＶ複製剤がフイトヘマグルチンである、請求項４１記載 の方法。 （４４）ＣＤ３抗体がＧ１９−４／ＣＤ３である、請求項４２記載の方法。