NO300691B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater Download PDF

Info

Publication number
NO300691B1
NO300691B1 NO902197A NO902197A NO300691B1 NO 300691 B1 NO300691 B1 NO 300691B1 NO 902197 A NO902197 A NO 902197A NO 902197 A NO902197 A NO 902197A NO 300691 B1 NO300691 B1 NO 300691B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
ligand
anthracycline
adm
conjugate
bombesin
Prior art date
Application number
NO902197A
Other languages
English (en)
Other versions
NO902197L (no
NO902197D0 (no
Inventor
Robert S Greenfield
Gary R Braslawsky
Lee J Olech
Takushi Kaneko
Peter A Kiener
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/353,729 external-priority patent/US5122368A/en
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of NO902197D0 publication Critical patent/NO902197D0/no
Publication of NO902197L publication Critical patent/NO902197L/no
Publication of NO300691B1 publication Critical patent/NO300691B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av nye antracyklin-ligand-konjugater. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremstilling av konjugater som omfatter minst ett antracyklinmolekyl bundet til et andre molekyl som reagerer med den utvalgte cellepopulasjon som skal fjernes, hvor antracyklinet er bundet til det cellereaktive molekyl via en 13-keto-acylhydrazonbinding.
Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen konjugeres antracyklinmolekylet via en linkerarm til en ligand, slik som epidermalvekstfaktor (EGF) eller bombesin, slik at antracyklinet blir bundet til linkeren via en syrefølsom acylhydrazonbinding i 13-ketostillingen til antracyklinet. Linkeren kan i tillegg inneholde en disulfid- eller tioeterbinding i sin struktur. Det syntetiseres acylhydrazonderivater av antracykliner som anvendes ved fremstillingen av konjugatene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Den syrefølsomme acylhydrazonbinding i konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen muliggjør frigjørelsen av antracyklin fra konjugatet i det sure eksterne eller interne miljø hos målcellen. Konjugatene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes i ligandmedierte legemiddel-avleveringssystemer for den fortrinnsvise dreping av en utvalgt populasjon av celler ved behandlingen av sykdom, slik som kreft og andre tumorer, ikke-cytocidale, virale eller andre patogene infeksjoner og autoimmunsykdommer.
Antracykliner er antibiotiske forbindelser som ut-viser cytotoksisk aktivitet. Undersøkelser har indikert at antracykliner kan virke ved å drepe celler ved hjelp av flere forskjellige mekanismer, inkludert: 1) interkalering av legemiddelmolekylene i DNA'en til en celle, og derved hemme DNA-avhengig nukleinsyresyntese; 2) fremstilling ved hjelp av legemidlet av frie radikaler som så reagerer med cellulære makromolekyler slik at det forårsakes skade på cellene, eller 3) interaksjoner mellom legemiddelmolekylene og cellemembranen [se f.eks. C. Peterson et al., "Transport And Storage Of Anthracyclines In Experimental Systems And Human Leukemia", i Anthracycllne Antlbiotics In Cancer Therapy, F.M. Muggia et al. (red.), s. 132 (Martinus Nijhoff Publishers 1982); se også N. R. Bachur, "Free Radical Damage", id. på s. 97-102]. Pga. deres cytotoksiske yteevne har antracykliner blitt brukt ved behandlingen av mange kreftformer, slik som leukemi, brystkar-sinom, lungekarsinom, ovarieadenokarsinom og sarkomer [Se f.eks. P.H. Wiernik, "Current Status Of Adriamycin And Daunomycin In Cancer Treatment", i Anthracycllnes: Current Status And New Developments, S. T. Crooke et al. (red.), s. 273-94 (Academic Press 1980)]. Vanlige brukte antracykliner omfatter adriamycin og daunomycin.
Også disse forbindelsene kan være anvendbare ved behandlingen av neoplasmer og andre sykdomstilstander hvor en utvalgt cellepopulasjon er søkt fjernet, er deres terapeutiske virkningsfullhet ofte begrenset av den doseavhengige toksisitet forbundet med administreringen. F.eks. ved behandlingen av tumorer omfatter typiske uheldige bivirkninger myelosuppresjon og kardiotoksisitet [se S. T. Crooke, "Goals For Anthracycline Analog Development At Bristol Laboratories", Anthracyclines; Current Status And New Developments, supra, på s. 11]. Forsøk er derfor blitt gjort ved behandlingen av tumorer på å for-bedre de terapeutiske virkningene av disse forbindelsene ved å binde antracyklinet til antistoffer rettet mot tumorassosierte antigener. På denne måte kan legemidlet avleveres eller "målrettes" mot tumorstedet, og dets toksiske bivirkninger på nor-male celler i kroppen kan reduseres. Immunkonjugater som består av antracyklinene adriamycin (ADM) eller daunomycin (DAU), bundet til polyklonale eller monoklonale antistoffer til tumorassosierte antigener, er kjent innen teknikken [se f.eks. J. Gallego et al., "Preparation Of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates With Anti-Tumour Activity", Int. J. Cancer, 33, s. 737-44 (1984) og R. Arnon et al., "In Vitro And In Vivo Efficacy Of Conjugates Of Daunomycin With Anti-Tumor Antibodies", Immunological Rev, 62, s. 5-27 (1982)].
Ved de hyppigst anvendte fremgangsmåter for festing av et antracyklin til et antistoff, har det vært utnyttet en binding i aminosukkerresten til antracyklinet. F.eks. har aminosukkeret blitt oksydert ved hjelp av natriumperjodatbe-handling og festet direkte til lysinrester på antistoffet via Schiff-basedannelse [se f.eks. E. Hurwitz et al., "The Covalent Binding Of Daunomycin And Adriamycin To Antibodies, With Retention Of Both Drug And Antibody Activities", Cancer Res., 35, s. 1182-86 (1975)]. Alternativt er antracykliner blitt bundet til antistoffer gjennom karbodiimid-mediert binding av aminosukkeret i antracyklinet til karboksylgrupper på antistoffer [se f.eks. E. Hurwitz et al., supra]. Og antracykliner har også blitt bundet til antistoffer ved å kryssbinde aminosukkeret i legemidlet og aminogrupper på antistoffet med glutaraldehyd [se f.eks. M. Belles-Isles et al., "In Vitro Activity Of Daunomycin-Anti-AlphaFetoprotein Conjugate On Mouse Hepatoma Cells", Br. J. Cancer, 41, s. 841-42 (1980)]. Undersøkelser med immunkonjugater hvor aminosukkerdelen i antracyklinmolekylet ble modifisert ved binding til antistoffet, indikerer imidlertid et tap av cytotoksisk aktivitet hos det konjugerte legemiddel [se f.eks. R. Arnon et al., supra, på s. 7-8]. I tillegg indikerer undersøkelser av antra-cyklinanaloger at modifikasjoner av antracykliner i deres aminosukker resulterer i en reduksjon av den cytotoksiske aktivitet hos legemiddelanalogen i forhold til opphavslege-midlet [se f.eks. K. Yamamoto et al., "Antitumor Activity Of Some Derivatives Of Daunomycin At The Amino And Methyl Ketone Functions", J. Med. Chem., 15, s. 872-75 (1972)].
Ytterligere andre immunkonjugater er blitt fremstilt hvor antracyklinet daunomycin er blitt bundet direkte til et antistoff i 14-karbonstillingen (C-14) til legemidlet. Den selektive cytotoksiske aktivitet av disse immunkonjugatene mot tumorceller var imidlertid ikke lett reproduserbare og ble entydig avdekket bare ved en konsentrasjon på 20 ug/ml [se J. Gallego et al., supra^ l.
I japansk patentsøknad nr. 274 658 beskrives konjugasjonen av et antracyklin med et antistoff via en 13-keto-acylhydrazonbinding. Denne konjugering ble utført ved å anvende fremgangsmåter som omfatter derivatisering av antistoffet og etterfølgende omsetning av derivatet med antracyklin. Disse fremgangsmåtene er ugunstige fordi derivatisering av antistoffet omfatter uønskede ikke-spesifikke reaksjoner,
og svært lave antracyklin/antistoff-forhold oppnås.
Ifølge den første fremgangsmåte ble antistoffet behandlet med karbodiimid i nærvær av hydrazin, hvorved man fikk et hydrazidantistoffderivat som så ble omsatt med antracyklinet slik at antracyklinet ble bundet direkte til antistoff strukturen. De resulterende immunkonjugater er imidlertid tilbøyelige til aggregering av antistoffmolekylene. Pga. at denne fremgangsmåten krever karboksylsyregrupper på antistoff-molekylet som er begrenset i antall, har dessuten disse immunkonjugatene lave antracyklin/antistoff-forhold (omtrent 1,1-1,3).
Den andre fremgangsmåte omfatter å omsette antistoffet med ravsyreanhydrid, hvorved man får et amidsyrederi-vat av antistoffet. Dette derivatet ble deretter omsatt med hydrazin, hvorved man fikk et antistoffhydrazidderivat som så ble omsatt med antracyklinet daunomycin. Denne andre fremgangsmåten er beheftet med den feil at omsetningen av anti-stof f derivatet med hydrazin er ikke-spesifikk, noe som fører til dannelsen av en blanding av forskjellige antistoffderi-vater i tillegg til det ønskede hydrazidderivat. Som angitt i japansk patentsøknad nr. 274 658 var således det molare forhold mellom antracyklin og antistoff svært lavt (omtrent 1, se den japanske patentsøknad, side 264, spalte 1). Se også euro-peisk patentsøknad med publikasjonsnr. 294 294, som beskriver konjugeringen av et C-13-hydrazonderivat av antracyklinet til karbohydratresten i et antistoff.
Endelig er andre antracyklinhydrazoner beskrevet i G.L. Tong et al., J. Med. Chem., 21. s. 732-37 (1978), T. Smith et al., J. Med. Chem., 21, s. 280-83 (1978) og R.T.C. Brownlee et al., J. Chem. Soc, s. 659-61 (1986). Se også US-patentskrift nr. 4 112 217 hvor det er beskrevet bis-hydrazoner av daunomycin og adriamycin.
I andre undersøkelser er antracykliner blitt bundet til bærere med høy molekylvekt, slik som dekstran eller poly-glutaminsyre, for å forsterke den cytotoksiske aktivitet og redusere toksisiteten av legemidlet [se f.eks. R. Arnon et al., supra, på s. 5, og E. Hurwitz et al., "Soluble Macro-molecules As Carriers For Daunorubicin", J. Rppl. Blochem., 2, s. 25-35 (1980)]. Disse bærerbundne antracykliner er også blitt kovalent bundet til antistoffer rettet mot tumorassosierte antigener for å danne immunkonjugater for målretning av det cytotoksiske legemiddel som er spesifikt for tumorceller. F.eks. har adriamycin blitt bundet til et slikt "anti-tumor"-antistoff via en karboksymetyl-dekstranhydrazid-bro hvor adri-amycinmolekylet ble bundet til et hydrazinderivat av karboksy-metyldekstran i C-13-karbonylsidekjeden til tetracyklinringen i adriamycinet, hvorved det ble dannet et hydrazon. Antistoffet ble så bundet til dekstranhydrazidderivatet med glutaraldehyd, hvorved det ble dannet et adriamycin-deks-antistoff-konjugat [se R. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies As Carriers For Immunotargeting Of Drugs", i Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, R.W. Baldwin et al.
(red.), s. 365-83 (1985) og E. Hurwitz et al., "A Conjugate Of Adriamycin And Monoclonal Antibodies To Thy-1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells In Vitro", Ann. N. Y. Acad. Sei., 417, s. 125-36 (1983)].
Anvendelsen av bærere medfører imidlertid visse ulemper. F.eks. er bærerholdige immunkonjugater ganske store i størrelse og fjernes hurtig av retikuloendotelialsystemet in vivo [se f.eks. R. 0. Dillman et al., "Preclinical Trials With Combinations And Conjugates Of T101 Monoclonal Antibody And Doxorubicin", Cancer Res., 46, s. 4886-91 (1986)]. Denne hurtige fjerning av de bærerholdige immunkonjugater kan være ufordelaktige for terapi fordi det kan hende at det konjugerte legemiddel aldri når sitt påtenkte virkningssted, dvs. den utvalgte gruppe av celler som skal drepes. I tillegg kan til-stedeværelsen av bæreren med den høye molekylvekt påvirke stabiliteten til immunkonjugatet negativt, og er påvist å redusere bindingsaktiviteten til antistoffet til konjugatet [se f.eks. M. J. Embleton et al., "Antibody Targeting Of Anti-cancer Agents", i Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, R. W. Baldwin et al. (red.), s. 323-24 (1985)]. Videre er det i undersøkelser med tumorceller ingen bevis for at de bærerholdige immunkonj ugater med høy molekylvekt er i stand til å lokalisere seg til tumorcellene in vivo. Sammenlign med C. H. J. Ford et al., "Localization And Toxi-city Study Of A Vindesine-Anti-CEA Conjugate In Patients With Advanced Cancer", Br. J. Cancer, 47, 35-42 (1983), som demonstrerer lokalisering av direkte konjugerte legemiddel/antistoff-konjugater til tumorceller in vivo.
Konjugeringen av antracykliner til antistoffer ved anvendelse av bestemte bindinger og bærere er således blitt beskrevet. Som redegjort for ovenfor medfører anvendelsen av disse immunkonjugatene klare ulemper, avhengig av den bestemte binding eller bærer som anvendes.
Visse ligand/toksin-konjugater er også blitt beskrevet. F.eks. beskrives i US-patentskrift 4 545 985 et eksotok-sinkonjugat hvor Pseudoznonas eksotoksin (PE) er bundet til EGF i et forhold på 1:2 for anvendelse mot celler med store antall EGF-reseptorer. EGF-ricin A- og EGF-difteritoksin-konjugater er også blitt laget [se f.eks. D. B. Cawley et al., "Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates: EGF-Ricin A Is A Potent Toxin While EGF-Diphtheria Fragment A Is Nontoxic", Cell, 22, s. 563-70 (1980) og N. Shimizu et al., "A Cytotoxic Epidermal Growth Factor Cross-Linked To Diphtheria Toxin A-Fragment", FEBS Letters, 118 (No. 2), s. 274-78 (1980)]. Videre har fusjonsproteiner av Pseudomonas eksotoksin blitt fremstilt ved å anvende proteiner, polypeptider og vekstfaktorer, slik som TGF-a, IL-2, IL-6 og CD4 [se f.eks. I. Pastan et al., "Novel Cytotoxic Agents Created By The Fusion Of Growth Factor And Toxin Genes", Fourth Internatl. Con-ference On Monoclonal Antibody Immunoconjugates For Cancer,
s. 36 (30. mars - 1. april, 1989), H. Lorberboum et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 1922-26 (1988), V. K. Chaudhary et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84, s. 4538-42 (1987), C. B. Siegall et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, s. 9738-42
(1988) og V. K. Chaudhary et al., Nature, 335, s. 369-72
(1988)]. Og det er blitt laget et fusjonsprotein av difteritoksin og a-melanocyttstimulerende hormon [se J. R. Murphy et al., "Genetic Construction, Expression And Melanoma-Selective Cytotoxicity Of A Diphtheria Toxin-Related a-Melanocyte-Stimu-lating Hormone Fusion Protein", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, s. 8258-62 (1986) og US-patentskrift nr. 4 675 382]. Ligandkonjugater omfattende proteintoksiner kan imidlertid
vise seg å være inununogene i eksenogene verter.
I tillegg er slike antracykliner som ADM eller DAU blitt bundet kjemisk til visse protein- eller polypeptid-ligander, slik som transferrin [se britisk patentsøknad nr. 2 116 979 A] og melanotropin [se J. M. Varga et al., "Melanotropin-Daunomycin Conjugate Shows Receptor-Mediated Cytotoxicity For Cultured Murine Melanoma Cells", Nature, 267, s. 56 - 58 (1977)]. Se også PCT-patentsøknad WO 88/00837 (EGF bundet via en polymer bærer til et cytotoksisk stoff, slik som daunomycin) og US-patentskrifter nr. 4 522 750 og 4 590 001 (transferrin bundet til henholdsvis vinca-alkaloid og platina).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny kjemi for binding av cytotoksiske antracyklinmolekyler via en linkerarm til et molekyl som kan reagere med en utvalgt målcellepopulasjon som skal drepes. Dette cellereaktive molekyl er en ligand, slik som bombesin eller EGF.
Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen ble de nye ADM-HZN-mellomproduktene bundet kovalent til tiolerte ligander, slik som bombesin, transferrin eller EGF, noe som resulterte i festingen av antracyklinet til liganden via en linkerarm. Antracyklinet festes til linkeren via en acylhydrazonbinding dannet i C-13-stillingen i antracyklinet. Disulfid- eller tioeterbinding kan i tillegg være til stede i linkerstrukturen. Som det helt klart fremgår av denne utførel-sesformen, tilveiebringes det hydrazonderivater av antracykliner som kan anvendes ved fremstillingen av konjugatene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Antracyklin-ligand-konjugatene som her er beskrevet, kan ha et forhold mellom antracyklin og ligand på minst 1, og beholde både reseptorbindende aktivitet og cytotoksisk legemiddelaktivitet. Den syrefølsomme hydrazonbinding som er til stede på stedet for festing av antracyklinet til linkerarmen i disse konjugatene, og i tillegg disulfid- eller tioeterbin-dingene i linkerarmen i den foretrukne utførelsesformen av oppfinnelsen, er ideelt egnet for frigivelsen av aktivt legemiddel under reduserende og sure betingelser, slik som de som man typisk støter på i en celle, f.eks. i lysosomvesikler. Konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes i farmasøytiske preparater, slik som de som omfatter en farmasøytisk effektiv mengde av minst ett konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Preparatene kan anvendes ved fremgangsmåter for selektiv avlevering av cytotoksiske legemidler til en utvalgt populasjon av målceller som det er ønsket å fjerne, samt fremgangsmåter for behandling av et pattedyr på en farmasøytisk akseptabel måte med en farmasøytisk effektiv mengde av preparatene .
Det er fordelaktig at konjugatene, de farmasøytiske preparatene og fremgangsmåtene som her er beskrevet, tilveiebringer en nyttige måte å målrette cytotoksiske antracyklin-legemidler mot en utvalgt populasjon av celler fortrinnsvis for dreping av disse målcellene ved behandlingen av sykdommer, slik som kreft og andre tumorer, ikke-cytocidale virus- eller andre patogene infeksjoner, og autoimmune sykdommer. Fig. 1 viser i skjematisk form syntesen av det nye ADM-HZN-hydrazonderivat anvendt ved fremstillingen av immunkonjugatene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fig. 2 viser i skjematisk form syntesen av immun-kon jugatene ifølge én utførelsesform av denne oppfinnelse hvor en ligand først ble tiolert under anvendelse av enten SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat) eller 2-IT (2-imino-tiolan), og den tiolerte ligand ble så omsatt med ADM-HZN, hvorved et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen med en hydrazonbinding i 13-keto-stillingen til ADM og en disulfidbinding i linkerarmen, ble dannet. Fig. 3 viser i skjematisk form syntesen av et immunkonjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen hvor det nye ADM-HZN-derivatet reduseres og så omsettes med en SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrat)-behandlet ligandstoff, hvorved det dannes et immunkonjugat med en linkerarm med en tioeterbinding i strukturen. Fig. 4 viser den kjemiske struktur av a) et bombesin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen, b) et EGF-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen og c) et transferrin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen. Fig. 5 viser to HPLC-kromatografer av cys-bombesin, kromatografert på henholdsvis en reversfase-C-18-kolonne og en ionebytter-CX-300-kolonne. Hver kromatografering ble utført ved 220 og 280 nm. Denne figuren viser renheten av cys-bombe-sinpreparatet anvendt til å konstruere et bombesin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen. Fig. 6 viser et massespektrum av cys-bombesin-ADM-konjugatet fremstilt ifølge oppfinnelsen. Fig. 7 viser i grafisk form en kompetitiv bindings-analyse på Swiss-3T3-celler, hvor <125>I-GRP ble inkubert med økende konsentrasjoner av et cys-bombesin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen, cys-bombesin eller GRP, og inhibering av <125>I-GRP-binding til cellene ble målt. Denne analysen viste retensjonen av bindingsaktivitet ved hjelp av cys-bombesin-ADM-konjugatet for bombesinreseptorer på cellene. Fig. 8 viser i grafisk form cytotoksisiteten til et cys-bombesin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen mot SVT2-celler, under anvendelse av en <3>H-tymidin-inkorporerings-analyse. Konjugatet utviste en større styrke sammenlignet med fritt ADM eller ADM-HZN mot cellene. Fig. 9 viser i grafisk form cytotoksisiteten til et cys-bombesin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen mot HCT116-celler, under anvendelse av en <3>H-tymidin-inkorpore-ringsanalyse. Fig. 10 viser i grafisk form cytotoksisiteten til et cys-bombesin-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen mot Swiss-3T3-celler, under anvendelse av en <3>H-tymidin-inkorpore-ringsanalyse. Fig. 11 er et HPLC-kromatografi som viser renheten av et EGF-ADM-konjugatpreparat fremstilt ifølge oppfinnelsen. Fig. 12 viser i grafisk form en kompetitiv bindings-analyse på A431-celler, hvor <125>I-EGF ble inkubert med økende konsentrasjoner av et EGF-ADM-konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen eller EGF, og inhibering av 12<5>I-EGF-binding til cellene ble målt. Denne analysen viste retensjonen av bindingsaktivitet ved hjelp av EGF-ADM-konjugatet for EGF-reseptorer på cellene.
For at den her beskrevne oppfinnelse skal bli forstått mer fullstendig, er den følgende nærmere beskrivelse gitt.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater. De cytotoksiske antracyklinene kan anvendes i farmasøytiske preparater for avlevering til en utvalgt populasjon av celler som det er ønsket-å fjerne, ved behandlingen av sykdommer T slik som kreft og andre tumorer, ikke-cytocidale virus- eller andre patogene infeksjoner og autoimmune sykdommer. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremstilling av antracyklinkonjugater som omfatter minst ett antracyklinmolekyl bundet til et molekyl som reagerer med en utvalgt cellepopulasjon som søkes fjernet, hvor antracyklinet er bundet til det cellereaktive molekyl via en 13-keto-acylhydrazonbinding. Det cellereaktive molekyl er en ligand, slik som bombesin eller EGF.
Ifølge en foretrukket utførelsesform omfatter oppfinnelsen fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater som består av en ligand, slik som et polypeptid eller en peptid-ligand, som reagerer med én eller flere reseptorer forbundet med celleoverflaten til en utvalgt cellepopulasjon, hvor liganden har minst ett antracyklinmolekyl bundet til sin struktur. Antracyklinet er kovalent bundet til peptidet ved hjelp av en linkerarm som er festet til antracyklinet i 13-ketostillingen til antracyklinet via en acylhydrazonbinding.
Konjugatene kan ifølge oppfinnelsen fremstilles på en trinnvis måte ved hjelp av den innledende dannelse av et nytt antracyklin-hydrazon-derivat som så omsettes med et protein eller en ligand med en passende spesifisitet [se f.eks. R. R. Hardy, "Purification And Coupling Of Fluorescent Proteins For Use In Flow Cytometry", i Handbodk. Of Experimental Immunology, volum 1: Immunochemistry, D. M. Weir et al. (red.), s. 31.4-31.12 (4. utg. 1986) for en omtale av konvensjonelle anti-stof f koblingsteknikker og J. M. Varga et al., supra, for fremstillingen av ligandkonjugater]. Lengden av linkerarmen som forbinder antracyklinet med den cellereaktive bestanddel i konjugatene kan variere bare punktet for festing av linkeren til antracyklinet er i form av et acylhydrazon i C-13-stillingen til antracyklinet. Linkerarmen kan i tillegg inneholde en annen binding, slik som en disulfid-, tioeter-, amid-, karbamat-, eter- eller esterbinding, langs dens lengde mellom punktene for festing fra legemidlet til det cellereak-
tive molekyl.
Antracyklinene som omfattes av konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan være hvilket som helst antracyklin som inneholder en ketogruppe i 13-karbonstillingen (C-13). Slike antracykliner omfatter, men er ikke begrenset til, adriamycin, daunomycin, detorubicin, karminomycin, idarubicin, epirubicin, esorubicin, 4'-THP-adriamycin, AD-32 og 3'-de-amino-3'-(3-cyan-4-morfolinyl)-doxorubicin [se A. M. Casazza, "Experimental Studies On New Anthracyclines", i Adriamycin; Its Expanding Role ln Cancer Treatment, M. Ogawa et al.
(red.), s. 439-52 (Excerpta Medica 1984)].
Det skal forstås at det cellereaktive molekyl hvortil antracyklinet er bundet i konjugatet, kan være hvilket som helst molekyl som binder seg til eller reagerer med cellepopulasjonen som søkes fjernet. Slike molekyler omfatter, men er ikke begrenset til, proteiner med høy molekylvekt (generelt større en 10 000 dalton), proteiner med mindre molekylvekt (generelt mindre enn 10 000 dalton), polypeptid- eller peptidligander.
Det skal også forstås at uttrykket "ligand" omfatter, slik det her er brukt, ethvert molekyl som binder seg spesifikt til en reseptor forbundet med celleoverflaten til en utvalgt målcellepopulasjon. Foretrukne ligander som kan anvendes for å danne antracyklin-ligand-konjugatene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, protein-, polypeptid- eller peptidligander, slik som transferrin, EGF og bombesin.
Det cellereaktive molekyl, det vil si en ligand, i konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen virker således til å avgi antracyklinmolekylene til den bestemte cellepopulasjon som liganden reagerer med. Ettersom tumorceller, slik som kar-sinomer, fortrinnsvis uttrykker visse reseptorer ved høy tett-het, slik som EGF-reseptoren, vil likeledes en ligand, slik som EGF, binde seg til og avlevere sitt antracyklin til karsi-nomceller.
Frigjørelse av legemidlet innenfor eller på stedet for den bestemte cellepopulasjon som liganden reagerer med, resulterer i preferansedreping av disse bestemte celler. Det er således åpenbart at konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved behandlingen av hvilken som helst sykdom hvor en bestemt cellepopulasjon søkes fjernet, idet cellepopulasjonen har en celleoverflatereseptor som-muliggjør binding av konjugatet. Sykdommer som foreliggende konjugater er anvendbare for omfatter, men er ikke begrenset til, kreft og andre tumorer, ikke-cytocidale virus- eller andre patogene infeksjoner, slik som AIDS, herpes, CMV (cytomegalovirus), EBV (Epstein Barr Virus) og SSPE (subakutt sklerosepanencefalitt) og reumatoid artritt.
Uten å være bundet av teori, antas det at de ligand-bundne antracyklinmolekylene, dvs. i form av konjugatet fremstilt ifølge oppfinnelsen, avleveres til målcellene som skal drepes via ligandspesifisiteten og så kan komme inn i cellen via det samme endocytiske spor som fører til internalisering av membranbundne ukonjugerte ligander [se f.eks. I. Pastan et al., "Pathway Of Endocytosis", i Endocytosis, I. Pastan et al.
(red.), s. 1-44 (Plenum Press 1985)]. Når de først er inne i cellen, smelter de endocytiske vesikler som inneholder konjugatet, sammen med primære lysosomer, slik at det danner sekundære lysosomer [se f.eks. M. J. Embleton et al., supra, på s. 334] . Ettersom antracyklinmolekylene er bundet til ligandbestanddelen i konjugatet via syrefølsomme acylhydrazon-bindinger, resulterer eksponering av dette konjugatet mot syremiljøet i de endocytiske vesikler og lysosomene i fri-gjørelsen av antracyklinet fra konjugatet. Videre antas det frigjorte antracyklin å være et forholdsvis umodifisert legemiddel som kan gi full cytotoksisk aktivitet. Den syreføl-somme hydrazonbinding av konjugatet er således svært fordelaktig for frigjørelsen av det cytotoksiske legemiddel i målceller, noe som øker cytotoksisiteten til konjugatet mot disse cellene. Alternativt kan hydrazonbindingen spaltes under sure og reduserende betingelser i det umiddelbare miljø utenfor eller som omgir målcellene, f.eks. på stedet til en tumor, og det frigjorte legemiddel kan tas opp av tumorcellene.
Konjugatene og fremgangsmåten for deres fremstilling er eksemplifisert ved hjelp av foretrukne utførelsesformer hvor antracyklinet, adriamycin, ble konjugert til forskjellige ligander.
Først ble et nytt adriamycinhydrazonderivat syntetisert i^en totrinns reaksjon. Det heterobifunksjonelle reagens SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat) fikk reagere med hydrazin, hvorved det ble dannet et 3-(2-pyridylditio)-propionylhydrazid og hydrazidet ble så omsatt med adriamycin-hydroklorid (ADM-HC1), hvorved det ble dannet et nytt acylhy-drazonderivat av ADM, inneholdende en pyridylbeskyttet disul-fidrest. En syrekatalysator, slik som trifluoreddiksyre, kan anvendes til å lette dannelsen av hydrazon. Det dannede derivat ble betegnet adriamycin-13-{3-(2-pyridylditio)propionyl}-hydrazonhydroklorid (ADM-HZN) (se fig. 1).
Ifølge en utførelsesform ble ADM-HZN-derivatet omsatt med hvilket som helst av ligandene bombesin, EGF eller transferrin, idet liganden først var blitt derivatisert slik at den hadde tiolgrupper. I tilfellet med bombesin, ble en cystein-rest innført i aminoenden til peptidet for å tilveiebringe en reaktiv sulfydrylgruppe for konjugering med ADM-HZN. I tilfellet med murin EGF, ble polypeptidet omsatt med SPDP for å innføre en reaktiv sulfydrylgruppe i aminoenden i molekylet for konjugering med ADM-HZN. I tilfellet med transferrin, ble proteinet først omsatt med 2-IT for å innføre reaktive tiolgrupper på proteinstrukturen. I hvert tilfelle ble den tiolerte ligand så omsatt med ADM-HZN slik at det ble dannet et antracyklin-ligand-konjugat ifølge oppfinnelsen med en linker mellom liganden og legemidlet, hvor linkeren var festet til C-13-stillingen i hvert antracyklin gjennom en acylhydrazonbinding. I tillegg inneholdt linkeren en disulfidbinding i strukturen (se fig. 2 og 4). Syntesen av det nye adriamycinhydrazonderivat hvor det ovenfor beskrevne ADM-HZN ble ytterligere behandlet med reduksjonsmidlene DTT (ditiotreitol) eller tri-butylfosfin, hvorved 13-{3-(merkaptopropionyl)}adriamycinhydrazon ble fremstilt (se fig. 3). Dette derivatet ble så omsatt med en ligand som f. eks. hvortil maleimidgrupper var blitt festet, f.eks. ved omsetning av liganden med SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidofenyl)butyrat). Som vist i fig. 3 ble det dannet et immunkonjugat med en linkerarm festet ved hjelp av en hydrazonbinding til C-13-stillingen i hvert ADM, og som også hadde en tioeterbindingsom del av festingen til antistoffet. Det er således åpenbart at linkerarmen som forbinder legemidlet og liganden, kan bestå av flere bestanddeler og bindinger, bare disse bindingene omfatter den syrefølsomme hydrazonbinding i 13-ketostillingen i antracyklinet.
Acylhydrazonderivater av 13-keto-holdige antracykliner har formlene I, II eller III:
hvor
R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5)2, R<2> er
hvor X = H, N02 eller halogen
R<3> er OCH3, OH eller hydrogen,
R<4> er NH2, NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyan-4-morfolinyl, 1-piperidinyl, 4-metoksy-l-piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanmetylamin eller l-cyan-2-metoksyetylamin, R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,
R<6> er OH eller hydrogen, forutsatt at R6 ikke er OH når R<5> er
OH eller O-THP, og
n er et helt tall fra og med 1 til og med 10,
hvor
R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5) 2,
R<3> er 0CH3, OH eller hydrogen,
R<4> er-NH2, NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyan-4-morfolinyl, 1-piperidinyl, 4-metoksy-l-piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanmetylamin eller l-cyan-2-metoksyetylamin, R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,
R<6> er OH eller hydrogen, forutsatt at R<6> ikke er OH når R<5> er
OH eller O-THP, og
n er et helt tall fra og med 1 til og med 10, og
hvor
R<1> er CH3, CH20H, CH20C0( CH2 )3CH3 eller CH20C0CH (OC2H5) 2, R<2> er
hvor X = H, N02 eller halogen
R<3> er 0CH3, OH eller hydrogen,
R<4> og R<7> er uavhengig av hverandre hydrogen, alkyl,
substituert alkyl, cykloalkyl, substituert cykloalkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl, eller R<4>, R7 og N danner tilsammen en ring med 4-7
ringatomer hvor ringen eventuelt kan være substituert,
R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,
R<6> er OH eller hydrogen, forutsatt at R<6> ikke er OH når R<5> er
OH eller O-THP, og
n er et helt tall fra og med 1 til og med 10.
De ovenfor beskrevne antracyklinacylhydrazoner utgjør mellomprodukter med fremstillingen av konjugatene ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og er eksemplifisert ved henholdsvis ADM-HZN og 13-{3-(merkaptopropionyl)}adriamycinhydrazon, som beskrevet i de foretrukne utførelsesformer som her er omtalt.
Som det ses av formlene ovenfor omfatter acylhydrazon-mellomproduktene, hydrazoner av hvilke som helst av flere kjente antracykliner, slik som adriamycin, daunomycin og karminomycin. I tillegg omfatter mellomproduktene acylhydrazoner som er derivatisert på bestemte steder på antracyklinstruk-turen (f.eks. 4'-THP-adriamycinhydrazon og 3'-deamino-3'-(3-cyan-4-morfolinyl)adriamycinhydrazon). Disse sistnevnte mellomproduktene kan syntetiseres ved først å derivatisere antracyklinet for å danne en ønsket analog og så anvende analogen til å fremstille hydrazonmellomproduktet. Kjente antracyklin-analoger omfatter de som er beskrevet i US-patentskrifter nr. 4 464 529 og 4 301 277 (3'-deamino-3'-(4-morfolinyl)- eller 3'-deamino-3'-(3-cyan-4-morfolinyl)-antracyklinanaloger), US-patentskrif ter nr. 4 202 967 og 4 314 054 (3'-deamino-3'-(1-piperdinyl)- eller 3'-deamino-3'-(4-metoksy-1-piperdinyl)-antracyklinanaloger), US-patentskrift nr. 4 250 303 (N-benzyl-eller N,N-dibenzylantracyklinanaloger), US-patentskrift nr. 4 591 637 (N-metoksymetyl- eller N-cyanmetylantracyklinanaloger) og US-patentskrift nr. 4 303 785 (acetalanaloger av antracykliner). Disse kjente antracyklinanalogene kan således omsettes som beskrevet ovenfor (se fig. 1), hvorved det fremstilles nye acylhydrazoner som så kan konjugeres til et antistoff eller en ligand med en ønsket spesifisitet som her beskrevet.
Alternativt kan et uderivatisert acylhydrazonmellompro-dukt først fremstilles som her beskrevet fra det uderivati-serte antracyklinet, slik som adriamycin, daunomycin eller karminomycin, og dette nye mellomprodukt så derivatiseres for å fremstille et nytt acylhydrazon substituert som ønsket. F.eks. kan ADM-HZN derivatiseres i sin aminosukkerrest ved reduktiv aminering med 2,2'-oksydiacetaldehyd under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i US-patentskrift nr. 4 464 529, hvorved 3-deamino-3'-(3-cyan-4-morfolinyl)adriamycinhydrazon fremstilles. Likeledes kan ADM-HZN derivatiseres i aminosukkerresten for å fremstille nye acylhydrazonderivater, slik som 3'-deamino-3'-(4-morfolinyl)-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4 301 277), 3'-deamino-3'-(1-piperidinyl)-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4 202 967), 3'-deamino-3'-{4-metoksyJ-l-piperidinyl ) -ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4 314 054), N-benzyl-ADM-hydrazon og N,N-dibenzyl-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4 250 303) eller N-metyoksymetyl-ADM-hydrazon og N-cyanmetyl-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4 591 637). I tillegg kan ADM-HZN derivatiseres i R<5->stillingen i formlene I-III, som beskrevet i US-patentskrift nr. 4 303 785, for å fremstille acetalderivater av hydrazonet, slik som 4'-THP-ADM-hydrazon.
Det skal forstås at ved disse fremgangsmåtene for derivatisering av acylhydrazonene kan det som utgangsmaterialer benyttes hydrazoner av andre antracykliner enn ADM, slik som daunomycin eller karminomycin, for å fremstille forbindelser slik som N-benzyl-daunomycinhydrazon eller 3'-deamino-3'-(4-morfolinyl)karminomycinhydrazon.
Undersøkelser hvor det anvendes humane tumorxenografter i mus har dessuten vist evnen til immunkonjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen når det gjelder å hemme tumorvekst in vivo, som i noen tilfeller fører til fullstendig tumorregre-sjon. Immunkonjugatene ble påvist å ha en større styrke og hemmet tumorvekst i en større utstrekning enn det ukonjugerte antracyklin. Dessuten ble immunkonjugatene tolerert av dyrene i en mye større utstrekning enn det frie legemiddel, idet de var minst 10 ganger mindre toksiske enn det ukonjugerte antracyklin alene.
Bindings- og cytotoksisitetsegenskapene til immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen synes å utgjøre en forbedring i forhold til immunkonjugater rapportert til i litteraturen hvor antracykliner var direkte bundet til antistoff gjennom aminosukkerdelen i antracyklinet. Disse amino-sukkerbundne immunkonjugater inneholdt ofte lavere molare forhold mellom antracyklin og antistoff, og utviste redusert cytotoksisitet i forhold til det frie legemiddel og reduserte antistoffbindende egenskaper [se f.eks. R. Arnon et al., Immunological Rev., 62, supra, ' E. Hurwitz et al., Cancer Res., 35, supra, ' og R. Yamamato et al., supra]. Dessuten indikerte stabilitetsundersøkelser utført på immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, at antracyklinet ble frigjort fra immun-kon j ugatene under lignende reduserende og sure-betingelser som de som finnes i et cellulært miljø. Bibeholdelsen av høy cytotoksisk legemiddelaktivitet som ble iakttatt med immunkonjugatene som her er beskrevet, kan således forklares ved det faktum at et forholdsvis umodifisert legemiddel avleveres til målcellene.
I tillegg var vi i stand til å optimaliserereaksjonsbe-tingelser, slik at molare forhold mellom antracyklin og antistoff på omtrent 4-10 ble oppnådd ved å anvendes flere antistoffer av forskjellige isotyper. Mengden av protein utvunnet etter kondensasjon med ADM-HZN-derivatet falt dramatisk når molare forhold større enn 10 ble forsøkt. Det syntes som om hovedbegrensningen for å oppnå immunkonjugater med molare forhold større enn 10 skyldtes den reduserte oppløselighet av konjugatene i vandig oppløsning og den fysiske binding av antracyklin til protein.
In vitro-undersøkelser har også vist evnen til antracyklin-ligand-konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen når det gjelder å drepe målceller. F.eks. har våre undersøkelser vist at visse antracyklin-ligand-konjugater ifølge oppfinnelsen beholdt sin spesifikke reseptorbindingsaktivitet samtidig som de utviste cytotoksisitet mot tumorceller. Et cys-bombesin-ADM-konjugat fremstilt som her beskrevet, utviste således en bindingsaktivitet til en bombesinreseptorpositiv cellelinje som er ekvivalent med den som ble observert med ukonjugert cys-bombesin, og var svært cytotoksisk mot en transformert fibroblastcellelinje in vitro. Faktisk var cys-bombesin-ADM-konjugatet sterkere enn fritt ADM eller ADM-HZN. I tillegg ble et EGF-ADM-konjugat samt et transferrin-ADM-konjugat fremstilt som her beskrevet.
Våre in vivo-undersøkelser som viser den økede antitu-moraktivitet til immunkonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen i forhold til det frie legemiddel, samt deres reduserte systemiske toksisitet, indikerer en økt terapeutisk indeks for konjugatene. Konjugatene kan således anvendes i farmasøytiske preparater, kombinasjoner og ved fremgangsmåter for behandling av sykdommer, slik som kreft og andre tumorer, ikke-cytocidale virus- eller andre patogene infeksjoner og autoimmunsykdommer. Nærmere bestemt ved fremgangsmåter for behandling av sykdom hos pattedyr hvor en farmasøytisk effektiv mengde av minst ett antracyklinholdig konjugat administreres på en farmasøytisk akseptabel måte til hvert pattedyr.
Flere forskjellige konjugater, dvs. som bærer forskjellige antracykliner eller forskjellige ligander, kan anvendes til kombinasjonskjemoterapi. Anvendelsen av flere konjugater som bærer forskjellige epitopspesifisiteter for tumoren, øker sannsynligheten for at det oppnås tilstrekkelig legemiddel på tumorstedet. I tillegg er denne utførelsesformen viktig for å oppnå en høy grad av spesifisitet for tumoren, ettersom sannsynligheten for at normalt vev vil ha alle de samme tumorassosierte antigenene er liten [jfr. I. Hellstrøm et al-, "Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Dependent Cytotoxicity", J. Immunol., 127 (nr. 1), s. 157-60 (1981)].
Alternativt kan det anvendes flere forskjellige immun-kon j ugater hvor bare antracyklinbestanddelen i konjugatet er forskjellig. En ytterligere utførelsesform omfatter konjugeringen av mer enn ett antracyklin til en bestemt ligand for å danne et immunkonjugat som bærer mange forskjellige antracyklinmolekyler på overflaten, hvor alle er bundet til ligand via en 13-keto-acylhydrazonbinding. Administrering av immunkonjugatet ifølge denne utførelsesformen, resulterer i fri-gjørelsen av flere forskjellig legemidler på stedet til, eller i, målcellene. Dessuten kan en kombinasjon av antracyklinantistoff- og antracyklin-ligand-konjugater anvendes når legemidlet kan målrettes mot en cellepopulasjon som bærer et bestemt antigen samt en reseptor for en spesifikk ligand på overflaten. Igjen kan én type antracyklin eller flere forskjellige legemidler, anvendes i denne kombinasjons-terapien.
Antracyklinkonjugatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan administreres i form av farmasøytiske preparater ved å anvende vanlige administreringsmåter som omfatter, men ikke er begrenset til, intravenøs, intraperitoneal, oral, intralym-fatisk eller administrering direkte til stedet for en utvalgt cellepopulasjon, slik som en tumor. Intravenøs administrering er foretrukket.
De farmasøytiske preparatene som omfatter antracyklinkonjugatene, kan være i mange forskjellige doseringsformer som omfatter, men ikke er begrenset til, faste, halvfaste og flytende doseringsformer, slik som tabletter, piller, pulvere, flytende oppløsninger eller suspensjoner, suppositorier, poly-mere mikrokapsler eller mikrovesikler, liposomer og injiser-bare eller innsprøytbare oppløsninger. Den foretrukne form avhenger av administreringsmåten og den terapeutiske applika-sjon.
De farmasøytiske preparatene kan også omfatte vanlige farmasøytisk akseptable bærere som er kjent innen teknikken, slik som serumproteiner som humant serumalbumin, slike buffer-stoffer som fosfater, vann eller salter eller elektrolytter.
Den mest effektive administreringsmåte og -doseringsplan for konjugatpreparatene, avhenger av alvorligheten og forløpet av sykdommen, pasientens helse og respons på behandling, og den behandlende leges bedømmelse. Doseringene av konjugatene og eventuelle ledsagende forbindelser, bør følgelig titreres for den enkelte pasient. Ikke desto mindre kan en effektiv dose av antracyklinimmunkonjugatet fremstilt ifølge oppfinnelsen være i området fra ca. 1 til ca. 100 mg/m<2> antracyklin. En effektiv dose av antracyklin-ligand-konjugatene kan være i området fra ca. 1 til ca. 100 mg/m<2> antracyklin eller fra ca. 1 til ca. 100 mg/m<2> ligand.
For at den her beskrevne oppfinnelse skal kunne bli mere fullstendig forstått, er de følgende eksempler angitt.
Syntese av et adriamvcinhvdrazon
Som det innledende trinn under fremstillingen av immunkonjugatet ifølge denne utførelsesformen, ble et ADM-hydrazon-derivat først syntetisert på følgende måte: 0,3 ml av en 1 M hydrazinoppløsning, dvs. NH2NH2-oppløsning, i isopropylalkohol ble tilsatt til en avkjølt oppløsning av 70 mg (0,22 mmol) SPDP i 3 ml THF (tetrahydrofuran). Etter omrøring i 20 min ved 0°C, ble produktet ekstrahert med CH2CL2, vasket med saltoppløsning og tørket over K2C03. Resten som ble erholdt etter inndamping av oppløsningsmidlene, ble kromatografert på nøytral alumina (5 % MeOH, 95 % CH2C12), hvorved man fikk 21 mg (41 %)- 3-(2-pyridylditio)-propionylhydrazid (forbindelse 2 i fig. 1). Dette hydrazidet og 48 mg (0,083 mmol) adriamycin-HCl ble oppløst i 5 ml MeOH og så omrørt i mørket ved værelsestemperatur i 6 dager. Reaksjonen ble etterfulgt av reversfase-tynnsjiktskromatografi (TLC) (MeOH:H20 = 2:1, inneholdende 3 % vekt/volum NH4OAc). Etter denne perioden ble oppløsningsmidlet avdampet og resten kromatografert på en C18-kolonne (MeOH:H20 = 3:2, inneholdende 3 % vekt/volum NH40Ac). Fraksjonene ble kom-binert og lyofilisert og overskuddet NH40Ac ble fjernet under redusert trykk. Resten ble oppløst i MeOH og utfelt ved til-setning av acetonitril, hvorved man fikk 45 mg (72 %) adriamycin-13-{3-(2-pyridylditio)propionyl}-hydrazonhydroklorid, heretter henvist til som ADM-HZN (forbindelse 4 i fig. 1). ADM-HZN-et ble karakterisert på følgende måte: sm.p. > 125"C gjør fargen mørkere og er ikke veldefinert;
NMR (aceton - d6, 6) 1,25 (s, 3 H, J = 6 Hz), 1,77 (m, 1 H), 2.06 (m, 1 H), 2,30 (m, 1 H), 2,53 (d, 1 H, J = 15 Hz), 2,89-3,18 (m, 6 H), 3,71 (m, 1 H), 3,85 (m, 1 H), 3,97 (m, 1 H), 4.07 (s, 3 H), 4,78 (s, 2 H), 5,21 (m, 1 H), 5,58 (t, 1 H, J = 7 Hz), 7,12 (m, 1 H), 7,64 (d, 1 H, J = 8 Hz), 7,75 (m, 2 H), 7,90 (t, 1 H, J = 8 Hz), 7,98 (d, 1 H, J = 8 Hz), 8,37 (d, 1 H, J = 4 Hz), 10,50 (s, 1 H), 10,52 (s, 1 H), 14,19 (bs, 1 H); IR (KBr) 3438, 1674, 1618, 1579, 1419, 1286, 1016, 988, 698 cm'<1>; FABMS (glyserol) m/e 755 (M+l), 737, 645, 625, 609.
Eksempel 1
Det følgende eksempel viser fremstillingen av et nytt antracyklin-ligand-konjugat hvor adriamycin er bundet til peptidliganden, bombesin, via en acylhydrazonbinding i 13-ketostillingen til legemidlet.
Fremstilling av et bombesin- ADM- konjugat
Urenset cys-bombesin med aminosyresekvensen: Cys-Glu-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, ble fremstilt av Vega Biotechnologies (Tuscon, Arizona). Alternativt har vi syntetisert cys-bombesin på et "Milligen 9050"-pep-tidsynteseapparat under anvendelse av aktiverte pantafluorestere av Fmoc-beskyttede aminosyrer. Det synteti-serte peptid ble avspaltet fra harpiksen, og sidekjedebeskyttelsesgrupper fjernet ved inkubasjon i 92,5 % trifluoreddiksyre, 2,5 % tiofenol og 5 % fenol i 2 timer ved 25°C.
Cys-bombesin ble så renset fra den urene peptidblanding ved hjelp av C18 reversfase-HPLC ("Perkin Eimer 410 Bio HPLC") etterfulgt av ionebytter-HPLC. Ved en typisk fremstilling ble 10 mg urent peptid og 20 mg ditiotreitol (DTT) oppløst i 10 % acetonitril i 0,01 M ammoniumacetat, Ph 6,0, og separert ved å bruke en 10-50 % acetonitrilgradient i 0,01 M ammoniumacetat, Ph 6,0. Eluater ble overvåket ved OD280. Fraksjoner (1 ml) ble samlet opp og fraksjoner som inneholdt reaktive tiolgrupper ble identifisert ved omsetning med DTNB. Antallet reaktive tiolgrupper inkorporert på antistoffene ble bestemt ved å anvende DTNB (5, 5 '-ditiobis-( 2-nitrobenzosyre) (E412 = 14150) ifølge fremgangsmåten til G. L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, s. 70-77 (1959).
Disse fraksjonene som inneholdt reaktive tiolgrupper, ble også testet med hensyn på bombesinimmunreaktivitet i en Elisa-analyse med et anti-bombesinmonoklonalt antistoff som binder seg til området i bombesinpeptidet som er kjent for å reagere med bombesinreseptoren. Analysen ble utført på følgende måte: Bombesinpeptidet (100 ng, 1 ug) ble absorbert på "Immulon II"-Elisa-plater i 2 timer ved 37°C. Platene ble blokkert med 3 % gelatin i 2 timer ved 37°C, vasket fem ganger med PBS inneholdende 0,05 % "Tween 20", inkubert med mus-anti-bombesin-antistoff i 1 time ved 37°C, og så vasket fem ganger med PBS "Tween 20". Platene ble så inkubert med peroksidase-merket kanin-anti-mus-Ig før de ble fremkalt med TMB-substrat ifølge produsentens instruksjoner (Kirkegaard og Perry).
Fraksjoner fra flere forsøk inneholdende frie sulfhy-drylgrupper og som utviste bombesin-immunreaktivitet, ble slått sammen og ytterligere renset ved ionebytte-HPLC ("Aquapore CX-300", 10 pm kolonne) under anvendelse av en 2-50 % saltgradient (500 mM ammoniumacetat, pH 6,0) i 10 % acetonitril. Eluater ble overvåket ved OD280, og 1 ml fraksjoner ble testet med hensyn på frie tiolgrupper ved hjelp av DTNB-metoden og med hensyn på bombesin-immunreaktivitet ved hjelp av Elisa-analyse som beskrevet ovenfor. Fraksjoner ble
slått sammen, oppkonsentrert under anvendelse av en "Savant
> speed-vac" og rekromatografert ved hjelp av HPLC på en Cl 8-kolonne som beskrevet ovenfor. Det endelige cys-bombesin-produkt oppviste en enkel topp i HPLC-kromatografiet (se fig. 28).
Den rensede cys-bombesin ble så brukt for omsetning med 3 ADM-HZN på følgende måte: Den rensede cys-bombesin ble ut-blandet til ca. 5-8 mg/4 ml i 10 mM ammoniumacetat (1,25 - 2 mg/ml) basert på A280 på 2,08 i 1 mg/ml renset Lys<3->bombesin. pH ble regulert til 7,0 med 7 M NH40H og så ble 2,5 - 4 mg ADM-HZN i 400 ul metanol tilsatt. Oppløsningen ble vorteks-5 behandlet og hensatt i 1 time ved 20°C, og så i 12 timer ved 4°C med mellomliggende blanding. Cys-bombesin-ADM-konjugatet ble skilt fra det frie legemiddel ved ionebytter-HPLC under anvendelse av betingelsene som det er redegjort for ovenfor
for fritt peptid med unntak av at acetonitrilkonsentrasjonen a ble holdt på 40 % under separasjonen. Fraksjoner inneholdende konjugatet ble slått sammen, tørket ned på en "Savant speed-vac" og oppløst i startbufferen for reversfase-HPLC-separasjonen, som tidligere redegjort for. Fritt peptid ble så
skilt fra peptid-legemiddel-konjugatet ved hjelp av s reversfase-HPLC-kromatografi (som beskrevet tidligere for rensing av fritt peptid). Kolonnen ble overvåket ved 280 nm og 495 nm. Fraksjoner inneholdende konjugatet ble slått sammen, tørket ned og lagret ved -20°C for ytterligere
karakterisering.
o Alternativt ble et bombesin-ADM-konjugat fremstilt hvor ADM var bundet til bombesinpeptidet i lysinresten (Lys<3>) i peptidet. Ifølge denne fremgangsmåten ble bombesin (også kalt Lys<3->bombesin) inkubert med et 3 mol overskudd av SPDP ved pH
8,5 i 1 time ved 25°C. Bombesinet ble skilt fra overskudd SPDP 5 ved hjelp av C18-reversfase-HPLC, redusert med overskudd DTT og så på nytt kromatografert ved hjelp av C18-reversfase-HPLC som beskrevet ovenfor. Det reduserte peptid ble så inkubert med et 2 mol overskudd av ADM-HZN i 1 time ved 25°C, etterfulgt av 14 timer ved 4°C. Forsøk på å separere peptid-
legemiddel-konjugatet fra legemidlet var imidlertid problem-atisk av to grunner: 1) på C18-kromatografiet som beskrevet for fremstillingen av cys-bombesin ovenfor, var peptid-legemiddel-konjugatet (påvist ved hjelp av Elisa-analyse som beskrevet ovenfor) hydrofobt og oppførte seg svært likt med ADM-HZN alene, men forskjellig fra redusert peptid, og 2) modifikasjon av bombesinet gjennom lysin<3->resten endrer ladningen på peptidet og gjør det mer vanskelig å skille fra fritt legemiddel ved ionebytterkromatografi. Kobling over et cys-bombesinpeptid var derfor favorisert.
Karakterisering av bombesin- ADM- koniugatet
Bombesin-ADM-konjugatet fremstilt fra cys-bombesin som beskrevet ovenfor, har strukturen som er vist i fig. 4, idet ADM er konjugert til en linkerarm i 13-ketostillingen via en acylhydrazonbinding. Linkeren som knytter sammen peptidet og legemidlet, inneholdt en disulfidbinding i strukturen. Fig. 6 viser et massespektrum av cys-bombesin-ADM-konjugatet. Denne analyse viser et molekylion på 2357 som svarer til l:l-addukt-et av cys-bombesin og ADM.
Cys-bombesin-ADM-konjugatet ble testet med hensyn på evne til å binde seg til bombesinreseptorer på "Swiss 3T3"-cellelinjen, en normal musfibroblastcellelinje erholdt fra ATCC. Binding ble målt ved å bruke en konkurranseanalyse som omfatter bruken av 12<5>I-merket gastrinfrigjørende peptid (GRP). GRP binder seg på samme måte som bombesin til bombesinreseptoren på overflaten av reseptorpositive celler, slik som "Swiss 3T3"-celler. <125>I-merket GRP ble således inkubert med økende konsentrasjoner av cys-bombesin, GRP eller cys-bombesin-ADM-konjugatet, og spesifikt bundet radioaktivitet ble kvantifisert. På denne måte ble inhibering av <125>I-GRP-binding målt.
Analysen ble utført på følgende måte: "Swiss 3T3"-cellene fikk vokse til sammenflyting (5-7 dager) i 150 cm<3> T-kolber i MEM-medium supplert med 10 % bovinfosterserum, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (komplett medium). Etter at cellene hadde nådd sammenflyting, ble mediet erstattet med MEM komplett medium supplert med 5 ug/ml insulin, 5 ug/ml transferrin og 5 ng/ml natriumselenitt. Cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer og innhøstet ved skraping med en gummiskrape i RPMI/HITS [RPMI 1640 inneholdende 5 mg/ml BSA, 4,7 mg/ml HEPES, 5 ug/ml insulin, 5 ug/ml transferrin og 5 ng/ml natriumselenitt» Cellene ble vasket én gang og sendt 3 ganger gjennom en nål av størrelse 22 for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Deretter ble 10 ul cys-bombesin, GRP eller bombesin-ADM-konjugatet ved forskjellige fortynninger (in triplo) tilsatt til rør inneholdende 5 x 10<5> celler hvortil det også ble tilsatt 150 pl <125>I-GRP (2 ng/ml, 2 000 Ci/mmol). Rørene ble blandet og inkubert i 1 time ved værelsestemperatur på en risteplattform. Cellebundet <125>I-GRP ble fraskilt ved sentrifugering ved 12 000 x g over et lag av 1:1 dibutylftalat:dioktylftalat i et mikro-sentrifugerør. Rørene ble nedfryst på tørris, og cellepel-letene skåret av og telt i en LKB 1275 gammateller.
Som vist i fig. 7 var det spesifikk konkurranse om binding av 12<5>I-merket GRP til 3T3-cellene mellom GRP, cys-bombesin og cys-bombesin-ADM-konjugatet. Viktigere var det at det ikke var noen signifikant forskjell i konkurransekurvene til de tre molekylene, noe som indikerer at de oppviser like affiniteter for bombesinreseptoren. Konjugeringen av ADM til bombesin forstyrrer således ikke bindingsaktiviteten til peptidet, idet konjugatet beholder evnen til å binde seg til bombesinreseptor-positive celler. Andre undersøkelser utført i våre laboratorier har bekreftet at cys-bombesin og bombesin oppviser like bindingsaktiviteter på reseptorpositive celler.
Cytotoksisk aktivitet av bombesin- ADM- konlugatet
Den cytotoksiske aktivitet av cys-bombesin-ADM-konjugatet ble bestemt ved å bruke en <3>H-tymidin-opptaksanalyse. Ifølge denne analyse ble celler av forskjellige typer som bærer bombesinreseptoren på sine celleoverflater, tilsatt til 96-brønners mikrotiterplater (5 000 celler/brønn) og dyrket i 24 timer ved 37°C i MEM-medium. Disse celler omfattet "Swiss 3T3"-fibroblastcellelinjen beskrevet tidligere, SVT2-cellelinjen, en transformert fibroblastcellelinje er holdt fra ATCC, og HCT116-cellelinjen, en tykktarmkarsinomcellelinje erholdt som en gave fra Dr. M. Brattain [Bristol-Baylor Labs., Houston, TX]. Fortynninger ble gjort av cys-bombesin-ADM-konjugatet, ADM, ADM-HZN eller en blanding av cys-bombesin-ADM pluss 20 ug/ml bombesin, i HITS-medium inneholdende RPMI 1640 medium, 5 mg/ml bovint serumalbumin, 0,02 M HEPES, 5 pg/ml insulin, 5 pg/ml transferrin og 5 ng/ml natriumselenitt. 50 pl av hver fortynning (in triplo) av konjugat, legemiddel eller blanding ble tilsatt til brønnene som inneholdt cellene, og det ble inkubert ved 37°C i minimum 1 time. Man hadde også kontrollbrønner hvortil bare medium ble tilsatt. Cellene ble så vasket, 200 pl friskt medium ble tilsatt og brønnene inkubert i ytterligere 38-44 timer i HITS-medium ved 37°C i en fuktig, 5 % C02-atmosfære. Én pCi <3>H-tymidin i 50 pl medium ble tilsatt til hver brønn og det ble inkubert i 4 timer ved 37°C. En oppløsning av 0,05 % trypsin i 0,53 nM EDTA, ble tilsatt i 15 minutter og cellene ble innhøstet i en "mash"-innhøster. Filtrene ble plassert i RPI 3a70B-scintillasjonsvæske og telt i en "Beckman LS5801"-scintillasjonsteller. Cytotoksisitet ble bestemt ved å bruke formelen:
Vi målte således inhiberingen av <3>H-tymidin-inkorporering i DNA til de bombesinreseptor-positive cellelinjene i nærvær av konjugatet ifølge oppfinnelsen, og følgelig den cytotoksiske effekt av konjugatet på cellene. Som vist i fig. 8, var cys-bombesin-ADM-konjugatet svært cytotoksisk mot SVT2-celler og var i virkeligheten sterkere enn fritt ADM eller ADM-HZN. En del av den cytotoksiske aktivitet av cys-bombesin-ADM-konj ugatet ble blokkert ved hjelp av overskuddsbombesin (dvs. blandingen av konjugatet pluss bombesin), noe som indikerer at konjugatets cytotoksiske effekt skyldtes idet minste delvis spesifikk binding av konjugatet til bombesinreseptoren. Som vist i fig. 9 og 10, var konjugatet også spesifikt cytotoksisk (etter en 2-timers eksponering) mot HCT116- og "Swiss 3T3"-celler.
Eksempel 2
Det følgende eksempel beskriver fremstillingen av et annet antracyklin-ligand-konjugat ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvor ADM konjugeres til polypeptidliganden, EGF, via en linker som festes til ADM ved hjelp av en 13-keto-acylhydrazonbinding.
Fremstilling av et EGF- ADM- koniugat
Ifølge denne utførelsesformen av oppfinnelsen ble ADM konjugert til en murin EGF. EGF'en ble erholdt fra mus-underkjevekjertler, renset ved hjelp av en modifikasjon av fremgangsmåten til Cohen, J. B. C., 237, s. 1555-62 (1962) og levert som et sterilt lyofilisert pulver (katalognr. BT-201) ved 0,1 mg/ampulle. Se også Savage et al., J. Biol. Chem., 22, s. 7669 (1973). Peptidet ble så tiolert ved å bruke SPDP for å innføre en reaktiv tiolgruppe på peptidet. I tilfelle med murin EGF, er det imidlertid ingen indre lysinrester for festing av SPDP og det eneste stedet for festing av SPDP er derfor i aminoende-aminosyren, noe som gir opphav til en forbindelse med minst én reaktiv sulfhydrylgruppe pr. EGF-molekyl (etter reduksjon med DTT). Tiolering av human EGF burde teoretisk resultere i en større grad av substitusjon ettersom molekylet har interne lysinmolekyler.
EGF ble således først oppløst i 0,1 ml PBS for å gi en sluttkonsentrasjon på 1,0 mg/ml. Til denne oppløsning ble 0,01 ml SPDP (sluttkonsentrasjon: 10 mM) (levert og fortynnet som beskrevet i eksempel 1, for antistofftiolering) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 30 minutter ved 30°C, hvoretter 0,02 ml DTT (50 mM) ble tilsatt for å fjerne tio-pyridylbeskyttelsesgruppen. Overskudd DTT og SPDP ble fjernet fra den tiolerte EGF ved mikrodialyse mot PBS under anvendelse av dialysemembraner med molekylvektstans på 3 500 (Spectrum Medical Industries Inc., katalognr.: 132 723).
Den tiolerte murine EGF ble så omsatt med et 5-6-gangers overskudd av ADM-HZN, fremstilt og fortynnet som beskrevet i eksempel 1 ovenfor. For dette eksempel ble 0,01 ml ADM-HZN (1,2 x 10<2> M) tilsatt til 0,1 mg SPDP-tiolert EGF i et sluttvolum på 0,2 ml PBS avkjølt til 4°C. Reaksjonsblandingen ble inkubert over natt ved 4°C og dialysert mot PBS som beskrevet ovenfor for SPDP-fjerning, for å fjerne eventuelt uomsatt legemiddel fra konjugatet.
Konjugatets renhet ble bestemt ved hjelp-av HPLC (se fig. 11). HPLC ble utført på en "Brownlee11-kolonne pakket med 5 um RP18-kuler. EGF-ADM-konjugatet ble sammenlignet med ukonjugert murin EGF (samme kilde og varepartinr.) og ukonjugert ADM. Prøvene ble eluert med en ammoniumformiat (pH 2,8)/acetonitril-gradient ved 1,0 ml/min. Som vist i fig. 11, var det når den konjugerte EGF, dvs. EGF-ADM-konjugatet ifølge oppfinnelsen, ble sammenlignet med ukonjugert EGF, at der var en homogen endring i retensjonstid for proteinet til en ny proteintopp. Når konjugatet ble sammenlignet med ukonjugert ADM, ble likeledes en lignende endring i retensjonstid for den konjugerte legemiddeltopp fra fri ADM observert. Dette HPLC-kromatografi illustrerer at det var mindre enn 1 % fritt legemiddel (som påvist ved 495 nm) eller fri ligand (som påvist ved 280 nm) i sluttkonjugatpreparatet.
Konjugatets renhet ble også bestemt ved hjelp av SDS-PAGE-analyse på en ikke-reduserende SDS-PAGE-gel (8-25 % gradientgel) (data ikke vist). Individuelle proteinbånd ble oppløst ved farging med sølvfarge ("Phastgel" sølvfargesett, katalognr.: 17-0617-01). EGF-ADM-konjugatet (ved omtrent 0,1 og 0,05 mg/ml) ble sammenlignet med tre fortynninger av ukonjugert murin EGF (1, 0,1 og 0,01 mg/ml). Det var ikke noe tegn på noe proteinbånd i EGF-ADM-preparatet som svarer til ukonjugert EGF-protein. Dette forsøket understøttet kon-klusjonen i fig. 11 om at det ikke var noe tegn på ukonjugert EGF i EGF-ADM-konjugatpreparatet.
Retensjon av EGF- ADM- konjugatets bindingsaktivitet
Retensjonen av EGF-bindingsaktivitet etter kjemisk kobling av ADM-HZN til EGF, ble bestemt ved en kompetitiv radioisotopanalyse under anvendelse av A431-cellelinjen. Denne cellelinjen var avledet fra et humant lungekarsinom og kan i vårt laboratorium binde mellom 1-4 x 10<7> molekyler EGF (resultater ikke vist). Celler som er fortynnet i RPMI 1640-dyrkningsmedium inneholdende 10 % FCS, ble platet ut på 96-brønners mikrotiterplater (5 x 10<5> celler/brønn) 24 timer før analysen. På analysedagen ble A431-cellene som vokser som en sammenvokst cellepopulasjon, vasket i DMEM inneholdende 2 % bovint serumalbumin (heretter henvist til som buffer A). Celler ble inkubert in triplo med 0,05 ml 2-ganger serie-fortynnet EGF eller EGF-ADM, og 0,05 ml 125I-merket EGF (50 ng/ml) fortynnet i buffer A (sluttvolum: 0,1 ml/brønn). Cellene ble inkubert ved 4°C i 4 timer og så vasket 3 ganger med buffer A. Cellene ble fjernet fra de 96-brønners plast-plater ved oppløseliggjøring med 1,0 M NaOH, og mengden av cellebundet 12<5>I-EGF ble bestemt ved å telle på en LKB modell 1272 gammateller.
EGF-ADM-konjugatets bindingsaktivitet for sin reseptor på A431-celler, er vist i fig. 12, hvor evnen til økende konsentrasjoner av EGF-ADM når det gjelder å inhibere bindingen av 12<5>I-merket EGF, sammenlignes. Dataen er presentert som inhibering av <125>I-EGF-binding (B/Bo), hvor B representerer de cellebundne radioaktive tellinger ved forskjellige konsentrasjoner av inhibitor (B) dividert med de cellebundne tellinger uten noen inhibitor (Bo). To separate EGF-ADM-konjugatpreparater ble sammenlignet med ukonjugert EGF. Begge konjugatpreparåtene utviste like bindingsaktiviteter. Når de ble sammenlignet med ukonjugert EGF, utviste EGF-ADM-konjugatene bare et lite tap av bindingsaktivitet for EGF-reseptoren på A431-tumormålceller.
Eksempel 3
Nok et annet eksempel på konjugatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er fremstillingen av antracyklin-ligand-konjugatet hvor ADM er konjugert til proteinliganden, transferrin, igjen via en linker festet til legemidlet gjennom en 13-keto-acylhydrazonbinding (se fig. 27).
Fremstilling av et transferrin- ADM- konjugat
5,1 mg humant holo-transferrin, 100 % jernsubstituert, ble oppløst i 2 ml av en buffer inneholdende 50 mM tri-etanolamin, 50 mM NaCl og 1 mM EDTA, pH 8,0. 40 pl 2-IT
(50 mM) ble så tilsatt og blandingen inkubert i 3 timer ved 37°C. Det tiolerte peptid ble så separert på en PD-10-kolonne. Deretter ble 135 pl ADM-HZN (2,1 mM) tilsatt til 2,7 ml tio-

Claims (10)

  1. lert transferrin i PBS-buffer og reaksjonsblandingen ble inkubert over natten ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble så sentri-fugert ved 2 000 rpm i 10 minutter og transferrin-ADM-konjugatet skilt fra uomsatt ADM ved passering gjennom en PD-10-kolonne. Det tomme volum som inneholder konjugatet, ble samlet opp og molforholdet mellom ADM/transferrin var 4,6, idet A280 på 1 ble brukt for 1 mg/ml transferrin.
    Eksemplene 1-3 viser derfor fremstillingen av antracyklin-ligand-konjugater hvor et cytotoksisk antracyklin-legemiddel bindes til en ligand som reagerer med reseptorer forbundet med en utvalgt cellepopulasjon som søkes drept. Antracyklinet bindes til liganden via en ny syrefølsom acylhydrazonbinding. Konjugatene som her er beskrevet, beholder både ligandens evne til å binde seg til sine reseptorer, samt cytotoksisiteten til antracyklinet mot cellepopulasjonen som det er rettet mot via liganden. 1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antracyklin-ligand-konjugat som omfatter minst ett antracyklinmolekyl bundet til en ligand som har reaksjonsevne med en utvalgt cellepopulasjon som skal drepes, hvor antracyklinet har en ketogruppe i C-13-stillingen og er festet til liganden via en linkerarm, idet linkerarmen er kovalent bundet til antracyklinet ved hjelp av en acylhydrazonbinding i C-13-keto-stillingen i antracyklinet, og idet liganden ikke er et antistoff,karakterisert ved at: a) liganden omsettes med et tioleringsmiddel, og b) den tiolerte ligand omsettes med et acylhydrazon
    med formelen
    hvor: R<1> er CH3, CH2OH, CH2OCO (CH2) 3CH3 eller CH2OCOCH (OC2H5) 2, R<2> er
    hvor X = H, N02 eller halogen R<3> er OCH3/ OH eller hydrogen, R<4> er NH2, NHCOCF3, 4-morfolinyl, 3-cyan-4-morfolinyl,
    1-piperidinyl, 4-metoksy-l-piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanmetylamin eller l-cyan-2-metoksy-etylamin,R<5> er OH, O-THP eller hydrogen,R<6> er OH eller hydrogen, forutsatt at R<6> ikke er OH når
    R<5> er OH eller O-THP, og n er et helt tall fra og med 1 til og med 10, eller med formelen:
    hvor
    R<1>, R<3>, R<4>, R<5>, R6 og n har den ovenfor angitte betydning, eller med formeler•
    hvor
    R<1>, R<2>, R<3>, R<5>, R6 og n har den ovenfor angitte betydning, og R<4>og R7 er uavhengig av hverandre hydrogen, alkyl, substituert alkyl, cykloalkyl, substituert cykloalkyl, aryl, substituert aryl, aralkyl eller substituert aralkyl, eller R<4>, R7 og N danner tilsammen en 4- til 7-ring hvor ringen eventuelt kan være substituert.
  2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
    karakterisert ved at acylhydrazonet er adriamycin-13-{3-(2-pyridyltio)propionyl}hydrazonhydroklorid (ADM-HZN).
  3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,
    karakterisert ved at ADM-HZN omsettes med en ligand hvortil tiolgrupper er blitt festet, idet liganden har reaksjonsevne med en utvalgt cellepopulasjon som skal drepes.
  4. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 2,
    karakterisert ved at: a) ADM-HZN behandles med et reduksjonsmiddel, hvorved det dannes 13-{3-(merkaptopropionyl)}-adriamycinhydrazon, og b) hydrazonet omsettes med en ligand hvortil maleimidgrupper er blitt festet, idet liganden har reaksjonsevne med en utvalgt cellepopulasjon som skal drepes.
  5. 5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som ligand anvendes et protein, polypeptid eller peptidmolekyl.
  6. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det som ligand utvelges en ligand fra gruppen bestående av bombesin, EGF og transferrin.
  7. 7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som antracyklin utvelges et antracyklin fra gruppen bestående av adriamycin, daunomycin, detorubicin, karminomycin, idarubicin, epirubicin, esorubicin, 4'-THP-adriamycin, AD-32 og 3'-deamino-3'-(3-cyan-4-morfolinyl)-doxorubicin.
  8. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som ligand anvendes bombesin, og som antracyklin anvendes adriamycin.
  9. 9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som ligand anvendes EGF, og som antracyklin anvendes adriamycin.
  10. 10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som ligand anvendes transferrin, og som antracyklin anvendes adriamycin.
NO902197A 1989-05-17 1990-05-16 Fremgangsmåte for fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater NO300691B1 (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/353,729 US5122368A (en) 1988-02-11 1989-05-17 Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO902197D0 NO902197D0 (no) 1990-05-16
NO902197L NO902197L (no) 1990-11-19
NO300691B1 true NO300691B1 (no) 1997-07-07

Family

ID=23390328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO902197A NO300691B1 (no) 1989-05-17 1990-05-16 Fremgangsmåte for fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0398305B1 (no)
JP (1) JP3062696B2 (no)
KR (1) KR0136899B1 (no)
AT (1) ATE150321T1 (no)
AU (1) AU631638B2 (no)
CA (1) CA2016584C (no)
DE (1) DE69030213T2 (no)
DK (1) DK0398305T3 (no)
ES (1) ES2099075T3 (no)
FI (1) FI102356B1 (no)
GR (1) GR3023784T3 (no)
HK (1) HK1005018A1 (no)
IE (1) IE81109B1 (no)
IL (1) IL94379A (no)
MY (1) MY131039A (no)
NO (1) NO300691B1 (no)
NZ (1) NZ233696A (no)
PT (1) PT94064B (no)
ZA (1) ZA903757B (no)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU638971B2 (en) * 1990-02-14 1993-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production
CA2048089A1 (en) * 1990-09-17 1992-03-18 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical conjugation of morpholino anthracyclines to antibodies
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
ATE296115T1 (de) * 1997-02-20 2005-06-15 David S Dime Ortsspezifische arzneimittel verabreichung
US7033765B1 (en) 1997-02-20 2006-04-25 Toronto Research Chemicals, Inc. Site-specific drug delivery
GB9724838D0 (en) * 1997-11-26 1998-01-21 Franks Christopher R Compositions
EP1305051A4 (en) * 2000-06-28 2007-01-10 Ward Page Faulk TARGETED ADMINISTRATION OF CYTOTOXIC ACTIVITIES A) TO ACTIVATED LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH TRANSPLANTED ORGANS, B) AS RADIATION SENSITIATORS TO CANCER CELLS IN RADIATION-TREATED PATIENTS, AND C) IN VITAMIN-BINDING PROTEINS AS ACTIVE INGREDIENTS IN DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER
WO2002049672A2 (en) * 2000-12-21 2002-06-27 Mcgill University Conjugates of antibodies and anticancer drugs
NZ511705A (en) * 2001-05-14 2004-03-26 Horticulture & Food Res Inst Methods and rapid immunoassay device for detecting progesterone and other steroids
KR100507968B1 (ko) * 2001-08-18 2005-08-17 한국과학기술연구원 자기집합체를 형성하는 항암제-키토산 복합체 및 그의제조방법
EP2161037A3 (en) 2003-04-22 2010-05-26 Ipsen Pharma Camptothecin-Somatostatin conjugates
CA2542834C (en) * 2003-10-21 2012-04-24 Igf Oncology, Llc Conjugates or co-administration of igf-1 receptor ligands with anti-cancer chemotherapeutic agents
US9011880B2 (en) 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
CA2558399C (en) * 2004-03-02 2015-05-19 Seattle Genetics, Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
EP1695717A1 (en) * 2005-02-23 2006-08-30 Ludwig-Maximilians-Universität Transport of nano-and macromolecular structures into cytoplasm and nucleus of cells
US8900589B2 (en) * 2008-07-15 2014-12-02 Genetech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
JP6835590B2 (ja) 2014-01-12 2021-02-24 アイジーエフ オンコロジー、 エルエルシー インスリン様成長因子−１および上皮増殖因子を含む融合タンパク質およびそのバリアントならびにその使用
CN106714844B (zh) * 2014-09-12 2022-08-05 基因泰克公司 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法
CN110636867B (zh) 2017-05-21 2023-09-05 Igf肿瘤公司 胰岛素样生长因子——用于治疗骨髓增生异常综合症的化学治疗缀合物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3957755A (en) * 1967-10-18 1976-05-18 Rhone-Poulenc S.A. Naphthacene derivatives
US4112217A (en) * 1977-09-02 1978-09-05 Sri International Bis-hydrazones of daunomycin and adriamycin
US4263428A (en) * 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US5162512A (en) * 1982-03-09 1992-11-10 Cytogen Corporation Amine derivatives of anthracycline antibodies
US4950738A (en) * 1984-09-13 1990-08-21 Cytogen Corporation Amine derivatives of anthracycline antibiotics
GB8610551D0 (en) * 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
AU638971B2 (en) * 1990-02-14 1993-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production

Also Published As

Publication number Publication date
ZA903757B (en) 1992-01-29
NO902197L (no) 1990-11-19
JP3062696B2 (ja) 2000-07-12
HK1005018A1 (en) 1998-12-18
GR3023784T3 (en) 1997-09-30
IL94379A (en) 1997-02-18
IE901764L (en) 1990-11-17
CA2016584C (en) 1999-06-29
EP0398305A3 (en) 1991-03-20
JPH0327321A (ja) 1991-02-05
ES2099075T3 (es) 1997-05-16
FI102356B (fi) 1998-11-30
PT94064A (pt) 1991-01-08
DK0398305T3 (da) 1997-06-23
FI102356B1 (fi) 1998-11-30
DE69030213T2 (de) 1997-10-16
AU5511790A (en) 1990-11-22
DE69030213D1 (de) 1997-04-24
CA2016584A1 (en) 1990-11-17
FI902387A0 (fi) 1990-05-14
IE81109B1 (en) 2000-03-08
KR900017597A (ko) 1990-12-19
ATE150321T1 (de) 1997-04-15
EP0398305B1 (en) 1997-03-19
MY131039A (en) 2007-07-31
NO902197D0 (no) 1990-05-16
KR0136899B1 (ko) 1998-04-25
EP0398305A2 (en) 1990-11-22
AU631638B2 (en) 1992-12-03
IL94379A0 (en) 1991-03-10
PT94064B (pt) 1997-07-31
NZ233696A (en) 1992-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5122368A (en) Anthracycline conjugates having a novel linker and methods for their production
NO300691B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av antracyklin-ligand-konjugater
JP3234980B2 (ja) 新規な二官能性化合物を含むコンジュゲートの製法
US6512101B1 (en) Branched hydrazone linkers
JPH0625012A (ja) チオエーテルコンジュゲート
NO312816B1 (no) Fremgangsmåte ved fremstilling av antistoff- superantigenkonjugater
CA2010164C (en) Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production
CA2239183C (en) Branched hydrazone linkers
NO178341B (no) Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive anthracyclinderivater

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired