NO312816B1 - Fremgangsmåte ved fremstilling av antistoff- superantigenkonjugater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av antistoffkonjugater som er istand til å aktivere cytotoksiske T-celler (CTLs). Konju-gatene er anvendelige for å ødelegge uønskede celler som blir assosiert med bl.a. kreftformer, autoimmune prosesser, parasittinfeksjoner og bakterielle, virale og soppinfeksjoner.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det har i de senere år blitt gjort forsøk på å bruke antistoffer i kombinasjon med midler som direkte utøver en toksisk effekt på målceller (cytotoksiske midler, cytotoksiner) for å fremskaffe en selektiv virkning på målceller og å forhindre og minimalisere den ikke-spesifikke effekt på andre celler. Preparatene som er beskrevet, har struk-ket seg fra kovalent bundne komplekser under anvendelse av linker-fremmende molekyler og ikke-kovalent bundne komplekser til enkle blandinger (f.eks. Ghose et al., J.

Nati. Cancer Inst. 61 (1979) 657-676 og Carlsson et al., Biotechnology 7 (1989) 567-73. Antydede cytotoksiner har bl.a. vært difteritoksin, ricin, subenhet A av ricin, gelonin og Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (Takeda Chemical Ind., EP-A-336, 405 og Pastan et al., WO-A-88/ 00703, hvorav begge har blitt anført i forbindelse med prioritetssøknaden, SE-9002479).

Med fremskaffelsen av hybridomteknologi og den medfølgende tilgjengelighet til monoklonale antistoff, har det vært mulig å bruke konseptet med komplekser mellom antistoff og cytotoksiske midler for mer spesifikt å rette de cytotoksiske midler mot den ønskede målcellepopulasjon.

I betraktning av den kjente skadelige effekt av cytotoksiske midler på andre celler enn målceller har det blitt antydet å erstatte de cytotoksiske midler med immunstimu-latorer som aktiverer T-lymfocytter og aktiverer CTLs. Spesielle forslag har vært opptatt med antistoff konjugert til i) antistoff som er rettet mot en T-cellereseptor eller forbindelser som er istand til å binde til en T-cellereseptor (Mass. Inst. Techn., EP-A1-180, 171);

ii) forbindelser, så som antigener, mitogener, andre frem-mede proteiner og peptider som aktiverer cytotoksiske T-celler (Neorex Corp., EP-A1-334 . 300);

iii) MHC antigener, (Behringwerke AG, EP-A1-352.761);

iv) antigener mot hvilke individet som skal behandles er immunt, (Med. Res. Counc. WO-A-90/11779 (publ. 1990-10-18); og

v) et ikke angitt bakterielt enterotoksin (Ochi og Wake, UCLA-Symposium: Cellular Immunity and the Immunotherapy of Cancers, 27. januar - 3. februar 1990, Abstract CE 515, side 109) .

Imidlertid har immunstimulatorene som hittil er beskrevet, enten vært for spesifikke eller for generelle i sin virkning. For eksempel aktiverer klassiske antigener kun omkring 1 av IO<5> T-celler, mens mitogener potensielt er i stand til å aktivere et flertall av T-cellene.

Det har blitt funnet at visse midler fremskaffer aktivering av.et moderat antall T-celler, dvs. de aktiverer T-celler ved en relativt høy frekvens, men langt fra 100 % (Fleischer et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1697-1707; og White et al., Cell 56 (1989), 27-35, hvorav begge artikler er innbefattet pr. referanse. Denne type midler er mer effektive aktivator-er enn klassiske antigener, og de har følgelig blitt beteg-net som superantigener (for en oversikt se Kappler og Mar-rack, Science 248:705, (1990)). Det har videre blitt vist (Dohlsten et al., Immunol. 71 (1990), 96-100; og Hedlund et al., Cell. Immunol. 129 (1990), 426-34, begge artikler innbefattet pr. referanse) at superantigenene som er kjent til nå har evnen til å binde til MHC klasse II-molekyler på målceller og aktivere cytotoksiske T-celler som inneholder den passende T-celle reseptor V beta-kjede. De publiserte data indikerer at MHC-bindingen er nødvendig for at T-cel-lebinding og aktivering skal inntreffe. Det kan ikke ute-lukkes at superantigener i fremtiden vil bli funnet å virke via en T-cellereseptor V alfa-kjede eller andre overflate-strukturer som kun finnes på subpopulasjoner av T-celler.

Den immunomodulatoriske effekt av superantigenet Staphylococcus enterotoxin A (SEA) har også blitt beskrevet av Platsoucs et al. (Cell Immunol. 97 (1986) 371-85) .

De fleste av de for tiden kjente superantigener har tid-liggere blitt funnet å være toksiner og alle har vært av mikrobiell opprinnelse. Stafylokokkiske endotoksiner er f.eks. enterotoksiske og aktiverer T-celler, og de to effekter kan skjelnes fra hverandre (Fleischer et al., Cell. Immunol. 118 (1989), 92-101; Alber et al., J. Immunol. 144

(1990), 4501-06; og Infect. Immun. 59 (1991) 2126-34).

Det har tidligere blitt foreslått å bruke superantigener for å dirigere CTL-mediert lysis av celler som bærer MHC klasse II antigener (Pharmacia AB, WO-A-91/04053, publisert 4.4.91. WO-A-91/04053 dekker, men nevner ikke spesielt superantigener som er inkorporert i kovalente immunokonjugater.

Celler som mangler MHC klasse II eller uttrykker margina-le mengder MHC klasse II-proteiner, binder imidlertid ikke tilstrekkelig superantigener for effektivt å dirigere lysis av dem av CTLs. Grunnet den generelle overflod av celler som bærer MHC klasse II-antigener og mangelen på overflod av MHC klassse II antigener på de fleste tumorceller, skulle super-antigener således være av liten verdi for den spesifikke avlivning av slike uønskede celler.

Imidlertid har oppfinnerne funnet at en spesifikk celleav-livende effekt fremskaffet av CTLs kan oppnås med super-antigener dersom de er kovalent bundet til et antistoff rettet mot en epitop som er spesifikk for cellene som skal ødelegges. Aktiveringen av immunsystemet kan indusere målceller som mangler MHC klasse II-antigener til å uttrykke dem, noe som kan fremme den ønskede lytiske effekt.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et konjugat, hvor fremgangsmåten er særpreget ved at den omfatter trinnene å

(i) syntetisere konjugatet fra et antistoff og et superantigen ved å koble, på i og for seg kjent måte, superantigenet til antistoffet via minst en struktur valgt fra (a) karbohydratstrukturer, (b) de funksjonelle grupper: tiolgrupper, disulfidgrupper, karboksygrupper og amino-grupper; og (ii) gjenvinne konjugatet fra mediet hvori det har blitt syntetisert.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremskaffes nye antistoffkonjugater som omfatter (1) et antistoff rettet mot målceller, og (2) et superantigen, dvs. en struktur som blir gjenkjent (samvirker med eller binder til) og aktiverer T-celler, spesielt CTLs.

Slike antistoffkonjugater kan ødelegge målceller, spesielt

i forbindelse med terapeutisk behandling og spesifikk aktivering av T-celler, så som CTLs.

Antistoffkonjugatene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan benyttes ved terapeutiske behandlings-metoder for kreft, autoimmunitet, virale infeksjoner, bakterielle infeksjoner, soppinfeksjoner, parasittinfeksjoner og andre sykdommer hvor målet er å avlive visse celler med en høy grad av nøyaktighet. Konjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan brukes i farmasøytiske blandinger som er tiltenkt å bli brukt for å ødelegge målceller assosiert med de sykdommene som er nevnt ovenfor. Individene som skal behandles er normalt dyr, spesielt mennesker.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Superantigendel av konjugatet

De fremstilte antistoffkonjugater er særpreget ved at strukturen som gjenkjennes av T-cellene er et superantigen. Konjugatene er normalt oppløselige ved fysiologisk pH og in vitro er de oppløselige i serum.

Foretrukne superantigener er valgt fra gruppen stafylokokkiske enterotoksiner (SEs), så som SEA, SEB, SEC, SED og SEE, toksoider, aktive fragmenter eller peptider derav og andre substanser som i hovedsak har samme virkningsmåte for å aktivere CTLs. Superantigenene kan innbefatte andre mikrobielle produkter (bakterielle såvel som virale), så som produkter fra stafylokokkiske stammer, f.eks. toksisk sjokk-syndrom-toksiner (TSST-1) , fra streptokokker, f.eks. pyrogent eksotoksin A, og bakterielle eksoproteiner og proteiner produsert av mycoplasma arthridis, som har en lignende evne til å samvirke med T-celler på samme måte som superantigener. Superantigener kan erholdes ved å dyr-ke de organismer som naturlig fremstiller dem eller fra genetisk manipulerte celler (rekombinante teknikker) eller potensielt også ved syntetisk peptid-syntese. Et superantigen som skal brukes i fremstillingen ifølge oppfinnelsen skal, når det anvendes i den eksperimentelle modell fremlagt i foreliggende beskrivelse, oppvise effekter som er analoge med det som er presentert i den eksperimentelle del av foreliggende søknad.

De foretrukne superantigener har den potensielle egenskap at de binder til omkring 1-40% av isoformene av et poly-morft T-celle overflateprotein assosiert med aktiveringen av CTLs, fortrinnsvis T-cellereseptor V beta-kjeden.

Antistoffdelen av konjugatet

Antistoffet er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff

(mab) , selv om polyklonaler kan brukes så lenge de har en tilstrekkelig smal spesifisitet. Uttrykket antistoff refererer til antistoffer generelt og omfatter således anti-stoffaktive fragmenter og andre molekyler som etteraper et antistoffs bindingsegenskaper, forutsatt at det har den passende spesi-fisitet, aviditet og affinitet for de aktu-elle målceller. Dette innbefatter genetisk manipulerte (rekombinant frem- stilte) antistoffer og antistoffderi-vater eller andre lignende bindende strukturer. I en ut-førelsesform er antistoffet spesifikt for en antigen determinant på tumor- celler, f. eks, en tarmkarsinom-assosiert determinant (epitop, struktur). Det er også tenkelig at antistoffet kan være spesifikt for en antigen determinant på celler som er ansvarlige for autoimmunitet, virus-infiserte celler, bakterier, parasitter eller sopp eller andre uønskede celler. Avhengig av effektiviteten av konjugatet kan anti- stoffet være rettet mot et antigen som vil internalisere antistoffet etter binding, selv om det er antatt at slike antistoff-spesifisiteter ikke er fore-trukket .

Monoklonale antistoffer studert i forbindelse med foreliggende oppfinnelse er C215-antistoffet rettet mot et antigen i GA-733-familien (se f.eks. EP-A-376.746 og referanser angitt deri samt Larsson et al., Int. J. Canc. 42

(1988) 877-82), C242-antistoffet (Larsson et al., Int. J. Canc. 42 (1988) 877-82) og Thy-1.2-antistoffet (mab C, Opitz et al., Immunobiol. 160 (1982 438-). Det er tenkelig at mab'er, som har spesifisiteter for andre målcel-leoverflatestrukturer, vil være anvendelige. Fremstillingen av monoklonale antistoffer rettet mot epitoper som er unike for utvalgte målceller, er velkjent i faget. Se f.eks. de ovenfor nevnte publikasjoner. Uttrykk som monoklonalt antistoff rettet mot C242-epitopen eller C215-epitopen, dekker antistoff som reagerer med kryssreager-ende epitoper.

Av de tre monoklonale antistoffer som er undersøkt til nå, vil C215-konjugatene sannsynligvis være av mindre viktig-het, fordi de reagerer med et epitop på et tumor-antigen, som altfor ofte blir uttrykt på normale celler. C242-konjugater synes å være bedre basert på spesifisitet-data, selv om søkers resultater indikerer at de kan kreve høyere doseringer. Mab C rettet mot Thy-1.2 vil sannsynligvis være av liten verdi for å målrette humane celler, fordi Thy-1.2-antigenet er spesifikt for en ikke-human pattedyr-tumorcelle.

En hybridomcellelinje som danner det C242 monoklonale antistoff har blitt deponert den 26. januar 1990 under nummer ECACC 90012601 ved European Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Salisbury, Wilts, England.

Strukturen som knytter superantigenet til antistoffet

I det foretrukne konjugat fremstilt ifølge oppfinnelsen er superantigenet kovalent bundet til antigenet via en kovalent binding (-B-). Dersom det er viktig at konjugatet ik-ke vil dekomponere når det tilføres til cellene som skal avlives, f.eks. til et dyr, bør bindingen i hovedsak være metabolsk stabil i en tilstrekkelig tidsperiode for å opp-nå effekt. Videre er det en fordel at bindingen som sådan ikke gir opphav til immunologiske reaksjoner i seg selv. Generelt bør bindingen være inert i den betydning at konjugatet opprettholder en effektiv målcellebindende spesi-fisitet (antitumor, antiviral osv.) samt en effektiv evne

til å aktivere cytotoksiske T-celler.

I den vitenskapelige litteratur såvel som i patentlitte-raturen har flere funksjonelle grupper blitt antydet i bindingsstrukturer av immunokonjugater. Følgelig kan bindingen -B- i de foreliggende konjugater inneholde strukturer valgt fra gruppen omfattende

(i) amider og hydrazider (amider = -CONRi- eller -NRiCO hvor hver av de fri valenser binder til et mettet karbon-atom og Rx kan være hydrogen eller en alkylsubstituent, så som lavere alkyl (Ci_6) eller alfa-N-substituenten av en naturlig forekommende alfa-aminosyre, fortrinnsvis en hydrofil aminosyre, og hydrazider = -CONHNH- eller -NHNHOC-, hvor hver av fri valenser binder til et mettet karbonatom)

ii) tioeter og disulfid (-Sr- hvor hver av de fri valenser binder direkte til henholdsvis et mettet karbonatom og S er et svovelatom, og r er et heltall 1 eller 2);

(iii) rette, forgrenede eller cykliske hydrokarbonkjeder som er mettet og som eventuelt kan være substituert med en eller flere hydroksyl- eller aminogrupper; (iv) eter (-0-, hvor hver av de fri valenser binder direkte til et mettet karbonatom); og (v) primært amin eller disubstituert hydrazin (-NH- eller -NH-NH-, hvor hver av de fri valenser binder direkte til et mettet karbonatom).

Lengden av broen bør ligge innenfor områdene som normalt er påtenkt innenfor det tekniske område, dvs. kortere enn 180 atomer, så som < 100 atomer, men lengre enn 3-6, fortrinnsvis lengre enn 16 atomer.

Den foretrukne binding er hydrofil og bør ikke inneholde noen aromatisk ring. Foretrukne hydrofile strukturer som kan være en del av bindingen -B- er : (i) polypeptidkjeder av de naturlig forekommende hydrofile alfa-aminosyrer (f .eks. asparaginsyre og dets amid, glutaminsyre og dets amid, lysin, arginin, glycin, treonin, serin og muligens også histidin) ; (ii) oksaalkylenkjeder så som (-0(C02)n)n'-, hvor n er et heltall 2-5, fortrinnsvis 2-3, og n' kan være et heltall 1-20; og (iii) -S- (tioetere), -0- (etere) og usubstituerte amider (-C0NH-), hvorav alle er bundet til korte usubstituerte hydrokarbonkjeder (Ci-4) , fortrinnsvis inneholdende 1 eller 2 karbonatomer.

Hydrofile aminosyrer kan være tilstede i hydrofile strukturer av typen (F- (Pro)n)mF, hvor F representerer en amino-syresekvens, fortrinnsvis 4-8 residuer, hvori hver aminosyre er individuelt valgt fra serin, glycin og treonin, m er et heltall 1-4 og n er et heltall 4-8 (Cetus Corp., W0-A-85/03508).

Bindingen -B- kan være festet enten ved spesielle plasse-ringer i antistoffet eller superantigendelen av konjugatet eller tilfeldig. Potensielle beliggenheter er en aminoterminal, en karboksylterminal og et lysinresiduum (omega aminogruppe). Dersom antistoffet eller superantigenet bærer en tiolgruppe eller disulfidgruppe (henholdsvis cystin eller cystein), kan disse grupper også bli brukt for kovalent kobling, med mindre de ikke er essensielle for aktiviteten av aktive deler av konjugatet. Når de er til stede, kan karbohydratstrukturer være oksydert til aldehydgrupper som i sin tur kan brukes for binding til den andre enhet av konjugatet (se Cetus Corp., EP-A-140.200).

Konjugatet fremstilt ifølge oppfinnelsen bør ikke inneholde signifikante mengder esterbindinger og labile amid-bindinger, spesielt ikke dannet med henholdsvis tyrosin-

og histidin-residuer. Dersom slike bindinger er blitt dannet i løpet av syntesen, kan de fjernes ved bruk av

hydroksylamin (Endo et al., Cancer Res. 48 (1988) 3330-3335).

Antallet superantigenenheter som kan være tilstede pr. aktiv antistoff enhet er normalt 1-5, fortrinnsvis 1 eller 2.

I en av de foretrukne former er konjugatsubstansen i hovedsak uniform med hensyn til superantigen pr. antistoff og/eller anvendte bindingsposisjoner i henholdsvis superantigenet og antistoffenhetene og/eller -B- bindinger osv. Med andre ord bør alle de enkelte konjugatmolekyler i konjugatsubstansen være de samme med hensyn til disse variab-ler.

Substansen bør i hovedsak være fri for ukonjugerte antistoffer eller ukonjugerte superantigener.

Det nøyaktige forhold mellom superantigen og antistoff, bindingsstruktur osv. for det optimale konjugat vil av-henge av det valgte monoklonale antistoff (innbefattende klasse, subklasse, fremstillende klon, spesifisitet) og valgte superantigen. De eksperimentelle modeller gitt i foreliggende beskrivelse vil tillate utvelgelse av optimale parametere også for andre superantigener og andre antistoffer.

I henhold til den utførelsesform av oppfinnelsen som er studert i størst utstrekning opp til innleveringsdato, omfatter bindingen -B- strukturen

De fri valenser i formel (I) binder til de henholdsvise aktive deler. Dette finner sted enten direkte eller via ytterligere divalente inerte strukturer som ligger inne i broen -B-.

n er et heltall > 0, f.eks. 1-20, fortrinnsvis 2, eller >

2 og i mange tilfeller < 10. m er 1 eller 2.

S er et svovelatom og binder direkte til et mettet karbon-atom ved hver av dets valenser (-Sr- = en tioeter eller et disulfid). r er et heltall 1 eller 2.

Y er -NH-, -NHNH- eller -NHN=CH-, som ved sine venstre ender binder til CO-gruppen vist i høyre ende i formel I

og ved sine høyre ender til et mettet karbonatom eller til en karbonylgruppe (bare når Y er lik -NHNH-) .

R er fortrinnsvis alkylen (med 1-4 karbonatomer, ofte 1 eller 2 karbonatomer) som eventuelt er substituert med en eller flere (1-3, i det foretrukne tilfelle < 2) hydroksy (OH)-grupper.

Fremstilling av antistoff- superantigenkonjugatet

Antistoffkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan erholdes ved å anrike dem og rense dem fra kulturmedier av celler som fremstiller dem eller fra andre medier hvor de har blitt syntetisert.

Syntesen av de foreliggende nye konjugater kan utføres ved teknikker som er kjent i faget for konjugatsyntese, dvs. genetisk manipulering (rekombinante teknikker) eller via det passende antistoff og superantigen ved klassiske kob-lingsreaksjoner ved passende funksjonelle grupper. De funksjonelle grupper som er tilstede i proteiner og normalt blir anvendt er: (i) Karbohydratstrukturer. Denne struktur kan oksyderes til aldehydgrupper, som i sin tur omsettes med en forbindelse inneholdende gruppen H2NNH- for dannelse av en -C=NH-NH-gruppe. (ii) Tiolgrupper (HS-). Tiolgruppen kan omsettes med en forbindelse inneholdende en tiolreaktiv gruppe for dannelse av en tioetergruppe eller disulfidgruppe. Fri tiolgrupper av proteiner er tilstede i cystinresiduer og kan inn-føres i proteiner ved tiolering eller spalting av disul-fider i native cysteinresiduer. (iii) Fri amino-grupper (H2N-) i aminosyreresiduer. En aminogruppe kan omsettes med en forbindelse inneholdende en elektrofil gruppe, så som en aktivert karboksygruppe, for dannelse av en amidgruppe. Den fri aminogruppe er fortrinnsvis en aminoterminal eller omega-aminogruppen av et lysinresiduum. (iv) Fri karboksylgrupper i aminosyreresiduer. En karboksylgruppe kan omdannes til en reaktiv (aktivert) karboksylgruppe og derpå omsettes med en forbindelse inneholdende en aminogruppe for dannelse av en amidgruppe. Imidlertid må det bli tatt forholdsregler for å minimalisere amiddannelse med aminogruppene, som for det meste er til stede sammen med karboksylgrupper i samme protein. De fri karboksylgrupper er fortrinnsvis en karboksyterminal eller en karboksylgruppe i en diacidisk alfa-aminosyre.

Forbindelsene som bærer en H2NNH- gruppe, en tiolreaktiv gruppe, en aktivert karboksylgruppe eller en aminogruppe kan være bifunksjonelle koblingsreagenser eller et anti-stoff eller et superantigen. Gruppene blir bundet direkte _^ til mettede karbonatomer, bortsett fra for H2NNH- gruppen, som som et alternativ også kan være bundet til et karbo-nylkarbon. Gruppene kan ha blitt innført på antistoffet eller superantigenet ved vanlig derivatisering.

Rekombinante teknikker gir effektive muligheter for fremstilling av konjugater hvor delene er spesifikt bundet sammen fra en terminal karboksylgruppe i én enhet til en terminal aminogruppe i den andre enhet. En bindingsstruktur som er konsistent med den anvendte teknikk kan bli satt inn.

De anvendte reagenser er valgt slik at de vil fremskaffe bidingen -B- som definert ovenfor. Vanlige bifunksjonelle reagenser har formelen Z-B'-Z', hvor Z og Z<1> er funksjonelle grupper som er gjensidig konsistente med hverandre og som tillater kovalent kobling til en funksjonell gruppe som er tilstede på et protein. Se ovenfor. B" er en inert bro som kan inneholde de samme strukturer som gitt for bindingen -B-ovenfor. Spesielt kan Z og Z' være identiske eller forskjellige og være valgt blant en tiolgruppe, en tiolreaktiv gruppe, en aktivert karboksylgruppe, -CONHNH2 osv. For en definisjon av desse grupper, se nedenfor under overskriften Nye Reagenser.

Fremgangsmåten som har blitt brukt for konjugatene anvendt

i den eksperimentelle del, omfatter trinnene:

(i) å omsette antistoffet eller superantigener med et organisk reagens inneholdende en tiolreaktiv gruppe og en aminoreaktiv gruppe for dannelse av et antistoff eller et superantigen som bærer den tiolreaktive gruppe, og (ii) å omsette den gjenværene del av superantigenet og antistoffet med et organisk reagens inneholdende en tiolgruppe eller en beskyttet tiolgruppe og en aminoreaktiv gruppe for dannelse av et superantigen eller et antistoff som bærer tiolgruppen eller den beskyttede tiolgruppe, hvoretter (iii) de erholdte produkter fra henholdsvis trinn (i) og (ii) omsettes med hverandre for dannelse av et konjugat hvor superantigenet bindes til antistoffet via et disulfid eller en tioeter.

Koblingsbetingelsene for hver gruppe er i og for seg kjent som anvendt i proteinkjemien. Koblingen kan foregå trinn-vis eller i ett trinn ved å danne intermediære funksjonelle grupper som kan bindes til utgangsmaterialet med inerte avstandsgivende armer. Generelt er betingelsene hvorunder syntesen og rensing/gjenvinning av konjugatet finner sted, alltid ikke-denaturerende for de involverte proteiner. Dette betyr normalt vandige medier og en pH-verdi og temperatur innenfor området henholdsvis pH 3-10 og 0°C-50°C. De nøyaktige verdier avhenger av gruppene som skal omsettes og konjugatet som skal gjenvinnes. Se mer under overskriften Nye reagenser.

Nye reagenser ( utviklet i forbindelse med oppfinnelsen) .

For den kjemiske syntese av konjugater med bindingen -B-har det blitt utviklet et nytt heterobifunksjonell reagens som stemmer overens med den generelle formel II:

m og n har samme betydning som ovenfor for formel (I) . Zj. er en HS-reaktiv elektrofil gruppe, tiol (-SH) eller beskyttet tio (f.eks. AcS-), med det forbehold at en tiolgruppe og en hydroksylgruppe ikke må være bundet til ett og samme karbon-atom i R. Eksempler på HS-reaktive elek-trofile grupper er: (i) halogen som er bundet til et mettet karbonatom, fortrinnsvis i form av et alfa-halo-alkylkarbonyl (f.eks. ____ Z1CH2CO-) ; (ii) aktivert tiol, fortrinnsvis et såkalt reaktivt disulfid (-SSRi) som er bundet til et mettet karbonatom;

(iii) 3 , 5-diokso-l-aza-cyklopent-3-en-l-yl.

For en definisjon av et reaktivt disulfid, se f .eks. EP-A-128.885, som er innbefattet pr. referanse.

Zi' er en aktivert karboksylgruppe, dvs. en elektrofil gruppe. Eksempler er karboksylsyrehalider (-C0C1, -COBr og -COI) , blandede karboksylksyreanhydrider (-COOOCRi) , reaktive estere, så som N-succinimidyloksykarbonyl, -C(=NH)-0R2, 4-nitrofenylkarboksylat (-CO-OC6H4N02) osv.

Ri og R2 kan være lavere alkyl (Ci-C6) og R2 også benzyl.

En av fordelene ved de nye reagenser er at de resulterer i uniforme konjugatsubstanser med hensyn til heltallet n i strukturen (OCH2CH2)n, dvs. n er den samme for hver enkelt molekyl av en gitt konj ugatsubstans.

Funksjonelle grupper som reagerer med Zi' og Zi kan være tilstede på native antistoff aktive molekyler eller native superantigener eller kan innføres på dem. Zi'- og Zi-termi-nalene kan så omsettes selektivt med det passende anti-stoff eller superantigen på en i og for seg kjent måte for disse typer grupper.

Kjente teknikker innbefatter kjedeforlengelse som starter enten fra de nye reagenser eller fra forbindelsene som skal konjugeres.

Kjedeforlengelse som anvender de nye reagenser kan f.eks. resultere i konjugater hvor -B- er: (1) -COR' -Sr-RCONHCH2CH2 (OCH2CH2) n0 (CH2) mCOY- ; CO binder til NH, (2) -COR1 -Sr-RCONHCH2CH2 (OCH2CH2)n0 (CH2) mCONHNH-R' 'NHN= ;

N= er vanligvis bundet til et sp<2->hybridisert karbon av-ledet fra en oksydert karbohydratstruktur i et antistoff eller et superantigen (når det er et glycoprotein) ,

(3) -CO(CH2)InO(CH2CH20)nCH2CH2NHCOR,-Sr- (forts.)

(forts . ) -RCONHCH2CH2 (OCH2CH2) n0 (CH2) mCOY- ;

CO- er bundet NH,

(4) -CO(CH2)mO(CH2CH20)nCH2CH2NHCOR<!>-Sr- (forts.)

(forts . ) RCONHCH2CH2 (OCH2CH2) n0 (CH2) mCONHNH-R' <1>NHN=;

N= er bundet som ovenfor i (2) ,

R, R' og R' 1 er alkylen valgt på samme måte som R i formel (I) . r har samme betydning som ovenfor.

Reagenset (Formel II) kan fremstilles ved å starte fra forbindelser som tilsvarer formel III:

m er lik et heltall 1 eller 2. n er lik et heltall 1-20,

så som 2-20 eller 3-9. Syntesen av visse forbindelser som tilsvarer formel, (III) med m=l og 2, og n= 1-10 har blitt beskrevet tidligere (Jullien et al., Tetrahedron Letters 29

(1988) 3803-06; Houghton and Southby, Synth.Commun. 19(18)

(1989) 3199-3209; og EP-A-410.280 (publisert 20.1.91) og Slama og Rando, Carbohydrate Research 88 (1981) 213-221 og Biochemistry 19 (1980) 4595-4600) .

Nye reagenser som stemmer overens med formel II, kan syntetiseres ved å omsette en forbindelse av formel III med et bifunksjonelt reagens av formel Z-B'-Z' som i og for seg er kjent, hvor Z = Zi, B<1> = R'' , dvs. som tidligere definert for R og R', og Z' = aktivert karboksyl som definert ovenfor. Etter reaksjonen blir -COOH-funksjonen _^ omformet til en aktivert karboksylgruppe, f.eks. Zi' = aktivert ester, så som N-succinimidylkarbonyl, 4-nitro-f enylosykarbonyl, 2, 4-dinitrofenyloksykarbonyl osv.

De nye forbindelser av formel III og deres nye derivater stemmer overens med polyetere av den generelle formel

hvor n er et heltall 2-20, fortrinnsvis 3-20 eller 3-9. X

er H2N- innbefattende den protonerte form derav (<+>H3N-) eller substituert H2N- som er transf ormerbar til H2N-, fortrinnsvis ved hydrolyse eller reduksjon. Eksempler er usubstituert amino (H2N-) ; nitro; amido (karbamido) , så som lavere acylamido (formylamido, acetylamido heksanoy-amido), innbefattende acylamidogrupper som har elektron-f jernende substituenter på acylenhetens alfa-atom, og da spesielt CF3CONH-, CH3COCH2CONH- osv; ftalimidoyl som eventuelt er ringsubstituert; karbamato (spesielt Ri'OCONH- og (Ri'OCO) (R2'OCO)N-, så som N-(t-butyloksykarbonyl) amino (Boe), N- (benzyl oksykarbonyl) amino og di (N-benzyloksy-karbonyl) amino (henholdsvis Z og diZ) , som eventuelt er ringsubstituert; alkylamino hvor karbonatomet som binder til nitrogenatomet er alfa til et aromatisk system, så som N-monobenzylamino og dibenzylamino, N-tritylamino (tri-fenylmetylamino) osv., innbefattende analoge grupper hvor metylkarbonatomet (innbefattende det benzyliske karbon-atom) er erstattet med et silisiumatom (Si) , så som N,li-di (tert-butylsilyl) amino; og 4-okso-l, 3,5-triazin-l-yl innbefattende slike som er substituert med lavere alkyl i sine 3- og/eller 5-posisjoner.

Ovenfor og senere i beskrivelsen står Ri' og R2' for lavere alkyl, spesielt sekundære og tertiære alkylgrupper og en metylgruppe som er substituert med 1-3 fenylgrupper som eventuelt er ringsubstituert. Lavere alkyl og lavere acyl-grupper har 1-6 karbonatomer.

Y er karboksy (-COON innbefattende C00"<1> eller en gruppe som er transf ormerbar til karboksyl, fortrinnsvis ved hydrolyse eller oksydasjon. De viktigste grupper er ester-gruppene hvori karbonylatomet eller det tilsvarende atom i orto-estere binder til metylengruppen i høyre terminal av formel (I). Eksempler er alkylestergrupper (-COORi<1>); ortoester-grupper (-C(OR3')3) og reaktive estergrupper som definert ovenfor. R3' har samme betydning som tidligere definert for Ri' .

Andre Y-grupper er -CHO, -CH, -CONH2/ -CONRi,R2', hvor Ri' og R2' har de samme betydninger som ovenfor.

Forbindelsen av formel IV kan syntetiseres fra kjente utgangsmaterialer ved å kombinere metoder som i og for seg er kjent. Passende synteseruter er:

A. Dannelse av kjeden.

B. Transformasjon av funksjonelle terminalgrupper.

C. Transformasjon av en symmetrisk polyeter til en usym-metrisk eter. D. Deling av en bisymmetrisk kjede til to identiske fragmenter . Passende utgangsmaterialer som har den gjentagende enhet -OCH2CH2-, er kommersielt tilgjengelige. Eksempler er oligo-etylenglykoler med 2 til 6 gjentagende enheter. Andre passende forbindelser med identiske terminalgrupper er tilsvarende dikarboksylsyrer og diaminer.

Passende utgangsmaterialer som har forskjellige terminalgrupper er omega-hydroksylmonokarboksylsyre, hvor termi-nalgruppene ligger fra hverandre med en ren polyetylen-oksydbro. Slike forbindelser som har opptil 5 gjentagende enheter, har blitt beskrevet i den tidligere teknikk (Nakatsuji, Kawamura og Okahara, Synthesis (1981) s. 42).

Farmasøytiske blandinger og fremstilling derav

De farmasøytiske blandinger som kan inneholde konjugater fremstilt ifølge oppfinnelsen, omfatter formuleringer som er kjent innenfor området. Således kan blandingene være i form av et frysetørket partikulært materiale, en steril eller aseptisk fremstilt oppløsning, en tablett, en ampul-le osv. Bærematerialer, så som vann (fortrinnsvis bufret til en fysiologisk pH-verdi så som PBS) eller annet inert faststoff- eller væskemateriale kan være tilstede. Gene-reit uttrykt blir blandingene fremstilt ved at konjugatet blandes med, oppløses i, bindes til eller på annen måte kombineres med ett eller flere vannuløselige eller vann-oppløselige, vandige eller ikke-vandige bærermaterialer,

om nødvendig sammen med passende additiver og adjuvanter. Det er viktig at bærematerialene og betingelsene ikke på uheldig måte påvirker konjugatets aktivitet. Vann som sådan er innbefattet i ekspresjonsbærermaterialene.

Tilførsels- og anvendelsesmetoder

Normalt vil konjugatet bli solgt og tilført i på forhånd utmålte doser, hvorav hver inneholder en effektiv mengde av konjugatet som, basert på resultatet som nå presenter-es, er antatt å ligge innenfor området 10 ug - 50 mg. Den nøyaktige dose varierer fra tilfelle til tilfelle og avhenger av pasientens vekt og alder, tilføringsrute, type sykdom, antistoff, superantigen, binding (-B-) osv.

Tilføringsruten er som vanlig kjent innen faget, dvs. en målcellelyserende effektiv mengde eller en terapeutisk effektiv mengde av et konjugat i henhold til oppfinnelsen settes i kontakt med målcellen. For de angivelser som er spesifisert ovenfor betyr dette for det meste parenteral tilførsel, så som injeksjon eller infusjon (subkutant, intravenøst, intra-arterielt, intramuskulært) til et pattedyr, så som et menneske. Konjugatet kan tilføres lokalt eller systemisk til individet som skal behandles.

Med "målcellelyserende effektiv mengde" er det ment at mengden er effektiv nok til å aktivere og dirigere CTLs til å ødelegge målcellen.

Oppfinnelsen er definert i de medfølgende krav, som er en del av beskrivelsen. Oppfinnelsen skal nå illustreres med et antall utførelsesformer som på ingen måte begrenser det generelle konsept som søker har oppdaget. Den eksperimentelle del presenterer i Del I den kjemiske syntese av konjugater og i Del II effekter av konjugatene fremstilt i eksempel 4 på aktiveringen av T-celler for lysering av målceller.

EKSPERIMENTELL DEL I

Fremstilling av omega- amino- peg- karboksylsyre Isopropropyl- 8- hydroksy- 3, 6- dioksa- oktanoat ( 1)

Natrium (23 g, 1,0 mol) i form av små skiver ble tilsatt

i porsjoner til dietylenglykol (500 ml) under nitrogen-atmosfære. Da natriumet hadde reagert fullstendig, ble blandingen avkjølt til romtemperatur og bromeddiksyre ble tilsatt (76 g, 0,5 mol) under omrøring. Etter 18 timer ved 100°C ble overskudd av dietylenglykol destillert fra ved omkring 4 mm Hg. Deretter ble isopropylalkohol (400 ml) og acetylklorid (51 g, 0,65 mol) i porsjoner tilsatt under omrøring. Etter 18 timer ved 65°C ble blandingen avkjølt til romtemperatur og nøytralisert med natriumacetat (3,5

g, 0,15 mol). Blandingen ble filtrert og filtratet inndampet nesten til tørrhet, hvoretter det ble oppløst i vann (200 ml). Vann- fasen ble ekstrahert med 1,1,1-trikloretan (3x50ml). De sammenslåtte organiske faser ble vasket med vann (20 ml) . Produktet ble ekstrahert fra de sammenslåtte vannfaser med diklormetan (50 ml) som etter inndamping gav en olje (55 g).

Isopropyl ll- hydroksy- 3, 6, 9- trioksa- undecanoat ( 2)

Natrium (23 g, 1,0 mol) i form av små skiver ble tilsatt porsjonsvis til trietylenglykol (700 ml) under nitrogen-atmosfære. Da natriumet hadde reagert fullstendig, ble blandingen avkjølt til romtemperatur og bromeddiksyre ble tilsatt (76 g, 0,5 mol) under omrøring. Etter 18 timer ved 100°C ble overskudd av dietylenglykol destillert fra ved omkring 4 mm HG. Deretter ble isopropylalkohol (400 ml) og acetylklorid porsjonsvis (51 g, 0,65 mol) tilsatt. Etter omrøring i 18 timer ved 65°C ble blandingen avkjølt til romtemperatur og nøytralisert med natriumacetat (3,5 g, 0,15 mol). Blandingen ble filtrert og filtratet inndampet nesten til tørrhet, hvoretter det ble oppløst i vann (200 ml). Vannfasen ble ekstrahert med 1,1,1-trikloretan (3x-50ml). De sammenslåtte organiske faser ble vasket med vann (20 ml) . Produktet ble ekstrahert fra de sammenslåtte vannfaser med diklormetan (50 ml) , som etter inndamping gav en olje.

xH-n.m.r. (CDC13) ; l,26(d, 6H) ; 3,07(s,2H); 3 , 6-3 , 8 (m, 12H) ; 4,11(S,2H); 5,09(m,1H).

8-( N- ftalimidoyl)- 3, 6- dioksa- oktanol ( 3)

8-klor-3,6-dioksa-oktanol (365 g, 2,2 mol, fremstilt fra trietylenglykol og S0C12) ble oppløst i dimetylformamid (400 ml) og kaliumftalimid (370 g, 2,0 mol) ble tilsatt under omrøring. Etter omrøring i 18 timer ved 110°C ble dimetylf ormamid destillert fra ved redusert trykk. Residuet ble suspendert i toluen (1,5 1) ved 40-50°C og kali-umklorid ble filtrert fra. Produktet krystalliserer ved avkjøling (-10°C) . En andre fraksjon kan oppnås fra moder-luten ved å konsentrere denne og gjenta krystalliserings-prosedyren.

^-n.m.r. (CDCI3) ; 2,90(s,lH); 3 , 51-3, 58 (m, 2H) ; 3,60-3,58(m,6H); 3,73-3,78 (t,2H); 3,89-3,94 (t,2H) ; 7,70-7,89(m,4H).

Isopropyl 17-( N- ftalimidoyl)- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksa-heptadecanoat ( 4)

En oppløsning av pyridin (2,8 ml, 35 mmol) i diklormetan (30 ml) ble tilsatt dråpevis under omrøring ved omkring - 5°C til en oppløsning av 8-(N-ftalimidoyl)-3,6-dioksa-oktanol (3) (8,5 g, 36 mmol) og trifluormetansulfonsyrean-hydrid (10,2 g, 36 mmol) i diklormetan. Etter omkring 30 min ble den organiske fase vasket med 0,5 M saltsyre og vann. Etter tørking (Na2S04) og filtrering ble isopropyl 8-hydroksy-3,6-dioksa-oktanoat (1) (12 g, 48 mmol) og Na2P04 (6,5 g, 46 mmol) tilsatt, hvorpå blandingen ble kraftig omrørt i 20 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble filtrert og filtratet inndampet. Residuet ble fordelt mellom 1,1,1-trikloretan og vann. Inndamping av den organiske fase resulterte i en olje (13 g) .

1H-n.m.r. (CDC13) ; Ul,26(d,6H); 3, 58-3 , 76 (m, 18H) ; 3,90(t,2H); 4,ll(s,2H); 5,09(m,lH); 7,70-7, 89(m,4H).

17-( N- ftalimidoyl)- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksa- heptadecansyre ( 5)

Isopropyl (17-(N-ftalimidoyl)-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadecanoat (4) (13 g) ble oppløst i tetrahydrofuran (50 ml) og saltsyre (kons., 50 ml)). Etter 16 timer ved romtemperatur ble oppløsningen fortynnet med vann (200 ml) og tetrahydrofuran ble fjernet ved redusert trykk. Vannfasen ble vasket med toluen (lx) og ekstrahert med diklormetan (2x) . Tørking (Na2S04) og inndamping av den organiske fase resulterte i produktet i form av en olje (8,5 g). ^-n.m.r (CDC13) : U 3, 57-3, 76 (m, 18H) ; 3,91(t,2H); 4,ll(s,2-H) ; 4,8(br,2H); 7,65-7,90(m,4H) .

Isopropyl l7- amino- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksa- heptadecanoat ( 6)

17-(N-ftalimidoyl)-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadecansyre

(5) (8,5 g) ble oppløst i 150 ml etanol og 3 ml hydrazin-hydrat. Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur, hvorpå HC1 (100 ml, 3M) ble tilsatt, og oppløsningen ble så kokt under til-bakeløp i 3 timer. Etter avkjøling til romtemperatur og filtrering ble pH justert (pH 9, NaOH), og filtratet ble inndampet nesten til tørrhet. Det ble tilsatt vann og ny inndamping nesten til tørrhet ble utført, hvoretter oppløsningens pH ble justert (pH 4, HC1), etterfulgt av inndamping til tørrhet. Produktet ble behandlet med isopropanoil (100 ml) og acetylklorid (2 ml) ved romtemperatur i løpet av natten og inndampet. Residuet ble samlet opp i vann og ekstrahert i diklormetan ved en alkalisk pH (7-11). Inndamping resulterte i produktet (3,3 g).

^-n.m.r. (CH3OD) :U 1,26 (d,6H) ; 3,17 (t, 2H) ; 3,65-3,80(M, 18H); 4,16(s,2H); 5,07(m,1H).

FORMLER FOR SYNTETISERTE AMINO- PEG- KARBOKSYLSYRER

H- (OCH2CH2) nCH2CO-OCH (CH3) 2

Forbindelse 1: n = 1

Forbindelse 2: n = 1

PhtN-CH2CH2- (OCH2CH2) 2OH

Forbindelse 3, PhtN- = N-ftalimidoyl

PhtN-CH2CH2- (OCH2CH2) 4CH2CO-OCH (CH3) 2 Forbindelse 4, PhtN = N-ftalimidoyl

PhtN-CH2CH2- (OCH2CH2)4CH2CO-OH

Forbindelse 5

H2N-CH2CH2- (OCH2CH2) 4CH2CO-OH

Forbindelse 6

FREMSTILLING AV BIFUNKSJONELLE REAGENSER OG

KO PLINGSPRODUKTER

Strukturelle formler er angitt på et separat ark.

Eksempel 1 Fremstilling av N-hydroksysuccinimidester av 17-iodoacetamido-3,6,9,12,15 pentaoksa-heptadecansyre

A. Fremstilling av 17- iodoacetylamino- 3, 6, 9, 12, 15-pentaoksaheptadecansyre (A)

Isopropyl 17-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecanoat (se del I av den eksperimentelle del) (1,1 g, 3,2 mmol) ble oppløst i 3 ml 1 M natriumhydroksydoppløsning og fikk stå ved romtemperatur i 30 min. 1,5 ml 5 M saltsyre ble tilsatt, og blandingen ble inndampet til tørrhet. Residuet ble tatt opp i diklormetan og filtrert for å gi 545 mg av 17-amino-3, 6, 9,12,15-pentaoksaheptadecansyre etter inndamping av oppløsningsmidlet. 460 mg (1,39 mmol) av denne forbindelse ble oppløst i 10 ml boratbuffer pH 8,4. Opp-løsningen ble deaerert med nitrogengass. En oppløsning av 432 ml (1,52 mmol) N-succinimidyl-2-iodoacetat i 5 ml dioksan ble tilsatt dråpevis i løpet av 1 min og pH ble holdt ved 8,4 ved tilsetning av 5 M NaOH. Reaksjonsoppløs-ningen ble omrørt i 15 min under innløp av nitrogengass. I henhold til tynnsjiktskromatografi (elueringsmiddel: CH2Cl2-MeOH 60:35) var reaksjonen fullstendig etter et par minutter. Etter 15 min ble pH av reaksjonsoppløsningen justert til 3, og oppløsningen ble frosset og frysetørket. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert på en revers fase-kolonne PEP-RPC HR 30/26 (Pharmacia Biosystems AB) under anvendelse av en gradient på 0-13% acetonitril med 0,1% trifluoreddiksyre, fulgt av isokratisk separasjon ved 13% acetonitril, 0,1% TFA. Fraksjoner fra den ønskede topp ble slått sammen og frysetørket, noe som gir 351 mg 17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadecansyre (A) .

Utbytte: 76%.

Strukturen av produktet ble fastslått ved hjelp av dets NMR-spektrum. <X>H NMR-spektrum (D20) uttrykt som 6-verdier:

-OCH2CH2O- 3,71-3,76, -NHCH2CH2O- 3,65 t,

-NHCH2CH2O- 3,41

B. Fremstilling av N- hydroksysuccinimidester av 17- iodoacetylamino- 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksaheptadecansyre (B)

Hydroksysuccinimid (4,5 mg, 39 umol) ble innveid i reaksjonsskipet. 17-iodoacetylamino-3.6.9.12.15-pentaoksaheptadecansyre (A) (18,3 mg, 39 umol) ble oppløst i 0,55 ml tørr dioksan og tilsatt til reaksjonsskipet. Skipet ble deaerert med nitrogengass og deretter ble en oppløsning av 8,0 mg (39 umol) dicykloheksylkarbodiimid i 0,15 ml tørr dioksan tilsatt dråpevis til reaksjonsskipet. Skipet ble fylt med nitrogengass, lukket og plassert i mørke. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3,5 time. Presipitatet som dannet seg ble fjernet ved filtrering. Prosentdelen av dannet produkt (B) i filtratet ble bestemt med NMR-analyse til å være 89%.

Eksempel 2 Fremstilling av (17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecanoyl-amino) -immunoglobulin (C)

A. Monoklonalt antistoff Mab C215

Et monoklonalt antistoff av immunoglobulin klasse IgG2a (Mab C215) (34 mg, 0,218 umol) oppløst i 17,7 ml 0,1 M boratbuffer pH 8,1 inneholdende 0,9% natriumklorid ble tilsatt et reaksjonskammer. 146 ul av en dioksanoppløsning inneholdende 3,6 mg (6,4 umol) N-hydroksy-succinimideter av 17-iodoacetylamino-3 -6-9-12-15-pentaoksaheptadecansyre (B) ble inji- sert inn i bufferoppløsningen og reaksjonen ble sluttført under omrøring i 25 minutter ved romtemperatur. Reaksjonskammeret ble dekket med folie for å ute-lukke lys. Overskudd av reagens B ble fjernet ved fraksjonering på Sephadex G 25 K 26/40-kolonne under anvendelse av 0,1 M fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 0,9% natriumklorid som elueringsmiddel. Fraksjoner inneholdende det ønskede produkt C ble slått sammen. Oppløsningen (22 ml) ble konsentrert i en Amicon-celle gjennom et YM 30-filter til 8 ml. Konsentrasjonene og graden av substitusjon ble bestemt ved aminosyreanalyse til å være henholdsvis 4,7 mg/ml og 18 avstandsgivende enheter pr. Mab C215.

B. Monoklonalt antistoff Mab C242

En monoklonalt antistoff (Mab C242) av immunoglobulinklassen IgG 1 ble omsatt med 15, 20 og 22 ganger molart overskudd av N-hydroksysuccinimidester av 17-iodoacetylamino-3 , 6, 9,12,15-pentaoksaheptadecansyre (B) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2A, noe som gir nona-, dodeca- og tetradeca(17-iodoacetylamino)-3,6,9, 12,15-pentaoksaheptadecanoylamino)-Mab C242 . (C)

C. Monoklonalt antistoff Mab C

Et monoklonalt antistoff (Mab C) av immunoglobulinklassen _ IgG 2a ble omsatt med henholdsvis 14 og 18 ganger molart overskudd av N-hydroksysuccinimidester av 17-iodacetyl-amino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecansyre (B) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2A, noe som gir tetra-og hepta(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksa-hepta-decanoylamino) Mab C. (C) .

Eksempel 3 Fremstilling av 2-merkaptopropionylamino-Eu<3->merket stafylokokkisk enterotoksin A (SEA)

A. Fremstilling av Eu3- merket SEA ( D)

SEA (frysetørket produkt fra Toxin Technology Inc.) (2 mg, 72 nmol) ble oppløst i 722 pl milli-Q vann og tilsatt til et 15 ml polypropylenrør. 100 ul av 0,1 M boratbuffer pH 8,6 ble tilsatt og deretter 2160 nmol av Eu<3+->chelatrea-genser (Pharmacia Wallac Oy) i 178 pl milli-Q. Reaksjonen ble gjort fullstendig ved romtemperatur over natten. Overskudd av reagens ble fjernet ved fraksjonering av reak-sjonsoppløsningen på Sephadex G 25 PD 10-kolonne (Pharmacia Biosystems AB) under anvendelse av 1,0 M fosfatbuffer pH 8,0 som elueringsmiddel. Fraksjoner med det ønskede produkt D ble slått sammen. Oppløsningen (3 ml) ble konsentrert i en Amicon celle gjennom et UM5-filter til et volum på 0,8 ml. Konsentrasj onene ble bestemt med aminosyreanalyse til å være 1,7 mg/ml. Substitusjonsgraden ble bestemt ved å sammenligne med en EuCl3 standard oppløsning til å være 0,8 Eu<3+> pr. SEA.

Bl. Fremstilling av 3-( 2- pyridyltio) propionylamino Eu<3*->merket SEA ( E) og 3- merkaptopropionylamino Eu3*- merket

SEA ( F)

Eu<3+->SEA (1,24 mg, 44,8 nmol) i 0,75 ml 0,1 M fosfatbuffet _ pH 8,0 ble tilsatt til et 15 ml polypropylenrør. 35 pl

(180 nmol) av en oppløsning av 1,6 mg N-succinimidyl-3-(2-pyri-dylditio)-propionat i 1 ml etanol ble tilsatt til røret, og reaksjonsoppløsningen ble omrørt i 30 minutter ved romtempe- råtur. Det erholdte produkt E ble ikke iso-lert før det ble redusert til produkt F.

Til reaksjonsoppløsningen fra det ovennevnte ble det tilsatt 20 ul 0,2 M Eu<3+->sitratoppløsning og 50 pl 2M eddik-syre for å justere pH til 5. Deretter ble en oppløsning av 3,1 mg ditiotreitol (Merck) i 0,1 ml 0,9% natriumklorid tilsatt, og reaksjonsoppløsningen ble omrørt i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble det totale volum justert til 1 ml ved tilsetning av 50 pl 0,9% natriumkloridopp-løsning. Reaksjonsoppløsningen (1 ml) ble plassert på en Sephadex G25 NAP-10-kolonne (Pharmacia Biosystems AB) og det ønskede produkt F ble eluert ved tilsetning av 1,5 ml 0,1 M fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 0,9% natriumklorid. Det eluerte produkt F ble samlet opp i et 15 ml polypropy-lenrør og umiddelbart brukt i syntesen av produkt G for å unngå oksydasjon til en disulfidforbindelse.

B2. Fremstilling av 2- merkaptopropionylamino-stafylokokkisk enterotoksin A ( SEA) (F2)

Nativt SEA (frysetørket produkt fra Toxin Technology Inc) eller rekombinant fremstilt SEA (rSEA) ble omsatt med 2 ganger molart overskudd av N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionat i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3B1.

Substitusjonsgraden ble bestemt med UV-analyse i henhold til Carlsson et al. (Biochem. J. 173 (1978) 723-737) til å være 1,9 merkaptopropionylgruppe pr. SEA.

Eksempel 4 Fremstilling av SEA-monoklonalt antistoffkonjugat (61 og G2) _

A. Konjugater mellom Eu3*- SEA og Mab C215 ( Gl)

Til oppløsningen av 4-merkaptopropionylamino Eu<3+->merket SEA (F) beskrevet i eksempel 3B ble det tilsatt 1,2 ml av en oppløsning av oktadeka(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecanoylamino)Mab C215 (C) (4 mg) i 0,1 M fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 0,9% natriumklorid. Reaksjonen ble avsluttet ved oppbevaring i romtemperatur over natten. Uomsatte jodalkylgrupper ble så blokkert ved tilsetning av 5 pl (1,2 umol) av en oppløsning av 20 pl merkaptoetanol i 1 ml vann. Reaksjonsoppløsningen ble etter-latt i 10 timer ved romtemperatur og så filtrert. Filtratet ble så fraksjonert på en Superose 12 HR 16/50-kolonne (Pharmacia Biosystems AB) ved som elueringsmiddel å bruke 0,002 M fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 0,9% natriumklorid. Fraksjoner med det ønskede produkt G ble slått sammen og analysert. Proteininnholdet var 0,22 mg/ml bestemt ved aminosyreanalyse. Substitusjonsgraden var én SEA pr. IgG bestemt ved Eu<3+->bestemmelse. Produktet ble også studert for immunostimulerende egenskaper og antistoffbin-dende evner.

Ved å øke mengden av forbindelse (F) i forhold til forbindelse (C) ble høyere substitusjonsgrad erholdt.

B. Konjugater mellom rSEA og Mab C215 (G2)

Oktadeka(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksahepta-decanoylamino)Mab C215 (C) ble omsatt i 1,8 ganger molart overskudd av 2-merkaptopropionylamino-rSEA (F2) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4A. Sammensetningen av konjugatet ble analysert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) på Phast-Gel<L gradient 4-14, og bindingene ble detektert med Phast IMAGE (Pharmacia Biosystems AB). Det erholdte konjugat besto av 6% Mab C215 med tre SEA, 15% med to SEA, 28% med ett SEA og 51% usubstituert Mab C215.

I et annet forsøk ble 2,7 ganger molart overskudd av F2 brukt, noe som gir et konjugat med sammensetningen 15% Mab C215 med tre SEA, 25% med to SEA, 34% med ett SEA og 26% usubstituert Mab C215.

C. Konjugater mellom rSEA og Mab C242

Cl. Tetradeka(17-iodoacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksa-heptadecanoylamino)Mab C242 (C) ble omsatt med 3,2 ganger molart overskudd av 2-merkaptopropionylamino-rSEA (F2) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4A. Sammensetningen av konjugatet ble analysert som beskrevet

i eksempel 4B og ble funnet å være 4% Mab C242 med fire SEA, 12% med tre SEA, 28% med to SEA, 36% med ett SEA og 20% usubstituert Mab C242.

Den samme reaksjon ble utført, men reaksjonsproduktet ble behandlet 4 timer med 0,2 M hydroksylamin før kolonnefrak-sjonering for å fjerne ustabile bindinger mellom Mab C242 og den avstandsgivende gruppe og mellom SEA og merkapto-propionylgruppen. Konjugatet som ble dannet hadde sammensetningen 1% Mab C242 med fire SEA, 12% med tre SEA, 27% med to SEA, 36% med ett SEA og 24% usubstituert Mab.

C2 . Dodeka( 17-iodoacetylamino-3, 6,9,12,15-pentaoksahepta-decanoylamino)Mab C242 (C) ble omsatt med 3 ganger molart overskudd av 2-merkaptopropionylamino-rSEA (F2) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4A. Det erholdte komjugat hadde sammensetningen 6% Mab C242 med tre SEA,

26% med to SEA, 36% med ett SEA og 31% usubstituert Mab C242.

C3 . Nona (17-iodoacetylamino-3, 6, 9,12,15-pentaoksahepta-decanoylamino)Mab C242 (C) ble omsatt med 3 ganger molart overskudd av 2-merkaptopropionylamino rSEA (F2) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4A. Det erholdte konjugat hadde sammensetningen 13% Mab C242 med to SEA,

39% med ett Sea og 46% usubstituert Mab C242.

D. Konjugater mellom rSEA og Mab C

Dl. Hepta (17-iodoacetylamino-3, 6, 9,12,15-pentaoksahepta-decanoylamino)Mab C ble omsatt med 5,4 ganger molart overskudd av 2-merkaptopropionylamino-rSEA (F2) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4A. Sammensetningen av konjugatet ble analysert som beskrevet i eksempel 4B og ble funnet å være 15% med fire SEA, 24% med tre SEA, 29% med to SEA, 19% med ett SEA og 3% usubstituert Mab C og 10% i en dimer form.

Den samme reaksjon ble utført med 0,2 M hydroksylamin til stede for å fjerne ustabile bindinger mellom Mab C og den avstandsgivende gruppe og mellom SEA og merkaptopropionyl-gruppen. Det dannede konjugat hadde den følgende sammensetning: 11% Mab C med tre SEA, 24% med to SEA, 30% med to SEA, 30% med ett SEA, 18% usubstituert Mab C og 17% i en dimer form.

D2 . Tetra( 17-iodoacetylamino) -3,6, 9,12,15-pentaoksahepta-decanoylamino)Mab C ble omsatt med 5,7 ganger molart overskudd av 2-merkaptopropionylamino-rSEA (F2) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4B. Konjugatet hadde følgende sammensetning: 8% Mab C2 med fire SEA, 18% med tre SEA, 30% med to SEa, 26% med ett SEa, 5% usubstituert Mab C og 12% i en dimer form.

Eksempel 5 Fremstilling av [17-(3-merkaptopro-piony 1 - amino )-3,6#9,12,15 -pen taoksa - heptadecanoyl-amino]-rSEA (I)

A. Fremstilling av 17-[ 3-( 2- pyridylditio) propionylamino] - 3 , 6, 9, 12, 15- pentaoksaheptadecanoylamino)- rSEA (H)_

En oppløsning av N-hydroksysuccinimidester av 17-[3-(2-pyridylditio)propionylamino]-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecansyre (K) (0,53 mg (896 nmol) i 43 pl dioksan) ble in-jisert i en oppløsning av 3,67 mg (128 nmol) rSEA i 1 ml 0,1 M fosfatbuffer pH 7,5 inneholdende 0,9% natriumklorid. Reaksjonen var fullstendig på 30 minutter ved romtemperatur. 100 pl ble tatt ut for analysering av substitusjonsgrad. Resten ble lagret frossen inntil den ble redusert

til produkt I.

Substitusjonsgraden ble bestemt ved å avsalte 100 pl av reaksjonsløsningen på en Sephadex G50 NICK-kolonne (Pharmacia Biosystems AB) og analysere eluatet med UV-spektro-skopi i henhold til Carlsson et al. (Biochem. J. 173

(1978) 723-737). 2,7 avstandsgivende grupper var koblet

til rSEA.

B. Fremstilling av [ 17-( 3- merkaptopropionylamino) - 3, 6, 9, 12, 15- pentaoksaheptadecanoylamino] - rSEA ( I)

pH av reaksjonsoppløsningen med produkt H (0,9 ml) ble justert med 2 HC1 til pH 4,4 og 2,9 mg ditiotreitol opp-løst i 75 pl 0,9% natriumklorid ble tilsatt. Reduksjonen ble gjort fullstendig i 30 minutter. Reaksjonsoppløsningen ble tilsatt til en Sephadex G25 NAP 10-kolonne (Pharmacia Bio- systems AB) og eluert med 1,5 ml 0,1 M fosfatbuffer

pH 7,5 med 0,9% NaCl og umiddelbart brukt i syntesen av produktet J i eksempel 11.

Eksempel 6 Fremstilling av SEA-monoklonalt anti-stoff konjugat J med et dobbelt avstandsgivende materiale

Dodeca(17-iodacetylamino-3,6,9,12,15-pentaoksaheptade-canoylamino) Mab C242 (C) (4,2 mh, 27 nmol i 1,0 ml av 0,1

M fosfatbuffer pH 7,5 med 0,9% NaCl) ble omsatt i løpet av , 43 timer med [17-(3-merkaptopropionylamino)-3,6,9,12,15-pentaoksaheptadecanoylamino] -rSEA (I) (1,17 mg, 42 nmol i

1 ml av den ovenfornevnte buffer) i mørke i nitrogenatmos-fære. Deretter ble 1,14 umol merkaptoetanol tilsatt. Etter ytterligere 1 time ble reaksjonsoppløsningen fraksjonert på en Superdex 200 HR 16/65-kolonne. Produktet ble eluert med 2 mM fosfatbuffer pH 7,5 med 0,9% NaCl. Fraksjoner med det ønskede produkt J ble slått sammen og analysert som beskre- vet i eksempel 4B. Konjugatet beto av 9% Mab C242

med to SEA, 25% med ett SEA og 66% usubstituert Mab C242.

EKSPERIMENTELL DEL II

Effekter av superantigen- antistoffkonjugater på celler

Det bakterielle toksin brukt i de følgende forsøk var Staphylococcus enteroxin A (SEA) erholdt fra Toxin Tech-nologies (WI, Usa) eller fremstilt som et rekombinant protein fra E. coli.

Antistoffene var C215, C242 og Thy-1.2 mAbs. C215 er et IgG2a mAb fremskaffet mot human tarmkarsinom cellelinje og reagerer med et 37kD-protein antigen på flere humane tarm-cellelinjer. Referanser til disse mAbs er blitt gitt ovenfor. Konjugatene blir fremstilt som beskrevet i den fore-gående del.

Før foreliggende prioritetsdato hadde det vært utført stu-dier kun med Eu<3+->merket SEA-C215 mAb-konjugater. I løpet av prioritets-året har resultatene blitt bekreftet med umerket SEA-215, SEA-242 og SEA-Thy-1.2 mAb-konjugater. Resultatene som nå er innbefattet refererer til umerkede konjugater.

For å bestemme cytotoksisiteten mediert av SEA-C215 mAb-konjugatet og ukonjugert SEa og C215 mAb mot tarmkarsinomceller som mangler MHC klasse II eller som uttrykker lave, men upåviselige mengder av MHC klasse II, anvendte søker forskjellige humane SEA-utvidede T-cellelinjer som effek-torceller og et antall tarmkarsinomceller og MHC klasse II<+> RAji-celler som målceller. Tarmkarsinom cellelinjene Colo205, SW20 og WiDr manglet alle ekspresjon av MHC klasse II, som ble bestemt ved å farge med mAbs mot HLA-DR, HLA-DP og HLA-DQ og FACS analyse. De SEA-ekspanderte T-cellelinjer ble etablert fra perifert blod ved ukentlige restimuleringer med mitomycin C-behandlede MHC klasse II<+ >BSM-lymfomceller på forhånd belagt med SEA i nærvær av rekombinant IL-2 (20 enheter/ml). Disse T-cellelinjer var sterkt cytotoksiske mot Raji- eller BSM-celler belagt med SEA, men ikke overfor ubelagte celler eller celler belagt med stafylokokkisk enterotoksin B (SEB). Denne SEA-induserte avlivning er avhengig av interaksjon av SEA med MHC klasse II på mål- cellen som bestemt ved bruken av blok-kerende HLA-DR-anti-stoff, MHC klasse II" Raji mutantceller og HLA-DR transfekterte L-celler (Dohlsten et al., Immuno-logy 71, (1990) 96-100). Disse T-cellelinjer kan bli aktivert til å drepe C215<+> MHC klasse II" tarmkarsinomceller av C215-SEA-konjugatet. I kontrast til dette var ukonjugerte SEA og C215 mAb ute av stand til å indusere mer enn margi-nal T-celledreping mot C215<+> MHC klasse II' tarmkarsinomcellene. Den stafylokokkiske enterotoksin antistoffkonju-gatavhengige cellemedierte cytotoksisitet var avhengig av binding av SEA-C215 mAb-konjugatet til C215<+> tumorcellene. Spesifisiteten i denne binding ble vist ved det faktum at overskudd av ukonjugerte C215 mAb, men ikke de irrelevante C242 og W6/32 mAbs inhiberte lysis av tarmkarsinomcellene. CD4<+> og CD8<+> T-celler viste avliving av SEA-C215-behandlede C215<+> tarmkarsinomceller, men lyserte ikke SEA-behandlede celler. Interaksjonen av T-celler med SEA-C215 mAb-konjugat bundet til MHC klasse II" tumorceller synes å involvere interaksjon med spesifikke V-beta TCR-sekvenser på en lignende måte som tidligere vist for SEA-indusert avliving av MHC klasse II<+->celler. Dette ble indikert ved interaksjonen av en SEA-spesifikk, men ikke en autolog SEB-spesifikk T- _ cellelinje med C215-SEA-konjugatet. C242 mAb og Thy-1.2 mAb-konjugatene viste aktivitet som var analog med C215 mAb-konjugatet.

Krom- merking og inkubering av målcellene med SEA

0,75xl0<6> målceller og 150 pCi <51>krom (Amersham Corp., Arlington Heights, England) ble inkubert i 45 minutter ved 37°C i et volum på lOOpl. Cellene ble holdt i fullstendig

medium inneholdende RPMI-164 0-medium (Gibco, Paisley,

GBR) , supplementert med 2,8% (v/v) 7,5% NaHC03, 1% natrium-pyrovat, 2% 200 mM L-glutamin, 1% IM Hepes, 1% 10 mg/ml gentamisin og 10% fatalt kalveserum (FCS, Gibco, Paisley, GBR). Etter inkuberingen ble cellene vasket én gang i fullstendig medium uten FCS og inkubert i 60 min ved 37°C og vasket og resuspendert i fullstendig medium inneholdende 10% FCS. 5xl0<3> målceller ble tilsatt til hver brønn av U-bunnede 96-brønners mikrotiterplater (Coster, Cambridge,

USA) .

Cytotoksisitets- assay

Effektorcellene ble tilsatt til brønnene i forskjellige ef fektor/målcelleforhold. Det endelige volum i hver brønn

var 200 pl. Hvert forsøk ble foretatt i triplikat. Platene ble inkubert 4 timer ved 37°C, hvoretter det frigjorte krom ble innhøstet. Mengden av <51>Cr ble bestemt i en gammateller (Cobra Auto-gamma, Packard). Den prosentvise cytotoksisitet ble utregnet ved formelen % cytotoksisitet = (X-M) /

(T/M) <*> 100, hvor X er kromfrigjøringen som cpm erholdt i forsøksprøven, M er den spontante kromfrigjøring av målceller inkubert med medium og T er den totale kromfrigj ør-ing erholdt ved å inkubere målcellene med 1% natriumdode-cylsulfat.

RESULTATER

SEA-C242, SEA-C215 og SEA-anti-Thy-1.2 mAB-konjugater binder til celler som uttrykker henholdsvis de relevante epitoper av mAbs, og til MHC klasse II<+->celler. Ukonjugert SEA på den annen side binder kun til MHC klasse II<+->celler. Ukonjugerte C215, C242 og Thy-1.2 mAbs binder til de relevante celler, men ikke til Raji-celler (Tabell 1).

Humane T-cellelinjer lyserte MHC klasse II" SW620-, Colo205- og WIDr-cellene i nærvær av SEA-C215 mAb-konjugat, men ikke i nærvær av ukonjugert SEA og C215 mAb (fig. 1) . Lysis av tarmkarsinomceller ble observert ved 10-100 ng/ml av SEA-C215 mAb-konjugat. Høye lysisnivå ved forskjellige effektor til målcelle-forhold ble observert med SEA-215 mAb-konjugat mot SW620 (fig. 1) . I motsetning til dette fremskaffet ukonjugert SEA eller C215 mAb ingen cytotoksisitet mot SW620-celler ved alle de undersøkte effektor til målforhold.

Dette indikerer at kapasiteten til å lysere MHC klasse II" <c>olo205-celler er begrenset til konjugatet og kan ikke in-duseres av ukonjugert SEA og C215 mAbb. SEA og SEA-C215 mAb-konjugat, men ikke C215 mAb fremmet T-celle-avlivning av MHC klasse II<+> Raji-celler og av interferonbehandlede MHC klasse II<+> Colo205-celler (fig. 1).

For å demonstrere at den SEA-C215 mAm-konjugatmedierte lysis involverte spesifik binding av konjugatet til C215-mAb-mole-kylet på målcellene, utførte søker blokkerings-studier med overskudd av ukonjugert C215 mAb og mAb C242, som binder til et irrelevant antigen på tarmkarsinomcellene (med hensyn til C215-binding) . Tilsetning av mAb C215 blokkerte sterkt cytotoksisitet, mens C242 mAb ikke hadde noen innvirkning (fig. 2) . Lignende lysis av et SEA C242 mAb-konjugat ble spesifikt blokkert ved overskudd av ukonjugert C242 mAb, men ikke C215 mAb.

SEA-C215 mAb-konjugatets evne til å indusere T-celleav-hengig lysis av MHC klasse II SW620 tarmkarsinomceller ble obser- vert både i DC4<+> og CD8<+> T-cellepopulasjoner (tabell 2) . SEA aktiverte ikke noen av disse T-cellesubklasser til å frem- skaffe avliving av SW620-celler, men induserte lysis av MHC klasse II<+> Raji-celler (tabell 2) .

SEA-C215 mAb-konjugatet induserte lysis av SW620 og Raji-celler med en SEA-ekspandert T-cellelinje, men ikke med en SEB-ekspandert T-cellelinje (fig. 3). Spesifisiteten av SEA-og SEB-linjene er indikert ved deres selektive respons til henholdsvis SEA og SEB når de er eksponert til Raji-celler (fig. 4). Dette indikerer at SEA-C215 mAb-konjugatet opprettholder lignende V-beta TCR-spesifisitet som for ukonjugert SEA.

Beskrivelse av figurene

Fig. 1. SEA-C215 mAb-konjugatet dirigerer CTL mot MHC klasse II" tarmkarsinomceller. Øvre venstre rute viser effekten av SEA-responsive CTL mot SW620-celler ved forskjellige effektor-til-mål-forhold ved fravær (-) eller nærvær av SEA-C215 mAb-konjugat, SEA, C215 og en blanding av C215 og SEA (C215+SEA) ved en konsentrasjon på 1 pg/ml av hvert additiv. De andre vinduer viser kapasiteten av SEA-C215 mAb-konjugat og SEA til mål-SEA-responsive CTL

mot C215+MHC klasse II" tarmkarsinomcellelinjer SW620, Colo205 og WiDr, MHC klasse II<+> C215<+> interferonbehandlede Colo205-celler og C215- MHC klasse II<+> Raji-celler. Effektor til mål-forhold var 30:1. Tilsetning av ukonjugert C215 mAb, ved flere konsentrasjoner, induserte ikke noen CTL-målgiving mot disse cellelinjer. FACS-analyse på AW620-celler, Colo205 og WiDr-celler ved å bruke mAbs mot HLA-DR, -DP, -DQ lyktes ikke i å påvise noen MHC klasse II overflateekspresjon, mens stor ekspresjon av HLA-DR, -DP

og -DQ ble påvist på Raji-celler og HLA-DR og -DP på interferonbehandlede Colo205-celler. Colo205-celler ble behandlet med 1000 enheter/ml rekombinant interferon-gamma _ i 48 timer før bruk i CTL-assayet.

Fig. 2 SEA-C215 mAb-konjugat indusert og SEA-C242 mAb-konju-gat indusert CTL-mål set ting mot tarmkarsinomceller avhenger av antigenselektiviteten av mAb. Lysis av Colo205-celler av en SEA-responsiv CTL-linje i nærvær av SEA-C215 mAb- og SEA-C242 mAb-konjugat (3 pg/ml) blir blokkert ved tilsetning av henholdsvis ukonjugert C215

og C242 mAbs (30 pg/ml) . De ukonjugerte mAbs eller kon-

trollmedium (-) ble tilsatt til målcellene 10 minutter før konjugatene. Fig. 3. Lysis av SEA-C215 mAb-konjugat-belagte tarmkarsinomceller blir fremmet av SEA, men ikke av SEB-responde-rende CTLs. Autologe SEA- og SEB-selektive T-cellelinjer ble brukt ved et effektor til mål-forhold på 10:1 mot SW620- og Raji-målceller ved fravær (kontroll) eller nærvær av SEA-C215 mAb-konjugat, en blanding av ukonjugert C215 mAb og SEA (C215+SEA) og ukonjugert C215 mAb og SEB (C215+SEB) ved en konsentrasjon på 1 pg/ml av hvert additiv. Fig. 4. Cytotoksisitet indusert av SEA-C242 mAb-konjugat og SEA-Anti-Thy-1.2 mAb-konjugat mot deres målceller (henholdsvis Colo205 kreft- og EL-4 kreftceller).

Celler ble inkubert med de forskjellige additiver av kontroll (PBS-BSA) i 30 minutter på is, vasket og behandlet som beskrevet nedenfor. Fargingen av C215 mAb og C242 mAb bundet til Colo205-celler og anti-Thy-1.2 bundet til EL-4-celler ble påvist ved å bruke FITC-merket kanin anti mus 1 g. Fargingen av SEA til Raji-celler ble påvist ved å bruke et kanin anti-SEA-serum, fulgt av et FITC-svine anti kanin 1 g. Fargingen av SEA-C215 mAb-konjugat til Colo-205- og Raji-celler ble påvist ved å bruke de ovenfor be-skrevne fremgangsmåter for C215 mAb og SEA. FACS-analyse ble utført på en FACS star plus fra Becton og Dickinson. Farging med bare andre og tredje trinn ble brukt for å de-finere bakgrunnen. A) CTL (SEA-3) ble brukt ved effektor til mål-forhold på 30:1 ved fravær (kontroll) eller nærvær av SEA og C215-SEA ved 1 pg/ml.

Claims (15)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et konjugat, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene å (i) syntetisere konjugatet fra et antistoff og et superantigen ved å koble, på i og for seg kjent måte, superantigenet til antistoffet via minst en struktur valgt fra (a) karbohydrat strukturer, (b) de funksjonelle grupper: tiolgrupper, disulfidgrupper, karboksygrupper og aminogrupper; og (ii) gjenvinne konjugatet fra mediet hvori det har blitt syntetisert.

2. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge krav 1, karakterisert ved at koblingen tillates å foregå ved en aminogruppe av superantigenet og/eller antistoffet.

3. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-2, karakterisert ved at fremstillingspro-sessen er rekombinant fremstilling av konjugatet.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at (i) . nevnte antistoff er spesifikt for en celleoverflate-struktur på en målcelle assosiert med en sykdom, og (ii) nevnte superantigen blir gjenkjent av T-celler og er i stand til å aktivere cytotoksiske T-celler (CTLs).

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av et konjugat ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at nevnte superantigen er i stand til å samvirke med deler av T-cellereseptor-komplekset.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at nevnte superantigen samvirker med T-cellereseptor V-beta-kjeden.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 4-6, karakterisert ved at målcellen er assosiert med en sykdom valgt fra gruppen omfattende kreft, autoimmunitet, parasittisk infeksjon og mikrobiell infeksjon, og antistoffet er rettet spesifikt mot en antigen determinant (epitop) som er tilstede på nevnte målcelle.

8. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 6-7, karakterisert ved at sykdommen er kreft og antistoffet er rettet mot en antigen determinant (epitop) som er tilstede på en kreftcelle.

9. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge krav 8, karakterisert ved at kreftcellen er en tarmkarsinom-assosiert celle.

10. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at antistoffet er spesifikt rettet mot C242-epitopen.

11. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at minst 1-5 superantigen- enheter per antistoffenhet blir introdusert.

12. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-11, karakterisert ved at antistoffet er monoklonalt.

13. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-12, karakterisert ved at superantigenet er et stafylokokkisk enterotoksin.

14. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-13, karakterisert ved at superantigenet er stafylokokkisk enterotoksin A.

15. Fremgangsmåte ved fremstilling av konjugat ifølge ethvert av kravene 1-14, karakterisert ved at superantigen-enheten og antistoff-enheten blir bundet sammen via en organisk tilslutningsstruktur som omfatter minst en amid-struktur.