JPH04352765A - 新規二官性連結化化合物及びその製法 - Google Patents

新規二官性連結化化合物及びその製法

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JPH04352765A
JPH04352765A JP3199757A JP19975791A JPH04352765A JP H04352765 A JPH04352765 A JP H04352765A JP 3199757 A JP3199757 A JP 3199757A JP 19975791 A JP19975791 A JP 19975791A JP H04352765 A JPH04352765 A JP H04352765A
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    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規二官性化合物、その
化合物を含むコンジュゲート、およびその製造、使用方
法に関する。さらに詳しくは、本発明は、細胞集団ター
ゲッティングのための分子と連結できるＮ−置換ヒドラ
ジン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】二またはそれ以上の分子が連結できる二
官性化合物はすでに知られている。例えば、細胞毒性試
薬を、細胞集団ターゲッティングのための分子に連結す
る二官性化合物は知られている。二官性化合物は、生体
内でこのタイプの細胞毒性試薬の運搬と放出が可能でな
ければならず、例えば、ターデッティング分子の活性を
損なうことなく、生体内で治療上十分なレベルの試薬を
供給しなければならない。確実な適用のためには、試薬
とターゲッティング分子間にｐＨに敏感な連結を含むコ
ンジュゲートが形成され、ｐＨの一定の範囲で細胞毒性
試薬が放出されることが望まれる。
【０００３】がんの治療に特に有用な試薬は、アントラ
サイクリンである。アントラサイクリンは、細胞毒活性
を示す抗生物質化合物である。アントラサイクリンは、
以下のいくつかの異なるメカニズムによって、細胞を殺
す作用をするであろうことが研究されている。１）薬剤
分子の、細胞のＤＮＡへのインターカレーション、それ
によるＤＮＡ依存性核酸合成の阻害。２）細胞巨大分子
と反応して、細胞に損傷を引き起こすフリーラジカルの
、薬剤による生成。３）薬剤分子と細胞膜との相互作用
（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，　　“Ｔｒａ
ｎｓｐｏｒｔ　　ＡｎｄＳｔｏｒａｇｅ　　Ｏｆ　　Ａ
ｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ　　Ｉｎ　　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ　　Ａｎｄ　　Ｈｕｍ
ａｎ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ”，ｉｎ　　Ａｎｔｈｒａｃ
ｙｃｌｉｎｅ　　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　　Ｉｎ　　
Ｃａｎｃｅｒ　　Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｕｇｇｉａ　　ｅ
ｔ　　ａｌ（Ｅｄｓ．），ｐ．１３２（Ｍａｒｔｉｎｕ
ｓ　　Ｎｉｊｈｏｆｆ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　　（
１９８２）およびＢａｃｈｕｒ，“Ｆｒｅｅ　　Ｒａｄ
ｉｃａｌ　　Ｄａｍａｇｅ”，　　ｉｄ．　　ｐｐ．９
７−１０２）。その細胞毒性の高さ故に、アントラサイ
クリンは、白血病、乳がん、肺がん、卵巣腺がん、肉腫
のような多くのがんの治療に用いられてきた（Ｗｉｅｒ
ｎｉｋ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｓｔａｔｕｓ　　Ｏｆ　
　Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　　Ａｎｄ　　Ｄａｕｎｏｍｙ
ｃｉｎ　　Ｉｎ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｔｒｅａｔｍｅｎ
ｔ”，ｉｎ　　Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ：Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ　　ＳｔａｔｕｓＡｎｄ　　Ｎｅｗ　　Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，　　Ｃｒｏｏｋｅ　　ｅｔ　　ａ
ｌ．（Ｅｄｓ，），ｐｐ．２７３−９４　　（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ（１９８０））。通常用いられ
るアントラサイクリンは、アドリアマイシン（ＡＤＭド
キソルビシンとしても知られる）とダウノマイシン（Ｄ
ＡＵダウノルビシンとしても知られる）を含む。
【０００４】これら化合物は、新生物や、標的細胞集団
が弱められるか除去されるかが求められるような他の疾
患の状態の治療で有用であるかもしれないが、その治療
効果は、その投与に関係する服量依存性の毒性によって
、しばしば制限される。例えば、腫瘍の治療で、これら
化合物の典型的逆副作用は、骨髄障害と心臓毒性である
（Ｃｒｏｏｋｅ，“Ｇｏａｌｓ　　ｆｏｒ　　Ａｎｔｈ
ｒａｃｙｃｌｉｎｅ　　Ａｎａｌｏｇ　　Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ　　Ａｔ　　Ｂｒｉｓｔｏｌ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ”，Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ：　　
Ｃｕｒｒｅｎｔ　　ＳｔａｔｕｓＡｎｄ　　Ｎｅｗ　　
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，前述、ｐ１１）。それ故腫
瘍の治療でこれら化合物の治療効果を改善するために、
アントラサイクリンを、腫瘍関連の抗原に向かう抗体に
連結して、腫瘍細胞へ薬剤を選択的に運搬するためのイ
ムノコンジュゲート形成の試みがされた。（Ｈｅｒｍｅ
ｎｔｉｎ　　ａｎｄ　　Ｓｅｉｌｅｒ，“Ｉｎｖｅｓｔ
ｉｇａｔｉｏｎｓ　　Ｗｉｔｈ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌＡｎｔｉｂｏｄｙ　　Ｄｒｕｇ（Ａｎｔｈｒａｃｙｃ
ｌｉｎｅ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｂｅｈｒｉｎｇ　
　Ｉｎｓｔｉ．　　Ｍｉｔｌ．８２：１９７−２１５（
１９８８））。この方法で薬剤は腫瘍の場所へ運搬また
は“ターゲッティング”でき、全身の正常な細胞への有
毒な副作用が減せるかもしれない。腫瘍関連の抗原に対
するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に連結し
た、アントラサイクリンＡＤＭまたはＤＡＵを含むイム
ノコンジュゲートはすでに知られている（例えばＧａｌ
ｌｅｇｏ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ　　Ｏｆ　　Ｆｏｕｒ　　Ｄａｕｎｏｍｕｃｉｎ−Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　７９１Ｔ
／３６　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　　Ｗｉｔｈ　　Ａｎ
ｔｉ−Ｔｕｍｏｒ　　Ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｉｎｔ．Ｊ
．Ｃａｎｃｅｒ　　３３：７３７−４４（１９８４）、
及びＡｒｎｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，”Ｉｎ　　Ｖｉｔ
ｒｏ　　Ａｎｄ　　Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　Ｅｆｆｉｃ
ａｃｙ　　Ｏｆ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　　ＯｆＤａ
ｕｎｏｍｙｃｉｎ　　Ｗｉｔｈ　　Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏ
ｒ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　　Ｒｅｖ．　　６２：５−２７（１９８２））
。
【０００５】アントラサイクリンの抗体への付着への、
最もしばしば用いられるアプローチは、アントラサイク
リンのアミノ糖部分での連結が利用されてきた。例えば
アミノ糖は、過酸化ナトリウムで酸化され、Ｓｃｈｉｆ
ｆ塩基形成を介して、抗体のリジン残基に直接付着させ
た（Ｈｕｒｗｉｔｚ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｔｈｅ　　
Ｃｏｖａｌｅｎｔ　　Ｂｉｎｄｉｎｇ　　Ｏｆ　　Ｄａ
ｕｎｏｍｙｃｉｎ　　Ａｎｄ　　Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ
　　Ｔｏ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｔｈ　　Ｒｅ
ｔｅｎｔｉｏｎＯｆ　　Ｂｏｔｈ　　Ｄｕｒｇ　　Ａｎ
ｄ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”，
Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ．３５：１１７５−１１８１（
１９７５））。一方アントラサイクリンのアミノ基と抗
体のカルボキシル基との、カルボジイミドを介する連結
を通じて、アントラサイクリンは抗体に連結された（Ｈ
ｕｒｗｉｔｚｅｔ　　ａｌ．，前述）またはアミノアル
キル基（Ｈｕｒｗｉｔｚ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｔｈｅ
　　Ｅｆｆｅｃｔ　　Ｉｎ　　Ｖｉｖｏ　　Ｏｆ　　Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　　Ｄｒｕｇ−Ａｎｔ
ｉｂｏｄｙ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　　Ｉｎ　　Ｔｗ
ｏ　　Ｍｕｒｉｎｅ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　
Ｔｕｍｏｒ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ　　２１：７４７−７５５（１９７８））。これら
と連結は容易に加水分解されず、アントラサイクリンの
放出管理を難しくしている。又、薬剤のアミノ糖と抗体
のアミノ基との、グルタルアルデヒドによるクロス連結
によって、アントラサイクリンは抗体に連結された（Ｂ
ｅｌｌｅｓ−Ｉｓｌｅｓ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｉｎ　
　Ｖｉｔｒｏ　　ＡｃｔｉｖｉｔｙＯｆ　　Ｄａｕｎｏ
ｍｙｃｉｎ−Ａｎｔｉ−ＡｌｐｈａＦｅｔｏｐｒｏｔｅ
ｉｎ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　　Ｏｎ　　Ｍｏｕｓｅ　
　Ｈｅｐａｔｏｍａ　　Ｃｅｌｌｓ”，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ４１，ｐｐ．８４１−４２（１９８０））。し
かしアントラサイクリン分子のアミノ糖部分が、抗体と
の連結によって変形されたイムノコンジュゲートの研究
で、コンジュゲートした薬剤の細胞毒活性の損失が示さ
れた（Ａｒｎｏｎｅｔ　　ａｌ．，前述，ｐ７−８）。 更にアントラサイクリン類似体の研究で、アントラサイ
クリンのアミノ糖を変形すると、薬剤類似体の細胞毒活
性が、親の薬剤に比し減少する結果となる（Ｙａｍａｍ
ｏｔｏ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　　
Ａｃｔｉｖｉｔｙ　　Ｏｆ　　Ｓｏｍｅ　　Ｄｅｒｉｖ
ａｔｉｖｅｓ　　Ｏｆ　　Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ　　Ａ
ｔ　　Ｔｈｅ　　Ａｍｉｎｏ　　ＡｎｄＭｅｔｈｙｌＫ
ｅｔｏｎｅ　　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．１５：８７２−７５（１９７２））。
【０００６】アントラサイクリンＤＡＵが、薬剤のＣ−
１４位置で抗体に直接連結したイムノコンジュゲートが
製造された。しかし腫瘍細胞へ向うこれらイムノコンジ
ュゲートの選択的細胞毒活性が容易に再生できず、２０
μｇ／ｍｌの濃度でだけ一貫して表われた（Ｇａｌｌｅ
ｇｏ　　ｅｔ　　ａｌ．，前述）。
【０００７】日本特許出願２７４６５８は、Ｃ−１３ア
シルヒドラゾン連結を介する、アントラサイクリンと抗
体とのコンジュゲート化を示している。このコンジュゲ
ート化は、抗体の誘導化と、その誘導体とアントラサイ
クリンとのその後の反応を含む方法で達成された。抗体
の誘導体化が望ましくない非特異的反応を含み、アント
ラサイクリン：抗体の比が非常に低いために、この方法
は不都合である。第一の方法によると、抗体をヒドラジ
ンの存在下カルボジイミドで処理して、ヒドラジド抗体
誘導体とし、次にアントラサイクリンと反応させて、ア
ントラサイクリンを抗体構造に直接連結した。しかし、
その結果生じたイムノコンジュゲートは、抗体分子の集
合体の傾向がある。更にこの方法は、数が限られるだろ
うカルボキシル基が求められるために、このコンジュゲ
ートは、アントラサイクリン：抗体の比が、約１．１〜
１．３と低い。第二の方法は、抗体を無水コハク酸と反
応させて、抗体のヘミ−コハク酸誘導体とする反応を含
む。この誘導体を次にヒドラジンと反応させて、抗体ヒ
ドラジド誘導体とし、更にアントラサイクリン、ダウノ
マイシンと反応させる。抗体誘導体とヒドラジンとの反
応が非特異的であり、望むヒドラジド誘導体に加えて、
種々の抗体誘導体の混合物を生成することにより、この
第二のアプローチは無効である。こうして、２７４６５
８出願に示されている通り、アントラサイクリンの抗体
に対するモル比が非常に低い（約１、日本出願２６４頁
１段を見よ）。又欧州特許出願、公開Ｎｏ．２９４２９
４には、アントラサイクリンのＣ−１３ヒドラゾン誘導
体と、抗体の炭化水素部分とのコンジュゲートが示され
ている。
【０００８】他にもアントラサイクリンヒドラゾンが示
されている（Ｔｏｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ
．Ｃｈｅｍ．，２１：７３２−３７（１９７８）、Ｓｍ
ｉｔｈｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１
：２８０−８３（１９７８）、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　　ｅ
ｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｐｐ．６５９
−６１（１９８６））。米国特許４，１１２，２１７に
、ＤＡＵとＡＤＭのビス−ヒドラジンが示されている。
【０００９】他方、アントラサイクリンは、デキストラ
ンまたはポリグルタミン酸のような高分子量担体と連結
して、薬剤の紬胞毒活性を高め、毒性を減している（Ａ
ｒｎｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，前述ｐ５およびＨｕｒｗ
ｉｔｚ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｓｏｌｕｂｌｅ　　Ｍａ
ｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　　Ａｓ　　Ｃａｒｒｉｅｒ
ｓＦｏｒＤａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ”，Ｊ．Ａｐｐｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．２，ｐｐ２５−３５（１９８０））。 これら担体連結のアントラサイクリンは、腫瘍細胞へ特
異的に細胞毒性試薬をターゲッティングするために、腫
瘍関連の抗原に向かう抗体と共有結合して、イムノコン
ジュゲートを形成する。例えば、カルボキシ−メチル−
デキストランヒドラジドブリッジを介して、ＡＤＭはそ
のような“抗腫瘍”抗体と連結し、そのヒドラジドブリ
ッジでは、ＡＤＭ分子はＣ−１３カルボニルでカルボキ
シメチルデキストランのヒドラジド誘導体と連結して、
ヒドラゾンを形成している。その後抗体が、グルタルア
ルデヒドによりデキストランヒドラジド誘導体と連結し
て、アドリアマイシン−デックス−抗体コンジュゲート
を形成する（Ａｒｎｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ａｓ　　
Ｃａｒｒｉｅｒｓ　　Ｆｏｒ　　Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ　　Ｏｆ　　Ｄｒｕｇｏ”，ｉｎ　　Ｍｏｎ
ｏｃｈｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ｆｏｒ　
　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　Ａｎｄ　　
Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ．（
Ｅｄｓ．），ｐｐ．３６５−８３（１９８５）およびＨ
ｕｒｗｉｔｚ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ａ　　Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ　　Ｏｆ　　Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ　　Ａｎｄ
　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴ
ｏ　　Ｔｈｙ−１　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｓ　　Ａ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏ
ｍａ　　Ｃｅｌｌｓ　　Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ”，Ａｎｎ
．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４１７，ｐｐ．１２５−
３６（１９８３））。
【００１０】しかし、担体の利用には確実に不利な点が
ある。例えば、担体を含むイムノコンジュゲートは大変
かさが大きく、生体内で細網内皮系により急速に移動す
る（Ｄｉｌｌｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｐｒｅｃｌ
ｉｎｉｃａｌ　　Ｔｒｉａｌｓ　　Ｗｉｔｈ　　Ｃｏｍ
ｂｉｎａｔｉｏｎｓ　　Ａｎｄ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓＯｆ　　Ｔ１０１　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ　　Ａｎｄ　　Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ”
，Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ．４６：４８８６−９２（１
９８６））。担体を含むイムノコンジュゲートの速い動
きは、コンジュゲートした薬剤が作用の予定された場所
へ、すなわち殺されるべき細胞の標的群へ着かないかも
しれないため、治療上不利かもしれない。更に高分子量
担体の存在は、イムノコンジュゲートの安定性に悪い影
響をあたえ、コンジュゲートの抗体の結合活性を減すこ
とが示された（Ｅｍｂｌｅｔｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，
“ＡｎｔｉｂｏｄｙＴａｒｇｅｔｉｎｇ　　Ｏｆ　　Ａ
ｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　　Ａｇｅｎｔｓ”，ｉｎ　　Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ｆｏ
ｒ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　Ａｎｄ
　　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ
．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．３２３−２４（１９８５））。 更に腫瘍細胞を研究すると、高分子量担体を含むイムノ
コンジュゲートが、生体内で腫瘍細胞に局在する証拠は
ない。（Ｆｏｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｌｏｃａｌｉ
ｚａｔｉｏｎ　　Ａｎｄ　　ＴｏｘｉｃｉｔｙＳｔｕｄ
ｙ　　Ｏｆ　　Ａ　　Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ−Ａｎｔｉ−
ＣＥＡＣｏｎｊｕｇａｔｅ　　Ｉｎ　　Ｐａｔｉｅｎｔ
ｓ　　Ｗｉｔｈ　　Ａｄｖａｎｃｅｄ　　Ｃａｎｃｅｒ
”，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４７：３５−４２（１９８
３）は直接コンジュゲートした薬剤−抗体コンジュゲー
トの、生体内腫瘍細胞への局在を説明しているで、比較
せよ）。
【００１１】こうして、特定の連結や担体の利用による
、アントラサイクリンと抗体とのコンジュゲート化は示
されている。上に概略を述べたように、これらイムノコ
ンジュゲートの使用は、用いた特定の連結または担体に
よっては明確に不利である。
【００１２】リガンド−毒素のコンジュゲートも示され
ている。Ｐａｓｔａｎによる米国特許４，５４５，９８
５は、プソイドモナル（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒
素（ＰＥ）が、多数のＥＧＦ受容体をもつ細胞に対して
用いるために、１：２の比でＥＧＦと連結した外毒素コ
ンジュゲートを示している。ＥＧＦ−リチンＡおよびＥ
ＧＦ−ジフテリア毒素コンジュゲートも作られた（Ｃａ
ｗｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　
　Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ−Ｔｏｘｉｎ　　Ａ　
　Ｃｈａｉｎ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：　　ＥＧＦ−
Ｒｉｃｉｎ　　Ａ　　Ｉｓ　　Ａ　　Ｐｏｔｅｎｔ　　
Ｔｏｘｉｎ　　Ｗｈｉｌｅ　　ＥＧＦ−Ｄｉｐｈｔｈｅ
ｒｉａ　　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　　Ａ　　Ｉｓ　　Ｎｏｎ
ｔｏｘｉｃ”，Ｃｅｌｌ２２：５６３−７０（１９８０
）およびＳｈｉｍｉｚｕ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ａ　　
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　Ｇｒｏ
ｗｔｈ　　Ｆａｃｔｏｒ　　Ｃｒｏｓｏ−Ｌｉｎｋｅｄ
　　Ｔｏ　　Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　　Ｔｏｘｉｎ　　
Ａ−Ｆｒａｇｅｍｅｎｔ”，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ　
　１１８（Ｎｏ．２）：２７４−７８（１９８０））。 更にプソイドモナス外毒素融合タンパク質は、タンパク
質、ポリペプチドおよびＴＧＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−
６、ＣＤ４のような増殖因子を用いて製造された（Ｐａ
ｓｔａｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ　　Ｃｙｔ
ｏｔｏｘｉｃ　　ＡｇｅｎｔｓＣｒｅａｔｅｄ　　Ｂｙ
　　Ｔｈｅ　　Ｆｕｓｉｏｎ　　Ｏｆ　　Ｇｒｏｗｔｈ
　　Ｆａｃｔｏｒ　　Ａｎｄ　　Ｔｏｘｉｎ　　Ｇｅｎ
ｅｓ”，ＦｏｕｒｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｃｏｎｆｅ
ｒｅｎｃｅ　　Ｏｎ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　
　Ｆｏｒ　　Ｃａｎｃｅｒ，　　Ｐ３６（３月３０日−
４月１日　　１９８９）、Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ　　ｅ
ｔａｌ．，　　Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：１９２２−２
６（１９８８）、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　　ｅｔ　　ａｌ
．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，
８４：４５３８−４２（１９８７），Ｓｉｅｇａｌｌ　
　ｅｔ　　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８５：　　９７３８−４２（１９８８）
，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３３５：３６９−７２（１９８８））。ジフテリア
毒素−α−メラニン細胞刺激ホルモン融合タンパク質が
作られた（Ｍｕｒｐｈｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｇｅｎ
ｅｔｉｃＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，　　Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ　　Ａｎｄ　　Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ｓｅｌｅｃ
ｔｉｖｅ　　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　　Ｏｆ　　Ａ
　　Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ　　Ｔｏｘｉｎ−Ｒｅｌａｔ
ｅｄ　　α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−Ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｉｎｇ　　Ｈｏｒｍｏｎｅ　　Ｆｕｓｉｏｎ　　Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８３：８２５８−６２（１９８６）。およびＭ
ｕｒｐｈｙによる米国特許４，６７５，３８２）。しか
しタンパク毒素を含むリガンドコンジュゲートは、異種
の宿主に免疫原であるかもしれない。
【００１３】更に、ＡＤＭまたはＤＡＵのようなアント
ラサイクリンは、トランスフェリンのような一定のタン
パク質またはポリペプチドリガンドに化学的に連結した
（英国特許出願ＧＢ２１１６９７９Ａ）、またメラノト
ロピンに連結した（Ｖａｒｇａ　　ｅｔ　　ａｌ．，“
Ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ−Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ　　
Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　　Ｓｈｏｗｓ　　Ｒｅｃｅｐｔｏ
ｒ−ＭｅｄｉａｔｅｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　　Ｆ
ｏｒ　　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　　Ｍｕｒｉｎｅ　　Ｍｅｌ
ａｎｏｍａ　　Ｃｅｌｌｓ”，　　Ｎａｔｕｒｅ　　２
６７：５６−５８（１９７７））。ＰＣＴ特許出願Ｗ０
　　８８／００８３７は、ＥＧＦが高分子担体を介して
ＤＡＵのような細胞毒性物質と連結したことを示し、米
国特許４，５２２，７５０と４，５９０，００１は、ト
ランスフェリンがビンカアルカロイドやプラチナにそれ
ぞれ連結したことを示している。
【００１４】イムノコンジュゲートに用いられた細胞毒
性試薬は、条件付放出メカニズムを介して放出されるべ
きであって、すなわち、漸次の、非特異的な場所の加水
分解でなく、特定の場所で放出されるべきである。特定
のイムノコンジュゲートがリソソームへ輸送されると提
案された（ｄｅＤｕｖｅ，“Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ　　Ｒ
ｅｒｉｓｉｔｅｄ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３７：３９１−３９７（１９８３））、リソソームはわ
ずかに酸性（ｐＨ５．０〜５．５）である。（Ｐｏｚｎ
ａｎｓｋｙ　　ａｎｄ　　Ｊｕｌｉａｎｏ，“Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　　Ｔｏ　　Ｔ
ｈｅ　　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　
　Ｏｆ　　Ｄｒｕｇｓ　　：　　Ａ　　Ｃｒｉｔｉｃａ
ｌ　　Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｒｅｖ．
３６：２７７−３３６（１９８４）。コンジュゲートし
た薬剤放出のための酸性条件の利用は、ＡＤＭへのシス
アコニッチル連結の開発で報じられている（Ｓｈｅｎ　
　ａｎｄ　　Ｒｅｉｓｅｒ，“Ｃｉｓ−Ａｃｏｎｉｔｙ
ｌ　　Ｓｐａｃｅｒ　　Ｂｅｔｗｅｅｎ　　Ｄａｕｎｏ
ｍｙｃｉｎ　　Ａｎｄ　　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　　：　　Ａ　　Ｍｏｄｅｌ　
　Ｏｆ　　ＰＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　　Ｌｉｎｋａｇ
ｅ　　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　　Ｄｒｕｇ　　Ｆｒｏｍ　
　ＡＬｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ　　Ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ，
Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４（１９８１
）およびＹａｎｇ　　ａｎｄ　　Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，“
ＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ　　Ｗｉ
ｔｈ　　Ａ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ　　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　Ｔｏ　　Ａ　　Ｈｕｍａ
ｎ　　Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　Ｐ
ｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　　Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　　
Ｔｈｅ　　Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｏｆ　　Ｅｓｔａｂｌｉｓ
ｈｅｄ　　Ｔｕｍｏｒ　　ＸｅｎｏｇｒａｆｔｓＩｎ　
　Ｎｕｄｅ　　Ｍｉｃｅ”，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８５：１１８９−１１９３（１９８８）
）またジフテリア毒素へのケタール連結で報じられてい
る（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｃｈａｒ　　ａｎｄ　　Ｎｅｖ
ｉｌｌｅ，“Ｎｅｗ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｒｏｓｏ
−Ｌｉｎｋｉｎｇ　　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　　Ｔｈａｔ　
　Ａｒｅ　　Ｃｌｅａｖｅｄ　　Ｂｙ　　Ｍｉｌｄ　　
Ａｃｉｄ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：２５０１
−２５０９（１９８９））。
【００１５】Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ他は、アシルヒドラ
ジン化合物を含む酸に敏感なイムノコンジュゲートの形
成を最近述べていて、アントラサイクリン分子の１３−
ケト位置にアシルヒドラゾン結合を介してコンジュゲー
トした３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオニルヒド
ラジドと、このアントラサイクリン誘導体の、抗体また
はリガンド分子へのコンジュゲート化について述べてい
る（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ．，欧州特
許出願Ｎｏ．３２８，１４７　　１９８９年４月１６日
公開）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】ターゲッティングを含
む分子と、生体内で治療に用いられる試薬分子の間に、
酸に敏感な連結を提供するような構造の二官性化合物を
提供するのは有意義である。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、有用な分子と
容易にコンジュゲートする新規二官性化合物と、その二
官性化合物の製造方法を提供する。その二官性化合物は
、反応性ピリジニルジチオ基またはオルト−ニトロフェ
ニルジチオ基を含む。本発明は又、その二官性化合物に
連結して、細胞毒性分子の誘導体を形成する細胞毒性分
子を含む新規コンジュゲートで、さらに殺されるべき標
的細胞集団と反応できる分子に連結した細胞毒性誘導体
を含むコンジュゲートを提供する。このターデッティン
グ分子は抗体のようなタンパク質またはボンベシン、Ｅ
ＧＦのようなリガンドであってよい。
【００１８】具体例によれば、新規二官性化合物、Ｎ−
〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジ
ンカルボキサミド（化合物１０）が合成され、化合物１
０にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭのＣ−１３
位置にセミカルバゾン結合を含む、ＡＤＭのセミカルバ
ゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００１９】もう一つの具体例によれば、新規二官性化
合物、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド
（化合物１１ａ）が合成され、化合物１１ａにＡＤＭが
付着する場所として働くＡＤＭのＣ−１３位置にカルバ
ゾン結合を含む、ＡＤＭのカルバゾン誘導体を形成する
のに用いられる。
【００２０】もう一つの具体例では、新規二官性化合物
、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテ
ニル〕ヒドラジンカルボチオアミド（化合物１２）が合
成され、化合物１２にＡＤＭが付着する場所として働く
ＡＤＭのＧ１３位置にチオセミカルバゾン結合を含む、
ＡＤＭのチオセミカルバゾン誘導体を形成するのに用い
られる。
【００２１】もう一つの具体例によれば、新規二官性化
合物、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラ
ジンカルボキシレート（化合物１３）が合成され、化合
物１３にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭのＣ−
１３位置にカルボキシレートヒドラゾン結合を含む、Ａ
ＤＭのヒドラゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００２２】もう一つの具体例では、新規二官性化合物
、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−
４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）が合成され
、化合物１５にＡＤＭが付着する場所として働くＡＤＭ
のＣ−１３位置にアリルヒドラゾン結合を含む、ＡＤＭ
のアリルヒドラゾン誘導体を形成するのに用いられる。
【００２３】本発明のその他の具体例によれば、上記新
規アントラサイクリン誘導体のいくつもの分子が、選ば
れた標的細胞集団と反応する分子に連結する。好ましく
は、細胞反応性分子は抗体であり、モノクローナル抗体
である。各アントラサイクリン誘導体分子は、アントラ
サイクリン分子のＣ−１３位置の、セミカルバゾン、カ
ルバゾン、チオセミカルバゾン、カルボキシレートヒド
ラゾン、アリルヒドラゾン結合を介してアントラサイク
リンに結合している二官性化合物を介して、抗体と連結
し、本発明の新規イムノコンジュゲートを形成する。例
えば、本発明の好例は、新規アドリアマイシン誘導体分
子の合成を含み、この誘導体分子がチオール化した抗体
と縮合して、二官性化合物を介して抗体にアントラサイ
クリンが付着する結果となる。ＡＤＭのＣ−１３位置に
形成されたヒドラゾン結合は、ＡＤＭに付着する場所と
して働く。この例で、それを介して抗体に付着している
二官性化合物の中に、ジスルフィド基が存在する。もう
一つの好例によれば、アドリアマイシン誘導体分子（二
官性化合物に結合したＡＤＭ）は還元されてスルフヒド
リル基を生じ、その結果できた誘導体が、マレイミド誘
導化抗体と縮合する。この結果、ＡＤＭのＣ−１３位置
に二官性化合物付着の場所としてＮ−置換ヒドラゾン結
合をもち、それを通して抗体に付着する二官性化合物内
にチオエーテル結合をもつイムノコンジュゲートを形成
することになる。
【００２４】本発明のその他の具体例によれば、新規ア
ントラサイクリン誘導体が、ボンベシン、トランスフェ
リン、ＥＧＦのようなリガンドと共有結合して、二官性
化合物を介してリガンドにアントラサイクリンが付着す
る結果となる。上で述べた他の例のように、アントラサ
イクリンのＣ−１３位置に形成したヒドラゾン結合を介
して、アントラサイクリンは二官性化合物に付着する。 リガンドは先にチオール化されてアントラサイクリン誘
導体に連結するのが好ましいが、内在する遊離のチオー
ル基を持つリガンドに直接付着してもよい。
【００２５】これらの具体例から明らかなように、本発
明は、この発明のコンジュゲート製造に有用な、新規二
官性化合物とアントラサイクリン誘導体を提供する。
【００２６】本発明のイムノコンジュゲートは、アント
ラサイクリン：抗体モル比が少なくとも１：１から１０
：１で、好ましくは約４：１〜１０：１であり、選択し
た標的細胞を殺すための、抗体と細胞毒性薬剤の両方の
活性が残る。この中で述べたアントラサイクリン−リガ
ンドコンジュゲートは、アントラサイクリン：リガンド
比が少なくとも１：１から１０：１で、好ましくは約４
：１〜１０：１である。これらコンジュゲートの二官性
化合物にアントラサイクリンが付着する場所に存在する
酸に敏感な結合は、例えばリソソーム小胞内のような、
細胞内で特徴的に出あうような酸性条件下で、活性な薬
剤を放出するのに理想的である。
【００２７】上に名をあげた誘導体の加水分解によるア
ドリアマイシンの放出が、ｐＨの関数として示され、そ
の新規誘導体は、リソソーム環境をまねた酸性条件下で
、大きなレンジの放出率をもった。これら誘導体は、抗
トランスフェリン受容体モノクローナル抗体５Ｅ９との
イムノコンジュゲートとしての、細胞毒性も示された。
【００２８】Ｎ−置換ヒドラジン二官性化合物は、ヒド
ラジン部分と、反応性ピリジニルジチオまたはオルト−
ニトロフェニルジチオ部分を含む。これら新規二官性化
合物は、いろいろな分子と連結して有用なコンジュゲー
トを形成するのに用いられる。二官性化合物のヒドラジ
ン部分に連結する分子は、遊離のカルボニル基または、
カルボニル基を含むように誘導化される基を含み、細胞
毒性試薬分子などである。カルボニル基を含む分子が二
官性化合物のヒドラジン部に連結する時、ヒドラゾン結
合が形成され、コンジュゲート形成に用いられる本発明
の二官性化合物によって、そのヒドラゾン結合は、セミ
カルバゾン、カルバゾン、チオセミカルバゾン、カルボ
キシレートヒドラゾン、アリルヒドラゾン結合である。 ピリジニルジチオまたはオルト−ニトロフェニルジチオ
部分を含む二官性化合物の末端に連結する分子は、遊離
のスルフヒドリル基またはスルフヒドリル基を含むよう
に誘導化できる基を含み、殺すべき標的細胞の抗原また
は受容体と反応する、抗体分子またはリガンドなどであ
る。抗体と二官性化合物との反応を通じ、ピリジニルジ
チオ部分はなくなる。遊離のカルボニル基を含む分子は
、選択した細胞を殺すことができるアントラサイクリン
のような細胞毒性分子が好ましい。好例では、細胞毒性
試薬分子を二官性化合物に連結するヒドラゾン結合は、
ｐＨに敏感に細胞毒性試薬を放出させる。
【００２９】本発明の二官性化合物との連結によって形
成された本発明のコンジュゲートは、本発明のイムノコ
ンジュゲートの少なくとも一つの製薬上有効な量と、製
薬上許容しうる担体を含むような、薬剤組成物中で利用
できるだろう。本発明は又、除去したい標的細胞の選ば
れた集団へ、細胞毒性試薬を選択的に運ぶための方法と
同様に、本発明の組成物の製薬上有効な量で、製薬上許
容しうる手法により、哺乳動物を治療するための方法も
含む。
【００３０】好都合に、この中で示された化合物、コン
ジュゲート、薬剤組成物、および方法は、がんやその他
の腫瘍、非細胞致死性のウィルス性または他の病原性の
感染、自己免疫不全症のような疾患の治療で、その標的
細胞を選択的に殺すための、選ばれた細胞集団への細胞
毒性試薬のターゲッティングに有用なアプローチを提供
する。
【００３１】本発明が更によく理解されるように、詳細
な説明をする。
【００３２】本発明は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二官性
化合物に関する：Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド（化合物１０）
、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル
〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド（化
合物１１ａ）、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ
〕−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミド（化合
物１２）、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒ
ドラジンカルボキシレート（化合物１３）、およびＮ−
〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒ
ドラジノベンズアミド（化合物１５）。これらの化合物
を用いて、アントラサイクリンのような細胞毒性試薬の
新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体を形成し、抗体に連結す
ると、イムノコンジュゲートを形成する。本発明は又、
二官性化合物、細胞毒性誘導体およびイムノコンジュゲ
ートの製造方法、がんや他の腫瘍、非細胞致死性のウィ
ルス性または他の病原性の感染、自己免疫不全のような
疾患を治療するため、標的細胞へ細胞毒性試薬を運ぶた
めの、薬剤組成物および方法に関する。
【００３３】コンジュゲートは、二官性化合物の一つに
よって、標的細胞集団と反応する分子少なくとも一つと
つながった、細胞毒性誘導体分子少なくとも一つから成
る。この分子は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体
のようなタンパク質またはボンベシン、ＥＧＦのような
リガンドであってよい。
【００３４】具体例をあげると、新規化合物、Ｎ−〔２
−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカ
ルボキサミド（化合物１０）が合成され、さらにＡＤＭ
のＣ−１３位置にセミカルバゾン結合を含み、ＡＤＭの
セミカルバゾン誘導体が形成される。又、新規化合物、
２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕
アミノ〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド（化合
物１１ａ）が合成され、さらにＡＤＭのＣ−１３位置に
カルバゾン結合をもつ、ＡＤＭのカルバゾン誘導体が形
成される。又、新規化合物、Ｎ−〔４−〔２−ピリジニ
ル）ジチオ〕−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオア
ミド（化合物１２）が合成され、さらにＡＤＭのＣ−１
３位置にチオセミカルバゾン結合をもつ、ＡＤＭのチオ
セミカルバゾン誘導体が形成される。又、新規化合物、
２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジンカ
ルボキシレート（化合物１３）が合成され、さらにＡＤ
ＭのＣ−１３位置にカルボキシレートヒドラゾン結合を
もつ、ＡＤＭのヒドラゾン誘導体が形成される。又、新
規化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）が
合成され、さらにＡＤＭのＣ−１３位置にアリルヒドラ
ゾン結合をもつ、ＡＤＭのアリルヒドラゾン誘導体を形
成する。
【００３５】他の具体例で、本発明は、抗体またはリガ
ンドのような、標的細胞集団と反応する分子少なくとも
一つと、細胞を殺す細胞毒性分子少なくとも一つを含み
、本発明の新規二官性化合物により連結されるコンジュ
ゲートに関する。又本発明は、と標的細胞集団、例えば
腫瘍細胞集団に向かう抗体を含むイムノコンジュゲート
に関し、その抗体は、その構造に連結したいくつものア
ントラサイクリン誘導体分子を持つ。アントラサイクリ
ン誘導体分子は、チオール化した抗体に共有結合で付着
し、各薬剤分子と抗体の間にジスルフィド結合が形成さ
れ、二官性化合物は、アントラサイクリンのＣ−１３位
置のヒドラゾン結合により、アントラサイクリン誘導体
に付着している。薬剤分子毎に、本発明の二官性化合物
一つを使い、一以上の薬剤分子が各抗体分子に付着する
かもしれない。モル比４：１は、４薬剤（すなわちアン
トラサイクリン誘導体）分子が１抗体に付着することを
示す。
【００３６】他の具体例で、アントラサイクリン誘導体
は還元されてスルフヒドリル基を生じ、このＡＤＭ誘導
体が、マレイミド化した抗体と縮合して、抗体とアント
ラサイクリン間にチオエーテル結合をつくる。
【００３７】これらのコンジュゲートは、未修飾アント
ラサイクリン薬剤をｐＨに敏感に放出させ、結果的に細
胞毒性の減少となる薬剤の構造的修飾をしない。
【００３８】別の具体例で、本発明は、ポリペプチドま
たはペプチドリガンドのようなリガンドを含む、アント
ラサイクリン−リガンドコンジュゲートを包含し、その
リガンドは、標的細胞集団の細胞表面に関連する受容体
一以上と反応し、その構造に連結したアントラサイクリ
ン誘導体分子少なくとも一つをもつ。アントラサイクリ
ンは、アントラサイクリンのＣ−１３位置のヒドラゾン
結合を介してアントラサイクリンに付着している二官性
化合物によって、ペプチドに共有的に結合している。他
の具体例で、アントラサイクリン誘導体は還元されてス
ルフヒドリル基を生じ、この誘導体が、マレイミド化し
たリガンドと縮合する。
【００３９】本発明のコンジュゲートは、一段ずつ製造
でき、まず新規Ｎ−置換ヒドラジン化合物をつくり、そ
れを用いて細胞毒性試薬のヒドラゾン誘導体をつくり、
更に適当な特異性をもつタンパク質またはリガンドと反
応させる（伝統的な抗体カップリング技術については、
Ｈａｒｄｙ，“ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｎｄＣｏｕ
ｐｌｉｎｇ　　Ｏｆ　　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　　Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ　　ＦｏｒＵｓｅ　　Ｉｎ　　Ｆｌｏｗ
　　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，ｉｎ　　Ｈａｎｄｂｏｏｋ
Ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ　　ｅｔ　　ａｌ．（Ｅｄｓ．
），ｐｐ．３１．４−３１．１２（４ｔｈ　　Ｅｄ．１
９８６）、リガンドコンジュゲートの製造については、
Ｖａｒｇａ　　ｅｔ　　ａｌ．，前述を参照）
【００４０】細胞毒性試薬を、コンジュゲートの細胞反
応性成分につなぐ二官性化合物の長さは、二官性化合物
が先に述べたヒドラゾン結合を介して、一またはそれ以
上の細胞毒性試薬分子のカルボニル基に付着する限りは
、変えられる。
【００４１】本発明のコンジュゲートを構成する細胞毒
性試薬は、カルボニル基を含む、いかなる分子であって
もよい。そのような試薬は、限定するものではないが、
アントラサイクリン：アドリアマイシン、ダウノマイシ
ン、デトルビシン、カルミノマイシン、イダルビシン、
エピルビシン、エソルビシン、４′−ＴＨＰ−アドリア
マイシン、ＡＤ−３２，および３′−デアミノ−３′−
（３−シアノ−４−モルホリニル）ドキソルビシンを含
む（Ｃａｓａｚｚａ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｎｔａｌ　
　Ｓｔｕｄｉｅｓ　　Ｏｎ　　Ｎｅｗ　　Ａｎｔｈｒａ
ｃｙｃｌｉｎｅｓ”，ｉｎ　　Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎｅ
　　：　　Ｉｔｓ　　Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　　Ｒｏｌｅ
　　Ｉｎ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｍ
．Ｏｇａｗａ　　ｅｔａｌ．（Ｅｄｓ），ｐｐ．４３９
−５２（Ｅｘｃｅｒｐｔａ　　Ｍｅｄｉｃａ，１９８４
））。
【００４２】細胞毒性試薬が二官性化合物を介してコン
ジュゲート内で連結する細胞反応性分子は、除去したい
細胞集団に結合するか反応し、スルフヒドリル基をもつ
かスルフヒドリルまたはマレイミド基を含むように修飾
できる、いかなる分子であってもよいと理解されるべき
である。そのような分子は、限定するものではないが、
抗体のような高分子量タンパク質（一般に１０，０００
ダルトン以上）、低分子量タンパク質（一般に１０，０
００ダルトン以下）、ポリペプチドまたはペプチドリガ
ンド、および非ペプチドリガンドを含む。
【００４３】本発明のイムノコンジュゲートを構成する
抗体は、除去または殺したい特定の標的細胞集団と反応
する、いかなる抗体であってもよい。そのような抗体の
例は、限定するものではないが、がん、黒色腫、リンパ
腫、骨または軟部組織肉腫、その他の腫瘍で見られる抗
原のような腫瘍関連の抗原に結合する抗体、ウィルス性
または他の病原性関連の抗原に結合する抗体、異常細胞
表面抗原に結合する抗体を含む。これら抗体はポリクロ
ーナルまたは好ましくはモノクローナル抗体であり、従
来十分に確立された技術を用いて製造できる（Ｗｅｇｅ
ｒ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ　　
Ｏｆ　　Ｍｕｒｉｎｅ　　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　　Ａｎｄ
　　Ｍｅｌａｎｏｍａ　　Ｃｅｌｌｓ　　Ｂｙ　　Ｃｈ
ｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　Ｃｏｍｐ
ｌｅｘｅｓ”，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖ．６
２：２９−４５（１９８２）（腫瘍に特異なポリクロー
ナル抗体が製造され、コンジュゲートに用いられた）、
Ｙｅｈ　　ｅｔ　　ａｌ．，“ＣｅｌｌＳｕｒｆａｃｅ
　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　Ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｍｅｌ
ａｎｏｍａ　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　　Ｂｙ　　Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：２９２７−３１（
１９７９）、Ｂｒｏｗｎ　　ｅｔａｌ．，“Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒａｌ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　
ＯｆＨｕｍａｎ　　Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　ｐ９７　　Ｗｉｔｈ　　
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（Ｎｏ．２）：５３９−４６
（１９８１）（腫瘍に特異なモノクローナル抗体の製造
）。例えば、ヒト肺がん細胞に特異なモノクローナル抗
体Ｌ６、または、骨肉腫細胞に特異なモノククローナル
抗体７９１Ｔ／３６が使用できる。更に非インターナリ
ジングまたは好ましくは、インターナリジングな抗体が
用いられる。この出願では、“抗体”という用語は、そ
のままの抗体または抗体分子の活性結合部分を含むフラ
グメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２を包含す
る。モノクローナル抗体を用いるならば、抗体は、と限
定するものではないが、マウスまたはヒト起源、または
キメラ抗体であってよい。
【００４４】“リガンド”という用語は、標的細胞集団
の細胞表面に関連する受容体に特異的に結合する、いか
なると分子も含むと理解されるべきである。本発明のア
ントラサイクリン−リガンドコンジュゲート形成に用い
られる好ましいリガンドは、限定するものではないが、
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドリガンドを含
み、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ボン
ベシン、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、血小板
由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、　　腫瘍増殖因子
（ＴＧＦ）−α、ＴＧＦ−β、ワクシニア増殖因子（Ｖ
ＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子ＩおよびＩ
Ｉなどである。非ペプチドリガンドは、ステロイド、炭
化水素、レクチンを含む。
【００４５】本発明のコンジュゲートの細胞反応性“タ
ーゲッティング”分子、例えば抗体またはリガンドは、
抗体またはリガンドが反応する特定の標的細胞集団へ細
胞毒性試薬分子を運ぶはたらきをする。例えば、腫瘍細
胞表面で見られる抗原に向かう抗体が、その腫瘍細胞へ
、細胞毒性試薬を運搬するだろうし、ＡＩＤＳをひきお
こすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のタンパク質に向
かう抗体が、その細胞毒性試薬をＨＩＶ感染細胞へ運搬
するだろう。同様にがんのような腫瘍細胞は、ＥＧＦ受
容体のような特定の受容体を高濃度で特異的に発現する
ので、ＥＧＦのようなリガンドが細胞毒性試薬をがん細
胞へ運搬するだろう。
【００４６】抗体またはリガンドが反応する特定の細胞
集団内またはその場所で、細胞毒性試薬が放出する結果
、その特定の細胞を選択的に殺すことになる。従って、
コンジュゲートが結合できる細胞表面抗原または受容体
をもつ特定の細胞集団の除去が望まれる疾患の治療で、
本発明のコンジュゲートが有用であることは明白である
。本発明のコンジュゲートが有用である疾患は、限定す
るものではないが、がんやその他の腫瘍、エイズ、ヘル
ペス、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）、ＥＢＶ（エプ
スタインバーウィルス）、ＳＳＰＥ（亜急性硬化性全脳
炎）のような非細胞致死性のウィルスまたは他の病原性
感染、リュウマチ性関節炎を含む。
【００４７】理論にしばられずに、抗体−またはリガン
ド−連結細胞毒性試薬分子は、すなわち本発明のコンジ
ュゲートの形で、抗体またはリガンドの特異性を介して
、殺すべき標的細胞へ運ばれて、細胞膜に結合したコン
ジュゲートしてない抗体やリガンドのインターナリゼー
ションに通じるのと同じエンドサイトな道を介して細胞
に入るものと信じる（Ｐａｓｔａｎ　　ｅｔ　　ａｌ．
，“Ｐａｔｈｗａｙ　　ＯｆＥｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ”
，ｉｎ　　Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，Ｉ，Ｐａｓｔａｎ
　　ｅｔ　　ａｌ．（Ｅｄｓ．），ｐｐ．１−４４（Ｐ
ｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ，１９８５）。いったん細胞
内に入ると、コンジュゲートを含むエンドサイトな小胞
は第一のリソソームと融合し、第二のリソソームをつく
る（Ｅｍｂｌｅｔｏｎｅｔ　　ａｌ．，前述，ｐ．３３
４）。細胞毒性分子は、、コンジュゲートの抗体または
リガンド成分と、酸に敏感なヒドラゾン結合を介して結
合しているので、エンドサイトな小胞やリソソームの酸
性環境にコンジュゲートを曝すと、コンジュゲートから
細胞毒性試薬を放出することになる。更に放出された試
薬は、十分な細胞毒活性が可能な比較的未修飾の試薬の
形であると信じられる。従って、コンジュゲートの酸に
敏感な結合は、標的細胞内での細胞毒性試薬の放出に大
変有利で、その細胞に対するコンジュゲートの細胞毒性
を高めている。一方、標的細胞の外部またはとり囲む直
接の環境、例えば腫瘍の場所での、酸性還元条件でヒド
ラゾン結合は開裂し、放出された薬剤は腫瘍細胞にとり
あげられるだろう。
【００４８】本発明の新規二官性化合物、細胞毒性試薬
の誘導体およびコンジュゲート、およびその製造方法は
、アントラサイクリン、アドリアマイシンが用いられる
例で示される。一般に、アドリアマイシンのカルボニル
誘導体は、アドリアマイシン塩酸塩を本発明の五つの二
官性化合物の一つで、メタノール中室温で処理して製造
される。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を触媒量加えると
、縮合反応を加速することがわかり、反応は一夜かくは
ん後完了した。この反応では副生成物がほとんどなく、
精製処理はアセトニトリルによる沈澱化だけでよい。こ
の簡素化された処理方法は、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄらに
よってかつて報告されたものより優れていて、より行な
いやすく、より経済的で、より早く、種々の分子とコン
ジュゲートするための追加の新規アドリアマイシン誘導
体を提供する。
【化１３】
【００４９】新規二官性化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピ
リジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド
の合成は以下の図式で示され、アドリアマイシンのセミ
カルバゾン誘導体製造に用いられる。
【化１４】 まずメトキシカルボニルスルフェニルクロリドを２−ア
ミノエタンチオール塩酸塩と、次いで２−メルカプトピ
リジンと反応させて、２−〔（２−ピリジニル）ジチオ
〕エタンアミン塩酸塩とする。この化合物をトリエチル
アミン（ＴＥＡ）の存在下ホスゲンと、次いでｔ−ブチ
ルカルバザートと反応させて、Ｎ−〔２−〔（２−ピリ
ジニル）ジチオ〕エチル〕−２−（ｔ−ブトキシーカル
ボニル）ヒドラジンカルボキサミドとする。ヒドラジン
カルボキサミドを次にＴＦＡに溶かして、Ｎ−〔２−〔
２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキ
サミド（化合物１０）、セミカルバジドとし、次にアド
リアマイシン塩酸塩と反応させて、反応性ピリジニルジ
チオ部分をもつＡＤＭのセミカルバゾン誘導体（化１３
の化合物１）とする。
【００５０】新規カルバジド二官性化合物、２−〔〔〔
（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボニ
ル〕カルボニックジヒドラジドの合成は以下の図式で示
され、アドリアマイシンのカルバゾン誘導体製造に用い
られる。
【化１５】 ｔ−ブチルカルバザートをＴＥＡの存在下ホスゲンと反
応させる。次いで２−（２−ピリジニルジチオ）エタン
アミン塩酸塩を加えて、２−〔〔〔２−〔（２−ピリジ
ニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，２
′−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニックジヒ
ドラジドとする。この中間体をＴＦＡに加えて、２−〔
〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ
〕カルボニル〕カルボニックジヒドラジド（化合物１１
ａ）とし、次にアドリアマイシン塩酸塩に加えて、反応
性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭのカルバゾン誘導
体（化１３の化合物２）とする。
【００５１】新規チオセミカルバジド二官性化合物、Ｎ
−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル
〕ヒドラジンカルボチオアミドの合成は以下の図式で示
され、アドリアマイシンのチオセミカルバゾン誘導体製
造に用いられる。
【化１６】 フタールイミドカリウムを１，４−ジブロモ−２−ブテ
ンと反応させて、１−ブロモ−４−（Ｎ−フタールイミ
ド）−２−ブテンとする。この化合物をチオ酢酸カリウ
ムと反応させて、１−（アセチルチオ）−４−（Ｎ−フ
タールイミド）−２−ブテンとし、次にヒドラジンと反
応させ、メトキシカルボニルスルフェニルクロリド、続
いて２−メルカプトピリジンと反応させて、１−アミノ
−４−〔（２−ピリジニル（ジチオ〕−２−ブテン塩酸
塩とする。この化合物をＴＥＡと合わせ、ジ−２−ピリ
ジルチオノカーボネート、次いでｔ−ブチルカルバザー
トを加えて、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）−ジチオ
〕−２−ブテニル〕−ヒドラジンカルボチオアミド（化
合物１２）のｔ−Ｂｏｃ誘導体とする。この化合物をＴ
ＦＡに溶かして、ゴム状の化合物とし、次にアドリアマ
イシン塩酸塩、ＴＦＡと反応させて、反応性ピリジニル
ジチオ部分をもつＡＤＭのチオセミカルバゾン誘導体（
化１３の化合物３）とする。
【００５２】新規二官性化合物、２〔（２−ピリジニル
）ジチオ〕エチルヒドラジンカルボキシレートの合成は
以下の図式で示され、アドリアマイシンのカルボキシレ
ートヒドラゾン誘導体製造に用いられる。
【化１７】 クロロカルボニルスルフェニルクロリドを２−メルカプ
トエタノール、２−メルカプトピリジンと反応させる。 炭酸アンモニウム溶液を加えて、２−（２−ピリジニル
）ジチオ）エタノールを無色オイルで得る。カルボニル
ジイミダゾールを加え、更にヒドラジンと反応させて、
２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジンカ
ルボキシレート（化合物１３）とする。この化合物をア
ドリアマイシン塩酸塩、ＴＦＡ次いでアセトニトリルと
反応させて、反応性ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭ
のカルボキシレートヒドラゾン誘導体（化１３の化合物
４）とする。
【００５３】新規化合物、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニ
ル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミドの
合成は以下の図式で示され、アドリアマイシンのアリル
ヒドラゾン誘導体製造に用いられる。
【化１８】 ｐ−ヒドラジノ安息香酸をジ−ｔ−ブチルピロカーボネ
ートと反応させて、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安
息香酸とする。この化合物をＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミド、ＤＣＣと反応させて、４−Ｎ−Ｂｏｃ−（ヒドラ
ジノ）安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルとする。これを２−（２−ピリジニル）ジチオ）エタ
ンアミン塩酸塩、ＴＥＡと反応させて、Ｎ−〔２−（２
−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−Ｎ−Ｂｏｃ−（ヒ
ドラジノ）ベンズアミドとする。この化合物をＴＦＡで
処理して、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チル〕−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）と
し、更にアドリアマイシン塩酸塩と反応させて、反応性
ピリジニルジチオ部分をもつＡＤＭのアリルヒドラゾン
誘導体（化１３の化合物５）とする。
【００５４】上述のＡＤＭのＮ−置換ヒドラゾン誘導体
は、本発明のコンジュゲートをつくるのに用いられる。 各誘導体は、ＳＰＤＰまたは２−ＩＴ（２−イミノチオ
ラン）で先にチオール化されたモノクローナル抗体と反
応させ、以下に示す通りである。
【化１９】
【化２０】 二官性化合物がＡＤＭのＣ−１３位置にヒドラゾン結合
を通して付着する方法により、イムノコンジュゲートは
、モノクローナル抗体にコンジュゲートしたＡＤＭ分子
から成る。二官性化合物もジスルフィド結合を含み、そ
れを通して抗体に付着している。
【００５５】アントラサイクリンのＣ−１３位置に酸に
敏感なヒドラゾン結合を含む限り、ＡＤＭと抗体をつな
ぐ二官性化合物は、いくつもの要素や結合を含んでよい
。好例の抗体はモノクローナル抗体５Ｅ９である。
【００５６】又、新規二官性化合物はアドリアマイシン
と化合して誘導体となり、更に還元剤ジチオトレイトー
ル（ＤＴＴ）またはトリブチルホスフィンと反応して、
二官性化合物の末端にスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含
むアドリアマイシン誘導体となる。例えば抗体をスクシ
ンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラー
ト（ＳＭＰＢ）と反応により、マレイミド基がすでに付
着しているモノクローナル抗体またはリガンドとこの誘
導体を反応させる。各ＡＤＭのＣ−１３位置のヒドラゾ
ン結合により付着した二官性化合物をもち、抗体の付着
部にチオエーナル結合をもつイムノコンジュゲートが形
成される。
【化２１】
【００５７】従って、ＡＤＭの１３−ケト位置のヒドラ
ゾン結合と、抗体と結びつくための反応性ピリジニルジ
チオまたはオルト−ニトロフェニルジチオ基を含む限り
、ＡＤＭと抗体またはリガンドとをつなぐ二官性化合物
は、いくつもの要素や結合を含んでよいのは明白である
。
【００５８】又、本発明の新規ＡＤＭ誘導体を、ボンベ
シン、ＥＧＦ、トランスフェリンのようなリガンドと反
応させる。リガンドは最初にチオール基またはマレイミ
ド基をもつよう誘導化される。ボンベシンの場合、シス
テイン残基がペプチドのアミノ末端に導入されて、ＡＤ
Ｍ誘導体とのコンジュゲーションのための反応性スルフ
ヒドリル基となる。ネズミＥＧＦの場合、ポリペプチド
がＳＰＤＰと反応して、分子のアミノ末端に反応性スル
フヒドリル基を導入する。トランスフェリンの場合、タ
ンパク質がまず２−ＩＴと反応して、タンパク構造に反
応性チオール基を導入する。各々の場合、チオール化し
たリガンドは次にＡＤＭ誘導体と反応して、本発明のア
ントラサイクリン−リガンドコンジュゲートとなり、そ
のコンジュゲートはリガンドとＡＤＭ間に二官性化合物
をもち、その二官性化合物はヒドラゾン結合を介して各
アントラサイクリン分子のＣ−１３位置に付着している
。
【００５９】本発明が、次の一般式Ｉ
【化２２】 （ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じであるか異な
るものであり）、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ
ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
２Ｈ５）２でありＲ３はＯＣＨ３、ＯＨまたは水素であ
り、Ｒ４はＮＨ２、ＮＨＣＯＣＦ３、４−モルホリニル
、３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル、
４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、ジ
ベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−シアノ
−２−メトキシエチルアミンでありＲ５はＯＨ、Ｏ−Ｔ
ＨＰまたは水素であり、Ｒ６はＯＨまたは水素であって
、Ｒ５がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ６はＯＨ
でない〕および一般式ＩＩ
【化２３】 （ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じであるか異な
るものであり）、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ
ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
２Ｈ５）２であり、Ｒ３はＯＣＨ３、ＯＨまたは水素で
あり、Ｒ４およびＲ７は各々、水素アルキル、置換アル
キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリル、
置換アリル、アラルキルまたは置換アラルキルであるか
またはＲ４、Ｒ７およびＮと共に、置換されていてもよ
い４〜７員環を形成し、Ｒ５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは
水素であり、Ｒ６はＯＨまたは水素であって、Ｒ５がＯ
ＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ６はＯＨでない〕を
有するアントラサイクリンの新規ヒドラジン誘導体を提
供するのは明白である。
【００６０】上述の二官性化合物およびアントラサイク
リンのＮ−置換ヒドラゾン誘導体は新規化合物である。 アントラサイクリンのヒドラゾン誘導体は新規細胞毒性
試薬として用いられ、また本発明の新規コンジュゲート
製造の中間体でもある。アントラサイクリンのヒドラゾ
ン誘導体は、アドリアマイシンセミカルバゾン、アドリ
アマイシンカルバゾン、アドリアマイシンチオセミカル
バゾン、アドリアマイシンカルボキシレートヒドラゾン
、アドリアマイシンアリルヒドラゾンによって例示され
、各々具体例で示される。
【００６１】上の式からわかるように、本発明のＮ−置
換ヒドラゾンＡＤＭ誘導体は、アドリアマイシン、ダウ
ノマイシン、カルミノマイシンのような多くの既知のア
ントラサイクリンのうちのいずれのＮ−置換ヒドラゾン
も含む、更に、アントラサイクリン構造上特異的な場所
で誘導化されたＮ−置換ヒドラゾンも含む（例えば、４
′−ＴＨＰ−アドリアマイシンヒドラゾン、３′−デア
ミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）アドリ
アマイシンヒドラゾン）。後者の誘導体は、まずアント
ラサイクリンを誘導化して、望む類似体とし、その類似
体を用いて本発明のＮ−置換ヒドラゾン誘導体とし、合
成できる。既知のアントラサイクリン類似体は、Ｕ．Ｓ
．特許Ｎｏ．４，４６４，５２９、４，３０１，２７７
（３′−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）または
３′−デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニ
ル）アントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．
４，２０２，９６７、４，３１４，０５４（３′−デア
ミノ−３′−（１−ピペリジニル）または３′−デアミ
ノ−３′−（４−メトキシ−１−ピペリジニル）アント
ラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，２５０
，３０３（Ｎ−ベンジルまたはＮ，Ｎ−ジベンジルアン
トラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４，５９
１，６３７（Ｎ−メトキシメチルまたはＮ−シアノメチ
ルアントラサイクリン類似体）、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．４
，３０３，７８５（アントラサイクリンのアセタール類
似体）記載のものを含む。これら既知のアントラサイク
リン類似体は、上で述べたように反応して、ＡＤＭの新
規ヒドラゾン誘導体となり、望む特異性をもつ抗体また
はリガンドのような細胞反応性分子と上で述べたように
コンジュゲートできる。
【００６２】一方、本発明の誘導化しないＮ−置換ヒド
ラゾン誘導体がまず、上で述べたように誘導化しないア
ントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ダウノマ
イシン、カルミノマイシンから製造され、この新規誘導
体が次に誘導化されて、望むように置換した新規Ｎ−置
換ヒドラゾンとなる。例えば、セミカルバゾンＡＤＭ誘
導体が、Ｕ．Ｓ．特許４，４６４，５２９記載の方法に
よる、２，２′−オキシジアセトアルデヒドによる還元
的アミノ化により、アミノ糖部分で誘導化され、３′−
デアミノ−３′−（４−モルホリノ）アントラサイクリ
ンのセミカルバゾンとなる。更に、Ｎ−置換ヒドラゾン
誘導体は、式ＩおよびＩＩののＲ５の位置で、Ｕ．Ｓ．
特許４，３０３，７８５記載のように誘導化され、４′
−ＴＨＰ−ＡＤＭ　　Ｎ−置換ヒドラゾンのようなヒド
ラゾンのアセタール誘導体となる。
【００６３】本発明のヒドラゾンを誘導化する方法は、
種々の化学療法剤を含め、他の試薬のＮ−置換ヒドラゾ
ンを出発物資として用いられると理解すべきである。ダ
ウノマイシン、カルミノマイシンのようなＡＤＭ以外の
アントラサイクリンが用いられ、Ｎ−ベンジルダウノマ
イシンＮ−置換ヒドラゾン、３′−デアミノ−３′−（
４−モルホリニル）カルミノマイシンＮ−置換ヒドラゾ
ンのような新規化合物が製造され、これも本発明の範囲
内である。
【００６４】本発明のアントラサイクリン誘導体は、ｐ
Ｈ４．５、５．０、７．４での薬剤アドリアマイシンの
放出率で評価され、大きなレンジの放出率を示した。更
に、モノクローナル抗体にコンジュゲートした誘導体か
ら成るイムノコンジュゲートは、ｐＨ４．５でのアドリ
アマイシンの放出率で評価された。イムノコンジュゲー
トはコロニー形成阻害検定でＤａｕｄｉ細胞を用いて細
胞毒性をテストされ、ヒドラゾン誘導体の安定性との相
関性が表された。イムノコンジュゲートも大きなレンジ
の放出率を示し、コロニー形成検定で腫瘍細胞に対し、
抗体に導かれた細胞殺傷力（細胞毒性）を示した。
【００６５】本発明のＮ−置換ヒドラジン化合物は、タ
ーゲッティングする分子と細胞毒性試薬を連結するのに
有用な二官性化合物である。カルボニル基を含む細胞毒
性分子を連結するのに用いると、ｐＨのある範囲内で開
裂して細胞毒性試薬を放出する。酸に敏感な結合を提供
する。本発明のアントラサイクリンイムノコンジュゲー
トは、過去に報じられたイムノコンジュゲートよりも重
要であることは明らかで、過去に報じられたものは、ア
ントラサイクリンが抗体にアントラサイクリンのアミノ
糖部分を通して直接連結していて、これらアミノ糖連結
コンジュゲートはしばしば、抗体に対するアントラサイ
クリンのモル比がより低く、フリーのＡＤＭより弱く、
抗体結合特性の減少を示すからである（Ａｒｎｏｎ　　
ｅｔ　　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅ
ｖ．６２，前述、Ｈｕｒｗｉｔｚ　　ｅｔａｌ．，Ｃａ
ｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ．３５，前述、ｙａｍａｍｏｔｏ　
　ｅｔ　　ａｌ．，前述）。更に本発明のイムノコンジ
ュゲートの安定性が研究され、アントラサイクリンがイ
ムノコンジュゲートから、細胞環境で見られるのと同様
の酸性条件で放出されることを示した。従って、本発明
のイムノコンジュゲートは、標的細胞へ運搬して比較的
未修飾の薬剤を放出するだろう。上述のコンジュゲート
は薬剤輸送に有利な、ｐＨのある範囲での薬剤の放出を
提供するだろう。
【００６６】本発明の二官性化合物、イムノコンジュゲ
ート、その製造方法は、アントラサイクリン、アドリア
マイシンの誘導体が、抗−トランスフェリン受容体モノ
クローナル抗体、５Ｅ９とコンジュゲートしている例で
示される。
【００６７】本発明は又、がんやその他の腫瘍、非細胞
致死性のウィルス性または他の病原性の感染、自己免疫
不全のような疾患の治療のための、薬剤組成物、組み合
わせ、方法を含む。特に、アントラサイクリンを含むコ
ンジュゲート少なくとも１つの製薬上の有効量が製薬上
許容しうる手法で宿主哺乳動物に投与される、哺乳動物
の疾患治療のための方法を含む。
【００６８】本発明方法の一つの例は、組み合わせ化学
療法の方法で用いるために、同時にまたは続いて、いく
つかの異なるコンジュゲート、すなわち異なる細胞毒性
試薬をもつか異なる抗体またはリガンドをもつコンジュ
ゲートの投与を含む。例えば、コンジュゲートの抗体成
分の特異性が異なるアントラサイクリン　　イムノコン
ジュゲートのいくつもの使用は本発明の具体例に含まれ
、すなわちいくつものイムノコンジュゲートが用いられ
、関心のある細胞集団に存在する、異なった抗原または
同じ抗原の異なった場所またはエピトープに特異的に結
合する抗体を各々もっている。これらイムノコンジュゲ
ートのアントラサイクリン成分は同じであっても違って
いてもよい。例えば、この例は、腫瘍表面の種々の多数
の抗原が既知であるか、腫瘍細胞集団が抗原の表れ方で
異種であって、十分な量の薬剤を腫瘍の場所で腫瘍細胞
すべてにターゲッティングすると確信したい、特定の腫
瘍の治療で特に有用であろう。腫瘍に対し異なる抗原特
異性または異なるエピトープ特異性をもつ、いくつもの
コンジュゲートの使用は、腫瘍の場所で十分な薬剤を得
る可能性を増す。更に、正常な組織が、腫瘍に関連した
抗原と同じものすべてをもっている可能性は小さいから
、腫瘍に対して高度の特異性を達成するために重要であ
る（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ　　ｅｔ　　ａｌ．，“Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　　
Ｔｗｏ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　　ｏｆ　　Ｍｅ
ｌａｎｏｍａ−Ａｎｔｉｇｅｎ　　ｐ９７　　Ａｃｔ　
　Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ　　Ｉｎ　　Ｃｏｍ
ｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　　Ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃｉｔｙ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２７（Ｎｏ
．１）ｐｐ．１５７−１６０（１９８１）参照）
【００６９】一方、コンジュゲートのアントラサイクリ
ン成分だけが変わる、いくつもの異なるイムノコンジュ
ゲートが用いられる。例えば、特定の抗体がアドリアマ
イシンと連結して一つのイムノコンジュゲートをつくり
、ダウノマイシンと連結して第二のイムノコンジユゲー
トをつくる。両方のコンジュゲートが宿主に投与され、
除去したい選ばれた細胞集団の場所に、抗体の特異性に
よって偏圧する。両方の薬剤がその場所で放出される。 この方法は、標的細胞内または場所で、いくつもの異な
る薬剤が放出されるから、腫瘍のような特定の細胞集団
の薬剤耐性に関して不確かな時、この例は重要であろう
。もう一つの例は、アントラサイクリンの１以上の型と
、一つの特定の抗体とのコンジュゲーションを含み、で
きたイムノコンジュゲートは、表面に沿って種々の異な
るアントラサイクリン分子をもち、すべて１３−ケトヒ
ドラゾン結合を介して抗体に連結している。この例のイ
ムノコンジュゲートの投与は、標的細胞内または場所で
、いくつもの異なる薬剤が放出することになる。 更にアントラサイクリン−リガンドコンジュゲートの組
み合わせを使用すると、薬剤は細胞表面に特定の抗体同
様受容体をもつ細胞集団へターゲッティングされる。一
種のアントラサイクリンまたはいくつもの異なる薬剤が
この組み合わせ療法で用いられる。
【００７０】本発明のコンジュゲートは、薬剤組成物の
形で、伝統的な投与方法を用いて投与され、限定するも
のではないが、静脈内、腹膜内、経口、リンパ内、また
は腫瘍のような選ばれた細胞集団の場所への直接投与を
含む。静脈内投与が好ましい。イムノコンジュゲートの
場合、生体内治療用に、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２のよう
な抗体フラグメントまたはキメラ抗体を含むコンジュゲ
ートの使用が有用であろう。
【００７１】コンジュゲートを含む、本発明の薬剤組成
物は種々の投与形であってよく、限定するものではない
が、固体、半固体、液体の投薬形を含み、錠剤、丸薬粉
剤、溶体溶液または懸濁液、座薬、重合したマイクロカ
プセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、注入でき
るまたは溶解しない溶液などである。好ましい形は、投
与方法や治療適用による。
【００７２】薬剤組成物は、伝統的な製薬上許容しうる
担体を含み、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク
質、リン酸塩のような緩衝液物質、水、生理食塩水、電
解液などである。
【００７３】本発明のコンジュゲート成分に対する、投
与、投薬管理の最も効果的な方法は、疾患の厳しさや道
すじ、患者の治ゆ力や治療の反応、治療する医師の判断
による。更にコンジュゲートと何か添付する化合物の投
与形は、個々の患者によるべきだ。しかしながら、本発
明のアントラサイクリン　　イムノコンジュゲートの有
効投薬量は、アントラサイクリン約１〜１００ｍｇ／ｍ
２または抗体約５００〜５０００ｍｇ／ｍ２の範囲であ
ろう。アントラサイクリン−リガンドコンジュゲートの
有効投薬量は、アントラサイクリン約１〜１００ｍｇ／
ｍ２またはリガンド約１〜１００ｍｇ／ｍ２の範囲であ
ろう。
【００７４】上に述べた発明をさらに良く理解されるよ
うに、実施例を置く。これら実施例は説明の目的のため
だけであって、この発明の範囲を限定するものでないこ
とを理解すべきである。
【００７５】
【実施例】
二官性化合物およびアドリアマイシン（ＡＤＭ）の誘導
体の製造 融点（ＭＰ）はＦｉｓｈｅｒ−Ｊｏｈｎｓ（Ｍｅｄｆｏ
ｒｄ，ＭＡ）融点測定装置で測定し、未修正である。核
磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｃｋｅｒＡＭ　
　３００機器で得た。赤外（ＩＲ）スペクトルはＫＢｒ
小球またはＣｈＣｌ３溶液でＰ−Ｅ　　ＦＴＩＲ（フー
リエ変換赤外）機器（Ｎｏｒｗａｌｋ　　ＣＴ）、型１
８００でとった。ＭＳ（質量分析）とＨＲＭＳ（高分解
能質量分析）はＫｒａｔｏｓ　　ＭＳ２５ＲＦＡとＭＳ
５０ＴＣ機器（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）でそれぞ
れ得た。 フラシュ　　クロマトグラフィーはＷｏｅｌｍ（Ａｔｌ
ａｎｔａ，ＧＡ）シリカゲルゲル（シリカ３２−６３）
を用いて行った。薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は
Ａｎａｌｔｅｃ（Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）シリカゲルＧＨ
ＬＦプレートまたはＲＰＳ−Ｆ逆相プレート、共に２５
０ミクロンで行った。ルーチン高圧液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）用に、Ｐ−Ｅポンプ、シリーズ４ＬＣ
、ＨＰ　　１０４６Ａ蛍光検出器、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅ
ｘ（Ｊｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）ＩＢ　　Ｓｉｌ−５Ｃ１
８（１５０×４．６ｍｍ）カラムが用いられた。移動相
は７０：３０メタノール−リン酸塩緩衝液（５０ｍｍｏ
ｌリン酸アンモニウム、ｐＨ４．４）であり、流速１．
５ｍｌ／分で行った。放出率測定のため、ＨＰＬＣシス
テムは、二台のＷａｔｅｒｓポンプ型５１０、オートサ
ンプラー型７１２、傾斜コントローラー型６８０を含ん
だ。クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ　　Ｃ−１８カ
ラムで行い、移動相はギ酸トリエチル−アンモニウム緩
衝液（０．０５Ｍ　　ｐＨ２．８）とアセトニトリルが
各々６８：３２の混合液である。溶離したアドリアマイ
シンの蛍光は、Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｒａｍｓｅｙ，ＮＪから得たＡＢＩ蛍光検出器型９
８０（励起、２５４ｎｍ；蛍光、５５０ｎｍ）を用いて
検出された。酢酸塩緩衝液はｐＨ４．５と５．０で用い
られ、リン酸緩衝溶液はｐＨ７．４で用いられた。アド
リアマイシン塩酸塩はサンラク（日本）から得た。その
他のすべての化学薬品は市販源から得た。元素分析はＢ
ｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　　Ｓｑｕｉｂｂ　　Ｃｏｍ
ｐａｎｙ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＴの分析部門と
Ｏｎｅｉｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｓｅｒｖｉｃｅ
ｓで行った。
【００７６】実施例１ 二官性化合物１０およびＡＤＭのセミカルバゾン誘導体
の製造 この実施例は二官性化合物と、ＡＤＭのＣ−１３位置に
セミカルバゾン結合をもつＡＤＭのセミカルバゾン誘導
体を製造する方法を述べる。Ｎ−〔２−〔（２−ピリジ
ニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド（化
合物１０）は化１４に示した反応で製造される。システ
アミン塩酸塩をメトキシカルボニルスルフェニル　　ク
ロリド次いで２−メルカプトピリジンと反応させて２−
（２−ピリジニル）ジチオエタンアミン塩酸塩（化１４
の化合物９）とする。これを次にホスゲンとｔ−ブチル
　　カルバザート、続いてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
と反応させて、望む生成物（化合物１０）を得る。
【００７７】２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタン
アミン塩酸塩の製造 メトキシカルボニルスルフェニル　　クロリド（Ｚｕｍ
ａｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ａｇｎｅｗ　　Ｃｈｅｍ．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｅｄｉｔ．９：５４−
６３（１９７０），（６．３３ｇ，５０ｍｍｏｌ）のＨ
ＰＬＣのグリードのメタノール（１００ｍｌ）溶液をＮ
２下かくはんし、氷で冷やす。これに、２−アミノエタ
ン−チオール塩酸塩（５．７ｇ、５０ｍｍｏｌ）のメタ
ノール（５０ｍｌ）溶液を滴下する。加え終って、室温
（ＲＴ）で２時間かくはんする。溶媒を蒸発させ、残オ
イルをアセトン（１００ｍｌ）から結晶化させ、固体（
６．９ｇ）が得られる。この固体をメタノール（１００
ｍｌ）に溶かす。氷で冷やし、Ｎ２下かくはんし、２−
メルカプトピリジン（３．８２ｇ、３４ｍｍｏｌ）のメ
タノール（５０ｍｌ）溶液を滴下する。１時間ＲＴでか
くはんし、少量に濃縮し、結晶化するまでアセトンで除
々に希釈する。冷蔵庫に１時間置いた後、固体を濾過し
て集め、乾燥して、化合物２−〔（２−ピリジニル）ジ
チオ〕エタンアミン塩酸塩（化合物９）を得る。この化
合物はＦｉｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ，２９：１６３２−１６３５（１９６４）および
Ｃｏｎｎｏｒ　　ａｎｄＳｃｈｒｏｉｔ，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２７：８４８−８５１（１９８８）にかかれている
。化合物の特性は次の通りである。 ｍｐ　　１２３−５゜（５．８ｇ，５２％）．ＩＲ（Ｋ
Ｂｒ）２９５２，２９１３，１６１０，１５７５，１５
５９，１４５１，１１１５，７６７ｃｍ−１．ＮＭＲ（
Ｄ２Ｏ）．δ　　８．４６，７．８３，７．３４（ｄ，
ｍ，ｍ　　４Ｈ，Ｐｙ），３．３７（ｔ，２Ｈ　　ＣＨ
２　　ＣＨ２　　ＮＨ２），３．１２（ｔ，２Ｈ，ＳＣ
Ｈ２　　ＣＨ２）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）：１８７（［Ｍ
＋Ｈ］＋に相当）１７０，１５２，１４２，１１２，１
０４，７６．元素分析：計算値Ｃ７Ｈ１１ＣＬＮ２Ｓ２
．１／４　　Ｈ２Ｏ：　　Ｃ，３７．００，Ｈ，５．０
６，Ｎ，１２．３３．　　実測値Ｃ，３６．８２：　　
Ｈ，４．９９，Ｎ，１２．３７．
【００７８】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕−２−（ｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン
カルボキサミド） ２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタンアミン塩酸塩
（２．２２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン（１
００ｍｌ）に懸濁させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（
５．８ｍｌ）で処理する。この溶液を、氷で冷やしなが
らかくはんするホスゲン（１．９３Ｍトルエン溶液１０
ｍｌ）の塩化メチレン（２００ｍｌ）溶液に滴下する。 反応をＴＬＣでモニターし、出発物質がなくなったら、
しばらくの間混合液にＮ２を通す。その後ｔ−ブチル　
　カルバザート（１．３２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、
一夜かくはんする。溶液を水で洗い、溶媒を蒸発させる
。残渣を、塩化メチレン：メタノール（１００：２）溶
媒系を用いシリカでクロマトグラフィーする。適当なフ
ラクションを集め、１．７４ｇのＮ−〔２−〔（２−ピ
リジニル）ジチオ〕エチル〕−２−（ｔ−ブトキシカル
ボニル）ヒドラジンカルボキサミド（化合物９ａ）を泡
状で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３２８１，２９７９，２９３２，１７２
３，１６７２，１５７７，１５６０，１５４５，１４４
８，１４１９，１２５３，１１６１，７６２ｃｍ−１．
　　ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）δ　　８．５０，７．５６，
７．５１，７．１２（４Ｈ，Ｐｙ），３．５１（２Ｈ，
ＣＨ２），２．８９（２Ｈ，ＣＨ２Ｓ），６．８４，６
．３７，６．１７（３Ｈ，ＮＨ），１．４４（９Ｈ），
（ＣＨ３）３Ｃ）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）３４５（［Ｍ＋
Ｈ］＋に相当），３１７，２８９，２４５，２１３，１
７８，１３４，１１２
【００７９】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
エチル〕ヒドラジンカルボキサミド Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−２
−（ｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジンカルボキサミ
ド（５７０ｍｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を氷で冷やしたＴ
ＦＡ（１０ｍｌ）に溶かす。氷中で１０分間かくはんし
、続いて冷やさずに１０分間かくはんする。ＴＦＡを減
圧でできるだけ蒸発させ、残渣を塩化メチレン：メタノ
ール：農水酸化アンモニウム（１００：５：０．５）溶
媒系を用いシリカでクロマトグラフィーする。適当なフ
ラクションをＴＬＣによって集め、溶媒を蒸発させて結
晶性残渣（０．４２ｇ、定量的）を残す。分析用サンプ
ルはＩＰＡから結晶化し、ｍｐ１０５−７°、Ｎ−〔２
−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカ
ルボキサミド（化合物１０）は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３３６，３２２０，３０６４，２９４
９，２６３４，１６７０，１６２３，１５７５，１５６
２，１１−３３，１４５２，１３６９，１１７２，１０
４６，７７０ｃｍ−１．　　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　
　８．４１，７．７８，７．２１（４Ｈ，Ｐｙ），３．
４３（２Ｈ，ＮＣＨ２），２．９１（２Ｈ，ＳＣＨ２）
．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）２４５（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当，２
２１，２１３，１６２，１３４，１１２．元素分析：計
算値Ｃ８Ｈ１２Ｎ４ＯＳ２：　　Ｃ，３９．３２，Ｈ，
４．９５；Ｎ，２２．９３；　　Ｓ，２６．２４．実測
値Ｃ，３９．１９；　　Ｈ，４８６；Ｎ，２２．４８；
　　Ｓ，２５．０２．
【００８０】アドリアマイシン塩酸塩およびＮ−〔２−
〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジンカル
ボキサミドのセミカルバゾン誘導体の製造 化合物１０（０．３７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）のメタノー
ル（２５ｍｌ）溶液をアドリアマイシン塩酸塩（０．６
６ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）のメタノール（５０ｍｌ）懸
濁液にかくはんしながら加える。ＴＦＡ（５滴）を加え
、一夜かくはんする。澄んだ溶液を濃縮し、０．３％酢
酸アンモニウムを含むメタノール：水（６０：４０）を
溶媒系として用いＣ−１８カラムでクロマトグラフィー
する。適当なフラクションを集め、メタノールをできる
だけ蒸発させる。水相を凍結乾燥し、残渣をメタノール
に溶かし、アセトニトリルに加える。濾過により赤色の
固体を集め、乾燥する（０．６５ｇ、６８％）。ＡＤＭ
のセミカルバゾン誘導体は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３９９，２９７６，２９３６，１６７
１．１６１８，１５７８，１５３８，１４１７，１２８
６，１２１０，１１１７，１０１５，９８９，７６４ｃ
ｍ−１．ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　　８．２５，７．７
６，７．６２，７．４８，７．０７（ｐｙ，ｐｈ，Ｈ）
，４．９５（アノマーＨ），４．６３（ＣＨ２ＯＨ），
４．２４（ＣＨ３ＣＨ），３．９７（ＯＣＨ３），３．
５−２．９（クラスター吸収ＳＳＣＨ２，−ＣＨ２−，
ＣＨ２−ＮＨ），１．２９（ＨＣ−ＣＨ３）．ＭＳ（ｍ
／ｅ）７７０（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），６４１，４３７
，３４６．　　ＨＲＭＳ：　　計算値Ｃ３５Ｈ４０Ｎ５
Ｏ１１Ｓ２：　　７７０．２１６６；実測値：７７０．
２１５７．
【００８１】実施例２ 二官性化合物１１ａおよびＡＤＭのカルバゾン誘導体の
製造 この実施例は、カルバジド二官性化合物とＡＤＭのＣ−
１３位置にカルバゾン結合をもつＡＤＭのカルバゾン誘
導体を製造する方法を述べる。２−〔（２−ピリジニル
）ジチオ〕−エタンアミン塩酸塩をｔ−ブチルカルバザ
ート、トリホスゲンと反応させて、化１５に示すように
、二官性化合物（化合物１１ａ）、カルバジドを得る。 過剰のｔ−ブチルカルバザートはホスゲンと反応してカ
ルボニックジヒドラジドとなる。
【００８２】２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕−２，２′−ビス（
ｔ−ブトキシカルボニル）カルボニック　　ジヒドラジ
ド ｔ−ブチル　　カルバザート（０．３９６ｇ，３ｍｍｏ
ｌ）を乾燥クロロホルム（１０ｍｌ）に溶かす。その溶
液をＮ２下、ＲＴでかくはんし、ＴＥＡ（０．６ｇ、６
ｍｍｏｌ）を加える。これにトリホスゲン（０．２９６
ｇ、１ｍｍｏｌ）を一気に加える。活発な反応が起こり
、静まってから、２−（２−ピリジニルジチオ）エタン
アミン塩酸塩（０．６６７ｇ、３ｍｍｏｌ）のＴＥＡ（
０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を含むクロロホルム溶液を加え
る。ＲＴで１．５時間かくはんし、水（３×２０ｍｌ）
で洗い乾燥して、減圧で溶媒を蒸発させると、泡（０．
９１ｇ）が残る。これを塩化メチレン：メタノール（１
００：２）溶媒系を用いシリカでクロマトグラフィーす
る。フラクションをＴＬＣでモニターし集めると、化合
物２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル
〕アミノ〕カルボニル〕−２，２′−ビス（ｔ−ブトキ
シカルボニル）カルボニック　　ジヒドラシド（化合物
１１）を泡状で得る（０．５４ｇ、５２％）。化合物１
１は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３３０２，２９８０，２９３３，１７２
６，１６８３，１４９８，１２５２，１１６０，１０４
７，１０１８，７６３ｃｍ−１．　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ
３）δ　　８．５０，７．５７，７．４９，７．１０，
（ｄ，ｑ，ｄ，ｔ，４Ｈ，Ｐｙ），３．５２（ｔ，２Ｈ
，ＳＳＣＨ２）２．９０（ｔ，２Ｈ　　ＣＯＮＣＨ２）
，１．４６［Ｃ（ＣＨ３）３］，８．３０，６．５０，
６．２９（ｂ，ｓ，ｓ，ＮＨ）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）５
０３（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），４４７，４３１，４１９
，４０３，３４７，３０３，２１３，１７９，１１２．
【００８３】２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニック　　ジ
ヒドラジド 化合物１１（０．３４ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に氷で冷
やしたＴＦＡ（５ｍｌ）を加えて１０分間かくはんし、
続いて冷やさずに１０分間かくはんする。ＴＦＡをでき
るだけ蒸発させ、残渣を、塩化メチレン：メタノール：
濃ＮＨ４ＯＨ（１００：５：０．５）溶媒系を用いシリ
カでクロマトグラフィーする。適当なフラクションを集
め、蒸発後化合物１１ａを吸湿性泡で得る（０．２ｇ、
定量的収率）。化合物１１ａは次のような特性である。 ＩＲ（フィルム）３３３０，２９６４，２９２９，１６
９８，１６６０，１５７６，１４８６，１２３１，１０
４５，７５９ｃｍ−１．　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ　
　８．５０，７．５６，７．１０（ｄ，ｍ，ｍ，４Ｈ，
Ｐｙ），３．５２（ｑ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ），２．９１（
ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＳＳ），８．８７，８．８５，４．１
９，３．７８（Ｄ２Ｏ可交換プロトン，ＮＨ）．　　Ｍ
Ｓ（ｍ／ｅ）３０３（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），２１３，
１１２．
【００８４】アドリアマイシン塩酸塩および２−〔〔〔
２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カ
ルボニル〕カルボニック　　ジヒドラシドのカルバゾン
誘導体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（３５６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ
）と化合物１１ａ（０．２ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を、
２〜３滴のＴＦＡを含むメタノール（５０ｍｌ）中で一
夜かくはんする。澄んだ溶液が得られ、ＨＰＬＣ（メタ
ノール：０．０１Ｍリン酸アンモニウム溶液、ｐＨ４．
５、７０：３０溶媒系）は、９０％以上のアドリアマイ
シンがセミカルバゾンに変わったことを示す。溶媒を蒸
発させ、残渣を、０．３％酢酸アンモニウムを含むメタ
ノール：水（６０：４０）溶媒系を用いＣ−１８カラム
でクロマトグラフィーする。逆相ＴＬＣ（０．３％酢酸
アンモニウムを除き同じ溶媒系）および／またはＨＰＬ
Ｃでフラクションをモニターし、アドリアマイシンのな
いフラクションを集める。メタノールの大部分を減圧で
蒸発させる。水溶液を凍結乾燥し、赤色の残渣を少量の
メタノールに溶かす。溶液を濾過し、アセトニトリル（
１１）にかきまぜながら加える。澄んだ溶液を約１／３
まで濃縮し、得られた固体を遠心分離により集め、乾燥
して、ＡＤＭのカルバゾン（化合物４）（１６０ｍｇ）
を得る。溶液を１００ｍｌにまで濃縮し、エーテルで希
釈し、遠心分離により固体を集めて、更に８５ｍｇ得る
（合計収率４９％）。このカルバゾン誘導体は次のよう
な特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）：３３４６，２９７５，２９３６，１７
１１，１６６８，１６１８，１５７８，１２８６，１２
１０，１０８３，１０１５，７６５ｃｍ−１．ＮＭＲ（
ＣＤ３ＯＤ）δ　　８．４３，７．８９，７．７７，７
．５２，７．２１．（Ｐｙ，Ｈ），５．１５（アノマー
Ｈ）４．５７（ＣＨ２ＯＨ），４．２５（ＣＨ３ＣＨ）
，３．９９（ＯＣＨ３），３．５３（ＳＳＣＨ２），３
．１７（−ＣＨ２−，ｒｉｎｇ），３．０５（ＣＨ２Ｎ
Ｈ＝），２．３８（−ＣＨ２，環）１．２９（ＣＨＣＨ
３）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）８２８（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当
），６９９，５７２，５３７，３７７，３４６，２８９
，２１３．
【００８５】実施例３ 二官性化合物１２およびＡＤＭのチオセミカルバゾン誘
導体の製造 この実施例は、二官性化合物（化合物１２）とＡＤＭの
Ｃ−１３位置にチオセミカルバゾン結合をもつＡＤＭの
チオセミカルバゾン誘導体を製造する方法を述べる。こ
の実施例では、実施例１で述べたセミカルバジド（化合
物１０）のチオ類似体を化１６に図示するように製造す
る。２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エタンアミンを
用いると、最後から二番目の工程で、チオセミカルバジ
ド部分の求核性が強いために２−メルカプトピリジンの
脱離が見られた。この問題は化１６に示すようにトラン
ス−２−ブテン基を用いてきりぬけた。
【００８６】１−ブロモ−４−（Ｎ−フタルイミド）−
２−ブテンの製造 １，４−ジブロモ−２−ブテン（８．４ｇ、４０ｍｍｏ
ｌ）のＤＭＦ（２００ｍｌ）溶液にフタール酸イミドカ
リウム（４．６２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を１時間かけて少
量ずつ加える。一夜かきまぜた後、溶媒を蒸発させ、残
渣を水と塩化メチレンに分配する。有機相を数回水で洗
い、乾燥し、溶媒を蒸発させる。残渣を２−プロパノー
ルから結晶化させて、望む生成物１−ブロモ−４−（Ｎ
−フタルイミド）−２−ブテン（３．９５ｇ、５９％）
を得、次のような特性である。 ｍｐ　　１０１−２゜．　　ＩＲ（ＫＢｒ）１７７５，
１７１１，１４６６，１４３６，１３９３，７２３ｃｍ
−１．　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ　　７．８１，７．
７３（ｍ，ｍ　　４Ｈ，ｐｈ），５．８８，５．８１（
ｍ，ｍ　　２Ｈ，２＝ＣＨ−１）４．３０（ｄ，２ＨＣ
Ｈ２−Ｎ），３．９０（ｄ，２Ｈ　　ＣＨ２Ｂｒ）．Ｍ
Ｓ（ｍ／ｅ）２８０（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），２００．
元素分析：計算値　　Ｃ１２Ｈ１０ＢｒＮＯ２：　　Ｃ
，５１．４５；Ｈ，３．６０；　　Ｎ，５．００．　　
実測値：　　Ｃ，５２．３５；　　Ｈ，３．４７，Ｎ，
４．８０．
【００８７】１−（アセチルチオ）−４−（
Ｎ−フタルイミド）−２−ブテンの製造 無水エタノール（５０ｍｌ）中の、１−ブロモ−４−（
Ｎ−フタルイミド）−２−ブテン（３．９５ｇ、１４ｍ
ｍｏｌ）とチオ酢酸カリウム（１．７７ｇ、１５．５ｍ
ｍｏｌ）の混合物を１／２時間還流する。溶媒を蒸発さ
せ、残渣を蒸発させ、残渣を塩化メチレンで抽出する。 溶媒を蒸発させて、結晶性残渣（３．８５ｇ、９９％）
を得、そのまま次の工程で用いる。分析用サンプルは２
−プロパノールから結晶化し、ｍｐ６９−７１°である
。この化合物は次のような特性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）１７６９，１７１３，１６８８，１４２
７，１３９１，１１１４，９５８ｃｍ−１．　　ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ３）δ　　７．８０，７．７３（ｍ，ｍ４Ｈ
　　Ｐｈ），５．７０（ｍ，２Ｈ，２　　＝ＣＨ−），
４．２４（ｄ，２Ｈ，ＣＨ２　　Ｎ），３．４８（ｔ，
２Ｈ　　ＣＨ２Ｓ），２．２９（ｓ，３Ｈ，Ｃ−ＣＨ３
）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）２７６（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当）
，２３４，２００． 元素分析：計算値Ｃ１４Ｈ１３ＮＯ３Ｓ：　　Ｃ，６１
．０７；　　Ｈ，４．７６；Ｎ，５．０９．　　実測値
：　　Ｃ，６１．２９；Ｈ，４．８２，Ｎ，５．２１
【
００８８】１−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジチ
オ〕−２−ブテン塩酸塩の製造 １−アセチルチオ−４−（Ｎ−フタルイミド）−２−ブ
テン（６．５ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）の無水エタノール
（１５０ｍｌ）溶液とヒドラジン（１．７４ｇ、５４ｍ
ｍｏｌ）を還流する。反応をＴＬＣで追い、出発物質が
なくなってから、溶液を氷で冷やし、６ＮＨＣｌ（１０
ｍｌ）で処理する。生じたかさ高の沈澱物はフタルヒド
ラジドと固定され（ＮＭＲ，ＭＳ）濾過する。濾液を１
０ｍｌまで濃縮し、水で希釈する。固体を濾過して除き
、濾液をエーテル（２Ｘ）と塩化メチレン（１Ｘ）で洗
い、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、凍結乾燥する。固体を少量
のメタノールに溶かし、Ｃｅｌｉｔｅで濾過し、溶媒を
蒸発させ、一夜排気する。ろう状の吸湿性物質を得、次
の特性をもつ。 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ２Ｏ）δ　　５．８３，５．６０
（ｍ，ｍ　　２Ｈ，２　　＝ＣＨ−）３．４０（ｄ，２
Ｈ　　ＣＨ２ＮＨ２），３．１６（ｄ　　２Ｈ，ＣＨ２
ＳＨ）ＭＳ（ｍ／ｅ）１０４（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），
８７，７０． このろう状物質をＨＰＬＣグレードのメタノール（７５
ｍｌ）に溶かす。溶液をかくはんし、メトキシカルボニ
ルスルフェニル　　クロリド（３ｇ、２３．７ｍｍｏｌ
）で処理する。１／２時間後、ＴＬＣで出発物質は見つ
からない。溶媒を蒸発させ、メタノール（７５ｍｌ）に
溶かす。溶液をかくはんし、２−メルカプトピリジン（
２．７ｇ、２４ｍｍｏｌ）で処理する。２時間後溶媒を
蒸発させ、高真空で排気する。残渣を、０．０１Ｎ　　
ＨＣｌとメタノール混合液（９０：１０、１３０ｍｌ）
に溶かす。濁った溶液を塩化メチレンで洗い、Ｃｅｌｉ
ｔｅで濾過し、凍結乾燥して、１−アミノ−４−〔（２
−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテン塩酸塩を吸湿性の
高い綿毛状物質（４ｇ、６８％）として得、次のような
特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４３３，２９５９，２８８４，１６０
７，１５７６，１４４７，１４１８，１１１８，７６７
ｃｍ−１．　　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ　　８．５１，８．
１３，８．０２，７．５４（ｍ　　４Ｈ，Ｐｙ）５．８
７，５７２（ｍ，ｍ２Ｈ，２　　＝ＣＨ−）３．５４（
ｄ　　２Ｈ，ＣＨ２　　ＮＨ２）３．４３（ｄ　　２Ｈ
，ＣＨ２　　Ｓ）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）２１３（［Ｍ＋
Ｈ］＋に相当），１９６，１１２．
【００８９】Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕
−２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミドの製造１
−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブ
テン塩酸塩（１．５ｇ、６ｍｍｏｌ）をかきまぜながら
塩化メチレン（３０ｍｌ）に懸濁させる。ＴＥＡ（１．
４６ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）を加え、続いてジ−２−ピ
リジル　　チオノカーボネート（Ｋｉｍ　　ａｎｄ　　
Ｙｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ．２６：１
６６１−１６６４（１９８５）），（１．４ｇ、６ｍｍ
ｏｌ）を加える。澄んだ溶液が得られ、ＴＬＣが出発物
質のないことを示す。ｔ−ブチル　　カルバザート（０
．８ｇ、６ｍｍｏｌ）を加え、１時間かくはんする。溶
液を水で洗い、溶媒を蒸発させる。残渣を塩化メチレン
：メタノール（１００：２）溶媒系を用いシリカでクロ
マトグラフィーし、ヘキサン：酢酸エチル（７５：２５
）溶媒系を用いて再クロマトグラフィーして、Ｎ−〔４
−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル〕ヒド
ラジンカルボチオアミドのｔ−Ｂｏｃ誘導体（１．４ｇ
、５８％）を泡状で得、次のような特性をもつ。 ＩＲ（ＫＢｒ）３２３８，２９７１，２９３０，１７１
８，１５４４，１４１８，１１５６，７６２ｃｍ−１．
　　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／Ｄ２Ｏ）δ　　８．４３，７
．６５，７．０８（ｍ，ｍ，ｍ　　４Ｈ，ｐｙ）５．５
７（ｍ　　２Ｈ，２＝ＣＨ），４．１２（ｄ　　２Ｈ，
ＣＨ２　　Ｎ）３．４５（ｄ　　２Ｈ　　ＣＨ２Ｓ），
１．４６（Ｓ　　９Ｈ，３　　ＣＨ３）．ＭＳ（ｍ／ｅ
）３８７（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），３５５，２８７，２
７６，１１２．
【００９０】保護カルボチオアミド（０
．８６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を氷で冷やしたＴＦＡに溶
かす。氷で１０分間冷やし（Ｎ２下）、続いて１０分間
冷やさずに置く。過剰の酸をできるだけ高真空で蒸発さ
せ、残渣を塩化メチレン：メタノール：濃ＮＨ４ＯＨ（
１００：５：０．５）溶媒系を用いシリカでクロマトグ
ラフィーする。適当なクラクションを集めて、化合物１
２をゴム状（０．３９ｇ、６３％）で得、次のような特
性をもつ。 ＩＲ（フィルム）３３２２，３１９８，２９７４，１６
２６，１５７４，１５６０，１５３８，１４４８，１４
１８，１２２４，７６０ｃｍ−１．　　ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ３／Ｄ２Ｏ）δ　　８．４１，７．６３，７．１１（
ｍ　　ｍｍ　　４Ｈ，Ｐｙ）５．６４（ｍ　　２Ｈ，２
＝ＣＨ），４．２０（ｄ　　２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）３．４１
（ｄ　　２Ｈ，ＣＨ２Ｓ）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）２８７
（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），２２５，２２１，１４４，１
１２．
【００９１】アドリアマイシン塩酸塩およびＮ−
〔４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニル〕
ヒドラジンカルボチオアミドのチオセミカルバゾン誘導
体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（３５０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ
）のＨＰＬＣグレードのメタノール（５０ｍｌ）懸濁液
にかきまぜながら、化合物１２（３５０ｍｇ、１．２ｍ
ｍｏｌ）のＨＰＬＣグレードのメタノール（２５ｍｌ）
溶液を加える。ＴＦＡ（３〜４滴）を加え、一夜かくは
んする。澄んだ溶液が得られ、フリーのアドリアマイシ
ンが残っていないことがＨＰＬＣまたはＴＬＣで示され
る。溶液を少量（５ｍｌ）に濃縮し、アセトニトリル（
６００ｍｌ）に加える。沈澱を生じ、冷蔵庫で冷やして
、遠心分離で集め、高真空で乾燥させる（２７５ｍｇ、
５４％）。チオセミカルバゾン誘導体は、次のような特
性である。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４１８，２９３４，１６１６，１５７
８，１５３４，１４１４，１２８４，１２０８，１０１
２，９８６ｃｍ−１．　　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　　
８．３０，７．８０，７．７４，７．５２，（Ｐｙ，ｐ
ｈ　　７Ｈ），５．６０（２＝ＣＨ）５．４０（アノマ
ーＨ）４．６７（ＣＨ２ＯＨ），４．２２（ＣＨ３ＣＨ
）４．０９（ＣＨ２Ｎ）４．０２（ＯＣＨ３）３．５−
１．８８（クラスター吸収−ＣＨ２−ＳＳ，−ＣＨ２−
ＣＨ），１．３０（ＣＨ３−ＣＨ）．ＭＳ（ｍ／ｅ）８
１２（［Ｍ＋Ｈ］＋に相当），７０１，６８３，６６９
，５７２，５５４，５４０，５３６，５２２，５０４．
　　ＨＲＭＳ計算値　　Ｃ３７Ｈ４２Ｎ５Ｏ１０Ｓ３：
　　８１２．２０９４；　　実測値８１２．２０８７．
【００９２】実施例４ 二官性化合物１３およびＡＤＭのカルボキシレートヒド
ラゾン誘導体の製造 この実施例は、新規二官性化合物１３およびＡＤＭのカ
ルボキシレートヒドラゾン誘導体の製造を述べている。 カルボキシレートヒドラゾン二官性化合物は、化１７に
示すように、メルカプトエタノールを誘導化してピリジ
ニルジチオエタノールとし、この化合物を活性化カルボ
ニル誘導体に変えてヒドラジンと縮合させて製造する。
【００９３】２−〔（２−（ピリジニル）ジチオ〕エチ
ル　　ヒドラジンカルボキシレートの製造クロロカルボ
ニルスルフェニル　　クロリド（１．２４ｇ、９．４５
ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）冷溶液（０℃）
に、２−メルカプトエタノール（７３７ｍｇ、９．４５
ｍｍｏｌ）を滴下する。３０分間０°〜１５℃でかくは
んし、０℃に冷やして、２−メルカプトピリジン（１．
０５ｇ、９．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ
）溶液で処理する。０℃で１時間かくはんし、次に室温
で１６時間かくはんする。炭酸アンモニウム溶液（水２
０ｍｌ中に１．０ｇ）を加えて、相を分け、有機相を水
で洗い、乾燥し、減圧濃縮して粗２−（２−ピリジニル
ジチオ）エタノール（１．７５ｇ）を無色オイルで得る
。カルボニルジ−イミダゾール（６４８ｍｇ、４ｍｍｏ
ｌ）を２−（２−ピリジニルジチオ）エタノール（７１
４ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）
溶液に加える。混合物を２０分間かくはんし、−２０℃
に冷やし、ヒドラジン（１２２ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）
で処理する。−５℃に１６時間置き、減圧濃縮する。残
渣を塩化メチレン：メタノール（１００：１〜３）溶媒
系をシリカゲルでクロマトグラフィーして、化合物１３
．２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル　　ヒドラ
ジンカルボキシレート（３４０ｍｇ、３７％）を無色の
オイルで得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ　　８．４６（１Ｈ），７．６
２（２Ｈ），７．０８（１Ｈ），５．９２（１Ｈ），４
．３５（ｔ，２Ｈ），３．７０（ｓ，ＺＨ），３．０１
（ｔ，２Ｈ），１．５６（ｓ，２Ｈ）．　　ＭＳ（ｍ／
ｅ）２４６（［Ｍ＋Ｈ］＋相当），１４２，１０３．
【
００９４】アドリアマイシン塩酸塩および２〔（２−ピ
リジニル）ジチオ〕エチル　　ヒドラジンカルボキシレ
ートのヒドラゾン誘導体の製造 アドリアマイシン塩酸塩（２９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ
）の無水メタノール（４ｍｌ）懸濁液に、化合物１３（
１７０ｍｇ、６．９ｍｍｏｌ）のメタノール（４ｍｌ）
溶液を、ＣＦ３ＣＯ２Ｈ（６ｍｇ）のメタノール（１ｍ
ｌ）溶液を加える。２４時間かくはんし、約４ｍｌまで
濃縮し、この溶液にアセトニトリル（５０ｍｌ）を加え
る。生成物を遠心分離で分ける。固体を水−メタノール
に溶かし、凍結乾燥し、アドリアマイシンのヒドラゾン
誘導体（３５４ｍｇ、８８％）を暗赤色の固体で得、次
のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　　８．３４（１Ｈ），７．９
３（ｄ，１Ｈ），７．８１（ｍ，３Ｈ），７．５４（ｄ
，１Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），５．４９（ｍ，１Ｈ
），５．１９（ｓ，１Ｈ），４．５９（ｍ，２Ｈ），４
．３７（ｍ，２Ｈ），４．２５（ｍ，１Ｈ），４．０１
（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｍ　　１Ｈ），３．５４（ｍ
，１Ｈ），３．１０（ｔ，３Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ
），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．８９（ｍ，１Ｈ），１
．２９（ｄ，３Ｈ）．　　ＭＳ（ｍ／ｅ）：７７１（［
Ｍ＋Ｈ］＋に相当），６４２．
【００９５】実施例５ 二官性化合物１５およびＡＤＭのアリルヒドラゾン誘導
体の製造 この実施例は、新規二官性化合物（化合物１５）および
ＡＤＭのＣ−１３位置にアリルヒドラゾン結合をもつＡ
ＤＭのアリルヒドラゾン誘導体の製造方法を述べている
。化合物１５は、４−Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ安息香酸
を用い、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン基
を結合させて、化１８に示すように製造される。
【００９６】４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸
の製造 ｐ−ヒドラジノ安息香酸（７６０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を
、ジオキサン（１０ｍｌ）、水（５ｍｌ）、１ＮＮａＯ
Ｈ溶液（５ｍｌ）に溶かす。ジ−ｔ−ブチルピロカーボ
ネート（１．３１ｇ、６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、０℃
で１時間、ＲＴで３０分かくはんする。その後溶液のか
さを半分にし、０．５％ＨＣｌ溶液で酸性にし、ＥｔＯ
Ａｃで抽出する。集めたＥｔＯＡｃ溶液をブラインで洗
い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。溶媒を除くとわずかに褐
色の固体が得られ、ＥｔＯＡｃとヘキサンから再結晶す
る（９５０ｍｇ、７５％）。次のような特性である。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　　７．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝
８．５　　Ｈｚ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５　
　Ｈｚ），１．４８（ｓ，９Ｈ）；　　ＩＲ（ＫＢｒ）
３３１６，１６８８，１６０７，１２９８ｃｍ−１．
【
００９７】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
チルー４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）ベンズアミドの
製造 Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５ｍｌ）中
の、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸（２５２
ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
１１５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシル−カルボ
ジイミド（ＤＣＣ）（２４７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を
一夜室温でかくはんする。ジシクロヘキシルウレア（Ｄ
ＣＵ）を濾過して除き、濾液を蒸発させる。残渣にＥｔ
２Ｏを加えて結晶化させて、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラ
ジノ）安息香酸のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエス
テル（３００ｍｇ）を得る。この物質（２５０ｍｇ、０
．７２ｍｍｏｌ）と２−（２−ピリジニルジチオ）エチ
ルアミン塩酸塩（１６７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）をＤ
ＭＦ（４ｍｌ）に溶かす。ＴＦＡ（０．１２５ｍｌ、０
．９ｍｍｏｌ）を加え、一夜室温でかくはんする。ＤＭ
Ｆを除き、ＳｉＯ２でクロマトグラフィー（２％　　Ｍ
ｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２）して、泡状物（２１７ｍｇ、５
２％）を得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ　　８．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
５．１　　ＨＺ），８．０１（ｂｔ，１Ｈ），７．７８
（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７　　Ｈｚ），７．５７（ｍ，１
Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１　　Ｈｚ），７
．０９（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７
　　Ｈｚ），７．４０（ｂｓ，１Ｈ），５．９２（ｂｓ
，１Ｈ），３．７０（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｔ，２Ｈ
，Ｊ＝５．８　　Ｈｚ），１．４５（ｓ，９Ｈ）；　　
ＩＲ（ＫＢｒ）３３０３，１７１４，１６１０，１５０
５ｃｍ−１；　　ｍｓ　　ｍ／ｅ　　４２１（Ｍ＋Ｈ）
，３６５，３２１，１１２，ＨＲＭＳ計算値Ｃ１９Ｈ２
５Ｎ４Ｏ３Ｓ２　　４２１．１３６８，実測値４２１．
１３５８．
【００９８】Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル
）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミドの製
造先の化合物（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をＴＦ
Ａ（１．５ｍｌ）で０℃で１時間処理する。その後ＴＦ
Ａを蒸発させ、残渣をＥｔ２Ｏで粉砕して、約２００ｍ
ｇのＮ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕
−４−ヒドラジノベンズアミド（化合物１５）をオイル
状で得、次のような特性をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　　８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．５　　Ｈｚ），７．８１（ｍ，４Ｈ），７．２２（
ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８　　Ｈｚ），６．９７（ｄ，２Ｈ
），Ｊ＝８．８　　Ｈｚ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ−
６．６　　Ｈｚ），３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈ
ｚ）；ＩＲ（フィルム）３２７８，１６７４，１６１３
ｃｍ−１；　　ＭＳ　　ｍ／ｅ　　３２１（Ｍ＋Ｈ）．
【００９９】アドリアマイシンおよびＮ−〔２−〔（２
−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕−４−ヒドラジノベン
ズアミドのアリルヒドラゾン誘導体の製造化合物１５と
アドリアマイシン塩酸塩（２５０ｍｇ、０．４３ｍｍｏ
ｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍｌ）に溶かし、暗室で２日間か
くはんする。溶媒を除去し、Ｃ−１８逆相ＳｉＯ２でク
ロマトグラフィーする。０．３％ＮＨ４ＯＡｃを含むＭ
ｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝２：１で溶出して、ヒドラゾン化合物
５（３０ｍｇ、８％）を橙色粉末で得、次のような特性
をもつ。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ　　８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．８　　Ｈｚ），７．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９　
　Ｈｚ），７．７４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０　　Ｈｚ）
，７．６６（ｍ，４Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８
．５　　Ｈｚ），７．１４（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｄ
，２Ｈ，Ｊ＝８．８　　Ｈｚ），５．４６（ｂｓ，１Ｈ
），５．１６（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），４
．２３（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．６２
（ｍ，４Ｈ），３．０２（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｍ，
１Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），１．９７（ｍ，２Ｈ）
，１．３２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５　　Ｈｚ）；　　Ｉ
Ｒ（ＫＢｒ）３２０６，１７０８，１６０７，１５７８
ｃｍ−１；　　ＭＳ　　ｍ／ｅ　　８４６（Ｍ＋Ｈ），
７３７，７１７，ＨＲＭＳ計算値Ｃ４１Ｈ４４Ｎ５Ｏ１
１Ｓ２，８４６．２４７９，実測値８４６．２３８０．
【０１００】０．３％　　ＮＨ４ＯＡｃを含むＭＣＯＨ
：Ｈ２Ｏ＝３：１で溶出して無水の誘導体（１２０ｍｇ
、３４％）を青色固体で得る。 ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＤ）δ　　８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝
４．１　　Ｈｚ），７．７７（ｍ，５Ｈ），７．４２（
ｍ，１Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），７．１６（ｍ，２
Ｈ），５．３５（ｂｓ，１Ｈ），５．２６（ｍ，１Ｈ）
，４．６５（ｓ，２Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．
９３（ｓ，３Ｈ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５　
　Ｈｚ），３．４４（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｔ，２Ｈ
，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．４９（ｍ，１Ｈ），１．８８
（ｍ，１Ｈ），１．６３（ｍ，１Ｈ），１．１９（ｄ，
３Ｈ，Ｊ＝６．５　　Ｈｚ）；　　ＭＳ　　ｍ／ｅ　　
８２８（Ｍ＋Ｈ）６９９，６８１，４９５；　　ＨＲＭ
Ｓ計算値Ｃ４１Ｈ４１Ｎ５Ｏ１０Ｓ２　　８２８．２３
７２，実測値８２８．２３００．
【０１０１】実施例６ ＡＤＭ誘導体の特性 実施例１〜５で述べたように製造された、本発明のＡＤ
Ｍ誘導体からのＡＤＭの放出は、ｐＨ４．５〜７．４で
、ＨＰＬＣ分析を用いて研究された。ＡＤＭ誘導体の保
存溶液（１ｍｇ／ｍｌ）はメタノールでつくられ、アリ
コートは水性緩衝溶液ｐＨ４．５、５．０、７．４に希
釈され、約１．６ｎｍｏｌ／ｍｌまで達した。各緩衝液
でのインキュベーションは３７℃で２４時間まで行われ
、アリコートは、ＨＰＬＣカラムに入れて分析され、コ
ンジュゲートしていないＡＤＭ量を測定した。放出物質
は、カラムでの保持時間から、また溶出物質のＵＶプロ
フィールからそのままのＡＤＭと同定された。放出率は
、ＡＤＭの最大量の百分率で表され、図１〜３に示す。
【０１０２】図に示されるように、本発明のＡＤＭ誘導
体は大きなレンジの放出率を示した。ＡＤＭ誘導体から
の放出物質の量は、ｐＨが７か４に下がるに従って、増
した。ＡＤＭ誘導体が酸に敏感な結合をもっている結果
、抗体タンパク質からＡＤＭが放出することになる。 これらの結果は、ＡＤＭを二官性化合物につないでいる
セミカルバゾン、カルバゾン、チオセミカルバゾン、カ
ルボキシレートヒドラゾン、アリルヒドラゾン結合の存
在で一貫している。
【０１０３】実施例７ アントラサイクリン　　イムノコンジュゲートの製造こ
の実施例は、本発明によるアントラサイクリン　　イム
ノコンジュゲートの製造を述べ、実施例１〜５で述べた
ＡＤＭ誘導体がモノクローナル抗体とコンジュゲートさ
れる。
【０１０４】二官性化合物内にジスルフィド結合をもつ
イムノコンジュゲートの製造 用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＡＴ
ＣＣＮｏ．ＨＢ２１から産する５Ｅ９であり、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ“ＡＴＣＣ”（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ
）から入手できる。モノクローナル抗体５Ｅ９は、すべ
ての分裂するヒト細胞上のトランスフェリン受容体と反
応し、腫瘍細胞の種々の組織学上の型とクロス反応する
、ＩｇＧ抗体である。５Ｅ９は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに
産する腹水から精製された（Ｂｒｕｃｋｅｔ　　ａｌ．
，“Ｏｎｅ−Ｓｅｔｐ　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　
　Ｏｆ　　Ｍｏｕｓｅ　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ｆｒｏｍ　　ＡｓｃｉｔｉｃＦ
ｌｕｉｄ　　ｂｙ　　ＤＥＡＥ−Ａｆｆｉｉｇｅｌ　　
Ｂｌｕｅ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”　　Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　　５ｂ：３１３−３
１９（１９８２））。
【０１０５】ＡＤＭ誘導体を選ばれたモノクローナル抗
体と反応させる前に、抗体をチオール化する。すなわち
抗体分子に反応性スルフヒドリル基を導入する。５Ｅ９
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）のチオール化は、ＳＰＤ
Ｐを用いて本質的にはＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ　　ｅｔ　
　ａｌ．，前述に述べられるように行われる。簡単に述
べると、ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　　Ｃｏ．，ＩＬ）（５０ｍＭ）をエタノールに溶かし
、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中の５Ｅ９Ｍ
Ａｂ（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）に加えて、最終濃度が５〜
１０ｍＭ間となる。反応混合物を３０分３０℃でインキ
ュベートする。未反応のＳＰＤＰをＳＰＤＰ誘導化抗体
から、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い
ゲル濾過クロマトグラフィーにより分離する。反応性ピ
リジニルジチオ部分は、過剰のＤＴＴで還元して除去す
る。還元した抗体をＰＤ−１０カラムに通し、遊離のチ
オールを含む抗体がＡＤＭ誘導体との縮合に用いられる
。
【０１０６】反応性チオール基は、２−ＩＴを用いても
抗体タンパク質に導入される。抗体（５０ｍＭ　　ＴＥ
Ａ、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０に５〜１０ｍｇ／ｍｌ）を２−ＩＴと（Ｐｉｅｒ
ｃｅ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＩＬ）最終濃度５〜
１０ｍＭで混合する。反応は９０分間４℃で進み、チオ
ール化された抗体は、２Ｍ　　ＮａＣｌ／ＰＢＳで平衡
化されたＰＤ−１０カラムで分離される。
【０１０７】抗体についた反応性チオール基の数は、Ｄ
ＴＮＢ（５，５′−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸）
（Ｅ４１２＝１１４１５０）を用い、Ｅｌｌｍａｎ，Ａ
ｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．８２：７０
−７７（１９５９）記載の方法により測定される。
【０１０８】各ＡＤＭ誘導体をＤＭＦに溶かし、還元さ
れたＳＰＤＰ−チオール化ＭＡｂ５Ｅ９のＰＢＳ溶液に
加える。ＡＤＭ誘導体の量は、抗体上のチオール基の数
と当量である。コンジュゲート化反応は一夜４℃でイン
キュベートして行われる。その後、抗体溶液をＰＢＳで
透析し、コンジュゲートしていないアドリアマイシン誘
導体を除く。次に抗体溶液をＳＭ−２　　ＢｉｏＢｅａ
ｄｓ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉ
ｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で一夜処理する。ＭＡｂに結合し
コンジュゲートしたアントラサイクリンの量は、４９５
ｎｍ（Ｅ４９５＝８０３０）での吸光度により測定され
る。抗体タンパク質の量は、２８０ｎｍで吸光度で測定
される（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４　　０．Ｄ．単位）。２
８０ｎｍでのＡＤＭ吸光度の重なりを補正するために次
の式を用いる。
【数１】
【０１０９】イムノコンジュゲートは、コンジュゲート
していないＡＤＭやＡＤＭ誘導体の存在に対して、ＨＰ
ＬＣ分析を用いて分析された。ＨＰＬＣは５ミクロンＩ
Ｂ−ＳＩＬＣ１８ビーズで充填したＰｈｅｎｏｍｅｎｅ
ｘカラムを用い行った。コンジュゲートしていない薬剤
、ＡＤＭ誘導体（すなわち、実施例１〜５で述べたよう
に製造された、本発明の二官性化合物の各々にコンジュ
ゲートしたＡＤＭ）（０．１μｍｏｌ）、０．５〜５μ
ｍｏｌ薬剤当量を含むイムノコンジュゲートをカラムに
入れ、メタノールと１０ｍＭリン酸アンモニウム、ｐＨ
４．５（７０：３０）、１．５ｍｌ／分で溶出した。 生成したイムノコンジュゲートは、ＨＰＬＣ分析で測定
したように、コンジュゲートしていない薬剤を意味ある
程には含まなかった（１％以下）。
【０１１０】実施例８ イムノコンジュゲートの特性 実施例７で述べたように製造したイムノコンジュゲート
は、１３−ケト位置で二官性化合物にコンジュゲートし
たＡＤＭ分子から成り、その二官性化合物がＡＤＭとＭ
Ａｂ５Ｅ９間に連結を形成している。更にＭＡｂを遊離
のチオール基によって、反応性ピリジニルジチオ部分を
含むＡＤＭ誘導体に加えると、ＡＤＭとＭＡｂをつなぐ
二官性化合物中にジスルフィド結合が形成されることに
なる。この実施例によってつくられたイムノコンジュゲ
ートは、限定するものではないが、５Ｅ９−ＡＤＭ−セ
ミカルバゾン−〔３．４２〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−カルバ
ゾン−〔４．３７〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−チオセミカルバ
ゾン−〔２．５１〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−カルボキシレー
トヒドラゾン−〔２．３５〕、５Ｅ９−ＡＤＭ−アリル
ヒドラゾン−〔２．５２〕を含み、名称の最初の部分は
コンジュゲートをつくるのに用いたモノクローナル抗体
を表し、第二の部分は抗体に連結したアントラサイクリ
ンを表し、数字はコンジュゲート中のＡＤＭ／抗体のモ
ル比を表す。
【０１１１】本発明のイムノコンジュゲートの結合活性
は蛍光結合検定で測定された（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ　
　ｅｔ．ａｌ．，“Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　Ｅｖａｌｕ
ａｔｉｏｎｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ
　　Ｐｒｅｐａｒｅｄ　　ｂｙ　　Ｌｉｎｋｉｎｇ　　
Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ　　Ｃ　　ｔｏ　　Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ｖｉａ　　Ｐｏｌｙｇ
ｌｕｔａｍｉｃ　　Ａｃｉｄ　　Ｃａｒｒｉｅｒｓ”ｉ
ｎ　　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅｓ　　ａｎｄ　　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓ，Ｖｏｌ．２，ｐ２０１（１９８９））．
　　簡単に述べると、イムノコンジュゲートを連続的に
１００μｌ検定培地に希釈する（ＲＰＭＩ１６４０に１
０％胎児ウシ血清とペニシリン／ストレプトマイシンを
補う、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ　　Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．
Ｙ．）。同じ培地で育てたＣＥＭ腫瘍細胞（ＡＴＣＣ　
　Ｎｏ．ＣＣＬ１１９）（１×１０６セル）を取り出し
、遠心分離により洗い、希釈したイムノコンジュゲート
を含む培地に懸濁させる（１×１０６）。４℃で１時間
インキュベートした後、細胞を洗い、１：４０希釈ヤギ
抗−マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈ
ａｍ．ＮＣ）を含む培地１００μｌに懸濁させ、更に４
℃で１時間置く。細胞を洗い、Ｃｏｕｌｔｅｒ　　Ｅｐ
ｉｃｓ　　Ｖ蛍光細胞分析器を用い分析する。各実験に
対して、同様に希釈したＭＡｂがコンジュゲートしてい
ない正の結合対照として用いられる。タンパク質収率の
百分率（分離して得た）、モル比（ＡＤＭ／ＭＡｂのモ
ル数）、元の結合活性の百分率で表した結合活性は表１
に示される。
【表１】
【０１１２】表１に示されるように、５Ｅ９イムノコン
ジュゲートは、コンジュゲートしていない５Ｅ９の元の
結合活性の９０％以上（チオセミカルバゾンを除く）を
保有した。このことは、ＡＤＭ誘導体の５Ｅ９とのコン
ジュゲートの結果、抗体の結合活性が比較的小さい程度
のロスですむことを示している。タンパク質収率は、タ
ンパク質の大部分がコンジュゲート化処理を通して維持
されたことを示す。
【０１１３】カルバゾンイムノコンジュゲートからのＡ
ＤＭの放出 本発明のカルバゾンイムノコンジュゲートからのＡＤＭ
の放出率は、ｐＨ４．５、５．０、７．４で、ＨＰＬＣ
分析により、実施例６でＡＤＭ誘導体に対して述べたよ
うに研究された。図４に示されるように、イムノコンジ
ュゲートからのＡＤＭの放出率は、実施例６でＡＤＭの
カルバゾン誘導体に対して示されたものと、本質的に同
じである。ＡＤＭ−イムノコンジュゲートから放出され
る物質量は、ｐＨが７から４に下がるにつれて増した。 このＡＤＭ−イムノコンジュゲートが酸に敏感な結合基
をもっている結果、抗体タンパク質からＡＤＭの放出と
なる。この結果はＡＤＭを二官性化合物につなぐヒドラ
ゾン結合の存在で一貫している。
【０１１４】ここで述べる実験データは、ＡＤＭ部分が
本発明のイムノコンジュゲートから、“生理学的”条件
、すなわちリソソーム環境で特徴的な酸性条件で放出さ
れることを示している。
【０１１５】イムノコンジュゲートの細胞毒活性本発明
のイムノコンジュゲートの細胞毒活性は、Ｇｒｅｅｎｆ
ｉｅｌｄ　　ｅｔａｌ．，欧州特許出願Ｎｏ．３２８，
１４７記載のように、Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫
）細胞（表現型：５Ｅ９＋、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ２１）
を用い軟アガルでのＣｏｌｏｎｙ　　Ｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ　　Ａｓｓａｙを用いて、インビトロ試験により測定
された。Ｄａｕｄｉ細胞は、完全培地（１０％胎児ウシ
血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭ１１６４０培地）で成長
させた。培地１ｍｌ中１×１０５セルを、１．５時間、
連続的に希釈した５Ｅ９−ＡＤＭイムノコンジュゲート
またはコンジュゲートしていないＡＤＭにさらした。各
希釈に対し３回測定した。対照は、薬剤にさらさず同様
に処理した細胞から成る。その後細胞を洗い、１５％Ｆ
ＢＳと０．３％アガロース（Ｍａｒｉｎｅ　　Ｃｏｌｌ
ｏｉｄ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）を含むＲＰＭＩ１６
４０培地に懸濁させた。懸濁液の１ｍｌ（１×１０３セ
ル）を、６つのウェルマイクロチタープレート（Ｃａｓ
ｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の０．４％アガロ
ース層に置いた。試料を３７℃で７〜１０日間インキュ
ベートし、その結果のコロニーをｐ−ヨードニトロテト
ラゾリウムバイオレット（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１ｍｇ／
ｍｌの０．５ｍｌで、４８時間着色した。コロニーはＯ
ｐｔｉｍａｘ　　４０−１０　　イメージアナライザー
を用いて数えられ、コロニー形成の阻害が、薬剤処理ま
たはイムノコンジュゲート処理細胞を非処理対照に比較
して測定された。その結果が表２にＩＣ５０（コロニー
形成を５０％阻害するのに要する濃度）として表わされ
る。
【表２】
【０１１６】表２に示されるように、ＡＤＭ放出の他に
、酸に敏感なイムノコンジュゲートのすべてが意味深い
インビトロ細胞毒活性をもつ。
【０１１７】実施例９ チオエーテル結合を含むアントラサイクリンイムノコン
ジュゲートの製造 この実施例は、本発明によるアントラサイクリンイムノ
コンジュゲートを製造するもう一つの具体例を述べてい
て、実施例１〜５で述べたように製造され、ＡＤＭ分子
に付着する場所として、セミカルバゾン、カルバゾン、
チオセミカルバゾン、カルボキシレートヒドラゾン、ア
リルヒドラゾンの５つの結合のいずれかをもつ、二官性
化合物の一つを介して、ＡＤＭはモノクローナル抗体に
コンジュゲートしている。更にイムノコンジュゲートは
、抗体に付着する場所として、チオエーテル結合をもつ
。
【０１１８】ＭＡｂ　　５Ｅ９（ＰＢＳ２．５ｍｌ中２
．５ｍｇ）をＳＭＰＢ（１００μｌテトラヒドロフラン
中スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチラート５９．５μｇ）で、３０℃で３０分間処理す
る。ｐＨをクエン酸ナトリウム緩衝液で６．０に調整す
る。ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を通して、未反応物質からマレイミドを含む抗体を分離
する。先のように製造したＡＤＭ誘導体（１ｍｇ）を１
ｍｌ　　ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（９：１）に溶かし、各々の
ＡＤＭ誘導体の０．５μｍｏｌを、４：１アセトン：Ｈ
２Ｏ中のトリ−ｎ−ブチルホスフィン０．５μｍｏｌと
反応させて、ＡＤＭ誘導体の還元形にする。１０分後、
０．１Ｍ硫黄のトリエン溶液を加え、残っているホスフ
ィンをこわす。還元したＡＤＭ誘導体を５Ｅ９マイレミ
ドを含むＭＡｂと混ぜる。そうして生成したイムノコン
ジュゲートをＰＤ−１０ゲル濾過カラムを通して精製す
る。トルエン溶媒の除去が十分でない、橙色溶媒層が反
応混合物と浮遊する何かタンパク質に分離する場合には
、溶媒を除くために空気の弱流を用い、変性したタンパ
ク質は、反応混合物を２分間１６０００×ｇで回転させ
て除く。澄んだ上清がイムノコンジュゲートを含み、ゲ
ル濾過して、ｐＨ７．４ＰＢＳ中で分析する。ＡＤＭ／
抗体モル比は、上で述べたようにＯＤ２８０とＯＤ４９
５を用いて分光測光的に測定される。典型的な反応で、
モル比３〜４のイムノコンジュゲートがつくられる。
【０１１９】この実施例でこうして製造されたイムノコ
ンジュゲートの結合活性、細胞毒活性が先に述べたよう
にテストされる。
【０１２０】上の実施例は、新規Ｎ−置換ヒドラジン二
官性化合物、これら二官性化合物でつくれらたＡＤＭの
新規Ｎ−置換ヒドラゾン誘導体、ＡＤＭが抗体に新規酸
に敏感な連結を介してコンジュゲートしている新規イム
ノコンジュゲートの製造を示している。二官性化合物は
細胞毒性試薬、ＡＤＭおよび細胞にターゲッテングする
分子、モノクローナル抗体と容易にコンジュゲートした
。コンジュゲートは、抗体結合活性（すなわち標的細胞
特異性）と細胞毒性薬剤活性の両方を維持し、標的細胞
の細胞環境で特徴的な酸性条件でフリーの変形されない
ＡＤＭを放出した。
【０１２１】従って、本発明の新規二官性化合物、イム
ノコンジュゲートは、有用な分子のコンジュゲート化を
約束し、特にがんやその他の腫瘍、非細胞致死性のウィ
ルス性または他の病原性感染、自己免疫不全のような疾
患の治療で、その細胞を特異的に殺すために、標的細胞
集団に細胞毒性試薬を運ぶためにコンジュゲートする。
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【０１２２】上にこの発明のいくつもの具体例をあげた
が、基本的構成は、この発明の二官性化合物、細胞毒性
試薬の誘導体、コンジュゲート、方法を利用する他の具
体例の提示にかえられるのは明白である。それ故、本発
明の範囲は、ここに添えるクレームに限定されるべきで
、実施例の方法であげた特定の具体例に限定されるべき
でないことは正しく評価されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ４．５の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図２】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ５．０の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図３】実施例６に記載したように、本発明のアドリア
マイシン誘導体をｐＨ７．４の緩衝液でインキュベート
し、時間の関数として、アドリアマイシンの放出を示す
グラフである。
【図４】実施例７に記載したように、ｐＨ４．５の緩衝
液でインキュベートした時間の関数として、本発明のア
ドリアマイシンのカルバゾン誘導体から、および５Ｅ９
イムノコンジュゲートからのアドリアマイシンの放出を
示すグラフである。

Claims (69)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　式 Ｈ２ＮＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８〔式中、ｎは
    １〜１０の整数であり、Ｒ８は【化１】 （式中、Ｘは、ＨＮＯ２またはハロゲンである）である
    〕を有する二官性Ｎ−置換ヒドラジン化合物。
  2. 【請求項２】ａ）メトキシカルボニルスルフェニルクロ
    リドを２−アミノエタンチオール塩酸塩および２−メル
    カプトピリジンと反応させて、２−〔（２−ピリジニル
    ）−ジチオ〕エタンミアン塩酸塩とし、ｂ）上記塩酸塩
    をトリエチルアミン、ホスゲンおよびｔ−ブチルカルバ
    ザートと反応させて、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）
    −ジチオ〕エチル〕−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボ
    ニル）ヒドラジンカルボキサミドとし、ｃ）上記ヒドラ
    ジンカルボキサミドをトリフルオロ酢酸と反応させて、
    Ｎ−〔２〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラ
    ジンカルボキサミドとすることを特徴とする請求項１の
    化合物を製造する方法。
  3. 【請求項３】　　Ｎ−〔２−〔２−ピリジニル）ジチオ
    〕エチル〕ヒドラジンカルボキサミド。
  4. 【請求項４】　　式 Ｈ２ＮＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８
    〔式中、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ８は【化２】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ２またはハロゲンである）である
    〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  5. 【請求項５】ａ）ｔ−ブチルカルバザート、トリエチル
    アミン、トリホスゲンおよび２−（２−ピリジニルジチ
    オ）エタンアミン塩酸塩を反応させて、２−〔〔〔２−
    （２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボニ
    ル〕−２，２′−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
    ）カルボニックジヒトラジドとし、 ｂ）上記Ｎ−ブトキシカルボニルカルボニックジヒドラ
    ジドをトリフルオロ酢酸と反応させて、２−〔〔〔２−
    〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボ
    ニル〕カルボニックジヒドラジドとすることを特徴とす
    る請求項４の化合物を製造する方法。
  6. 【請求項６】　　２−〔〔〔２−〔（２−ピリジニル）
    ジチオ〕エチル〕アミノ〕カルボニル〕カルボニックジ
    ヒドラジド。
  7. 【請求項７】　　式 　　Ｈ２ＮＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ＝（ＣＨ２）
    ｎＳＳＲ８ 〔式中、ｍ、ｎは１〜１０の整数であって、同じである
    か異なるものであり、Ｒ８は 【化３】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ２またはハロゲンである）である
    〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  8. 【請求項８】ａ）１，４−ジブロモ−２−ブテンをフタ
    ル酸イミドカリウムと反応させて、１−ブロモ−４−（
    Ｎ−フタルイミド）−２−ブテンとし、ｂ）上記ブロモ
    ブテンをチオ酢酸カリウムと反応させて、１−（アセチ
    ルチオ）−４−（Ｎ−フタルイミド）−２−ブテンとし
    、 ｃ）上記アセチルチオブテンをヒドラジンと反応させて
    、１−アミノ−４−メルカプト−２−ブテン塩酸塩とし
    、 ｄ）上記アミノメルカプトブテンをメトキシカルボニル
    スルフェニルクロリドおよび２−メルカプトピリジンと
    反応させて、１−アミノ−４−〔（２−ピリジニル）ジ
    チオ〕−２−ブテン塩酸塩とし、 ｅ）上記アミノブテン塩酸塩をＴＥＡおよびジ−２−ピ
    リジニルチオノカーボネートおよびｔ−ブチルカルバザ
    ートと反応させて、Ｎ−〔４−〔（２−ピリジニル）ジ
    チオ〕−２−ブテニル〕−ヒドラジンカルボチオアミド
    のカルボチオアミドを保護するｔ−Ｂｏｃ誘導体とし、
    ｆ）上記ｔ−Ｂｏｃ誘導体をトリフルオロ酢酸と反応さ
    せて、Ｎ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブ
    テニル〕ヒドラジンカルボチオアミドとすることを特徴
    とする請求項７の化合物を製造する方法。
  9. 【請求項９】　　Ｎ−４−〔（２−ピリジニル）ジチオ
    −２−ブテニル〕ヒドラジンカルボチオアミド。
  10. 【請求項１０】　　式 Ｈ２ＮＮＨＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８〔式中、ｎは１
    〜１０の整数であり、Ｒ８は【化４】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ２またはハロゲンである）である
    〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  11. 【請求項１１】ａ）クロロカルボニルスルフェニルクロ
    リドを２−メルカプトエタノールおよび２−メルカプト
    ピリジン、次いで炭酸アンモニウムと反応させて、粗２
    −（２−ピリジニルジチオ）エタノールとし、ｂ）上記
    ２−（２−ピリジニルジチオ）エタノールをカルボニル
    ジイミダゾールおよびヒドラジンと反応させて、２〔（
    ２−ピリジニル）ジチオ〕エチル−ヒドラジンカルボキ
    シレートとすることを特徴とする請求項１０の化合物を
    製造する方法。
  12. 【請求項１２】　　２〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エ
    チルヒドラジンカルボキシレート。
  13. 【請求項１３】　　式 Ｈ２ＮＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８〔式
    中、ｎは１〜１０の整数であり、Ｒ８は【化５】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ２またはハロゲンである）であり
    、Ａｒは 【化６】 である〕を有するＮ−置換ヒドラジン二官性化合物。
  14. 【請求項１４】ａ）Ｐ−ヒドラジノ安息香酸をジ−ｔ−
    ブチルピロカーボネートと反応させて、４−（Ｎ−Ｂｏ
    ｃ−ヒドラジノ）安息香酸とし、 ｂ）上記４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸をＮ
    −ヒドロキシスクシンイミドおよびＤＣＣと反応させて
    、４−（Ｎ−Ｂｏｃ−ヒドラジノ）安息香酸のＮ−ヒド
    ロキシ−スクシンイミドエステルとし、ｃ）上記エステ
    ルを２−（２−ピリジニルジチオ）−エチルアミン塩酸
    塩およびトリエチルアミンと反応させて、Ｎ−〔２−〔
    （２−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−（Ｎ−Ｂｏｃ
    −ヒドラジノ）ベンズアミドとし、ｄ）上記Ｎ−〔２−
    （２−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−（Ｎ−ＢＯＣ
    −ヒドラジノ）ベンズアミドをトリフルオロ酢酸と反応
    させて、Ｎ−〔２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチ
    ル〕−４−ヒドラジノベンズアミドとすることを特徴と
    する請求項１３の化合物を製造する方法。
  15. 【請求項１５】　　Ｎ−〔２−（２−ピリジニル）ジチ
    オ〕エチル〕−４−ヒドラジノベンズアミド。
  16. 【請求項１６】　　化合物が還元剤により還元されて遊
    離のスルフヒドリル基を形成する、請求項１、４、７、
    １０または１３の化合物から成る二官性化合物。
  17. 【請求項１７】　　還元剤がジチオトレイトールまたは
    トリブチルホスフィンである、請求項１６の二官性化合
    物。
  18. 【請求項１８】　　請求項１、４、７、１０または１３
    の化合物を、遊離のカルボニル基を含む分子少なくとも
    １つ、およびスルフヒドリル基を含む分子少なくとも１
    つと結合させて形成されるコンジュゲート。
  19. 【請求項１９】　　カルボニル基を含む分子が細胞毒性
    試薬である、請求項１８のコンジュゲート。
  20. 【請求項２０】　　細胞毒性試薬がアントラサイクリン
    である請求項１９のコンジュゲート。
  21. 【請求項２１】　　スルフヒドリル基を含む分子が、標
    的細胞集団と反応する分子である、請求項１８のコンジ
    ュゲート。
  22. 【請求項２２】　　分子がモノクローナル抗体である、
    請求項２１のコンジュゲート。
  23. 【請求項２３】　　請求項１６の化合物を、遊離のカル
    ボニル基を含む分子少なくとも１つ、および付着したマ
    レイミド基を持つ分子少なくとも１つと結合させて形成
    されるコンジュゲート。
  24. 【請求項２４】　　遊離のカルボニル基を含む分子がア
    ントラサイクリンであり、付着したマレイミド基を持つ
    分子が抗体である、請求項２３のコンジュゲート。
  25. 【請求項２５】　　請求項１、４、７、１０または１３
    の化合物をアントラサイクリンと反応させて製造するア
    ントラサイクリン誘導体。
  26. 【請求項２６】　　アントラサイクリンが、アドリアマ
    イシン、ダウノマイシン、デトルビシン、カルミノマイ
    シン、イダルビシン、エピルビシン、エソルビシン、４
    ′−ＴＨＰ−アドリアマイシン、ＡＤ−３２および３′
    −デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）
    −ドキソルビシンから成る群から選ばれる、請求項２５
    のアントラサイクリン誘導体。
  27. 【請求項２７】　　請求項２５のアントラサイクリン誘
    導体を、標的細胞集団と反応する分子と反応させて製造
    するコンジュゲート。
  28. 【請求項２８】　　分子が、腫瘍細胞と反応する抗体で
    ある、請求項２７のコンジュゲート。
  29. 【請求項２９】　　抗体が、５Ｅ９、Ｌ６、３Ａ１およ
    びＧ２８．５から成る群から選ばれるモノクローナル抗
    体である、請求項２８のコンジュゲート。
  30. 【請求項３０】　　アントラサイクリンがアドリアマイ
    シンであり、抗体が５Ｅ９である、請求項２８のコンジ
    ュゲート。
  31. 【請求項３１】　　分子がリガンドである、請求項２７
    のコンジュゲート。
  32. 【請求項３２】　　リガンドがタンパク質、ポリペプチ
    ド、またはペプチド分子である、請求項３１のコンジュ
    ゲート。
  33. 【請求項３３】　　リガンドが、ボンベシン、ＥＧＦ、
    トランスフェリン、ガストリン、ガストリン放出ペプチ
    ド、血小板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ
    −α、ＴＧＦ−β、ＶＧＦ、インスリンおよびインスリ
    ン様増殖因子ＩおよびＩＩから成る群から選ばれる、請
    求項３２のコンジュゲート。
  34. 【請求項３４】　　リガンドが、炭化水素、ステロイド
    およびレクチンから成る群から選ばれる非ペプチドリガ
    ンドである、請求項３１のコンジュゲート。
  35. 【請求項３５】　　アドリアマイシン１３−Ｎ−〔２−
    〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕ヒドラジン−カ
    ルボキサミドセミカルバゾン塩酸塩。
  36. 【請求項３６】　　アドリアマイシン１３−２−〔〔〔
    ２−〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル〕アミノ〕カ
    ルボニル〕カルボニックジヒドラジドカルバゾン塩酸塩
    。
  37. 【請求項３７】　　アドリアマイシン１３−Ｎ−４−〔
    （２−ピリジニル）ジチオ〕−２−ブテニルーヒドラジ
    ンカルボチオアミドチオセミカルバゾン塩酸塩。
  38. 【請求項３８】　　アドリアマイシン１３−２−〔（２
    −ピリジニル）ジチオ〕エチルヒドラジン−カルボキシ
    レートカルボキレートヒドラゾン塩酸塩。
  39. 【請求項３９】　　アドリアマイシン１３−Ｎ−〔２−
    〔（２−ピリジニル）ジチオ〕エチル−４−ヒドラジノ
    ベンズアミドアリルヒドラゾン塩酸塩
  40. 【請求項４０】　　式 【化７】 〔式中、Ｒ１は、ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、
    ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、ＮＨ
    ＣＳＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ＝（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、Ｎ
    ＨＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、ＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ
    （ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−
    Ｈ、ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−Ｈ、Ｎ
    ＨＣＳＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ（ＣＨ２）ｎＳ−Ｈ、ＮＨ
    ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＳ−ＨまたはＮＨ−Ａｒ−ＣＯＮＨ
    （ＣＨ２）ｎＳ−Ｈ〔式中、ｍ、ｎは１〜１０の整数で
    あって、同じであるか異なるものであり、Ｒ８は【化８
    】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ２またはハロゲンである）であり
    、Ａｒは 【化９】 である〕であり、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ
    ＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ
    ２Ｈ５）２であり、Ｒ３はＯＣＨ３、ＯＨまたは水素で
    あり、Ｒ４はＮＨ２、ＮＨＣＯＣＦ３、４−モルホリニ
    ル、３−シアノ−４−モルホリニル、１−ピペリジニル
    、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミン、
    ジベンジルアミン、シアノメチルアミンまたは１−シア
    ノ−２−メトキシエチルアミンであり、Ｒ５はＯＨ、Ｏ
    −ＴＨＰまたは水素であり、Ｒ６はＯＨまたは水素であ
    って、Ｒ５がＯＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ６は
    ＯＨでない〕を有するアントラサイクリン誘導体。
  41. 【請求項４１】　　式 【化１０】 〔式中、Ｒ１は、ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、
    ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、ＮＨ
    ＣＳＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８
    、ＮＨＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、ＮＨ−Ａｒ−ＣＯ
    ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＳＲ８、ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎ
    Ｓ−Ｈ、ＮＨＣＯＮＨＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−Ｈ
    、ＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｎＳ
    −Ｈ、ＮＨＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＳ−ＨまたはＮＨ−Ａｒ
    −ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−Ｈ〔式中、ｍ、ｎは１〜１
    ０の整数であって、同じであるか異なるものであり、Ｒ
    ８は 【化１１】 （式中、ＸはＨ、ＮＯ２またはハロゲンである）であり
    、Ａｒは 【化１２】 である〕であり、Ｒ２はＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ｏ
    ＣＯ（ＣＨ２）３ＯＨまたはＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ２
    Ｈ５）２であり、Ｒ３はＯＣＨ３、ＯＨまたは水素であ
    り、Ｒ４およびＲ７は各々、水素、アルキル、置換アル
    キル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリル、
    置換アリル、アラルキルまたは置換アラルキルであるか
    またはＲ４、Ｒ７およびＮと共に、置換されていてもよ
    い４〜７員環を形成し、Ｒ５はＯＨ、Ｏ−ＴＨＰまたは
    水素であり、Ｒ６はＯＨまたは水素であって、Ｒ５がＯ
    ＨまたはＯ−ＴＨＰである時にはＲ６はＯＨでない〕を
    有するアントラサイクリン誘導体。
  42. 【請求項４２】　　標的細胞集団と反応する分子の少な
    くとも１つとコンジュゲートした、請求項４０または４
    １のアントラサイクリン誘導体を含むコンジュゲート。
  43. 【請求項４３】　　分子が抗体である、請求項４２のコ
    ンジュゲート。
  44. 【請求項４４】　　抗体が腫瘍細胞と反応する、請求項
    ４３のコンジュゲート。
  45. 【請求項４５】　　抗体が、５Ｅ９、Ｌ６、３Ａ１およ
    びＧ２８．５から成る群から選ばれるモノクローナル抗
    体である、請求項４４のトコンジュゲート。
  46. 【請求項４６】　　抗体を先にチオール化剤と反応させ
    て、アントラサイクリン誘導体とコンジュゲートさせる
    ことから成る、請求項４３のコンジュゲートを製造する
    方法。
  47. 【請求項４７】　　チオール化剤がＳＰＤＰまたは２−
    ＩＴである、請求項４６の方法。
  48. 【請求項４８】　　アントラサイクリン誘導体を先に還
    元して抗体とコンジュゲートさせる、請求項４３のコン
    ジュゲートを製造する方法であって、抗体に先にマレイ
    ミド基を付着させて抗体を誘導体と反応させる工程を含
    む方法。
  49. 【請求項４９】　　マレイミド基が、抗体とスクシンイ
    ミジル−４−（Ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートと
    の反応によって付着する、請求項４８の方法。
  50. 【請求項５０】　　標的細胞集団と反応する分子が、標
    的細胞と反応するリガンドである、請求項４２のコンジ
    ュゲート。
  51. 【請求項５１】　　リガンドが、タンパク質、ポリペプ
    チドおよびペプチド分子から成る群から選ばれる請求項
    ５０のコンジュゲート。
  52. 【請求項５２】　　リガンドが、ボンベシン、ＥＧＦ、
    トランスフェリン、ガストリン、ガストリン放出ペプチ
    ド、血小板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧＦ
    −α、ＴＧＦ−β、ＶＧＦ、インスリンおよびインスリ
    ン様増殖因子ＩおよびＩＩから成る群から選ばれる、請
    求項５１のコンジュゲート。
  53. 【請求項５３】　　反応性ピリジニルジチオまたはオル
    ト−ニトロフェニルジチオ部分を有する二官性化合物に
    よって、遊離のスルフヒドリル基を有する分子少なくと
    も１つと連結した、遊離のカルボニル基を有する分子少
    なくとも１つを含むコンジュゲートであって、その二官
    性化合物は、セミカルバゾン、カルバゾン、チオセミカ
    ルバゾン、カルボキシレートヒドラゾンおよびアリルヒ
    ドラゾン結合から成る群から選ばれる結合によって、遊
    離のスルフヒドリル基を有する分子に付着している。
  54. 【請求項５４】　　遊離のカルボニル基を有する分子が
    細胞毒性試薬分子である、請求項５３のコンジュゲート
    。
  55. 【請求項５５】　　細胞毒性試薬分子が化学療法剤分子
    である、請求項５４のコンジュゲート。
  56. 【請求項５６】　　化学療法剤がアントラサイクリンで
    あり、二官性化合物が、アントラサイクリン分子のＣ−
    １３位置のケト基に連結している、請求項５５のコンジ
    ュゲート。
  57. 【請求項５７】　　アントラサイクリンが、アドリアマ
    イシン、ダウノマイシン、デトルビシン、カルミノマイ
    シン、イダルビシン、エピルビシン、エソルビシン、４
    ′−ＴＨＰ−アドリアマイシン、ＡＤ−３２および３′
    −デアミノ−３′−（３−シアノ−４−モルホリニル）
    −ドキソルビシンから成る群から選ばれる、請求項５６
    のコンジュゲート。
  58. 【請求項５８】　　細胞反応性分子が抗体またはリガン
    ドである、請求項５３のコンジュゲート。
  59. 【請求項５９】　　分子が腫瘍細胞と反応する抗体であ
    る、請求項５８のコンジュゲート。
  60. 【請求項６０】　　抗体が、がん、黒色腫、リンパ腫、
    骨または軟部組織肉腫に関連する抗原と反応する、請求
    項５９のコンジュゲート。
  61. 【請求項６１】　　抗体がモノクローナル抗体である、
    請求項６０のコンジュゲート。
  62. 【請求項６２】　　抗体が、５Ｅ９、Ｌ６、３Ａ１およ
    びＧ２８．５から成る群から選ばれ、アントラサイクリ
    ンがアドリアマイシンである、請求項６１のコンジュゲ
    ート。
  63. 【請求項６３】　　分子がリガンドである、請求項５８
    のコンジュゲート。
  64. 【請求項６４】　　リガンドが、タンパク質、ポリペプ
    チドおよびペプチド分子から成る群から選ばれる、請求
    項６３のコンジュゲート。
  65. 【請求項６５】　　リガンドが、ボンベシイン、ＥＧＦ
    、トランスフェリン、ガストリン、ガストリン放出ペプ
    チド、血小板由来増殖因子、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＧ
    Ｆ−α、ＴＧＦ−β、ＶＧＦ、インスリンおよびインス
    リン様増殖因子ＩおよびＩＩから成る群から選ばれる、
    請求項６４のコンジュゲート。
  66. 【請求項６６】　　リガンドが非ペプチドリガンドであ
    る、請求項６３のコンジュゲート。
  67. 【請求項６７】　　リガンドが、炭化水素、ステロイド
    およびレクチンから成る群から選ばれる、請求項６６の
    コンジュゲート。
  68. 【請求項６８】　　請求項５２によるコンジュゲートの
    少なくとも１つの製薬上有効な量と、製薬上許容しうる
    担体とを含む、疾患治療上有用な製薬上許容しうる組成
    物。
  69. 【請求項６９】　　請求項６８の組成物でもって、処置
    すべき標的細胞集団にアントラサイクリンを運ぶ方法。
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